CN110055202B

CN110055202B - 用于高表达外源蛋白的大肠杆菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN110055202B
Application number: CN201910197073.7A
Authority: CN
Inventors: 吴晓云; 黄俊杰; 李胜峰; 俞金泉
Original assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Current assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2039-03-15
Also published as: CN110055202A

Abstract

本发明提供一种高表达外源蛋白的大肠杆菌，所述大肠杆菌的基因型缺失prc基因，并携带突变的spr基因和突变的ilvG基因；其中所述突变的spr基因为：spr基因编码的174位由色氨酸突变为精氨酸或赖氨酸；所述突变的ilvG基因为：ilvG基因的981bp位置处插入“TA”两个碱基。该大肠杆菌实现了提高高密度发酵过程大肠杆菌菌株生长的稳定期，且抑制了大肠杆菌周质空间中分泌表达的外源性蛋白被降解，同时实现外源蛋白的高表达，提高表达量。

Description

用于高表达外源蛋白的大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程领域，特别涉及一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法及其应用。

背景技术

大肠杆菌(E.coli)因其自身的优势可作为外源蛋白的独特系统，如成本低、产量高、生长速度快、转化效率高、可在短时间内获得目的蛋白并对其进行纯化和分析，且最终蛋白产量较高。相比之下，用于获得完整抗体分子的哺乳动物细胞系统的缺点是生产成本高、表达周期长。所以大肠杆菌是大多数科学研究及应用中实现蛋白表达的首选宿主。但大肠杆菌在表达一些含有复杂二硫键结构的或者需要转译后修饰的蛋白方面还存在一些问题。由于大肠杆菌周质空间具有独特优势，多数重组蛋白选择在大肠杆菌周质空间表达。

大肠杆菌有内膜和外膜组成的双层膜结构，在内膜和外膜之间的区域即所谓的周质(periplasmic space)。利用大肠杆菌系统,在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽,可将目的蛋白运送到周质空间，经信号肽酶将信号肽切除后，即可获得与天然蛋白一致的构象(不含N端多余的甲硫氨酸)。E.coli的细胞周质中含有一系列的酶，并提供了一个氧化的环境，这些都有利于二硫键的正确形成，促进蛋白的正确折叠，使有活性药物蛋白的产量得到提高。另外，周质空间的蛋白含量低，蛋白酶活性要比胞质中低，使所表达的蛋白能避免胞内降解从而稳定地存在，有利于目标蛋白的浓缩。

作为治疗用的Fab类抗体蛋白，由于其相对分子质量小、组织分布特异性强和免疫原性低等使Fab类抗体成为近几十年来的研究热点。例如目前治疗年龄相关的黄斑变性的ranibizumab(中文商品名：雷珠单抗，英文商品名：Lucentis)，和用于治疗银屑病的certolizumab(中文商品名：赛妥珠单抗，英文商品名：Cimzia)等等抗体都是Fab类抗体，且都是通过大肠杆菌发酵获得。国内很多研究机构也在研究Fab类抗体在大肠杆菌体内的表达等相关方面的内容。

利用大肠杆菌作为宿主菌生产Fab类抗体，大都是利用大肠杆菌的周质空间进行分泌表达的，这种表达方式分泌的蛋白是可溶的，但是表达量较低，需要通过多种方式来提高表达量。如优化诱导时间、优化诱导温度、优化培养时间、优化目标蛋白的密码子等等。

使用野生型的E.coli作为宿主菌来表达蛋白，一般表达量很低，所以需要通过多种手段提高表达量。工业上经常对E.coli进行各种基因工程手段的操作，如基因敲除、基因突变、定向进化等等。E.coli strain W3110为表达外源蛋白的常用宿主菌，但是存在高密度发酵时难以保持较长的稳定期，同时分泌外源蛋白的产量不太高的问题。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌及其构建方法与应用，以提高编码外源蛋白的表达量。

具体技术方案如下：

一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，所述大肠杆菌的基因型缺失prc基因，并携带突变的spr基因和突变的ilvG基因；

所述突变的spr基因为：spr基因编码的174位由色氨酸突变为精氨酸或赖氨酸；

所述突变的ilvG基因为：ilvG基因的981bp位置处插入“TA”两个碱基。

本发明的另一个目的还在于提供一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法，具体技术方案如下：

一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)将大肠杆菌的spr基因的编码174位色氨酸的序列突变为编码精氨酸或赖氨酸的序列，即得携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R；

(2)在ilvG基因的981bp位置插入“TA”两个碱基，即得即得携带突变的ilvG基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R/ilvGta；

(3)敲除prc基因。

本发明的另一个目的还在于提供一种高表达外源蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)构建表达载体，所述表达载体中包括有目的基因表达框序列；所述目的基因表达框序列两端为酶切位点，中间依次连接有启动子、目的基因序列和终止子；所述启动子为phoA启动子，包括核心启动子和编码信号肽的基因；

所述phoA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述终止子的核苷酸序列如SEQID NO.30所示。

(2)将构建得到的表达载体转化入权利要求1-4任一项所述的用于高表达外源蛋白的大肠杆菌中，发酵培养，即得。

基于上述技术方案，本发明具有以下效果：

本发明发明人通过大量创造性劳动，对大肠杆菌的spr、ilvG和prc 3个基因进行了改造，得到了基因型缺失prc基因，并携带突变的spr基因和突变的ilvG基因的大肠杆菌，其中，spr基因编码的174位由色氨酸突变为精氨酸或赖氨酸，ilvG基因的981bp位置处插入“TA”两个碱基，这些基因的改造，从大肠杆菌的代谢途径入手解决大肠杆菌对培养基中缬氨酸的耐受，同时有助于合成其它支链氨基酸，明显提高菌株的存活，延长菌株的培养时间，提高高密度发酵过程大肠杆菌菌株生长的稳定期，而且抑制了大肠杆菌周质空间中分泌表达的外源性蛋白被降解，同时实现外源蛋白的高表达，提高表达量。

而且，本发明所述的高表达外源蛋白的方法，找到适用于上述高表达外源蛋白的大肠杆菌的启动子和信号肽，在目的基因表达框中采用phoA表达框、构建表达载体，并转入上述高表达外源蛋白的大肠杆菌中，在调控下，外源蛋白在细胞内的累积是渐进的，降低了外源蛋白迅速累积时导致细菌表达系统过载和形成包涵体的机会，在抑制了大肠杆菌周质空间中分泌表达的外源性蛋白被降解的同时，更进一步提高了外源蛋白的表达量。

附图说明

图1-2为spr基因改造鉴定的凝胶电泳图；

图3为ilvG基因插入突变前后序列对比；

图4为含有突变的ilvG基因的打靶片段的凝胶电泳图；

图5-图6为ilivG基因改造鉴定的凝胶电泳图；

图7为两侧含有FRT位点的抗性基因的打靶片段琼脂糖凝胶电泳图；

图8为被氯霉素基因替换后琼脂糖凝胶电泳图；

图9为氯霉素抗性基因消除后琼脂糖凝胶电泳图；

图10为phoA启动子结构示意图；

图11为外源基因与phoA启动子融合示意图；

图12为pBR322-lucentis质粒图谱；

图13为pBR322-RORc his质粒图谱；

图14为pBR322-RORc Fc质粒图谱；

图15为用于高表达外源蛋白的大肠杆菌BATX47C/Δprc菌株生长曲线与BATX47C对比图；

图16为两种不同宿主菌分泌表的的Fab检测结果；

图17为发酵结束时两种不同宿主菌裂解上清中SDS-PAGE检测结果；

图18为通过用于高表达外源蛋白的大肠杆菌BATX47C/Δprc表达的Lucentis类似药与原药SDS-PAGE检测结果；

图19为通过用于高表达外源蛋白的大肠杆菌BAX47c/Δprc分泌表达的Lucentis的生物类似药与Lucentis原药的体外药效对比结果；

图20为不同宿主菌中RORc-his表达量SDS-PAGE检测结果；

图21为不同宿主菌中RORc-Fc表达量SDS-PAGE检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供的一种用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，其基因型缺失prc基因，并携带突变的spr基因和突变的ilvG基因；所述突变的spr基因为：spr基因编码的174位由色氨酸突变为精氨酸或赖氨酸；所述突变的ilvG基因为：ilvG基因的981bp位置处插入“TA”两个碱基。

其中，优选地，所述突变的spr基因序列如SEQ ID NO.6所示；和/或所述突变的ilvG基因序列如SEQ ID NO.17所示。进一步优选地，所述大肠杆菌由E.coli strain W3110改造得到。更优选地，所述大肠杆菌的基因型为tonA ptr3△phoA△E15△(argF-lac)169degP41△ompT kan^RsprW174R ilvG⁺2096。

本发明提供的用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：(1)将大肠杆菌的spr基因的编码174位色氨酸的序列突变为编码精氨酸或赖氨酸的序列，即得携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R；(2)在ilvG基因的981bp位置插入“TA”两个碱基，即得即得携带突变的ilvG基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R/ilvGta；(3)敲除prc基因。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述的将大肠杆菌的spr基因的编码174位色氨酸的序列突变为编码精氨酸或赖氨酸的序列的方法为：通过基因打靶技术，将突变的spr基因整合到所述大肠杆菌的基因组中。

具体地，所述将突变的spr基因整合到所述大肠杆菌的基因组中，步骤包括：(1)构建打靶载体：将含有突变的spr基因的打靶序列与pCVD442质粒通过XbaI酶切位点连接，得打靶载体pCVD442-spr；(2)制备供体菌株：将所述打靶载体pCVD442-spr转化入大肠杆菌β2155菌株，得供体菌株β2155/pCVD442-spr；(3)将所述供体菌株β2155/pCVD442-spr与受体菌株大肠杆菌E.coli strain W3110混合，培养、筛选，即得携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R。

优选地，所述含有突变的spr基因的打靶序列，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.4所示的引物，以大肠杆菌E.coli strain W3110的基因组DNA为模板，PCR扩增得到。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述的在ilvG基因的981bp位置插入“TA”两个碱基的方法为：通过基因打靶技术，将突变的ilvG基因整合到所述大肠杆菌的基因组中。

具体地，所述将突变的ilvG基因整合到所述大肠杆菌的基因组中，步骤包括：(1)构建打靶载体：将含有突变的ilvG基因的打靶序列与pCVD442质粒通过XbaI酶切位点连接，得打靶载体pCVD442-ilvG；(2)制备供体菌株：将所述打靶载体pCVD442-ilvG转化入大肠杆菌β2155菌株，得供体菌株β2155/pCVD442-ilvG；(3)将所述供体菌株β2155/pCVD442-ilvG与受体菌株携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R混合，培养、筛选，即得携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R/ilvGta。

优选地，所述含有突变的ilvG基因的打靶序列，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.12～SEQID NO.15的引物，以步骤(1)中所述的携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R的基因组DNA为模板，PCR扩增得到。

在其中一些实施例中，采用基因打靶技术将大肠杆菌基因组中的prc基因替换为两侧带有FRT位点的抗性基因片段，并通过定向重组删除抗性基因，即得用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，其采用大肠杆菌作为外源蛋白表达系统，并结合大肠杆菌噬菌体来源的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件，利用两侧带有FRT位点的抗生素抗性基因取代目标基因，再通过诱导外源性温敏质粒表达FLP重组酶删除抗生素抗性基因以敲除大肠杆菌中的prc基因，从而抑制了大肠杆菌周质空间中分泌表达的外源性蛋白被降解，同时实现外源蛋白的高表达，提高表达量。

