ES2612545T3

ES2612545T3 - Sistema de expresión del operón melibiosa

Info

Publication number: ES2612545T3
Application number: ES05817790.8T
Authority: ES
Inventors: Johann Brass; Joachim Klein; Ralf Ostendorp; Armin Weidmann
Original assignee: Lonza AG; Morphosys AG
Current assignee: Lonza AG; Morphosys AG
Priority date: 2004-12-07
Filing date: 2005-12-05
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2025-12-05
Also published as: AU2005313530A1; HK1115155A1; IL183609A; CN101090963B; WO2006061173A3; US20080305526A1; CA2589823A1; PL1824961T3; CN101090963A; EP1824961B1; AU2005313530B2; US20120077225A1; JP5080269B2; EP1824961A2; DK1824961T3; IL183609A0; WO2006061173A2; JP2008522598A; US8735099B2; CA2589823C

Abstract

Un vector expresable en un huésped que comprende el promotor melAB del operón melibiosa unido operativamente a una unidad transcripcional que comprende una secuencia de ácido nucleico que es heteróloga a dicho huésped y una secuencia señal operativamente unida a dicha secuencia de ácido nucleico y que codifica un péptido señal seleccionado del grupo que consiste en los péptidos señal de E. coli LamB, MalE, OmpA y PhoA, en donde la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicho promotor melAB y en donde dicho promotor melAB es deficiente en el sitio de unión CRP1

Description

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de ácido nucleico de interés es más preferiblemente de otra clase, como la gammaproteobacteria tal como, por ejemplo, Burkholderia sp., en particular de un filo diferente, tal como bacterias archae, y más en particular de un organismo eucariota, tal como mamíferos, en particular, seres humanos. Sin embargo, la secuencia de ácido nucleico heteróloga podría modificarse de acuerdo con el "uso de codones" del huésped. La secuencia heteróloga de acuerdo con la presente invención es por lo general un gen de interés. El gen de interés codifica preferiblemente un polipéptido heterólogo tal como una proteína estructural, reguladora o terapéutica, o fusiones N-o C-terminales de la proteína estructural, reguladora o terapéutica con otras proteínas ("Marcadoras") tales como la proteína verde fluorescente u otras proteínas de fusión. La secuencia de ácido nucleico heteróloga puede codificar también una transcripción que puede ser utilizada en forma de ARN, tal como, por ejemplo, ARN antisentido.

La proteína puede ser producida como un agregado insoluble o como una proteína soluble que está presente en el citoplasma o en el espacio periplásmico de la célula huésped, y/o en el medio extracelular. Preferiblemente, la proteína se produce como una proteína soluble que está presente en el espacio periplásmico de la célula huésped y/o en el medio extracelular. Ejemplos de proteínas incluyen hormonas tales como la hormona del crecimiento, factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico, sustancias analgésicas como la encefalina, enzimas como la quimotripsina, anticuerpos, receptores a hormonas e incluye además las proteínas por lo general usadas como marcadores de visualización, por ejemplo, la proteína fluorescente verde.

Otras proteínas de interés son los receptores del factor de crecimiento (por ejemplo, FGFR, PDGFR, EFG, NGFR, y VEGF) y sus ligandos. Otras proteínas son los receptores de la proteína G e incluyen el receptor de la sustancia K, el receptor de la angiotensina, receptores [alfa] -y [beta]-adrenérgicos, los receptores de serotonina, y el receptor de PAF (véase, por ejemplo, Gilman, Ann. Rev. Biochem. 56, 625-649 (1987). Otras proteínas incluyen los canales de iones (por ejemplo, los canales de calcio, sodio, potasio), los receptores muscarínicos, los receptores de acetilcolina, los receptores de GABA, receptores de glutamato, y los receptores de dopamina (véase Harpold, patentes de EE.UU. Nos. 5.401.629 y 5.436.128). Otras proteínas de interés son las proteínas de adhesión, tales como las integrinas, selección y miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas (véase Springer, Nature 346, 425-433 (1990). Osborn, Cell 62, 3 (1990); Hynes, Cell 69, 11 (1992)). Otras proteínas son las citocinas, tales como las interleucinas IL-1 a IL-13, factores de necrosis tumoral [alfa] y [beta], interferones [alfa], [beta] y [gamma], factor de crecimiento tumoral beta (TGF [beta ]), factor estimulante de colonias (CSF) y factor estimulante de colonias de monocitos granulocitos (GM-CSF) (véase citoquinas humanas: Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research. Aggrawal et al. eds., Blackwell Scientific, Boston, Mass. 1991). Otras proteínas de interés son los mensajeros intracelulares e intercelulares, tales como, la adenil ciclasa, guanil ciclasa, y fosfolipasa C. Los fármacos son también proteínas de interés. La proteína heteróloga de interés puede ser de origen humano, de mamífero o procariótico. Otras proteínas son antígenos, tales como las glicoproteínas y los carbohidratos de patógenos microbianos, tanto virales como bacterianos, y de tumores. Otras proteínas son enzimas como la quimosina, proteasas, las polimerasas, deshidrogenasas, nucleasas, glucanasas, oxidasas, α-amilasa, oxidorreductasas, lipasas, amidasas, nitrilo hidratasas, esterasas o nitrilasas.

