KR101741865B1 - 돌연변이체 ｓｐｒ 유전자 및 야생형 ｔｓｐ 유전자를 포함하는 박테리아 숙주 균주 - Google Patents

돌연변이체 ｓｐｒ 유전자 및 야생형 ｔｓｐ 유전자를 포함하는 박테리아 숙주 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돌연변이체 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자를 포함하며, 비재조합 야생형 염색체 Tsp 유전자를 포함하는 재조합 그람-음성 박테리아 세포를 제공한다.

Description

돌연변이체 ＳＰＲ 유전자 및 야생형 ＴＳＰ 유전자를 포함하는 박테리아 숙주 균주{BACTERIAL HOST STRAIN COMPRISING A MUTANT SPR GENE AND A WILD-TYPE TSP GENE}
본 발명은 재조합 박테리아 숙주 균주, 특히 이.콜라이(E.coli)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 세포에서 목적 단백질을 생성시키는 방법에 관한 것이다.
박테리아 세포, 예컨대 이.콜라이는 재조합 단백질을 제조하는데 통용된다. 특히 플라스미드를 통한 유전자 삽입을 허용하는 숙주 세포로서 박테리아 세포의 다재다능한 성질 덕분에 재조합 단백질을 제조하기 위해 박테리아 세포, 예컨대 이.콜라이를 사용하는 것은 많은 장점을 갖는다. 이.콜라이는 인간 인슐린을 포함하여 많은 재조합 단백질을 제조하는데 사용되어 왔다.
재조합 단백질을 제조하는데 박테리아 세포를 사용하는 것이 많은 장점을 가짐에도 불구하고, 목적 재조합 단백질의 발현 동안 박테리아 세포가 용균되는 경향을 포함하여 여전히 상당한 제한이 존재한다. 이러한 용균 표현형은 야생형 박테리아 세포와 또한 유전자 조작 세포, 예컨대 박테리아 프로테아제가 결여된 세포에서도 볼 수 있다. 프로테아제는 이.콜라이 주변세포질(periplasm) 및 세포질에서 늙고, 손상되거나 또는 미스폴딩된 단백질을 순환회수시키는데서 중요한 역할을 한다. 박테리아 프로테아제는 목적 재조합 단백질을 분해하는 기능을 하여, 종종 유의하게 활성 단백질의 수율을 저하시킨다. 따라서, 프로테아제 활성 감소가 목적 단백질의 단백질가수분해를 줄이는데 바람직하다. 그러나, 프로테아제, 예컨대 Tsp(Prc라고도 알려짐)가 결여된 박테리아 균주도 역시 세포 용균을 나타낸다.
Tsp(Prc라고도 알려짐)는 60 kDa의 주변세포질 프로테아제이다. Tsp(prc) 활성 저하는 목적 단백질의 단백질가수분해를 줄이는데 유리하다. 그러나, 프로테아제 prc가 결여된 세포는 저삼투압에서 감열성 성장을 보이는 것으로 확인되었다. [Hara et al.]는 유전자외 억제인자(spr) 돌연변이를 함유하는 내열성 복귀돌연변이인 Tsp 결핍 균주를 단리하였다(Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Spr은 18kDa의 막결합 주변세포질 프로테아제이고, spr의 기질은 세포 분열 동안 세포벽 가수분해에 관여하는 외막내 펩티도글리칸과 Tsp이다. spr 유전자는 UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_ECOLI)로서 표시된다. 돌연변이체 spr 유전자를 보유하는 프로테아제 결핍 박테리아 균주는 [Chen et al (Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5;85(5):463-74)]에 기술되어 있는데 여기서는 유전자의 상류와 하류 영역을 증폭시키고 이들을 선별 마커와 sprW174R 돌연변이를 포함하는 벡터 상에 함께 결찰시킴으로써 생성된, prc(Tsp) 및 다른 프로테아제, DegP에 상이한 돌연변이 조합을 보유하는 이.콜라이 균주의 제작을 기술하고 있다.
놀랍게도 돌연변이체 spr 유전자 및 야생형 Tsp 유전자를 보유하는 그람-음성 박테리아 세포가 용균성이 감소된 세포를 제공한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명자는 목적 단백질을 생성하는데 유리한 특성을 갖는 신규한 균주를 제공한다.
놀랍게도 본 발명에 따른 세포는 유리한 성장 및 단백질 수율 표현형을 나타내는데, spr 및 Tsp가 상호 억제인자로 알려져 있기 때문에, 아마도 하나가 우세하도록 만들면 세포가 불충분한 성장 표현형을 보이거나, 예컨대 누출되거나 또는 높은 세포 용균 경향을 나타내는 것으로 예측된다. 하지만, 본 발명의 세포는 야생형 세포 및 넉아웃(knockout) 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포와 비교하여 세포 용균 표현형이 상당히 감소된 것으로 나타났다.
본 발명은 돌연변이체 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자를 포함하며, 비재조합 야생형 염색체 Tsp 유전자를 포함하는 재조합 그람-음성 박테리아 세포를 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 세포의 게놈은 돌연변이된 spr 유전자를 제외하고는 야생형 박테리아 세포의 게놈과 동질유전자형이다.
본 발명에서 제공하는 세포는 유리한 성장 및 단백질 생성 표현형을 나타낸다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 재조합 그람-음성 박테리아 세포에서 목적 재조합 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 목적 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
도 1은 야생형 W3110 및 MXE001와 비교하여 MXE012 및 MXE017의 성장률을 도시한 도면이다.
도 2는 야생형 W3110 및 MXE001와 비교한 MXE012 및 MXE017에서 항-TNFα Fab'의 발현을 도시한 도면이다.
도 3은 항-TNFα Fab' 생성 발효 동안 W3110 및 MXE012의 성장 프로파일을 보여주는 도면이다.
도 4는 항-TNFα Fab' 생성 발효 동안 W3110 및 MXE012 (W3110 spr H119A)에 대한 항-TNFα Fab' 축적(실선 및 채워진 심볼) 및 배지 Fab' 축적(점선 및 오픈 심볼)을 보여주는 도면이다.
도 5는 항-TNFα Fab' 발현 균주 W3110 및 MXE012 및 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 W3110 및 MXE012의 성장 프로파일을 도시한 도면이다.
도 6은 항-TNFα Fab' 발현 균주 W3110 및 MXE012 및 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 W3110 및 MXE012 유래의 주변세포질(음영 심볼) 및 상등액(개방 비음영 심볼)으로부터의 항-TNFα Fab' 수율을 도시한 도면이다.
도 7은 W3110, MXE001, MXE008 및 MXE012 균주의 dsDNA 어세이 결과를 도시한 도면이다.
도 8은 W3110, MXE001, MXE008 및 MXE012 균주의 단백질 어세이 결과를 도시한 도면이다.
도 9a는 야생형 ptr(프로테아제 III) 및 넉아웃 돌연변이된 ptr(프로테아제 III) 단백질 및 유전자 서열의 5' 말단을 도시한 도면이다.
도 9b는 야생형 Tsp 및 넉아웃 돌연변이된 Tsp 단백질 및 유전자 서열의 5' 말단을 도시한 도면이다.
도 9c는 야생형 DegP 및 돌연변이된 DegP 단백질 및 유전자 서열의 영역을 도시한 도면이다.
도 10은 본 발명의 구체예에 따라 세포를 생성시키는데 사용된 벡터의 구성을 도시한 도면이다.
도 11은 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 200 ℓ 발효물의 성장 프로파일을 도시한 도면이다.
도 12는 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 200 ℓ 발효물의 항-TNFα Fab' 역가를 도시한 도면이다.
도 13은 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 200 ℓ 발효물의 생존률을 도시한 도면이다.
도 14는 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 3000 ℓ 발효물의 성장 프로파일을 도시한 도면이다.
도 15는 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 3000 ℓ 발효물의 항-TNFα Fab' 역가를 도시한 도면이다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 개시 코돈의 상류에 6개 뉴클레오티드 ATGAAC를 포함하는 야생형 Tsp 유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 2는 야생형 Tsp 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 개시 코돈의 상류에 6개 뉴클레오티드 ATGAAT를 포함하는 돌연변이된 넉아웃 Tsp 유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 4는 야생형 프로테아제 III 유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 5는 야생형 프로테아제 III 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 돌연변이된 넉아웃 프로테아제 III 유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 7은 야생형 DegP 유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 8은 야생형 DegP 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 9는 돌연변이된 DegP 유전자의 DNA 서열이다.
서열번호 10은 돌연변이된 DegP 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 11은 항-TNF 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 12는 항-TNA 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다.
서열번호 13은 항-TNF 항체의 경쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호 14는 항-TNF 항체의 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호 15는 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 돌연변이된 Tsp 유전자 영역에 대한 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열이다.
서열번호 16은 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 돌연변이된 Tsp 유전자 영역에 대한 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열이다.
서열번호 17은 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 돌연변이된 프로테아제 III 유전자 영역의 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열이다.
서열번호 18은 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 돌연변이된 프로테아제 III 유전자 영역에 대한 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열이다.
서열번호 19는 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 돌연변이된 DegP 유전자 영역에 대한 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열이다.
서열번호 20은 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 돌연변이된 DegP 유전자 영역에 대한 3' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열이다.
서열번호 21은 처음 26개 아미노산 잔기인 신호 서열을 포함하는 야생형 spr 유전자의 서열이다. 서열번호 22는 신호 서열이 없는 비돌연변이된 spr 유전자의 서열이다.
서열번호 23은 D210A 및 H212A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 OmpT 서열의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 24는 D210A 및 H212A 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 OmpT 서열의 아미노산 서열이다.
서열번호 25는 돌연변이된 넉아웃 OmpT 서열의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 26은 His-태깅된 DsbC의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 27은 His-태깅된 DsbC의 아미노산 서열이다.
서열번호 28은 hTNF40의 CDRH1의 아미노산 서열이다.
서열번호 29는 CDRH2 of hTNF40 하이브리드 CDR인 hTNF40의 CDRH2의 아미노산 서열로서, 여기서 C-말단 6개 아미노산은 인간 서브그룹 3 배선 항체의 H2 CDR 서열에서 유래한 것이고 이러한 하이브리드화 결과에 따른 아미노산 서열 변화는 다음과 같다: WINTYIGEPI YADSVKG.
서열번호 30은 hTNF40의 CDRH3의 아미노산 서열이다.
서열번호 31은 hTNF40의 CDRL1의 아미노산 서열이다.
서열번호 32는 hTNF40의 CDRL2의 아미노산 서열이다.
서열번호 33은 hTNF40의 CDRL3의 아미노산 서열이다.
서열번호 34는 hTNF40의 CDRH2의 아미노산 서열이다.
서열번호 35는 OmpA 올리고뉴클레오티드 어댑터의 서열이다.
서열번호 36은 이.콜라이 Fab 발현을 위한 유전자간 서열 1(IGS1)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 카세트의 서열이다.
서열번호 37은 이.콜라이 Fab 발현을 위한 유전자간 서열 2(IGS2)를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 카세트의 서열이다.
서열번호 38은 이.콜라이 Fab 발현을 위한 유전자간 서열 3(IGS3)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 카세트의 서열이다.
서열번호 39는 이.콜라이 Fab 발현을 위한 유전자간 서열 4(IGS4)를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 카세트의 서열이다.
본 발명은 돌연변이된 spr 유전자 및 비재조합 야생형 염색체 Tsp 유전자를 포함하는 목적 단백질을 발현시키는데 적합한 재조합 그람-음성 박테리아 세포를 제공한다.
놀랍게도 돌연변이된 spr 및 비재조합 야생형 염색체 Tsp를 보유하는 세포가 세포 성장을 향상시킨 것으로 나타났고 야생형 세포 또는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포에 비하여 세포 용균 표현형이 감소된 것으로 나타남을 확인하였다.
또한, 일 구체예에서, 돌연변이체 spr 및 비재조합 야생형 염색체 Tsp를 보유하는 세포는 야생형 박테리아 세포 또는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포에 비하여 목적 재조합 단백질의 수율이 증가된 것으로 나타났다. 향상된 단백질 수율은 주변세포질 단백질 수율 및/또는 상등액 단백질 수율일 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 세포는 세포로부터의 누출 감소 덕분에 야생형 세포와 비교하여 주변세포질 단백질 수율이 향상된 것으로 나타났다. 재조합 박테리아 세포는 세포 용균 감소 덕분에 목적 재조합 단백질을 장기간 발현할 수 있다.
본 발명에 따른 세포는 바람직하게 주변세포질 및/또는 배지 내 목적 단백질의 최대 수율이 대략 1.0g/ℓ, 1.5g/ℓ, 1.8g/ℓ, 2.0g/ℓ, 2.4g/ℓ, 2.5g/ℓ, 3.0g/ℓ, 3.5g/ℓ 또는 4.0g/ℓ로 나타난다.
이전에 재조합 단백질을 발현하기 위해 생성하여 사용된, 기지의 유전자 조작 균주, 예컨대 프로테아제 결핍 박테리아 균주와 관련된 단점에는 세포 물질대사 및 DNA 복제에 관여되는 유전자 예컨대, 이.콜라이 균주에서의 phoA, fhuA, lac, rec, gal,ara, arg, thi 및 pro의 돌연변이의 사용을 포함한다. 이들 돌연변이는 세포 성장, 안정성, 재조합 단백질 발현 수율 및 독성에 대한 효과를 포함하여 숙주 세포에 대한 많은 유해한 효과를 가질 수 있다. 이들 게놈 돌연변이 중 1 이상을 갖는 균주, 특히 높은 수로 이들 돌연변이를 갖는 균주는 산업적 단백질 생산에 적합하지 않은 수준으로 박테리아의 성장을 저하시키는 건강성 상실을 나타낼 수 있다. 또한, 상기 게놈 돌연변이 중 임의의 돌연변이는 예측할 수 없는 해로운 방식으로 시스 및/또는 트랜스로 다른 유전자에 영향을 미칠 수 있고 그에 따라 균주의 표현형, 건강성 및 단백질 프로파일을 변경시킬 수 있다. 게다가, 심하게 돌연변이된 세포의 사용은 대체로, 상업적 용도, 특히 치료제용의 재조합 단백질 제조에는 적합하지 않은데, 이러한 균주들은 일반적으로 결핍성 물질대사 경로를 가지게 되어 최소 또는 화학적으로 한정된 배지에서 불충분하게 성장하거나 또는 전혀 성장하지 않을 수 있기 때문이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 세포는 spr 돌연변이체를 도입하는데 요구되는 게놈에서의 오직 최소 돌연변이만을 보유한다. 이러한 구체예에서, 박테리아 세포의 게놈은 spr 유전자에 1 이상의 돌연변이만이 야생형 박테리아 세포의 게놈과 다르고 목적 단백질의 발현능 및/또는 세포의 성장에 유해한 영향을 줄 수 있는 임의의 다른 돌연변이는 보유하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 1 이상의 재조합 숙주 세포는 게놈 서열에 추가의 유전자 조작 돌연변이를 포함하는 세포와 비교하여 향상된 단백질 발현성 및/또는 향상된 성장 특징을 나타낼 수 있다. 본 발명에서 제공하는 세포는 또한 세포 게놈에 추가의 파괴를 포함하는 세포와 비교하여 치료 단백질을 생산하는데 사용하는 것이 보다 더 적합하다.
본 발명은 또한 돌연변이체 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자를 포함하는 재조합 그람-음성 박테리아 세포를 제공하며, 이 세포의 게놈은 돌연변이된 spr 유전자를 제외하고는 야생형 박테리아 세포의 게놈와 동질유전자형이다. 본 발명의 이러한 측면에서, 세포는 야생형 Tsp 유전자를 보유한다. 야생형 염색체 Tsp 유전자는 바람직하게 비재조합 염색체 Tsp 유전자이다.
당분야의 숙련가는 발효배양법, ELISA 및 단백질 G HPLC 등을 포함하는 당분야에 공지된 방법을 사용해 목적 단백질의 원하는 수율을 갖는지를 확인하기 위해 후보 세포 클론을 쉽게 테스트할 수 있다. 발효배양법은 하기 문헌들에 기술되어 있다. [Humphreys D P, et al. (1997). Formation of dimeric Fabs in E.coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab' expression levels, tail piece sequences and growth conditions. J. IMMUNOL. METH. 209: 193-202; Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N. Bowering L. Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Journal of Biotechnology. 135(4):358-65, 2008 Jul 31; Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Journal Article] Proteomics. 1(9):1133-48, 2001 Sep; 및 Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U. Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S. Pluckthun A. Riesenberg D. High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Applied Microbiology & Biotechnology. 46(5-6):524-32, 1996 Dec]. 당분야의 숙련가는 당분야의 공지 방법, 예컨대 단백질 G HPLC, 원이색법, NMR, X-선 결정학 및 에피토프 친화력 측정법을 사용해 단백질 올바르게 폴딩되었는지 여부를 확인하기 위해 분비 단백질을 쉽게 테스트할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다.
본 발명을 이하 보다 상세하게 설명한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 달리 명세서에서 언급하지 않으면 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "펩티드"는 10개 또는 그 이하의 아미노산을 의미하는 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 달리 언급하지 않으면 유전자, DNA, cDNA, RNA, mRNA 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서의 용어 "포함하는(comprising)"은 "포괄하는(including)"으로 해석되어야 한다.
본원의 명세서에서 비돌연변이 세포 또는 제어 세포는 돌연변이체 spr 유전자를 보유하도록 변형되지 않은, 본 발명의 재조합 그람-음성 세포와 동일한 유형의 세포를 의미한다. 예를 들면, 비돌연변이 세포는 야생형 세포일 수 있고 임의의 돌연변이를 도입하기 위한 변형전 본 발명의 세포와 동일한 숙주 세포 개체군에서 유래될 수 있다.
표현 "세포", "세포주", "세포 배양물" 및 "균주"는 상호교환적으로 사용된다.
본 발명에서 표현 "돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형"은 돌연변이체 Tsp 유전자를 보유하는 세포에 의해 나타나는 표현형을 의미한다. 대체로 돌연변이체 Tsp 유전자를 포함하는 세포는 특히 고밀도 세포에서 용균될 수 있다. 이들 세포의 용균은 임의의 재조합 단백질이 상등액으로 누출되게 한다. 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포는 또한 저오스모몰농도에서 감열성 성장을 보일 수 있다. 예를 들면, 세포는 고온, 예컨대 40℃ 또는 그 이상의 온도에 저장성 배지에서 사멸하거나 또는 성장률을 보이지 않거나 또는 감소된 성장률을 보이지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "동질유전자형(isogenic)"은 본 발명의 세포의 게놈이 돌연변이된 spr 유전자를 제외하고는 유도시킨 야생형 세포와 비교하여 동일한 게놈 서열을 갖거나 또는 실질적으로 동일한 게놈 서열을 갖는 것을 의미한다. 이러한 구체예에서 본 발명에 따른 세포의 게놈은 추가의 비천연 발생 또는 유전자 조작 돌연변이를 포함하지 않는다. 일 구체예에서 본 발명에 따른 세포는 일어날 수 있는 임의의 천연 발생 돌연변이를 고려하여, 돌연변이된 spr 유전자를 제외하고는 야생형 세포와 비교하여 실질적으로 동일한 게놈 서열을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 돌연변이된 spr 유전자를 제외하고는 야생형 세포와 정확하게 동일한 게놈 서열을 가질 수 있다.
세포가 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 구체예에서, DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포를 형질전환시키고/시키거나 숙주 세포 게놈에 통합되는 적절한 발현 벡터 상에 존재할 수 있다. DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 게놈에 삽입되는 구체예에서, 본 발명의 세포는 또한 DsbC를 코딩하는 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열로 인해 야생형 세포와는 다를 수 있다. 바람직하게, DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현 벡터에 존재하여 숙주 세포의 게놈에 최소한의 파괴를 야기시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "야생형"은 임의의 유전자 조작 돌연변이를 보유하지 않는, 환경에서 단리된 그대로 또는 자연계에서 발생될 수 있는 그대로의 그람-음성 박테리아 세포 균주를 의미한다. 야생형 이.콜라이의 예로는 W3110, 예컨대 W3110 K-12 균주가 있다.
임의의 적절한 그람-음성 박테리아가 본 발명의 재조합 세포를 생산하기 위한 모세포로서 사용될 수 있다. 적절한 그람-음성 박테리아로는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 슈도모나서 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 어위니아 카로토보라(Erwinia carotovora), 시겔라(Shigella), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 슈노모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii) 및 이.콜라이가 포함된다. 바람직하게 모세포는 이.콜라이이다. 이.콜라이의 임의의 적절한 균주를 본 발명에서 사용할 수 있지만, 바람직하게는 야생형 W3110 균주, 예컨대 K-12 W3110가 사용된다.