具体地，为实现将大肠杆菌基因组中的prc基因替换为两侧带有FRT位点的抗性基因片段，可以将pKD46质粒转化入大肠杆菌菌株BATX47C，制备BAX47C/pKD46感受态细胞后，两侧各带有一个FRT位点的抗性基因片段转化入BATX47C/pKD46感受态细胞，然后通过平板筛选得到阳性克隆，所得到的阳性克隆菌株命名为BAX47C/Δprc::Cm。其中，在电击转化后还包括加入含L-阿拉伯糖的LB培养基，悬浮培养的步骤，以使得大肠杆菌复苏。其中，平板筛选得到阳性克隆，可以通过筛选抗性基因实现，例如，在培养基中加入抗性基因片段对应的抗生素。可选地，抗性基因片段可以是氯霉素抗性基因，在筛选培养基中加入氯霉素进行筛选；或是采用其它抗生素代替氯霉素，例如四环素、链霉素等。其中，所述抗生素应避免为卡那霉素和氨苄青霉素，原因是：含氯霉素或四环素或链霉素的质粒在实验室一般用的较少，导入宿主菌之后，宿主菌很少会产生耐药性，更容易筛选。当采用四环素或链霉素时，需要经pKD3质粒中的氯霉素抗性基因替换成四环素或链霉素即可。优选地，所述两侧带有FRT位点的抗性基因片段，可以通过设计引物prc-F和prc-R，以pKD3质粒为模板，扩增得到。

在一些实施例中，所述的定向重组的方法为：诱导外源性温敏质粒表达FLP重组酶，优选地采用pCP20质粒。

以上构建得到的用于高表达外源蛋白的大肠杆菌，在表达分泌一些难表达的蛋白中具有较高应用价值，如可以应用于转录因子类微生物A相关的孤儿受体伽马(Retinoid-related orphan receptor gamma，RORγ，RoRc)在大肠杆菌的周质空间进行分泌表达、Lucentis抗体片段的表达等。

本发明还构建了一种高表达外源蛋白的方法，其通过构建两端为酶切位点，中间依次连接有启动子、目的基因序列和终止子的目的基因表达框及表达载体，并转化入上述构建得到的大肠杆菌中发酵培养得到。其中，优选地，所述启动子为phoA启动子，包括核心启动子和信号肽；在上述构建得到的大肠杆菌抑制了周质空间中分泌表达的外源性蛋白被降解的基础上，在表达载体元件的调控下，外源蛋白在细胞内的累积是渐进的，降低了外源蛋白迅速累积时导致细菌表达系统过载和形成包涵体的机会，更进一步提高了外源蛋白的表达量。可选的，目的基因表达框序列两端的酶切位点为EcoRI和ClaI，或其他载体上常见的酶切位点。在一些实施例中，所述启动子为phoA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，所述终止子为λt₀终止子，核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。

下面将结合具体实施例对本发明进行详细说明：

实施例1

1、改造BAT47

大肠杆菌BAT47(E.coli strain W3110)由ATCC购买得到，其基因型为：tonA ptr3△phoA△E15△(argF-lac)169degP41△ompT kan^R。

对BAT47(tonA ptr3△phoA△E15△(argF-lac)169degP41△ompT kan^R)进行spr和ilvG基因的改造，步骤如下：

第一步：将该宿主菌的spr基因编码的174位色氨酸(W，Trp)突变为精氨酸(R，Arg)(spr基因序列的第520bp T突变为C)。

1、打靶载体pCVD442-spr的构建

参照spr基因(NCBI Locus tag:YP75_p2138)及其上下游序列设计引物。以BAT47基因组DNA为模板，用高保真PCR酶使用spr-5F、spr-5R、spr-3F、spr-3R引物(SEQ ID NO.1-4)获得全长的spr打靶片段，该打靶片段中已经包含T/C突变，可以使spr基因174位的色氨酸突变成精氨酸(SEQ ID NO.5-7)

划线接种DH5αλpir/pCVD442菌种到LB/Amp平板，30℃培养过夜。挑单克隆入100mlLB/Amp培养液中，30℃培养过夜。次日酚/氯仿法提取pCVD442质粒，溶于200μl TE(10mMTris and 0.1mM EDTA，pH＝8.0)。将spr打靶片段和pCVD442分别用XbaI进行酶切，酶切结束后加入磷酸化酶37℃反应30min。处理后的载体和片段用T4DNA连接酶进行酶连。然后通过电转化方法将酶连产物电转化转入大肠杆菌DH5αλpir，在LB平板(含氨苄青霉素100μg/ml)上于37℃培养至单克隆形成。在氨苄青霉素平板上随机挑选生长良好的克隆，接种入3ml LB培养基(含Amp 100μg/ml)，37℃培养过夜。次日离心柱法提取质粒，洗脱于30μl去离子水，此质粒即为打靶载体：pCVD442-spr。

引物名称	SEQ ID NO.	序列	备注
				spr-5F	1	atatctagacgaattatggatcagtatgctgactggaaagg	包含XbaI酶切位点
spr-5R	2	gtaacgcttcttccGgtacggttcattca
				spr-3F	3	tgaatgaaccgtacCggaagaagcgttac
spr-3R	4	atatctagaccagtatcgcaatcattacgcctgcaac	包含XbaI酶切位点

spr野生型序列(SEQ ID NO.5)

atggtcaaatctcaaccgattttgagatatatcttgcgcgggattcccgcgattgcagtagcggttctgctttctgcatgtagtgcaaataacaccgcaaagaatatgcatcctgagacacgtgcagtgggtagtgaaacatcatcactgcaagcttctcaggatgaatttgaaaacctggttcgtaatgtcgacgtaaaatcgcgaattatggatcagtatgctgactggaaaggcgtacgttatcgtctgggcggcagcactaaaaaaggtatcgattgttctggtttcgtacagcgtacattccgtgagcaatttggcttagaacttccgcgttcgacttacgaacagcaggaaatgggtaaatctgtttcccgcagtaatttgcgtacgggtgatttagttctgttccgtgccggttcaacgggacgccatgtcggtatttatatcggcaacaatcagtttgtccatgcttccaccagcagtggtgttattatttccagcatgaatgaaccgtacTggaagaagcgttacaacgaagcacgccgggttctcagccgcagctaa

spr突变序列(SEQ ID NO.6)

atggtcaaatctcaaccgattttgagatatatcttgcgcgggattcccgcgattgcagtagcggttctgctttctgcatgtagtgcaaataacaccgcaaagaatatgcatcctgagacacgtgcagtgggtagtgaaacatcatcactgcaagcttctcaggatgaatttgaaaacctggttcgtaatgtcgacgtaaaatcgcgaattatggatcagtatgctgactggaaaggcgtacgttatcgtctgggcggcagcactaaaaaaggtatcgattgttctggtttcgtacagcgtacattccgtgagcaatttggcttagaacttccgcgttcgacttacgaacagcaggaaatgggtaaatctgtttcccgcagtaatttgcgtacgggtgatttagttctgttccgtgccggttcaacgggacgccatgtcggtatttatatcggcaacaatcagtttgtccatgcttccaccagcagtggtgttattatttccagcatgaatgaaccgtacCggaagaagcgttacaacgaagcacgccgggttctcagccgcagctaa

spr打靶片段序列(SEQ ID NO.7)

cgaattatggatcagtatgctgactggaaaggcgtacgttatcgtctgggcggcagcactaaaaaaggtatcgattgttctggtttcgtacagcgtacattccgtgagcaatttggcttagaacttccgcgttcgacttacgaacagcaggaaatgggtaaatctgtttcccgcagtaatttgcgtacgggtgatttagttctgttccgtgccggttcaacgggacgccatgtcggtatttatatcggcaacaatcagtttgtccatgcttccaccagcagtggtgttattatttccagcatgaatgaaccgtacCggaagaagcgttacaacgaagcacgccgggttctcagccgcagctaataaaccgtttggatgcaatcccttggctatcctgacgagttaactgaaagcactgcttaggcagtgcttttttgttttcattcatcagagaaaatgatgtttccgcgtcttgatccaggctatagtccggtcattgttatcttttaaatgttgtcgtaatttcaggaaattaacggaatcatgttcatacgcgctcccaattttggacgtaagctcctgcttacctgcattgttgcaggcgtaatgattgcgatactgg

2、供体菌的构建

将打靶载体pCVD442-spr电转化进入大肠杆菌β2155菌株，铺LB平板(含Amp 100μg/ml，0.5mM DAP)，37℃培养至单克隆形成。此克隆即为用于接合实验的供体菌株β2155/pCVD442-spr。

3.接合实验及spr阳性克隆的鉴定

在LB平板上划线接种受体菌BAT47，37℃培养至单克隆形成。挑单克隆BAT47入3mlLB；挑β2155/pCVD442-spr单克隆入3ml LB(含Amp 100μg/ml，0.5mM DAP)。37℃，220rpm培养过夜。取500μl供体菌β2155/pCVD442-spr菌液与1000μl受体菌BAT47菌液混合，6000rpm离心5min，收集菌体，无抗性LB培养液(含0.5mM DAP)洗涤1次，菌体重悬于1ml LB培养液(含0.5mM DAP)中，取100μl铺到0.22μm无菌滤膜上，30℃培养过夜。次日，滤膜上菌体在5ml生理盐水中吹打洗脱，取40μl菌液涂布于含有100μg/ml Amp的LB平板，30℃培养过夜。在Amp抗性平板上，随机挑选16个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液行ilvG基因外侧引物spr-outF和spr-outR扩增，见图1所示，M:DNA分子量标准；1-16：第1-16号克隆的扩增结果。结果显示：第2号克隆为无/弱扩增，是可能的打靶质粒正确整合到基因组的克隆。选此克隆继续进行实验，命名为BAT47/pCVD442-spr。

取BAT47/pCVD442-spr菌液划线接种LB蔗糖平板(含10％蔗糖，无NaCl)，30℃培养至单克隆形成。随机挑选16个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液用spr基因外侧引物进行PCR检测。结果显示：全部16个克隆的PCR产物又出现明亮的特异性单条带扩增，长度约4000bp，见图2所示；M:DNA分子量标准；1-16：第1-16号克隆的扩增结果。此结果表明在蔗糖平板上筛选到了整合的打靶质粒通过打靶片段的基因组内再次重组又被剔除的阳性克隆。在这个过程中，spr基因序列可能回复到野生型，也可能是spr的突变型，需要通过测序确定。取第1号克隆的PCR产物送测序，测序引物为spr-outF2。测序结果显示为突变成功克隆，将克隆命名为BAT47/sprW174R。相关引物序列SEQ ID NO.8-11。

第二步：在BAT47/sprW174R基础上，将ilvG基因(NCBI Locus tag：Y75_p3407)的981bp位置处插入“TA”2个碱基，突变后的基因命名为ilvGta，(ilvG插入突变前后序列对比如图3所示)

1、打靶片段ilvGta的制备

以第一步改造得到的BAT47/sprW174R的基因组为模板，使用高保真PCR酶用引物ilvGta-5F、ilvGta-5R、ilvGta-3F、ilvGta-3R(SEQ ID NO.12-15)进行融合PCR操作，以得到同源重组手臂，即打靶片段，电泳结果见图4所示，其中泳道1为融合PCR产物，长度719bp，M为DNA分子量标准。

