JP2003503074A

JP2003503074A - Ｄｅｇｐプロテアーゼインヒビター類の分析方法

Info

Publication number: JP2003503074A
Application number: JP2001507100A
Authority: JP
Inventors: ジョーンズ，ハル・シー; リウ，クリストファー; ハルトグレン，スコット・ジェイ; ルビー，デニス・イー; フランク，クリスティン・エイ; エヴァンズ，エイミー・ケイ
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1999-06-29
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2003-01-28
Also published as: AU767670B2; CA2377491C; DE60031533D1; US6306619B1; WO2001001147A1; CA2377491A1; ATE343790T1; AU5775600A; EP1190258A1; EP1190258B1

Abstract

(57)【要約】ＤｅｇＰ（ＨｔｒＡ）プロテアーゼは、ペリプラズム中の、ミスフォールドされた凝集タンパク質を除去するのに不可欠な多機能タンパク質である。本発明は、ＤｅｇＰ活性のインヒビターである疑いがあるものとＤｅｇＰおよび適切な基質（好ましくは、ＰａｐＡ等の、ＤｅｇＰの天然基質）を混合するステップと、ＤｅｇＰ活性の変化を検出するステップとを含むＤｅｇＰ活性のインヒビターの分析方法を提供する。ＤｅｇＰは病原性に不可欠であることが、幾つかのグラム陰性病原体で証明されている。ＤｅｇＰに関して、３種の天然の標的が記載されているに過ぎない。それらは、コリシンＡ溶解タンパク質（Ｃａｌ）、ピリンサブユニット（Ｋ８８、Ｋ９９、Ｐａｐ）および最近記載されたＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＨＭＷ１およびＨＭＷ２である。ＤｅｇＰは、カゼインおよび幾つかの他の非天然基質に対してｉｎｖｉｔｒｏで弱いプロテアーゼ活性を示した。本発明者らは、Ｐａｐ線毛の主要ピリンサブユニットであるＰａｐＡを、天然ＤｅｇＰ基質として同定し、この基質のｉｎｖｉｔｒｏでの結合およびタンパク質分解を明らかにした。ＮＨ₂末端アフィニティ標識を使用して、本発明者は、変性剤の存在下でＰａｐＤシャペロンなしでＰａｐＡを精製し、タンパク質分解基質として使用した。この結果、基質タンパク質におけるＤｅｇＰ認識部位および切断部位の同定が可能になり、さらにプロテアーゼ作用の低分子インヒビターのデザインが可能になるであろう。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］［１．発明の分野］ＤｅｇＰ（ＨｔｒＡ）プロテアーゼは、ペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）
中のミスフォールドされた凝集されたタンパク質類を除去するのに不可欠な多機
能性タンパク質である。ＤｅｇＰは病原性に不可欠であることが、幾つかのグラ
ム陰性病原体で証明されている。ＤｅｇＰに関して、３種の天然の標的が知られ
ているに過ぎない。それらは、コリシンＡ溶解タンパク質（Ｃａｌ）、ピリンサ
ブユニット（Ｋ８８、Ｋ９９、Ｐａｐ）および最近記載されたＨｅｍｏｐｈｉｌ
ｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＨＭＷ１およびＨＭＷ２である。ＤｅｇＰは
、ｉｎｖｉｔｒｏで、カゼインおよび幾つかの他の非天然基質類に対して弱い
プロテアーゼ活性を示した。本発明者らは、Ｐａｐ線毛の主要ピリンサブユニッ
トであるＰａｐＡを天然のＤｅｇＰ基質として同定し、この基質のｉｎｖｉｔ
ｒｏでの結合およびタンパク質分解を明らかにした。本発明者らは、ＮＨ₂末端
アフィニティ標識を使用して、変性剤の存在下ＰａｐＤシャペロンなしでＰａｐ
Ａを精製し、タンパク質分解基質として使用した。この結果、基質タンパク質に
おけるＤｅｇＰ認識部位および切断部位の同定が可能になり、さらに、プロテア
ーゼ作用を有する低分子インヒビターのデザインが可能になるであろう。

【０００２】［２．関連技術の説明］細菌の細胞質およびペリプラズムにおける、ミスフォールドされた変性タンパ
ク質の分解は重要なハウスキーピング作用であり、細胞の生存に欠くことができ
ない（Ｐａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＷｒｅｎ，Ｂ．Ｗ．（１９９７）Ｍｏ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６，２０９−２２１；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｇ．（１
９９６）ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅ
ｌｌａＣｅｌｌｉｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｎ
ｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，ｅｄｓ）ｐｐ．９３８−９５４，ＡＳＭＰｒ
ｅｓｓＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．）。タンパク分解組織（ｐｒｏｔｅｏ
ｌｙｔｉｃｍａｃｈｉｎｅｒｙ）も細菌の病原性に不可欠な成分であることが
、次第に明らかになってきた（Ｐａｌｌｅｎ＆Ｗｒｅｎ、前掲）。最近、科
学者達は、ペリプラズムの環境変化に応答してプロテアーゼ類、シャペロン類お
よび「フォールダーゼ」類を動員し、この細菌の区画における状態を管理するの
を助ける制御システムＣｐｘＡ／ＣｐｘＲを明らかにした（たとえば、Ｄａｎｅ
ｓｅ，Ｐ．Ｎ．，ｅｔａｌ．（１９９５）ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ９，３８７−３９８；Ｄａｎｅｓｅ，Ｐ．Ｎ．ａｎｄＳｉｌｈ
ａｖｙ，Ｔ．Ｊ．（１９９７）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１１，１１８３−１１９
３を参照）。宿主は、しばしば、侵入する生物に敵対する環境を備えるため、宿
主の防御の際には、ＣｐｘＡ／ＣｐｘＲ制御回路は「妨害される」ことが示唆さ
れる。ペリプラズムにおいて最も重要なプロテアーゼの１つであるＤｅｇＰ／Ｈ
ｔｒＡセリンプロテアーゼ（Ｐａｌｌｅｎ＆Ｗｒｅｎ、前掲）は、ＣｐｘＡ
／ＣｐｘＲレギュロンのメンバーである（Ｄａｎｅｓｅ，Ｐ．Ｎ．，ｅｔａｌ
．（１９９５）、前掲；ＤａｎｅｓｅａｎｄＳｉｌｈａｖｙ（１９９７）
前掲）。このタンパク質は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、および
Ｙｅｒｓｉｎｉａの病原性においても重要な役割を果たす（Ｐａｌｌｅｎ＆
Ｗｒｅｎ、前掲）。具体的には、ＤｅｇＰは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ、ＢｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓおよびＹｅｒｓｉｎｉａ
ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａにおける病原性決定因子である。病原性における
ＤｅｇＰ作用の現行モデルによれば、ＤｅｇＰは、ミスフォールドされたタンパ
ク質および宿主の反応性酸素中間体類への曝露に起因して生ずるタンパク質凝集
体を除去するように作用する。機能性のＤｅｇＰが存在しなければ、これらのタ
ンパク質凝集体は、病原過程を弱くする（Ｐａｌｌｅｎ＆Ｗｒｅｎ、前掲）
。