바람직한 구체예에서, 세포는 돌연변이된 spr 유전자를 제외하고는, 야생형 이.콜라이 세포, 예컨대 W3110과 동질유전자형이다.
일 구체예에서, 본 발명의 세포는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 구체예에서, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포를 형질전환시키고/시키거나 숙주 세포의 게놈으로 통합되는 적절한 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 게놈에 삽입된 구체예에서, 본 발명의 게놈은 또한 목적 단백질을 코딩하는 삽입된 폴리뉴클레오티드 서열로 인해 야생형 세포와는 다를 수 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현 벡터에 존재하여 숙주 세포의 게놈에 최소의 파괴만 일으킨다.
본 발명에 따른 세포는 야생형 Tsp 유전자를 보유한다. 본 발명의 일 측면에서, 세포는 야생형 비재조합 염색체 Tsp 유전자를 보유한다. 야생형 비재조합 염색체 Tsp 유전자는 재조합 DNA 기법을 사용해 구성되거나, 제조되거나 또는 염 색체에 삽입되거나 하지 않은 염색체 Tsp 유전자를 의미한다.
본원에서 사용되는 "Tsp 유전자"는 페니실린-결합 단백질-3(PBP3) 및 페이지 꼬리 단백질에 대해 작용할 수 있는 주변세포질 프로테아제인 프로테아제 Tsp(Prc라고도 함)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 야생형 Tsp 유전자의 서열은 서열번호 1에 나타내었고 야생형 Tsp 단백질의 서열은 서열번호 2로 나타내었다.
spr 단백질은 18 kDa 막 결합 주변세포질 프로테아제이고 spr의 기질은 세포 분열 동안 세포벽 가수분해에 관여하는 외막내 펩티도글리칸 및 Tsp이다.
spr 단백질의 야생형 아미노산 서열은 N 말단에 신호서열을 표시하여 서열번호 21로 나타내었고 26개 아미노산의 신호 서열 없이 서열번호 22로 나타내었다(UniProt 수탁번호 P0AFV4에 따름). 본 발명에서 spr 단백질 서열의 아미노산 넘버링은 신호 서열을 포함한다. 따라서, spr 단백질의 아미노산 1은 서열번호 21에 나타낸 제1 아미노산(Met)이다.
돌연변이된 spr 유전자는 바람직하게는 세포의 염색체 spr 유전자이다.
돌연변이된 spr 유전자는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질을 코딩한다. 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포는 양호한 세포 성장률을 가질 수 있지만 이들 세포의 한가지 한계는 특히 고밀도 세포에서 용균되는 경향이다. 따라서, 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형은, 특히 고밀도 세포에서의 용균 경향이다. 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포는 또한 낮은 오스모몰농도에서 감열성 성장을 보여준다. 그러나, 본 발명의 세포가 보유하는 spr 돌연변이는, 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포로 도입시, 돌연변이체 Tsp 표현형을 억제하며, 그에 따라 특히 고밀도 세포에서, 낮은 용균성을 나타낸다. 세포의 성장 표현형은 진탕 플라스크 또는 고밀도 세포 발효배양 기술 동안 당분야의 숙련가가 쉽게 측정할 수 있다. 세포 용균 표현형의 억제는 Tsp 돌연변이체 및 야생형 spr을 보유하는 세포와 비교하여 spr 돌연변이체 및 Tsp 돌연변이체를 보유하는 세포가 나타내는, 특히 주변세포질에서의, 개선된 재조합 단백질 생성 및/또는 개선된 성장률로 확인할 수 있었다.
임의의 적절한 돌연변이 또는 돌연변이를 spr 유전자에 가하여서 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질을 생성시킬 수 있다. 이러한 활성은 돌연변이체 spr 유전자 및 돌연변이체 Tsp 유전자를 보유하는 세포를 생성시키고 돌연변이체 Tsp 유전자만을 보유하는 세포의 표현형과 비교함으로써 당분야의 숙련가가 테스트할 수 있다. Tsp 유전자에 적절한 돌연변이는 이하에 상세히 기술한다. 돌연변이된 Tsp 유전자 또는 돌연변이된 Tsp 유전자가 코딩하는 Tsp에 대한 언급은 달리 언급하지 않으면 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자 또는 저하된 프로테아제 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩하는 돌연변이된 Tsp 유전자를 의미하는 것이다.
표현 "저하된 프로테아제 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩하는 돌연변이된 Tsp 유전자"는 돌연변이된 Tsp 유전자가 야생형 비돌연변이된 Tsp 유전자와 비교하여 완전한 프로테아제 활성을 갖지 않음을 의미한다. 돌연변이된 Tsp 유전자는 야생형 비돌연변이된 Tsp 단백질의 프로테아제 활성의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하의 활성을 갖는 Tsp 단백질을 코딩할 수 있다. 돌연변이된 Tsp 유전자는 프로테아제 활성을 갖지 않는 Tsp 단백질을 코딩할 수 있다. 세포는 염색체 Tsp에 결핍이 없는데, 다시 말해서, Tsp 유전자는 임의 형태의 Tsp 단백질 발현을 방지하도록 결실되거나 또는 돌연변이되지 않았다.
저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 생성시키기 위해 임의의 적절한 돌연변이를 Tsp 유전자에 도입시킬 수 있다. 그람-음성 박테리아에서 발현되는 Tsp 단백질의 프로테아제 활성은 임의의 적절한 방법, 예컨대 Tsp의 프로테아제 활성을 테스트한 [Keiler et al (Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease* THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 270, No. 48, Issue of December 1, pp. 28864-28868, 1995 Kenneth C. Keiler and Robert T. Sauer)]에 기술된 방법 등의 임의의 적절한 방법으로 당분야의 숙련가가 쉽게 테스트할 수 있다.
Tsp는 [Keiler et al (상동)]에서 잔기 S430, D441 및 K455 및 잔기 G375, G376, E433 및 T452를 포함하는 활성 부위가 Tsp의 구조를 유지하는데 중요하다고 보고된바 있다. [Keiler et al (상동)]는 돌연변이된 Tsp 유전자 S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A 및 T452A가 검출가능한 프로테아제 활성을 갖지 않는다는 발견을 보고하였다. 여기서는 또한 돌연변이된 Tsp 유전자 S430C가 야생형 활성의 약 5-10%를 나타낸다고 보고하였다. 따라서, 저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 생성시키기 위한 Tsp 돌연변이는 잔기 S430, D441, K455, G375, G376, E433 및 T452의 1 이상에 돌연변이, 예컨대 미스센스 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게, 저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 생성시키기 위한 Tsp 돌연변이는 활성 부위 잔기 S430, D441 및 K455 중 1개, 2개 또는 3개 모두에 돌연변이, 예컨대 미스센스 돌연변이를 포함할 수 있다.
따라서, 돌연변이된 Tsp 유전자는 다음의 돌연변이들을 포함할 수 있다:
. S430에 돌연변이; 또는
. D441에 돌연변이; 또는
. K455에 돌연변이; 또는
. S430 및 D441에 돌연변이; 또는
. S430 및 K455에 돌연변이; 또는
. D441 및 K455에 돌연변이; 또는
. S430, D441 및 K455에 돌연변이.
S430, D441, K455, G375, G376, E433 및 T452 중 1 이상의 임의의 적절한 아미노산으로 돌연변이되어 저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 생성시킬 수 있다. 적절한 돌연변이의 예로는 S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A 및 T452A가 있다. 돌연변이된 Tsp 유전자는 활성 부위 잔기에 1개, 2개 또는 3개의 돌연변이를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 유전자는 다음의 돌연변이를 포함할 수 있다:
. S430A 또는 S430C; 및/또는
. D441A; 및/또는
. K455A 또는 K455H 또는 K455R.
바람직하게, Tsp 유전자는 점 돌연변이 S430A 또는 S430C를 포함한다.
표현 "넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자"는 유전자가 1 이상의 돌연변이를 포함하여서, 넉아웃 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 결핍된 세포를 제공하도록 그 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 발현되지 않게 하는 것을 의미한다. 넉아웃 유전자는 부분적으로 또는 완전하게 전사될 수 있지만 코딩 단백질로 번역되지 않을 수 있다. 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자는 임의의 적절한 방식으로, 예를 들면 1 이상의 결실, 삽입, 점, 미스센스, 넌센스 및 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 돌연변이되어, 단백질 발현을 일으키지 않을 수 있다. 예를 들면, 유전자는 외래 DNA 서열, 예컨대 항생제 내성 마커를 유전자 코딩 서열에 삽입시켜 넉아웃될 수 있다.
돌연변이된 Tsp 유전자는 유전자 개시 코돈에 돌연변이 및/또는 유전자 개시 코돈의 하류 및 유전자 중지 코돈의 상류에 위치하는 1 이상의 중지 코돈을 포함하여 Tsp 단백질의 발현을 방지할 수 있다. 개시 코돈에 돌연변이는 개시 코돈의 뉴클레오티드 중 1개, 2개 또는 3개 모두의 미스센스 돌연변이일 수 있다. 다르게 또는 부가적으로, 개시 코돈은 삽입 또는 결실 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다. Tsp 유전자는 코딩 서열의 5' 말단에 2개의 ATG 코돈을 포함하고, 이 ATG 코돈 중 하나 또는 둘 모두가 미스센스 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다. Tsp 유전자는 도 9b에 도시된 바와 같이, 제2의 ATG 코돈(코돈 3)에서 TCG로 돌연변이될 수 있다. Tsp 유전자는 다르게 또는 부가적으로, 유전자 개시 코돈의 하류 및 유전자 중지 코돈의 상류에 위치된 1 이상의 중지 코돈을 포함할 수 있다. 바람직하게, 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자는 개시 코돈에 미스센스 돌연변이 및 1 이상의 삽입된 중지 코돈 둘 모두를 포함한다. 도 9b에 도시된 바와 같이, Tsp 유전자는 5번째 코돈에서 "T"가 결실되도록 돌연변이시켜서 코돈 11 및 16에 중지 코돈이 생성되는 프레임쉬프트가 일어날 수 있다. 도 9b에 도시된 바와 같이, Tsp 유 전자는 Ase I 제한효소 부위가 삽입되도록 돌연변이시켜서 코돈 21에 제3의 인프레임 중지 코돈이 생성될 수 있다.
넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자는 서열번호 3의 DNA 서열을 가지는데, 이는 개시 코돈의 상류에 6개 뉴클레오티드 ATGAAT를 포함한다. 서열번호 3의 넉아웃 돌연변이된 Tsp 서열에 일으킨 돌연변이는 도 9b에 도시하였다. 일 구체예에서 돌연변이된 Tsp 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 7-2048의 DNA 서열을 갖는다.
따라서, 적절한 돌연변이체 Tsp 유전자를 보유하는 세포가 동정되면, 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질이 생성되는 적절한 spr 유전자 돌연변이를 동정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따른 세포는 N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147, H157 및 W174에서 선택된 1 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 및 W174에서 선택된 1 이상의 아미노산에 돌연변이를 갖는 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자를 포함한다. 이 구체예에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 돌연변이를 갖지 않는다. 바람직하게, 돌연변이체 spr 유전자는 N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 및 H157에서 선택된 1 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 및 H157에서 선택된 1 이상의 아미노산에 돌연변이를 갖는 spr 단백질을 코딩한다. 이러한 구체예에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 돌연변이를 갖지 않는다. 바람직하게, 돌연변이체 spr 유전자는 N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 및 G147에서 선택된 1 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 S95, V98, Y115, D133, V135 및 G147에서 선택된 1 이상의 아미노산에 돌연변이를 갖는 spr 단백질을 코딩한다. 이러한 구체예에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 돌연변이를 갖지 않는다.
본 발명의 일 측면에서, C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 및 H157에서 선택된 1 이상의 아미노산, 바람직하게는 S95, V98, Y115, D133, V135 및 G147에서 선택된 1 이상의 아미노산을 갖는 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자를 포함하는 그람-음성 박테리아 세포를 제공하며, 여기서 세포는 야생형 Tsp 유전자를 포함한다. 이러한 구체예에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 돌연변이를 갖지 않는다.
야생형 염색체 Tsp 유전자는 바람직하게는 비재조합 염색체 Tsp 유전자이다. 바람직하게, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다.
상기 아미노산 중 1 이상에 돌연변이는 이 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 중 1개, 2개 또는 3개에 대한 임의의 적절한 미스센스 돌연변이일 수 있다. 돌연변이는 이 아미노산 잔기를 임의의 적절한 아미노산으로 변경시켜서 그 결과 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 돌연변이된 spr 단백질이 생성된다. 미스센스 돌연변이는 야생형 아미노산과 비교하여 다른 크기이고/이거나 다른 화학적 특성을 갖는 것으로 그 아미노산을 변화시킬 수 있다.
일 구체예에서, 돌연변이는 C94, H145, 및 H157의 아미노산 잔기의 촉매 트티아드 중 1개, 2개 또는 3개에 대해 일어난다(Solution NMR Structure of the NlpC/P60 Domain of Lipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel Cysteine Peptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717).
따라서, 돌연변이된 spr 유전자는 다음의 돌연변이를 포함할 수 있다:
. C94에 돌연변이; 또는
. H145에 돌연변이; 또는
. H157에 돌연변이; 또는
. C94 및 H145에 돌연변이; 또는
. C94 및 H157에 돌연변이; 또는
. H145 및 H157에 돌연변이; 또는
. C94, H145 및 H157에 돌연변이.
이러한 구체예에서, spr 단백질은 바람직하게는 추가의 임의 돌연변이를 갖지 않는다.
C94, H145 및 H157 중 1개, 2개 또는 3개는 임의의 적절한 아미노산으로 돌연변이되어서 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질을 생성시킬 수 있다. 예를 들면, C94, H145, 및 H157 중 1개, 2개 또는 3개는 소형 아미노산 예컨대 Gly 또는 Ala로 돌연변이될 수 있다. 따라서, spr 단백질은 돌연변이 C94A, H145A 및 H157A 중 1개, 2개 또는 3개를 가질 수 있다. 바람직하게, spr 유전자는 미스센스 돌연변이 H145A를 포함하는데, 이는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질을 생성시키는 것으로 확인되었다.
본원에서 치환 돌연변이체에 대한 표시는 글자 다음에 번호가 이어지고 뒤이어 글자로 이루어진다. 첫번째 글자는 야생형 단백질에서의 아미노산을 의미한다. 번호는 아미노산 치환이 이루어진 아미노산 위치를 의미하며, 두번째 글자는 야생형 아미노산을 치환시키는데 사용된 아미노산을 의미한다.
바람직한 구체예에서, 돌연변이체 spr 단백질은 N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 및 G147에서 선택된 1 이상의 아미노산에 돌연변이, 바람직하게는 S95, V98, Y115, D133, V135 및 G147에서 선택된 1 이상의 아미노산에 돌연변이를 포함한다. 이러한 구체예에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 돌연변이를 갖지 않는다. 따라서, 돌연변이된 spr 유전자는 다음의 돌연변이를 포함한다:
. N31에 돌연변이; 또는
. R62에 돌연변이; 또는
. I70에 돌연변이; 또는
. Q73에 돌연변이; 또는
. S95에 돌연변이; 또는
. V98에 돌연변이; 또는
. Q99에 돌연변이; 또는
. R100에 돌연변이; 또는
. L108에 돌연변이; 또는
. Y115에 돌연변이; 또는
. D133에 돌연변이; 또는
. V135에 돌연변이; 또는
. L136에 돌연변이; 또는
. G140에 돌연변이; 또는
. R144에 돌연변이; 또는
. G147에 돌연변이.
일 구체예에서 돌연변이체 spr 단백질은 다음과 같이 복수개의 아미노산에 대한 돌연변이를 포함한다:
. S95 및 Y115; 또는
. N31, Q73, R100 및 G140　; 또는
. Q73, R100 및 G140; 또는
. R100 및 G140; 또는
. Q73 및 G140; 또는
. Q73 및 R100;또는
. R62, Q99 및 R144　;또는
. Q99 및 R144.
N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 및 G147 중 1 이상은 임의의 적절한 아미노산으로 돌연변이되어 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포의 표현형을 억제할 수 있는 spr 단백질이 생성될 수 있다. 예를 들면, N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 및 R144 중 1 이상은 소형 아미노산 예컨대 Gly 또는 Ala로 돌연변이될 수 있다.
바람직한 구체예에서 spr 단백질은 다음의 돌연변이 중 1 이상을 포함한다: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D 또는 V135G, L136P, G140C, R144C 및 G147C. 바람직하게 spr 단백질은 다음의 돌연변이 중 1 이상을 포함한다: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D 또는 V135G 및 G147C. 이러한 구체예에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 돌연변이를 갖지 않는다.
일 구체예에서 spr 단백질은 N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D 또는 V135G, L136P, G140C, R144C 및 G147C에서 선택된 1종의 돌연변이를 갖는다. 이러한 구체예에서, spr 단백질은 바람직하게는 임의의 추가 돌연변이를 갖지 않는다.
추가 구체예에서, spr 단백질은 하기에서 선택된 복수개의 돌연변이를 갖는다:
. S95F 및 Y115F;
. N31Y, Q73R, R100G 및 G140C;
. Q73R, R100G 및 G140C;
. R100G 및 G140C;
. Q73R 및 G140C;
. Q73R 및 R100G;
. R62C, Q99P 및 R144C; 또는
. Q99P 및 R144C.
일 구체예에서 spr 단백질은 돌연변이 W174R을 갖는다. 다른 구체예에서, spr 단백질은 돌연변이 W174R을 갖지 않는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 돌연변이된 spr 유전자 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는, "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기법을 사용해 구성되거나 또는 제조된 단백질을 의미한다. DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리아 세포에서 발견되는 DsbC를 코딩하는 내생성 서열과 동일할 수 있다. 다르게, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열은 야생형 DsbC 서열의 돌연변이형, 예를 들면, 제한효소 부위, 예컨대 EcoRI 부위가 제거된 돌연변이형, 및/또는 His-태그를 코딩하는 서열을 갖는 돌연변이형이다. 본 발명에서 사용하기 위한 변형된 DsbC 뉴클레오티드 서열의 예는 서열번호 26에 도시하였으며, 이는 서열번호 27에 도시된 His-태깅된 DsbC 아미노산 서열을 코딩한다.
본 발명의 일 측면에서는, 돌연변이체 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 야생형 Tsp 유전자를 포함하는 그람-음성 박테리아 세포를 제공한다. 야생형 Tsp 유전자는 바람직하게는 비재조합 염색체 Tsp 유전자이다.
DsbC는 이.콜라이에서 이황화 결합 형성을 촉매하는 이.콜라이의 주변세포질에 존재하는 원핵생물 단백질이다. DsbC는 236의 아미노산 서열 길이(신호 펩티드 포함)를 가지며 분자량은 25.6 KDa이다(UniProt No. P0AEG6). DsbC는 1994년에 처음 동정되었다(Missiakas et al. The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation, The EMBO Journal vol 13, no 8, p2013-2020, 1994 및 Shevchik et al. Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity, The EMBO Jounral vol 13, no 8, p2007-2012, 1994).
숙주 세포에서 단백질 발현을 향상시키기 위해 이황화 결합의 형성을 촉매하는 단백질을 공동 발현시키는 것으로 알려져 있다. WO98/56930은 박테리아 세포에서 이종성 이황화 결합 함유 폴리펩티드를 제조하는 방법을 개시하고 있는데, 여기서 원핵생물 이황화 이소머라아제, 예컨대 DsbC 또는 DsbG가 진핵생물 폴리펩티드와 공동발현된다. US6673569는 외래 단백질을 제조하는데 사용하기 위해 DsbA, DsbB, DsbC 및 DsbD 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 인공 오페론을 개시하고 있다. EP0786009는 박테리아에서 이종성 폴리펩티드를 제조하는 방법을 개시하고 있는데, 여기서는 DsbA 또는 DsbC를 코딩하는 핵산의 발현이 이종성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현을 유도하기 전에 유도된다.
본 발명자들은 돌연변이된 spr 유전자 및 야생형 Tsp 유전자를 포함하는 박테리아 세포에서 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현의 특이적 조합이 목적 단백질을 발현시키기 위한 개선된 숙주를 제공한다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 이러한 새로운 균주는 야생형 세포 또는 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 세포와 비교하여 높은 세포 성장률 및 높은 세포 생존기간을 나타낸다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 재조합 DsbC 유전자, spr 돌연변이 및 야생형 Tsp를 보유하는 세포는 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 세포에 비하여 감소된 세포 용균 표현형을 나타낸다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 또한 다음과 같은 1 이상의 추가 단백질을 발현한다:
. 단백질 폴딩을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 FkpA, Skp, SurA, PPiA 및 PPiD; 및/또는
. 단백질 분비 또는 전좌를 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY 및 Lep; 및/또는
. 이황화 결합 형성을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.