引物名称	SEQ ID NO.	序列	备注
				ilvGta-5F	12	atatctagagtacgttggcggtggcgtgggtatg	包含XbaI酶切位点
ilvGta-5R	13	gtgttgctgccagtcaTAttgatttaacggctgc
				ilvGta-3F	14	gcagccgttaaatcaaTAtgactggcagcaacac
ilvGta-3R	15	atatctagacggtgcccagctcttgcacattcatcatg	包含XbaI酶切位点

ilvG序列(SEQ ID NO.16)

atgaatggcgcacagtgggtggtacatgcgttgcgggcacagggtgtgaacaccgttttcggttatccgggtggcgcaattatgccggtttacgatgcattgtatgacggcggcgtggagcacttgctatgccgacatgagcagggtgcggcaatggcggctatcggttatgctcgtgctaccggcaaaactggcgtatgtatcgccacgtctggtccgggcgcaaccaacctgataaccgggcttgcggacgcactgttagattccatccctgttgttgccatcaccggtcaagtgtccgcaccgtttatcggcactgacgcatttcaggaagtggatgtcctgggattgtcgttagcctgtaccaagcacagctttctggtgcagtcgctggaagagttgccgcgcatcatggctgaagcattcgacgttgcctgctcaggtcgtcctggtccggttctggtcgatatcccaaaagatatccagttagccagcggtgacctggaaccgtggttcaccaccgttgaaaacgaagtgactttcccacatgccgaagttgagcaagcgcgccagatgctggcaaaagcgcaaaaaccgatgctgtacgttggcggtggcgtgggtatggcgcaggcagttccggctttgcgtgaatttctcgctgccacaaaaatgcctgccacctgtacgctgaaagggctgggcgcagtagaagcagattatccgtactatctgggcatgctggggatgcacggcaccaaagcggcaaacttcgcggtgcaggagtgtgacctgctgatcgccgtgggcgcacgttttgatgaccgggtgaccggcaaactgaacaccttcgcgccacacgccagtgttatccatatggatatcgacccggcagaaatgaacaagctgcgtcaggcacatgtggcattacaaggtgatttaaatgctctgttaccagcattacagcagccgttaaatcaatgactggcagcaacactgcgcgcagctgcgtgatgaacattcctggcgttacgaccatcccggtgacgctatctacgcgccgttgttgttaaaacaactgtcggatcgtaaacctgcggattgcgtcgtgaccacagatgtggggcagcaccagatgtgggctgcgcagcacatcgcccacactcgcccggaaaatttcatcacctccagcggtttaggtaccatgggttttggtttaccggcggcggttggcgcacaagtcgcgcgaccgaacgataccgttgtctgtatctccggtgacggctctttcatgatgaatgtgcaagagctgggcaccgtaaaacgcaagcagttaccgttgaaaatcgtcttactcgataaccaacggttagggatggttcgacaatggcagcaactgttttttcaggaacgatacagcgaaaccacccttactgataaccccgatttcctcatgttagccagcgccttcggcatccatggccaacacatcacccggaaagaccaggttgaagcggcactcgacaccatgctgaacagtgatgggccatacctgcttcatgtctcaatcgacgaacttgagaacgtctggccgctggtgccgcctggcgccagtaattcagaaatgttggagaaattatcatga

ilvGta序列(SEQ ID NO.17)

atgaatggcgcacagtgggtggtacatgcgttgcgggcacagggtgtgaacaccgttttcggttatccgggtggcgcaattatgccggtttacgatgcattgtatgacggcggcgtggagcacttgctatgccgacatgagcagggtgcggcaatggcggctatcggttatgctcgtgctaccggcaaaactggcgtatgtatcgccacgtctggtccgggcgcaaccaacctgataaccgggcttgcggacgcactgttagattccatccctgttgttgccatcaccggtcaagtgtccgcaccgtttatcggcactgacgcatttcaggaagtggatgtcctgggattgtcgttagcctgtaccaagcacagctttctggtgcagtcgctggaagagttgccgcgcatcatggctgaagcattcgacgttgcctgctcaggtcgtcctggtccggttctggtcgatatcccaaaagatatccagttagccagcggtgacctggaaccgtggttcaccaccgttgaaaacgaagtgactttcccacatgccgaagttgagcaagcgcgccagatgctggcaaaagcgcaaaaaccgatgctgtacgttggcggtggcgtgggtatggcgcaggcagttccggctttgcgtgaatttctcgctgccacaaaaatgcctgccacctgtacgctgaaagggctgggcgcagtagaagcagattatccgtactatctgggcatgctggggatgcacggcaccaaagcggcaaacttcgcggtgcaggagtgtgacctgctgatcgccgtgggcgcacgttttgatgaccgggtgaccggcaaactgaacaccttcgcgccacacgccagtgttatccatatggatatcgacccggcagaaatgaacaagctgcgtcaggcacatgtggcattacaaggtgatttaaatgctctgttaccagcattacagcagccgttaaatcaaTAtgactggcagcaacactgcgcgcagctgcgtgatgaacattcctggcgttacgaccatcccggtgacgctatctacgcgccgttgttgttaaaacaactgtcggatcgtaaacctgcggattgcgtcgtgaccacagatgtggggcagcaccagatgtgggctgcgcagcacatcgcccacactcgcccggaaaatttcatcacctccagcggtttaggtaccatgggttttggtttaccggcggcggttggcgcacaagtcgcgcgaccgaacgataccgttgtctgtatctccggtgacggctctttcatgatgaatgtgcaagagctgggcaccgtaaaacgcaagcagttaccgttgaaaatcgtcttactcgataaccaacggttagggatggttcgacaatggcagcaactgttttttcaggaacgatacagcgaaaccacccttactgataaccccgatttcctcatgttagccagcgccttcggcatccatggccaacacatcacccggaaagaccaggttgaagcggcactcgacaccatgctgaacagtgatgggccatacctgcttcatgtctcaatcgacgaacttgagaacgtctggccgctggtgccgcctggcgccagtaattcagaaatgttggagaaattatcatga

打靶片段ilvGta序列(SEQ ID NO.18)

gtacgttggcggtggcgtgggtatggcgcaggcagttccggctttgcgtgaatttctcgctgccacaaaaatgcctgccacctgtacgctgaaagggctgggcgcagtagaagcagattatccgtactatctgggcatgctggggatgcacggcaccaaagcggcaaacttcgcggtgcaggagtgtgacctgctgatcgccgtgggcgcacgttttgatgaccgggtgaccggcaaactgaacaccttcgcgccacacgccagtgttatccatatggatatcgacccggcagaaatgaacaagctgcgtcaggcacatgtggcattacaaggtgatttaaatgctctgttaccagcattacagcagccgttaaatcaaTAtgactggcagcaacactgcgcgcagctgcgtgatgaacattcctggcgttacgaccatcccggtgacgctatctacgcgccgttgttgttaaaacaactgtcggatcgtaaacctgcggattgcgtcgtgaccacagatgtggggcagcaccagatgtgggctgcgcagcacatcgcccacactcgcccggaaaatttcatcacctccagcggtttaggtaccatgggttttggtttaccggcggcggttggcgcacaagtcgcgcgaccgaacgataccgttgtctgtatctccggtgacggctctttcatgatgaatgtgcaagagctgggcaccg

2、打靶载体(pCVD442-ilvGta)的构建

划线接种DH5αλpir/pCVD442菌种到LB/Amp平板，30℃培养过夜。挑单克隆入100mlLB/Amp培养液中，30℃培养过夜。次日酚/氯仿法提取pCVD442质粒，溶于200μl TE(10mMTris and 0.1mM EDTA,pH＝8.0)。将pCVD442和打靶片段ilvGta分别用XbaI酶进行酶切，同时pCVD442需要用CIAP处理

去磷酸化，以防止在酶连反应中发生自连。用T4DNA连接酶将酶切后的pCVD442和ilvGta进行酶连，然后通过电转化方法将其转入大肠杆菌DH5αλpir，然后铺LB平板(含氨苄青霉素100μg/ml)，37℃培养至单克隆形成。第二天随机挑选生长良好的克隆，接种入3mlLB培养基(含Amp 100μg/ml)，37℃培养过夜。次日离心柱法提取质粒，洗脱于30μl去离子水，此质粒即为打靶载体，命名为pCVD442-ilvGta。

3、供体菌的构建

将打靶载体pCVD442-ilvGta电转化进入大肠杆菌β2155菌株(具体步骤见附件)，铺LB平板(含Ap 100μg/ml，0.5mM DAP)，37℃培养至单克隆形成。此克隆即为用于接合实验的供体菌株β2155/pCVD442-ilvGta。

4、结合实验及ilvGta阳性克隆的鉴定

在LB平板上划线接种受体菌BAT47/sprW174R，37℃培养至单克隆形成。挑单克隆BAT47/sprW174R入3ml LB；挑β2155/pCVD442-ilvGta单克隆入3ml LB(含Amp 100μg/ml，0.5mM DAP)。37℃，220rpm培养过夜。取500μl供体菌β2155/pCVD442-ilvGta菌液与1000μl受体菌BAT47/sprW174R菌液混合，6000rpm离心5min，收集菌体，无抗性LB培养液(含0.5mMDAP)洗涤1次，菌体重悬于1ml LB培养液(含0.5mM DAP)中，取100μl铺到0.22μm无菌滤膜上，30℃培养过夜。次日，滤膜上菌体在5ml生理盐水中吹打洗脱，取40μl菌液涂布于含有100μg/ml Amp的LB平板，30℃培养过夜。在Amp抗性平板上，随机挑选8个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液用ilvG基因外侧引物ilvGta-outF和ilvGta-outR扩增，见图5所示，泳道1-8依次为第1-8号克隆的扩增结果。结果显示：第4、5号克隆为弱扩增，是可能的打靶质粒正确整合到基因组的克隆。选择第4号克隆继续进行实验，暂时命名为BAT47/sprW174R/pCVD442-ilvGta。

取BAT47/sprW174R/pCVD442-ilvGta菌液划线接种LB蔗糖平板(含10％蔗糖，无NaCl)，30℃培养至单克隆形成。随机挑选2个克隆，分别挑入20μl LB培养基，取0.5μl菌液用ilvG基因外侧引物ilvGta-outF和ilvGta-outR进行PCR检测，见图6所示，M为DNA分子量标准，。结果显示：此两个克隆的PCR产物又出现明亮的特异性单条带扩增，长度介于3000-4000bp；此结果表明在蔗糖平板上筛选到了整合的打靶质粒通过打靶片段的基因组内再次重组又被剔除的阳性克隆。将此两个克隆的PCR产物送测序，测序引物为ilvGta-5F(序列号12)。测序结果表明此2个克隆正确，命名为BAT47/sprW174R/ilvGta(简写为BATX47C)。相关引物与序列下表。

引物名称	SEQ ID NO.	序列
			ilvGta-outF	19	GCTTGCAGATGATCGGCTATCAGGCATCCTTC
ilvGta-outR	20	CAGTGAAGAGGCCGAAGAAGGCTTGCTGAATG

2、敲除prc基因

改造后的BATX47C(基因型：tonA ptr3△phoA△E15△(argF-lac)169degP41△ompT kan^RilvG⁺2096sprW174R)为表达外源蛋白的常用宿主菌。本实施例提供了对BATX47C基因组中prc基因的敲除的方法。

本实施例利用大肠杆菌噬菌体来源的Red重组系统在细菌内高效介导同源重组事件，该套系统共有3个质粒，分别是pKD3(NCBI GenBank:AY048742.1)、pKD46(GenBank:AY048746.1)和pcP20(GenBank:JA207314.1)，先用两侧带有FRT位点的抗生素抗性基因取代目标基因，再通过诱导外源性温敏质粒表达FLP重组酶删除抗生素抗性基因达到敲除目标基因的目的。具体步骤如下：

1、制备BAX47C/pKD46电转化感受态细胞

将pKD46质粒转化入BAX47C菌株，制备电转化感受态细胞BAX47C/pKD46备用。

2、构建打靶序列及电转化打靶片段

根据prc基因序列(NCBI Locus tag：Y75_p1806)和pKD3质粒序列(NCBI GenBank:AY048742.1)，设计两条长引物prc-F(SEQ ID NO.23)和prc-R(SEQ ID NO.24)，外侧40-50bp序列为prc基因的靶向同源重组臂，内侧20-30bp序列用于从pKD3质粒上扩增出氯霉素抗性基因表达框。在该抗性基因表达框的有两侧各带有一个FRT位点，其间的序列可通过定向重组(pCP20质粒表达的酵母来源的FLP重组酶)删除。PCR技术得到的打靶片段(SEQ IDNO.22)经过胶回收试剂盒回收纯化，电泳图片如图7所示，其中M为DNA分子量标准。泳道1为prc基因打靶片段，1104bp。