【０００３】ＤｅｇＰ（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：分解）という用語は、不安定な融合タン
パク質をペリプラズムに蓄積することを可能にしたＥ．ｃｏｌｉにおけるある突
然変異の初期マッピングを指す（Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｋ．Ｌ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，
Ｋ．ａｎｄＢｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１７１，２６８９−２６９６；Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｋ．Ｌ．ａｎｄＢｅｃｋｗｉ
ｔｈ，Ｊ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．８５，１５７６−１５８０）。ＨｔｒＡ（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｒｅｇｕｌ
ａｔｅｄ：熱ショック制御）という呼称は、同じ遺伝子内にトランスポゾンを挿
入した結果、熱感受性の成長表現型になることを示す（Ｌｉｐｉｎｓｋａ，Ｂ．
，Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．ａｎｄＧｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ（１９８８）Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１６，１００５３−１００６６）。
最後に、ＤｅｇＰはプロテアーゼＤｏとも呼ばれ、またＥ．ｃｏｌｉにおける熱
感受性の表現型を与える突然変異を示す（Ｓｅｏｌ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔａｌ．（
１９９１）ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅ
ｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ１７６，７３０−７３６）。Ｄ
ｅｇＰは、カゼインを基質として使用したｉｎｖｉｔｒｏ分析法で機能性のプ
ロテアーゼ活性を示したが、カゼイン基質に対するその活性は弱かった（Ｌｉｐ
ｉｎｓｋａ，Ｂ．，Ｚｙｌｉｃｚ，Ｍ．ａｎｄＧｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ
．（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２，１７９１−１７９７）。Ｌ
ｉｐｉｎｓｋａらは、カゼインに対する活性を、他の既知のプロテアーゼインヒ
ビターではなくＤＦＰによって阻害できることを証明し、ＤｅｇＰがセリンプロ
テアーゼであることを示唆している。プロテアーゼ触媒三つ組残基のうちの２成
分であるセリン２１０およびヒスチジン１０５における位置指定突然変異誘発は
、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでのＤｅｇＰ作用を弱める。すなわち
セリン２１０またはヒスチジン突然変異体誘導体を担持する菌株は、高温におけ
る成長に対して感受性であった（Ｓｋｏｒｋｏ−Ｇｌｏｎｅｋ，Ｊ．ｅｔａｌ
．（１９９５）Ｇｅｎｅ１６３，４７−５２）。ＤｅｇＰに好ましい基質は
、包括的にまたは一時的に変性したタンパク質であると考えられ、ｉｎｖｉｖ
ｏにおけるその役割は、ミスフォールドされたタンパク質または変性タンパク質
をペリプラズムから取り除くことであると考えられる（Ｋｏｌｍａｒ，Ｈ．，Ｗ
ａｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．Ｈ．ａｎｄＳａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．（１９９６）Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，５９２５−５９２９）。この結果を支持して、Ｌａ
ｓｋｏｗａら（Ｌａｓｋｏｗｓｋａ，Ｅ．，ｅｔａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２，５５５−５７１）は、精製されたＤｅｇＰタンパ
ク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物から分画された凝集タンパク質を熱的に分解するこ
と、およびＤｎａＪシャペロンは、ＤｅｇＰ分解を拮抗すること、すなわち、シ
ャペロンはそれらがもはやＤｅｇＰによる分解の標的ではなくなるようにタンパ
ク質をリフォールドするのに役立つことをｉｎｖｉｔｒｏで証明した。

【０００４】ＤｅｇＰ／ＨｔｒＡは、その弱いプロテアーゼ活性に加えて、幾つかの病原性
生物の病原性因子であることも証明された。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍでは、ｈｔｒＡヌルは非病原性であり、且つ酸化的ストレスの影響
を受けやすかった（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．，ｅｔａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５，４０１−４０７）。この研究の執筆者達は、ｈｔｒ
Ａ突然変異体類は、マクロファージ内での酸化的殺傷（ｋｉｌｌｉｎｇ）に耐え
る能力が低いことを示唆している。ｈｔｒＡ損傷は、ワクチン菌株として実施す
るためのＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉの減弱に有用であった。同様に、Ｂ
ｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓおよびＢｒｕｃｅｌｌａｍｅｌｅｎｔｅｎｓ
ｉｓｈｔｒＡヌル突然変異体類は、ヤギにおける病原性が減弱されており、且
つｉｎｖｉｔｒｏで、培養された好中球による酸化的殺傷には著しく敏感であ
った（Ｅｌｚｅｒ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔａｌ（１９９６）Ｒｅｓｅａｒｃｈｉ
ｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ６０，４８−５０；Ｅｌｚｅｒ，
Ｐ．Ｈ．，ｅｔａｌ．（１９９６）ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕ
ｎｉｔｙ６４，４８３８−４８４１；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．Ｗ．，ｅｔａ
ｌ．（１９９７）ＲｅｓｅａｒｃｈｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅ
ｎｃｅ６３，１６５−１６７）。Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔ
ｉｃａにおけるアイソジェニックペアである野生型およびｈｔｒＡヌル突然変異
体を作製し、マウスエルジニア症モデルで試験した。ＨｔｒＡは、病原性に不可
欠であり、突然変異体菌株は、酸化的ストレスに敏感であった（Ｌｉ，Ｓ．−Ｒ
．，ｅｔａｌ（１９９６）ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ
６４，２０８８−２０９４）。最後に、Ｂｏｕｃｈｅｒら（（１９９６）Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８，５１１−５２３）は、最近、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａのムコイド（ｍｕｃｏｉｄｙ）（いわゆるＣＦ表
現型）への転換は、２つのＨｔｒＡホモログを含むことを証明した。ＤｅｇＰホ
モログは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｇａｓｃ，
Ａ−Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４４：４３
３−４３９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、およびＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓで確認されている。３つのホモログ全て
が、Ｅ．ｃｏｌｉＤｅｇＰタンパク質の触媒三つ組残基を共有する。