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico heteróloga, según la presente invención, codifica un polipéptido, más preferiblemente un anticuerpo y más preferiblemente un fragmento Fab. En particular, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, más particularmente un fragmento Fab humano se codifica por la secuencia de ácido nucleico. El fragmento Fab humano codificado por la secuencia de ácido nucleico es preferiblemente o bien un fragmento de anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo humano que fue injertado con al menos una CDR de otra especie de mamífero. En una realización más preferida, el fragmento Fab humano es un HuCAL-Fab completamente humano obtenible a partir de una biblioteca artificial, basado en el consenso-marco de anticuerpo humano de fago que se asignó al azar artificialmente en el CDR como se describe por Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296 (1), 57-86. En otra realización opcional más preferida, el fragmento Fab humano opcionalmente quimérico, CDR injertado, es un no-HuCAL-Fab en contraposición a la definición de HuCAL-Fab en lo anterior, que en el caso de un fragmento Fab completamente humano preferiblemente significa que no comparte el marco secuencia de consenso HuCAL pero sus porciones de secuencia no CDR son al menos 70%, más preferiblemente 85%, más preferiblemente 95% idénticas en secuencia de aminoácidos a las secuencias codificadas de la línea germinal de las cadenas ligeras y pesadas constantes y variables respectivas, además, y más preferiblemente que sus CDRs se obtienen directamente de secuencias genómicas de origen natural de células linfoides que incluyen eventos de maduración de afinidad genómica.

El fragmento Fab se deriva preferiblemente de un anticuerpo IgG y no contiene residuos de cisteína que formen los dos enlaces disulfuro entre cadenas entre las dos cadenas pesadas en la inmunoglobulina intacta. En particular, la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo o preferiblemente del fragmento Fab se codifican por una unidad transcripcional dicistrónica, mientras que cada cadena está unida operativamente a una secuencia señal y una región de iniciación de la traducción idéntica aguas arriba del punto de iniciación de la traducción de la unidad transcripcional. En una realización preferida, la región de iniciación de traducción consiste en la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID. NO 2).

En la presente invención, el orden y la distancia en la que la secuencia señal y la secuencia de ácido nucleico heteróloga están dispuestas dentro de los vectores de expresión se puede variar. En realizaciones preferidas, la secuencia señal está 5' (aguas arriba) respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica, por ejemplo, el polipéptido de interés. La secuencia del péptido señal y la secuencia de ácido nucleico que codifica, por ejemplo, el

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polipéptido de interés se puede separar de cero a aproximadamente 1000 aminoácidos. En realizaciones preferidas, la secuencia del péptido señal y la secuencia del ácido nucleico que codifica, por ejemplo, el polipéptido de interés están directamente adyacentes entre sí, es decir, separados por cero ácidos nucleicos.

Preferiblemente, la región promotora y la unidad transcripcional unida operativamente del vector de la presente invención consisten en la secuencia de SEQ ID NO. 3, o una secuencia complementaria de la misma.

Más preferiblemente, la región promotora y la unidad transcripcional unida operativamente del vector de la presente invención consisten en la secuencia SEQ ID NO. 4 o una secuencia complementaria de la misma.