引物、序列如下：

目的基因prc及其上下游序列(SEQ ID NO.21)，其中划线区域为prc基因序列：

ATGGAAAATCAACCTAAGTTGAATAGCAGTAAAGAAGTAATCGCGTTTCTGGCCGAACGTTTTCCCCACTGTTTCAGTGCGGAAGGTGAAGCGCGTCCGCTGAAAATCGGTATTTTTCAGGATTTGGTCGATCGTGTTGCTGGGGAAATGAACCTGAGCAAAACGCAATTGCGATCCGCTTTACGTCTCTACACTTCGAGCTGGCGTTATCTTTACGGTGTTAAACCCGGCGCAACGCGTGTCGATCTTGACGGCAACCCATGCGGTGAGCTGGACGAGCAACATGTAGAGCATGCTCGCAAGCAGCTTGAAGAAGCGAAAGCGCGTGTTCAGGCACAGCGTGCTGAACAGCAAGCGAAAAAACGCGAAGCTGCCGCAACTGCTGGTGAGAAAGAAGACGCACCGCGCCGCGAACGCAAGCCACGTCCGACTACGCCACGCCGCAAAGAAGGCGCTGAACGTAAACCTCGTGCGCAAAAGCCGGTAGAGAAAGCGCCAAAAACAGTAAAAGCACCTCGCGAAGAACAGCACACCCCGGTTTCTGACATTTCAGCTCTGACTGTCGGACAAGCCCTGAAGGTGAAAGCGGGTCAAAACGCGATGGATGCCACCGTATTAGAAATCACCAAAGACGGCGTCCGCGTCCAGCTGAATTCGGGTATGTCTTTGATTGTGCGCGCAGAACACCTGGTGTTCTGAAACGGAGGCCGGGCCAGGCATGAACATGTTTTTTAGGCTTACCGCGTTAGCTGGCCTGCTTGC AATAGCAGGCCAGACCTTCGCTGTAGAAGATATCACGCGTGCTGATCAAATTCCGGTATTAAAGGAAGAGACGCAGC ATGCGACGGTAAGTGAGCGCGTAACGTCGCGCTTCACCCGTTCTCATTATCGCCAGTTCGACCTCGATCAGGCATTT TCGGCCAAAATCTTTGACCGCTACCTGAATCTGCTCGATTACAGCCACAACGTGCTGCTGGCAAGCGATGTTGAACA GTTCGCGAAAAAGAAAACCGAGTTAGGCGATGAACTGCGTTCAGGCAAACTCGACGTTTTCTACGATCTCTACAATC TGGCGCAAAAGCGCCGTTTTGAGCGTTACCAGTACGCTTTGTCGGTACTGGAAAAGCCGATGGATTTCACCGGCAAC GACACTTATAACCTTGACCGCAGCAAAGCGCCCTGGCCGAAAAACGAGGCTGAGTTGAACGCGCTGTGGGACAGTAA AGTCAAATTCGACGAGTTAAGCCTGAAGCTGACAGGAAAAACGGATAAAGAAATTCGTGAAACCCTGACTCGCCGCT ACAAATTTGCCATTCGTCGTCTGGCGCAAACCAACAGCGAAGATGTTTTCTCGCTGGCAATGACGGCGTTTGCGCGT GAAATCGACCCGCATACCAACTATCTTTCCCCGCGTAATACCGAACAGTTCAACACTGAAATGAGTTTGTCGCTGGA AGGTATTGGCGCAGTGCTGCAAATGGATGATGACTACACCGTTATCAATTCGATGGTGGCAGGTGGTCCGGCAGCGA AGAGTAAAGCTATCAGCGTTGGTGACAAAATTGTCGGTGTTGGTCAAACAGGCAAGCCGATGGTTGACGTGATTGGC TGGCGTCTTGATGATGTGGTTGCCTTAATTAAAGGGCCGAAGGGCAGTAAAGTTCGTCTGGAAATTTTACCTGCTGG TAAAGGGACCAAGACCCGTACTGTAACGTTGACCCGTGAACGTATTCGTCTCGAAGACCGCGCGGTTAAAATGTCGG TGAAGACCGTCGGTAAAGAGAAAGTCGGCGTGCTGGATATTCCGGGCTTCTATGTGGGTTTGACAGACGATGTCAAA GTGCAACTGCAGAAACTGGAAAAACAGAATGTCAGCAGCGTCATCATCGACCTGCGTAGCAATGGCGGTGGGGCGTT AACTGAAGCCGTATCGCTCTCCGGTCTGTTTATTCCTGCGGGTCCCATTGTTCAGGTCCGCGATAACAACGGCAAGG TTCGTGAAGATAGCGATACCGACGGACAGGTTTTCTATAAAGGCCCGCTGGTGGTGCTGGTTGACCGCTTCAGTGCT TCGGCTTCAGAAATCTTTGCCGCGGCAATGCAGGATTACGGTCGTGCGCTGGTTGTGGGTGAACCGACGTTTGGTAA AGGCACCGTTCAGCAATACCGTTCATTGAACCGTATTTACGATCAGATGTTACGTCCTGAATGGCCAGCGCTGGGTT CTGTGCAGTACACGATCCAGAAATTCTATCGCGTTAACGGCGGCAGTACGCAACGTAAAGGCGTAACGCCAGACATC ATCATGCCGACGGGTAATGAAGAAACGGAAACGGGTGAGAAATTCGAAGATAACGCGCTGCCGTGGGATAGCATTGA TGCCGCGACTTATGTGAAATCAGGAGATTTAACGGCCTTTGAACCGGAGCTGCTGAAGGAACATAATGCGCGTATCG CGAAAGATCCTGAGTTCCAGAACATCATGAAGGATATCGCGCGCTTCAACGCTATGAAGGACAAGCGCAATATCGTT TCTCTGAATTACGCTGTGCGTGAGAAAGAGAATAATGAAGATGATGCGACGCGTCTGGCGCGTTTGAACGAACGCTT TAAACGCGAAGGTAAACCGGAGTTGAAGAAACTGGATGATCTACCGAAAGATTACCAGGAGCCGGATCCTTATCTGG ATGAGACGGTGAATATCGCACTCGATCTGGCGAAGCTTGAAAAAGCCAGACCCGCGGAACAACCCGCTCCCGTCAAG TAATATCAATCAGGCACAAGAAATTGTGCCTGATTTTTTAACAGCGACAAGATGCCGTAAATCAGATGCTACAAAATGTAAAGTTGTGTCTTTCTGGTGACTTACGCACTATCCAGACTTGAAAATAGTCGCGTAACCCATACGATGTGGGTATCGCATATTGCGTTTTGTTAAACTGAGGTAAAAAGAAAATTATGATGCGAATCGCGCTCTTCCTGCTAACGAACCTGGCCGTAATGGTCGTTTTCGGGCTGGTACTGAGCCTGACAGGGATACAGTCGAGCAGCGTTCAGGGGCTGATGATCATGGCCTTGCTGTTCGGTTTTGGTGGTTCCTTCGTTTCGCTTCTGATGTCCAAATGGATGGCATTACGATCTGTTGGCGGGGAAGTGATCGAGCAACCGCGTAACGAAAGGGAACGTTGGCTGGTCAATACTGTAGCAACCCAGGCTCGTCAGGCGGGGATCGCTATGCCGCAAGTGGCTATCTACCATGCGCCGGACATCAACGCTTTTGCAACCGGTGCGCGCCGTGATGCCTCTCTGGTTGCTGTCAGCACCGGTTTGCTGCAGAACATGAGCCCGGATGAAGCCGAGGCGGTAATTGCTCACGAAATCAGCCACATCGCCAATGGTGATATGGTCACCATGACGCTGATTCAGGGCGTGGTGAACACCTTCGTTATCTTTATTTCCCGTATTCTGGCGCAGCTTGCCGCGGGTTTTATGGGCGGAAATCGTGATGAAGGTGAAGAGAGCAACGGCAACCCGCTGATCTACTTTGCGGTTGCAACGGTTCTGGAACTGGTGTTTGGTATTCTGGCGAGCATTATCACCATGTGGTTCTCGCGTCATCGTGAATTCCATGCTGATGCCGGTTCGGCAAAACTGGTTGGTCGCGAGAAAATGATTGCCGCGCTGCAGCGCCTGAAAACCAGCTATGAACCGCAAGAAGCAACCAGCATGATGGCTCTCTGCATTAACGGTAAGTCGAAATCGCTCAGTGAGTTGTTCATGACCCACCCGCCGCTGGATAAACGAATTGAAGCTCTGCGTACGGGTGAATACCTGAAGTAA

prc基因打靶片段(SEQ ID NO.22)：

acacctggtgttctgaaacggaggccgggccaggcatgaacatgttttttGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTATTCATTAAGCATCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGACAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTAGGCGCGCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGtatcaatcaggcacaagaaattgtgcctgattttttaacagcgacaagat

引物prc-F(SEQ ID NO.23)：

acacctggtgttctgaaacggaggccgggccaggcatgaacatgttttttGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA

引物prc-R(SEQ ID NO.24)：

atcttgtcgctgttaaaaaatcaggcacaatttcttgtgcctgattgataCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC

取100ng纯化的打靶片段加入BAX47C/pKD46感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置1min，转移入预冷的2mm电转杯(Bio-Rad)，迅速擦干电转杯外表水分，放入电极进行电击转化(电击参数：电压＝2.5kV，电容＝25μF，电阻＝200Ω)；电击后立即向电转杯中加入1mlLB(含L-阿拉伯糖(L-(+)-Arabinose)，终浓度1mM)，吹打悬浮，全部转移入新的无菌1.5ml离心管，37℃、160rpm培养复苏2小时。取500μl转化菌铺LB平板(含34μg/ml氯霉素)，置37℃培养箱培养至单克隆形成。

3、筛选同源重组克隆

随机挑选4个克隆，各接种3ml LB(含34ug/ml氯霉素)，37℃培养过夜。用基因组上同源手臂外侧的一对引物prc-outF(SEQ ID NO.26)和prc-outR(SEQ ID NO.27)进行菌落PCR检测，prc基因敲除前扩增产物长度为2511bp，而prc被氯霉素基因替换后扩增产物(SEQID NO.25)长度变为1481bp，见图片8所示，其中M为DNA分子量标准。泳道1-4分别为第1-4号克隆的扩增结果。泳道5为BAX47C原始菌株的扩增结果。结果显示：从PCR产物长度判断，4个克隆均为阳性克隆。选择第1号克隆继续实验，命名为BAX47C/Δprc::Cm。相关引物与序列如下：

prc被氯霉素抗性基因取代后序列(SEQ ID NO.25)：

gtttctgacatttcagctctgactgtcggacaagccctgaaggtgaaagcgggtcaaaacgcgatggatgccaccgtattagaaatcaccaaagacggcgtccgcgtccagctgaattcgggtatgtctttgattgtgcgcgcagaacacctggtgttctgaaacggaggccgggccaggcatgaacatgttttttGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTATTCATTAAGCATCTGCCGACATGGAAGCCATCACAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGACAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTAGGCGCGCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGtatcaatcaggcacaagaaattgtgcctgattttttaacagcgacaagatgccgtaaatcagatgctacaaaatgtaaagttgtgtctttctggtgacttacgcactatccagacttgaaaatagtcgcgtaacccatacgatgtgggtatcgcatattgcgttttgttaaactgaggtaaaaagaaaattatgatgcgaatcgcgctcttcctgctaacgaacctggccgtaatggtcgttttcgggctggtactgagcctgacagggatacagtcgagc