상기 단백질 중 1 이상은 세포의 게놈에 통합되고/되거나 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 다음의 추가 단백질 중 1 이상을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다:
. 단백질 폴딩을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 FkpA, Skp, SurA, PPiA 및 PPiD;
. 단백질 분비 또는 전좌를 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY 및 Lep; 및
. 이황화 결합 형성을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 재조합 그람-음성 박테리아 세포는 샤페론 활성 및 저하된 프로테아제 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자 및/또는 돌연변이된 ptr 유전자 및/또는 돌연변이된 OmpT 유전자를 더 포함하며, 여기서 돌연변이된 ptr 유전자는 저하된 프로테아제 활성을 갖는 프로테아제 III 단백질을 코딩하거나 또는 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자이고, 돌연변이된 OmpT 유전자는 저하된 프로테아제 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩하거나 또는 적아웃 돌연변이된 OmpT 유전자이다.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 a, b, 및 c를 포함하는 재조합 그람-음성 박테리아 세포를 제공한다:
a. 돌연변이된 spr 유전자;
b. 야생형 비재조합 염색체 Tsp 유전자; 및
c. 샤페론 활성 및 저하된 프로테아제 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자 및/또는 돌연변이된 OmpT로서, 여기서 돌연변이된 OmpT 유전자는 저하된 프로테아제 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩하거나 또는 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자인 돌연변이된 OmpT.
바람직하게, 이러한 구체예에서, 세포는 상기 돌연변이를 제외하고는 야생형 박테리아 세포와 동질유전자형이다.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 a, b, 및 c를 포함하는 재조합 그람-음성 박테리아 세포를 제공한다:
a. 돌연변이된 spr 유전자;
b. 야생형 비재조합 염색체 Tsp 유전자; 및
c. 돌연변이된 ptr 유전자 및/또는 돌연변이된 OmpT 유전자로서, 여기서 돌연변이된 ptr 유전자는 저하된 프로테아제 활성을 갖는 프로테아제 III 단백질을 코딩하거나 또는 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자이고, 돌연변이된 OmpT 유전자는 저하된 프로테아제 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩하거나 또는 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자인 돌연변이된 유전자.
바람직하게, 이러한 구체예에서, 세포는 상기 돌연변이를 제외하고는 야생형 박테리아 세포와 동질유전자형이다.
일 구체예에서, 본 발명은 하기 a, b, c, d, 및 e를 포함하는 세포를 제공한다:
a. 돌연변이된 spr 유전자;
b. 야생형 비재조합 염색체 Tsp 유전자;
c. 샤페론 활성 및 저하된 프로테아제 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자;
d. 돌연변이된 ptr 유전자로서, 여기서 돌연변이된 ptr 유전자는 저하된 프로테아제 활성을 갖는 프로테아제 III 단백질을 코딩하거나 또는 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자인 돌연변이된 ptr 유전자; 및
e. 경우에 따라 돌연변이된 OmpT 유전자로서, 여기서 돌연변이된 OmpT 유전자는 저하된 프로테아제 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩하거나 또는 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자인 돌연변이된 OmpT 유전자.
바람직하게, 이러한 구체예에서, 세포는 상기 돌연변이를 제외하고는 야생형 박테리아 세포와 동질유전자형이다.
본 발명의 일 구체예에서 세포는 돌연변이된 DegP 유전자를 보유한다. 본원에서 사용되는 "DegP"는 샤페론 및 프로테아제(Families of serine peptidases; Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994;244:19-61)로서의 이중 기능을 갖는, DegP 단백질(HtrA라고도 함)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 비돌연변이된 DegP 유전자의 서열은 서열번호 7에 나타내었고 비돌연변이된 DegP 단백질의 서열은 서열번호 8에 나타내었다.
저온에서 DegP는 샤페론으로서 기능하고 고온에서 DegP는 프로테아제로서의 기능이 우선된다[(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) 및 (The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658)].
세포가 DegP 돌연변이를 포함하는 구체예에서, 세포에서 DegP 돌연변이는 샤페론 활성을 가지만 완전한 프로테아제 활성은 갖지 않는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자를 제공한다.
본원에서 사용되는 표현 "샤페론 활성을 갖는"은 돌연변이된 DegP 단백질이 야생형 비돌연변이된 DegP 단백질과 비교하여 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 샤페론 활성을 갖는것을 의미한다. 바람직하게, 돌연변이된 DegP 유전자는 야생형 비돌연변이된 DegP 단백질의 샤페론 활성의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상을 갖는 DegP 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게, 돌연변이된 DegP 유전자는 야생형 DegP와 비교하여 동일한 샤페론 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩한다.
본원에서 사용되는 표현 "저하된 프로테아제 활성을 갖는"은 돌연변이된 DegP: 단백질이 야생형 비돌연변이된 DegP 단백지로가 비교하여 완전한 프로테아제 활성을 갖지 않음을 의미한다. 바람직하게, 돌연변이된 DegP 유전자는 야생형 비돌연변이된 DegP 단백질의 프로테아제 활성의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하를 갖는 DegP 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게, 돌연변이된 DegP 유전자는 프로테아제 활성을 갖지 않는 DegP 단백질을 코딩한다. 세포는 염색체 DegP가 결핍되지 않았는데, 다시 말해서, DegP 유전자 서열이 임의 형태의 DegP 단백질 발현을 방지하도록 결실되지 않았거나 또는 돌연변이되지 않았다.
샤페론 활성 및 저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 제조하기 위하 임의의 적절한 돌연변이가 DegP 유전자에 도입될 수 있다. 그람-음성 박테리아로부터 발현되는 DegP 단백질의 프로테아제 및 샤페론 활성은 임의의 적절한 방법 예컨대 DegP의 프로테아제 및 샤페론 활성은 DegP의 천연 기질인 MalS 상에서 테스트하는 [Spiess et al]에 기술된 방법(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) 및 [The proteolytic activity of the HtrA (DegP) Protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658]에 기술된 방법으로 당분야의 숙련가가 용이하게 테스트할 수 있다.
DegP는 세린 프로테아제이고 His105, Asp135 및 Ser210의 아미노산 잔기의 촉매 트리아드로 구성된 활성 중심을 갖는다(Families of serine peptidases, Methods Enzymol., 1994, 244:19-61 Rawlings N and Barrett A). 샤페론 활성 및 저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 생성시키기 위한 DegP 돌연변이는 예컨대His105, Asp135 및 Ser210 중 1개, 2개 또는 3개에 돌연변이, 예컨대 미스센스 돌연변이를 포함한다.
따라서, 돌연변이된 DegP 유전자는 다음의 돌연변이를 포함할 수 있다:
. His105에 돌연변이; 또는
. Asp135에 돌연변이; 또는
. Ser210에 돌연변이; 또는
. His105 및 Asp135에 돌연변이; 또는
. His105 및 Ser210에 돌연변이; 또는
. Asp135 및 Ser210에 돌연변이; 또는
. His105, Asp135 및 Ser210에 돌연변이.
His105, Asp135 및 Ser210 중 1개, 2개 또는 3개는 임의의 적절한 아미노산으로 돌연변이되어 샤페론 활성 및 저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질이 생성될 수 있다. 예를 들면, His105, Asp135 및 Ser210 중 1개, 2개 또는 3개는 소형 아미노산 예컨대 Gly 또는 Ala로 돌연변이될 수 있다. 추가의 적절한 돌연변이는 His105, Asp135 및 Ser210 중 1개, 2개 또는 3개를 반대 특성을 갖는 아미노산으로 변화시키는 것인데 예컨대 Asp135를 Lys 또는 Arg로 돌연변이시키고, 극성 His105를 비극성 아미노산 예컨대 Gly, Ala, Val 또는 Leu로 돌연변이시키고, 소형 친수성 Ser210은 대형 또는 소수성 잔기 예컨대 Val, Leu, Phe 또는 Tyr로 돌연변이시킨다. 바람직하게, DegP 유전자는 샤페론 활성은 갖지만 프로테아제 활성은 갖지 않는 단백질을 생성하는 것으로 확인된, 도 9c에 도시된 바와 같은, 점 돌연변이 S210A를 포함한다(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).
DegP는 2개의 PDZ 도메인, PDZ1(잔기 260-358) 및 PDZ2(잔기 359-448)를 가지며, 이들은 단백질-단백질 상호작용을 매개한다(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M). 본 발명의 일 구체예에서 degP 유전자는 PDZ1 도메인 및/또는 PDZ2 도메인이 결실되도록 돌연변이된다. PDZ1 및 PDZ2의 결실로 인해 야생형 DepG 단백질과 비교해 샤페론 활성이 저하되고 DegP 단백질의 프로테아제 활성이 완전하게 손실되는 반면 PDZ1 또는 PDZ2 중 하나의 결실로 인해서는 프로테아제 활성이 5%가 되며 야생형 DepG 단백지로가 비교해서 샤페론 활성은 유사하다(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339-347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).
돌연변이된 DegP 유전자는 또한 예를 들어 도 9c에 도시한 바와 같이, 동정과 스크리닝법을 보조하기 위해 침묵 비천연 발생 제한효소 부위, 예컨대 Ase I을 포함할 수 있다.
점 돌연변이 S210A 및 Ase I 제한효소 마커 부위를 포함하는 돌연변이된 DegP 유전자의 바람직한 서열은 서열번호 9에 나타내었고 코딩된 단백질 서열은 서열번호 10에 도시하였다. 서열번호 9의 돌연변이된 DegP 서열에서 이루어진 돌연변이는 도 9c에 도시하였다.
세포가 샤페론 활성 및 저하된 프로테아제 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자를 포함하는 본 발명의 구체예에서, 본 발명이 제공하는 1 이상의 세포는 DegP 유전자가 DegP 발현이 방지된 넉아웃 DegP, 예컨대 염색체 결핍 DegP로 돌연변이된 돌연변이 세포에 비하여 향상된 세포 유래의 올바르게 폴딩된 단백질 수율을 제공할 수 있다. DegP 발현이 방지된 넉아웃 돌연변이된 DegP 유전자를 포함하는 세포에서, DegP의 샤페론 활성은 완전하게 소실되는 반면, 본 발명에 따른 세포에서는, DegP의 샤페론 활성은 유지되나 프로테아제 활성은 완전하게 소실된다. 이들 구체예에서, 본 발명에 따른 1 이상의 세포는 숙주 세포에서 단백질의 올바른 폴딩 및 운반을 가능케하는 샤페론 활성은 유지되는 한편 단백질의 단백질 가수분해를 방지하도록 낮아진 프로테아제 활성을 갖는다.
당분야의 숙련가는 당분야의 공지 방법, 예컨대 단백질 G HPLC, 원이색법, NMR, X-선 결정법 및 에피토프 친화력 측정법을 사용해 단백질이 올바르게 폴딩되었는지 여부를 확인하고자 분비 단백질을 쉽게 테스트할 수 있다.
이들 구체예에서, 본 발명에 따른 1 이상의 세포는 DegP 발현이 방지된 돌연변이된 넉아웃 DegP 유전자를 보유하는 세포에 비하여 향상된 세포 성장률을 갖는다. 임의의 이론에 한정되지 않고, 향상된 세포 성장률은 샤페론 활성을 요구하는 모든 단백질을 프로세싱하도록 세포의 능력을 증가시킬 수 있는 샤페론 활성을 보유하는 DegP 프로테아제 덕분에 나타나는 것이다. 따라서, 세포의 성장 및 복제에 필요한 올바르게 폴딩된 단백질의 생성은 DegP 넉아웃 돌연변이를 보유하는 세포와 비교하여 본 발명의 1 이상의 세포에서 증가될 수 있고 그에 따라 성장을 조절하는 세포 경로가 개선될 수 있다. 또한, 알려진 DegP 프로테아제 결핍 균주는 일반적으로 온도-감응성이며 약 28℃ 보다 높은 온도에서는 성장하지 않는다. 그러나, 본 발명에 따른 세포는 온도 감응성이 아니며, 박테리아로부터 단백질을 산업적 규모로 생산하는데 통상 이용되는, 대략 30℃∼대략 37℃의 온도를 포함하여, 28℃ 또는 그 이상의 온도에서 성장할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 세포는 돌연변이된 ptr 유전자를 보유한다. 본원에서 사용되는 "ptr 유전자"는 고분자량 단백질을 분해하는 프로테아제인, 프로테아제 III을 코딩하는 유전자를 의미한다. 비돌연변이된 ptr 유전자의 서열은 서열번호 4에 도시하였고 비돌연변이된 프로테아제 III 단백질의 서열은 서열번호 5에 도시하였다.
돌연변이된 ptr 유전자 또는 프로테아제 III을 코딩하는 돌연변이된 ptr 유전자에 대한 언급은 달리 표시하지 않으면, 저하된 프로테아제 활성을 갖는 프로테아제 III 단백질을 코딩하는 돌연변이된 ptr 유전자 또는 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자를 의미한다.
본원에서 사용되는 표현 "저하된 프로테아제 활성을 갖는 프로테아제 III 단백질을 코딩하는 돌연변이된 ptr 유전자"는 야생형 비돌연변이된 ptr 유전자와 비교하여 완전한 프로테아제 활성을 갖지 않는 돌연변이된 ptr 유전자를 의미한다.
바람직하게, 돌연변이된 ptr 유전자는 야생형 비돌연변이된 프로테아제 III 단백질의 프로테아제 활성의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하를 갖는 프로테아제 III 단백질을 코딩한다. 보다 바람직하게, 돌연변이된 ptr 유전자는 프로테아제 활성을 갖지 않는 프로테아제 III 단백질을 코딩한다. 이러한 구체예에서, 세포는 염색체 ptr이 결핍된 것이 아닌데, 다시 말해서, ptr 유전자 서열이 결실되거나 또는 돌연변이되어 임의 형태의 프로테아제 III 단백질의 발현이 억제된 것이 아니다.
저하된 프로테아제 활성을 갖는 프로테아제 III 단백질을 생산하기 위해 임의의 적절한 돌연변이를 ptr 유전자에 도입시킬 수 있다. 그람-음성 박테리아로부터 발현되는 프로테아제 III 단백질의 프로테아제 활성은 당분야의 임의의 적절한 방법에 따라 당분야의 숙련가가 용이하게 테스트할 수 있다.
본원에서 사용되는 표현 "넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자"는 이 유전자가 1 이상의 돌연변이를 포함하여서 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현이 일어나지 않아 넉아웃 돌연변이된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 결핍된 세포를 제공하는 것을 의미한다. 넉아웃 유전자는 부분적으로 또는 완전하게 전사되지만 코딩된 단백질로 번역되지 않는다. 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자는 1 이상의 결실, 삽입, 점, 미스센스, 넌센스 및 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 임의의 적절한 방식으로 돌연변이되어서, 단백질 발현이 일어나지 않을 수 있다. 예를 들면, 유전자는 유전자 코딩 서열에 외래 DNA 서열, 예컨대 항생제 내성 마커가 삽입되어 넉아웃될 수 있다.
바람직한 구체예에서 유전자는 유전자 코딩 서열에, 외래 DNA 서열, 예컨대 항생제 내성 마커를 삽입시켜 돌연변이되지 않는다. 바람직하게 프로테아제 III 유전자는 유전자 개시 코돈에의 돌연변이 및/또는 유전자 개시 코돈의 하류 및 유전자 중지 코돈의 상류에 위치하는 1 이상의 중지 코돈을 포함하여 프로테아제 III 단백질의 발현이 억제된다.
표적 넉아웃 유전자 개시 코돈에 대한 돌연변이는 개시 코돈의 기능 상실을 일으켜서 표적 유전자가 코딩 서열의 출발점에서 적절한 개시 코돈을 포함하지 않도록 한다. 개시 코돈에 대한 돌연변이는 개시 코돈의 뉴클레오티드 중 1개, 2개 또는 3개 모두의 미스센스 돌연변이일 수 있다. 부가적으로 또는 다르게 개시 코돈은 삽입 또는 결실 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다.
바람직한 구체예에서 ptr 유전자는 도 9a에 도시된 바와 같이 ATG 개시 코돈이 ATT로 변화되도록 돌연변이된다.
넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자는 다르게 또는 부가적으로 유전자 개시 코돈의 하류 및 유전자 중지 코돈의 상류에 위치하는 1 이상의 중지 코돈을 포함한다. 바람직하게 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자는 개시 코돈에 대한 미스센스 돌연변이 및 1 이상의 삽입된 중지 코돈 둘 모두를 포함한다.
1 이상의 삽입된 중지 코돈은 바람직하게 인프레임 중지 코돈이다. 그러나, 1 이상의 삽입된 중지 코돈은 다르게 또는 부가적으로 아웃오브프레임 중지 코돈일 수 있다. 1 이상의 아웃오브프레임 중지코돈은 아웃오브프레임 개시 코돈이 삽입 또는 결실 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 인프레임 개시 코돈으로 변화된 경우 번역을 중지시키는데 필요할 수 있다. 1 이상의 중지 코돈은 넌센스 점 돌연변이 및 프레임쉬프트 돌연변이를 포함하여 임의의 적절한 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 1 이상의 중지 코돈은 바람직하게는 프레임쉬프트 돌연변이 및/또는 삽입 돌연변이에 의해, 바람직하게는 중지 코돈을 포함하는 서열로 유전자 서열을 치환하여 도입된다. 예를 들면, 중지 코돈 TAA가 포함된, Ase I 제한효소 부위가 삽입될 수 있다.
바람직한 구체예에서 ptr 유전자는 도 9a에 도시된 바와 같이, Ase I 제한효소 부위의 삽입에 의해 인프레임 중지 코돈이 삽입되도록 돌연변이된다. 바람직한 구체예에서 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자는 서열번호 6의 DNA 서열을 갖는다. 서열번호 6의 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자 서열에 이루어진 돌연변이는 도 9a에 도시하였다.
상기 기술된 넉아웃 돌연변이는 이들이 표적 넉아웃 유전자 부위의 상류 또는 하류의 염색체 DNA에 대한 최소의 파괴를 야기하거나 또는 파괴를 야기하지 않고 목적 단백질, 특히 치료 단백질을 발현하기 위한 세포의 적합성에 영향을 줄 수 있는, 외래 DNA, 예컨대 항생제 내성 마커의 삽입 및 체류를 필요로하지 않기 때문에 유리하다. 따라서, 본 발명에 따른 1 이상의 세포는 유전자 코딩 서열에 외래 DNA를 삽입시켜 프로테아제 유전자가 넉아웃된 세포와 비교하여 향상된 성장 특징 및/또는 단백질 발현을 나타낼 수 있다.
일 구체예에서 본 발명에 따른 세포는 돌연변이된 OmpT 유전자를 보유한다. 본원에서 사용되는 "OmpT 유전자"는 외막 프로테아제인 프로테아제 OmpT(outer membrane protease T)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 야생형 비돌연변이된 OmpT 유전자 서열은 SWISS-PROT P09169이다.
돌연변이된 OmpT 유전자 또는 OmpT를 코딩하는 돌연변이된 OmpT 유전자에 대한 언급은 달리 표시하지 않으면, 저하된 프로테아제 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩하는 돌연변이된 OmpT 유전자 또는 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자를 의미한다.
본원에서 사용되는 표현 "저하된 프로테아제 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩하는 돌연변이된 OmpT 유전자"는 돌연변이된 OmpT 유전자가 야생형 비돌연변이된 OmpT 유전자와 비교하여 완전한 프로테아제 활성을 갖지 않음을 의미한다. 돌연변이된 OmpT 유전자는 야생형 비돌연변이된 OmpT 단백질의 프로테아제 활성의 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하또의 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩한다. 돌연변이된 OmpT 유전자는 프로테아제 활성을 갖지 않는 OmpT 단백질을 코딩한다. 이 구체예에서, 세포는 염색체 OmpT가 결핍되지 않았는데, 다시 말해서 OmpT 유전자 서열은 임의 형태의 OmpT 단백질의 발현이 억제되도록 결실되거나 또는 돌연변이되지 않는다.
저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 생성하기 위해 임의의 적절한 돌연변이가 OmpT 유전자에 도입될 수 있다. 그람-음성 박테리아로부터 발현되는 OmpT 단백질의 프로테아제 활성은 당분야의 임의의 적절한 방법 예컨대 [[Kramer et al (Identification of essential acidic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site, FEBS Letters 505 (2001) 426-430)] 및 [Dekker et al (Substrate Specitificity of the Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed Peptide Libraries, Biochemistry 2001, 40, 1694-1701)]에 기술된 방법에 의해 당분야의 숙련가가 용이하게 테스트할 수 있다.