【０００５】ｉｎｖｉｖｏで最初に同定されたＤｅｇＰの標的は、コリシンＡ溶解タンパ
ク質（Ｃａｌ）（Ｃａｖａｒｄ，Ｄ．，Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｃ．ａｎｄＨｏ
ｗａｒｄ，Ｓ．Ｐ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１７１，６３１６
−６３２２）であった。ＤｅｇＰは、Ｃａｌのアシル化された前駆型を２つのフ
ラグメントに分解することが確認された。ｄｅｇＰ突然変異体菌株類においては
、成熟したＣａｌが高レベルまで蓄積した（Ｃａｖａｒｄｅｔａｌ．（１
９８９）、前掲）。ＤｅｇＰ標的類の第２のファミリーは、細菌の線毛として同
定された。ｄｅｇＰ突然変異体菌株では、Ｋ８８ピリンサブユニットおよびＫ９
９ピリンサブユニットが高レベルまで蓄積（Ｂａｋｋｅｒ，Ｄ．，ｅｔａｌ（
１９９１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５，８７５−８８６）することがわ
かった。この現象に関するさらに詳細な研究で、Ｐ線毛類、特にＰａｐＡは、Ｄ
ｅｇＰプロテアーゼの基質であることが証明された（Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｈ．，ｅ
ｔａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯＪ．１６，６３９４−６４０６）。最近に
なって、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの非線毛接着タンパク質ＨＭＷ１およびＨＭ
Ｗ２は、ＤｅｇＰのｉｎｖｉｖｏでの基質であることが確認された（Ｓｔ．Ｇ
ｅｍｅＩＩＩ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄＧｒａｓｓ，Ｓ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７，６１７−６３０）。

【０００６】ＤｅｇＰ／ＨｔｒＡ配列が１９８８年に公開された（Ｌｉｐｉｎｓｋａ，Ｓｈ
ａｒｍａ，＆Ｇｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ、前掲）。ＨｔｒＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ
の数十個のプロテアーゼのうちの１つであり、ラン藻、マイコバクテリウム、酵
母およびヒトで、ホモログを有することが知られている（Ｐａｌｌｅｎ＆Ｗ
ｒｅｎ、前掲）。Ｅ．ｃｏｌｉには、ＤｅｇＱおよびＤｅｇＳというＤｅｇＰの
２つのホモログもある（Ｋｏｌｍａｒｅｔａｌ．（１９９６）、前掲；Ｗａ
ｌｌｅｒ，Ｐ．Ｒ．ａｎｄＳａｕｅｒ，Ｒ．Ｔ．（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１７８，１１４６−１１５３）。最近、多くの真核タンパク質で保
存される新しい相同領域がＤｅｇＰにおいて同定された（Ｐａｌｌｅｎ＆Ｗ
ｒｅｎ、前掲）。触媒配列２０８ＧＮＳＧＧＡＬ２１４から下流は、２つのＰＤ
Ｚドメインである（Ｌｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ｉ．，ｅｔａｌ．（１９９７）Ｃ
ｅｌｌ９１，９３９−９４７）。これらの８０〜１００個のアミノ酸ドメイン
は、１００近くのタンパク質、主として真核のタンパク質で確認された。タンパ
ク質とタンパク質との相互作用である役割を果たし、多量体の形成または基質結
合のいずれかを促進すると考えられる（Ｌｅｖｃｈｅｎｋｏ，Ｉ．，ｅｔａｌ
．（１９９７）、前掲）。最近同定されたグラム陽性ＤｅｇＰホモログ類では、
ＰＤＺドメインの相同性が維持される。興味深いことに、Ｋｏｌｍａｒら（１９
９６、前掲）は、ＤｅｇＰがｉｎｖｉｔｒｏで十二量体を形成することを証明
したが、ＰＤＺドメインがＤｅｇＰの多量体化に寄与するかどうかは、まだ分か
らない。ＤｅｇＰがｉｎｖｉｖｏで多量体として作用するのであれば、真核細
胞質ゾルおよびＥＲに記載のプロテオソームマシーンが暗示される（Ｐａｌｌｅ
ｎ＆Ｗｒｅｎ、前掲）。

【０００７】初期のｉｎｖｉｖｏデータから、線毛はＤｅｇＰの基質であったことが示唆
される（Ｂａｋｋｅｒ，Ｄ．，ｅｔａｌ（１９９１）前掲）。シャペロンの非
存在下でピリンサブユニットタンパク質を発現させると、サブユニットをペリプ
ラズムに蓄積することができず、また、ｄｅｇＰ突然変異体菌株は、より多くの
サブユニットをペリプラズムに蓄積させた（Ｂａｋｋｅｒ，Ｄ．，ｅｔａｌ（
１９９１）、前掲；Ｊｏｎｅｓ，ｅｔａｌ．（１９９７）前掲；Ｈｕｌｔｇ
ｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｏｒｍａｒｋ，Ｓ．ａｎｄＡｂｒａｈａｍ，Ｓ．Ｎ．（
１９９１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５，３８３−４１５；
Ｈｕｌｔｇｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｈ．ａｎｄＮｏｒｍａｒｋ，
Ｓ．Ｎ．（１９９６）ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ；ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙ（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．，ｅｄｓ）ｐｐ．２７３０−２７５
６，ＡＳＭＰｒｅｓｓＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ）。さらに、ｄｅｇＰ突
然変異体におけるサブユニットの発現は極めて有毒であった（Ｊｏｎｅｓｅｔ
ａｌ．（１９９７）、前掲）。ｄｅｇＰを補完することにより毒性も蓄積も抑
制された（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．（１９９７）、前掲）。線毛生物発生の研
究を妨げる重大な障害は、ＰａｐＤシャペロンの非存在下ではサブユニットを精
製できないことである。これは、ＰａｐＡのアミノ末端にアフィニティ標識を付
加することにより克服された。これによって、変性条件下で、多量のＰａｐＡの
精製が実現した。ＰａｐＤシャペロンの存在下でＰａｐＡを復元することにより
、ＰａｐＤ−ＰａｐＡ複合体を形成することができた。さらに、ＤｅｇＰを変性
ＰａｐＡと混合すると、ＰａｐＡ−ＤｅｇＰ複合体のアフィニティ精製およびア
ミノ末端ＰａｐＡフラグメントの放出によるタンパク質分解ができた。