引物prc-outF(SEQ ID NO.26)：

gtttctgacatttcagctctgactgtcggacaag

引物prc-outR(SEQ ID NO.27)：

gctcgactgtatccctgtcaggctcagtac

4、删除氯霉素抗性基因

用质粒提取试剂盒制备pCP20质粒，同时制备BAX47C/Δprc::Cm的电转化感受态细胞，将pCP20质粒电转化入上述细胞。铺LB平板(含50μg/ml Amp)，30℃培养过夜。挑选生长良好的单个克隆划线接种LB平板(无抗性)，42℃培养过夜。随机选取15个克隆用于鉴定阳性克隆(氯霉素抗性基因被删除)，用Prc-outF(SEQ ID NO.26)和Prc-outR(SEQ IDNO.27)这对引物再次进行PCR扩增鉴定，氯霉素抗性基因消除的克隆产物(SEQ ID NO.28)长度缩短为551bp，见图片9所示；其中，M为DNA分子量标准。1-15泳道分别为：第1-15号克隆的扩增结果。全部为氯霉素抗性基因删除的阳性克隆。16泳道为BAX47c/Δprc::Cm菌株的扩增结果。结果显示，15个克隆全部为氯霉素抗性删除的阳性克隆，阳性克隆命名为BAX47C/Δprc。相关序列如下：

氯霉素抗性基因消除的克隆产物(SEQ ID NO.28)：

GTTTCTGACATTTCAGCTCTGACTGTCGGACAAGCCCTGAAGGTGAAAGCGGGTCAAAACGCGATGGATGCCACCGTATTAGAAATCACCAAAGACGGCGTCCGCGTCCAGCTGAATTCGGGTATGTCTTTGATTGTGCGCGCAGAACACCTGGTGTTCTGAAACGGAGGCCGGGCCAGGCATGAACATGTTTTTTGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGTATCAATCAGGCACAAGAAATTGTGCCTGATTTTTTAACAGCGACAAGATGCCGTAAATCAGATGCTACAAAATGTAAAGTTGTGTCTTTCTGGTGACTTACGCACTATCCAGACTTGAAAATAGTCGCGTAACCCATACGATGTGGGTATCGCATATTGCGTTTTGTTAAACTGAGGTAAAAAGAAAATTATGATGCGAATCGCGCTCTTCCTGCTAACGAACCTGGCCGTAATGGTCGTTTTCGGGCTGGTACTGAGCCTGACAGGGATACAGTCGAGC

实施例2利用周质空间表达外源蛋白载体设计与构建

phoA启动子包括核心启动子(-40bp至+40bp)和信号肽两部分，phoA启动子结构示意图如图10。为了使外源蛋白序列转录为RNA的过程中有效终止，在转录终止子的选择上可以使用天然的终止子如：T7终止子或rrnB终止子，但为了使转录更有效终止，本实施例中采用了工程化的终止子λt0(见序列号)。为了使外源蛋白能够在大肠杆菌周质空间中正确折叠，将编码phoA启动子的序列(SEQ ID NO.29)与外源蛋白序列及转录终止子λt0融合(外源蛋白结构示意图如图11所示)，这样蛋质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与细胞外膜之间的外周质时,信号肽可被信号肽酶所切割。

pBR322是一种常见的大肠杆菌克隆载体，用限制性内切酶EcoRI和ClaI将pBR322酶切备用。将外源蛋白基因序列和phoA启动子及λt0元件一起合成，两端的酶切位点设计为EcoR1和ClaI，然后将此外源蛋白序列克隆到EcoRI和ClaI双酶切的pBR322质粒中，然后通过电转化到BATX47C/Δprc感受态细胞中，同时为了后续实验比较将构建好的质粒也电转化到BATX47C感受态细胞中。

通过上述方法将表达Lucentis抗体片段(SEQ ID NO.31)、RORc-his融合蛋白(SEQIDNO.32)、RORc-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.33)的序列插入到EcoRI和ClaI双酶切的pBR322质粒中，pBR322-lucentis质粒图谱如图12所示、pBR322-RORc his质粒图谱如图13所示、pBR322-RORc Fc质粒图谱如图14所示；

编码phoA启动子的序列(SEQ ID NO.29)：

CTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGTACATG GAGAAAATAAAGTGAAACAAAGCACTATTGCACTGGCACTCTTACCGTTACTGTTTACCCCTGTGACAAAAGCC

λt0终止子序列(SEQ ID NO.30)

AACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTAT

Lucentis抗体基因表达框架序列(SEQ ID NO.31)：

RORc-his融合蛋白基因表达框架序列(SEQ ID NO.32)：

RORc-Fc融合蛋白基因表达框架序列(SEQ ID NO.33)：

其中，单行划线区域为phoA核心启动子序列，波浪线划线区域为λt0终止子序列，gaattc为EcoRI酶切位点，atcgat为ClaI酶切位点。

实施例3单克隆抗体片段Fab的表达

在10L发酵罐中，培养基成分为：酪蛋白水解物(casein hydrolysate)12g/L，二水柠檬酸钠1.2g/L，硫酸铵6.2g/L，三水磷酸氢二钾3.5g/L，二水磷酸二氢钠1.3g/L，消泡剂0.2ml/L(V/V)，硫酸镁1.44g/L，一水葡萄糖3.36g/L，异亮氨酸0.3g/L，三水氯化铁0.0337g/L，七水硫酸锌0.00575g/L，硫酸铜0.00319g/L，硼酸0.00124g/L，六水氯化钴0.00476g/L，一水硫酸锰0.00338g/L，二水钼酸钠0.00284g/L，卡那霉素0.05g/L，氨苄青霉素0.05g/L。从划线的LB平板中挑取单菌落，接种到装有12ml LB培养基(卡那霉素50μg/ml，氨苄青霉素50μg/ml)的50ml离心管中，37℃220rpm震荡过夜培养，培养时间约为19小时。第二天取10ml菌液接种到1000ml LB培养基中(卡那霉素50μg/ml，氨苄青霉素50μg/ml)，30℃220rpm震荡培养12h后离心收集菌体，然后将菌体重悬到500ml的发酵培养基中，然后再接种到装有10L发酵培养基的发酵罐中。溶氧控制为30％±5％，pH控制为7.0±0.2。培养过程中每2个小时检测一次葡萄糖含量变化和磷酸盐含量的变化，接种后约40小时时，培养基中磷酸养含量降至较低水平同时菌液OD550数值达到最大水平。培养约72h后下罐，菌体生长曲线见图15所示。发酵结束时取同样数量的菌体，通过超声波破碎后通过Fortebio仪器(protein L传感器)检测上清中Fab的浓度并作图，结果如16所示，同时对裂解上清跑还原SDS-PAG，见图17。通过以上结果可以看到在42h之后BATX47C的菌液密度开始显著下降，然而改造过的工程菌BATX47c/Δprc的菌液密度则可以长时间保持较高密度直至培养结束，同时改造后的宿主菌可以表达更多的lucentis抗体，表明prc基因的敲除可能与背景菌株BATX47C的spr基因的改造(spr基因编码的174位由色氨酸突变为精氨酸)和ilvG基因的改造(ilvG基因的981bp位置处插入“TA”两个碱基)所产生的效果进行了“叠加”，进一步增加lucentis抗体的表达量。在其他一些实施例中，spr基因编码的174位由色氨酸突变为赖氨酸，也能够实现增加蛋白表达量的效果。而如果在工程菌的改造中，spr基因编码的174位由色氨酸突变为组氨酸，则无法实现增加蛋白表达量的效果。

用低温离心机收集菌体，然后用高压低温破碎仪均质在提取缓冲液中(20mMTriseHCl(pH 8.0),500mM NaCl,10％glycerol)，均质比列为1：100(V/V，即1ml提取缓冲液对应100ml培养体积的菌体)。之后用低温离心机8000rpm 30分钟进行离心，上清用0.4μm过滤器进行过虑。过虑后的滤液通过protein L进行亲和纯化，以及洗脱可以得到高纯度的单克隆抗体片段Fab(见图18)，将其命名为Lucentis的生物类似药(biosilimar)。将同样培养条件和同样纯化条件得到的SDS-PAGE结果显示，通过BAX47c/Δprc宿主菌分泌表达的Lucentis的生物类似药无论还原和非还原都与原研药Lucentis分子量大小非常相似，如图12所示。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)需要VEGF165的刺激才能增殖生长，重组单克隆抗体片段Fab能够高亲和力地选择性结合VEGF165从而中和掉VEGF165，在体外表现出能够抑制VEGF165诱导的HUVEC细胞生长，抗体片段的浓度和HUVEC的增殖情况成显著的反相关关系，即抗体片段浓度越高HUVEC细胞增殖能力越弱细胞活力越差，通过CCK-8试剂可以很明显反映出OD值的变化，如图19所示。根据HUVEC增殖抑制实验结果表明，通过BATX47c/Δprc宿主菌分泌表达的Lucentis的生物类似药与原研药具有几乎一样的抑制HUVEC增殖的能力，IC50值分别为6.229ng/ml和7.464ng/ml。该结果这说明通过该工程菌周质空间分泌的单克隆抗体片段可以正常被折叠具有正常的生物学功能。

实施例4转录因子RORc的表达

从划线的LB平板中挑取pBR322-RORc-his和pBR322-RORc-Fc质粒转化后的大肠杆菌单菌落，接种到装有25ml LB培养基的125ml要瓶中，37℃220rpm震荡过夜培养，培养时间约为19小时。第二天5000g离心收集菌体，然后将菌体重悬到25ml诱导培养基，再次离心收集菌体。之后将菌体用诱导培养基重悬然后接种到500ml的诱导培养基中在30℃220rpm条件下进行培养。诱导培养基配方如下：1×MOPS盐、0.2％(m/V)葡萄糖、0.2％(m/V)酪蛋白水解物、20μg/ml腺嘌呤、0.5μg/ml硫铵、1×中性磷酸盐缓冲液(10×母液配方为：1mmol/LNa₂HPO₄和1mmol/L NaH₂PO₄混合液)、卡那霉素50μg/ml，氨苄青霉素50μg/ml。培养48小时后，离心收集菌体。然后取同样多的不同宿主菌体，通过超声波破碎，之后离心收集。然后用上清跑还原SDS-PAGE电泳，如图20和21所示。结果表明在BATX47c/Δpr宿主菌中无论是RORc-his或者是RORc-Fc的上清中目标蛋白的量都明显高于改造前的菌株，由此可见prc基因敲除后转录因子蛋白RORc-his和RORc-Fc被降解的蛋白相对较少，从而使周质空间分泌表达更多的目标蛋白。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 百奥泰生物制药股份有限公司

<120> 用于高表达外源蛋白的大肠杆菌及其构建方法与应用

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atatctagac gaattatgga tcagtatgct gactggaaag g 41

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtaacgcttc ttccggtacg gttcattca 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaatgaacc gtaccggaag aagcgttac 29

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atatctagac cagtatcgca atcattacgc ctgcaac 37