OmpT는 [Kramer et al (Identification of active site serine and histidine residues in Escherichia coli outer membrane protease OmpT FEBS Letters 2000 468, 220-224)]에 보고되었는데 여기서는 세린, 히스티딘 및 산성 잔기를 알라닌으로 치환한 결과 Glu27, Asp97, Asp208 또는 His101에 대해서는 활성이 ∼10배 감소되었고, Ser99에 대해서는 활성이 ∼500배 감소되었으며, Asp83, Asp85, Asp210 또는 His212에 대해서는 활성이 ∼10000배 감소된 것으로 개시되어 있다. [Vandeputte-Rutten et al (Crystal Structure of the Outer Membrane Protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site, The EMBO Journal 2001, Vol 20 No 18 5033-5039)]에서는 Asp83-Asp85 쌍 및 His212-Asp210 쌍을 포함하는 활성 부위를 갖는 것으로 기새되어 있다. 또한 [Kramer et al (Lipopolysaccharide regions involved in the activation of Escherichia coli outer membrane protease OmpT, Eur. J. Biochem. FEBS 2002, 269, 1746-1752)]는 루프 L4에서의 돌연변이 D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K/K217G, K217T 및 R218L가 모두 부분적으로 또는 실제적으로 완전하게 효소 활성을 상실하는 것으로 개시되어 있다.
따라서, 저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질을 생성하기 위한 OmpT 돌연변이는 잔기 E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 및 E250 중 1 이상에 돌연변이, 예컨대 미스센스 돌연변이를 포함할 수 있다.
E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 및 E250 중 1 이상은 저하된 프로테아제 활성을 갖는 단백질이 생성되는 임의의 적절한 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 및 E250 중 1 이상은 알라닌으로 돌연변이될 수 있다. 적절한 돌연변이의 예로는 E27A, D43A, D83A, D85A, D97A, S99A, H101A E111A, E136A, E193A, D206A, D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K, K217G, K217T, R218L 및 E250A가 있다. 일 구체예에서 돌연변이된 OmpT 유전자는 D210A 및 H212A 돌연변이를 포함한다. D210A 및 H212A 돌연변이를 포함하는 적절한 돌연변이된 OmpT 서열은 서열번호 23에 도시하였다.
본원에서 사용되는 표현 "넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자"는 유전자가 1 이상의 돌연변이를 포함하여서 그 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현시키지 않아 넉아웃 돌연변이된 유전자에 의해 코딩된 단백질이 결핍된 세포를 제공하는 것을 의미한다. 넉아웃 유전자는 부분적으로 또는 완전하게 전사되지만 코딩된 단백질로 번역되지는 않을 수 있다. 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자는 임의의 적절한 방식, 예를 들면 1 이상의 결실, 삽입, 점, 미스센스, 넌센스 및 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 돌연변이되어, 단백질의 발현을 일으키지 않는다. 예를 들면, 유전자는 외래 DNA 서열, 예컨대 항생제 내성 마커를 유전자 코딩 서열에 삽입시켜 넉아웃될 수 있다.
일 구체예에서 OmpT 유전자는 유전자 개시 코돈에 돌연변이 및/또는 유전자 개시 코돈의 하류 및 유전자 중지 코돈의 상류에 위치하는 1 이상의 중지 코돈을 포함하여서 OmpT 단백질의 방지된다. 개시 코돈에서의 돌연변이는 개시 코돈의 뉴클레오티드 중 1개, 2개 또는 3개 모두의 미스센스 돌연변이일 수 있다. 추가적으로 또는 부가적으로 개시 코돈은 삽입 또는 결실 프레임쉬프트 돌연변이에 의해 돌연변이될 수 있다.
적절한 돌연변이된 넉아웃 OmpT 서열은 서열번호 24에 도시하였다.
일 구체예에서 본 발명에 따른 그람-음성 박테리아 세포는 넉아웃 돌연변이된 ompT 유전자를 보유하지 않는데, 예컨대 염색체 ompT가 결핍되지 않았다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 그람-음성 박테리아 세포는 넉아웃 돌연변이된 degP 유전자를 보유하지 않는데, 예컨대 염색체 degP가 결핍되지 않았다. 일 구체예에서, 본 발명에 따른 그람-음성 박테리아 세포는 돌연변이된 degP 유전자를 보유하지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 그람-음성 박테리아 세포는 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자를 보유하지 않는데, 예컨대 염색체 ptr이 결핍되지 않았다.
넉아웃 돌연변이를 포함하여 많은 유전자 조작 돌연변이는 성공적으로 돌연변이된 세포의 선별 및 동정을 가능하게 하는 항생제 내성 마커의 사용을 포함한다. 그러나, 항생제 내성 마커 사용에 따른 수많은 단점이 존재한다.
본 발명의 일 구체예에서, 돌연변이된 유전자는 1 이상의 제한효소 마커 부위를 포함할 수 있다. 따라서, spr 유전자 및/또는 샤페론 활성을 가지나 프로테아제 활성은 없는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자 및/또는 돌연변이된 ptr 유전자 및/또는 돌연변이된 OmpT 유전자는 1 이상의 제한효소 마커 부위를 포함하도록 돌연변이될 수 있다. 제한효소 부위는 유전자 내로 유전자 조작되어지고 비천연 발생적이다. 제한효소 마커 부위는 이들이 필요한 염색체 돌연변이를 포함하는 올바르게 변형된 세포의 스크리닝 및 동정을 가능케하므로 유리하다. 1 이상의 돌연변이된 유전자를 보유하도록 변형된 세포는 비천연 발생 제한효소 마커 부위를 포함하는 게놈 DNA의 영역을 증폭하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용해 세포 용균물로부터 게놈 DNA를 PCR하여 분석할 수 있다. 증폭된 DNA를 이어 비천연 발생 제한효소 마커 부위에서 DNA를 효소분해할 수 있는 적절한 제한 효소와 항온반응하기 전 및 후에 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석할 수 있다. 제한효소와의 항온반응 후 DNA 단편의 존재는 세포가 1 이상의 돌연변이된 유전자를 보유하도록 성공적으로 변형되었음을 확인해준다.
세포가 서열번호 6의 DNA 서열을 갖는 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자를 포함하는 구체예에서, 서열번호 17 및 서열번호 18에 도시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 사용해 형질전환된 세포의 게놈 DNA로부터 비천연 발생 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 DNA 영역을 증폭시킬 수 있다. 증폭된 게놈 DNA를 이어 Ase I 제한효소와 항온반응시키고 겔 전기영동으로 분석하여 게놈 DNA에 돌연변이된 ptr 유전자의 존재를 확인할 수 있다.
세포가 서열번호 9의 DNA 서열을 갖는 돌연변이된 DegP 유전자를 포함하는 구체예에서, 서열번호 19 및 서열번호 20에 도시된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 사용해 형질전환된 세포의 게놈 DNA로부터 비천연 발생 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 DNA 영역을 증폭시킬 수 있다. 이어 증폭된 게놈 DNA를 Ase I 제한효소와 항온반응시키고 겔 전기영동으로 분석하여 게놈 DNA 내 돌연변이된 DegP 유전자의 존재를 확증할 수 있다.
1 이상의 제한 효소 부위는 1 이상의 결실, 삽입, 점, 미스센스, 넌센스 및 프레임쉬프트 돌연변이를 포함하는 임의의 적절한 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 제한효소 부위는 상기 기술된 바와 같이 1 이상의 중지 코돈을 도입하기 위한 돌연변이 및/또는 개시 코돈의 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 이 구체예는 제한효소 마커 부위가 도입되는 넉아웃 돌연변이의 직접적이고 고유한 마커이므로 유리하다.
인프레임 중지 코돈, 예컨대 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 제한효소 마커 부위가 삽입될 수 있다. 이는 삽입된 제한효소 부위가 제한효소 마커 부위 및 중지 코돈 둘 모두로서 제공되어 유전자 코딩 서열의 완전한 전사가 방지될 수 있기 때문에 특이 유리하다. 중지 코돈이 Ase I 부위의 도입에 의해 ptr 유전자에 도입되는 구체예에서, 이는 또한 도 9a에 도시된 바와 같은, 제한효소 부위를 생성시킨다.
제한효소 마커 부위는 개시 코돈에서의 돌연변이 및 경우에 따라 1 이상의 추가 점 돌연변이에 의해 삽입될 수 있다. 이러한 구체예에서 제한효소 마커 부위는 바람직하게 EcoR I 제한효소 부위이다. 이는 개시 코돈에서의 돌연변이가 또한 제한효소 마커 부위를 생성시키기 때문에 특이 유리하다. 예를 들면, ptr 유전자의 개시 코돈이 ATT로 변경된 구체예에서, 이는 도 9a에 도시된 바와 같이 EcoR I 마커 부위를 생성시킨다.
세포가 돌연변이된 OmpT 유전자를 보유하는 본 발명의 구체예에서, 1 이상의 제한효소 부위는 1 이상의 결실, 삽입, 점, 미스센스, 넌센스 및 프레임쉬프트 돌연변이를 포함하는 임의의 적절한 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 예를 들면, OmpT 유전자가 돌연변이 D210A 및 H212A를 포함하는 구체예에서, 이들 돌연변이는 선별 마커로서 사용될 수 있는 침묵 HindIII 제한효소 부위를 도입시킨다.
돌연변이된 spr 유전자 및 돌연변이된 DegP 유전자에서, 마커 제한효소 부위는 침묵 코돈 변화를 사용해 도입될 수 있다. 예를 들면, Ase I 부위를 침묵 제한효소 마커 부위로서 사용할 수 있는데, 여기서 TAA 중지 코돈은 DegP에 대해 도 9c에 도시한 바와 같이 아웃오브프레임이다.
ptr 유전자가 저하된 프로테아제 활성을 갖는 프로테아제 III을 코딩하도록 돌연변이된 본 발명의 구체예에서, 1 이상의 마커 제한효소 부위는 침묵 코돈 변화를 사용해 도입될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 그람-음성 박테리아 세포는 임의의 적절한 수단에 의해 생성될 수 있다.
당분야의 숙련가는 spr 돌연변이체 유전자를 도입하기 위해 염색체 유전자 서열을 돌연변이된 유전자 서열로 치환하는데 사용할 수 있는 적합한 기술을 알고 있다. 상동성 재조합에 의해 숙주 염색체로 통합시킬 수 있는 적절한 벡터를 사용할 수 있다.
적절한 유전자 치환 방법은 예를 들면, [Hamilton et al (New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli, Hamilton C. M. et al., Journal of Bacteriology Sept. 1989, Vol. 171, No. 9 p 4617-4622), Skorupski et al (Positive selection vectors for allelic exchange, Skorupski K and Taylor R. K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al (A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation, Kiel J.A.K.W. et al, Mol Gen Genet 1987, 207:294-301), Blomfield et al (Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSC101 replicon, Blomfield I. C. et al., Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) 및 Ried et al. (An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis, Ried J. L. and Collmer A., Gene 57 (1987) 239-246)]에 기술되어 있다. 상동성 재조합/치환를 가능하게하는 적절한 플라스미드로는 pKO3 플라스미드(Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237)가 있다.
세포가 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구체예에서, 당분야의 숙련가는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 삽입하는데 사용할 수 있는 적절한 기술을 알고 있다. DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터 예컨대 pK03 플라스미드를 사용해 세포의 게놈에 통합될 수 있다.
세포가 목적 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구체예에서, 당분야의 숙련가는 목적 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 삽입하는데 사용할 수 있는 적합한 기술을 알고 있다. 목적 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터 예컨대 pK03 플라스미드를 사용해 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
다르게 또는 부가적으로, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 목적 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 재조합 발현 카세트로 비통합될 수 있다. 일 구체예에서, 발현 카세트는 DsbC 및/또는 목적 단백질 및 1 이상의 조절 발현 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유하기 위해 본 발명에서 사용된다. 1 이상의 조절 발현 서열은 프로모터를 포함할 수 있다. 1 이상의 조절 발현 서열은 또한 3' 비번역 영역 예컨대 종결 서열을 포함할 수도 있다. 적절한 프로모터는 이하에 상세하게 기술한다.
일 구체예에서, 발현 카세트는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 보유하도록 본 발명에서 사용된다. 발현 카세트는 대체로 1 이상의 조절 발현 서열, 1 이상의 목적 목적 단백질을 코딩하는 코딩 서열 및/또는 DsbC를 코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 1 이상의 조절 발현 서열은 프로모터를 포함할 수 있다. 1 이상의 조절 발현 서열은 또한 3' 비번역 영역 예컨대 종결 서열을 포함할 수 있다. 적절한 프로모터는 이하에 상세히 기술한다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 1 이상의 벡터, 예컨대 플라스미드를 포함한다. 벡터는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 1 이상의 발현 카세트를 포함한다. 일 구체예에서, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 한 벡터에 삽입된다. 다르게 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 개별 벡터에 삽입된다.
목적 단백질이 경쇄와 중쇄 둘 모두를 포함하는 항체인 구체예에서, 세포주는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터의 2종 벡터로 형질감염될 수 있다. 다르게, 단일 벡터가 사용될 수 있으며, 이 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 다르게, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나의 벡터에 삽입된다. 바람직하게, 벡터는 항체의 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
세포가 또한 다음과 같은 1 이상의 추가 단백질을 발현하는 구체예에서, 이러한 1 이상의 추가 단백질은 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일한 벡터에 삽입된 1 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다:
. 단백질 폴딩을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 FkpA, Skp, SurA, PPiA 및 PPiD; 및/또는
. 단백질 분비 또는 전좌를 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질, 예컨대 SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY 및 Lep; 및/또는
. 이황화 결합 형성을 촉진할 수 있는 1 이상의 단백질.
다르게 1 이상의 폴리뉴클레오티드는 개별 벡터에 삽입될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 상기 정의된 바와 같은 1 이상의 발현 카세트를 적절한 벡터에 삽입시켜 제조될 수 있다. 다르게, 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 지정할 수 있는 조절 발현 서열이 벡터에 함유될 수 있고 따라서 오직 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역만이 벡터를 완결하는데 요구될 수 있다.
DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포에 적절한 프로모터의 제어 하에서 세포 중에서 발현되기 위해, 복제가능 벡터, 대체로 자가 복제 벡터로 적절하게 삽입된다. 이러한 목적을 위한 많은 벡터들이 당분야에 알려져 있으며, 적절한 벡터의 선택은 핵산의 크기 및 특정 세포 유형에 따라 좌우될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용할 수 있는 벡터의 예로는
. 플라스미드, 예컨대 pBR322 또는 pACYC184, 및/또는
. 바이러스 벡터 예컨대 박테리아 파지,
. 수송가능한 유전 성분 예컨대 트랜스포존
이 포함된다.
이러한 벡터들은 일반적으로, DNA 복제의 플라스미드 기원, 항생제 선별 마커, 목수 클로닝 부위(발현 카세트)에 의해 분리되어진 프로모터 및 전사 종결인자 및 리보소 결합 부위를 코딩하는 DNA 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 프로모터는 예를 들면 관련 폴리펩티드가 삽입되었을 때 관련 프로모터가 그에 작동할 수 있도록 벡터내에서 적절한 위치에 직접적으로 또는 교대식으로 위치된 관련 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 일 구체예에서 프로모터는 작용하는 폴리뉴클레오티드의 코딩부 전에 위치하며, 예를 들여 관련 프로모터는 각 폴리뉴클레오티드의 코딩부 전에 위치한다. 본원에서 사용되는 "전에"는 프로모터가 코딩 폴리뉴클레오티드 부분에 대해 5 프라임 말단에 위치함을 의미하려는 것이다.
프로모터는 숙주 세포에 내생성이거나 또는 외생성일 수 있다. 적절한 프로모터는 Lac, tac, trp, PhoA, Ipp, Arab, Tet 및 T7을 포함한다.
적용되는 1 이상의 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 하나의 벡터에 삽입된 구체예에서, DsbC 및 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 단일 프로모터 또는 개별 프로모터의 조절 하에 존재할 수 있다. DsbC 및 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 개별 프로모터의 제어 하에 존재하는 구체예에서, 프로모터는 독립적으로 유도될 수 있는 프로모터일 수 있다.
박테리아 시스템에서 사용하기 위한 발현 유닛은 대체로 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가르노(S.D.) 서열을 함유할 수 있다. 프로모터는 제한효소 분해에 의해 박테리아 공급 DNA로부터 분리되어 원하는 DNA를 함유하는 벡터로 삽입될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 서열이 2 이상의 목적 단백질, 예를 들면 항체의 경쇄 및 항체의 중쇄를 위한 2 이상의 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 mRNA의 중간부에서 번역을 개시할 수 있는 1 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있다. IRES 서열은 코딩되는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 위치하여서 코딩된 폴리펩티드 서열을 생성하도록 mRNA의 개별 번역을 증강시킬 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 또한 WO 03/048208 또는 WO2007/039714(이들 내용을 참조하여 본원에 편입시킴)에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원 결합 단편(fragment)을 생성하도록 디시스트론 메세지를 포함한다. 바람직하게 상류 시스트론은 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA를 포함하고 하류 시스트론은 상응하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 포함하며 디시스트론 유전자내 서열(IGS)는 바람직하게는 IGS1 (서열번호 36), IGS2 (서열번호 37), IGS3 (서열번호 38) 및 IGS4 (서열번호 39)를 포함한다.
종결인자는 숙주 세포에 내생성이거나 또는 외생성일 수 있다. 적절한 종결인자는 rrnB이다.
프로모터 및 종결인자를 포함하는 추가의 적절한 전사 조절인자 및 단백질 표적화 방법은 ["Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli" Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996, p 512-538]에 기술되어 있다.
발현 벡터로 삽입된 DsbC 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 DsbC 신호 서열을 코딩하는 핵산 및 DsbC 코딩 서열을 포함한다. 벡터는 그 벡터가 바람직하게는 1 이상의 선택 숙주 세포에서 복제될 수 있는, 바람직하게는 숙주 염색체와는 독립적으로 복제될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 그러한 서열은 다양한 박테리아에 대해 공지되어 있다.
일 구체예에서 DsbC 및/또는 목적 단백질은 N-말단 및/또는 C-말단에 히스티딘-태그를 포함한다.
항체 분자는 적절한 신호 서열에 의해 주변세포질로 표적화되거나 또는 세포로부터 분비될 수 있다. 다르게 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적될 수 있다. 바람직하게, 항체 분자는 주변세포질로 표적화된다.
목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리펩티드, 바람직하게는 신호 서열 또는 성숙한 폴리펩티드의 N 말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드와 융합체로서 발현될 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 프로세싱되는 것이어야 한다. 천연 또는 진핵생물 폴리펩티드 신호 서열을 인식하지 못하여 프로세싱할 수 없는 원핵생물 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 원핵생물 신호 서열로 치환된다. 적절한 신호 서열은 OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA 및 DsbC를 포함한다.
1 이상의 상기 열거한 성분들을 함유하는 적절한 벡터의 제작에는 표준 결찰법이 적용된다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 필요한 플라스미드를 생성시키는데 바람직한 형태로 절단, 재단, 및 재결찰된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 본 발명은 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 멀티-시스트론을 제공한다. 멀티시스트론 벡터는 벡터로 폴리뉴클레오티드 서열의 반복적은 연속 클로닝을 가능하게하는 유리한 클로닝 방법에 의해 제조될 수 있다. 이 방법은 제한효소 부위 쌍의 적합한 코헤시브(cohesive) 말단, 예컨대 Ase I 및 Nde I 제한효소 부위의 "AT" 말단을 사용한다. 코딩 서열을 포함하고 적합한 코헤시브 말단, 예컨대 Ase I-Nde I 단편을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터 내 제한효소 부위, 예컨대 Nde I 부위에 클로닝할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입으로 5' 제한효소 부위가 파괴되지만, 새로운 3' 제한 효소 부위, 예컨대 Nde I이 생성외어서, 이를 적합한 코헤시브 말단을 포함하는 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는데 사용할 수 있다. 이러한 과정을 이후 반복하여 추가 서열을 삽입시킬 수 있다. 벡터에 삽입된 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 스크리닝용 Ssp I 부위를 포함할 수 있는 중지 코돈의 3' 비코딩 서열, 샤일 달가르노 리보솜 결합 서열, A 풍부 스페이스 및 개시 코돈을 코딩하는 Nde I 부위를 포함한다.
