CZ20031523A3

CZ20031523A3 - Bakteriální hostitelské kmeny a způsob tvorby polypeptidu

Info

Publication number: CZ20031523A3
Application number: CZ20031523A
Authority: CZ
Inventors: Christiana Yu-Ching Chen
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 2000-12-14
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2003-10-15
Also published as: CN1526010A; NO20032694D0; ES2259338T3; RU2003121232A; DE60117601D1; HUP0303892A3; RU2287574C2; JP4056880B2; ZA200304101B; EP1341899B9; DE60117601T2; IL156111A0; US6828121B2; DK1341899T3; EP1341899A2; HUP0303892A2; KR20030057579A; WO2002048376A2; PL366194A1; PL205897B1

Description

Vynález se týká použití proteolyticky nedostatečných bakteriálních hostitelských kmenů. Konkrétně, vynález se týká takových hostitelských kmenů, které neumožňují degradaci heterologních polypeptidů a zlepšují výtěžek těchto polypeptidů.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Kmeny E. coli nedostatečné v proteinázách nebo v genech kontrolujících regulaci proteináz jsou známé. Viz, například: Beckwith and Strauch, WO 88/05821, 11.8. 1988; Chaudhury and Smith, J. Bacteriol., 160:788-791 (1984); Elish et al., J. Gen. Microbiol., 134:1355-1364 (1988); Baneyx and Georgiou, „Expression of proteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli“, Stability of Protein Pharmaceuticals, vol. 3: Chemical and Physical Pathways of Protein Degradation, Ahern and Manning, eds. (Plenům Press, New York, 1992), 69-108.

Některé z těchto kmenů byly použity při pokusech účinně produkovat proteolyticky citlivé proteiny, zvláště takové, které by mohly být lékařsky nebo obchodně důležité. US 5 508 192 (Georgiou et al.) popisuje tvorbu mnoha bakteriálních kmenů nedostatečných v proteinázách a/nebo v proteinech vyvolávaných teplem. Takové kmeny zahrnují jedno-, dvoj-, troj-, nebo čtyřnásobně nedostatečné bakterie v proteinázách a jednonásobně nedostatečné bakterie v proteinázách, které nesou také mutaci v rpoH genu. Příklady zde popisovaných kmenů nedostatečných v proteinázách zahrnují kmeny, které nemají degP, ompT, ptr3 a/nebo prc (tsp), a degP rpoH, které produkují velké titry rekombinantních proteinů v£. coli. Perk et al., Biotechnol. Prog., 15: 164-167 (1999) také popisuje, že kmen (HM114) nedostatečný ve dvou proteinázách buněčného obalu {degP, prc) roste mírně rychleji a produkuje více fúzního proteinu než ostatní kmeny nedostatečné ve více proteinázách. Oni tvrdili, že tento kmen roste při použití stejného pH, při plné kultivaci do suché váhy 47,86 g/1 za 29 hodin. Produkovaný protein byl Α-Ξ-laktamáza fúzní protein, který vykazoval o 30 % vyšší 3-laktamázovou aktivitu, než protein získaný z jeho rodičovského kmene KS272.

Hara et al., J. Bacteriol., 173:4799-4813 (1991) poprvé izoloval Prc protein jako periplazmatickou proteinázu, která štěpí karboxylový konec periplazmatického penicilín vázajícího proteinu 3 (PBP3). Následně byl také identifikován jako proteináza, která výběrově degraduje proteiny s nepolárním C-koncem a byl přejmenován na Tsp (Silber et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:295-299 (1992)). Bylo ukázáno, že prc gen kóduje 75-kDa protein, který je potřebný pro ochranu buněk před tepelným a osmotickým šokem (Hara et al., viz výše). Bylo potvrzeno, že sekvence na C-konci určuje upřednostnění substrátu (Keiler et al., Protein Sci.,

4:1507-1515 (1995)). Míra štěpení je citlivá na totožnost zbytků nebo funkčních skupin na

C-konci substrátového proteinu. Přítomnost volné 3-karboxylové skupiny je důležitá pro určení, zda blízce příbuzné peptidy s nepolární C-koncovou sekvencí jsou účinně štěpení pomocí Prc.

Prc homology byly identifikovány u odlišné skupiny prokaryot, které zahrnují různé cyanobakterie (Brand et al.. Planí Mol. Biol., 20:481-491 (1992); Shestakov et al., J. Biol. Chem., 269:19354-19359 (1994)), Neisseria gonorrhoeae (Black et al., J. Bacteriol., 177:1952-1958 (1995)), Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., Science, 269: 496-512 (1995)), a Bartonella bacilliformis (GenBank přístup, č. L37094). Doména v Prc rodině proteinů je podobná doméně u retino 1 vázajících proteinů, což naznačuje společnou skládací doménu, která může u těchto proteinů tvořit vazebnou kapsu pro hydrofobní substráty (Silber et al., viz výše; Shestakov et al., viz výše).

Hara et al., viz výše, objevil, že teplovzdorný zmutovaný gen, který získá zpět své původní vlastnosti podstoupením další mutace = )prc mutanti, obsahuje mimogenové supresorové mutace (spr). Dále identifikovali produkt kontrolního spr genu jako lipoproteín v obalové frakci. Předpokládali, že kontrolní spr gen může být pro peptidoglykan hydrolyzující enzym (Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)). Jestliže spr není funkční u per pozitivního kmene, byl supresor pro spr mutaci identifikován jako PBP7, další penicilín vázající protein (Hara et al., 1996, výše). Hara et al. dále popsal klonování spr a přípravu )prc mutantu, kde Spr není degradován proteinázou (Abstr., Table Rondě Roussel Uclan 86, Versailles. 05/1997, kde autoři shrnují, že prc a spr jsou mutační supresory).

Při použití podmíněného smrtelného fenotypu prc (tsp) základního kmene E. coli byly také izolovány tři mnohočetné prc supresory (Bass et al., J. Bacteriol., 178:1154-1161 (1996)). Žádný z nich není příbuzný spr genu. Jednu skupinu těchto supresorů tvoří dva domnělé proteinázové geny v tandemu, které mapují 72,5 min. na chromozómu. Tyto dva geny jsou homology htrA, které kódují proteiny, které jsou z 58 a 35 % identické jako HtrA (DegP) serinové proteinázy. Další typ supresoru byl identifikován jako dksA (dnak supresor) gen, který je také mnohočetný supresor poruch u genů tepelného šoku dank, dnaj a grpE. Gen dksE byl také nezávisle izolován jako mnohočetný supresor mukB mutace, která je vyžadována pro chromozomální dělení. Třetím typem je gen pro zkrácený lipoproteín A (rlpÁ).

Gen degP kontroluje syntézu buněčné obalové proteinázy DegP (HtrA). Mutant nedostatečný na degP byl prvně vytvořen a rekombinován do E. coli chromozómu (Beckwith and Strauch, viz výše). HtrA má vysokou molekulovou hmotnost 500 kDa a je to protein vyvolávaný teplem, jehož proteolytická aktivita je nezbytná pro přežívání E. coli při vysokých teplotách, jako je

teplota nad 42 °C (Skorko-Glonek et al., Gene, 163:47-52 (1995)). Mnoho obyčejně nestabilních buněčných obalových proteinů může být stabilizováno mutací degP (Strauch and Beckwith, Proč. Nati. Acad. Sci USA, 85:1676-1580 (1988)). V současnosti, pomocí elektronové mikroskopie a chemickou analýzou příčných vazeb bylo popsáno, že HtrA protein se chová jako dvanáctimer skládající se ze dvou skupin šestimerních kruhů (Kim et al., J. Mol. Biol., 294:1363-1374 (1999)). Rozvinutí proteinových substrátů, např. vystavením vysoké teplotě nebo redukcí disulfidových vazeb, je nezbytné pro jejich přístup do vnitřního prostoru dvojitého kruhového HtrA, kde může docházet ke štěpení peptidových vazeb (Kim et al., viz výše).

Mnoho heterologních polypeptidů může být produkováno v různých kmenech nedostatečných v proteinázách. Nicméně, mnoho kmenů poskytuje poměrně nízký produkční titr a/nebo slabý růst. Je zapotřebí poskytnout bakteriální kmen nedostatečný v proteinázách, který neumožňuje štěpení produktu a který poskytuje vysoký produkční titr.

PODSTATA VYNÁLEZU

Navrhovaný vynález odpovídá uvedeným nárokům. Z jednoho hlediska, navrhovaný vynález poskytuje kmeny E. coli, které jsou nedostatečné v chromozomálním degP a prc kódující proteinázy DegP a Prc, a nesou nebo obsahují mutantní spr gen, jehož produkt potlačuje růstový fenotyp, který je vykazován kmeny nesoucí prc mutanty. Výhodně, kmen není nedostatečný v chromzomálním pír 3 kódující Proteinázu III a/nebo v chromozomálním ompT kódující proteinázu OmpT. Nejvýhodněji, E. coli kmen je vytvořen vložením mutantního spr genu do degP? prc? kmene, aby bylo docíleno stacionární fáze s vysokou hustotou buněk E.coli při kvasném procesu.

V jiném zpracování kmen obsahuje nukleovou kyselinu kódující polypeptid heterologní ke kmeni, výhodněji proteolyticky senzitivní polypeptid, nej výhodněj i eukaryotický polypeptid.

V dalším zpracování vynález poskytuje způsob produkce heterologního polypeptidů, tj., takový, který je heterologní ke kmeni. Tento způsob zahrnuje kultivaci E. coli kmene, který je nedostatečný v chromozomálním prc kódující proteinázu Prc a nese nebo obsahuje mutantní spr gen, jehož produkt potlačuje růstový fenotyp, který vykazují kmeny nesoucí prc mutanty. Tento kmen také obsahuje nukleovou kyselinu kódující heteologní polypeptid. Kultivace probíhá tak, aby byla exprimována nukleová kyselina. V druhém kroku tohoto způsobu je z kmene získáván polypeptid zcytoplazmy, periplazmy nebo kultivačního média, výhodněji zperiplazmy nebo kultivačního média, a nejvýhodněji z celkového kvasného bujónu. Výhodně, polypeptid je Apo2 ligand nebo protilátka, zahrnující fragment protilátky.

Zde používaný „polypeptid“ obecně představuje peptidy a proteiny mající více než 10 aminokyselin. „Heterologní“ polypeptidy jsou takové polypeptidy, které jsou cizí k používaným hostitelským buňkám, jako je lidský protein produkovaný E. colí. Polypeptid může být prokaryotický nebo eukaryotický, výhodněji je eukaryotický, nejvýhodněji savčí.

Příklady savčích polypeptidů zahrnují molekuly jako jsou např., renin, růstový hormon, zahrnující lidský růstový hormon; hovězí růstový hormon; faktor uvolňující růstový hormon; parathyroidní hormon; hormon stimulující činnost štítné žlázy; lipoproteiny; 1-antitrypsin; Ařetězec inzulínu; B-řetězec inzulínu; proinzulín; trombopoietin; folikuly stimulující hormon; kalcitonin; luteinizační hormon; glukadon; koagulační faktor jako je faktor VIIIC, faktor IX, tkáňový faktor; a von Willebrandův faktor; anti-koagulační faktory jako je Protein C; atriový faktor; povrchově aktivní protein plic; aktivátor plazminogenu, jako je urokináza nebo lidský močový nebo tkáňový aktivátor plazminogenu (t-PA); bombesin; trombin; hemopoetický růstový faktor; TNF-aa TNF-β; protilátky proti ErbB2 doméně jako je 2C4 (WO 01/00245; hybridom ATCC HB-12697), které se vážou v oblasti v mimobuněčné doméně ErbB2 (např., jeden nebo více zbytků v oblasti 22 až 584 v ErbB2 včetně), enkefalináza; sérový albumin jako je lidský sérový albumin; „mullerian“ inhibiční substance; A-řetězec relaxinu; prorelaxin; myší s gonadortopinem asociovaný peptid; mikrobiální protein, jako je beta-laktamáza; DNáza; inhibin; aktivin; vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF); receptory pro hormony nebo růstové faktory; integrin; protein A nebo D; revmatoidní faktory; neurotrofícký faktor jako je mozkový neurotrofícký faktor (BDNF), neurotrofín-3, -4, -5 nebo -6 (NT-3, NT-4, NT-5, nebo NT-6), nebo nervový růstový faktor jako je NGF; kardiotrofiny (srdeční hypertrofní faktor) jako je kardiotrofín-1 (CT-1); destičkový růstový faktor (PDGF); růstový faktor fibroblastů jako je aFGF a bFGF; epidermální růstový faktor (EGF); transformující růstový faktor (TGF) jako je TGF-α a TGF-β, zahrnující TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, nebo TGF-5; růstový faktor podobný inzulínu I a II (IGF-I a IGF-II); des(l-3)-IGF-I (mozkový IGF-I), proteiny vázající růstový faktor podobný inzulínu; CD proteiny jako je CD-3, CD-4, CD-8, a CD-19; erytropoetin; osteoinduktivní faktory; imunotoxiny; kostní morfogenetický protein (BMP); interferon jako je interferon-α, -β a -γ; sérový albumin, jako je lidský sérový albumin (HSA) nebo hovězí sérový albumin (BSA); kolonie stimulující faktory (CSF), např., M-CSF, GM-CSF, a G-CSF; interleukiny (IL), např., IL-1 až IL-10; anti-HER-2 protilátky; Apo2 ligand; superoxid dismutáza; T-buněčné receptory; proteiny povrchu membrány; faktor urychlující rozpad; virový antigen jako je například část AIDS obalu; transportní proteiny; naváděcí receptory; adresiny; regulační proteiny; protilátky; a fragmenty kterýchkoliv z výše zmiňovaných polypeptidů.

Výhodné polypeptidy zahrnují polypeptidy jako je HSA, BSA, anti-IgE, anti-CD20, anti-IgG, t-PA, gpl20, anti-CDlla, anti-CD-18, 2C4, anti-VEGF, VEGF, TGF-beta, aktivin, inhibin, antiHER-2, DNáza, IGF-I, IGF-II, mozkový IGF-I, růstový hormon, řetězce relaxinu, faktor uvolňující růstový hormon, řetězce inzulínu nebo proinzulín, NGF, NT-3, BDNF, Apo2 ligand, a urokináza. Zvláště výhodné savčí polypeptidy jsou protilátky, které zahrnují protilátky v plné délce, fragmenty protilátky a Apo2 ligand. Nejvýhodněji jsou tyto protilátky lidské nebo humanizované protilátky. Ty zahrnují např., anti-IgG, anti-Her-2, anti-CDlla, anti-CD18, antiCD20, a anti-VEGF, 2C4, BSA, nebo HSA. Ještě výhodněji je protilátka anti-CD18, anti-VEGF, anti-tkáňový faktor, 2C4, anti-Her-2, anti-CD-20, anti-CD40, nebo anti-CDlla. Fragmenty protilátek zahrnují podle definice polypeptidu například fragment Fab, Fab‘, Fab‘2, nebo Fab‘2-leucinový zip (LZ), a nejvýhodněji to jsou anti-CD18 Fab‘2-LZ, anti-tkáňový faktor Fab‘2-LZ-6xhis, anti-VEGF Fab, anti-CD8 histidinem označený Fab‘2-LZ, a anti-CD18 lysinem označený Fab'2-LZ.

Zde užívaný pojem „proteolyticky senzitivní“ polypeptid se týká polypeptidů, které jsou náchylné pro štěpení, snadno podléhají štěpení, nebo jsou štěpeni jednou nebo více E. coli proteinázami, jak v nativním stavu nebo během sekrece.

Kvašení „buněk o vysoké hustotě“ nebo jejich kultivace se týká procesu, ve kterém jsou nejprve typicky přidány do dávek některé živiny, aby byl umožněn buňkám růst a který dává výhodu souvislosti spotřeby O2 a spotřeby glukózy při použití rozpuštěného kyslíku, který je snadný pro měření, pro kontrolu přidávání glukózy. Pro dosažení vyšších buněčných hustot, může být plynule přidáváno amonium, a další méně významné živiny (například P, K, S a Mg) mohou být přidávány v jistých stádiích kvašení pro podporu růstu buněk, tak jak je detailněji popsáno v příkladech níže.

„Mutantní spr gen, jehož produkt potlačuje růstové fenotypy, které vykazují kmeny nesoucí prc mutanty“, se týká E. coli prc supresoru (spr) (kódující Prc^sup) se sekvencí popsanou v Hara et al., 1996, viz výše, nebo sjejí mutací, který poskytuje genový produkt, který funguje jako supresor růstových fenotypů kmenů s prc mutanty. Výhodně, mutaci představuje jednobodová mutace. Nejvýhodněji je jednobodová mutace W148R, ve které je TFF kodon změněn na CGG, čehož následkem je změna tryptofanu na arginin v aminokyselině 148.

Zde používaný pojem „protilátka“ v širším smyslu, a specificky pokrývá přirozené monoklonální protilátky, polyklonální protilátky, mnohospecifické protilátky (např. bispecifické protilátky) vytvořené z alespoň dvou přirozených protilátek, a fragmenty protilátek, pokud vykazují vyžadovanou biologickou aktivitu.

··· ·

Zde používaný pojem „monoklonální protilátky“ se týká protilátek získaných z populace v podstatě homogenních protilátek, tj. jednotlivé protilátky obsažené v populaci jsou identické kromě možných přirozeně se vyskytujících mutací, které mohou být přítomny v malém množství. Monoklonální protilátky jsou vysoce specifické, jsou namířeny proti jednotlivému antigennímu místu. Navíc, na rozdíl od přípravků polyklonálních protilátek, které zahrnují různé protilátky namířené proti různým determinantám (epitopům), každá monoklonální protilátka je namířena proti jednotlivé determinantě na antigenů. Navíc k jejich specifičnosti, monoklonální protilátky jsou výhodné vtom, že mohou být syntetizovány bez kontaminace odlišnými protilátkami. Přívlastek „monoklonální“ naznačuje charakter protilátky jak je získána z podstatě homogenní populace protilátek, a není chápán jako vyžadující produkci protilátky nějakým konkrétním způsobem. Například, monoklonální protilátky používané podle navrhovaného vynálezu mohou být připraveny metodou hybridomů, kterou poprvé popsal Koehler et al.. Nátuře, 256:495 (1975), nebo mohou být připraveny metodami rekombinantní DNA (viz např. US 4 816 567). „Monoklonální protilátky“ mohou být také izolovány z fágové knihovny protilátek při použití technik popsaných například v Clackson et al., Nátuře, 352:624-628 (1991) a Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).

Monoklonální protilátky zde specificky zahrnují „chimérické“ protilátky, ve kterých část těžkého a/nebo lehkého řetězce je stejná nebo homologní s odpovídající sekvencí protilátek odvozených od konkrétního druhu nebo s protilátkami, které patří konkrétní třídě nebo podtřídě protilátek, stejně tak jako s fragmenty takových protilátek, pokud vykazují požadovanou biologickou aktivitu (US 4 816 567; Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Chimérické protilátky zde zahrnují „primatizované“ protilátky zahrnující sekvenci pro vazbu antigenů ve variabilní doméně odvozenou od nelidských primátů (např. opice starého světa, lidoopi atd.) a od oblastí lidských konstantních sekvencí.