<210> 5

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtcaaat ctcaaccgat tttgagatat atcttgcgcg ggattcccgc gattgcagta 60

gcggttctgc tttctgcatg tagtgcaaat aacaccgcaa agaatatgca tcctgagaca 120

cgtgcagtgg gtagtgaaac atcatcactg caagcttctc aggatgaatt tgaaaacctg 180

gttcgtaatg tcgacgtaaa atcgcgaatt atggatcagt atgctgactg gaaaggcgta 240

cgttatcgtc tgggcggcag cactaaaaaa ggtatcgatt gttctggttt cgtacagcgt 300

acattccgtg agcaatttgg cttagaactt ccgcgttcga cttacgaaca gcaggaaatg 360

ggtaaatctg tttcccgcag taatttgcgt acgggtgatt tagttctgtt ccgtgccggt 420

tcaacgggac gccatgtcgg tatttatatc ggcaacaatc agtttgtcca tgcttccacc 480

agcagtggtg ttattatttc cagcatgaat gaaccgtact ggaagaagcg ttacaacgaa 540

gcacgccggg ttctcagccg cagctaa 567

<210> 6

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggtcaaat ctcaaccgat tttgagatat atcttgcgcg ggattcccgc gattgcagta 60

gcggttctgc tttctgcatg tagtgcaaat aacaccgcaa agaatatgca tcctgagaca 120

cgtgcagtgg gtagtgaaac atcatcactg caagcttctc aggatgaatt tgaaaacctg 180

gttcgtaatg tcgacgtaaa atcgcgaatt atggatcagt atgctgactg gaaaggcgta 240

cgttatcgtc tgggcggcag cactaaaaaa ggtatcgatt gttctggttt cgtacagcgt 300

acattccgtg agcaatttgg cttagaactt ccgcgttcga cttacgaaca gcaggaaatg 360

ggtaaatctg tttcccgcag taatttgcgt acgggtgatt tagttctgtt ccgtgccggt 420

tcaacgggac gccatgtcgg tatttatatc ggcaacaatc agtttgtcca tgcttccacc 480

agcagtggtg ttattatttc cagcatgaat gaaccgtacc ggaagaagcg ttacaacgaa 540

gcacgccggg ttctcagccg cagctaa 567

<210> 7

<211> 622

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgaattatgg atcagtatgc tgactggaaa ggcgtacgtt atcgtctggg cggcagcact 60

aaaaaaggta tcgattgttc tggtttcgta cagcgtacat tccgtgagca atttggctta 120

gaacttccgc gttcgactta cgaacagcag gaaatgggta aatctgtttc ccgcagtaat 180

ttgcgtacgg gtgatttagt tctgttccgt gccggttcaa cgggacgcca tgtcggtatt 240

tatatcggca acaatcagtt tgtccatgct tccaccagca gtggtgttat tatttccagc 300

atgaatgaac cgtaccggaa gaagcgttac aacgaagcac gccgggttct cagccgcagc 360

taataaaccg tttggatgca atcccttggc tatcctgacg agttaactga aagcactgct 420

taggcagtgc ttttttgttt tcattcatca gagaaaatga tgtttccgcg tcttgatcca 480

ggctatagtc cggtcattgt tatcttttaa atgttgtcgt aatttcagga aattaacgga 540

atcatgttca tacgcgctcc caattttgga cgtaagctcc tgcttacctg cattgttgca 600

ggcgtaatga ttgcgatact gg 622

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaccagtct atgaaccgtg gatagatctg c 31

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagcgaacaa aatcgtccag cggtaacg 28

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgattgcagt agcggttctg ctttctg 27

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccggtcagt agtggatttc aggtcg 26

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atatctagag tacgttggcg gtggcgtggg tatg 34

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtgttgctgc cagtcatatt gatttaacgg ctgc 34

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcagccgtta aatcaatatg actggcagca acac 34

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atatctagac ggtgcccagc tcttgcacat tcatcatg 38

<210> 16

<211> 1645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgaatggcg cacagtgggt ggtacatgcg ttgcgggcac agggtgtgaa caccgttttc 60

ggttatccgg gtggcgcaat tatgccggtt tacgatgcat tgtatgacgg cggcgtggag 120

cacttgctat gccgacatga gcagggtgcg gcaatggcgg ctatcggtta tgctcgtgct 180

accggcaaaa ctggcgtatg tatcgccacg tctggtccgg gcgcaaccaa cctgataacc 240

gggcttgcgg acgcactgtt agattccatc cctgttgttg ccatcaccgg tcaagtgtcc 300

gcaccgttta tcggcactga cgcatttcag gaagtggatg tcctgggatt gtcgttagcc 360

tgtaccaagc acagctttct ggtgcagtcg ctggaagagt tgccgcgcat catggctgaa 420

gcattcgacg ttgcctgctc aggtcgtcct ggtccggttc tggtcgatat cccaaaagat 480

atccagttag ccagcggtga cctggaaccg tggttcacca ccgttgaaaa cgaagtgact 540

ttcccacatg ccgaagttga gcaagcgcgc cagatgctgg caaaagcgca aaaaccgatg 600

ctgtacgttg gcggtggcgt gggtatggcg caggcagttc cggctttgcg tgaatttctc 660

gctgccacaa aaatgcctgc cacctgtacg ctgaaagggc tgggcgcagt agaagcagat 720

tatccgtact atctgggcat gctggggatg cacggcacca aagcggcaaa cttcgcggtg 780

caggagtgtg acctgctgat cgccgtgggc gcacgttttg atgaccgggt gaccggcaaa 840

ctgaacacct tcgcgccaca cgccagtgtt atccatatgg atatcgaccc ggcagaaatg 900

aacaagctgc gtcaggcaca tgtggcatta caaggtgatt taaatgctct gttaccagca 960

ttacagcagc cgttaaatca atgactggca gcaacactgc gcgcagctgc gtgatgaaca 1020

ttcctggcgt tacgaccatc ccggtgacgc tatctacgcg ccgttgttgt taaaacaact 1080

gtcggatcgt aaacctgcgg attgcgtcgt gaccacagat gtggggcagc accagatgtg 1140

ggctgcgcag cacatcgccc acactcgccc ggaaaatttc atcacctcca gcggtttagg 1200

taccatgggt tttggtttac cggcggcggt tggcgcacaa gtcgcgcgac cgaacgatac 1260

cgttgtctgt atctccggtg acggctcttt catgatgaat gtgcaagagc tgggcaccgt 1320

aaaacgcaag cagttaccgt tgaaaatcgt cttactcgat aaccaacggt tagggatggt 1380

tcgacaatgg cagcaactgt tttttcagga acgatacagc gaaaccaccc ttactgataa 1440

ccccgatttc ctcatgttag ccagcgcctt cggcatccat ggccaacaca tcacccggaa 1500

agaccaggtt gaagcggcac tcgacaccat gctgaacagt gatgggccat acctgcttca 1560

tgtctcaatc gacgaacttg agaacgtctg gccgctggtg ccgcctggcg ccagtaattc 1620

agaaatgttg gagaaattat catga 1645

<210> 17

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgaatggcg cacagtgggt ggtacatgcg ttgcgggcac agggtgtgaa caccgttttc 60

ggttatccgg gtggcgcaat tatgccggtt tacgatgcat tgtatgacgg cggcgtggag 120

cacttgctat gccgacatga gcagggtgcg gcaatggcgg ctatcggtta tgctcgtgct 180

accggcaaaa ctggcgtatg tatcgccacg tctggtccgg gcgcaaccaa cctgataacc 240

gggcttgcgg acgcactgtt agattccatc cctgttgttg ccatcaccgg tcaagtgtcc 300

gcaccgttta tcggcactga cgcatttcag gaagtggatg tcctgggatt gtcgttagcc 360

tgtaccaagc acagctttct ggtgcagtcg ctggaagagt tgccgcgcat catggctgaa 420

gcattcgacg ttgcctgctc aggtcgtcct ggtccggttc tggtcgatat cccaaaagat 480

atccagttag ccagcggtga cctggaaccg tggttcacca ccgttgaaaa cgaagtgact 540

ttcccacatg ccgaagttga gcaagcgcgc cagatgctgg caaaagcgca aaaaccgatg 600

ctgtacgttg gcggtggcgt gggtatggcg caggcagttc cggctttgcg tgaatttctc 660

gctgccacaa aaatgcctgc cacctgtacg ctgaaagggc tgggcgcagt agaagcagat 720

tatccgtact atctgggcat gctggggatg cacggcacca aagcggcaaa cttcgcggtg 780

caggagtgtg acctgctgat cgccgtgggc gcacgttttg atgaccgggt gaccggcaaa 840

ctgaacacct tcgcgccaca cgccagtgtt atccatatgg atatcgaccc ggcagaaatg 900

aacaagctgc gtcaggcaca tgtggcatta caaggtgatt taaatgctct gttaccagca 960

ttacagcagc cgttaaatca atatgactgg cagcaacact gcgcgcagct gcgtgatgaa 1020

cattcctggc gttacgacca tcccggtgac gctatctacg cgccgttgtt gttaaaacaa 1080

ctgtcggatc gtaaacctgc ggattgcgtc gtgaccacag atgtggggca gcaccagatg 1140

tgggctgcgc agcacatcgc ccacactcgc ccggaaaatt tcatcacctc cagcggttta 1200

ggtaccatgg gttttggttt accggcggcg gttggcgcac aagtcgcgcg accgaacgat 1260

accgttgtct gtatctccgg tgacggctct ttcatgatga atgtgcaaga gctgggcacc 1320

gtaaaacgca agcagttacc gttgaaaatc gtcttactcg ataaccaacg gttagggatg 1380

gttcgacaat ggcagcaact gttttttcag gaacgataca gcgaaaccac ccttactgat 1440

aaccccgatt tcctcatgtt agccagcgcc ttcggcatcc atggccaaca catcacccgg 1500

aaagaccagg ttgaagcggc actcgacacc atgctgaaca gtgatgggcc atacctgctt 1560

catgtctcaa tcgacgaact tgagaacgtc tggccgctgg tgccgcctgg cgccagtaat 1620

tcagaaatgt tggagaaatt atcatga 1647

<210> 18

<211> 719

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtacgttggc ggtggcgtgg gtatggcgca ggcagttccg gctttgcgtg aatttctcgc 60

tgccacaaaa atgcctgcca cctgtacgct gaaagggctg ggcgcagtag aagcagatta 120

tccgtactat ctgggcatgc tggggatgca cggcaccaaa gcggcaaact tcgcggtgca 180

ggagtgtgac ctgctgatcg ccgtgggcgc acgttttgat gaccgggtga ccggcaaact 240

gaacaccttc gcgccacacg ccagtgttat ccatatggat atcgacccgg cagaaatgaa 300

caagctgcgt caggcacatg tggcattaca aggtgattta aatgctctgt taccagcatt 360

acagcagccg ttaaatcaat atgactggca gcaacactgc gcgcagctgc gtgatgaaca 420

ttcctggcgt tacgaccatc ccggtgacgc tatctacgcg ccgttgttgt taaaacaact 480

gtcggatcgt aaacctgcgg attgcgtcgt gaccacagat gtggggcagc accagatgtg 540

ggctgcgcag cacatcgccc acactcgccc ggaaaatttc atcacctcca gcggtttagg 600

taccatgggt tttggtttac cggcggcggt tggcgcacaa gtcgcgcgac cgaacgatac 660

cgttgtctgt atctccggtg acggctcttt catgatgaat gtgcaagagc tgggcaccg 719

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcttgcagat gatcggctat caggcatcct tc 32

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagtgaagag gccgaagaag gcttgctgaa tg 32