항체의 경쇄(LC), 항체의 중쇄(HC), DsbC 폴리뉴클레오티드 서열 및 추가의 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 생성에 대한 대표적인 개략도를 도 10에 도시하였다.
성공적으로 돌연변이된 균주는 콜로니 PCR DNA 서열분석 및 콜로니 PCR 제한효소 지도화를 포함하여 당분야에 공지된 방법을 사용해 동정할 수 있다.
세포가 2 이상의 돌연변이된 유전자를 포함하는 구체예에서, 돌연변이된 프로테아제는 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에서 그람-음성 박테리아로 도입될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 그람-음성 박테리아 세포는 예컨대 염색체 OmpT가 결핍된, 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자를 보유하지 않는다.
본 발명에 따른 세포는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다. 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 외생성이거나 또는 내생성일 수 있다. 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주의 염색체로 통합되거나 또는 벡터, 전형적으로는 플라스미드로 비통합될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 세포는 목적 단백질을 발현한다. 본원에서 사용되는 "목적 단백질"은 발현을 위한 폴리펩티드, 일반적으로는 재조합 폴리펩티드를 의미하는 것이다. 그러나, 목적 단백질은 숙주 세포 내 내생성 유전자로부터 발현되는 내생성 단백질일 수도 있다.
본원에서 사용되는 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기술을 사용해 제작되거나 또는 생성된 단백질을 의미한다. 목적 단백질은 내생성 단백질과 동일한 외생성 서열이거나 또는 예를 들면 외생성 벡터로부터 발현되는, 약화된 생물학적 활성을 갖는 돌연변이형, 또는 그의 단편일 수 있다. 다르게, 목적 단백질은 숙주 세포에서 정상적으로는 발현되지 않는 이종성 단백질일 수 있다.
목적 단백질은 치료, 예방 또는 진단 단백질을 포함하여 임의의 적합한 단백질일 수 있다.
일 구체예에서, 목적 단백질은 염증성 질환 및 질병, 면역 질환 및 질병, 섬유증 질환 및 암을 포함하는 질환이나 질병의 치료에 유용하다.
용어 "염증성 질환" 또는 "질병" 및 "면역 질환 또는 질병"은 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 스틸병, 머클 웰스 질환, 건선, 크론병, 궤양성 대장염, SLE (전신 홍반성 루푸스), 천식, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 다발성 경화증, 혈관염, I형 진성 당뇨병, 이식 및 이식편 대 숙주 질환을 포함한다.
용어 "섬유증 질환"은 특발성 폐섬유화증 (IPF), 전신 경피증 (또는 피부 경화증), 신장 섬유증, 당뇨성 신증, IgA 신증, 고혈압, 말기 신질환, 복막 섬유증 (자기 복막 환류), 간경변증, 나이 관련 근육 퇴행증 (ARMD), 망막병증, 심장 반응성 섬유증, 흉터, 켈로이드, 화상, 피부궤양, 혈관형성술, 관상동맥 우회술, 관절성형술 및 백내장 수술을 포함한다.
용어 "암"은 상피에서 발생되거나, 피부에서 발견되거나, 또는 보다 일반적으로는 신체 장기계통, 예를 들면 유방, 난소, 전립선, 신장, 췌장, 위, 방광 또는 장에 존재하는 악성의 새로운 성장물을 포함한다. 암은 인접한 조직으로 침윤하여 윈위 장기, 예를 들면 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 확산(전이)되는 경향이 있다.
단백질은 단백질가수분해 감응성 폴리펩티드, 즉 천연 상태에서 또는 분비 동안, 절단되는 경향이 있거나, 절단에 민감하거나 또는 1 이상의 그람-음성 박테리아, 예컨대 이.콜라이, 프로테아제에 의해 절단되는 경향이 있는 단백질일 수 있다. 일 구체예에서, 목적 단백질은 DegP, 프로테아제 III 및 Tsp에서 선택된 프로테아제에 단백질가수분해 감응성이다. 일 구체예에서 목적 단백질은 프로테아제 Tsp에 대해 단백질 가수분해 감응성이다. 일 구체예에서 목적 단백질은 프로테아제 DegP 및 프로테아제 III에 대해 단백질가수분해 감응성이다. 일 구체예에서 목적 단백질은 프로테아제 DegP 및 Tsp에 대해 단백질가수분해 감응성이다. 일 구체예에서 목적 단백질은 프로테아제 Tsp 및 프로테아제 III에 단백질가수분해 감응성이다. 일 구체예에서 목적 단백질은 프로테아제 DegP, 프로테아제 III 및 Tsp에 단백질가수분해 감응성이다.
바람직하게 단백질은 진핵생물 폴리펩티드이다.
본 발명에 따른 세포에 의해 발현되는 목적 단백질은 예를 들면, 면역원, 2종의 이종 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 항체일 수 있다. 목적 단백질로서 사용되는 항체는 단일클론, 다가, 다중 특이성, 인간화, 완전 인간 또는 키메라 항체를 포함한다. 항체는 임의의 종에서 유래된 것일 수 있지만 바람직하게는 단일클론 항체, 인간 항체, 또는 인간화 단편으로부터 유리된다. 항체는 임의 클래스의 면역글로불린 분자(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA) 또는 서브클래스 면역글로불린 분자로부터 유도된 것이고 예를 들면, 마우스, 래트, 상어, 토끼, 돼지, 햄스터, 낙타, 리마, 염소 또는 인간을 포함한 임의의 종에서 얻을 수 있다. 항체 단편의 일부분은 1 이상의 종에서 얻을 수 있는데 예를 들면 그러한 항체 단편은 키메라일 수 있다. 일례에서 불변 영역은 하나의 종에서 유래된 것이고 가변 영역은 다른 종에서 유래된 것이다.
항체는 완전한 중쇄 및 경쇄 또는 그의 단편을 갖는 완전한 항체 분자, 예를 들면, VH, VL, VHH, Fab, 변형 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv 단편, Fab-Fv, 또는 이중 특이성 항체, 예컨대 PCT/GB2008/003331에 기술된 바와 같은 Fab-dAb일 수 있다.
항체는 임의의 표적 항원에 특이적일 수 있다. 항원은 세포 관련 단백질, 예를 들면 세포 예컨대 박테리아 세포, 효모 세포, T-세포, 내피 세포 또는 종양 세포 상의 세포 표면 단백질이거나, 또는 가용성 단백질일 수 있다. 목적 항원은 또한 임의의 의학적으로 관련된 단백질, 예컨대 질환이나 감염 동안 상향조절된 단백질, 예를 들면 수용체 및/또는 그들의 상응하는 리간드일 수 있다. 세포 표면 단백질에 대한 구체적인 예에는 부착 분자, 예를 들면 인테그린 예컨대 β1 인테그린, 예를 들면 VLA-4, E-셀렉틴, P 셀렉틴 또는 L-셀렉틴, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 또는 CSF1-수용체, DPCR1, DPCR1, 두둘린2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectin-like2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, 암배 항원 (CEA), 인간 모유 지방 글로불린 (HMFG1 및 2), MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 항원, KDR 및 VEGF, 및 적절한 경우 그의 수용체가 포함된다.
가용성 항원은 인터루킨 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 또는 IL-17, 예컨대 IL17A 및/또는 IL17F, 바이러스 항원 예를 들면 호흡기 세포융합 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 항원, 면역글로불린, 예컨대 IgE, 인터페론 예컨대 인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ, 종양 괴사 인자 TNF(이전에는 종양 괴사 인자 α로 알려짐), 종양 괴사 인자-β, 콜로니 자극 인자 예컨대 G-CSF 또는 GM-CSF, 및 혈소판 유도된 성장 인자 예컨대 PDGF-α, 및 PDGF-β 및 적절한 경우 그의 수용체를 포함한다. 다른 항원으로는 박테리아 세포 표면 항원, 박테리아 독소, 바이러스 예컨대 인플루엔자, EBV, HepA, B 및 C, 생화학무기, 방사성 핵종 및 중금속, 및 뱀 및 거미 독 및 독소가 포함된다.
일 구체예에서, 항체는 목적 항원의 활성을 기능적으로 변경시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체는 상기 항원의 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 중화, 길항 또는 효현시킬 수 있다.
본 발명의 일 측면에서는, 돌연변이체 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자, 야생형 Tsp 유전자 및 TNF에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 그람-음성 박테리아 세포를 제공한다. 야생형 염색체 Tsp 유전자는 바람직하게 비재조합 염색체 Tsp 유전자이다. 바람직하게, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다.
바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 세포에 의해 발현되는 목적 단백질은 항-TNF 항체, 보다 바람직하게는 WO01/094585(이의 내용을 참조하여 본원에 편입시킴)에 기술된 바와 같은, 항-TNF Fab'이다.
일 구체예에서, 인간 TNFα에 대한 특이성을 갖는 항체는 중쇄를 포함하고, 여기서 가변 도메인은 CDRH1에 대해 서열번호 28에 도시한 서열, CDRH2에 대해 서열번호 29 또는 서열번호 34에 도시한 서열 또는 CDRH3에 대해 서열번호 30에 도시한 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
일 구체예에서 항체는 경쇄를 포함하고, 여기서 가변 도메인은 CDRL1에 대해 서열번호 31에 도시한 서열, CDRL2에 대해 서열번호 32에 도시한 서열 또는 CDRL3에 대해 서열번호 33에 도시한 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
상기 언급된 서열번호 28, 및 30 내지 34에 제공된 CDR은 마우스 단일클론 항체 hTNF40에서 유래된 것이다. 그러나, 서열번호 29는 하이브리드 CDR로 구성된다. 하이브리드 CDR은 마우스 단일클론 항체 hTNF40(서열번호 34) 유래의 중쇄 CDR2의 일부분 및 인간 그룹3 배선 V 영역 서열 유래의 중쇄 일부분을 포함한다.
일 구체예에서 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고 여기서 중쇄 가변 도메인은 CDRH1에 대해 서열번호 28에 도시한 서열, CDRH2에 대해 서열번호 29 또는 서열번호 34에 도시한 서열 또는 CDRH3에 대해 서열번호 30에 도시한 서열을 갖는 CDR을 포함하고, 경쇄 가변 도메인은 CDRL1에 대해 서열번호 31에 도시한 서열, CDRL2에 대해 서열번호 32에 도시한 서열 또는 CDRL3에 대해 서열번호 33에 도시한 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
일 구체예에서 항체는 CDRH1에 대해 서열번호 28, CDRH2에 대해 서열번호 29 및 서열번호 34, CDRH3에 대해 서열번호 30, CDRL1에 대해 서열번호 31, CDRL2에 대해 서열번호 32 및 CDRL3에 대해 서열번호 33을 포함한다. 바람직하게 항체는 CDRH2에 대해 서열번호 29를 포함한다.
항-TNF 항체는 바람직하게 CDR-이식된 항체 분자이다. 바람직한 구체예에서 가변 도메인은 인간 억셉터 프레임워크 영역 및 비인간 도너 CDR을 포함한다.
바람직하게 항체 분자는 인간 TNF(이전에는 TNFα로 알려짐)에 대한 특이성을 가지며, 여기서 경쇄는 서열번호 11의 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄는 서열번호 12의 중쇄 가변 영역을 포함한다.
항-TNF 항체는 바람직하게 Fab 또는 Fab' 단편이다.
바람직하게 인간 TNF에 대한 특이성을 갖는 항체 분자는 Fab'이고 서열번호 13으로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 경쇄 서열 및 서열번호 14로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 중쇄 서열을 갖는다.
발현 후, 항체 단편은 예를 들면 다른 독립체 예컨대 이펙터 분자에 접합시켜 후속 프로세싱될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 이펙터 분자는 예를 들면, 항신생물제, 약물, 독소(예를 들면, 박테리아 또는 식물 기원의 효소 활성 독소 및 그의 단편, 예를 들면 리신 및 그의 단편) 생물학적 활성 단백질, 예를 들면 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 그의 단편, 예를 들면, DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오드, 방사성동위원소, 킬레이트화 금속, 나노입자 및 리포터 기 예컨대 형광발광 화합물 또는 NMR이나 ESR 분광계로 검출할 수 있는 화합물을 포함한다. 이펙터 분자는 임의의 적절한 방법에 의해 항체 또는 이의 단편에 부착될 수 있는데, 예를 들면 항체 단편은 WO05/003171　또는 WO05/003170(이의 내용을 참조하여 본원에 편입시킴)에 기술된 바와 같이 1 이상의 이펙터 분자에 부착되도록 변형될 수 있다. WO05/003171　또는 WO05/003170은 또한 적절한 이펙터 분자를 기술하고 있다.
일 구체예에서 항체 또는 이의 단편, 예컨대 Fab는 원하는 특성을 갖는 생성물, 예를 들면, 필요한 경우 전체 항체와 유사한 생성물을 생성하도록 PEG화된다. 예를 들면, 항체는 바람직하게는 WO01/094585에 기술된 바와 같은, PEG화 항-TNFα Fab'일 수 있는데, 바람직하게는 중쇄의 C 말단에 시스테인 잔기 중 하나에 결합된 리실-말레이미드-유도 기를 가지며, 여기서 리실 잔기의 2개 아미노 기 각각은 분자량이 약 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기에 공유 결합되어서, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기의 총 평균 분자량은 대략 40,000 Da이고, 보다 바람직하게 리실-말레이미드-유도 기는 [1-[[[2-[[3-(2,5-디옥소-1-피롤리디닐)-1-옥소프로필]아미노]에틸]아미노]-카르보닐]-1,5-펜탄디일]비스(이미노카르보닐)이다.
세포는 또한 1 이상의 추가의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에서 야생형에서 정제 동안 목적 재조합 단백질과 공동 정제되는 것으로 알려진 1 이상의 이.콜라이 숙주 단백질은 [Humphreys et al. "Engineering of Escherichia coli to improve the purification of periplasmic Fab' fragments: changing the pI of the chromosomely encoded PhoS/PstS protein", Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118] 및 WO04/035792에 기술된 바와 같이, 유전자 변형을 위해 선택된다(상기 문헌들의 내용을 참조하여 본원에 편입시킴). 이러한 변형된 숙주 단백질의 사용은 선택된 이.콜라이 단백질의 물리적 특성을 변경시켜 더 이상 재조합 항체와 공동정제되지 않도록 하여 이.콜라이에서 생성된 목적 단백질, 특히 항체의 정제 프로세스를 개선시킨다. 바람직하게, 변경된 이.콜라이 단백질은 인산염 결합 단백질(PhoS/PstS), 디펩티드 결합 단백질(DppA), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 티오레독신 중 1 이상에서 선택된다.
일 구체예에서, 오염된 숙주 단백질의 물리적 특성은 C 말단 또는 N 말단에 아미노산 태그를 부가하여 변경된다. 바람직한 구체예에서, 변경되는 물리적 특성은 등전점이고 아미노산 태그는 C 말단에 부착되는 폴리아스파르트산 태그이다. 일 구체예에서 이상기 태그를 부가하여 변경되는 이.콜라이 단백질은 디펩티드 결합 단백질 (DppA), 말토스 결합 단백질 (MBP), 티오레독신 및 인산염 결합 단백질 (PhoS/PstS)이다. 일 특정 구체예에서, 이콜라이 인산염 결합 단백질 (PhoS/PstS)의 pI는 C 말단에 6개 아스파르트산 잔기를 함유하는 폴리아스파르트산 태그(polyD)를 부가하여 7.2에서 5.1로 감소된다.
또한 바람직하게는 N 또는 C 말단 태그의 부가와 조합하거나 또는 단독으로, 그 물리적 특성을 변경시키기 위해 오염된 이.콜라이 단백질의 특정 잔기를 변형시키는 것이다. 이러한 변화에는 단백질의 크기를 변경시키기 위한 삽입 또는 결실 또는 pI 또는 소수성을 변화시키기 위한 아미노산 치환이 포함된다. 일 구체예에서, 이들 잔기는 단백질의 표면 상에 위치된다. 바람직한 구체예에서, PhoS 단백질의 표면 잔기는 단백질의 pI를 감소시키기 위해 변경된다. 바람직하게 인산염 결합(Bass, US5,304,472)에서 중요한 것으로 알려진 잔기는 기능적 PhoS 단백질을 유지하기 위해 피한다. 바람직하게, 단백질 표면 밖으로 돌출되거나 또는 염기성 잔기의 거대 기에 또는 그 근처에 있는 라신 잔기를 표적으로 한다. 일 구체예에서, PhoS 단백질은 C-말단에 부착된 헥사 폴리아스파르트산 태그를 갖는 한편 분자의 반대쪽 말단에 있는 표면 잔기는 치환 표적이다. 바람직하게,선택된 리신 잔기는 글루탐산 또는 아스파르트산으로 치환되어 중성 잔기가 산성 잔기로 변화될 때보다 더 강력한 pI 변화가 일어난다. 본원에서 치환 돌연변이에 대한 표시는 글자 다음에 번호에 이어 글자로 구성된다. 첫번째 글자는 야생형 단백질에서의 아미노산을 의미한다. 번호는 아미노산 치환이 일어난 아미노산 위치를 의미하며, 두번재 글자는 야생형 아미노산을 치환하는데 사용된 아미노산을 의미한다. 본 발명에서 PhoS의 바람직한 돌연변이는, 리신 잔기(K) 275, 107, 109, 110, 262, 265, 266, 309, 313이 단독 또는 조합 돌연변이로서, 글루탐산(E) 또는 글루타민(Q)으로 치환되는 것이고, 또한 리신(K)318이 단독 또는 조합 돌연변이로서 아스파르트산(D)으로 치환될 수 있다. 바람직하게, 단독 돌연변이는 K262E, K265E 및 K266E이다. 바람직하게, 복합 돌연변이는 K265/266E 및 K110/265/266E이다. 보다 바람직하게, 모든 돌연변이는 C 말단에 부착된 폴리아스파르트산(polyD)과 조합되며 경우에 따라서는 또한 K318D 치환과 조합된다. 바람직한 구체예에서 돌연변이는 pI가 적어도 2 유닛 감소된다. 바람직하게, 본 발명의 돌연변이는 PhoS의 pI를 7.2에서 약 4 내지 약 5.5로 감소시킨다. 본 발명의 일 구체예에서, 이.콜라이의 PhoS 단백질의 pI는 돌연변이 polyD K318D, polyD K265/266E 및 polyD K110/265/266E를 사용하여 각각 7.2에서 약 4.9, 약 4.8 및 약 4.5로 감소된다.
목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리펩티드, 바람직하게는 성숙한 폴리펩티드의 N 말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드와 융합물로서 발현될 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 프로세싱되는 것이어야 한다. 천연 또는 진핵생물 폴리펩티드 신호 서열을 인식하지 않아서 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 원핵생물 신호 서열로 치환된다. 적절한 신호 서열은 OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA 및 DsbC를 포함한다.
폴리뉴클레오티드를 참조하는 본원에 기술된 본 발명의 구체예는 관련 측면이 돌일하게 적용될 수 있는 한, 본원에 적용되는 성분을 포함하는 벡터, 발현 카세트 및/또는 숙주 세포에 동등하게 적용된다.
본 발명은 또한 목적 재조합 단백질을 발현하는데 효과적인 조건 하에 배양 배지에서 상기 기술된 바와 같은 재조합 그람-음성 박테리아 세포를 배양하는 단계 및 재조합 그람-음성 박테리아 세포의 주변세포질 및/또는 배양 배지로부터 목적 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 세포가 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일 구체예에서, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 효과적인 조건 하에서 배양된다.
본 발명의 방법에 적용되는 그람 음성 박테리아 세포 및 목적 단백질은 바람직하게는 상기 상세하게 기술되어 있다.
목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 외생성인 경우, 폴리뉴클레오티드는 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용해 숙주 세포로 도입될 수 있다. DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 당분야에 공지된 임의의 적절한 수단을 사용해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 대체로, 폴리뉴클레오티드는 세포를 형성질환시키는 발현 벡터의 일부분으로서 도입된다. 따라서, 일 측면에서 본 발명에 따른 세포는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트 및 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 표준 방법, 예를 들면, 염화루비듐, PEG 또는 전기천공을 적용하는 표준 방법을 사용해 세포로 형질전환될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 또한 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 성공적으로 형질전환된 안정한 세포의 선별을 돕도록 선별 시스템을 채택할 수 있다. 선별 시스템은 대체로 선별 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 공동 형질전환시키는 것을 사용한다. 일 구체예에서, 세포로 형질전환되는 각 폴리뉴클레오티드는 1 이상의 선별 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 따라서, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경우에 따라 DsbC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 마커를 코딩하는 1 이상의 폴리뉴클레오티드의 형질전환은 함께 수행되며 선별 시스템은 원하는 단백질을 생성하는 세포를 선별하는데 사용될 수 있다.