„Fragmenty protilátky“ zahrnují část přirozené protilátky, nejvhodněji zahrnující antigen vázající nebo variabilní oblast. Příklady fragmentů protilátek zahrnují Fab, Fab‘, F(ab‘)₂, a Fv fragmenty; lineární protilátky; jednořetězcové molekuly protilátek; a mnohospecifické protilátky vytvořené z fragmentů protilátek.

„Přirozená“ protilátka je taková protilátka, která obsahuje variabilní oblast vázající antigen, stejně tak jako konstantní doménu lehkého řetězce (Cl) a konstantní domény těžkého řetězce

Cul, Ch2 a Ch3. Konstantní domény mohou mít původní sekvenci konstantní domény (např.

lidská přirozená sekvence konstantních domén) nebo variantu aminokyselinové sekvence.

Výhodně, přirozená protilátka má jednu nebo více výsledných funkcí.

•4 4 ·· 44

4 44 · 4 4 •• 4 4 4 44

4 4 4 4 4 4 • 4 · 4 4 ·

444 44 44 „Výsledné funkce“ protilátek se týkají takových biologických aktivit, které mohou být přisuzovány Fc oblasti (původní sekvence Fc oblasti nebo varianta aminokyselinové sekvence Fc oblasti) protilátky. Příklady výsledných funkcí protilátky zahrnují vazbu Clq, na komlementu závislou cytotoxicitu, vazbu Fc receptoru, buněčně zprostředkovanou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC), fagocytózu, regulaci receptorů na buněčném povrchu (např. B buněčný receptor; BCR) atd.

V závislosti na aminokyselinové sekvenci konstantní domény jejich těžkých řetězců, mohou být přirozené protilátky zařazeny do různých „tříd“. Existuje pět hlavních tříd přirozených protilátek: IgA, IgĎ, IgE, IgG a IgM, a některé z těchto protilátek mohou být dále rozděleny do „podtříd“ (izotypy), např. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA a IgGA2. Konstantní domény těžkých řetězců, které odpovídají různým třídám protilátek jsou nazývány α, δ, ε, γ a μ. Struktury podjednotek a trojrozměrné uspořádání různých tříd imunoglobulinů jsou známé.

„Buněčně zprostředkovaná cytotoxicita závislá na protilátkách“ a „ADCC“ se týká buněčně zprostředkované reakce, ve které nespecifické cytotoxické buňky, které mají Fc receptory (FcR) (např. přirození zabiječi (NK buňky), neutrofily a makrofágy), rozpoznávají navázanou protilátku na cílové buňce a následně způsobují rozklad cílové buňky. Primárně buňky zprostředkovávající ADCC, NK buňky, mají pouze FcRIII, zatímco monocyty mají FcRI, FcRII a FcRIII. Exprese FcR na hematopoetických buňkách je shrnuta v tabulce 3 na straně 464, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991). Pro stanovení ADCC aktivity nějaké molekuly může být proveden in vitro ADCC test, který je popsán v US 5 500 362 nebo 5 821 337. Užitečné efektorové buňky pro tyto testy jsou periferní krevní mononukleární buňky (PBMC) a přirození zabíječi (NK buňky). Nebo jinak může být ADCC aktivita molekuly stanovena in vivo, např. u zvířecího modelu, jak je popsáno v Clynes et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 95:652-656 (1998).

„Lidské efektorové buňky“ představují leukocyty, které exprimují jeden nebo více FcR a mají efektorové funkce. Nejvýhodněji, buňky exprimují alespoň FcRIII a mají ADCC efektorovou funkci. Příklady lidských leukocytů, které zprostředkují ADCC zahrnují periferní krevní mononukleární buňky (PBMC), přirozené zabij eče (NK buňky), monocyty, cytotoxické T buňky a neutrofily, přičemž nej výhodnější jsou PBMC a NK buňky. Efektorové buňky mohou být izolovány z původního zdroje, např. z krve nebo z periferních krevních buněk, tak jak je zde popsáno.

„Původní protilátky“ jsou obyčejně heterotetramerní glykoproteiny okolo 150000 Da, jsou složeny ze dnou stejných lehkých (L) a dvou stejných těžkých (H) řetězců. Každý lehký řetězec je spojen s těžkým řetězcem jednou kovalentní disulfidickou vazbou, zatímco množství

• ·· 4 4 4 4 4 44 4 ·· 4 4 4 4 44 4

4 4 44 4 4 «

444 44 444 4 4

4444 4444

444 44 44 44 44 disulfidických vazeb se u těžkých řetězců různých typů imunoglobulinů liší. Každý těžký a lehký řetězec má také pravidelně rozmístěnou disulfidickou vazbu uvnitř řetězce. Každý těžký řetězec má na jenom konci variabilní doménu (Vh), na kterou navazuje množství konstantních domén. Každý lehký řetězec má na jednom konci variabilní doménu (Vl) a na druhém konci konstantní doménu. Konstantní doména lehkého řetězce je ve stejné úrovni jako první konstantní doména těžkého řetězce, a variabilní doména lehkého řetězce je ve stejné úrovni jako variabilní doména těžkého řetězce. Předpokládá se, že konkrétní aminokyselinové zbytky tvoří rozhraní mezi variabilními doménami lehkého a těžkého řetězce.

Pojem „variabilní“ znamená fakt, že jisté části variabilních domén různých protilátek se značně liší v sekvenci a jsou používány pro vazbu a specifičnost každé konkrétní protilátky pro její konkrétní antigen. Nicméně, variabilita není rozmístěna ve variabilních doménách protilátek rovnoměrně. Je koncentrována do tří segmentů, které jsou nazývány hypervariabilní oblasti ve variabilních doménách lehkého a těžkého řetězce.Vysoce konzervované části variabilních domén jsou nazývány strukturní oblasti (FR). Variabilní domény původních těžkých a lehkých řetězců obsahují čtyři FR, které převážně zaujímají β-listovou strukturu a jsou spojeny třemi hypervariabilními oblastmi, které tvoří smyčky spojující, a v některých případech tvořící část βlistové struktury. Hypervariabilní oblasti v každém řetězci jsou pomocí FR drženy v blízkosti pohromadě a spolu s hypervariabilními oblastmi jiného řetězce přispívají k tvorbě antigen vázajícího místa protilátek (viz Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^thEd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Konstantní domény nejsou zapojeny přímo do vazby protilátky k antigenu, ale vykazují různé efektorové funkce, jako je účast protilátky v buněčné cytotoxicitě závislé na protilátkách (ADCC).

Zde používaný pojem „hypervariabilní oblast“ se týká aminokyselinových zbytků protilátky, které jsou zodpovědné za vazbu antigenu. Hypervariabilní oblast obecně obsahuje aminokyselinové zbytky z „oblasti určující komplementaritu“ nebo „CDR“ (např. zbytky 24 až 34 (LI), 50 až 56 (L2) a 89 až 97 (L3) ve variabilní doméně lehkého řetězce a 31 až 35 (Hl), 50 až65 (H2) a 95 až 102 (H3) ve variabilní doméně těžkého řetězce; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) a/nebo tyto zbytky vytvářejí „hypervariabilní smyčku“ (např. zbytky 26 až 32 (LI), 50 až 52 (L2) a 91 až 96 (L3) ve variabilní doméně lehkého řetězce a 26 až 32 (Hl), 53 až 55 (H2) a 96 až 101 (H3) ve variabilní doméně těžkého řetězce; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). „Strukturní oblast“ nebo „FR“ zbytky jsou takové zbytky ve variabilní doméně, které jsou jiné než zde popsané zbytky v hypervariabilní doméně.

·· ··· · ·· 9 9 9 9 99 9 • 9 9 99 9 9 9 • 99 99 999 9 · • · 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99

Štěpením protilátky papainem vznikají dva stejné antigen vázající fragmenty nazývané „Fab“ fragmenty, každý má jednotlivé antigen vázající místo, a zbývající „Fc“ fragment, jehož jméno je odvozeno od schopnosti lehké krystalizace. Opracování pepsinem dává vznik F(ab‘)₂fragmentu, který má dvě antigen vázající místa a je stále schopný příčné vazby s antigenem.

„Fv“ je nejmenší fragment protilátky, který obsahuje kompletní antigen rozpoznávající a antigen vázající místo. Tato oblast se skládá z dimeru pevně, nekovalentně vázaných variabilních domén těžkého a lehkého řetězce. V této struktuře se vzájemně ovlivňují tři hypervariabilní oblasti každé variabilní domény tak, že určují antigen vázající místo na povrchu Vh-Vl dimeru. Společně určuje šest hypervariabilních oblastí specifičnost vazby antigenů k protilátce. Nicméně, i jednotlivá variabilní doména (nebo půl Fy fragmentu obsahující jen tři hypervariabilní oblasti specifické pro antigen) má schopnost rozpoznat a vázat antigen, ačkoliv s nižší afinitou než celé vazebné místo.

Fab fragment také obsahuje konstantní doménu lehkého řetězce a první konstantní doménu (CHI) těžkého řetězce. Fab‘ fragmenty se od Fab fragmentů liší přidáním několika zbytků ke karboxylovému konci CHI domény těžkého řetězce zahrnující jeden nebo více cysteinů z pantové oblasti protilátky. Fab‘-SH je zde zkratkou pro Fab‘, kde cysteinové zbytky v konstantní doméně nesou alespoň jednu volnou thiolovou skupinu. F(ab‘)2 fragmenty protilátky byly původně vytvořeny jako páry Fab‘ fragmentů, které mají mezi sebou pantové cysteiny. Jsou známá také jiná chemická spojení fragmentů protilátek.

„Lehké řetězce“ protilátek jakýchkoliv druhů obratlovců mohou být roztříděny do jednoho nebo více jasně stanovených druhů, nazývaných kappa (6) a lambda (8), založené na aminokyselinových sekvencích jejich konstantních domén.

„Jednořetězcový F_v“ nebo „scF_v“ fragmenty protilátky obsahují Vu a V_L domény protilátky, přičemž tyto domény jsou přítomny v jednotlivém polypeptidovém řetězci. Nejvýhodněji Fv polypeptid dále obsahuje polypeptidové spojení mezi Vh a Vl doménami, které umožňuje scFy vytvořit požadovanou strukturu pro vazbu antigenů. Pro bližší seznámení viz Plůckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol 113, Rosenburg and Moore eds. (Springer-Verlag, New York, 1994), 269-315. ScFV fragmenty anti-ErbB2 protilátky jsou popsány v WO93/16185; US 5 571 894; a US 5 587 458.

Pojem „dvojprotilátka“ se týká malých fragmentů protilátky s dvěma antigen vázajícími místy, přičemž fragmenty obsahují variabilní doménu těžkého řetězce (Vh) spojenou s variabilní doménou lehkého řetězce (Vl) ve stejném polypeptidovém řetězci (V_h-Vl). Použitím spojovacího prvku, který je příliš krátký pro umožnění spojení mezi dvěmi doménami na stejném řetězci, jsou domény nuceny se párovat s komplementárními doménami jiného řetězce a tvoří tak

9 ··· · ·· 9 99 99 • · 99 9999 99 9 • · 9 99 99 999 • · · >9 99 999 9 9

W· · · 9999 9999 ·· ··· 99 99 99 99 dvě antigen vázající místa. Dvojprotilátky jsou detailněji popsány například v EP 404 097; WO 93/11161; a Hollinger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

„Humanizované“ formy nelidských (např. hlodavcích) protilátek jsou chimérické protilátky, které obsahují minimální sekvence odvozené od nelidských imunoglobulinů. Z větší části jsou humanizované protilátky lidské imunoglobuliny (protilátka příjemce), ve kterých jsou zbytky z hypervariabilní oblasti příjemce nahrazeny zbytky z hypervariabilní oblasti nelidských druhů (protilátka dárce), jako je myš, krysa, králík, nebo nelidský primát mající požadovanou specifičnost, afinitu a kapacitu. V některých případech jsou zbytky ze strukturní oblasti (FR) lidského imunoglobulinů nahrazeny odpovídajícími nelidskými zbytky. Navíc, humanizované protilátky mohou obsahovat zbytky, které se nenacházejí u protilátky příjemce nebo protilátky dárce. Tyto změny jsou udělány pro další zlepšení výkonu protilátky. Obecně, humanizovaná protilátka bude obsahovat v podstatě alespoň jednu, typicky dvě variabilní domény, ve kterých všechny nebo v podstatě všechny hypervariabilní smyčky odpovídají smyčkách nelidského imunoglobulinů, a všechny nebo v podstatě všechny FR mají lidskou imunoglobulinovou sekvenci. Humanizovaná protilátka může také obsahovat alespoň část konstantní oblasti imunoglobulinů (Fc), typicky lidského imunoglobulinů. Pro další detaily, viz Jones et al., Nátuře, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nátuře, 332:323-329 (1988); a Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

„Izolovaná“ protilátka je taková protilátka, která byla identifikována a oddělena a/nebo získána jako součást přirozeného prostředí. Znečišťující látky tohoto přirozeného prostředí jsou materiály, které by mohly narušit diagnostické nebo léčebné použití protilátky, a mohou zahrnovat enzymy, hormony, a jiné proteinové nebo neproteinové rozpuštěné látky. Ve vhodném zpracování je protilátka přečištěna (1) až do více než 95 % hmotnosti protilátky, jak je určováno metodou podle Lowry, výhodněji do více než 99 % hmotnosti (2) až do míry dostatečné pro získání alespoň 15 zbytků na N-konci nebo z interní aminokyselinové sekvence při použití sekvenátoru, nebo (3) do homogenity pomocí SDS-elektroforézy za redukčních a neredukčních podmínek při použití Coomassie blue, nebo výhodněji barvením stříbrem. Izolovaná protilátka zahrnuje protilátku in šitu v rekombinantních buňkách, pokud alespoň jedna složka přirozeného prostředí protilátky nebude přítomna. Obyčejně jsou izolované protilátky připravovány alespoň jedním čistícím krokem.

Pojem „kontrolní sekvence“ se týká DNA sekvencí nutných pro expresi operabilně spojených kódujících sekvencí v konkrétním hostitelském organismu. Kontrolní sekvence, které jsou výhodné pro pro kary ota, zahrnují promotor, mohou mít operátor a vazebné místo pro ribozóm.

► 99 • 9 ·

99

9 9 • · ·99 · (

I 4 9 9

Nukleová kyselina je „operabilně spojena“ jestliže je umístěna tak, že má funkční vztah s jinou sekvencí nukleové kyseliny. Například, DNA pro sekreční iniciátor je operabilně spojena s DNA pro polypeptid, jestliže je exprimován jako pre-protein, který se účastní sekrece polypeptidů; promotor je operabilně spojen s kódující sekvencí, jestliže tak ovlivňuje transkripci sekvence; nebo vazebné místo pro ribozóm operabilně spojené s kódující sekvencí je umístěno tak, že usnadňuje translaci. Obecně, „operabilně spojeno“ znamená, že DNA sekvence jsou spojeny tak, ze spolu sousedí, a v případě sekrečního iniciátoru spolu sousedí a jsou ve čtecím rámci. Spojení je dosaženo spojováním ve vhodných štěpících místech. V případě nepřítomnosti takových míst, mohou být používány umělé oligonukleotidové adaptory nebo spoj ovace podle běžných praktik. Zde používané pojmy „buňky“, „buněčná linie“ a „ buněčná kultura“ jsou používány zaměnitelně a všechna tato ustanovení zahrnují potomky. Takto slova „transformanty“ a „transformované buňky“ zahrnují původní buňky a kultury z nich odvozené, bez ohledu na množství přenosů. Je také jasné, že všechny vzniklé buňky nemusí mít díky záměrným i nechtěným mutacím přesně stejný obsah DNA. Vzniklé mutantní buňky, které mají stejnou funkci nebo biologickou aktivitu jako u původních transformovaných buňkách, jsou zahrnuty. Tam kde jsou zamýšlena odlišná ustanovení, to bude jasné ze souvislosti.

Způsoby provedení vynálezu

Navrhovaný vynález poskytuje kmeny E. coli nedostatečné v chromozomálním degP a prc kódující proteinázy DegP a Prc, nesoucí mutantní spr gen, jehož produkt potlačuje růstové fenotypy, které vykazují kmeny nesoucí prc mutanty. Kmen může být dále nedostatečný v chromozomálním ptr3 kódujícím Proteinázu III a/nebo v chromozomálním ompT kódující proteinázu OmpT.

V jiném zpracování kmen obsahuje kyselinu nukleovou kódující polypeptid heterologní ke kmeni. Kmen je výhodně transformován kyselinou nukleovou, která je nejvýhodněji DNA (cDNA nebo genomová DNA), při použití rekombinantního expresního vektoru.

Z dalšího hlediska vynález poskytuje způsob produkce takového heterologního polypeptidů. Tímto způsobem je výše zmiňovaný kmen E. coli, který také obsahuje nukleovou kyselinu kódující polypeptid, kultivován tak, že je nukleová kyselina exprimována. Poté je polypeptid izolován z kmene. Může být získán z periplazmy nebo kultivačního média kmene. Výhodně probíhá kultivace v zařízení pro kvašení a nejvýdněji za podmínek pro kvašení s vysokou hustotou buněk.

Parametry kultivace a produkce polypeptidů je řízena běžným způsobem, jako u postupů popsaných níže.

A. Výběr kyseliny nukleové a její modifikace ·· ·« • · · · • · ·· • · · · · • · · · • tf tftftf · • · · • · · • · · • · · · • · · ·

Nukleová kyselina kódující určitý polypeptid je výhodně RNA, cDNA, nebo genomová DNA z jakéhokoliv zdroje, přičemž poskytuje kódovaný určitý polypeptid. Způsoby pro výběr vhodné nukleové kyseliny pro expresi heterologních polypeptidů (zahrnující jejich varianty) v E. coli jsou známy.

Pokud jsou produkovány monoklonální protilátky, DNA kódující monoklonální protilátky je snadno izolována a sekvenována běžnými postupy (např., použitím oligonukleotidových sond, které jsou schopné specifické vazby ke genům kódujícím těžké a lehké řetězce myších protilátek). Hybridomové buňky slouží jako nejvhodnější zdroj pro takovou DNA. Po izolaci může být DNA vložena do expresních vektorů, které jsou poté transformovány do bakteriálních hostitelských buněk, aby tak došlo k syntéze monoklonálních protilátek v rekombinantních hostitelských buňkách. Shrnující články o rekombinantní expresi DNA kódující protilátky v bakteriích zahrnují Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) a Plůckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

Způsoby přípravy humanizovaných nelidských protilátek byly popsány v současném stavu techniky. Nejvýhodněji mají humanizované protilátky jeden nebo více vložených aminokyselinových zbytků, které nepocházejí z lidského zdroje. Tyto nelidské aminokyselinové zbytky jsou často nazývány „významné“ zbytky, které jsou typicky odebírány z „významné“ variabilní domény. Humanizace může být v podstatě provedena způsobem podle Wintera a spol. (Jones et al., Nátuře, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nátuře, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al.. Science, 239:1534-1536 (1988)), nahrazením sekvencí hypervariabilní oblasti za odpovídající sekvence lidské protilátky. Podle toho, takovéto „humanizované“ protilátky jsou chimérické protilátky (US 4 816 567), přičemž v podstatě méně než původní lidská variabilní doména byla nahrazena odpovídající sekvencí z nelidských druhů. Ve skutečnosti jsou humanizované protilátky typicky lidské protilátky, ve kterých některé zbytky hypervariabilní oblasti a možná některé zbytky FR oblasti jsou nahrazeny zbytky a obdobných míst u hlodavčích protilátek.