【０００８】［発明の概要］簡単に説明すると、本発明は、幾つかのヒト病原体および非ヒト病原体におい
て不可欠な病原性因子であるＤｅｇＰプロテアーゼのインヒビターを識別するた
めの高処理量スクリーニング分析方法を提供する。本分析方法で識別される化合
物であるＤｅｇＰプロテアーゼ作用性の低分子インヒビターは、臨床において高
い有用性があることが期待される。

【０００９】以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および添付された請求の範囲を
参照することにより、前述および以下に明らかになるであろう本発明の他の目的
、利点および特徴と共に、本発明の性質をさらに明白に理解することが可能であ
る。

【００１０】［発明の好ましい実施形態の詳細な説明］ＤｅｇＰは、全部ではないが多くのグラム陰性細菌に存在するペリプラズムの
プロテアーゼであり、ＤｅｇＰ突然変異体は宿主で生存しないため、細菌の生存
力に重要であり且つ病原性に不可欠である。本発明は、ＤｅｇＰ活性についての
ｉｎｖｉｔｒｏ分析方法である。本発明の分析方法は天然のＤｅｇＰ基質であ
るＰａｐＡピリンサブユニットを使用するが、これはｉｎｖｉｔｒｏで使用さ
れるＤｅｇＰについて同定された僅か２つの関連する基質の１つであり、高処理
量スクリーニングに適したｉｎｖｉｔｒｏ分析方法を実現する。

【００１１】さらに詳細には、本発明は、新しい抗生物質標的および標的のインヒビターを
識別するための分析方法の両者に関する。本発明の分析方法は、ライブラリース
クリーニングのための高処理量の分析方法において使用するのに適する。本発明
の分析構成成分は、樹脂上に固定されたＰａｐ線毛の主要ピリンサブユニットお
よびＤｅｇＰプロテアーゼを含むペリプラズム抽出物である。本分析方法を使用
して、本発明者らは、ＰａｐＡおよびＤｅｇＰを含む複合体ならびにＰａｐＡの
タンパク分解性アミノ末端フラグメントをアフィニティ精製した。好ましい実施
形態では、ＤｅｇＰプロテアーゼおよびＰａｐＡ標的を含む本分析方法の全成分
が均質な調製物である。好ましくは、標的は認識／切断部位を含むペプチドに変
形（ｒｅｄｕｃｅ）される。次いで、切断をモニタリングし且つ／またはＤｅｇ
Ｐ活性をモニタリングするために、検出可能なマーカーでペプチドを標識する。
この分析方法を使用してインヒビターライブラリーをスクリーニングすることは
、ＤｅｇＰプロテアーゼ活性を阻害する低分子化合物を識別するのに有用であり
、これらの化合物は、治療関連の臨床用薬になるであろう。

【００１２】均質になるまでタンパク質を精製するために、ＤｅｇＰを十分に制御されたプ
ロモーターの調節下にあるプラスミドにクローニングしてもよい。タンパク質分
解分析方法を使用してＰａｐＡタンパク分解生成物を識別し、配列決定してＤｅ
ｇＰ切断部位を明らかにすることができる。いったんこの部位が判明したら、ペ
プチドを設計し、プロテアーゼの標的として試験する。最後に、このペプチドを
検出可能なマーカーで標識するか、または蛍光近接性分析方法（ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｅｃｅ−ｐｒｏｘｉｍｉｔｙａｓｓａｙ）のために改造する。この基質
は、タンパク分解作用の迅速な分析を可能にするため、高処理量スクリーニング
（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：「ＨＴＳ」）に適す
る。本発明者は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓでＤｅｇＰホモログを識別した。従って
、このタンパク質は、最近記述されたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるホモロ
グを含むグラム陽性生物で、十分に示されている（Ｇａｓｃ，Ａ−Ｍ．ｅｔａ
ｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４４：４３３−４３９）。

【００１３】様々な標識および標識方法を使用して、ペプチドを標識することが可能である
。本発明で使用することができる標識のタイプの例としては、酵素標識類、放射
性同位元素標識類、非放射性同位元素標識類、蛍光標識類、毒素標識類、および
化学発光標識類などが挙げられるが、その限りではない。

【００１４】適切な酵素標識類の例としては、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカ
スヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母−アルコールデヒドロ
ゲナーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフ
ェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギ
ナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、
ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グ
ルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等々が挙げられる。

【００１５】適切な放射性同位元素標識類の例としては、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ
、¹⁴Ｃ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｔｏ、⁵⁸Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁷⁵Ｓｅ、¹⁵²Ｅｕ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Ｃｕ、² ¹⁷ Ｃｉ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｐｂ、⁴⁷Ｓｃ、および¹⁰⁹Ｐｄなどが挙げられる。

【００１６】適切な蛍光標識類の例としては、¹⁵²Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチ
オシアナート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標
識、およびアロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、フルオレサミ
ン標識等々が挙げられる。

【００１７】適切な毒素標識類の例としては、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素
などが挙げられる。化学発光標識類の例としては、ルミナール標識、イソルミナ
ール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、およびイミダゾール標識、およ
びアクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェ
ラーゼ標識、エクオリン標識等々が挙げられる。