También abarcado por la presente invención está el uso de un vector de acuerdo con la invención para la expresión heteróloga regulada de una secuencia de ácido nucleico en un huésped procariota. La expresión puede ser regulada por la cantidad de melibiosa disponible para el huésped procariota. Por lo general, la cantidad de melibiosa en el medio del huésped procariota cultivado está entre 0,01 y 100 g/l, preferiblemente entre 0,1 y 10 g/l, más preferiblemente entre 1 y 5 g/l.

Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico heteróloga codifica para un polipéptido, más preferiblemente para un anticuerpo y más preferiblemente para un fragmento Fab, mientras que las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o el fragmento Fab se expresan en cantidades iguales, lo que conduce a altas concentraciones de anticuerpo funcional o fragmento Fab. En particular, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, más particularmente un fragmento Fab humano, más particularmente un fragmento Fab humano como se describe anteriormente se codifica por la secuencia de ácido nucleico heteróloga.

Con el fin de obtener altas concentraciones de anticuerpo funcional o fragmento Fab, es esencial tener una cantidad igual de las cadenas pesadas y ligeras que se expresan. En el caso de que una de ambas cadenas se produzca en exceso en comparación con la otra cadena, se pueden construir agregados inmunoreactivos no reducibles de alto peso molecular, lo cual es indeseable. Sorprendentemente, se ha encontrado que con los vectores de la presente invención se pueden obtener altos títulos de anticuerpos funcionales, mientras que sólo se construyen cantidades muy bajas de la cadena pesada o ligera que se producen en exceso o de agregados inmunoreactivos de alto peso molecular. Por lo general, menos del 20%, preferiblemente menos del 10% de la cantidad expresada del anticuerpo

: o fragmento Fab se expresan como cadena pesada o ligera que se produce en exceso o agregados inmunoreactivos de alto peso molecular. La cantidad de las cadenas pesada y ligera en sobreproducción y de agregados inmunoreactivos de alto peso molecular se puede medir mediante el análisis de extractos del huésped que expresan el anticuerpo o el fragmento Fab tal como extractos de lisozima de la célula huésped cultivada utilizando SDS-PAGE

: o transferencia Western.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada y purificada expresable en un huésped que comprende el promotor melAB del operón melibiosa unido operativamente a una unidad transcripcional que comprende una secuencia de ácido nucleico que es heteróloga a dicho huésped, y una secuencia señal operativamente unida a dicha secuencia de ácido nucleico y que codifica un péptido señal seleccionado del grupo que consiste en los péptidos señal de E. coli LamB, MalE, OmpA y PhoA, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicho promotor melAB del operón melibiosa y en el que el promotor melAB es deficiente en el sitio de unión CRP1. La secuencia de ácido nucleico aislada y purificada más preferida consiste en SEQ ID NO. 1, una secuencia complementaria de la misma. En particular, la secuencia de ácido nucleico aislada y purificada consiste en SEQ ID NO. 3, una secuencia complementaria de la misma. Más particularmente, la secuencia de ácido nucleico aislada y purificada consiste en SEQ ID NO. 4 o una secuencia complementaria de la misma. La secuencia de ácido nucleico aislada y purificada de esta invención se puede aislar de acuerdo con protocolos de PCR estándar y métodos bien conocidos en la técnica. Dicha secuencia de ADN purificada y aislada puede comprender además una o más secuencias reguladoras, como se conoce en la técnica, por ejemplo, un potenciador, usualmente empleado para la expresión del producto codificado por la secuencia de ácido nucleico.

Con el fin de seleccionar las células huésped con éxito y transformadas de manera estable con el vector o la secuencia de ácido nucleico aislada y purificada de la presente invención, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, con resistencia a antibióticos) se puede introducir en las células huésped junto con la secuencia de ácido nucleico de interés. El gen que codifica un marcador seleccionable puede estar ubicado en el vector o en la secuencia de ácido nucleico aislada y purificada o puede opcionalmente ser co-introducido en forma separada, por ejemplo, en un vector separado. Varios marcadores de selección se pueden utilizar incluyendo aquellos que confieren resistencia a los antibióticos, tales como higromicina, ampicilina y tetraciclina. La cantidad del antibiótico se puede adaptar como se desee con el fin de crear condiciones selectivas. Por lo general, se utiliza un marcador seleccionable. También se pueden introducir genes indicadores así como proteínas fluorescentes en las células huésped junto con la secuencia de ácido nucleico de interés, con el fin de determinar la eficiencia de la transformación.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un huésped procariótica transformado con un vector de la presente invención. En una realización particular de la invención, el huésped procariota se transforma con el plásmido pBLL15 o el plásmido pAKL15E, preferiblemente con el plásmido pAKL15E que comprende dos región de