Volba lidských variabilních domén, lehkých i těžkých, které jsou používány pro tvorbu humanizovaných protilátek, je velmi důležitá pro redukci antigenicity. Podle takzvaně „nejlepší“ metody je sekvence variabilní doména hlodavčí protilátky přezkoušena proti celé knihovně známých sekvencí lidské variabilní domény. Lidská sekvence, která je nejblíže k hlodavčí sekvenci, je přijatelná jako lidská strukturní oblast (FR) pro humanizovanou protilátku (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Jiný způsob využívá konkrétní strukturní oblast odvozenou od shodné sekvence všech lidských protilátek konkrétní podtřídy lehkých nebo těžkých řetězců. Stejná strukturní oblast může být použita pro •0 0 ·0 00 000

00 0000 00 « •00 «0 0« 000

IQ 000 00····0· ¹ -⁷ 00 000 00 00 00 00 různé humanizované protilátky (Carter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. ImmunoL, 151:2623 (1993)).

Dále je důležité, aby protilátky byly humanizovány s ohledem na zachování vysoké afinity pro antigen a dalších výhodných biologických vlastností. Pro dosažení tohoto požadavku podle nejvhodnější metody, jsou humanizované protilátky připravovány analýzou rodičovských sekvencí a různých pojmových humanizovaných produktů při použití trojrozměrných modelů rodičovských a humanizovaných sekvencí. Trojrozměrné modely imunoglobulinů jsou běžně dostupné a jsou známé odborníkům v současném stavu techniky. Jsou dostupné počítačové programy, které ilustrují a ukazují pravděpodobné trojrozměrné struktury vybraných kandidátských imunoglobulinových sekvencí. Tyto obrázky umožňují analýzy pravděpodobné role zbytků ve funkci kandidátské sekvence imunoglobulinu, tj., analýza zbytků, které ovlivňují schopnost kandidátského imunoglobulinu vázat jeho antigen. Tímto způsobem mohou být vybírány a kombinovány FR zbytky dárce a mohou být vkládány sekvence tak, aby bylo dosaženo některých požadovaných vlastností protilátek, jako je zvýšená afinita pro cílový antigen. Obecně, zbytky hypervariabilní oblasti jsou přímo a nej podstatněji zahrnuty v ovlivňování vazby antigenu.

Je uvažováno o různých formách humanizované protilátky nebo vazebně zralé protilátky. Například, humanizovanou protilátkou nebo afinně zralou protilátkou může být fragment protilátky, jako je Fab, který může být spojen s jedním nebo více cílovým činidlem za tvorby imunokonjugátu. Nebo jinak může být humanizovanou protilátkou nebo vazebně zralou protilátkou neporušená protilátka, jako je neporušená IgGl protilátka.

Fab‘-SH fragmenty mohou být přímo získány z£. coli a mohou být chemicky navázány za tvorby F(ab‘)2 fragmentů (Carter ct al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Podle jiného přístupu, mohou být F(ab‘)2 fragmenty přímo izolovány z kultury rekombinantních hostitelských buněk. Jiné techniky produkce fragmentů protilátky budou známé odborníkům v současném stavu techniky. V jiných zpracování je vybraná protilátka jednořetězcový F_v fragment (scFv) (WO 93/16185; US 5 571 894 a 5 587 458). Fragment protilátky může být také „lineární protilátka“, např. jak je popsáno v US 5 641 870. Takové fragmenty lineární protilátky mohou být jednospecifické nebo dvoj specifické.

Dvoj specifické protilátky jsou protilátky, které mají vazebnou specifičnost alespoň pro dva různé epitopy. Vzorové dvoj specifické protilátky mohou vázat dva různé epitopy na Dkk-1 proteinu. Dvoj specifické protilátky mohou být připraveny jako protilátky v plné délce nebo jako fragmenty protilátek (např. F(ab‘)2 dvoj specifické protilátky).

« · • « • » » « 'i 0* «*0 0 0 0 0 • 00· 00 9 «0 00 400 · 4 « *0 « 0 00 0 0· ·* «0 40 f 0 ····

Podle různých přístupů, jsou variabilní domény protilátek s požadovanou vazebnou specifičností (místa spojení protilátek s antigenem) spojeny s konstantními doménami imunoglobulinů. Spojení je výhodné s konstantní doménou těžkého řetězce imunoglobulinu, která obsahuje alespoň část pantové oblasti, CH2 a CH3 oblasti. Nejvýhodněji je alespoň v jednom spojení přítomna první konstantní oblast těžkého řetězce (CH1) obsahující místo potřebné pro vazbu lehkého řetězce. DNA kódující spojení těžkého řetězce imunoglobulinů a je-li požadováno, lehký řetězec imunoglobulinu, jsou vloženy do jednotlivých expresních vektorů, a jsou přemístěny do vhodného bakteriálního hostitelského organismu. To poskytuje velkou pružnost v přizpůsobení společných vlastností tří polypeptidových fragmentů ve zpracování, kde nestejné poměry tří polypeptidových řetězců použitých v přípravě, poskytují optimální výtěžky. Je nicméně možné vložit kódující sekvence pro dva nebo všechny tři polypeptidové řetězce do jednoho expresního vektoru, kdy exprese alespoň dvou polypeptidových řetězců ve stejném poměru vede k vysokým výtěžkům, nebo kdy poměry nemají konkrétní důležitost.

V nej výhodněj ším zpracování tohoto přístupu jsou dvoj specifické protilátky složeny z hybridu těžkého imunoglobulinového řetězce s jednou vazebnou specifičností na jednom rameni, a hybridního páru těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu (poskytující druhou vazebnou specifičnost) na druhém rameni. Bylo zjištěno, že tato nesymetrická struktura usnadňuje separaci požadované dvoj specifické sloučeniny od nežádoucích kombinací imunoglobulinového řetězce, přičemž přítomnost lehkého řetězce imunoglobulinu v pouze jedné polovině dvoj specifické molekule poskytuje snadný způsob separace. Tento postup je popsán v WO 94/04690. Další detaily tvorby dvoj specifických protilátek viz například, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986).

Podle jiného přístupu popsaného v US 5 731 168, propojení mezi párem protilátkových molekul může být vytvořeno tak, aby co nejvíce zvětšilo procento heterodimerů, které jsou získány z kultury rekombinantních buněk. Nejvýhodnější propojení obsahuje aslespoň části CH3 domény konstantní domény protilátky. Tímto způsobem jsou jedna nebo více malých aminokyselinových postranních řetězců ze styčné plochy první protilátky nahrazeny většími postranními řetězci (např. tyrozin nebo tryptofan). Na styčné ploše druhé protilátky se nahrazením větších aminokyselinových postranních řetězců menšími (např., alanin nebo treonin) vytvářejí vyrovnávací „dutiny“ stejné nebo podobné velikosti k většímu postrannímu řetězci. To poskytuje mechanismus zvýšení výtěžku heterodimerů oproti jiným nechtěným konečným produktům, jako jsou homodimery.

Dvoj specifické protilátky zahrnují příčně spojené protilátky nebo „heterokonjugáty“. Například, jedna z protilátek v heterokonjugátu může být navázána na avidin, jiná na biotin. Takové • 4 ·· • · • ® • · • · • · ·· *

• >· « » · * ·β • · · «

9 1 ·· *··· ·· ·· • · · 9 9 4

9 • 14 1

19 protilátky mají například cílit buňky imunitního systému na nežádoucí buňky (US 4 676 980) a pro léčbu HIV infekcí (WO 91/00360, WO 92/200373 a EP 03089).

Heterokonjugované protilátky mohou být vytvořeny běžnými způsoby tvorby příčných vazeb. Vhodná činidla pro příčné vazby jsou velmi dobře známá v současném stavu techniky a jsou popsány v US 4 676 980 spolu s dalšími technikami příčné vazby.

Techniky tvorby dvoj specifických protilátek z fragmentů protilátek byly také popsány v literatuře. Například, dvoj specifické protilátky mohou být připraveny chemickou vazbou. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) popisuje postup, kde původní protilátky jsou proteolyticky štěpeny za tvorby F(ab‘)2 fragmentů. Tyto fragmenty jsou redukovány v přítomnosti arsenitanu sodného, který stabilizuje přilehlé dithioly a zabraňuje tvorbě mezimolekulárních disulfidů. Vytvořené fragmenty Fab‘ jsou poté přeměněny na thionitrobenzoátové (TNB) deriváty. Jeden zFab‘-TNB derivátů je poté přeměněn na Fab-thiol redukcí s merkaptoethylaminem a je smíchán se stejným molárním množstvím jiného Fab‘-TNB derivátu za tvorby dvoj specifické protilátky. Vytvořené dvoj specifické protilátky mohou být používány jako činidla pro výběrovou imobilizaci enzymů.

Navíc, fragmenty Fab‘-SH mohou být přímo získávány z E. coli a chemicky spojeny za vzniku dvoj specifických protilátek (Shalaby ct al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)).

Byly popsány různé techniky tvorby a izolace dvoj specifických fragmentů protilátek přímo z kultury rekombinantních buněk. Například, dvoj specifické protilátky byly vytvořeny při pomocí leucinových zipů. (Kostelny ct al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)). Peptidy s motivem leucinového zipu u Fos a Jun proteinů jsou spojeny s Fab‘ částí dvou různých protilátek genovou fúzí. Homodimery protilátek jsou redukovány v pantové oblasti za tvorby monomerů a poté jsou okysličeny za tvorby heterodimerů protilátek. Tento způsob může být také použit pro tvorbu homodimerů protilátek. Technologie „dvojprotilátek“ popsaná v Hollinger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) poskytuje alternativní způsob přípravy dvoj specifických fragmentů protilátek. Fragmenty obsahují variabilní doménu těžkého řetězce (Vh) spojenou s variabilní doménou lehkého řetězce (V_L) spojovačem, který je tak krátký, že umožňuje spojení mezi dvěma doménami na stejném řetězci. Takto jsou V_H a Vl domény jednoho fragmentu nuceny párovat se s obdobnými Vl a Vh doménami jiného fragmentu, takže tak tvoří dvě antigen vázající místa. Jiný způsob přípravy dvoj specifických fragmentů protilátek pomocí jednořetězcových Fy (sF_v) dimerů byl také popsán (Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)).

Jsou zamýšleny také protilátky s více než dvěmi valencemi. Například, mohou být připraveny troj specifické protilátky (Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)).

Z- «·· · · · “ 16 ·· ··· ·· ·· ·· ··

Molekuly kyseliny nukleové kódující varianty polypeptidů jsou připravovány různými způsoby známými v současném stavu techniky. Tyto způsoby zahrnují izolaci z přírodního zdroje (v případě přirozeně se vyskytujících variant aminokyselinových sekvencí), nebo přípravu oligonukleotidem zprostředkované (nebo místně řízené) mutageneze, PCR mutagenezi, nebo kazetovou mutagenezi již dříve připravené varianty nebo ne-variantní verze polypeptidů.

Může být požadováno, aby protilátka podle vynálezu byla modifikována s ohledem na efektorovou funkci, např. tak, aby byla zvýšena vazebnost Fc receptoru. To může být dosaženo uskutečněním záměn jedné nebo více aminokyselin v Fc oblasti protilátky. Jinak také mohou být do Fc oblasti zavedeny cysteinové zbytky, aby tak mohlo dojít k tvorbě disulfidické vazby uvnitř řetězce v této oblasti.

Pro zvýšení poločasu rozpadu protilátky v séru může být do protilátky vložen záchranný vazebný epitop receptoru (zvláště do fragmentu protilátky) jak je popsáno například v US 5 739 277. Zde používaný pojem „záchranný vazebný epitop receptoru“ se týká epitopu v Fc oblasti IgG molekuly (např. IgGi, IgG2, IgG3, nebo IgG₄), který je zodpovědný za zvýšení poločasu rozpadu IgG molekuly v séru in vivo.

Zde jsou uvažovány i další obměny protilátek. Například, protilátka může být spojena s množstvím neproteinových polymerů, např. polyethylenglykol, polypropyleglykol, polyoxyalkyleny, nebo kopolymery polyethylenglykolu a polypropylenglykolu.

B. Vložení kyseliny nukleové do množícího se vektoru

Heterologní kyselina nukleová (např., cDNA nebo genomová DNA) je vhodně vložena do množícího se vektoru, aby došlo k expresi v bakteriích pod kontrolou vhodného promotoru. Mnoho vektorů je dostupných pro tento účel, a výběr vhodného vektoru bude záviset hlavně na velikosti nukleové kyseliny, která má být do vektoru vložena a na konkrétních hostitelských buňkách, které mají být vektorem transformovány. Každý vektor obsahuje různé komponenty v závislosti na konkrétních hostitelských buňkách, se kterými jsou slučitelné. V závislosti na konkrétním typu hostitele zahrnuje vektor obyčejně, i když ne pokaždé, jeden nebo více následujících komponent: signální sekvence, počátek replikace, jeden nebo více znakových genů, promotor, sekvenci terminace transkripce.

Obecně, plazmidové vektory obsahující replikon a kontrolní sekvence, které jsou odvozeny od druhů slučitelných s hostitelskými buňkami, jsou používány ve spojení s E. coli hostiteli. Vektor obyčejně nese replikační místo, stejně tak jako znakové sekvence, které jsou schopné poskytnout fenotypový výběr u transformovaných buněk. Například, E. coli je typicky transformována pBR322, plazmidem odvozeným od E. coli druhů (viz, např., Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)). pBR322 obsahuje geny pro odolnost proti ampicilinu a tetracyklinu a tím poskytuje snadný ·· ···· • · • · prostředek určení transformovaných buněk. Plazmid pBR322 nebo jiné bakteriální plazmidy nebo fágy také obyčejně obsahují, nebo jsou pozměněny tak aby obsahovaly, promotory, které mohou být použity u E. coli hostitelských buňkách, aby došlo k expresi výběrových znakových genů.

I) Signální sekvence

DNA kódující určitý polypeptid může být exprimován přímo, ale také fúzně s jiným polypeptidem, nej výhodněj i má signální sekvence nebo jiný polypeptid specifické štěpné místo na N-konci zralého polypeptidů. Obecně, signální sekvence může být jako součást vektoru, nebo může být částí DNA pro polypeptid, která je vložena do vektoru. Vybraná heterologní signální sekvence by měla být rozpoznána a zpracována (např. štěpena signální peptidázou) hostitelskými buňkami.

Pro prokaryotické hostitelské buňky, které nerozpoznávají a nezpracují původní nebo eukaryotickou polypeptidovou signální sekvenci, je signální sekvence nahrazena vybranou prokaryotickou signální sekvencí, například, ze skupiny obsahující alkalickou fosfatázu, penicilinázu, lpp, nebo vedoucí sekvencí tepelně stálého enterotoxinu II.

II) Počátek replikace

Expresní vektory obsahují sekvence nukleové kyseliny, které umožňují množení vektorů v jedněch nebo více vybraných hostitelských buňkách. Takové sekvence jsou dobře známé pro množství bakterií. Počátek replikace z plazmidu pBR322 je vhodný pro většinu Gram-negativních bakterií jako je E. coli.

III) Výběrové geny

Expresní vektory obyčejně obsahují výběrový gen, často označován také jako selekční markér. Tento gen kóduje protein, který je potřebný pro přežití nebo růst transformovaných hostitelských buněk rostoucích ve zvoleném kultivačním médiu. Hostitelské buňky, které nejsou transformovány vektorem obsahujícím výběrový gen, v kultivačním médiu nepřežijí. Tento selekční markér je oddělen od používaných genetických znaků a je popsán v tomto vynálezu. Typické výběrové geny kódují proteiny, které a) udělují odolnost proti antibiotikům nebo jiným toxinům, např., ampicilin, neomycin, methotrexát, nebo tetracyklin, b) doplňují auxotrofní nedostatky jiné než které jsou způsobeny přítomností genetických znaků, nebo c) nahrazují kritické živiny, které nejsou dostupné z celkového média, např. gen kódující D-alanin racemázu pro Bacilli.

Příkladem výběrového schéma je použití léčiva, které zastavuje růst hostitelských buněk. V tomto případě tyto buňky, které jsou úspěšně transformovány požadovanou nukleovou kyselinou, produkují polypeptid udělující odolnost proti léčivu a tudíž i v přežití v tomto • · • ·

• · · • · · • · · • · · · • · · · výběrovém prostředí. Příklady takových dominantních výběrů používají léčiva neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1:327 (1982)), kyselinu mykofenolovou (Mulligan et al., Science, 209:1422 (1980)) nebo hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)). Tři výše zmíněné příklady používají bakteriální geny pod eukaryotickou kontrolou pro vyjádření odolnosti proti přijatelnému léčivu G418 nebo neomycinu (geneticin), xgpt (mykofenolová kyselina), nebo hygromycinu.

IV) Promotor

Expresní vektor pro produkci požadovaného polypeptidů obsahuje vhodný promotor, který je rozpoznáván hostitelským organizmem a je operabilně spojen s nukleovou kyselinou kódující požadovaný polypeptid. Promotory vhodné pro použití u prokaryotických hostitelů zahrnují beta-laktamázový a laktózový promotorový systém (Chang et al., Nátuře, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nátuře, 281:544 (1979)), arabinózový promotorový systém (Guzman et al., J. Bacteriol., 174:7716-7728 (1992)), alkalickou fosfatázu, tryptofan (trp) promotorový systém (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) a EP 36 776) a hybridové promotory, jako je tac promotor (deBoer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Nicméně, také jiné známé bakteriální promotory jsou vhodné. Jejich nukleotidové sekvence byly publikovány, a tím je pro odborníka v současném stavu techniky možné operabilně vložit tyto sekvence do DNA kódující požadovaný polypeptid (Siebenlist et al.. Cell, 20:269 (1980)) při použití spojovacích částí nebo adaptorů pro doplnění jakýchkoliv požadovaných restrikčních míst.

Promotory, které jsou používány v bakteriálních systémech, také obyčejně obsahují Shineovu-Dalgarnovu sekvenci (S.D.) operabilně spojenou s DNA kódující požadovaný polypeptid. Promotor může být z bakteriálního DNA zdroje odstraněn štěpením restrikčními enzymy a může být vložen do vektoru obsahujícím požadovanou DNA.

V) Konstrukce a analýza vektorů

Konstrukce vhodných vektorů obsahujících jednu nebo více výše zmiňovaných složek využívá standardní vazebné techniky. Izolované plazmidy nebo fragmenty DNA jsou štěpeny, upraveny a znovu spojeny za tvorby požadovaných plazmidů.

Pro potvrzení správné sekvence ve vytvořených plazmidech jsou spojovací směsi použity pro transformaci E coli K12 kmene 294 (ATCC 31,446) nebo jiných kmenů, a úspěšné transformanty jsou vybírány, tam kde je to vhodné, pomocí odolnosti proti ampicilinu nebo tetracyklinu. Plazmidy z transformantů jsou připraveny, analyzovány štěpením restrikční endonukleázou, a/nebo sekvenovány podle metody v Sanger et al., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 nebo Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981), nebo způsobem podle Maxam et al., Method in Enzymology, 65:499 (1980).