<210> 21

<211> 3840

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atggaaaatc aacctaagtt gaatagcagt aaagaagtaa tcgcgtttct ggccgaacgt 60

tttccccact gtttcagtgc ggaaggtgaa gcgcgtccgc tgaaaatcgg tatttttcag 120

gatttggtcg atcgtgttgc tggggaaatg aacctgagca aaacgcaatt gcgatccgct 180

ttacgtctct acacttcgag ctggcgttat ctttacggtg ttaaacccgg cgcaacgcgt 240

gtcgatcttg acggcaaccc atgcggtgag ctggacgagc aacatgtaga gcatgctcgc 300

aagcagcttg aagaagcgaa agcgcgtgtt caggcacagc gtgctgaaca gcaagcgaaa 360

aaacgcgaag ctgccgcaac tgctggtgag aaagaagacg caccgcgccg cgaacgcaag 420

ccacgtccga ctacgccacg ccgcaaagaa ggcgctgaac gtaaacctcg tgcgcaaaag 480

ccggtagaga aagcgccaaa aacagtaaaa gcacctcgcg aagaacagca caccccggtt 540

tctgacattt cagctctgac tgtcggacaa gccctgaagg tgaaagcggg tcaaaacgcg 600

atggatgcca ccgtattaga aatcaccaaa gacggcgtcc gcgtccagct gaattcgggt 660

atgtctttga ttgtgcgcgc agaacacctg gtgttctgaa acggaggccg ggccaggcat 720

gaacatgttt tttaggctta ccgcgttagc tggcctgctt gcaatagcag gccagacctt 780

cgctgtagaa gatatcacgc gtgctgatca aattccggta ttaaaggaag agacgcagca 840

tgcgacggta agtgagcgcg taacgtcgcg cttcacccgt tctcattatc gccagttcga 900

cctcgatcag gcattttcgg ccaaaatctt tgaccgctac ctgaatctgc tcgattacag 960

ccacaacgtg ctgctggcaa gcgatgttga acagttcgcg aaaaagaaaa ccgagttagg 1020

cgatgaactg cgttcaggca aactcgacgt tttctacgat ctctacaatc tggcgcaaaa 1080

gcgccgtttt gagcgttacc agtacgcttt gtcggtactg gaaaagccga tggatttcac 1140

cggcaacgac acttataacc ttgaccgcag caaagcgccc tggccgaaaa acgaggctga 1200

gttgaacgcg ctgtgggaca gtaaagtcaa attcgacgag ttaagcctga agctgacagg 1260

aaaaacggat aaagaaattc gtgaaaccct gactcgccgc tacaaatttg ccattcgtcg 1320

tctggcgcaa accaacagcg aagatgtttt ctcgctggca atgacggcgt ttgcgcgtga 1380

aatcgacccg cataccaact atctttcccc gcgtaatacc gaacagttca acactgaaat 1440

gagtttgtcg ctggaaggta ttggcgcagt gctgcaaatg gatgatgact acaccgttat 1500

caattcgatg gtggcaggtg gtccggcagc gaagagtaaa gctatcagcg ttggtgacaa 1560

aattgtcggt gttggtcaaa caggcaagcc gatggttgac gtgattggct ggcgtcttga 1620

tgatgtggtt gccttaatta aagggccgaa gggcagtaaa gttcgtctgg aaattttacc 1680

tgctggtaaa gggaccaaga cccgtactgt aacgttgacc cgtgaacgta ttcgtctcga 1740

agaccgcgcg gttaaaatgt cggtgaagac cgtcggtaaa gagaaagtcg gcgtgctgga 1800

tattccgggc ttctatgtgg gtttgacaga cgatgtcaaa gtgcaactgc agaaactgga 1860

aaaacagaat gtcagcagcg tcatcatcga cctgcgtagc aatggcggtg gggcgttaac 1920

tgaagccgta tcgctctccg gtctgtttat tcctgcgggt cccattgttc aggtccgcga 1980

taacaacggc aaggttcgtg aagatagcga taccgacgga caggttttct ataaaggccc 2040

gctggtggtg ctggttgacc gcttcagtgc ttcggcttca gaaatctttg ccgcggcaat 2100

gcaggattac ggtcgtgcgc tggttgtggg tgaaccgacg tttggtaaag gcaccgttca 2160

gcaataccgt tcattgaacc gtatttacga tcagatgtta cgtcctgaat ggccagcgct 2220

gggttctgtg cagtacacga tccagaaatt ctatcgcgtt aacggcggca gtacgcaacg 2280

taaaggcgta acgccagaca tcatcatgcc gacgggtaat gaagaaacgg aaacgggtga 2340

gaaattcgaa gataacgcgc tgccgtggga tagcattgat gccgcgactt atgtgaaatc 2400

aggagattta acggcctttg aaccggagct gctgaaggaa cataatgcgc gtatcgcgaa 2460

agatcctgag ttccagaaca tcatgaagga tatcgcgcgc ttcaacgcta tgaaggacaa 2520

gcgcaatatc gtttctctga attacgctgt gcgtgagaaa gagaataatg aagatgatgc 2580

gacgcgtctg gcgcgtttga acgaacgctt taaacgcgaa ggtaaaccgg agttgaagaa 2640

actggatgat ctaccgaaag attaccagga gccggatcct tatctggatg agacggtgaa 2700

tatcgcactc gatctggcga agcttgaaaa agccagaccc gcggaacaac ccgctcccgt 2760

caagtaatat caatcaggca caagaaattg tgcctgattt tttaacagcg acaagatgcc 2820

gtaaatcaga tgctacaaaa tgtaaagttg tgtctttctg gtgacttacg cactatccag 2880

acttgaaaat agtcgcgtaa cccatacgat gtgggtatcg catattgcgt tttgttaaac 2940

tgaggtaaaa agaaaattat gatgcgaatc gcgctcttcc tgctaacgaa cctggccgta 3000

atggtcgttt tcgggctggt actgagcctg acagggatac agtcgagcag cgttcagggg 3060

ctgatgatca tggccttgct gttcggtttt ggtggttcct tcgtttcgct tctgatgtcc 3120

aaatggatgg cattacgatc tgttggcggg gaagtgatcg agcaaccgcg taacgaaagg 3180

gaacgttggc tggtcaatac tgtagcaacc caggctcgtc aggcggggat cgctatgccg 3240

caagtggcta tctaccatgc gccggacatc aacgcttttg caaccggtgc gcgccgtgat 3300

gcctctctgg ttgctgtcag caccggtttg ctgcagaaca tgagcccgga tgaagccgag 3360

gcggtaattg ctcacgaaat cagccacatc gccaatggtg atatggtcac catgacgctg 3420

attcagggcg tggtgaacac cttcgttatc tttatttccc gtattctggc gcagcttgcc 3480

gcgggtttta tgggcggaaa tcgtgatgaa ggtgaagaga gcaacggcaa cccgctgatc 3540

tactttgcgg ttgcaacggt tctggaactg gtgtttggta ttctggcgag cattatcacc 3600

atgtggttct cgcgtcatcg tgaattccat gctgatgccg gttcggcaaa actggttggt 3660

cgcgagaaaa tgattgccgc gctgcagcgc ctgaaaacca gctatgaacc gcaagaagca 3720

accagcatga tggctctctg cattaacggt aagtcgaaat cgctcagtga gttgttcatg 3780

acccacccgc cgctggataa acgaattgaa gctctgcgta cgggtgaata cctgaagtaa 3840

<210> 22

<211> 1104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acacctggtg ttctgaaacg gaggccgggc caggcatgaa catgtttttt gagctgcttc 60

gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcat ttaaatggcg 120

cgccttacgc cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg tattcattaa gcatctgccg 180

acatggaagc catcacaaac ggcatgatga acctgaatcg ccagcggcat cagcaccttg 240

tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg aaaacggggg cgaagaagtt gtccatattg 300

gccacgttta aatcaaaact ggtgaaactc acccagggat tggctgagac gaaaaacata 360

ttctcaataa accctttagg gaaataggcc aggttttcac cgtaacacgc cacatcttgc 420

gaatatatgt gtagaaactg ccggaaatcg tcgtggtatt cactccagag cgatgaaaac 480

gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa cactatccca tatcaccagc 540

tcaccgtctt tcattgccat acgtaattcc ggatgagcat tcatcaggcg ggcaagaatg 600

tgaataaagg ccggataaaa cttgtgctta tttttcttta cggtctttaa aaaggccgta 660

atatccagct gaacggtctg gttataggta cattgagcaa ctgactgaaa tgcctcaaaa 720

tgttctttac gatgccattg ggatatatca acggtggtat atccagtgat ttttttctcc 780

attttagctt ccttagctcc tgaaaatctc gacaactcaa aaaatacgcc cggtagtgat 840

cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc gatcaacgtc tcattttcgc 900

caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac caggatttat ttattctgcg 960

aagtgatctt ccgtcacagg taggcgcgcc gaagttccta tactttctag agaataggaa 1020

cttcggaata ggaactaagg aggatattca tatgtatcaa tcaggcacaa gaaattgtgc 1080

ctgatttttt aacagcgaca agat 1104

<210> 23

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acacctggtg ttctgaaacg gaggccgggc caggcatgaa catgtttttt gagctgcttc 60

gaagttccta 70

<210> 24

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atcttgtcgc tgttaaaaaa tcaggcacaa tttcttgtgc ctgattgata catatgaata 60

tcctccttag ttcctattc 79

<210> 25

<211> 1481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtttctgaca tttcagctct gactgtcgga caagccctga aggtgaaagc gggtcaaaac 60

gcgatggatg ccaccgtatt agaaatcacc aaagacggcg tccgcgtcca gctgaattcg 120

ggtatgtctt tgattgtgcg cgcagaacac ctggtgttct gaaacggagg ccgggccagg 180

catgaacatg ttttttgagc tgcttcgaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc 240

ggaataggaa cttcatttaa atggcgcgcc ttacgccccg ccctgccact catcgcagta 300

ctgttgtatt cattaagcat ctgccgacat ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct 360

gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa 420

cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc 480

agggattggc tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt 540

tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt 600

ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag 660

ggtgaacact atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgt aattccggat 720

gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt 780

tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt 840

gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg 900

tggtatatcc agtgattttt ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa aatctcgaca 960

actcaaaaaa tacgcccggt agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta 1020

cgtgccgatc aacgtctcat tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag 1080

ggacaccagg atttatttat tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtagg cgcgccgaag 1140

ttcctatact ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa ctaaggagga tattcatatg 1200

tatcaatcag gcacaagaaa ttgtgcctga ttttttaaca gcgacaagat gccgtaaatc 1260

agatgctaca aaatgtaaag ttgtgtcttt ctggtgactt acgcactatc cagacttgaa 1320

aatagtcgcg taacccatac gatgtgggta tcgcatattg cgttttgtta aactgaggta 1380

aaaagaaaat tatgatgcga atcgcgctct tcctgctaac gaacctggcc gtaatggtcg 1440

ttttcgggct ggtactgagc ctgacaggga tacagtcgag c 1481

<210> 26

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtttctgaca tttcagctct gactgtcgga caag 34

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gctcgactgt atccctgtca ggctcagtac 30

<210> 28

<211> 551

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gtttctgaca tttcagctct gactgtcgga caagccctga aggtgaaagc gggtcaaaac 60

gcgatggatg ccaccgtatt agaaatcacc aaagacggcg tccgcgtcca gctgaattcg 120

ggtatgtctt tgattgtgcg cgcagaacac ctggtgttct gaaacggagg ccgggccagg 180

catgaacatg ttttttgagc tgcttcgaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc 240

ggaataggaa ctaaggagga tattcatatg tatcaatcag gcacaagaaa ttgtgcctga 300

ttttttaaca gcgacaagat gccgtaaatc agatgctaca aaatgtaaag ttgtgtcttt 360

ctggtgactt acgcactatc cagacttgaa aatagtcgcg taacccatac gatgtgggta 420

tcgcatattg cgttttgtta aactgaggta aaaagaaaat tatgatgcga atcgcgctct 480

tcctgctaac gaacctggcc gtaatggtcg ttttcgggct ggtactgagc ctgacaggga 540

tacagtcgag c 551

<210> 29

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctgtcataaa gttgtcacgg ccgagactta tagtcgcttt gtttttattt tttaatgtat 60

ttgtacatgg agaaaataaa gtgaaacaaa gcactattgc actggcactc ttaccgttac 120

tgtttacccc tgtgacaaaa gcc 143

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aacgctcggt tgccgccggg cgttttttat 30