1 이상의 마커를 발현할 수 있는 세포는 인공적으로 부여된 일정 조건, 예를 들면 독소 또는 항생체 부가 조건 하에서 생존/성장/복제할 수 있는데, 본원에서 도입한 선별 시스템의 폴리펩티드/유전자 또는 폴리펩티드 성분(예를 들면, 항생제 내성)에 의해 부여된 특성때문이다. 1 이상의 마커를 발현할 수 없는 세포들은 인공적으로 부여된 조건 하에서 생존/성장/복제할 수 없다. 인공적으로 부여된 조건은 필요하다면 보다 또는 덜 격렬하도록 선택할 수 있다.
임의의 적절한 선별 시스템이 본 발명에서 사용될 수 있다. 대체로 선별 시스템은 벡터에 기지 항생제 예를 들면, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 카나마이신 또는 암피실린 내성 유전자에 내성을 제공하는 1 이상의 유전자를 포함하는 것을 기초로 할 수 있다. 관련 항생제 존재 하에서 성장하는 세포는 그들이 항생제에 내성을 부여하는 유전자와 원하는 단백질을 제공하는 유전자 둘 모두를 발현하므로 선별할 수 있다.
유도성 발현 시스템 또는 항상성 발현 시스템을 본 발명에서 사용하여 목적 단백질 및/또는 DsbC 단백질을 발현할 수 있다. 일 구체예에서, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현은 배양 배지에 유도인자(inducer)를 부가하여 유도된다. 적절한 유도성 발현 시스템 및 항상성 프로모터는 당분야에서 공지이다.
임의의 적절한 배지를 사용하여 형질전환된 세포를 배양할 수 있다. 배지는 특정 선별 시스템에 따라 조정될 수 있는데, 예를 들면, 배지는 성공적으로 형질전환된 세포만이 배지에서 성장하도록, 항생제를 포함할 수 있다.
배지에서 얻은 세포에 대해서 필요하다면 추가의 스크리닝 및/또는 정제를 수행할 수 있다. 이 방법은 필요하다면 목적 단백질을 추출 및 정제하는 1 이상의 단계를 더 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 세포질, 주변세포질 및/또는 상등액을 포함하여, 균주로부터 회수될 수 있다.
단백질을 정제하는데 사용되는 특정 방법(들)은 단백질 유형에 따라 좌우된다. 적절한 방법은 면역 친화성 또는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전법; 역상 HPLC; 소수성-상호작용 크로마토그래피; 실리카 상에서의 크로마토그래피; 이온-교환 수지 예컨대 S-세파로스 및 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 황산암모늄 침전법; 및 겔 여과법을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 DsbC로부터 목적 재조합 단백질을 분리하는 단계를 더 포함한다.
항체는 통상의 항체 정제법 예컨대 단백질 A-세파로스, 단백질 G 크로마토그래피, 단백질 L 크로마토그래피, 친황, 혼합 모드 수지, His-태그, FLAG 태그, 히드록실라파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 친화력 크로마토그래피, 황산암모늄, 에탄올 또는 PEG 분획화/침전법, 이온 교환 막, 팽창상 흡착 크로마토그래피(EBA) 또는 모의 이동층 크로마토그래피에 의해 배양 배지 및/또는 세포질 추출물 및/또는 주변세포질 추출물로부터 적절하게 분리될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 목적 단백질의 발현 양을 측정하고 목적 단백질의 발현 수준이 높은 세포를 선택하는 추가 단계를 포함할 수도 있다.
본 발명의 방법은 또한 예컨대 목적 단백질, 예컨대 항체 또는 항체 단편의 PEG화 등과 같은 1 이상의 추가의 후속 처리 단계를 포함할 수도 있다.
본원에 기술된 1 이상의 방법 단계뜰은 적절한 용기 예컨대 생물반응기에서 조합되어 수행될 수 있다.
실시예
실시예 1 - 세포 균주 MXE001(ΔTsp)의 생성
MXE001 균주는 다음과 같이 생성하였다:
Tsp 카세트는 Sal I, Not I 제한 효소 단편으로서 유사하게 제한효소 처리한 pKO3 플라스미드로 이동시켰다. pKO3 플라스미드는 염색체 통합 이벤트를 일으키고 선별하기 위한 클로람페니콜 마커와 함께 pSC101 복제 기원(RepA)의 온도 감응성 돌연변이체를 사용한다. 레반수크라아제를 코딩하는 sacB 유전자는 수크로스 상에서 성장하는 이.콜라이에 치명적이어서 (클로람페니콜 마커 및 pSC101 기원과 함께) 탈통합 및 플라스미드 큐어링(curing)을 일으키고 이에 대해 선별하는데 사용된다. 이러한 방법론은 이미 [(Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622), 및 (Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457)]에 기술되어 있다. pKO3 시스템은 삽입된 유전자를 제외하고는 숙주 게놈으로부터 모든 선별 마커를 제거시킨다.
이하의 플라스미드를 제작하였다.
EcoR I 및 Ase I 제한효소 마커를 포함하는 서열번호 3에 도시된 바와 같은 넉아웃 돌연변이된 Tsp 유전자를 포함하는 pMXE191.
이어서 이 플라스미드를 [Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)]에 기재된 방법을 사용해 제조한 전기-컴피턴트 컴피턴트(competent) 이.콜라이 W3110 세포에 형질전환시켰다.
1일. 40 ㎕의 이.콜라이 세포를 (10 pg) 1 ㎕의 pKO3 DNA와 차가운 BioRad 0.2 ㎝ 전기천공 큐벳에서 혼합시킨 후 2500 V, 25 μF 및 200 Ω에서 전기천공하였다. 1000 ㎕의 2xPY를 즉시 부가하고, 세포를 30℃에 항온배양기에서 1시간 동안 250 rpm에서 진탕하여 회수하였다. 세포를 2xPY에서 1/10로 연속 희석한 후 100 ㎕ 분취액을 30℃ 및 43℃에서 사전승온시킨 20 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 2xPY 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 30℃ 및 43℃에서 밤새 항온반응시켰다.
2일. 30℃에서 성장한 콜로니의 수는 전기천공 효율 추정치를 제공하는 한편 43℃에서의 생존 성장은 잠재적인 통합 이벤트를 의미한다. 43℃ 플레이트 유래의 단일 콜로니를 얻어서 10 ㎖의 2xPY에 재현탁시켰다. 이중 100 ㎕를 30℃에서 사전승온시킨 5%(w/v) 수크로스 함유 2xPY 한천 플레이트에 플레이팅하여 단일 콜로니를 생성시켰다. 플레이트를 30℃에서 밤새 항온배양시켰다.
3일. 여기서 콜로니는 잠재적인 동시적인 탈통합 및 플라스미드 큐어링 이벤트를 의미한다. 탈통합 및 큐어링 이벤트가 성장 초기에 일어났다면, 대량의 콜로니 덩어리가 복제될 것이다. 단일 콜로니를 얻어서 20 ㎍/㎖ 의 클로람페니콜 또는 5%(w/v) 수크로스를 함유하는 2xPY 한천 플레이트 상에 레플리카 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 30℃에서 항온배양시켰다.
4일. 수크로스 상에서는 성장하고 클로람페니콜 상에서는 사멸된 콜로니는 잠재적인 염색체 치환 및 플라스미드 큐어링 이벤트를 의미한다. 이들을 얻어서 돌연변이 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용해 PCR을 통해 스크리닝하였다. 5%(w/v) 수크로스 함유 2xPY 한천 플레이트 상에서 단일 콜로니를 생성시키기 위해 올바른 크기의 양성 PCR 밴드를 생성한 콜로니를 스트리킹하고 이 플레이트를 30℃에서 밤새 항온배양하였다.
5일. PCR 양성, 클로람페니콜 감응성 및 수크로스 내성 이.콜라이 콜로니를 사용하여 글리세롤 스톡, 화학적 컴피턴트 세포를 만들고 Taq 중합효소를 사용한 직접 DNA 서열분석을 위한 PCR 산물을 생성시키도록 5' 및 3' 측접 올리고머와의 PCR 반응을 위한 PCR 주형으로서 사용하였다.
세포 균주 MXE001는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 도 1a, 1b 및 1c에 도시된 바와 같이, 비천연 발생 Ase I 제한효소 부위를 포함하는 Tsp 유전자 영역의 PCR 증폭을 통하여, 돌연변이된 Tsp 유전자를 보유하는 게놈 DNA의 성공적인 변형을 검증하는 테스트를 하였다. 이어서 DNA 증폭 영역을 돌연변이된 유전자 내 비천연 발생 Ase I 제한효소 부위의 존재를 확증하기 위해 Ase I 제한효소와 항온반응하기 전 및 후에 겔 전기영동으로 분석하였다. 이 방법은 다음과 같이 수행하였다.
MXE001 및 W3110으로 준비한 이.콜라이 세포 용균물 유래의 게놈 DNA를 다음의 올리고머를 사용하고 PCR을 이용해 증폭시켰다:
6284 Tsp 3' 5'-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3' (서열번호 15)
6283 Tsp 5' 5'-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3' (서열번호 16)
용균물은 1X PCR 완충액 20 ㎕ 중에서 95℃에 10분간 세포의 단일 콜로니를 가열하여 준비하였다. 이러한 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 10분간 13,200 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 분리하고 '세포 용균물'이라고 표지하였다.
각 균주는 Tsp 올리고머 쌍을 사용해 증폭하였다.
DNA는 표준 PCR 방법을 사용해 증폭하였다.
5 ㎕ 완충액 x10 (Roche)
1 ㎕ dNTP 믹스 (Roche, 10 mM 믹스)
1.5 ㎕ 5' 올리고 (5 pmol)
1.5 ㎕ 3' 올리고 (5 pmol)
2 ㎕ 세포 용균물
0.5 ㎕ Taq DNA 중합효소 (Roche 5U/㎕)
38.5 ㎕ H2O
PCR 싸이클.
94℃ 1 분
94℃ 1 분)
55℃ 1 분) 30싸이클 반복
72℃ 1 분)
72℃ 10 분
반응이 종료되면 Ase I 효소분해를 위해 25 ㎕를 새로운 마이크로튜브에 옮겼다. 25 ㎕의 PCR 반응물에 19 ㎕의 H2O, 5 ㎕의 완충액 3(NEB), 1 ㎕의 Ase I(NEB)을 부가하고, 혼합한 후 37℃에서 2시간 동안 항온반응시켰다.
나머지 PCR 반응물에 5 ㎕의 로딩 완충액(x6)을 부가하고 20 ㎕를 에티듐 브로마이드(5 ㎕의 10 mg/㎖ 스톡)가 더해진 0.8% TAE 200 ㎖ 아가로스 겔 상에 로딩하고 1시간 동안 100 볼트에서 러닝하였다. 10 ㎕의 크기 마커(퍼펙트 DNA 마커 0.1-12Kb, Novagen)를 마지막 레인에 로딩하였다.
Ase I 효소분해가 완료되면 10 ㎕의 로딩 완충액(x6)을 부가하고 에티듐 브로마이드(5 ㎕의 10 mg/㎖ 스톡)가 더해진 0.8% TAE 아가로스 겔(Invitrogen) 상에 20 ㎕를 로딩하고 100 볼트에서 1시간 동안 러닝하였다. 10 ㎕의 크기 마커(퍼펙트 DNA 마커 0.1-12Kb, Novagen)를 마지막 레인에 로딩하였다. 두 겔을 UV 트랜스루미네이터를 사용해 가시화하였다.
증폭된 게놈 단편은 Tsp에 대해 2.8 kb의 정확한 크기 밴드를 보였다. Ase I로 효소분해한 후, Tsp 결핍 균주 MXE001에는 도입된 Ase I 부위가 존재하지만 W3110 대조군에는 존재하지 않음을 통해서 확인하였다.
MXE001: 게놈 DNA를 Tsp 프라이머 세트를 사용해 증폭하였고 얻어진 DNA는 Ase I로 효소분해하여 2.2 및 0.6 Kbp 밴드가 생성되었다.
W3110 PCR 증폭된 DNA는 Ase I 제한효소에 의해 분해되지 않았다.
실시예 2 - spr 돌연변이체의 생성
spr 돌연변이는 상보성 어세이를 사용해 생성시키고 선별하였다.
spr 유전자는 1000 bp 당 1 내지 2 돌연변이를 도입시키는 Clontech® random mutagenesis diversity PCR 키트를 사용해 돌연변이시켰다. 돌연변이된 spr PCR DNA는 spr 돌연변이체와 함께 CDP870 Fab'를 발현하는 유도성 발현 벡터 [pTTO CDP870]에 클로닝하였다. 이러한 결찰물을 이어 [Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)]에 기술된 방법을 사용해 준비한 이.콜라이 균주 MXE001(ΔTsp)에 전기-형질전환시켰다. 이하의 프로토콜을 사용하였는데, 40 ㎕의 전기 컴피턴트 MXE001, 2.5 ㎕의 결찰물(100 pg의 DNA)을 0.2 cm 전기천공 큐벳에 부가하고, 전기-형질전환을 다음의 조건: 2500 V, 25 μF 및 200 Ω으로 BioRad Genepulser Xcell을 사용해 수행하였다. 전기-형질전환 후 1 ㎖의 SOC(Invitrogen) (37℃로 사전승온)를 부가하고 세포를 조심스럽게 교반하면서 1시간 동안 37℃에서 회복시켰다.
세포를 저장성 한천 배지(5 g/ℓ 효모 추출물, 2.5 g/ℓ 트립톤, 15 g/ℓ 한천(모두 Difco))에 플레이팅하고 40℃에서 항온배양하였다. 콜로니가 형성된 세포를 HLB 상에 43℃에서 재플레이팅하여 MXE001 균주에 대해 고온에 저삼투압 조건 하에서 성장하는 능력의 복원을 확인하였다. 플라스미드 DNA를 선별한 클론으로부터 준비하고 서열분석하여 spr 돌연변이를 확인하였다.
이 방법을 사용하여 다음과 같이 ΔTsp 표현형을 보완하는 spr 단백질 내에 단일 돌연변이 8개, 이중 돌연변이 1개 및 복수 돌연변이 1개를 단리하였다:
1. V98E
2. D133A
3. V135D
4. V135G
5. G147C
6. S95F 및 Y115F
7. I70T
8. N31T, Q73R, R100G, G140C
9. R62C, Q99P, R144C
10. L108S
11. L136P
실시예 3 - spr 돌연변이를 보유하는 이.콜라이 세포 균주의 생성
야생형 비재조합 염색체 Tsp 유전자를 보유하는 spr 돌연변이된 균주를 생성하도록 야생형 W3110 이.콜라이 균주(유전자형: F-LAM-IN(rrnD-rrnE)1 rph1(ATCC 번호 27325)) 또는 조합된 ΔTsp/돌연변이체 spr 균주를 만들도록 실시예 1 유래의 MXE001(ΔTsp) 균주를 이용하여 신규한 균주를 생성시키기 위해 실시예 2에서 동정된 개별 돌연변이 1-5 및 spr의 3 촉매 트리아드 돌연변이(C94A, H145A, H157A) 및 W174R를 사용하였다.
이하의 돌연변이체 이.콜라이 세포 균주는 MXE001을 생성하기 위해 실시예 1에서 기술한 바와 같이, pKO3 상동성 재조합/치환 플라스미드(Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237)를 사용하는 유전자 치환 벡터 시스템을 이용해 생성시켰다.
돌연변이체 이.콜라이 세포 균주 유전자형 Spr 벡터
MXE001 ΔTsp -
MXE008 ΔTsp, spr D133A pMXE339, pK03 spr D133A (-SalI)
MXE009 ΔTsp, spr H157A pMXE345, pK03 spr H157A (-SalI)
MXE010 spr G147C pMXE338, pK03 spr G147C (-SalI)
MXE011 spr C94A pMXE343, pK03 spr C94A (-SalI)
MXE012 spr H145A pMXE344, pK03 spr H145A (-SalI)
MXE013 spr W174R pMXE346, pK03 spr W174R (-SalI)
MXE014 ΔTsp, spr V135D pMXE340, pK03 spr V135D (-SalI)
MXE015 ΔTsp, spr V98E pMXE342, pK03 spr V98E (-SalI)
MXE016 ΔTsp, spr C94A pMXE343, pK03 spr C94A (-SalI)
MXE017 ΔTsp, spr H145A pMXE344, pK03 spr H145A (-SalI)
MXE018 ΔTsp, spr V135G pMXE341, pK03 spr V135G (-SalI)
돌연변이체 spr 통합 카세트는 Sal I, Not I 제한효소 단편으로서 유사하게 제한효소 처리한 pKO3 플라스미드로 옮겼다.
플라스미드는 염색체 통합 이벤트를 일으키고 선별하기 위한 클로람페니콜 마커와 함께 pSC101 복제 기원(RepA)의 온도 감응성 돌연변이체를 사용한다. 레반수크라아제를 코딩하는 sacB 유전자는 수크로스 상에서 성장하는 이.콜라이에 치명적이며 따라서(클로람페니콜 마커 및 pSC101 기원과 함께) 탈통합 및 플라스미드 큐어링 이벤트를 일으키고 선별하는데 사용된다. 이러한 방법은 이미 [(Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622) 및 (Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457)]에 기술되어 있다. pKO3 시스템은 삽입된 유전자를 제외하고는 숙주 게놈으로부터 모든 선별 마커를 제거한다.
클로닝 확인을 위한 Sal I 제한효소 부위를 제거한 spr 서열 내 침묵 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 spr 유전자를 포함하는, 이하의 pKO3 벡터를 제작하였다.
pMXE336, pK03 spr S95F (-SalI)
pMXE337, pK03 spr Y115F (-SalI)
pMXE338, pK03 spr G147C (-SalI)
pMXE339, pK03 spr D133A (-SalI)
pMXE340, pK03 spr V135D (-SalI)
pMXE341, pK03 spr V135G (-SalI)
pMXE342, pK03 spr V98E (-SalI)
pMXE343, pK03 spr C94A (-SalI)
pMXE344, pK03 spr H145A (-SalI)
pMXE345, pK03 spr H157A (-SalI)
pMXE346, pK03 spr W174R (-SalI)
이들 플라스미드를 이어서 [Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation," in Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)]에 기술된 바와 같은 방법을 사용해 제조된 화학적 컴피턴트 이.콜라이 W3110 세포에 형질전환시키거나 또는 실시예 1 유래의 MXE001 균주에 형질전환시켜서 표 1에 도시된 바와 같은, 복합 ΔTsp/돌연변이체 spr 균주를 만들었다.
1일. 40 ㎕의 전기-컴피턴트 이.콜라이 세포 또는 MXE001 세포를 차가운 BioRad 0.2 ㎝ 전기영동 큐벳에서 1 ㎕의 pKO3 DNA와 혼합하고 2500V, 25 μF 및 200 Ω에서 전기천공하였다. 1000 ㎕의 2xPY를 즉시 부가하고, 세포는 1시간 동안 30℃ 항온배양기에서 250 rpm에서 진탕하여 회복시켰다. 세포를 2xPY에서 1/10 연속 희석한 후 100 ㎕ 분취액을 30℃ 및 42℃에서 사전승온시킨 30 ㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 2xPY 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 30℃ 및 43℃에서 항온배양하였다.
2 일. 30℃에서 성장한 콜로니의 수는 전기천공 효율 추정치인 한편 43℃에서의 생존 성장은 잠재적인 통합 이벤트를 의미한다. 43℃ 플레이트에서 단일 콜로니를 얻고 10 ㎖의 2xPY에 재현탁하였다. 이중 100 ㎕를 30℃로 사전승온시킨 5%(w/v) 수크로스를 함유하는 2xPY 한천 플레이트 상에 플레이팅하여 단일 콜로니를 생성시켰다. 플레이트를 밤새 30℃에서 항온배양시켰다.
3일. 여기서 콜로니는 잠재적인 동시적 탈통합 및 플라스미트 큐어링 이벤트를 의미한다. 탈통합 및 큐어링 이벤트가 성장 초기에 일어났으면, 다량의 콜로니가 복제될 것이다. 단일 콜로니를 얻어서 20 ㎍/㎖의 클로람페니콜 또는 5%(w/v) 수크로스를 함유하는 2xPY 한천 배지에 레플리카 플레이팅하였다. 플레이트를 밤새 30℃에서 항온배양하였다.