• · • ·

C. Výběr a transformace hostitelských buněk

E. coli hostitelské buňky jako původní hostitelské buňky pro expresi plazmidů zde zahrnují E. coli W3110 (ATCCV 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, a E. coli X1776 (ATCC 31,537). Tyto příklady jsou spíše názorné než limitující. Mutantní buňky jakýchkoliv výše zmiňovaných kmenů mohou být také použity jako počáteční hostitelské buňky, které jsou poté dále mutovány tak, že obsahují alespoň minimální zde požadovaný genotyp. E. coli kmen W3110 je nejvýhodněji původní hostitel, protože je to společný hostitelský kmen pro kvašení rekombinantního DNA produktu. Příklady počátečních E. coli hostitelů používaných jako původní hostitelé spolu s jejich genotypy jsou zahrnuty v tabulce níže:

Kmen	Genotyp
W3110	K-12 F' lambda' IN(rrnD-rrnE)l
1A2	W3110 )JhuA
9E4	W3110 )fhuA ptr3
27A7	N\^r3W0 )fhuA ptr3 phoA)E15 )(argF-lac) 169
27C6	//31U) )fhuA ptr3 phoA)E15 )(argF-lac) 169 )ompT
27C7	W3110 )fhuA ptr3 phoA)E15 )(argF-lac) 169 )ompT degP41 Qpstl-kan^R)
33D3	W3110 )fhuA ptr3 laclq lacL8)ompT dcgP41 ()pstI-kan^R)
36F8	W3110//1W phoA)E15)(argF-lac) 169ptr3 degP41 ()pstI-kan^R) ilvG2096^R
43D3	W3110 )fhuA ptr3 phoA)E15 )(argF-lac) 169 )ompT dcgP41 ()Pstl-kan^R) HvG2096^r
43E7	W3110 )fhuA )(argF-lac) 169 )ompT ptr3 phoA)E15 degP41 ()Pstl-kan^s) ilvG2096^R
44D6	WillO)fhuAptr3)(argF-lac) 169 degP41 ()pstl-kan^s))ompTilvG2096^R
45F8	W3110 )fhuA ptr3 )(argF-lac) 169 degP41 0pstl-kan^s))ompTphoS* (Γ10Υ) ilvG2096^R
45F9	W3110ý/Zzw4 ptr3 )(argF-lac) 169 degP41 ()pstl-kan^s))ompT ilvG2096^R phoS* (Γ10Υ) )cyo:kan^R

Vhodné jsou také meziprodukty v přípravě kmene 26F8, např., 27B4 (US 5 304 472) a 35E7 (spontánní teplotně odolné kolonie rostou lépe než 27B4). Další vhodný kmen je E. coli kmen mající mutantní periplazmatickou proteinázu popsanou v US 4 946 783, vydaný 7.8. 1990.

Kmeny podle navrhovaného vynálezu mohou být produkovány chromozomálním začleněním rodičovského kmene nebo jinými technikami, které jsou zahrnuty a vysvětleny níže v příkladech.

44··

Nukleová kyselina kódující polypeptid je vložena do hostitelských buněk. Nejvýhodněji je toho dosaženo transformací hostitelských buněk výše popsanými expresními vektory a kultivací v běžném výživném médiu, které je pozměněno tak, aby bylo vhodné pro vyvolání různých promotorů.

Transformace znamená vložení DNA do organizmu tak, že DNA se množí jako extrachromozomální element nebo jako chromozomální součást. V závislosti na použitých hostitelských buňkách je transformace provedena standardními způsoby, které jsou vhodné pro tyto buňky. Pro prokaryotické buňky nebo pro jiné buňky, které obsahují pevnou buněčnou stěnu je obecně používán chlorid vápenatý, jak je popsáno v sekci 1.82 v Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Jiný způsob transformace používá polyethylenglykol/DMSO, jak je popsáno v Chung and Miller, Nucleic Acids Res., 16:3580 (1988). Dalším způsobem je použití techniky nazvané elektroporace.

D. Kultivace hostitelských buněk

Prokaryotické buňky používané k produkci určitého polypeptidu jsou kultivovány ve vhodném médiu, jak je popsáno obyčejně v Sambrook et al., výše. Kultivační podmínky, jako je teplota, pH a podobně, jsou stejné jako pro hostitelské buňky určené pro expresi a budou jasné odborníkům v současném stavu techniky.

Při použití promotoru alkalické fosfatázy, jsou E. coli buňky používané k produkci určitého polypeptidu podle navrhovaného vynálezu kultivovány ve vhodném médiu, ve kterém může být promotor alkalické fosfatázy částečně nebo úplně indukován, tak jak je popsáno obecně např., v Sambrook et al., výše. Kultivace nikdy neprobíhá v nepřítomnosti anorganického fosfátu nebo při určité hladině fosfátů. Nejprve, médium obsahuje anorganický fosfát v množství nad hladinou indukce syntézy proteinu a které je dostatečné pro růst bakterií. Jak buňky rostou a spotřebují fosfát, snižuje se hladina fosfátu v médiu a tím je spuštěna indukce syntézy polypeptidu.

Další potřebné složky média kromě zdroje uhlíku, dusíku a anorganického fosfátu, mohou být také zahrnuty do média ve vhodných koncentracích, samostatně nebo jako směs s jinou složkou nebo médiem, jako je komplexní zdroj dusíku. V závislosti hlavně na hostitelském organismu se může pH média pohybovat od 5 až 9.

Jestliže promotorem je inducibilní promotor, jsou typicky buňky pro indukci kultivovány až do dosažení určité optické hustoty, např. při použití postupu vysoké buněčné hustoty, hodnota A550 přibližně 200 je bodem, kdy indukce začíná (např. přidáním vyvolávající látky, odstraněním složky média, apod.), a je vyvolána exprese genu kódující určitý polypeptid.

• · ··· ·

E. Detekce exprese

Exprese genu může být měřena přímo ve vzorku, například běžným Southern blottingem, northem blottingem, kdy se kvantifikuje transkripce mRNA (Thomas, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), dot blottingem (DNA analýza), nebo in šitu hybridizací, při použití vhodné označené sondy, založené na sekvenci polypeptidu. Mohou být používány různé značky, nej běžněji radioizotopy, obzvláště P. Nicméně, mohou být použity i jiné techniky, jako je použití nukleotidů označených biotinem pro vložení do polynukleotidu. Biotin poté slouží jako místo vazby pro avidin nebo protilátky, které mohou být značeny velkým množstvím značek, jako jsou radioaktivní nuklidy, fluorescenty, enzymy a podobně. Jinak mohou být pro detekci proteinu použity kvantitativní rozbory nebo gely.

Pro sekreci produktu exprimovaného genu jsou hostitelské buňky kultivovány za podmínek dostatečných pro sekreci produktu genu. Tyto podmínky zahrnují např. teplotu, živiny a podmínky buněčné hustoty, které umožňují buněčnou sekreci. Navíc, tyto podmínky jsou takové, při kterých jsou buňky schopné běžných buněčných funkcí, jako je transkripce, translace a prostoupení proteinů z jednoho buněčného prostoru do jiného, jak je známo odborníkům v současném stavu techniky.

F. Přečištění polypeptidů

Příkladem vhodných čistících postupů jsou následující postupy, jednotlivě nebo v kombinaci, přičemž použití specifických metod je v závislosti na typu polypeptidu: rozdělení na imunoafinních kolonách nebo na kolonách s výměnou iontů; srážení etanolem; HPLC s reverzními fázemi; hydrofobní chromatografie; chromatografie na křemíku; chromatografie na iontoměničové pryskyřici, jako je S-SEPHAROSE^(TM) a DEAE; chromatofokusace; SDS elektroforéza; srážení sulfátem amonným; a použití gelové filtrace, například SEPHADEX™ G75.

Monoklonální protilátky mohou být vhodně odděleny z kultivačního média běžnými postupy čištění protilátek, jako je například protein A-Sepharose, hydroxylapatitová chromatografie, gelová elektroforéza, dialýza nebo afinní chromatografie.

Vynález bude jasnější v následujících příkladech. Ty by ale nicméně neměly omezovat rámec vynálezu. Veškerá literatura a citace patentů jsou zde začleněny svým odkazem.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obr. la-le ukazují celkovou nukleotidovou a kódující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NOS:1 a 2) expresní kazety pro přípravu pY0317, produkčního plazmidu pro anti-VEGF Fab. Tučně jsou vyznačeny CDR zbytky z původní myší A.4.6.1 protilátky. Kurzívou vyznačené ·· ···· zbytky a podtržené zbytky představují soustavu myších zbytků, které jsou vyžadovány pro vazbu antigenu.

Obr. 2a a 2b ukazuj í schéma plazmidu ρY0317 (obr. 2a) a tvorbu plazmidu ρ Y0317tet20 (obr. 2a a 2b).

Obr. 3 ukazuje schéma plazmidu pAPApo2-P2RU.

Obr. 4 ukazuje cDNA nukleotidovou sekvenci lidského Apo-2 ligandu (SEQ ID NO:3) a jeho odvozenou aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO:4). „N“ v nukleotidové pozici 447 (v SEQ ID NO:3) představuje nukleotidovou bázi, která může být „T“ a „G“.

Obr. 5 znázorňuje schéma odvozování kmenů E. coli 59A7, 49A5 a 43H1.

Obr. 6 znázorňuje výsledek 2-D gelu pelety kvašených buněk odvozených od kmene 49A5 (pre-pozitivní kmen), exprimující fúzní rhuFab'2 anti-CD18-LZ protein jako heterologní polypeptid. Všechny LC příbuzné skvrny jsou zakroužkovány.

Obr. 7 znázorňuje výsledek 2-D gelu pelety kvašených buněk odvozených od kmene 43H1 (prc-negativní kmen), exprimující fúzní rhuFab'2 anti-CD18-LZ protein jako heterologní polypeptid. V tomto gelu LC-štěpené produkty zmizely.

Obr. 8 ukazuje pět sloupců nalezených rozborem při použití AME5™/kolony reverzní fáze a tak poskytuje porovnání štěpení těchto nalezených protilátkových fragmentů rhuFab'2-LZ (xCD18). Osa y představuje specifickou oblast vrcholů sloupců 1 až 5. Osa x ukazuje tři rhuFab'2-LZ (xCD18) produkční kmeny, 43H1 (prc-), 49A5 (prc+) a 58H2 (prc-obnovený 43H1). Šedý sloupec se silným okrajem je LC-115; černý sloupec je LC, bílý sloupec je LC dimer, šedý sloupec s tenkým okrajem je molekula podobná Fab, a sloupec s cihlovým vzorem je Fab'2-LZ. Je patrné, že sloupec 1 (LC-115) mizí uprc-negativního kmene.

Obr. 9 ukazuje růstové profily standardního kvašení buněk o vysoké hustotě u prc-negativního kmene bez mutantního spr genu (58B3 transformovány s pSl 130) (kostky) a prc-negativního kmene s mutantním spr genem (59A7 transformovány s pSl 130) (kosočtverce), vyjádřené jako funkce hodin kvašení při OD 550.

Obr. 10 znázorňuje sekvenci humanizovaného anti-CD18 kappa LC s vypočtenými hodnotami pí požadovaných LC degradačních produktů. Lomítky zvýrazněná štěpení byly potvrzeny hmotnostní spektrometrií. Viz tabulka 3 níže.

Obr. 11 znázorňuje gel se sedmi dráhami při použití různých hostitelů a tří různých typů proteinů. Tento gel ukazuje, že 20-kDa LC fragment (LC 182) není přítomen u 43H1 (prc-) buněk exprimujících fúzní molekuly anti-VEGF Fab a protitkáňový faktor Fab'2-LZ. V dráze 1 je protitkáňový faktor Fab'2-LZ-6xHis, hostitelský kmen 33B6, v dráze 2 je protitkáňový faktor Fab'2-LZ-6xHis, hostitelský kmen 43H1, v dráze 3 je anti-CD18 F(ab')2 LZ 6xHis, hostitelský ·· ··· ·

kmen 49A5, v dráze 4 je anti-CD18 F(ab')2-LZ-6xHis, hostitelský kmen 41H1, v dráze 5 je pBR322, hostitelský kmen 49A5, v dráze 6 je anti-VEGF Fab, hostitelský kmen 43H1, a v dráze 7 je anti-VEGF Fab, hostitelský kmen 43E7. Označení HC a H představuje těžký řetězec a LC a L předstvuje lehký řetězec.

Obr. 12 znázorňuje výsledek 2-D gelu pelety buněk z třepajících baněk odvozených od kmene 59A7 (pcr-negativní kmen) exprimující anti-VEGF Fab (pY0317tet20) jako heterologní polypeptid. Na tomto gelu LC-štěpené produkty a dva HC-štěpené fragmenty nalezené v pre-pozitivních buněk mizí. Dále jsou vidět dva oddělené HC fragmenty detekované pouze u 59A7, které jsou OmpT- nebo Ptr3-štěpené produkty.

Obr. 13 znázorňuje výsledek 2-D gelu pelety buněk z třepajících baněk odvozených od kmene 60C1 (pcr-pozitivní kmen) exprimující anti-VEGF Fab (pY0317tet20) jako heterologní polypeptid. Na tomto gelu byly detekovány mnohonásobné LC-štěpené fragmenty a dva HC-štěpené fragmenty.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1.

Materiál a metody

A. Exprese plazmidů

1. Plazmidy pro expresi rhuFab‘2 LZ (xCDl 8) a označené deriváty pSl130

Plazmid pSl 130 je plazmid odvozený od pBR322, který je popsán v US 6 180 367 a 6 258 560. Syntéza rhuFab'2 LZ (xCD18) je regulována promotorem E. coli alkalické fosfatázy. Jestliže je AP promotor aktivován spotřebováním fosfátu, tvoří se dicistroní mRNA sekvence v pořadí STU signál-sekvence kódující kappa lehký řetězec; STU signál-sekvence kódující těžký řetězec, následuje sekvence leucinového zipu. Lambda transkripční terminátor byl umístěn v blízkosti translačního terminačního kodonu.

pcyc34

Plazmid pcyc34 je tacll promotorový doplněk pSl 130.

pxCD18-7T3

Plazmid s dvojitým promotorem pxCD18-7T3 obsahující dvě oddělené translační jednotky umožňuje současné oddělení transkripce lehkého řetězce od transkripce těžkého řetězce. Jako u pSl 130 zůstává lehký řetězec pod kontrolou phoA promotoru. Nicméně, u pxCD18-7T3 po kódující sekvenci lehkého řetězce následuje λίο transkripční terminátor. Za tento terminátor byl

44·· přidán tacll promotor pro kontrolu transkripce fragmentu těžkého řetězce/C-terminálního leucinového zipu (DeBoer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Po této kódující sekvenci následuje druhý λίο transkripční terminátor. Varianty tichého kodonu sekvence STU signálu byly použity pro řízení sekrece obou řetězců (Simmons and Yansura, Nátuře Biotechnology, 14:629-634 (1996)). Konkrétně, nukleotidy v sekvenci STU signálu byly pozměněny tak, aby lehký řetězec měl TIR relativní sílu 7 a těžký řetězec měl TIR relativní sílu 3, a poslední tři nukleotidy signální sekvence předcházející lehký i těžký řetězec byly GCT. V tomto dvojitém promotorovém systému jsou sekvence phoA promotoru a DNA pro lehké a těžké řetězce protilátky stejné jako u pS 1130.

pAB3

Plazmid pAB3 je navržen tak, aby exprimoval anti-CD18 F(ab')2 vperiplazmě E. coli pod kontrolou promotoru alkalické fosfatázy (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9 (21):5671-5678 (1981)) a má leucinový zip a je označen His. Tepelně stabilní signální sekvence enterotoxinu II (Picken et al., Infect. Immun., 42:269-275 (1983)) předchází lehký a těžký řetězec a na C-terminální konec těžkého řetězce je připojen GCN4 leucinový zip kvasinek následováný šesti histidinovými zbytky. Kódující sekvence lehkého a těžkého řetězce jsou v polycistronním postavení s λο transkripčním terminátorem (Scholtissek and Grosse, Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987)) následující gen těžkého řetězce.

Plazmid pAB3 byl vytvořen spojením tří DNA fragmentů dohromady, první je vektor pSl 130, ve kterém byl odstraněn malý fragment KpnI-SphI. Druhá část byla tvořena fragmentem pSl 130 tvořeným přibližně 645 páry bází KpnI-SphI. Konečnou částí byl syntetický duplex DNA s následující sekvencí:

5‘-AGCTTGTCGGGGAGCGCCATCACCATCACCATCACTAAGCATG (SEQ ID NO:6) ACAGCCCCTCGCGGTAGTGGTAGTGGTAGTGATTC-5‘ (SEQ ID NO:7) pAB21

Plazmid pAB21 je odvozený od pAB3, ve kterém je šest histidinových zbytků na C-terminálním konci těžkého řetězce nahrazeno šesti zbytky lysinu. Tento plazmid byl vytvořen stejným způsobem jako pAB3 kromě toho, že syntetická DNA použita pro vazbu byla následující: 5‘-AGCTTGTCGGGGAGCGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGTAAGCATG (SEQ ID NO:8)

ACAGCCCCTCGCGTTTTTCTTTTTCTTTTTCATTC-5‘ (SEQ ID NO:7)

2. Plazmid pro expresi anti-TF Fab‘2-LZ-6xhis

Plazmid D3H44-F(ab‘)2 (známý také jako pD3h44f2), vytvořený pro přímou produkci protitkáňového faktoru Fab‘2-leucinový zip-6xhis, má přesně stejnou základní DNA sekvenci • 9 • 9 ·99· « · · · · · · · * ♦ · ··· 9··· 999

I ζ 9 99 99 999 · · · · 9 9 · 9999 ··« ·· 99 ·· ·· jako ρΑΒ3 kromě toho, že variabilní oblasti pro HC a LC byly změněny zxCD18 VL/VH na xTF VL/VH. Tvorba plazmidu je popsána v WO 01/70984, publikovaný 27. 9. 2001.

Konkrétně, plasmid pro expresi anti-TF Fab (D3H44-F)ab)) byl připraven následovně: Plazmid pEMXl použitý pro mutagenezi a expresi F(ab) fragmentů v E. coli byl popsán v Werther et al., J. Immunol., 157:4986-4995 (1996). Krátce, plazmid obsahuje DNA fragment kódující konvenční lidský lehký řetězec κ podskupiny I (VFkI-CF), konvenční lidský těžký řetězec podskupiny III (VHIII-CH1) a promotor alkalické fosfatázy. Použití konvenčních sekvencí pro VL a VH bylo popsáno v Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992); Carter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992).

Místně řízená mutageneze (Kunkel, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985)) byla provedena na pEMXl obsahujícím deoxyuridin. Šest CDR bylo změněno na myší D3 sekvenci; zbytky zahrnuté v každém CDR byly odvozeny od sekvencí založených na CDR vymezení (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5, Public Health Service (National Institutes of Heatlth, Bethesda, MD (1991)), kromě CDR-H1, který byl definován kombinací CDR-H1 vymezení od Kabat et al., výše, a Chothia et al., Nátuře, 342:877-833 (1989), tj. CDR-H1 byl definován jako rozšiřující zbytky H26-H35 v těžkém řetězci. D3H44-F(ab) tak kóduje F(ab) obsahující celou lidskou soustavu (VLk podskupina I a VH podskupina III) s šesti kompletními myšími CDR sekvencemi.