【００１８】当業者は、本発明に従って使用することが可能な他の適切な標識について知っ
ているであろう。これらの標識は、当業者に一般に知られている標準的な技法を
使用して、抗体またはそれらのフラグメントに結合される。代表的な技法は、Ｋ
ｅｎｎｅｄｙ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔａｌＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ７０：
１−３１（１９７６）、およびＳｃｈｕｒｓ，Ａ．Ｈ．Ｗ．Ｍ．，ｅｔａｌ，
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ８１：１−４０（１９７７）により記載されて
いる。後者に記載されているカップリング技法は、グルタルアルデヒド法、過ヨ
ウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシ
ンイミドエステル法であり、これらの方法全てを引用することにより本明細書の
一部をなすものとする。

【００１９】以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をさらに十分に説明するために示
すものである。しかし、これらの実施例は、決して本発明の広範な範囲を限定す
るものと考えてはならない。

【００２０】［実施例］本実施例では、発明者らは、本発明の分析方法を使用して、ＤｅｇＰとＰａｐ
Ａとの複合体およびＰａｐＡの特異的タンパク質分解フラグメントを精製した。
分析／反応の生成物は、アミノ酸配列決定法を使用して識別する。

【００２１】［材料および方法］［構築物］既述（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．
（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１４，４５４−４５７）の通り、
所望の挿入物およびクローニングを容易にするための制限部位を作るために、適
切なプライマーを使用して、ＰａｐＡ−６ｈｉｓおよびＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａ
ｌａをＰＣＲで構築した。増幅中にランダム突然変異が加わらなかったことを保
証するために、完全なＰａｐＡオープンリーディングフレームを配列決定した。
ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａを、ＩＰＴＧ誘導可能なＰ_tacプロモーターの調節
下にあるｐＭＭＢ６６にサブクローニングした（Ｆｕｒｓｔｅ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ
ａｌ．（１１９８６）Ｇｅｎｅ４８，１１９−１３１）。既述（Ｊｏｎｅ
ｓ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔａｌ．（１９９７）ＥＭＢＯＪ．１６，６３９４−６４０
６）の通り、ｐＨＪ９２０３，Ｐ_araプロモーターからＰａｐＤを発現させた。
ｐＫＳ１７によりＤｅｇＰが産生された（Ｓｔｒａｕｃｈ，Ｋ．Ｌ．ｅｔａｌ
．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７１：２６８９−２６９６参照）。

【００２２】［ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａの発現および精製］ペリプラズムにおける最大限の転位および安定性を提供するために、ＰａｐＡ
−６ｈｉｓ４ａｌａをＰａｐＤと共にＫＳ４７４（ｄｅｇＰ：：ｋａｎ）で発現
させた。誘導条件は、１ｍＭのＩＰＴＧ，０．５％のアラビノース、９０分、Ａ
６００=０．６〜０．８であった。既述（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．（１９９７
）、前掲）の通りに、ペリプラズム抽出を実施し、２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８
中に透析し、アフィニティ精製の準備をした。ＰａｐＤとの複合体の状態である
ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａを精製するために、製造会社の説明書に従って、Ｔ
ａｌｏｎ金属アフィニティビーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃ
Ａ）をバッチで使用した。０．１Ｍのイミダゾールをビーズに加え、１０分間振
動させて上澄みを回収することにより、溶離を実施した。回収率を最大限に高め
るために、溶離を３回実施した。透析後、尿素を８Ｍまで加えることによって複
合体を変性させ、Ｔａｌｏｎ樹脂に再度加えた。１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８／
８Ｍの尿素で洗浄した後、８Ｍの尿素中、０．１Ｍのイミダゾールで純ＰａｐＡ
−６ｈｉｓ４ａｌａを溶離した。

【００２３】［ＤｅｇＰの共精製およびタンパク質分解分析］熱誘導性ｏＥプロモーターの熱誘導により、ｐＫＳ１７からＤｅｇＰを発現さ
せた（Ｌｉｐｉｎｓｋａｅｔａｌ．，Ｂ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．ａｎｄＧ
ｅｏｒｇｏｐｏｕｌｏｓ（１９８８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅ
ａｒｃｈ１６，１００５３−１００６６）。既述（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．（
１９９７）、前掲）の通りに、ペリプラズム抽出物を作製し、ペリプラズムを２
０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８中に透析した。ＤｅｇＰ量を高めたペリプラズムおよ
び対照（熱処理したＨＢ１０１）ペリプラズムをＰａｐＡ−６ｈｉｓ−４ａｌａ
含有Ｔａｌｏｎ樹脂（８Ｍの尿素処理済）に加え、振盪しながら、室温で３０分
間インキュベートした。Ｔａｌｏｎビーズを徹底的に洗浄し、次いで結合したタ
ンパク質を０．１Ｍのイミダゾールで溶離した。

【００２４】［結果］［ＰａｐＡヒスチジン標識融合体の構築］ＰＣＲ増幅を使用して、６−ヒスチジンアフィニティ標識されたＰａｐＡ構築
物（ＰａｐＡ−６ｈｉｓ）を構築した。効率的に発現させるためには、ＰａｐＡ
のヒスチジン標識（ｈｉｓ−ｔａｇ）とリーダーペプチダーゼ切断点との間にア
ラニンスペーサーを付加しなければならなかった。ｈｉｓ−ｔａｇがリーダーペ
プチダーゼ切断部位に近すぎると、ＰａｐＡはプロセッシングを受けず、膜と結
合したままであった（Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｃ．ａｎｄＨｕｌｔｇ
ｒｅｎ，Ｓ．Ｊ．（１９９８）、前掲）。懸案の、嵩高いヒスチジン側鎖の立体
効果を克服するために、ヒスチジン標識と切断部位との間に合計４個のアラニン
を作り、Ａ２アラニンスペーサーを、ｈｉｓ−ｔａｇ（ＰａｐＡ−６ｈｉｓ−４
ａｌａ）とペプチダーゼプロセッシング部位との間に配置した。ＰａｐＡ−６ｈ
ｉｓ−４ａｌａ誘導体を適切にリーダープロセッシングし、ペリプラズムに局在
化させた（図１）。