4일. 수크로스 상에서는 성장하고 클로람페니콜 상에서는 사멸하는 콜로니는 잠재적인 염색체 치환 및 플라스미트 큐어링 이벤트를 의미한다. 이들을 얻어서 PCR과 SalI 부위 상실에 대한 제한효소 분해를 통해 스크리닝하였다. 5%(w/v) 수크로스를 함유하는 2xPY 한천 배지 상에서 단일 콜로니를 생성시키기 위해 올바른 크기의 양성 PCR 밴드를 생성하고 SalI 분해에 대해 내성인 콜로니를 스트리킹하고 이 플레이트를 밤새 30℃에서 항온배양시켰다.
5 일. PCR 양성, 클로람페니콜 감응성 및 수크로스 내성 이.콜라이의 단일 콜로니를 사용해 글리세롤 스톡, 화학적 컴피턴트 세포를 만들고, 올바른 돌연변이를 확인하기 위해 Taq 중합효소를 사용하여 직접 DNA 서열분석을 위한 PCR 산물을 생성시키기 위해 5' 및 3' 측접 올리고와의 PCR 반응을 위한 PCR 주형으로서 사용하였다.
실시예 4 - Fab' 및 DsbC 공동발현용 플라스미드의 생성
항-TNF Fab'의 경쇄 및 중쇄 서열(서열번호 13에 도시된 경쇄 서열 및 서열번호 14에 도시된 중쇄 서열을 갖는 항-TNF Fab') 및 DsbC를 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드를 제작하였다.
WO01/94585에 기술된 항-TNFα Fab' 단편(CDP870라 함)의 디시트론 메세지를 생성시켰다. 상류 시스트론은 항체의 경쇄(서열번호 13)를 코딩하는 한편 하류 시스트론은 항체의 중쇄(서열번호 14)를 코딩하였다. OmpA 신호 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 주변세포질로의 효율적인 분비가 이루어지도록 경쇄 및 중쇄 각각에 대한 DNA 코딩부의 5' 말단에 융합시켰다. 유전자내 서열(IGS2)은 서열번호 37에 도시된 바와 같은 것을 사용하였다.
CDP870 Fab'(항-TNF Fab') 및 DsbC(주변세포질 폴리펩티드)용 발현 벡터인, 플라스미드 pDPH358(pTTO 40.4 CDP870 IGS2)는 [Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y]에 기재된 바와 같은 통상의 제한효소 클로닝 방법론을 사용해 제작하였다. 플라스미드 pDPH358은 다음의 특징을 포함한다: 강력한 tac 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열. 도 10에 도시한 바와 같이, Fab' 중쇄의 코딩 영역 이후에 고유한 EcoRI 제한효소 부위, 후속되는 비코딩 서열 및 이어서 고유한 NdeI 제한효소 부위를 포함한다. DsbC 유전자는 PCR 산물이 5' EcoRI 부위, 이어서 강한 리보솜 결합부, 이어서 천연 개시 코돈, 신호 서열 및 성숙한 DsbC 서열이 후속되어 코딩되고, C 말단에 His 태그로 종결되며 최종적으로 비코딩 NdeI 부위를 코딩하도록 주형으로서 W3110 미정제 염색체 DNA를 사용해 PCR 클로닝하였다. EcoRI-NdeI PCR 단편을 제한효소 처리하고 발현 벡터에 결찰시켜서 모든 3종의 폴리펩티드: Fab' 경쇄, Fab' 중쇄 및 DsbC가 단일 폴리시스트론 mRNA 상에 코딩되게 하였다.
Fab 경쇄, 중쇄 유전자 및 DcbC 유전자는 단일 폴리시스트론 메세지로서 전사되었다. 이.콜라이 OmpA 단백질 유래의 신호 펩티드를 코딩하는 DNA를 경쇄 및 중쇄 유전자 서열의 5' 말단에 융합시켜서, 폴리펩티드가 이.콜라이 주변세포질로 위치이동할 수 있게 하였다. 전사는 이중 전사 종결인자 rrnB t1t2를 사용해 종결시켰다. lacIq 유전자는 항상 발현되는 Lac I 억제인자 단백질을 코딩한다. 이는 알로락토스 또는 IPTG 존재에 의해 탈억제가 유도될 때까지 tac 프로모터로부터의 전사를 억제한다. 사용되는 복제 기원은 카피수를 낮게 유지시키는 p15A였다. 이 플라스미드는 항생제 선별을 위한 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하였다.
실시예 5 - 이.콜라이 균주에서 항-TNF Fab' 또는 항-TNF Fab' 및 DsbC의 발현
항-TNF Fab' 및 DsbC의 발현
야생형 W3110 세포주, 실시예 1에서 제공된 MXE001 균주 및 실시예 3에서 제공된 돌연변이체 균주 MXE012(H145A spr 돌연변이체 균주)를 실시예 4에서 만든 플라스미드로 형질전환시켰다.
균주의 형질전환은 [Chung C.T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989)]에 기술된 방법을 이용해 수행하였다.
항-TNF Fab'의 발현
야생형 W3110 세포주, 실시예 3에서 제공된 spr 돌연변이체 균주 MXE008, MXE012, MXE017 및 MXE012(H145A spr 돌연변이체 균주) 및 실시예 1에서 제공된 MXE001 균주를 플라스미드 pMXE117(pTTO CDP870 또는 40.4 IGS17)로 형질전환시켰는데, 이 CDP870 Fab'(서열번호 13에 도시된 경쇄 서열 및 서열번호 14에 도시된 중쇄 서열을 갖는 항-TNF Fab')에 대한 발현 벡터는 [Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y]에 기술된 통상의 제한효소 클로닝 방법론을 사용해 제작하였다. 플라스미드 pMXE117(pTTO CDP870 또는 40.4 IGS17)는 다음의 특징을 포함한다: 강력한 tac 프로모터 및 lac 오퍼레이터 서열. Fab 경쇄 및 중쇄 유전자는 단일 디시스트론 메세지로서 전사되었다. 이.콜라이 OmpA 단백질 유래의 신호 펩티드를 코딩하는 DNA를 경쇄 및 중쇄 유전자 서열의 5' 말단에 융합시켜서, 이.콜라이 주변세포질로 폴리펩티드가 위치이동할 수 있게 하였다. 전사는 이중 종결인자 rrnB t1t2를 사용해 종결시켰다. lacIq 유전자는 항상 발현되는 Lac I 억제인자 단백질을 코딩한다. 이는 알로락토스 또는 IPTG 존재에 의해 탈억제가 유도될 때까지 tac 프로모터로부터의 전사가 억제된다. 사용된 복제 기원은, 카피 수를 낮게 유지시키는 p15A였다. 이 플라스미드는 항생제 선별을 위한 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하였다.
균주의 형질 전환은 [Chung C.T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989)]에 기술된 방법을 사용해 수행하였다.
실시예 6 - 진탕 플라스크 배양을 사용하여 돌연변이된 이.콜라이 균주에서 항-TNF Fab'의 발현
항-TNF Fab'를 발현하는 실시예 5에서 생성된 다음의 균주들: W3110, MXE001, MXE012 및 MXE017을 Fab'의 발현 및 성장을 비교하는 진탕 플라스크 실험으로 테스트하였다.
사용된 진탕 플라스크 실험 프로토콜은 다음과 같이 수행하였다:
5 ㎖ 진탕 플라스크 실험
단일 콜로니를 10 ㎍/㎖의 테트라사이클린을 포함하는 5 ㎖ LB에 넣고 250 rpm에서 진탕하면서 30℃에서 밤새 성장시켰다.
밤새 배양물을 사용해 테트라사이클린을 포함한 100 ㎖에 OD600 0.1(즉, 4의 OD에 대해, 100/4x01 = 100 ㎖ 중 2.5 ㎖)로 접종하였다.
3x5 ㎖ 배양 튜브를 이러한 마스터 배양을 사용하는데 필요한 매 시점에 대해 셋팅하였다. 1 기준 배양은 OD 측정용 샘플링을 위해 셋팅하였다.
배양물은 처음에는 육안으로 성장을 모니터링하고, 이후에는 0.5 OD600의 배양물(일반적으로 약 2시간)을 맞추기 위해 기준 배양물을 샘플링하여 모니터링하면서 30℃ 250 rpm에서 진탕하였다. 배양물이 0.5를 넘는 OD에 도달하면 200 μM (0.04 M 25 ㎕)의 농도로 각 배양물에 IPTG를 부가하였다.
배양 튜브를 필요한 시점 예를 들면 유도 후 1시간, 2시간에 채취하여 얼음에 유지시켰다.
13,200 rpm에서 5분간 원심분리 후, 세포 펠렛을 주변세포질 추출 완충액(100 mM Tris.Cl/10 mM EDTA pH 7.4) 200 ㎕에 재현탁시켰다. 주변세포질 추출물을 250 rpm에서 밤새 30℃에서 교반하였다. 다음날, 추출물을 10분간 13,200 rpm에서 원심분리하고, 상등액을 버리고 '주변세포질 추출물'로서 -20℃에 보관하였다. 소모된 세포 펠렛은 버렸다.
ELISA 정량
96 웰 플레이트를 PBS 중 2 ㎍/㎖의 AB141(토끼 항-인간 CH1, UCB)로 4℃에서 밤새 코딩하였다. 300 ㎕의 샘플/접합체 완충액(PBS, BSA 0.2% (w/v), Tween 20 0.1% (v/v))으로 3회 세척한 후, 샘플과 표준물의 연속 1/2 희석을 100 ㎕의 샘플/접합체 완충액 중에 플레이트 상에서 수행하고, 플레이트를 250 rpm에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 300 ㎕의 세척 완충액(PBS, Tween 20 0.1% (v/v))으로 3회 세척 후, 샘플/접합체 완충액 중에서 1/1000으로 희석한 후, 100 ㎕의 노출 항체 6062(토끼 항-인간 카파 HRP 접합됨, The Binding Site, Birmingham, U.K.)를 부가하였다. 이어서 플레이트를 250 rpm에 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 세척 완충액 3 x 300 ㎖로 세척한 후, 100 ㎕의 TMB 기질(TMB 용액(Calbiochem):H2O의 50:50 믹스)을 부가하고 자동 플레이트 판독기를 사용해 A630을 기록하였다. 주변세포질 추출물 중 Fab'의 농도는 적절한 이소타입의 정제된 Fab' 표준물과 비교하여 산출하였다.
도 1은 야생형 W3110 및 MXE001과 비교하여 향상된 MXE012 및 MXE017의 성장률을 도시한 도면이다.
도 2는 야생형 W3110 및 MXE001과 비교하여 MXE012 및 MXE017에서 Fab'의 향상된 발현을 도시한 도면이다.
실시예 7 - 고밀도 발효배양을 사용한 항-TNF Fab' 또는 항-TNF Fab' 및 DsbC를 발현하는 이.콜라이의 성장
실시예 5에서 제조한 바와 같은 이하의 균주들을 성장 및 항-TNFα Fab'의 발현을 비교하는 발효배양 실험에서 테스트하였다:
실시예 5에서 제조된 항-TNF Fab'를 발현하는 균주:
W3100
MXE012(H145A spr 돌연변이체 균주)
실시예 5에서 제조된 항-TNF Fab' 및 DsbC를 발현하는 균주:
W3110
MXE012(H145A spr 돌연변이체 균주)
성장 배지
발효배양 배지는 3.86 g/ℓ NaH2PO4.H2O 및 112 g/ℓ 글리세롤을 포함하는 SM6E 배지([Humphreys et al., 2002, Protein Expression 및 Purification, 26, 309-320)]에 기재됨)를 기초로 하였다.
접종. 접종 배양물은 10 ㎍/㎖ 테트라사이클린이 보충된 동일 배지에서 성장시켰다. 배양물은 대략 22시간 동안 교반하면서 30℃에서 항온배양하였다.
발효배양. 발효배양기(총 2.5 리터)에 0.3-0.5 OD600로 접종 배양물을 씨딩하였다. 온도는 성장기 동안 30℃로 유지하였고 유도 전에 25℃로 낮추었다. 용존 산소 농도는 다양한 교반 및 기류에 의해 30% 공기 포화도 이상으로 유지시켰다. 배양 pH는 15% (v/v) NH4OH 및 10%(v/v) conc. H2SO4를 사용하는 자동 적정에 의해 7.0으로 제어하였다. 10%(v/v) Struktol J673 용액(Schill and Seilacher)을 사용해 거품발생을 제어하였다.
발효배양의 상이한 단계에서 수많은 부가물을 가하였다. 생물량 농도가 40 OD600에 도달하면, 마그네슘 염 및 NaH2PO4.H2O를 부가하였다. 인산염이 과량으로 유지될 수 있도록 유도기 전 및 동안 NaH2PO4.H2O를 추가로 부가하였다. 발효배양 시작시 존재한 글리세롤이 고갈되면(대략 75 OD600) 80%(w/w) 글리세롤을 연속적으로 공급하였다. 동시에 발효배양물에 170 μM 의 IPTG를 공급하였다. IPTG 공급 시작은 유도 시작에 따라 실시하였다. 발효배양은 글리세롤 공급 속도(0.5 내지 2.5 ㎖/h)에서 대체로 64-120시간 동안 실시하였다.
생물량 농도 및 성장률 측정. 생물량 농도는 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 결정하였다.
주변세포질 추출. 세포는 원심분리를 통해 배양 샘플로부터 회수하였다. 상등액 분획을 추가 분석을 위해 유지시켰다(-20℃에서). 세포 펠렛 분획을 추출 완충액(100 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA; pH 7.4)에 원래 배양 부피로 재현탁하였다. 대략 16시간 동안 60℃에서 항온반응 후, 추출물을 원심분리하여 투명하게 만들고 상등액 분획을 분석을 위해 유지시켰다(-20℃에서).
Fab' 정량. 주변세포질 추출물 배양 상등액 중 Fab' 농도는 [Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320]에 기술된 바와 같이 Fab' 어셈블리 ELISA에 의해 그리고 단백질 G HPLC를 사용해 측정하였다. HiTrap 단백질-G HP 1 ㎖ 컬럼(GE-Healthcare 또는 균등물)을 2 ㎖/분으로 분석물과 함께 로딩하고(대략 중성 pH, 30℃, 0.2 ㎛ 여과됨), 컬럼을 20 mM 인산염, 50 mM NaCl pH 7.4로 세척하고, 이어서 50 mM 글리신/HCl pH 2.7을 주입하여 Fab'을 용리하였다. 용리된 Fab'는 Agilent 1100 또는 1200 HPLC 시스템 상에 A280에서 측정하고 기지 농도의 정제된 Fab'의 표준 곡선을 참조하여 정량하였다.
도 3은 장기간 실행 시간의 발효배양 동안 항-TNF Fab'을 발현하는 W3110 및 MXE012의 성장 프로파일을 도시한 도면이다. 이 데이타는 생물량 축정 동안 야생형과 비교하여 spr 균주의 초기 성장률이 조금 증가한 것으로 도시되어 있으며 마지막 ∼20시간의 발효배양동안 야생형 균주 W3110에 비하여 spr 돌연변이체 균주 MXE012의 생존 기간이 증가된 것으로 도시되어 있다.
도 4는 장기간 실행 시간의 발효배양 동안 항-TNF Fab'을 발현하는 W3110 및 MXE012(W3110 spr H145A)에 대한 주변세포질 Fab' 축적(실선 및 채워진 심볼) 및 배지 Fab' 축적(점선 및 오픈 심볼)을 도시한 도면이다. 이 데이타는 주변세포질 Fab' 축적의 초기 속도가 2 균주간에 매우 유사하지만, 야생형 W3110 세포는 MXE012와 비교하여 발효배양 후기에 주변세포질 Fab'를 누출하는 것을 보여준다.
도 5는 항-TNFα Fab' 발현 균주 W3110 및 MXE012 및 항-TNFα Fab'와 재조합 DsbC 발현 균주 W3110 및 MXE012의 성장 프로파일을 도시한 도면이다. 이 그래프에서는 DsbC를 발현하는 균주가 재조합 DsbC를 발현하지 않는 상응하는 세포 균주와 비교하여 향상된 성장률을 나타내는 것을 보여준다. 또한 균주에 spr 돌연변이 존재가 세포 성장률을 향상시킴을 볼 수 있다.
도 6은 항-TNFα Fab' 발현 이.콜라이 균주 W3110 및 MXE012 및 항-TNFα Fab'와 재조합 DsbC 발현 이.콜라이 균주 W3110 및 MXE012로부터의 주변세포질(음영 심볼) 및 상등액(오픈 비음영 심볼) 유래 Fab 수율을 도시한 도면이다. 이 그래프에서는 재조합 DsbC를 발현하는 균주가 항-TNFα Fab'을 높은 수율로 생산함을 보여주는데 균주 MXE012는 대략 92 시간 동안 3.0 g/ℓ 이상 생산한다. 또한 돌연변이체 spr 유전자를 보유하는 MXE012 균주는 적은 상등액 항-TNFα Fab'(오픈 심볼)로도 확인할 수 있는 바와 같이 W3110 균주와 비교하여 용균이 감소된 것으로 나타났다.
실시예 8 - 균주에서 DNA 누출 및 총 단백질량의 결정
dsDNA 어세이:
균주 W3110, MXE001, MXE008 및 MXE012의 상등액으로 이중가닥 DNA 누출을 Quant-IT Picogreen dsDNA 어세이 키트(Invitrogen, Ref: P11496)를 사용해 측정하였다. 표준 곡선은 1-1000 ng/㎖ 범위로 제공된 DNA 표준물을 희석하여 준비하였다. 샘플을 TE 완충액에 희석하여, 형광발광 판독값이 방법의 선형 범위(500 내지 1000배)내에 속하도록 하였다. 96웰 플레이트에서, 100 ㎕의 희석 샘플 또는 포준물을 100 ㎕의 Picogreen 시약과 혼합하고, 이 플레이트를 5분간 빛으로부터 보호하고, 실온에서 항온반응시켰다. 형광발광 계측값은 485 nm 여기 필터, 및 535 nm 발광 필터를 사용해 0.1 s 동안 측정하였다. 결과를 도 7에 도시하였다.
단백질 어세이:
균주 W3110, MXE001, MXE008 및 MXE012의 총 단백질 농도는 쿠마시 플러스 브래드포드 어세이 키트(Pierce, Ref: 23236)를 사용해 측정하였다. 표준 곡선은 25-1000 ㎍/㎖ 범위로 소 혈청 알부민 표준물을 희석하여 만들었다. 샘플을 물에 희석하여 광학 밀도가 방법의 선형 범위(5 내지 10배) 내에 속하도록 하였고, 33 ㎕의 샘플 또는 표준물을 1 ㎖의 쿠마시 시약과 혼합하였다. 10분간 실온에서 항온반응 후, 블랭크로써 쿠마시 시약을 사용하여 분광광도계 상에서 OD595nm를 판독하였다. 총 단백질 농도는 표준 곡선을 기초로 산출하였다. 결과를 도 8에 도시하였다.
실시예 9 - 대규모 발효배양을 사용한 항-TNF Fab' 및 DsbC 발현 이.콜라이 균주의 성장
실시예 5에서 제조된 이하의 균주를 균주의 성장과 생존률 및 항-TNFα Fab' 발현을 비교하는 발효배양 실험에서 테스트하였다:
실시예 5에서 제조된 항-TNF Fab' 및 DsbC를 발현하는 MXE012(spr H145A 돌연변이체)
발효배양은 다음과 같이 수행하였다:
항-TNF Fab' 및 DsbC를 발현하는 MXE012 세포를 진탕 플라스크 배양으로 효모 추출물 및 펩톤의 복합 배지를 사용해 초기 배양하였다. 이어서 세포를 화학적 제한 배지를 사용해 씨딩 단계 발효배양기로 옮겼다. 세포를 정해진 운반점까지 영양분 비제한 조건 하에서 성장시켰다. 세포를 이어서 대략 230 ℓ의 최종 부피로 유사한 화학적 제한 배지를 사용해 250 ℓ 생산 발효배양기로 옮겼다. 배양물을 탄소원 고갈까지 뱃치 모드로 초기 성장시켰다. 탄소원 고갈 후 탄소원을 제한한 공급물을 배수 증가 속도로 공급하였다. 정해진 양의 탄소원을 부가한 후 공급 용액 부가 속도를 감소시키고 IPTG를 부가하여 Fab' 발현을 유도시켰다. 이어서 발효배양을 계속하고 주변세포질에 Fab'을 축적시켰다. 유도 후 정해진 기간에, 배양물을 원심분리로 회수하고 Tris 및 EDTA 완충액 중에 회수된 세포를 재현탁시키고 59℃로 가열하여 세포로부터 Fab'을 추출하였다.
발효배양물의 성장 프로파일은 배양물의 광학 밀도를 600 nm에서 측정하여 결정하였다.