D3H44-F(ab‘)2 byl vytvořen přidáním spojení těžkého řetězce (CPPCPAPELLGG; SEQ ID NO: 10) k C-terminálnímu konci D3H44-F(ab), s následujícím GCN4 leucinovým zipem a 6 histidiny pro izolaci (viz popis pro pAB3 výše, pro leucinový zip a hisxó).

3. Plazmidy pro expresi anti-VEGF Fab pY0317

Afinně zralý anti-VEGF Fab protein Y0317 je popsán v Chen et al., J. Mol. Biol., 293:865-881 (1999). Pro tvorbu plazmidu produkující protein pY0317, krátce, expresní kazeta byla klonována do kostry E. coli plazmidu pBR322 v EcoRI místě (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43:77-90 (1978)). Expresní kazeta obsahovala alespoň následující základní složky: 1) phoA promotor pro řízení transkripce; 2) λΐο terminátor k ukončení transkripce; a 3) ShineovaDalgarnova sekvence z E. coli trp nebo z genu tepelně stabilního enterotoxinu II (STU), nebo kombinaci obojího, k usnadnění translace. Základní složky bakteriálních expresních kazet jsou známé v současném stavu techniky a byly popsány například v Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9(21):5671-5678 (1981) (pro phoA promotor); Scholtissek and Grosse, Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987) (pro λΐο terminátor); Yanofsky et al., Nucleic Acids Res., 9:6647-6668 (1981) (pro trp); Picken et al., Infect. Immun., 42:269-275 (1983) (pro STU); a Chang et al., Gene, ·· ····

9« 9«

9 9 9

9 99

9 9 9

99

9 ·

9 9

55:189-196 (1987) (pro kombinaci použití trp a STU Shineovu-Dalgarnovu sekvenci). Dále, kódující sekvenci pro lehký a těžký řetězec vpY0317 pro produkci anti-VEGF Fab předchází STU signální sekvence nebo varianty tichého kodonu, které řídí sekreci proteinu do periplazmy. Picken et al., Infect. Immun., 42:269-275 (1983); Simmons and Yansura, Nátuře Biotechnology, 14:629-634 (1996). Nukleotidové a aminokyselinové sekvence pro 1952 párů bází expresní kazety vložené do EcoRI místa pro produkci rekombinantního proteinu jsou ukázány na obrázku 1 (SEQ ID NOS: 1 a 2).

RhuFab V2 Y0317 byl vytvořen humanizací myší A.4.6.1 (Presta et al., Cancer Res., 57:45934599 (1997) monoklonální protilátky při použití dříve popsaného postupu pro jiné protilátky (Carter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 89:4285-4289 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623-2632 (1993); Werther et al., J. Immunol. 157: 4986-4995 (1996)). Krátce, cDNA kódující muMAb A.4.6.1 variabilní lehké a variabilní těžké řetězce byly izolovány pomocí RTPCR z buněk hybridomu produkující myší monoklonální protilátky. Tyto cDNA byly klonovány a spojeny s lidskými CL a lidskými DH1 doménami (Werther et al., J. Immunol., 157:4986-4995 (1996)), za tvorby myšího-lidského chimérického Fab. Šest komplement určujících oblastí (CDR) (znázorněny na obrázku 1 tučným písmem) bylo vloženo do již dříve humanizovaného protilátkového vektoru, který kóduje konvenční lidský κ lehký řetězec podskupiny I a konvenční lidský těžký řetězec podskupiny III (Carter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992)). Přenos pouhých CDR zbytků do lidské struktury způsobil 1000-násobnou redukci vazby k VEGF antigenů. Různé strukturní zbytky blízko CDR (znázorněno na obrázku 1 kurzívou a podtržením) byly také změněny pro zlepšení vazby cílové struktury (Presta et al., Cancer Res., 57:4593-4599 (1997)). Dohromady, sedm zbytků těžkého řetězce a jeden zbytek lehkého řetězce bylo změněno mimo CDR. Těžké a lehké řetězce byly poté přemístěny do fágového vektoru (Bača et al., J. Biol. Chem., 272:10678-10684 (1997)), a nahradily hGH gen vphGHam-g3 (Bass et al., Proteins, 8:309-314 (1990)). Místně směrovaná mutageneze byla použita pro změnu VL Met4Leu, aby se zabránilo oxidaci methioninu a VH Thr231Leu pro snažší klonováni do genuIII. Tento vektor je pojmenován Y0101 a byl použit jako počáteční bod pro optimalizaci CDR ve vazbě na VEGF antigen (Muller et al., Structure, 6:1153-1167 (1998)). Jen mutace v CDR HI a H3 zlepšovaly vazbu a byly vloženy do konečné verze pY0317. Změny plazmidu pYOlOl na pY0317 jsou: Thr28Asp, Asn31His, HislOlTyr, Serl05Thr. Všechny tyto změny jsou ve variabilní oblasti těžkého řetězce. Plazmid pY0317 je Fab fágový vektor. Schéma tohoto plazmidu je ukázáno na obrázku 2a.

pY0317tet20 • 9 ·* **··

I · · « » · · « ·· ··

Plazmid pY0317tet20 byl vytvořen pro přímou produkci rhuFab V-2 v E. coli. Obrázky 2a a 2b vyznačují vývojový diagram tvorby plazmidu, která začíná spY0317. Plazmid pY0317tet20 je pozměněná forma dobře popsaného pBR322 plazmidu. Z pBR322 části plazmidu byl odstraněn 639-párů bází Aval-Pvull fragment. Toto odejmutí má za následek odstranění rop genu, který je zahrnutý v řízení počtu kopií (Cesareni et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79:6313-6317 (1982)). Proto tedy má plazmid mírně zvýšený počet kopií ve srovnání spBR322. Expresní kazeta, která má 1952 párů bází (obrázek 1) byla vložena do EcoRI místa pro produkci rekombinantního proteinu. Plazmid pY0317tet20 je rezistentní na tetracyklinová a β-laktamová antibiotika. Expresní kazeta obsahuje jednu kopii lehkého řetězce a těžkého řetězce spojené v tandemu. Transkripce každého genu do jednolivé dicistronní mRNA je řízena E. coli phoN promotorem (Chang et al., Gene, 44:121-125 (1986)). Signály počátku translace pro každý řetězec poskytují E. coli STII (tepelně stabilní enterotoxin) Shineova-Dalgarnova sekvence. Translace každého řetězce začíná pomocí 23 zbytků STII signálního peptidu (Picken et al., Infection and Immunity, 42:269-275 (1983)), které řídí translokaci peptidů přes cytoplazmatickou membránu do periplazmatického prostoru. STII signální peptid je poté odstraněn E. coli vedoucí peptidázou. Po sekreci do periplazmy se lehké a těžké řetězce uspořádají do jejich přirozené konformace a jsou kovalentně vázaný mezimolekulární disulfidickou vazbou.

Do konečného vektoru byla modifikací pY0317 vložena rezistence na tetracyklin (viz obr. 2a a 2b). SapUApal fragment pY0317 mající 3642 párů bází, který zahrnuje počátek replikace pBR322, β-laktamázový gen, phok promotor, celý lehký řetězec, a N-konec těžkého řetězce (VH), byl vložen do SapUApal fragmentu p6G4Vl 1N35A.PEG mající 2738 párů bází. Tento druhý fragment obsahuje CHI oblast těžkého řetězce a gen rezistence na tetracyklin zpBR322. Tento fragment dále obsahuje čtyři další aminokyseliny na karboxylovém konci těžkého řetězce pro místně specifickou modifikaci proteinu. Oblast obsahující čtyři další zbytky a CHI oblast byly odstraněny štěpením ^óHII/Hpnl a nahrazeny /NsHII/Yůuí fragmentem pY0317, a taky byla navrácena sekvence původního těžkého řetězce a byla odstraněna oblast s místně specifickou modifikací. Štěpení Xbal bylo provedeno nejdříve a převislý konec byl doplněn Klenowem a deoxynukleotidy. Poté následovalo štěpení ΖΝλΉΙΙ a čištění 433 bp fragmentu z gelu. Konečné zpracování plazmidu představuje nahrazení Nhel až Ndel fragmentu pBR322 za Nhel/Ndel fragmentu pBR322 obsahující 639 bp Aval-Pvull deleci. Konečný plazmid pY0317tet20 je rezistentní na tetracyklin a β-Iaktamázová antibiotika, a obsahujephoN promotor a geny kódující lehké a těžké řetězce anti-VEGF.

4. Plazmid pro expresi Apo2L ·· ···· ·· • · ·

• · · · • · · • ··

pAPApo2-P2RU je popsán v WO 01/00832 vydaný 4.1.2001. Krátce, tento plazmid, konstrukt, který je ukázán na obrázku 3, kóduje společnou expresi Apo-2L (aminokyselinové zbytky 114 až 281) a tRNA kódující pro2 a argU, jejichž společná exprese je řízena promotorem alkalické fosfatázy. Plazmid pAPApo2-P2RU odvozený od pBR322 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43:77-90 (1978)), byl použit pro produkci Apo-2L v£. coli. Transkripční a translační sekvence důležité pro expresi Apo-2L poskytuje promotor alkalické fosfatázy a trp Shineova-Dalgarnova sekvence, jak je popsáno pro plazmid phGHl (Chang et al., Gene, 55:189196 (1987)). Kódující sekvence pro Apo-2L (114 až 281) je umístěna za promotorem a Shineovóu-Dalgarnovou sekvencí a předchází ji počáteční methionin. Kódující sekvence zahrnuje nukleotidy (znázorněno na obrázku 4) kódující zbytky 114 až 281 v Apo-2L (obr. 4 (SEQ ID NOS:3 a 4, pro nukleotidové a aminokyselinové sekvence)) kromě toho, že kodon kódující zbytek Prol 19 je změněn na „CCG“ místo „CCT“, aby se zabránilo možné sekundární struktuře. Sekvence kódující lambda to transkripční terminátor (Scholtissek et al., Nucleic Acids Res., 15:3185 (1987)) následuje Apo-2L kódující sekvenci.

Navíc, tento plazmid také zahrnuje sekvence pro expresi tRNA pro2 (Komíne et al., J. Mol. Biol., 212:579-598 (1990)) a argU/dnaY (Garcia et al., Cell, 45:453-459 (1986)). Tyto geny byly klonovány PCR z E. coli W3110 a umístěny za lambda to transkripční terminátor. Tento plazmid uděluje hostitelskému organismu rezistenci na tetracyklin a ampicilin.

B. Buněčné transformace

Kompetentní buňky příslušného kmene byly připraveny a transformovány vhodným plazmidem standardními technikami, a úspěšné transformanty byly vybírány a kultivovány v kultuře.

V případě plazmidů, které byly rezistentní na tetracyklin, byly transformanty odebrány z LB misek obsahující 20 pg/ml tetracyklinu (LB+Tet20), přečištěny, kultivovány v LB médiu s 20 pg/ml tetracyklinu v třepačce při teplotě 30 °C a poté zamraženy v DMSO při -80 °C.

V případě plazmidů pxCD18-7T3 a pcyc34 byl společně spxCD18-7T3 nebo pcyc34 transformován také další plazmid pMS421. pMS421 je plazmid odvozený od pSCIOl, který nadměrně exprimuje /aclq supresor, který potlačuje indukci tacll promotoru, pokud nebylo přidáno IPTG, které ruší toto potlačení, a který také uděluje rezistenci na spektinomycin a streptomycin. Tento plazmid poskytuje další kopie laclq chromozomálního genu pod kontrolou jeho vlastního promotoru z /«dq kmene, jehož gen je vložen do slučitelného plazmidů pSCIOl.

C. Izolace protilátek

Rozpustná frakce E. coli buněk byla připravena rozpuštěním 20 OD-ml pelety v 500 μΐ 200 mM TRIS-HC1 (pH 8) s 20 μΐ 0,1 M EDTA (pH 8) a 10 μΐ lysozymu (6 mg/ml). Tato směs byla promíchána, sonikována 7 až 10 pulzy, poté odstředěna při 15 000 otáčkách po dobu 15 minut při 4 °C. Tekutá frakce po odstředění se nazývá vysokosolný extrakt (HSE). Zbývající peleta byla použita pro analýzu nerozpustné frakce.

D. Určení proteinu

Jednorozměrná SDS-gelová elektroforéza byla použita s 4 až 12 % lineárním akrylamidovým gradientem od Novex. Konkrétně, použitý systém byl NOVEX® NuPage™ Systém, obsahující NuPAGE Bis-TRIS již připravené gely (pro proteiny mající malé nebo střední molekulové hmotnosti).

Dvojrozměrná gelová elektroforéza byla provedena podle Champion et al., Electrophoresis, 20 (4-5):994-1000 (1999)), se stálým pH gradientem (pH 3 až 10) v prvním rozměru a s lineárním akrylamidovým gradientem (9 až 18 %) v druhém rozměru, zakoupené u Amersham Pharmacia Biotech. Identifikace proteinu byla určena při použití kombinace barvení stříbrem a Coomassie modří, NH2-terminálním sekvenováním, a hmotnostní spektrometrií. Pro analytické gely byly E. coli buněčné lyzáty (přibližně 40 pg proteinu) smíchány s rehydratačním roztokem, tak jak je popsáno v Champion et al., výše. Pro izoelektrickou fokuzaci byly použity 18 centimetrové gely s nelineárním stabilním pH gradientem pro celkově 50 000 Vh.

Vzorky z gelů byly přeneseny na polyvinylidendifluoridové membrnány (PVDF, ProBlott; Applied Biosystems), tak jak je popsáno výrobcem. NH₂-terminální sekvenování proběhlo při použití 20 minutového Edmanového cyklu a násobného vzorkového horizontálního proudového reaktoru pro sekvenční analýzu PVDF-přenesených proteinů (Henzel et al., Analytical Biochemistry, 267:148-160 (1999)). Molekulové hmotnosti specifických skvrn lehkého řetězce byly určeny z MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie a kapilární LC-MS ze vzorků izolovaných z gelů (Champion et al., výše).

E. Měření cílových druhů proteinů

Pro stanovení titru anti-CD18 F(ab‘)2-LZ byla použita AME5™ dvojitá kolona s reverzními fázemi (AME5™/RP dvojitá kolona), tak jak je popsáno níže.

F. AME5^{1 m}/RP dvojitá kolona

1. Přístrojová technika a vybavení

INTEGRÁL™ stanice (od PerSeptive Biosystem) byla nastavena na dvojitý kolonový gradient. Afinní kolona obsahující anti-lehký řetězec (kappa) Fab protilátky (AME5™) navázaný na kolonu s určitými póry byla použita pro navázání cílového proteinu. Pro další určení navázaných druhů protilátek byla použita kolona reverzní fáze při kontrlované teplotě 60 °C. Aktivované aldehydové imunoafinní částice (AL-20), částice pro reverzní fázi POROS (R220), a prostředky pro náplň kolony byly získány od PerSeptive Biosystems (Cambridge, MA, USA). CPG prázdné PEEK kolony, 30 x 2,1 mm (100 μΐ) byly získány od Upchurch Scientific (Oak Harbor, WA,

·* • «

0 • 4 « · 0 ··

4 t 9 • 0 0

0» 9999 · *

0« * · • ·· 0

4 · 0

USA). E. coli vzorky byly filtrovány při použití ACRODISC™ PF stříkačky s 5 pm filtry (od Gelman Sciences).

2. Přečištění AME5™ anti-lidského kappa FAb (his-gly)4his-(lys)

Jako zaváděcí pufr se zde používá fosfátový pufr mající pH 7,2 (PBS) obsahující 9,4 mM fosfát sodný, 136,9 mM chlorid sodný, a 2,7 mM chlorid draselný. Monoklonálni protilátky byly získány z myší FAb, AME5™ anti-lidského kappa FAb (his-gly)4his-(lys), který byl izolován z E. coli směsi a je zde z praktického hlediska nazýván AME5™ FAb hgk. E. coli směs byla získána z 10 litrů kultivovaných 27C7 buněk. Mikrozkapalňovač byl použit pro homogenizaci buněk ve směsi obsahující 20 mM fosfát sodný, 0,25 M chlorid sodný, 10 mM chlorid hořečnatý a 2 mM imidazol při pH 7. E. coli extrakt byl čeřen přidáním 0,2 % polyethyleniminu (PEI) a odstředěn. Pročeřený extrakt byl přečištěn při použití kombinace výměny iontů a navázanou koviont-chelatační chromatografií (IMAC). Chelatační SEPHAROSE FAST FLOW™ a SP SEPHAROSE FAST FLOW™ pryskyřice byly od Amersham Pharmacia.

3. Imobilizace AME5™ FAb hgk na aktivované glycerylem potažené CPG

Přečištěný Fab byl navázán na periodátem aktivované glycerylem potažené skleněné částice s určitými póry (CPG) za tvorby afinních částic. AME5^{1 M} FAb hgk protilátka byla navázána na aktivované glycerylem potažené CPG podle pozměněného způsobu podle Roy et al., J. Chromatography, 303:225-228 (1984).

Suché CPG byly smáčeny přečištěnou vodou, přeneseny do chromatografické kolony a aktivovány po dobu 30 minut promýváním kolony 1 % metaperiodátem sodným (Sigma S1878™). Aktivované částice byly poté promyty 20 mM fosfátem sodným, 0,15 M chloridem sodným, pH 7,2 (vazebný pufr).

Skrze aktivované částice protékala AME5^rM FAb hgk protilátka v koncentraci přibližně 5 mg/ml ve vazebném pufru obsahující 1 pg/ml redukujícího činidla kyanoborohydridu sodného (Sigma S8628). Vazba protilátky na částice byla sledována snižováním absorpce při 280 nm. Když nedocházelo již k dalšímu snížení absorpce, zbývající protilátka byla odmyta vazebným pufrem a byla uschována. Hustota vazby byla stanovena rozdílem mezi počátečním množstvím a množstvím získaným po reakci a je určena v mg FAb na ml částic.

Zbývající aktivní místa na částicích poté reagovala pomocí protékajícího 1 M ethanolaminu, pH 8 (ICN, katalogové číslo 151078) v přítomnosti 1 pg/ml kyanoborohydridu sodného po dobu 2 hodin. Částice byly poté promyty vazebným pufrem obsahujícím 0,01 % thimerosal (GDL International) pro uskladnění. Před použitím proteinu byly částice třikrát promyty vyrovnávajícím a vymývajícím pufrem.

4. Činidla a způsob rozboru ·· © · · • · • » • · • · ·*· • · ·· ·· *· ····

Zásoby rozpouštědla byly: rozpouštědlo 1 A, afinní zaváděcí pufr; rozpouštědlo IB, pufr reverzní fáze a afinní vymývající pufr, 0,1 % TFA ve vodě; rozpouštědlo 2A, voda. Rozpouštědlo 2B, organický vymývající pufr reverzní fáze, 0,09 % TFA/80 % acetonitril. Bylo vloženo padesát μΐ E. coli HSE (ředěno 1:2) nebo kapaliny nad sedlinou kvašené kultury v zavádějícím pufru. Všechny formy anti-CD18 nalezené v extraktech buněčného kvašení byly vychytány AME5™ protilátkou, jak je stanoveno porovnáním 2D-gelů kontrolního běhu, produkčního běhu a afmitně zachyceného AME5™ materiálu z produkčního běhu. Po nespecifické adsorpci byl redukován (vymytím s PBS), afinní kolona byla umístěna do řady s kolonou reverzní fáze a vychycené složky byly eluovány vymytím ředěnou kyselinou. Tyto složky byly následně rozpuštěny vymytím kolony reverzní fáze v acetonitrilovém gradientu. Detekce byla provedena měřením absorbance při 280 nm, nereagující protilátka byla kvantifikována porovnáním oblasti vrcholů s podobně analyzovanými standardy.