【００２５】［ＰａｐＡ−６ｈｉｓ−４ａｌａ誘導体の発現および精製］ペリプラズムにおけるピリンサブユニットの蓄積は、ペリプラズムシャペロン
に高度に依存する（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．（１９９７）、前掲）。従って、
ＰａｐＤシャペロンは、アフィニティ標識ＰａｐＡを同時に発現させた。図１Ａ
は、ペリプラズムにおけるＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａの蓄積は、ＰａｐＤに依
存することを示す。Ｔａｌｏｎ金属アフィニティ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）
を用いたアフィニティクロマトグラフィによるＰａｐＡ−６ｈｉｓ−４ａｌａの
精製で、ＰａｐＤがおおよそ等モル量で共精製された（図１Ｂ、レーン２）。Ｐ
ａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａからＰａｐＤを除去するために、複合体が結合したＴ
ａｌｏｎ樹脂を８モル濃度の尿素で処理した。ポリヒスチジンに対する金属アフ
ィニティ結合は、８Ｍの尿素中で安定しているため、尿素洗浄液は、ＰａｐＤを
実質的に全部含み、ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａをほとんどあるいは全く含まな
かった。０．１Ｍのイミダゾールで溶離するだけで、精製した変性されたＰａｐ
Ａ−６ｈｉｓ−４ａｌａを精製することができた（図１Ｂ、レーン３）。樹脂を
含有する変性されたＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａを、ＰａｐＤまたは精製された
ＰａｐＤのいずれかを含むペリプラズム中に希釈することにより、シャペロンサ
ブユニット複合体ＰａｐＤ−ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａをｉｎｖｉｔｒｏで
再形成することができた（図１Ｃ）。

【００２６】［ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａ−ＤｅｇＰ複合体の精製］ＤｅｇＰを含有するペリプラズムを変性したＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａ樹脂
に加え、室温で３０分間混合し、結合した物質を溶離することにより、ＰａｐＡ
−６ｈｉｓ４ａｌａのほかにも幾つかの新しいバンドが明らかになった。その１
つはおよそ４８ｋＤａであった（図２、レーン２）。アミノ末端配列決定法で、
４８ｋＤａのタンパク質はＤｅｇＰであると同定され、プロテアーゼが変性した
ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａに結合したことがわかる。ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａ
ｌａおよびＤｅｇＰタンパク質類に加えて、他の２種のタンパク質がＰａｐＡ−
６ｈｉｓ４ａｌａアフィニティ樹脂から溶離された。およそ１２ｋＤａのバンド
は、ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａのヒスチジン６個のアミノ末端を有することが
確認され、これは、全長ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａのアミノ末端切断生成物を
表すと考えられる（図２、レーン３）。

【００２７】［ＤｅｇＰの精製］既述（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．（１９９７））の通りに作製した全てのペリプ
ラズムから、ＤｅｇＰプロテアーゼを精製した。ＤｅｇＰの高い収率は、中間対
数（ｍｉｄ−ｌｏｇ）培養の一過性熱ショック（４５℃）に対立するものとして
の一晩の（飽和された）培養から得られたことに注目した。ペリプラズム抽出物
を、３３ｍＭのＭＥＳ、３３ｍＭのＨＥＰＥＳ、３３ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．９
中に透析し、ＨｉＴｒａｐＳ陽イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，Ｕ
ｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に充填した。ＤｅｇＰは、リニアグラジエントの
およそ１００ｍＭのＮａＣｌにて溶離した（図３Ａ）。Ｓカラムからのピーク分
画を、２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ=７．０／０．５ＭのＡｍＳＯ４に対して透析
し、ＨＩＣブチルカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄ
ｅｎ）に充填した。ＤｅｇＰは、およそ４０％の緩衝溶液Ｂ（０．３ＭのＡｍＳ
０４）で、ＨＩＣカラムから溶離した。ＤｅｇＰは、９８％以上純粋であり、僅
かな混在物質は、自己切断に起因する２種のＤｅｇＰの特異的切断型であると考
えられる。

【００２８】［プロテアーゼ分析方法−カゼイン基質］市販のプロテアーゼ分析法（ＥｎｚＣｈｅｋ）を使用して、既に確認されてい
る（Ｌｉｐｉｎｓｋａｅｔａｌ．，１９９０）カゼインに対するＤｅｇＰ活
性について試験した。分子内消光される高度にフルオレセイン処理（ＢＯＤＩＰ
Ｙ）されたカゼイン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ
）を基質として使用したが、これは多くのタイプのプロテアーゼを検出するため
の優れた標的である。トリプシンおよびＤｅｇＰは、両者ともにカゼイン基質を
切断する（図４）。この分析方法を使用して、各カラムからの精製ステップで溶
離されたＤｅｇＰは活性であることを確認した。

【００２９】［可溶性ＰａｐＡ切断分析法］ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａ基質を用いて、変性条件下で、精製ＤｅｇＰを試
験した。ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａ（８Ｍの尿素）２０μｌを、ＤｅｇＰ（Ｓ
カラムからの分画５および６）に加え、最終容量を５０μｌとした。反応を３７
℃にて一晩続行した。図５に示す実験で、ＰａｐＡ基質に対するＤｅｇＰの２種
の活性が明らかになった。図２で見られたものに似た、およそ１２ｋＤａの２つ
の新しいバンドの出現、ならびに、レーン５と６とを比較したとき、全長バンド
の強度の低下によって分かる通り、レーン１〜４では、ＰａｐＡは限られた分解
を受けた。第２の活性は、ｐＨ８のみにて出現するブロッキング凝集体形成であ
ると考えられる。レーン１、２、および５で実行された反応は、ｐＨ=５．９で
実施され、レーン３、４、および６で実行された反応は、ｐＨ=８で実施された
。ＤｅｇＰは、変性され、変形（ｒｅｄｕｃｅ）され、カルボキシメチル化され
、透析されて尿素が除去されたＰａｐＡも、変性された基質と同程度に効率的に
分解した。