Fab' 역가는 주변세포질 추출 동안 신선한 세포를 사용하고 1 ㎖의 추출 완충액을 세포 배양물에 부가한 것을 제외하고는 상기 실시예 7에 기술된 대로 단백질 G HPLC로 측정하였다. 상등액 및 주변세포질 Fab'은 실시예 7에 기술된 대로 측정하였다. 도 12는 주변세포질 Fab' 역가를 도시한 도면이다.
세포 배양물 생존률은 형광발광-활성화 세포 분류법을 사용해 유세포측정법으로 측정하였다.
도 11은 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 200 ℓ 발효배양의 성장 프로파일이다.
도 12는 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 200 ℓ 발효배양의 주변세포질 항-TNFα Fab' 역가를 도시한 도면이다.
도 13은 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 200 ℓ 발효배양의 생존률을 도시한 도면이다.
실시예 10 - 대규모 발효배양을 사용한 항-TNF Fab' 및 DsbC 발현 이.콜라이 균주의 성장
실시예 5에서 제조된 이하의 균주를 균주의 성장 및 항-TNFα Fab' 발현을 비교하는 발효배양 실험에서 테스트하였다:
실시예 5에서 제조된 항-TNF Fab' 및 DsbC 발현 MXE012
대략 2650 ℓ의 최종 부피를 함유하는 3000 ℓ 생산 발효배양기를 사용해 실시예 9에 기술된 바와 같이 발효배양을 수행하였다.
발효배양의 성장 프로파일은 배양물의 광학 밀도를 600 nm에서 측정하여 결정하였다.
Fab' 역가는 상기 실시예 9에 기술된 바와 같이 단백질 G HPLC에 의해 결정하였다.
도 14는 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 3000 ℓ 발효배양의 성장 프로파일을 도시한 도면이다.
도 15는 항-TNFα Fab' 및 재조합 DsbC 발현 균주 MXE012의 3000 ℓ 발효배양의 주변세포질 항-TNFα Fab' 역가를 도시한 도면이다.
본 발명을 바람직한 구체예를 참조하여 구체적으로 도시하고 기술하였지만, 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 다양한 변형을 가할 수 있음은 당분야의 숙련가에게는 자명하다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB PHARMA S.A. <120> BACTERIAL HOST STRAIN <130> G0105-WO <150> GB1000590.8 <151> 2010-01-14 <160> 39 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2049 <212> DNA <213> E. coli <400> 1 atgaacatgt tttttaggct taccgcgtta gctggcctgc ttgcaatagc aggccagacc 60 ttcgctgtag aagatatcac gcgtgctgat caaattccgg tattaaagga agagacgcag 120 catgcgacgg taagtgagcg cgtaacgtcg cgcttcaccc gttctcatta tcgccagttc 180 gacctcgatc aggcattttc ggccaaaatc tttgaccgct acctgaatct gctcgattac 240 agccacaacg tgctgctggc aagcgatgtt gaacagttcg cgaaaaagaa aaccgagtta 300 ggcgatgaac tgcgttcagg caaactcgac gttttctacg atctctacaa tctggcgcaa 360 aagcgccgtt ttgagcgtta ccagtacgct ttgtcggtac tggaaaagcc gatggatttc 420 accggcaacg acacttataa ccttgaccgc agcaaagcgc cctggccgaa aaacgaggct 480 gagttgaacg cgctgtggga cagtaaagtc aaattcgacg agttaagcct gaagctgaca 540 ggaaaaacgg ataaagaaat tcgtgaaacc ctgactcgcc gctacaaatt tgccattcgt 600 cgtctggcgc aaaccaacag cgaagatgtt ttctcgctgg caatgacggc gtttgcgcgt 660 gaaatcgacc cgcataccaa ctatctttcc ccgcgtaata ccgaacagtt caacactgaa 720 atgagtttgt cgctggaagg tattggcgca gtgctgcaaa tggatgatga ctacaccgtt 780 atcaattcga tggtggcagg tggtccggca gcgaagagta aagctatcag cgttggtgac 840 aaaattgtcg gtgttggtca aacaggcaag ccgatggttg acgtgattgg ctggcgtctt 900 gatgatgtgg ttgccttaat taaagggccg aagggcagta aagttcgtct ggaaatttta 960 cctgctggta aagggaccaa gacccgtact gtaacgttga cccgtgaacg tattcgtctc 1020 gaagaccgcg cggttaaaat gtcggtgaag accgtcggta aagagaaagt cggcgtgctg 1080 gatattccgg gcttctatgt gggtttgaca gacgatgtca aagtgcaact gcagaaactg 1140 gaaaaacaga atgtcagcag cgtcatcatc gacctgcgta gcaatggcgg tggggcgtta 1200 actgaagccg tatcgctctc cggtctgttt attcctgcgg gtcccattgt tcaggtccgc 1260 gataacaacg gcaaggttcg tgaagatagc gataccgacg gacaggtttt ctataaaggc 1320 ccgctggtgg tgctggttga ccgcttcagt gcttcggctt cagaaatctt tgccgcggca 1380 atgcaggatt acggtcgtgc gctggttgtg ggtgaaccga cgtttggtaa aggcaccgtt 1440 cagcaatacc gttcattgaa ccgtatttac gatcagatgt tacgtcctga atggccagcg 1500 ctgggttctg tgcagtacac gatccagaaa ttctatcgcg ttaacggcgg cagtacgcaa 1560 cgtaaaggcg taacgccaga catcatcatg ccgacgggta atgaagaaac ggaaacgggt 1620 gagaaattcg aagataacgc gctgccgtgg gatagcattg atgccgcgac ttatgtgaaa 1680 tcaggagatt taacggcctt tgaaccggag ctgctgaagg aacataatgc gcgtatcgcg 1740 aaagatcctg agttccagaa catcatgaag gatatcgcgc gcttcaacgc tatgaaggac 1800 aagcgcaata tcgtttctct gaattacgct gtgcgtgaga aagagaataa tgaagatgat 1860 gcgacgcgtc tggcgcgttt gaacgaacgc tttaaacgcg aaggtaaacc ggagttgaag 1920 aaactggatg atctaccgaa agattaccag gagccggatc cttatctgga tgagacggtg 1980 aatatcgcac tcgatctggc gaagcttgaa aaagccagac ccgcggaaca acccgctccc 2040 gtcaagtaa 2049 <210> 2 <211> 682 <212> PRT <213> E. coli <400> 2 Met Asn Met Phe Phe Arg Leu Thr Ala Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Gln Thr Phe Ala Val Glu Asp Ile Thr Arg Ala Asp Gln Ile 20 25 30 Pro Val Leu Lys Glu Glu Thr Gln His Ala Thr Val Ser Glu Arg Val 35 40 45 Thr Ser Arg Phe Thr Arg Ser His Tyr Arg Gln Phe Asp Leu Asp Gln 50 55 60 Ala Phe Ser Ala Lys Ile Phe Asp Arg 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atatgccgaa 480 cgtgagcgta atgcggtgaa cgctgaatta accatggcgc gtacgcgtga cgggatgcgc 540 atggcacagg tcagcgcaga aaccattaac ccggcacacc ccggttcaaa gttttctggt 600 ggtaacctcg aaactttaag cgacaaacct ggtaatccgg tgcagcaggc gctgaaagat 660 ttccacgaga agtactattc cgccaatttg atgaaggcgg ttatttacag taataaaccg 720 ctgccggagt tggcaaaaat ggcggcggac acctttggtc gcgtgccgaa caaagagagc 780 aaaaaaccgg aaatcaccgt gccggtagtc accgacgcgc aaaagggcat tatcattcat 840 tacgtccctg cgctgccgcg taaagtgttg cgcgttgagt ttcgcatcga taacaactca 900 gcgaagttcc gtagtaaaac cgatgaattg attacctatc tgattggcaa tcgcagccca 960 ggtacacttt ctgactggct gcaaaagcag ggattagttg agggcattag cgccaactcc 1020 gatcctatcg tcaacggcaa cagcggcgta ttagcgatct ctgcgtcttt aaccgataaa 1080 ggcctggcta atcgcgatca ggttgtggcg gcaattttta gctatctcaa tctgttacgt 1140 gaaaaaggca ttgataaaca atacttcgat gaactggcga atgtgctgga tatcgacttc 1200 cgttatccgt cgatcacccg tgatatggat tacgtcgaat ggctggcaga taccatgatt 1260 cgcgttcctg ttgagcatac gctggatgca gtcaatattg ccgatcggta cgatgctaaa 1320 gcagtaaagg aacgtctggc gatgatgacg ccgcagaatg cgcgtatctg gtatatcagc 1380 ccgaaagagc cgcacaacaa aacggcttac tttgtcgatg cgccgtatca ggtcgataaa 1440 atcagcgcac aaactttcgc cgactggcag aaaaaagccg ccgacattgc gctctctttg 1500 ccagagctta acccttatat tcctgatgat ttctcgctga ttaagtcaga gaagaaatac 1560 gaccatccag agctgattgt tgatgagtcg aatctgcgcg tggtgtatgc gccaagccgt 1620 tattttgcca gcgagcccaa agctgatgtc agcctgattt tgcgtaatcc gaaagccatg 1680 gacagcgccc gcaatcaggt gatgtttgcg ctcaatgatt atctcgcagg gctggcgctt 1740 gatcagttaa gcaaccaggc gtcggttggt ggcataagtt tttccaccaa cgctaacaac 1800 ggccttatgg ttaatgctaa tggttacacc cagcgtctgc cgcagctgtt ccaggcattg 1860 ctcgaggggt actttagcta taccgctacg gaagatcagc ttgagcaggc gaagtcctgg 1920 tataaccaga tgatggattc cgcagaaaag ggtaaagcgt ttgagcaggc gattatgccc 1980 gcgcagatgc tctcgcaagt gccgtacttc tcgcgagatg aacggcgtaa aattttgccc 2040 tccattacgt tgaaagaggt gctggcctat cgcgacgcct taaaatcagg ggctcgacca 2100 gagtttatgg ttatcggcaa catgaccgag gcccaggcaa caacgctggc acgcgatgtg 2160 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cgtatcgcac ggctttctat ctggaagttg agaacgacgc cttgcctggt 420 gcggtagacc gcctggccga tgctattgct gaacctttgc tcgacaagaa atatgccgaa 480 cgtgagcgta atgcggtgaa cgctgaatta accatggcgc gtacgcgtga cgggatgcgc 540 atggcacagg tcagcgcaga aaccattaac ccggcacacc ccggttcaaa gttttctggt 600 ggtaacctcg aaactttaag cgacaaacct ggtaatccgg tgcagcaggc gctgaaagat 660 ttccacgaga agtactattc cgccaatttg atgaaggcgg ttatttacag taataaaccg 720 ctgccggagt tggcaaaaat ggcggcggac acctttggtc gcgtgccgaa caaagagagc 780 aaaaaaccgg aaatcaccgt gccggtagtc accgacgcgc aaaagggcat tatcattcat 840 tacgtccctg cgctgccgcg taaagtgttg cgcgttgagt ttcgcatcga taacaactca 900 gcgaagttcc gtagtaaaac cgatgaattg attacctatc tgattggcaa tcgcagccca 960 ggtacacttt ctgactggct gcaaaagcag ggattagttg agggcattag cgccaactcc 1020 gatcctatcg tcaacggcaa cagcggcgta ttagcgatct ctgcgtcttt aaccgataaa 1080 ggcctggcta atcgcgatca ggttgtggcg gcaattttta gctatctcaa tctgttacgt 1140 gaaaaaggca ttgataaaca atacttcgat gaactggcga atgtgctgga tatcgacttc 1200 cgttatccgt cgatcacccg 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tgataacgct gaagcttatg acccgggaaa aagaatcact 720 tatcgcagta aggtcaaaga ccaaaattac tattctgttg cagtcaatgc aggttattac 780 gtcacaccta acgcaaaagt ttatgttgaa ggcgcatgga atcgggttac gaataaaaaa 840 ggtaatactt cactttatga tcacaataat aacacttcag actacagcaa aaatggagca 900 ggtatagaaa actataactt catcactact gctggtctta agtacacatt t 951 <210> 24 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated OmpT sequence <400> 24 Met Arg Ala Lys Leu Leu Gly Ile Val Leu Thr Thr Pro Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ser Ser Phe Ala Ser Thr Glu Thr Leu Ser Phe Thr Pro Asp Asn Ile 20 25 30 Asn Ala Asp Ile Ser Leu Gly Thr Leu Ser Gly Lys Thr Lys Glu Arg 35 40 45 Val Tyr Leu Ala Glu Glu Gly Gly Arg Lys Val Ser Gln Leu Asp Trp 50 55 60 Lys Phe Asn Asn Ala Ala Ile Ile Lys Gly Ala Ile Asn Trp Asp Leu 65 70 75 80 Met Pro Gln Ile Ser Ile Gly Ala Ala Gly Trp Thr Thr Leu Gly Ser 85 90 95 Arg Gly Gly Asn Met Val Asp Gln Asp Trp Met Asp Ser Ser Asn Pro 100 105 110 Gly Thr Trp Thr Asp Glu Ser Arg His Pro Asp Thr Gln Leu Asn Tyr 115 120 125 Ala Asn Glu Phe Asp Leu Asn Ile Lys Gly Trp Leu Leu Asn Glu Pro 130 135 140 Asn Tyr Arg Leu Gly Leu Met Ala Gly Tyr Gln Glu Ser Arg Tyr Ser 145 150 155 160 Phe Thr Ala Arg Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Ser Ser Glu Glu Gly Phe 165 170 175 Arg Asp Asp Ile Gly Ser Phe Pro Asn Gly Glu Arg Ala Ile Gly Tyr 180 185 190 Lys Gln Arg Phe Lys Met Pro Tyr Ile Gly Leu Thr Gly Ser Tyr Arg 195 200 205 Tyr Glu Asp Phe Glu Leu Gly Gly Thr Phe Lys Tyr Ser Gly Trp Val 210 215 220 Glu Ser Ser Asp Asn Ala Glu Ala Tyr Asp Pro Gly Lys Arg Ile Thr 225 230 235 240 Tyr Arg Ser Lys Val Lys Asp Gln Asn Tyr Tyr Ser Val Ala Val Asn 245 250 255 Ala Gly Tyr Tyr Val Thr Pro Asn Ala Lys Val Tyr Val Glu Gly Ala 260 265 270 Trp Asn Arg Val Thr Asn Lys Lys Gly Asn Thr Ser Leu Tyr Asp His 275 280 285 Asn Asn Asn Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Asn Gly Ala Gly Ile Glu Asn 290 295 300 Tyr Asn Phe Ile Thr Thr Ala Gly Leu Lys Tyr Thr Phe 305 310 315 <210> 25 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated OmpT sequence <400> 25 attcgggcga aacttctggg aatagtcctg acaaccccta ttgcgatcag ctcttttgct 60 tctaccgaga ctttatcgtt tactcctgac aacataaatg cggacattag tcttggaact 120 ctgagcggaa aaacaaaaga gcgtgtttat ctagccgaag aaggaggccg aaaagtcagt 180 caactcgact ggaaattcaa taacgctgca attattaaag gtgcaattaa ttgggatttg 240 atgccccaga tatctatcgg ggctgctggc tggacaactc tcggcagccg aggtggcaat 300 atggtcgatc aggactggat ggattccagt aaccccggaa cctggacgga tgaaagtaga 360 caccctgata cacaactcaa ttatgccaac gaatttgatc tgaatatcaa aggctggctc 420 ctcaacgaac ccaattaccg cctgggactc atggccggat atcaggaaag ccgttatagc 480 tttacagcca gaggtggttc ctatatctac agttctgagg agggattcag agatgatatc 540 ggctccttcc cgaatggaga aagagcaatc ggctacaaac aacgttttaa aatgccctac 600 attggcttga ctggaagtta tcgttatgaa gattttgaac tcggtggcac atttaaatac 660 agcggctggg tggaatcatc tgataacgat gaacactatg acccgggaaa aagaatcact 720 tatcgcagta aggtcaaaga ccaaaattac tattctgttg cagtcaatgc aggttattac 780 gtcacaccta acgcaaaagt ttatgttgaa ggcgcatgga atcgggttac gaataaaaaa 840 ggtaatactt cactttatga tcacaataat aacacttcag actacagcaa aaatggagca 900 ggtatagaaa actataactt catcactact gctggtctta agtacacatt ttaa 954 <210> 26 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated DsbC sequence <400> 26 atgaagaaag gttttatgtt gtttactttg ttagcggcgt tttcaggctt tgctcaggct 60 gatgacgcgg caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag 120 cccgcgcctg tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc 180 gatgatggta aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc 240 aatgtcacca ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt 300 tataaagcgc cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac 360 tgccacaaac tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat 420 cttgctttcc cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg 480 tgtgcgaaag ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca 540 gccagttgcg acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc 600 ggtactccgg cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca gccgccgaaa 660 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170 175 Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala 180 185 190 Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser 195 200 205 Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu 210 215 220 Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys His His His His 225 230 235 240 His His <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hTNF40 CDRH1 <400> 28 Asp Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hTNF40 Human hybrid CDRH2 <400> 29 Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hTNF40 CDRH3 <400> 30 Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:hTNF40 CDRL1 <400> 31 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr 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gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggggagtgt taaaatgaag aagactgcta 60 tagcaattg 69 <210> 38 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS cassette-3 <400> 38 gagctcacca gtaacaaaaa gctttaatag aggagagtgt tgaggaggaa aaaaaaatga 60 agaaaactgc tatagcaatt g 81 <210> 39 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS cassette-4 <400> 39 gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggagagtgt tgacgaggat tatataatga 60 agaaaactgc tatagcaatt g 81

Claims (23)

  1. 돌연변이 H145A를 갖는 돌연변이체 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자를 포함하고, 비재조합 야생형 염색체 Tsp 유전자를 포함하는 것인 재조합 그람 음성 박테리아 세포.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 세포는 돌연변이된 spr 유전자를 제외하고는 야생형 박테리아 세포와 동질유전자형(isogenic)인 세포.
  8. 제1항에 있어서, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 세포.
  9. 제7항에 있어서, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 세포.
  10. 제1항에 있어서, 세포는 하기의 돌연변이된 유전자 a, b 및 c 중 1 이상을 더 포함하는 것인 세포:
    a. 샤페론 활성 및 저하된 프로테아제 활성을 갖는 DegP 단백질을 코딩하는 돌연변이된 DegP 유전자;
    b. 저하된 프로테아제 활성을 갖는 프로테아제 III 단백질을 코딩하거나 넉아웃 돌연변이된 ptr 유전자인 돌연변이된 ptr 유전자; 및
    c. 저하된 프로테아제 활성을 갖는 OmpT 단백질을 코딩하거나 넉아웃 돌연변이된 OmpT 유전자인 돌연변이된 OmpT 유전자.
  11. 제1항에 있어서, 세포는 이.콜라이(E. coli)인 세포.
  12. 제1항에 있어서, 세포는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 세포.
  13. 제12항에 있어서, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 것인 세포.
  14. 제13항에 있어서, 벡터는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 제어하는 프로모터를 포함하는 것인 세포.
  15. 제12항에 있어서, 목적 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 세포.
  16. 제15항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TNF에 특이적인 세포.
  17. 돌연변이 H145A를 갖는 돌연변이체 spr 단백질을 코딩하는 돌연변이체 spr 유전자, 야생형 Tsp 유전자 및 TNF에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 그람 음성 박테리아 세포.
  18. 제17항에 있어서, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 세포.
  19. 목적 재조합 단백질의 제조 방법으로서, 목적 재조합 단백질을 발현하는데 효과적인 조건 하에 배양 배지에서 제1항, 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 재조합 그람 음성 박테리아 세포를 배양하는 단계 및 재조합 그람 음성 박테리아 세포의 주변세포질, 배양 배지, 또는 둘 모두로부터 목적 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, 목적 재조합 단백질은 주변세포질, 상등액 또는 둘 모두로부터 회수되는 것인 제조 방법.
  21. 제19항에 있어서, 세포는 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하고, DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 효과적인 조건 하에서 배양되는 것인 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 DsbC를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현이 배양 배지에 유도인자를 부가함으로써 유도되는 것인 제조 방법.
  23. 제19항에 있어서, DsbC로부터 목적 재조합 단백질을 분리하는 단계를 더 포함하는 제조 방법.
KR1020127021019A 2010-01-14 2011-01-13 돌연변이체 ｓｐｒ 유전자 및 야생형 ｔｓｐ 유전자를 포함하는 박테리아 숙주 균주 KR101741865B1 (ko)

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