G. Stanovení vrcholů v chromatogramu

Tento rozbor rozlišil anti-CD-18 fragmenty v pěti protilátkových oblastech, které představují následující protilátkové fragmenty:

Oblast 1: LC-115 (115 aminokyselinový degradační produkt kappa lehkého řetězce)

Oblast 2: nespojené volné lehké řetězce a glutathion-lehký řetězec

Oblast 3: dimer lehkých řetězců

Oblast 4: fragment podobný Fab

Oblast 5: Fab‘2-LZ nebo Fab‘2 fragment

Jako standard bylo použito velké množství anti-CD18 F(ab)‘2 uvolněného materiálu (5 mg/ml). E. coli extrakt získaný z kvašení 49A5/pSl 130 o vysoké buněčné hustotě byl zmrazen při -70 °C a byl použit jako pozitivní kontrola. Stejné buněčné množství bylo vloženo pro všechny porovnávané vzorky.

H. Celkové HC/LC POROS™ stanovení s reverzními fázemi

Pro stanovení celkového množstí fragmentů lehkých a těžkých řetězců produkovaných kvašením byl použit alternativní HPLC stanovení s reverzními fázemi (RP-HPLC). Pro celkové stanovení protilátky bylo přidáno 100 μΐ celého média s 100 μΐ 0,2 M TRIS 8,0. Po sonikaci 10 pulzy bylo přidáno 650 μΐ guanidin-HCl/50 mM TRIS, pH 9 a 50 μΐ 2 M DTT a inkubováno při pokojové teplotě po dobu 15 minut. Před vložením na kolonu bylo přidáno 200 μΐ acetonitrilu a filtrováno skrze velikostně rozdělující odstředivou kolonu (Pharmacia). Pět μΐ této suspenze bylo analyzováno POROS™ stanovením s reverzními fázemi.

Pro metodiku reverzní fáze byl použit HEWLETT-PACKARD™ 1100 HPLC s POROS™ R-l kolonou reverzní fáze. Analýzy probíhaly na koloně zahřívané na 60 °C, a byla sledována UV

0*0 absorbance při 278 nm. Kolona byla vyvážena v 28 % roztoku acetonitrilu ve vodě s 0,1 % trifluoroctovou kyselinou. Dále bylo na kolonu zavedeno 25 μΐ vzorku a vymytí bylo provedeno lineárním gradientem od 28 % do 38 % acetonitrilu po dobu 20 minut, poté následovala 17 minutová perioda regenerace při 95 % acetonitrilu a znovu vyvážena 28 % acetonitrilem. Oblasti lehkých a těžkých řetězců byly určeny srovnáním standardů a analýzou při použití HEWLETTPACKARD^rM hmotnostním detektorem. Podobně byly připraveny vzorky z kvašení z kontrolního běhu, ve kterém byly použity stejné hostitelské buňky, kromě toho, že plazmid neobsahoval sekvence pro těžký a lehký řetězec, a byly analyzovány pro stanovení vhodných základních čar pro analýzu. Začlenění oblastí vrcholů bylo provedeno pomocí HEWLETTPACKARD™ softwaru, a standardy byly porovnány se vzorky kontrolního běhu pro stanovení kalibrační křivky a určení množství různých druhů ve vzorcích.

Rozpustné vzorky lyzátů byly připraveny pro stanovení výměny iontů. Typicky, 100 μΐ vzorku bylo ředěno s 650 μΐ 6 M guanidin-HCl, 50 mM TRIS-HC1, pH 9. Před vložením na HPLC bylo přidáno padesát μΐ 2 M dithiothreitolu (čestvě připraven), poté 200 μΐ acetonitrilu a následovala filtrace přes 0,2 pm filtr.

Nerozpustné vzorky lyzátů byly také podobně analyzovány naředěním nerozpustných, PBS omytých a dobře promícháných pelet získaných po buněčné extrakci v 100 μΐ 0,2 M TRIS 8,0. Pak bylo přidáno 650 μΐ 6 M guanidin-HCl/50 mM TRIS-HC1, pH 9, 50 μΐ 2 M DTT a 200 μΐ acetonitrilu. Vzorky byly poté filtrovány a 10 μΐ filtrovaných vzorků bylo analyzováno stejnými metodami jako rozpustné vzorky lyzátů.

I. CSX stanovení

Štěpení anti-CD18 Fab‘2-LZ bylo stanoveno HPLC kationt-výměnnou chromatografii. Konkrétně, vzorky byly naředěny alespoň 1:1 a 250 μΐ bylo vloženo na BAKERBONFJ™ karboxy-sulfon (CsX) 50 x 4,6-mm kolonu (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) při zachování teploty 55 °C Hewlett-Packard 1090 HPLC systému. Vzorky byly vymyty gradientem přibižně 5 až 50 mM fosforečnanem sodným (pH 7) po dobu 14 minut a oblasti vrcholů byly sledovány UV absorbancí při 278 nm. Oblast obsahující anti-CD18 Fab‘2-leucinový zip byla identifikována a kvantifikována srovnáním s přečištěnými standardy.

J. Konstrukce buněčné linie

Hostitelé použití v kvašení rhuFab‘2 LZ (xCD18) jsou odvozeny od E. coli W3110 (Bachmann,

Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology,

1987), pp. 1190-1219), a jsou označeny následovně: 49A5, 58B3, 59A7, 43H1, 58H2, 45F8,

41H1, a 33D3. Obrázek 5 znázorňuje schéma odvození E. coli kmenů 59A7, 49A5 a 43H1.

1. Kmen 49 A5

Kompletní genotyp 49A5 je AfhuA phoA Δ.Ε15A(argF-lac)169 deoC2 degP41(A.pstl-Karij !N(rrD-rrE)l ilvG2096 (Val^r) AfucP AmalE. Počáteční kmen, E. coli W3110 je odvozen od E. coli K-12, která je F‘- a lambda-mínus. Bylo prokázáno, že nese obrácenou oblast chromozómu mezi rrnD a rrnE (Bachmann, výše; Hill and Harnish, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78:7069-7072 (1981)). //z uA gen (dříve nazýván ton A) byl odstraněn z W3110 nepřesným odstraněním 77? 10 a jeho následným vložením do fhuA genu. Výsledný kmen 1A2 je rezistentní na bakteriofág TI, T5 a 080.

Dvě deleční mutace, phoA A.E15 (Sarthy A. et al., J. Bacteriol., 145:288-292 (1981)) a A(arglac)169 (Schweizer et al., Mol. Gen. Genet., 192:293-294 (1983)), byly současně vloženy do kmene 1A2 pomocí PÍ společné transdukce se spojeným Tn5 vložením do proC genu. Přesné odstranění transpozonu obnovuje proC gen. phoA ΔΕ15 mutace eliminují expresi alkalické fosfatázy a A(argF-lac) 169 mutace je odpovědná za lac fenotyp tohoto kmene, který je nazýván 7C1.

deoQ2 mutace, která eliminuje expresi deoxyribózofosfátaldolázy, byla vložena PÍ společnou transdukcí. Fokus deoC je geneticky spojen s threonin biosytetickým lokusem. Threoninový auxotrof byl připraven 77? 10 vložením a nepřesným odstraněním. Threoninový auxotrof byl poté transdukován do threoninového prototrofu s PÍ fágem, rostoucí na deoC2 mutantu. Přítomnost deoC2 mutace byla potvrzena neschopností výsledného kmene 16C9 růst na 0,2 % thymidinu jako zdroji uhlíku.

Mutace degP41(APstl-Kan), mutace v genu pro periplazmatickou proteázu, byla vložena transdukcí. Tato mutace byla vytvořena in vitro nahrazením sekce degP genu s genem rezistence na kanamycin (Strauch and Beckwith, J. Bacteriol., 171: 2689-2696 (1989)). Není to transpozon, ale umožňuje selekci delece použitím kanamycinové rezistence. Výsledný kmen je nazýván 23E3.

Mutace z7vG2096 (Val^r) (Fawther et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78:922-925 (1981)) byla vložena homogenotizací. Tato mutace opravuje posun rámce, který způsobuje, že kontrolní typ E. coli K-12 je citlivý na valin. Kmen 23E3 byl transformován plazmidem pAH29 (Fawther et al., výše) obsahující z'/vG2096 (Val^r) znak a gen rezistence na ampicilin. Kmen pojmenovaný 33B6, kteý samovolně ztratil plazmid a který získal požadovanou alelu, byl identifikován kontrolováním amipicilin-citlivých klonů pro rezistenci na valin.

Konečně, dvě mutace v dráze využití cukrů byly vloženy tak, aby umožnily hostiteli být rozlišeny od dalších rekombinantních hostitelů jednoduchým testem využití cukrů. Deleční mutace fucP a malE byly připraveny PCR a byly odděleně vloženy do plazmidového vektoru obsahující beta-laktamázu a sacharázu (Bass et al., výše). Každý úplný plazmid byl

rekombinován do chromozómu derivátu W3110, který by nepodporoval nezávislou replikaci plazmidového vektoru (Bass et al., výše). Kmen 33B6 byl poté transdukován rezistencí na karbenicilin sPl fágem rostoucí na W3110 derivátu nesoucí fuč? deleční plazmid vložený do jeho chromozómu. Deriváty tak neexprimují sacharázu a tak byly vybrány rezistanti na sacharózu, kteří byly kontrolovány pro ztrátu rezistence na karbenicilin a neschopnost využít fukózu. Pomocí PCR bylo potvrzeno, že výsledný kmen 49B2 nese plánovanou /«cP deleci. Stejný postup byl použit pro přípravu malE delece. Kmen 49B2 byl transdukován rezistencí na karbenicilin sPl fágem a pěstován na kmeni nesoucí malE deleční plazmid vložený do jeho chromozómu. Poté byly vybrány deriváty rezistentní na sacharózu a kontrolovány pro ztrátu rezistence na karbenicilin a neschopnost využít maltózu, a přítomnost malE delece byla potvrzena pomocí PCR.

Důležité znaky kmene 49A5 zahrnují:

• Je rezistentní na TI fágy • Nedochází k nadprodukci alkalické fosfatáza, když je odstraněn fosfát (což je podmínka pro vyvolání syntézi produktu) • Postrádá proteinázu • Je náchylný na toxicitu valinu • Může být rozlišen od jiných hostitelů testem využití cukrů

2. Kmen 58B3

Kmen 58B3 byl také odvozen od kmene 33B6. Genotyp Aprc::pS1080 (Bass et al., výše; Metcalf et al., Gene, 138:1-720 (1994)) byl vložen do kari derivátu kmene 33B6 (56G4) PÍ transdukcí, a byly vybrány kolonie nerostoucí dobře na polovičním LB s nízkým obsahem soli při 42 °C. Kmen kari nese deg? deleci odvozenou od pKSló (Strauch and Beckwith, 1989, výše), vedoucí k fenotypu citlivému na kanamycin. Proto, 58B3 kmen je kari kmen nesoucí deleci degP a deleci prc.

Kompletní genotyp 58B3 kmene je W3110 ÍsfhuA phoA ΔΕ15 A(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)l Kari ilvG2096 (Val^r) prc.

3. Kmen 59A7

Kmen je vytvořen vložením Prc supresoru (Spr mutant) do 58B3 kmene. PÍ fágový lysát kmene 51B8 (tonA prc prc sup zeg722::TnlO) byl transdukován do kmene 58B3, který je vybírán pro tet-rezistentní kolonie a kontrolován pro Prc supresorový fenotyp (rostoucí dobře na polovičním LB s nízkým obsahem solí při 42 °C). Nový kmen se nazývá 58F1. Mutant Eprc nepřežije při 42 °C. Gen rezistence na tetracyklin byl odstraněn z 58F1 naočkováním na Malloy misky, což vede ke zjištění /č7'^v-citlivému kmenu, který se nazývá 59A7. Kompletní genotyp kmene 59A7 je

W3110 KfhuA phoA ΔΕΙ5 A(argF-lac) 169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)l Kari ilvG2096 (VaT) Aprc óT?rW148R.

Původní 51B9 kmen má Prc supresor Spr, který nese bodovou mutaci W148R, stejnou jako Spr v 43H1 a 59A7 kmenech.

4. Kmen 43H1

Kompletní genotyp 43H1 kmene je velmi podobný genotypu 49A5: W3110 Δ/huA phoA ΔΕ15 A(argF-lac)169 degP41(Apstl-Kan) IN(rrD-rrE)l ilvG2096 (VaT) ptr3 ΔοηιρΤ prc::kanr sprW148R. Nese o tři více proteinázových znaků než 49A5, Ptr3 OmpT a Prc. Tento kmen má bodovou mutaci (W148R) v Spr. Je Kan^r.

5. Kmen 58H2

Kmen 43H1 byl transdukován na tef Pl fágem rostoucím na kmeni 42E3. Tento kmen (58F9) byl opraven pro prc::karí mutaci; proto se stal karí. Tento kmen byl poté naočkován na minimální glukoronové médium, aby byl odstraněn edaríTrílrí Nový vytvořený kmen 58H2 je karí a stal se trojitým proteinázovým mutantem s kontrolním prc. Kompletníé genoty 58H2 kmene je W3110 Δ/huA phoA ΔΕ15 A(argF-lac)169 degP4](\pstl-Karí) IN(rrD-rrE)l ilvG2096 (VaT) ptr3 ΔοηιρΤ sprW148R.

6. Kmen 45F8

Kompletní genotyp kmene 45F8 je W3110 XfhuA A(argF-lac)169 degP41 Karí ΔοηιρΤ ptr3 ilvG2096 (VaT) phoS*(T104). Je to phoS kmen s trojnásobnými proteinázovými znaky.

7. Kmen41Hl

Kompletní genotyp kmene 41H1 je W3110 KfhuA phoS*(T104) A(argF-lac)169 degP41 (ApstlKarí) ptr3 ilvG2096 (VaT) přizpůsobený na teplotu 37 °C. Je to phoS kmen s dvojnásobnými proteinázovými znaky.

8. Kmen 33 D3

Kompletní genotyp kmene 33D3 je W3110 )ftiuA ptr3 laclq lacL8 )ompT degP41 ()pstl-kan^R). Popis přípravy může být nalezen např. v US 5 789 199.

K. Třepací láhve a kultury kvašení

Pro experiment střepacími láhvemi bylo použito Luria-Bertani médium (LB) a C.R.A.P. minimální médium s 5 pg/ml Ampicilin™ antibiotikem. C.R.A.P. minimální médium bylo připraveno následovně: 3,57 g (NPL^SCú, 0,71 g citrátu sodného, 1,07 g KCI, 5,36 g kvasinkového extraktu a 5,36 g HYCASE SF-SHEDDIELD™ bylo smícháno, pH bylo upraveno KOH na 7,3, a objem byl upraven deionizovanou vodou na 872 ml. Tato směs byla poté autoklávována a chlazena na 55 °C. Bylo přidáno 110 ml 1 M MOPS pufru mající pH 7,3, 11 ml 50 % glukózy a 7 ml 1 M MgSO4.

Zde používaný E. coli kvasný proces byl proces tvorby buněk o vysoké hustotě, tak jak je definováno výše. Pro dosažení vyšších buněčných hustot je přidáván plynule amoniak, a přídavné, méně významné živiny (P, K, S a Mg) byly přidány v určitém stupni kvašení, aby byl podpořen buněčný růst. Snížení množství živin způsobí jiný proces, který má nižší konečnou optickou hustotu média se stejnou kvalitou produktu, který je zde nazýván jako proces nízké buněčné hustoty.

Jednotlivá zkumavka obsahující 1,5 ml kultury v 10 až 15 % DMSO byla rozmražena v 1 1 třepací láhvi obsahující 500 ml LB médium, do kterého bylo přidáno 0,5 ml tetracyklinového roztoku (5 mg/ml) a 2,5 ml 1 M roztoku fosfátu sodného. Tato původní kultura byla kultivována přibližně 16 hodina při 30 °C a poté byla použita pro očkování 10 1 kvasného zařízení.

Kvasné zařízení zpočátku začalo s přibližně 6,5 1 média obsahující přibližně 4,4 g glukózy, 100 ml 1 M síranu hořečnatého, 10 ml roztoku stopových prvků (100 ml kyseliny chlorovodíkové, 27 g chloridu železitého-hexahydrát, 8 g síranu zinečnatého-heptahydrát, 7 g chloridu kobaltu-hexahydrát, 7 g molybdenan sodného-dihydrát, 8 g síranu měďnatého-pentahydrát, 2 g kyseliny borité, a 5 g síranu manganičitého-monohydrát, v celkovém objemu 1 litru), 20 ml tetracyklinového roztoku (5 mg/ml v ethanolu), 10 ml FERMAX ADJUVANT 27™ (nebo nějaký ekvivalent proti pěnění), 1 balení HCD solí (37,5 g síranu ammoného, 19,5 g dvojsytného fosforečnanu draselného, 9,75 g jednosytného fosforečnanu sodného-dihydrát, 7,5 g citrátu sodného-dihydrát, a 11,3 g jednosytného fosforečnanu draselného) a 200 g NZ Amin A (proteinový hydrolyzát). Kvašení probíhalo při 30 °C s 10 slpm průtoku vzduchu a bylo regulováno na pH 7,0 ± 0,2 (ačkoliv v některých případech se vyskytly příležitostné výkyvy mimo toto rozmezí). Zpětný tlak kvasného zařízení a rychlost míchání se lišily, aby byla ovlivněna rychlost přenosu kyslíku v kvasném zařízení, a následně pro kontrolu rychlosti buněčného dýchání.

Po naočkování kvasného zařízení médiem obsahujícím buňky z třepací láhve, byla kultura kultivována v kvasném zařízení do vysokých buněčných hustot při použití počítačového algoritmu pro přidávání koncentrovaného roztoku glukózy do kvasného zařízení. Pro kontrolu pH byl přidáván do kvasného zařízení také hydroxid amonný (58 % roztok) a kyselina sírová (24 % roztok). V některých případech jsou pro kontrolu pěnění přidávány další přídavné látky proti pěnění. Když kultura dosahuje buněčné hustoty přibližně 40 při OD 550, je do kvasného zařízení přidáváno 100 ml 1 M síranu hořečnatého. Navíc, přidávání koncentrovaných solí (přibližně 10 g síranu amonného, 26 g dvojsytného fosforečnanu ddraselného, 13 g jednosytného fosforečnanu sodného, 2 g citrátu sodného-dihydrát a 15 g jednosytného fosforečnanu draselného v 1 1 vody) do kvasného zařízení začalo rychlosí 2,5 ml/min. dokud kultura nedosáhla přibližně

při OD 550 a pokračovalo, dokud přibližně 1250 ml bylo opřidáno ke kvašení. Kvašení probíhala obvykle 72 až 80 hodin.