【００３０】［ＤｅｇＰ結合性ＥＬＩＳＡおよび切断分析方法］６−ｈｉｓアフィニティ標識ＰａｐＡを利用して、我々は、ＰａｐＡへのＤｅ
ｇＰ結合を検出するための捕捉ＥＬＩＳＡをデザインした。ＤｅｇＰとのインキ
ュベーション後、ＰａｐＡエピトープの損失を検出できるかどうかを判定できる
ように、ＥＬＩＳＡを改変した。精製されたＰａｐＡ６ｈｉｓ４ＡｌａをＥＬＩ
ＳＡプレートに一晩結合させた。プレートを、３％のＢＳＡ／１×ＰＢＳで２時
間ブロックした。次いで、ＤｅｇＰをプレートに１時間にわたって加え、室温で
インキュベートした。このプレートを１×ＰＢＳで洗浄し、抗ＤｅｇＰ抗血清で
現像した。図６Ａに示す通り、ＤｅｇＰは天然ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａに効
率よく結合した。次に、天然のＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａを６−ｈｉｓアフィ
ニティ標識で捕捉し、ＤｅｇＰに２時間曝露した。本分析方法は、ほかの点では
上述の通りに設定した。次いで、ＥＬＩＳＡを抗ＰａｐＡポリクローナル抗血清
で現像した。明らかに、図６Ｂからわかる通り、ＤｅｇＰはかなりの量のＰａｐ
Ａをタンパク質分解した。

【００３１】［実施例２：相同配列の同定］ＤｅｇＰ／ＨｔｒＡホモログを探すために、ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃ
ａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）検索を実施した。Ｅ．ｃ
ｏｌｉＤｅｇＰを、検索で照会配列として使用し、発見された各対象配列をＥ
．ｃｏｌｉＤｅｇＰと並べた。Ｒｉｃｋｓｅｔｔｉａ配列除き、全ての細菌ホモ
ログが触媒三つ組残基（図７Ａ）、および少なくとも１つのＰＤＺドメイン（図
７Ｂ）を含む。真核ホモログの多くが三つ組およびＰＤＺドメインを有するが、
一部は、ＰＤＺドメインを介して相同性のみを共有する。

【００３２】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉＤｅｇＰおよび３つのグラム陽性ホモログの配列を示
す。この配列に、同一の残基および保存された変化をボールド体で示す。保存さ
れたこの配列における重要な残基は、セリンプロテアーゼの触媒三つ組残基を構
成する、ヒスチジン１０５（Ｅ．ｃｏｌｉ残基１３７ナンバリングは、シグナル
配列を含み、より長いＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ配列で始まる）、アスパラギン
酸１３５（１６７）およびセリン２１０（２５２）である。第１のＰＤＺドメイ
ンは、残基３０４（メチオニン）にて開始し、グリシン４０１まで続く。Ｅ．ｃ
ｏｌｉＤｅｇＰは、グルタミン４１７からアスパラギン酸４９６までの第２のＰ
ＤＺドメインを含む。このファミリーのタンパク質類が非常に大きい場合、これ
らのホモログは十分に保存され、構造上のモチーフに適合する。

【００３３】様々な具体的な材料、手順および実施例に言及することにより、本明細書に本
発明を説明してきたが、本発明は、特定の材料、材料の組合せ、およびその目的
に合わせて選択された手順に制限されないことがわかる。このような詳細の多数
の改変が含まれ、当業者により理解されるであろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰａｐＡ−６ｈｉｓ２ａｌａの発現および精製ならびにＰａｐＤ−ＰａｐＡ複
合体の再構成。Ａ．ペリプラズムにおけるＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａの蓄積は、ＰａｐＤシ
ャペロンに依存する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける、ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａのみ
のＩＰＴＧ誘導（レーン１）またはＰａｐＤシャペロンとＰａｐＡ−６ｈｉｓ４
ａｌａの共誘導（レーン２）からのペリプラズム分画を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにロードした。Ｂ．ペリプラズム（レーン１、未結合物質；レーン２、溶離液）からのＰａｐ
Ａ−６ｈｉｓ４ａｌａ−ＰａｐＤ複合体の精製。複合体が結合した金属アフィニ
ティ樹脂を８Ｍの尿素で処理し、洗浄してＰａｐＤを除去した。溶離したＰａｐ
Ａ−６ｈｉｓ４ａｌａをレーン３に示す。レーン４は、尿素を除ｓ去するために
透析した後のＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａ溶離液を示す。レーン３におけるダブ
レットＰａｐＡバンドは、尿素処理の結果であり、タンパク質の変化した形であ
ることが示されている。Ｃ．シャペロンサブユニット複合体の再構成。変性したＰａｐＡ−６ｈｉｓ２
ａｌａ（レーン２）を、精製ＰａｐＤシャペロンと混合し、金属アフィニティ樹
脂に結合させ、洗浄して０．１Ｍのイミダゾールで溶離した。溶離した複合体を
レーン３に示す。レーン１は、分子量標準を含む。Ａ、Ｂ、およびＣは、クーマ
シーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％）である。

【図２】ＤｅｇＰプロテアーゼ結合およびＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａの切断。金属アフィニティ樹脂に結合した変性されたＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａを対
照ペリプラズム（レーン１）またはＤｅｇＰ量を高めたペリプラズム（レーン２
）と混合した。結合したタンパク質を、０．１Ｍのイミダゾールで金属アフィニ
ティ樹脂から溶離した。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、溶離液を移動させ
、クーマシーブリリントブルーで染色した。レーン２（ＤｅｇＰ量を高めた）に
現れ、且つレーン１（対照ペリプラズム）に現れない３つの新規なバンドを示す
。円形の矢印は、未だ同定されていない新しいバンドを示す。アミノ酸配列決定
法により、ＤｅｇＰバンドおよびＰａｐＡ−ＮＨ２バンドを確認した。ＤｅｇＰ
バンドの配列は、Ｌｉｐｉｎｓｋａｅｔａｌ．（１９８８；前掲）ＡＥＴＳ
ＳＡにより発表されたものと同じであった。１２ｋＤａのＰａｐＡ−ＮＨ２バン
ドのアミノ末端配列はＡＡＡＨＨＨＨであり、シグナルプロセッシングが正しい
部位で起こったこと、つまり４個のヒスチジンは、６−ヒスチジン標識の一部で
あることが確認された。