<210> 31

<211> 1856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gaattcctgt cataaagttg tcacggccga gacttatagt cgctttgttt ttatttttta 60

atgtatttgt acatggagaa aataaagtga aacaaagcac tattgcactg gcactcttac 120

cgttactgtt tacccctgtg acaaaagccg atatccagtt gacccagtcc ccgagctccc 180

tgtccgcctc tgtgggcgat agggtcacca tcacctgcag cgcaagtcag gatattagca 240

actatttaaa ctggtatcaa cagaaaccag gaaaagctcc gaaagtactg atttacttca 300

cctcctctct ccactctgga gtcccttctc gcttctctgg atccggttct gggacggatt 360

tcactctgac catcagcagt ctgcagccag aagacttcgc aacttattac tgtcaacagt 420

atagcaccgt gccgtggacg tttggacagg gtaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg 480

ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgctt 540

ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg 600

ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca 660

gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag 720

tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca 780

ggggagagtg ttaattaaat cctctacgcc ggacgcatcg tggcgagctc ggtacccggg 840

gatctaggcc taacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta ttgttgccga cgcgcatcct 900

gtcataaagt tgtcacggcc gagacttata gtcgctttgt ttttattttt taatgtattt 960

gtacatggag aaaataaagt gaaacaaagc actattgcac tggcactctt accgttactg 1020

tttacccctg tgacaaaagc cgaggttcag ctggtggagt ctggcggtgg cctggtgcag 1080

ccagggggct cactccgttt gtcctgtgca gcttctggct acgacttcac gcactacggt 1140

atgaactggg tccgtcaggc cccgggtaag ggcctggaat gggttggatg gattaacacc 1200

tataccggtg aaccgaccta tgctgcggat ttcaaacgtc gtttcacttt ttctttagac 1260

acctccaaaa gcacagcata cctgcagatg aacagcctgc gcgctgagga cactgccgtc 1320

tattactgtg caaagtaccc gtactattat gggacgagcc actggtattt cgacgtctgg 1380

ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctcg gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 1440

ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 1500

gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 1560

cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgact 1620

gtgccctcta gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 1680

aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cctgtaatta 1740

aatcctctac gccggacgca tcgtggcgag ctcggtaccc ggggatctag gcctaacgct 1800

cggttgccgc cgggcgtttt ttattgttaa ctcatgtttg acagcttatc atcgat 1856

<210> 32

<211> 1033

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gaattcctgt cataaagttg tcacggccga gacttatagt cgctttgttt ttatttttta 60

atgtatttgt acatggagaa aataaagtga aacaaagcac tattgcactg gcactcttac 120

cgttactgtt tacccctgtg acaaaagccg caccctatgc ctccctgaca gagatagagc 180

acctggtgca gagcgtctgc aagtcctaca gggagacatg ccagctgcgg ctggaggacc 240

tgctgcggca gcgctccaac atcttctccc gggaggaagt gactggctac cagaggaagt 300

ccatgtggga gatgtgggaa cggtgtgccc accacctcac cgaggccatt cagtacgtgg 360

tggagttcgc caagaggctc tcaggcttta tggagctctg ccagaatgac cagattgtgc 420

ttctcaaagc aggagcaatg gaagtggtgc tggttaggat gtgccgggcc tacaatgctg 480

acaaccgcac ggtctttttt gaaggcaaat acggtggcat ggagctgttc cgagccttgg 540

gctgcagcga gctcatcagc tccatctttg acttctccca ctccctaagt gccttgcact 600

tttccgagga tgagattgcc ctctacacag cccttgttct catcaatgcc catcggccag 660

ggctccaaga gaaaaggaaa gtagaacagc tgcagtacaa tctggagctg gcctttcatc 720

atcatctctg caagactcat cgccaaagca tcctggcaaa gctgccaccc aaggggaagc 780

ttcggagcct gtgtagccag catgtggaaa ggctgcagat cttccagcac ctccacccca 840

tcgtggtcca agccgctttc cctccactct acaaggagct cttcagccat catcatcatc 900

atcatcatca ttgattaaat cctctacgcc ggacgcatcg tggcgagctc ggtacccggg 960

gatctaggcc taacgctcgg ttgccgccgg gcgtttttta ttgttaactc atgtttgaca 1020

gcttatcatc gat 1033

<210> 33

<211> 1720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gaattcctgt cataaagttg tcacggccga gacttatagt cgctttgttt ttatttttta 60

atgtatttgt acatggagaa aataaagtga aacaaagcac tattgcactg gcactcttac 120

cgttactgtt tacccctgtg acaaaagccg caccctatgc ctccctgaca gagatagagc 180

acctggtgca gagcgtctgc aagtcctaca gggagacatg ccagctgcgg ctggaggacc 240

tgctgcggca gcgctccaac atcttctccc gggaggaagt gactggctac cagaggaagt 300

ccatgtggga gatgtgggaa cggtgtgccc accacctcac cgaggccatt cagtacgtgg 360

tggagttcgc caagaggctc tcaggcttta tggagctctg ccagaatgac cagattgtgc 420

ttctcaaagc aggagcaatg gaagtggtgc tggttaggat gtgccgggcc tacaatgctg 480

acaaccgcac ggtctttttt gaaggcaaat acggtggcat ggagctgttc cgagccttgg 540

gctgcagcga gctcatcagc tccatctttg acttctccca ctccctaagt gccttgcact 600

tttccgagga tgagattgcc ctctacacag cccttgttct catcaatgcc catcggccag 660

ggctccaaga gaaaaggaaa gtagaacagc tgcagtacaa tctggagctg gcctttcatc 720

atcatctctg caagactcat cgccaaagca tcctggcaaa gctgccaccc aaggggaagc 780

ttcggagcct gtgtagccag catgtggaaa ggctgcagat cttccagcac ctccacccca 840

tcgtggtcca agccgctttc cctccactct acaaggagct cttcagcatt gaaggtagaa 900

tggatccaaa gtcctgcgac aagacccaca cctgcccccc ttgccctgct ccagagctgc 960

tgggcggccc ctccgtgttt ctgttccccc ccaagcctaa ggacaccctg atgatctccc 1020

gcaccccaga ggtgacctgc gtggtggtgg acgtgtccca cgaggaccca gaggtgaagt 1080

tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc acaatgctaa gaccaagcct cgggaggagc 1140

agtacaacag cacctatcgc gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga 1200

atggcaagga gtacaagtgt aaggtgagca acaaggctct gccagctcca atcgagaaga 1260

ccatctccaa ggctaagggc cagcctcgcg agccacaggt gtataccctg cctcctagcc 1320

gggacgagct gaccaagaat caggtgtctc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccat 1380

ccgacatcgc tgtggagtgg gagagcaacg gccagcctga gaacaactat aagaccaccc 1440

ctccagtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaagt 1500

ctagatggca gcagggcaac gtgttcagct gttctgtgat gcacgaggct ctgcacaacc 1560

actacaccca gaagtctctg tctctgtctc caggcaagtg attaaatcct ctacgccgga 1620

cgcatcgtgg cgagctcggt acccggggat ctaggcctaa cgctcggttg ccgccgggcg 1680

ttttttattg ttaactcatg tttgacagct tatcatcgat 1720

Claims

1.一种高表达外源蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建表达载体，所述表达载体中包括有目的基因表达框序列；所述目的基因表达框序列两端为酶切位点，中间依次连接有启动子、目的基因序列和终止子；所述启动子为phoA启动子，包括核心启动子和编码信号肽的基因；

所述phoA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述终止子的核苷酸序列如SEQID NO.30所示；

（2）将构建得到的表达载体转化入用于高表达外源蛋白的大肠杆菌中，发酵培养，即得；

所述大肠杆菌在E. coli strain W3110的基础上缺失prc基因，并携带突变的spr基因和突变的ilvG基因；

所述突变的spr基因序列如SEQ ID NO.6所示；

所述突变的ilvG基因序列如SEQ ID NO.17所示；

所述E. coli strain W3110，其基因型为：tonA ptr3 △phoA△E15△(argF-lac)169degP41△ompT kan^R。

2.根据权利要求1所述的高表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述大肠杆菌的基因型为tonA ptr3△phoA△E15△(argF-lac)169 degP41△ompT kan^R△prc sprW174R ilvG⁺2096。

3.根据权利要求1或者2所述的高表达外源蛋白的方法，其特征在于，用于高表达外源蛋白的大肠杆菌的构建方法包括以下步骤：

（1）将大肠杆菌的spr基因的编码174位色氨酸的序列突变为编码精氨酸的序列，即得携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R；

（2）在ilvG基因的981bp位置插入“TA”两个碱基，即得携带突变的ilvG基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R/ilvGta；

（3）敲除prc基因。

4.根据权利要求3所述的高表达外源蛋白的方法，其特征在于，步骤（1）所述的将大肠杆菌的spr基因的编码174位色氨酸的序列突变为编码精氨酸的序列的方法为：通过基因打靶技术，将突变的spr基因整合到所述大肠杆菌的基因组中；和/或

步骤（2）所述的在ilvG基因的981bp位置插入“TA”两个碱基的方法为：通过基因打靶技术，将突变的ilvG基因整合到所述大肠杆菌的基因组中。

5.根据权利要求4所述的高表达外源蛋白的方法，其特征在于，所述将突变的spr基因整合到所述大肠杆菌的基因组中，步骤包括：

构建打靶载体：将含有突变的spr基因的打靶序列与pCVD442质粒通过XbaI酶切位点连接，得打靶载体pCVD442-spr；

制备供体菌株：将所述打靶载体pCVD442-spr转化入大肠杆菌β2155菌株，得供体菌株β2155/pCVD442-spr；

将所述供体菌株β2155/pCVD442-spr与受体菌株大肠杆菌E. coli strain W3110混合，培养、筛选，即得携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R；和/或

所述含有突变的spr基因的打靶序列，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示的引物，以大肠杆菌E. coli strain W3110的基因组DNA为模板，PCR扩增得到。

6.根据权利要求4所述的高表达外源蛋白的方法，其特征在于，将所述突变的ilvG基因整合到所述大肠杆菌的基因组中，步骤包括：

构建打靶载体：将含有突变的ilvG基因的打靶序列与pCVD442质粒通过XbaI酶切位点连接，得打靶载体pCVD442-ilvG；

制备供体菌株：将所述打靶载体pCVD442-ilvG转化入大肠杆菌β2155菌株，得供体菌株β2155/pCVD442-ilvG；

将所述供体菌株β2155/pCVD442-ilvG与受体菌株携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R混合，培养、筛选，即得携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R/ilvGta；和/或

所述含有突变的ilvG基因的打靶序列，通过核苷酸序列如SEQ ID NO.12~ SEQ IDNO.15的引物，以步骤（1）中所述的携带突变的spr基因的大肠杆菌BAT47/sprW174R的基因组DNA为模板，PCR扩增得到。

7.根据权利要求4至6任一项所述的高表达外源蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）所述的敲除prc基因，步骤包括：

将大肠杆菌基因组中的prc基因替换为两侧带有FRT位点的抗性基因片段，通过定向重组删除抗性基因，即得用于高表达外源蛋白的大肠杆菌；

所述两侧带有FRT位点的抗性基因片段中由以下方法制备得到：

设计引物prc-F和prc-R，以pKD3质粒为模板，扩增得两侧各带有一个FRT位点的抗性基因片段；

所述prc-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述prc-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.24所示。