Během kvašení, když byl dosažšn určitý bod rozpuštění kyslíku pro kvašení, byl přidán roztok koncentrované glukózy, v závislosti na signálu rozpuštěného kyslíku, který kontroluje koncentraci rozpuštěného kyslíku v určitém bodě. Následně, v tomto kontrolním schématu, manipulace kvasného zařízení ovládající parametry jako je rychlost třepání nebo zpětný tlak, které ovlivňují kapacitu přenosu kyslíku v kvašení, shodně ovlivňují rychlost absorbce kyslíku nebo rychlost metabolismu buněk.

Hmotnostní spektrometer byl použit pro sledování složení vylučovaného plynu z kvašení a umožňuje stanovení absorbce kyslíku a rychlosti tvorby oxidu uhelnatého v kvašení.

Když kultura dosáhla buněčné hustoty přibližně 220 při OD 550, třepání bylo sníženo z původní rychlosti 1000 ot./min. na přibližně 725 ot./min. po dobu přibližně 12 hodin.

Pro kvašení buněk transformovaných spMS421 a pcyc34 (kde byl použit tacll promotor pro kontrolu exprese těžkého a lehkého řetězce), nebo buněk transformovaných pMS421 a plazmidem pxCD18-7T3 s dvojitým promotorem (kde tacll promotor byl použit pro kontrolu expresi těžkého řetězce), bylo přibližně 12 hodin poté, co kultura dosáhla buněčné hustoty 220 při OD 550, přidáno 50 ml 200 mM IPTG pro indukci syntézy těžkého a lehkého řetězce pro pcyc34 a syntézy těžkého řetězce pro pxCDl 8-7T3.

Výsledky

A. Objevené a identifikované produkty štěpení kappa lehkého řetězce

Rozpustné extrakty E. coli (viz HSE v Materiálech & Metodách) a zbývající pelety rozpuštěné v SDS vzorkovém pufru (běžně dostupný komerční produkt pro SDS gely) byly analyzovány SDS-elektroforézou. Vzorky pocházely z pelet mající 20 OD-ml sbírané během E. coli vysokohustotního buněčného kvašení (HCD) u 49A5 kmene nesoucí pS1130 plazmid pro produkci rhuF(ab)‘2-LZ (xCD18).V rozpustné frakci byl identifikován štěpný fragment kappa LC, který má 115 aminokyselin. V nerozpustné frakci byl identifikován štěpný fragment kappa LC mající 182 aminokyselin. Všechny fragmenty byly přeneseny na PVDF membránu a byly sekvenovány. Oba měly správný N-konec jako zpracované formy kappa-LC. Hmoty byly stanoveny hmotnostní spektrometrickou analýzou, a mají 12488,5 a 19857,2 Da. Místa proteolytického štěpení byly mezi zbytky Valí 15 a Phel 16 pro LC-115 a mezi zbytky Serl82 a Lysl83 pro LC-182. Jen jedno místo vypadalo jako typické Prc sestřihové místo.

Byla analyzována dvojrozměrnou gelovou elektroforézou další E. coli 20 OD-ml peleta na konci kvašení. E. coli buněčný lyzát pelety (~40 pg proteinu) byl smíchán s rehydratačním roztokem, jak je popsáno v Champion ct al., výše. Ze znaků 2-D gelu buněk odvozených od 49A5/pSl 130 • · · ·· · · ······ ···· ···· · · · • · · · · · · · · · ·· · · · · · · · · · ·« ··· ·· ·· 99 99 kvašení, byly srovnáváním produkčního gelu s kontrolním 2-D gelem odvozeným od buněčných pelet (49A5/pBR322) kvašení v podobném časovém bodě, identifikovány signály specifické pro kappa-lehhký řetězec. Pelety byly vybírány ve stejném časovém bodě dvou kvašení, s předpokladem, že buňky by měly být ve srovnatelném metabolickém stavu. Všechny kappa LC signály byly identifikovány immunoblotem při použití alkalické fosfatázy konjugované s antilidskou kappa LC protilátkou.

Kromě dvou hlavních štěpů identifikovaných 1-D gelovou analýzou, 2-D gel znázorňuje neporušený LC, izoformu neporušeného LC, a alespoň 5 menších LC-štěpů (viz obrázek 6). Odpovídající signály byly vymyty a sekvenovány. Všechny LC-specifické peptidy měli správný N-konec, což naznačuje, že jsou všechny dobře zpracovány se štěpeným STU signálem. Všechny tyto peptidy byly analyzovány hmotnostním spektrometrem pro změření přibližné hmoty. Kvůli stopovému množství přítomných menších štěpů, správná hmota pro stanovení štěpných míst těchto fragmentů nemohla být stanovena.

Tři menší štěpy se připojily ke kappa LC-115 štěpu při pl hodnotě okolo 9. Čtvrtý měl pl hodnotu okolo 6,5 a pátý měl stejnou hodnotu pl jako LC-182 štěp, pl okolo 6. Pro zjištění rozpustnoti těchto LC fragmentů, HSE stejných pelet byl vložen na 2-D gel. Fragment LC182 se vyskytuje pouze v nerozpustné frakci.

B. Prc je výhradní proteináza odpovědná za štěpení kappa-lehkého řetězce

Byly srovnány 1-D SDS-elektroforézové gely naplněné nerozpustnou frakcí buněk odvozených od čtyř různých kvašení E. coli proteinázových mutantů, 19A5, 45F8, 41H1, exprimující antiCD18 Fab‘2 LZ molekulu. Proteolytické štěpení LC-182 bylo přítomno ve třech ze čtyř vzorků (ne v prc-delečním kmeni 43H1), což naznačuje, že Prc proteináza může být zapojena do kappaLC štěpení. Vrchol 1, který odpovídá LC-115 štěpu, přítomný ve vzorcích odvozených od kmene 49A5 (prc-plus), zmizel také z 43H1-odvozených vzorků ze srovnání chromatogamů rozlišených z AME5™/RP dvojité kolony. Tento rozbor vybíravě váže druhy s kappa-LC-protilátkami, které jsou poté rozděleny do pěti vrcholů, tak jak je popsáno výše v sekci Materiál a Metody.

Při analýze 2-D gelu pelet buněk odvozených od 43H1 bylo zjištěno, že nejen LC-115 a LC-182 fragmenty zmizely z gelu, ale zmizely také všechny ostatní LC-příbuzné menší druhy (viz obrázek 7). Tento výsledek silně naznačuje, že Prc je jediný enzym zodpovědný za štěpení kappa-LC. Tato 43H1 buněčná peleta byla odvozena od nízkohustotního buněčného kvašení.

C. Tvorba kmene pro potvrzení, že Prc je jediný enzym zahrnutý do štěpení kappa-lehkého řetězce

1. přeměna na prc-plus z /?rc-delečního kmene • 0 · ·· 00

0··· 000« 00 ·

0 0000 00 0

0000

Důkaz, že Přeje jediným enzymem zahrnutým v kappa-LC štěpení, byl získán obnovením 43H1 kmene (prc-minus hostitel s čtyřnásobným protinázovým znakem) tak, že se stal prc-plus, trojnásobným proteinázovým kmenem (58H2). Kmen 42E3 nese eda-51 ::TnlO, který je transdukovatelný společně sprc. Kmen 43H1 byl transdukován na tef s Pl fágem rostoucím na 42E3. Výsledný kmen (58F9) byl obnoven na prc::karí mutaci; proto se stal kan^s. Tento kmen byl poté naočkován na minimální glukoronové médium, aby byl odstraněn eda::TnlO. Nově vytvořený kmen 58H2 se stal trojnásobným proteinázovým mutantem s kontrolním prc. Tento izolát je buď transduktant nebo spontánní Eda+ izolát. Prc-plus genotyp byl potvrzen pomocí PCR. Tento 58H2 kmen stále nese prc supresor (.spr^wl48R) odvozený od 43H1 aje katí. Pomocí rozboru AME5™/RP na dvojité koloně (viz obrázek 8) byl zjištěn nový výskyt LC-štěpů v tomto 58H kmeni.

2. prc gen byl odstraněn z původního kmene za vzniku prc-minus

Kmen 49A5 byl prc kontrolní kmen, jak je popsáno výše. Když je prc delece vložena do tohoto kmene, původního pro tvorbu 58B3 kmene, a byly analyzovány buněčné extrakty pomocí rozboru AME5™/RP na dvojité koloně, LC-115 štěp (vrchol 1) zmizel. Kmen 58B3 byl odvozen od kmene 33B6, který nese pouze proteinázový znak DegP. Do karí derivátu 33B6 (56G4) byl Pl transdukcí vložen Aprc::pSl080 (Bass et al., výše; Metcalf et al., výše) za tvorby degP Aprc dvojitého proteinázového kmene 59A7.

Souhrn výsledků štěpení pro všech sedm kmenů je znázorněn v tabulce 1.

Tabulka 1: E. coli hostitelské kmeny exprimující anti-CD18 F(ab)‘2-leucinový zip

E. coli hostitel	Proteinázový znak	LC odbourání
49A5	DegP	+
45F8	DegP Ptr3	+
41H1	DegP Ptr3 OmpT	+
43H1	DegP Ptr3 OmpT APrc Spr^w,48R	-
58H2	DegP Ptr3 OmpT Spr^wl48R	+
58H3	DegP APrc	-
59A7	DegP APrc Spr^wl48R	-

D. Zlepšení výtěžku rhuFab‘2-LZ (xCD18) v prc-minus hostitelích

1. Výsledky třepání lahví

Tři kmeny (49A5, 43H1 a 58H2) exprimující rhuFab‘2-LZ (xCD18) byly nejprve kultivovány v LB médiu + Amp přes noc při 30 °C. Poté byly všechny kultury shodně naočkovány do

·· ····

9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 9 9 třepacích lahví obsahujících 25 ml C.R.A.P minimálního média + Amp a byly plynule třepány přes noc při 30 °C. Dvacet OD-ml pelety byly sbírány pro tvorbu rozpustných lyzátů (HSE). Na AME5™ kolony s reverzními fázeni bylo vloženo 25 μΐ z 530 μΐ.

Obrázek 8 znázorňuje sloupcový graf představující 5 vrcholů rozdělených tímto rozborem. Osa Y je specifická oblast maxima vrcholu 1 až 5 (viz Materiál & Metody). Osa X znázorňuje rhuFab‘2-LZ (xCD18) produkční kmeny. Oba prc+ kmeny, 49A5 a 58H2, produkovaly téměř stejná množství produktu, a oba vykazovaly téměř stejná množství LC-115 fragmentu (vrchol 1), ve srovnání s téměř žádným množstvím ve vrcholu 1 a s více produktu ve vrcholu 5 u Áprc kmene (43H1). Tento graf znázorňuje rozštěpení fragmentů protilátky. Vyšší množství rozpustného, neporušeného LC a LC dimeru bylo nalezeno u 43H1 kmene, než u 49A5 a 58H2 kmene V třepacích lahvích produkoval prc- hostitel téměř 5-krát více rhuFab‘2 LZ (xCD18) produktu než kontrolní prc kmeny.

2. Výsledky kvašení

Průměrný titr rhuFab‘2-LZ (xCD18) získaný standardním vysokohustotním buněčným (HCD) kvašením, byl 893 mg/1 u kontrolního prc hostitele (49A5, počet = 6), vycházející z rozboru na dvojité koloně AME5™/RP. Téměř dvojnásobné zlepšení titru bylo nalezeno u kvašení 43Hl/pSl 130. Významný rozdíl mezi třepacími lahvemi (5x) a titry kvašení (< nebo 2x) pro 43H1 a 49A5 hostitele byl, bez omezení na jakoukoli teorii, pravděpodobně kvůli rozdílu v účinnosti sekrece produktů. Když byly analyzovány celkové lyzáty pelet třepacích lahví, jen 50 % fragmentů protilátek bylo správně zpracováno v prostředí prc-plus kmenu, zatímco lyzát odvozený od 43H1 buněk z třepajících lahví nebo všechny buňky odvozené od kvašení (prc-plus a minus) vykazovaly 100 % zpracování. Zpracování Prc proteinu bylo nalezeno jako secY, secA závislé (Hara et al., 1991, výše). Bez omezení na jakoukoli teorii, má se za to, že výsledek třepacích lahví ukazuje, že Prc protein soutěží s fragmenty protilátky o translokaci.

3. Byla měřena celková exprese fragmentů protilátek

Pro stanovení účinnosti složení a spojení protilátky byl vyvinut rozbor vzorků celkového média kvašení na POROS™ koloně, jak je popsáno v sekci Materiál & Metody. Srovnáním vložených stejných vzorků celého média odvozených od tří anti-CD18 HCD kvašení v různých hostitelích bylo zjištěno, že 43H1 kvašení exprimuje podobné množství HC jako 49A5 kvašení, ale vyšší množství neporušeného kappa-LC (viz tabulka 2). Titr rhuFab‘2-LZ (xCD18) byl 1830 mg/1 pro 43H1 ve srovnání s 887,8 mg/1 rpo 49A5. Kvašení 59A7 neprodukovalo pouze navíc fragmenty protilátky, ale také dosahovalo nejvyššího titru rhuFab‘2-LZ (xCD18) 2403 mg/1.

Tabulka 2: Celková exprese fragmentů protilátek a Fab‘2-LZ titry různých kmenů exprimujících rhuFab‘2-LZ (xCDl 8) standardním HCD kvasným postupem

0 0··

Vzorky kvašení	Hostitel	Celkový LC (g/i)	Celkový HC (g/i)	Celkový HC + LC (g/i)	Fab‘2-LZ (mg/1)	Čas (h)
1	49A5	2,23	2,27	4,5		40
2	49A5	4,75	3,96	8,71	887,8	72

3	43H1	6,57	4	10,57		62
4	43H1	7,38	4,18	11,56	1830	72

5	59A7	12,49	6,87	19,36		68
6	59A7	13,76	7,47	21,22	2403	72

E. Prc supresor je potřebný pro přežívání ve stacionární fázi

Bylo zjištěno, že kmen 58B3, nesoucí delece degP a prc, vykazoval lýzu během prodlouženého růstu ve stacionární fázi HCD kvašení exprimující anti-CD18 Fab‘2-LZ molekuly. Buněčná lýze začala 50 hodin po očkování. Bylo produkováno pouze 320 mg/1 rhuFab‘2-LZ (xCD18), zatímco kvašení 59A7/pS1130 udrželo dobrý růst ve stacionární fázi až 72 hodin, kdy HCD kvašení dosáhlo vysoké buněčné hustoty (přibližně 300 při OD 550-ml). Obrázek 9 znázorňuje srovnání růstu těchto dvou kvašení. V tomto původním kmeni byla nalezena také velmi vysoká exprese HC i LC fragmentů, která zvýšela výtěžek rhuFab‘2-LZ (xCD18) molekul na 2403 mg/1. Opět nebyly nalezeny žádné kappa-LC štěpy ve vzorcích odvozených od 58B3 a 59A7 delečních kmenů.

Prc supresor (spr) (kódující Prc^sup) byl původně izolován z kmene 40A6 (prc::kurt spr) jako spontánní mutace, tj., termorezistentní revertant prc delečního mutantu. Poté co gen byl sekvenován a byla zmapována konjugace, bylo zjištěno, že se nachází přibližně na 48 min. na E. coli chromozómu. Nukleotidová sekvence tohoto PCR produktu souhlasila s E. coli spr genem uvedeným vHara ct al., 1996, výše, kromě jedné bodové mutace v aminokyselině 148, ve kterém je kodon TGG zaměněn na CGG, kterou dojde ke změně tryptofanu na arginin (W148R). Tento prc supresor po vložení do 59A7 kmene má W148R mutaci. Kontrolní spr gen byl uveden jako kódující lipoprotein v obalové frakci, který je považován za peptidoglykan hydrolyzující enzym (Hara et al., 1996, výše).

♦ · φ φ φφφφ φ φ φ *

Φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ

Prc supresor byl vložen do 59A7 kmene pomocí TnlO spojeného s tímto supresorem a společní transduktanti byly vybírány tak, že jsou rezistentní na tetracyklin a schopni růstu na polovičních LB miskách s nízkým obsahem solí při 42 °C. Nová bodová mutace se vyskytla v době, kdy byl na Malloy miskách odstraněn TnlO.

Z výsledků anti-CD18 Fab‘2 kvašení kmenů 58B3 a 59A7 bylo odvozeno, že Prc supresor je nezbytný pro úspěšný růst ÁPrc mutantu, zvláště při vysokohustotním buněčném E. coli kvašení. Kmen pojmenovaný jako 58B3 nese přestě stejný genotyp jako 59A7, kromě spr (W148R), a není životaschopný při standardním HCD kvašení po 50 hodinách.

F. Prc deleční mutant může zvýšit hladiny produkce různých protilátek díky umístění Prc štěpných míst

Obrázek 10 znázorňuje sekvence humanizovaných kappa LC (SEQ ID NO:5). V tabulce 3 jsou ukázány vypočítané pl hodnoty možných Prc štěpů.

Tabulka 3: Vypočítané pl hodnoty možných Prc štěpů

Vypočítaná hodnota pl	Štěpné místo	Typ proteinázy	LC-šťěp
5,97	S/K	Specifická na serin	LC-182
9,14	V/F	Prc	LC-115
9,14	S/V	Specifická na serin	LC-114
9,14	V/A	Prc	LC-110

Bez omezení na některou teorii, z výsledků na obrázku 10 a v tabulce 3 se má za to, že Prc proteináza začíná štěpit kappa-LC z jeho C-konce, 9 nebo 18 aminokyselin dovnitř LC sekvence, a poté je postupně štěpen směrem k N-konci, aby bylo přístupné S/K místo pro serin-specifickou proteinázu. Je možné, že jiné druhy kappa LC (pravděpodobně v odlišném strukturním stavu) byly štěpeny hlavně až do 115 aminokyselin. Mnoho možných štěpných produktů má molekulární hmotnost a vypočítané pl hodnoty, které dobře odpovídají kappa LC signálům nalezeným na 2-D gelu.

Obrázek 11 znázorňuje prc-deleční kmen (43H1) vylučující LC-182 štěp z buněk exprimujících anti-VEGF Fab, anti-CD18 Fab‘2-LZ, anti-CD18 Fab‘2-LZ-6xHis molekuly a protitkáňový faktor Fab‘2-LZ-6xHis. Kvašené vzorky odvozené od cab2826 (33B6/D3H44-F(ab‘)2) a cab2847 (43H1/D3H44-F(ab‘)2) byly kvašeny s vysokou buněčnou hustotou, aby došlo k expresi protitkáňového faktoru Fab‘2-LZ-6xHis. Proces kvašení byl stejný standardní HCD proces, jak je popsáno výše pro anti-CD18 Fab‘2-LZ kvašení. Cab2793 bylo kvašení •4 4444

4 4« 44

4444 4444 4 4 4

444 «4 44 «44

444444444 4

Λ-> 44444444444

HA ·« 44« 44 44 44 44

49A5/pAB3 zamýšlené pro expresi anti-CD18 Fab‘2 LZ-6xHis molekul. Cab2846 bylo kvašení

41Hl/pSl 130 zamýšlené pro expresi anti-CD18 Fab‘2 LZ molekul. JJ81 (43Hl/pY0317) a JJ67 (43E7/pY0317) kvašení byly zamýšleny pro tvorbu anti-VEGF Fab. Cab 2814 (49A5/pBR322) bylo kontrolní kvašení, které obsahuje podobný plazmid bez genů exprimujících protilátky.