【図３】ＤｅｇＰの精製。Ａ．陽イオン交換分画。細胞３０ｇから調製したペリプラズムを５ｍｌのＨｉ
ＴｒａｐＳＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃ
ｈ社製，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に充填し、リニア塩グラジエントで溶
離した。出発材料およびフロースルー分画を、それぞれレーン２およびレーン３
に示す。溶離勾配の関連部分をレーン４〜８に示す。ＤｅｇＰは、およそ１００
ｍＭのＮａＣｌで溶出した。Ｂ．ＨＩＣブチル分画。陽イオン交換分画からのピーク分画プールし、ＨｉＴ
ｒａｐＨＩＣブチルカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。フロースルー
分画をレーン２に示す。ＤｅｇＰは、およそ０．３Ｍの塩で溶離し、これをレー
ン４〜８に示す。小さい矢印は、ＤｅｇＰの切断型を示し、その全てをアミノ末
端配列決定法で同定した（未発表のデータ）。ＡとＢの双方で、レーン１は高分
子量マーカーを含む。

【図４】カゼイン基質に対するＤｅｇＰ活性。蛍光性カゼイン基質（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＰｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して、ＨＩＣ精製材料からのＤ
ｅｇＰ分画中のプロテアーゼ活性についてスクリーニングした。別個の２つのＤ
ｅｇＰ調製物（ｄｅｇＰ−Ａ、ｄｅｇＰ−Ｂ）を試験し、トリプシン対照に匹敵
する活性を有することを示した。

【図５】ｉｎｖｉｔｒｏＤｅｇＰ切断分析方法。変形（ｒｅｄｕｃｅ）してカルボ
キシメチル化したＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａをＤｅｇＰと混合し、４５℃で一
晩インキュベートした。ＰＶＤＦ膜に移動させたＳＤＳ−ＰＡＧＥで反応を分析
し、Ｐ線毛全体に対して生じたポリクローナル抗体で現像した。ＰａｐＡ−６ｈ
ｉｓ４ａｌａを、それぞれ、ＤｅｇＰの存在下（レーン３：０．２５μｇ、レー
ン５：０．５μｇ）および非存在下（レーン２：０．２５μｇおよびレーン４：
０．５μｇ）で、インキュベートした。レーン１は対照としてＤｅｇＰのみを含
む。インキュベーションは、３７℃で１２時間行った。

【図６】ＤｅｇＰ結合性ＥＬＩＳＡおよび高処理量の切断分析法。Ａ．結合性ＥＬＩＳＡ。抗−６ｈｉｓ抗血清を使用して、９６ウェルのマイク
ロタイタープレートのウェル上に、ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａ（０．８ｍｇ／
ｍｌ）を捕捉した。タンパク質調製物の連続５倍希釈液を三回加えた。ＤｅｇＰ
（５０ｐＭ）をプレートに加え、６０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡを、
抗−ＤｅｇＰ抗血清に続いてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体
で現像した。Ｂ．切断分析法。ＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａを上述の通りに捕捉し、Ｄｅｇ
Ｐで２時間処理した。洗浄後、本分析物をポリクローナル抗ＰａｐＡ抗血清で現
像して、プレート上に残存するＰａｐＡ−６ｈｉｓ４ａｌａを検出した。

【図７】グラム陰性およびグラム陽性生物由来のＤｅｇＰ様プロテアーゼの相同／コン
センサス配列。３６種のグラム陰性ＤｅｇｌＰホモログおよび５種のグラム陽性
ＤｅｇｌＰホモログを選択し、触媒ドメインの配列（図７Ａ）をＰＤＺドメイン
（図７Ｂ）の配列と分離させた。次いで、コンセンサス配列を同定するために、
配列を手で並べた。こうすることによって、ＤｅｇＰ様プロテアーゼを明確にす
るための一組の特徴が得られた。

【図８】Ｅ．ｃｏｌｉＤｅｇＰおよび３種のグラム陽性ホモログの配列を示す図であ
る。この配列で、同じ残基および保存された変化は、ボールド体で示されている
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジョーンズ，ハル・シーアメリカ合衆国オレゴン州97333，コーヴァリス，サウスウェスト・ウェスタン・ブールヴァード 3560 (72)発明者リウ，クリストファーアメリカ合衆国マサチューセッツ州02139，ケンブリッジ，ケンブリッジ・ストリート 1367，アパートメント３ (72)発明者ハルトグレン，スコット・ジェイアメリカ合衆国ミズーリ州63119，ボールウィン，カントリー・ヒル・レイン 1637 (72)発明者ルビー，デニス・イーアメリカ合衆国オレゴン州97321，オールバニー，ノースウェスト・インディペンデンス・ハイウェイ 2262 (72)発明者フランク，クリスティン・エイアメリカ合衆国オレゴン州97321，オールバニー，ノースウェスト・インディペンデンス・ハイウェイ 2262 (72)発明者エヴァンズ，エイミー・ケイアメリカ合衆国オレゴン州97330，コーヴァリス，ノースイースト・コロンビア・アヴェニュー 126 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 FB07 4B063 QA01 QQ06 QQ95 QR16 QR23 QS03 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｐａｐ線毛の主要なピリンサブユニットと、ＤｅｇＰプロテ
アーゼと、ＤｅｇＰ認識／切断部位を含む標的ペプチドとを準備するステップと
、ＤｅｇＰ活性のインヒビターである疑いがあるものの存在下で該ＤｅｇＰと
適切な基質とを混合するステップと、該インヒビターである疑いがあるものの存在下で該ＤｅｇＰプロテアーゼの酵
素活性を検出するステップと、該インヒビターの存在下での該ＤｅｇＰ活性を、該インヒビターの非存在下で
の活性と比較するステップとを含むＤｅｇＰプロテアーゼのインヒビター類の分析方法。
【請求項２】前記Ｐａｐ線毛の主要なピリンサブユニットが固体基材上に
固定される請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】前記ＤｅｇＰプロテアーゼが、該ＤｅｇＰプロテアーゼを含
むペリプラズムの抽出物の形で提供される請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】前記ＤｅｇＰの適切な基質がＤｅｇＰの天然基質である請求
項１に記載の分析方法。
【請求項５】前記ＤｅｇＰの天然基質がＰａｐＡピリンである請求項４に
記載の分析方法。
【請求項６】ＤｅｇＰプロテアーゼとＰａｐＡ標的とを含む前記分析方法
における全ての成分が均質な調製物である請求項１に記載の分析方法。
【請求項７】前記認識／切断部位を含むペプチドが検出可能な標識に接合
される請求項１に記載の分析方法。
【請求項８】前記検出可能な標識が蛍光染料である請求項７に記載の分析
方法。