Pelety kvašení mající OD 20 byly opracovány s TRIS/EDTA/lysozymem pro odstranění rozpustných HSE. Zbývající pelety byly rozmíchány v 400 μΐ 1 x SDS vzorkového pufru plus 20 μΐ beta-merkaptoethanolu, a poté byly zahřívány při 95 °C na tepelném bloku po dobu 5 minut.

Poté bylo 5 μΐ naneseno na 4 až 12 % NUPAGE™ gel. Kmeny 33B6, 41 Hl, 49A5 a 43E7 jsou prc-plus kmeny. Kmen 43H1 je prc-minus kmen. Všechny vzorky odvozené od původního prckmene mají 19,8 kDa LC degradovaný produkt. Cab2829 (33B6/pD3H44TB) kvašený vzorek, který exprimuje anti-TF Fab, může také obsahovat LC degradační fragment o stejné velikosti. Všechny tyto fragmenty byly sekvenovány na aminokyseliny a bylo zjištěno, že sekvence LC mají správný N-konec.

G. Kmen 59A7 vykazuje kvalitnější expresi anti-CD18 His- a Lys-označených Fab‘2-LZ a Apo2L cytoplazmatického proteinu v třepacích lahvích

Přídavná data kultivace v třepacích lahvích znázorněná v tabulce 4 naznačují, že kmen 59A7 exprimuje pAB3 (anti-CD18 His-označený Fab‘2-LZ) lépe než kmen 43H1 a 49A5. Kmen 59A7 exprimoval pAB21 (Lys-označený Fab‘2-LZ) lépe než 33B6 kmen 2,4-krát. Kmen 59A7 a 43H1 exprimoval pSl 130 (Fab‘2-LZ bez označení) lépe než 49A5 kmen 2,9-krát. Nicméně, výsledky kvašení vždy ukazují, že kmen 59A7 je lepší než kmen 43H1 v expresi pSl 130.

Pro neprotilátkový cytoplazmatický protein Apo2L je specifická aktivita přibližně o 20 až 30 % vyšší, když je exprimován v kmeni 59A7 než v kmeni 43E7 (v třepacích lahvích). Poté co kmen 43E7 narostl do vyššího OD 550, byla celková exprese podobná. Kmen 43E7 je ompTptr3 degP kmen bez prc a spr.

Tabulka 4: Vyšší specifické titry různých proteinů exprimovaných v 59A7 a další kmeny v kulturách v třepacích lahvích

Kmen	Proteinázový znak	pS1130	pAB3	pAB21	Apo2L
		mg/l/OD-ml	mg/l/OD-ml	mg/l/OD-ml	mg/l/OD-ml
33B6	DegP	nevýzn.	nevýzn.	0,33	nevýzn.
49A5	DegP	0,38	0,46	nevýzn.	nevýzn.
43H1	DegP Ptr3 OmpT	1,1	0,3	nevýzn.	nevýzn.

····

444 4 4 44 444

4 444 44 444 4 4

4 4444 4444

444 ·4 44 44 44

	PrcŠpr^WIW
59A7	DegPŠp?™	1,1	0,7	0,8	14,4 15,2
43E7	DegP Ptr3 OmpT	nevýzn.	nevýzn.	nevýzn.	12,2 11,4

G. Kmen 59Α7 vykazuje kvalitnější expresi anti-CDl 8 Fab‘2-LZ kvašením

Tabulka 5 ukazuje, že kmen 59A7 byl lepší v expresi anti-CDl8 Fab‘2-LZ z plazmidu pxCD187T3 s dvojitým promotorem než kmen 33D3 a lepší v expresi anti-CDl8 Fab‘2-LZ z plazmidu pcyc34 než 49A5.

Tabulka 5: Vyšší specifické titry anti-CDl8 Fab‘2-LZ exprimované v 59A7 v porovnání s 33D3 a 49A5 při použití dvou různých plazmidů kvašením

Kmen	Plazmidy	Anti-CD18 Fab‘2 LZ titr pomocí CSX stanovení (mg/1) (průměr)
33D3	pxCD18-7T3/pMS421	2500
59A7	pxCD18-7T3/pMS421	4000
49A5	pcyc34/pMS421	241,3
59A7	pcyc34/pMS421	2067,1

V této studii byla studována degradace kappa-LC v E. coli buňkách exprimuj ících anti-CDl 8 Fab‘2-LZ molekuly. Dřívější práce ukázaly mnoho možných Prc substrátů, ale žádná nepopisuje nalezení fragmentů protilátky jako substrátu pro tuto proteinázu. Zde je ukázáno, že Prc je jedinou proteinázou zahrnutou ve štěpení kappa LC uvnitř E. coli buněk. Bylo zjištěno, že protein Prc štěpí kappa LC výběrově na samostatných místech, které dávají vznik dvou velkých štěpů (LC-115 a LC-182) a pěti dalších menších štěpných produktů, jak bylo pozorováno z výsledků 2-D gelu. Poté, co jedním z velkých štěpů byl S/K štěpný produkt, který nezapadal do charakteristik Prc štěpných míst (Keiler et al., výše), byla provedena kompletnější studie. Poté bylo zjištěno, že degradace kappa lehkého řetězce v E. coli buňkách souvisí s E. coli periplazmatickou proteinázou (Prc/Tsp). Štěpné produkty kappa lehkého řetězce byly identifikovány analytickými metodami (1-D/2-D SDS elektroforéza, hmotnostní spektrometrie, sekvenování N-konce) E. coli výtažků odvozených od různých proteolyticky nedostatečných kmenů exprimujících anti-CDl8 F(ab)‘2-leucinový zip, aby bylo potvrzeno, že Prc/Tsp je jedinou proteinázou zodpovědnou za štěpení kappa lehkého řetězce.

φφ »«»♦ ·· φ ·· ·· • · · · · · φ φ φφ φ • ΦΦ φφφφ φφφ φφ φφφφφφφφφ φ

AC · · ΦΦΦΦΦΦΦΦΦ

ΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

Jedinečná kombinace degP prc delece s prc supresorem (spr mutant) byla shledána za unikátní u E. coli kmene, který je schopný produkce velmi vysokého množství rekombinantního proteinu nebo vyšší specifické aktivity proteinu, jak je zde představováno Apo2 ligandem a aktivní protilátkou.

Kvašení degP prc spr kmene má zde za následek vysokohustotní buněčný růst (až do OD 300 nebo výše) a produkci rhuxCD18 Fab‘2-leucinový zip s vysokým výtěžkem ve srovnání s expresí protilátek u kontrolního kmene nebo jiných proteolyticky nedostatečných kmenů.

Proces kvašení zde umožňuje produkci 100 až 200 g/1 suché váhy buněk za 72 hodin s vyšším než 200 % zvýšením u aktivní protilátky produkované jedním vhodným kmenem 59A7, mající kombinaci degP prc spr. Kompletní genotyp kmene 59A7 je W3110 EfhuA phoA NEJ5 E(cirgFlac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)l karí ilvG2096(Val^r) Eprc spr*¹™^. Jeho původní kmen je 58B3, který má stejné genetické znaky jako 59A7 kmen kromě prc supresoru, spr. Kmen 58B3 nebyl schopný podporovat růst ve stacionární fázi E. coli vysokohustotního buněčného kvašení.

Kmen produkuje nižší produkci protilátky než původní prc kmen (49A5), který také nese degP deleční znak a další stejné genotypy jako kmen 59A7, kromě toho, že kmen 49A5 je prc původní kmen rezistentní na kanamycin, zatímco kmen 59A je Aprc kmen citlivý na kanamycin.

Z toho tedy zde bylo dokázáno, že přítomnost prc supresoru (spr) je potřebná pro dobrý růst a vyšší hladinu produkci protilátek u degP prc delečního kmene, zvláště při vysokohustotním buněčném kvašení, ale také u nízkohustotního buněčného kvašení.

DegPÁ proteinázový mutant a další mnohočetné nedostatečné kmeny na proteinázy, které zahrnují degPE, neprodukují zvláště vysoké hladiny rekombinantních produktů. Dva dříve zmiňované kmeny, degP rpoH a degP prc, exprimují více produktu než mnoho dalších srovnávaných kmenů, ale zdaleka ne tak moc jako kmen 59A7. Konkrétněji, bez spr supresoru kmen 58B3 s degP prc kombinací nevykazoval žádnou výhodu v produkci fragmentů protilátek, jak je zde ilustrováno molekulou anti-CD18 Fab‘2-LZ.

Jsou poskytnuty analytické výsledky, aby bylo dokázáno, že štěpení kappa LC u E. coli buněk exprimujících humanizované molekuly anti-CD18 F(ab)‘2-leucinový zip souvisí s periplazmatickým C-koncovým zpracujícím proteinem (Prc). Prc protein je výhradní proteinázou zodpovědnou za štěpení kappa lehkého řetězce, což bylo potvrzeno dvojrozměrnou gel ovou elektroforézou a genetickou manipulací kmenů produkujících protilátky. Potvrzení, že Prc proteináza je opravdu jediným enzymem zahrnutým ve štěpení kappa LC nastalo, když byl Eprc kmen opraven na původní prc kmen a štěpné produkty kappa LC se znovu objevily. Podobně, když byl prc gen odstraněn z původního prc kmene, LC-štěpené produkty zmizely. Konstrukce obou kmenů byla provedena Pl transdukcí.

·« 99 99 »··· · 9 · 9 9 · · ·· «99 »9 99 9 9 9 9 9

9 · · · 99 9

99 99 99 99

Navíc jsou poskytnuty porovnání titrů molekul anti-CD18 F(ab)‘2-leucinový zip odvozených od E. coli proteolytických mutantů, s prc delecí nebo bez prc delece. Tato data dokazují, že kmen 59A7 je vyšší producent exprimováných protilátek. Jsou popsány různé nukleové kyseliny vytvořené pro expresi molekul anti-CD18 F(ab)‘2-leucinový zip; všechny expresní plazmidy transformované do kmene 59A7 produkovaly vyšší množství fragmentů protilátek ve srovnání s degPÍS proteinázovým mutantem nebo degP prc mutantem bez spr. Jiný kmen, 43H1, který má genotyp degP prc spr navíc k ompP a ptr3 mutacím, nerostl tak dobře jako 59A7 kmen, ačkoliv 43H1 kmen má stejnou spr mutaci jako má 59A7, ve kterým v pozici 520 obsahuje změnu z T na C, což vede ke změně aminokyseliny W na R v pozici 148. Produkuje vysoký titr anti-CD18 F(ab)‘2-LZ než produkuje kmen degP (49A5), ale zdaleka ne tak vysoký, jaký produkuje kmen 59A7 v kvasném zařízení.

Bylo uvedeno, že Prc proteináza štěpí její substráty v určitých místech, ale s celkem širokou sekvenční specifitou (Keiler et al., výše). Bylo zjištěno, že Prc štěpná místa u kappa-LC fragmentů jsou umístěna v konstantní oblasti, což je opěrná sekvence běžně používaná pro konstrukci různých plazmidů exprimujících humanizované protilátky. Ze zdejších výsledků se očekává, že Prc deleční mutant by zlepšil titr různých fragmentů protilátek, jako jsou: Fab, Fab‘,

Fab2‘ (s leucinovým nebo bez leucinového zipu) zahrnující protilátku v celé délce, exprimující v Escherichia coli buňkách. Fragment protilátky obklopený His značkou nebo Lys značkou na C-konci HC je také považován za prospěšný.

Bylo zjištěno, že kmen 59A7 je kvalitnější než kmen 49A5 v expresi pAB3 a je kvalitnější než kmen 43E7 ve specifické expresi Apo2L cytoplazmatického proteinu vtřepacích lahvích a kvalitnější než 43H1 a 49A5 kmeny v expresi pSl 130 a pcyc34 (tacll promotor jako doplněk pSl 130) kvašením. Dále, je kvalitnější než kmen 33D3 v expresi plazmidu pxCD18-7T3 s dvojitým promotorem.

PŘÍKLAD 2.

A. Expresní plazmidy

Plazmid D3H44-F(ab‘)2 je popsán v příkladu 1

Plazmid pY0317tet20 je popsán v příkladu 1

B. Kmeny

Kmen použitý pro expresi xVEGF Fab je podobný ostatním kmenům popsaným v příkladu 1. Je odvozený od E. coli W3110 a je pojmenován jako 600. Kompletní genotyp 600 kmene je W3110 EfhuA A(argF-lac) 169 ptr3 degP41 Kan^s AompT ilvG2096(Valj S(nmpc-fepE) EssrA. Podobně jako kmen 45F8, nese trojnásobný proteinázový znak bez prc.

• 9 9 99 99 • 9 99 9999 99 9

999 99 99 999

99999999999 9 / 999 99999999 • 9 999 99 99 99 99

Kmeny 43H1, 59A7 a 33B6 jsou popsány v příkladu 1.

C. Kultivace v třepacích lahvích probíhala jak je popsáno v příkladu 1. Růst třepaných kultur exprimujících molekulu xTF Fab‘2-LZ-6x his byl prodloužen na 42 hodin při 30 °C, a dvě sady vzorků byly pro srovnání odebírány v různých obdobích růstu. Ve srovnání s xVEGF Fab expresí, byly kultivovány dvojité kultury a byly odebírány pouze po 24 hodinách.

C. Identifikace proteinu

2-D gelová elektroforéza byla provedena tak, jak je popsáno v příkladu 1.

Výsledky

Data třepání kultur v lahvích jsou znázorněna v tabulce 6 níže. Jak je zřejmě z příkladu 1 pro produkci rhuFab‘2-LZ (xCD18), Pre- kmeny 43H1 a 59A7 byly kvalitnější než Prc+ kmeny 60C1 a 33B6 v množství produkovaného produktu (anti-VEGF Fab‘ a protitkáňový faktor Fab‘2-LZ-6xhis).

Obrázek 12 představuje 2-D gel ukazující, že prc delece (kmen 59A7, prc-minus kmen) exprimující anti-VEGF Fab (pY0317tet20) odstraňuje všechny degradované anti-VEGF LC a dva degradované xVEGF HC fragmenty (nalezeny u prc-plus kmene), ačkoliv dva oddělené HC štěpy byly objeveny u 59A7, které jsou buď OmpT- nebo Ptr3-štěpené produkty. Obrázek 13 je 2-D gel ukazující, že kmen 600 (prc-plus kmen) exprimující anti-VEGF Fab (pY0317tet20) jako heterologní polypeptid, obsahoval mmonočetně degradovaný anti-VEGF LC a dva degradované HC fragmenty.

9« 9999

Tabulka 6: Data třepání v lahvích srovnávající xVEGF Fab u prc+l- hostitele a xTF Fab‘2-LZ6xhis expresi u prc+l- hostitele

Kmen	Kultivace 24 hodin	Kultivace 42 hodin	Stav pst
	anti-VEGF (mg/l/OD)	Fab
59A7/pY0317tet20	2,44		-
59A7/pY0317tet20	2,53		-
60Cl/pY0317tet20	0,82		+
60Cl/pY0317tet20	1,03		+
	anti-TF Fab‘2 (mg/l/OD)	-LZ-6xhis
33B6/pd3h44f2	0,68	0,54	+
43Hl/pd3h44f2	1,6	1,88	-
59A7/pd3h44f2	2,18	3,98	-

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

* 0 «β · 0 · »Μ • · » · e · ·

0 0 0* 0 0 0

E. coli kmen, který je nedostatečný v chromozomální degP aprc kódující proteinázu DegP a Prc, a který nese mutantní spr gen, jehož produkt potlačuje růstový fenotyp, který je vykazován kmeny nesoucí prc mutanty.

Kmen podle nároku 1, který není nedostatečný v chromozomální ptr3 kódující Proteinázu III nebo v chromozomální ompT kódující proteinázu OmpT.

Kmen podle nároku 1, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující heterologní polypeptid ke kmeni.

Kmen podle nároku 3, přičemž polypeptid je proteolyticky citlivý.

Kmen podle nároku 3, přičemž polypeptid je eukaryotický polypeptid.

Kmen podle nároku 5, přičemž polypeptid je savčí polypeptid.

Kmen podle nároku 3, který je transformován nukleovou kyselinou.

Způsob tvorby polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje a) kultivaci E. coli kmene nedostatečného v chromozomálním prc kódující proteinázu Prc a nesoucí mutantní spr gen, jehož produkt potlačuje růstový fenotyp, který je vykazován kmeny nesoucí prc mutanty, jejichž kmen obsahuje nukleovou kyselinu kódující polypeptid, který je heterologní ke kmeni, ve kterém je nukleová kyselina exprimována, a b) získání heterologního polypeptidu ze kmene.

Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že heterologní polypeptid je proteolyticky citlivý.

Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že kultivace probíhá v kvasném zařízení.

Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že kultivace probíhá za podmínek vysokohustotního buněčného kvašení.
12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že kultivace probíhá za podmínek nízkohustotního buněčného kvašení.

44 49 • · · 4 • · · · • · 4 9 1 • · · « ·* ·( *· ♦·*·
13. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že polypeptid je získáván z periplazmy nebo z kultivačního média kmene.
14. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že polypeptid je protilátka nebo Apo2 ligand.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že polypeptid je protilátka.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že protilátka je humanizovaná protilátka.
17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že protilátka je v celé délce.
18. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že protilátka je anti-CD 18, antiVEGF, protitkáňový faktor, 2C4, anti-Her-2, anti-CD20, anti-CD40, nebo anti-CDlla protilátka.
19. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že protilátku představuje fragment protilátky.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že fragment protilátky má lehký řetězec.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že lehký řetězec je kappa lehký řetězec.
22. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že fragment protilátky je Fab, Fab‘, Fab‘2, nebo Fab‘2 s leucinovým zipem.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že fragment protilátky je antiCD 18 Fab‘2 s leucinovým zipem, protitkáňový faktor Fab‘2 s leucinovým zipem, nebo antiVEGF Fab, s histidinovou nebo lysinovou značkou nebo bez nich.
24. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že fragment protilátky je antiCD 18 Fab‘2 s leucinovým zipem, protitkáňový faktor Fab‘2 s leucinovým zipem s 6-histidinovou značkou, anti-VEGF Fab, anti-CD 18 Fab‘2 s leucinovým zipem a 6-histidinovou značkou, a anti-CD18 Fab‘2 s leucinovým zipem a 6-lysinovou značkou.

1 GAATTCAACT TCTCCATACT TTGGATAAGG AAATACAGAC ATGAAAAATC TCATTGCTGA

61 GTTGTTATTT AAGCTTTGGA GATTATCGTC ACTGCAATGC TTCGCAATAT GGCGCAAAAT

121 GACCAACAGC GGTTGATTGA TCAGGTAGAG GGGGCGCTGT ACGAGGTAAA GCCCGATGCC

181 AGCATTCCTG ACGACGATAC GGAGCTGCTG CGCGATTACG TAAAGAAGTT ATTGAAGCAT

241 CCTCGTCAGT AAAAAGTTAA TCTTTTCAAC AGCTGTCATA AAGTTGTCAC GGCCGAGACT

301 TATAGTCGCT TTGTTTTTAT TTTTTAATGT ATTTGTAACT AGAATTCGAG CTCGGTACCC

341 GGGGATCCTC TAGAGGTTGA GGTGATTTT' ATG AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT -23 MK KNIAFL