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codificación diferentes en su casete de expresión dicistrónico para la expresión de una proteína heterodimérica secretada en dicha célula huésped tal como, por ejemplo, un Fab. Preferiblemente, dicha proteína heterodimérica es un Fab. En otra realización de la invención, el huésped procariota se transforma con una secuencia de ácido nucleico aislada y purificada de la presente invención.

Una amplia variedad de células huésped procariotas son útiles en la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas de la presente invención. Estos huéspedes pueden incluir cepas de células Gram-negativas tales como E. coli y Pseudomonas, o células Gram postiva tales como Bacillus y Streptomyces. Preferiblemente, la célula huésped es una célula Gram-negativa, más preferiblemente una célula de E. coli. Las E. coli que se pueden usar son, por ejemplo las cepas TG1, W3110, DH1, XL1-Blue y Origami, que están disponibles comercialmente o se pueden obtener a través de la DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania). Lo más preferiblemente, se utiliza W3110. La célula huésped puede o no puede metabolizar melibiosa. Una célula huésped que es normalmente capaz de la absorción y de metabolizar melibiosa como E. coli podría modificarse para ser deficiente en una o más funciones relacionadas con la absorción y/o el metabolismo de la melibiosa. La deficiencia de una o más funciones relacionadas con la absorción y/o el metabolismo de melibiosa pueden lograrse, por ejemplo, por la supresión o el bloqueo de la expresión de un gen que codifica una proteína relacionada con la absorción y/o el metabolismo de melibiosa, tal como el gen melA que codifica para alfa-galactosidasa. Esto se puede hacer mediante técnicas conocidas tales como mutagénesis de transposón o mutación knock-out. Por lo general, el huésped procariota corresponde a las secuencias de señal elegidas, por ejemplo, en caso de que se utilicen las secuencias de señal de E. coli, la célula huésped es usualmente un miembro de la misma familia de la enterobacteria, más preferiblemente la célula huésped es una cepa de E. coli.

Además se proporciona con la presente invención un método para producir un polipéptido en una célula huésped, que comprende las etapas de:

a) construir un vector,

b) transformar un huésped procariota con dicho vector,

c) permitir la expresión de dicho polipéptido en un sistema de cultivo celular en condiciones adecuadas,

d) recuperar dicho polipéptido a partir del sistema de cultivo celular.

El vector utilizado, así como su construcción y la transformación de un huésped procariota son como se definen anteriormente, mientras que la secuencia heteróloga de ácido nucleico que se comprende por el vector codifica un polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido producido es un anticuerpo y más preferiblemente un fragmento Fab, mientras que las cadenas pesada y ligera del anticuerpo o el fragmento Fab se expresan en el sistema de cultivo celular en cantidades iguales, lo que conduce a altas concentraciones de anticuerpo funcional o fragmento Fab.

Como sistema de cultivo celular, un cultivo continuo o un cultivo discontinuo, tal como un cultivo en lote o cultivo discontinuo alimentado se pueden aplicar en tubos de cultivo, matraces de agitación o fermentadores bacterianos. Las células huésped son por lo general cultivadas en medios convencionales como se conoce en la técnica, tales como medios complejos como "medio de levadura de caldo nutritivo" o un glicerol que contiene medio como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65 o un medio de sal mineral como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1. El medio preferido para llevar a cabo la expresión de dicho polipéptido es un medio que contiene glicerol, más preferiblemente el medio descrito por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39,59-65.

El medio podría modificarse como sea apropiado, por ejemplo, mediante la adición de ingredientes adicionales tales como tampones, sales, vitaminas o aminoácidos. También se pueden utilizar diferentes medios o combinaciones de medios durante el cultivo de las células. Preferiblemente, el medio utilizado como medio básico no debe incluir melibiosa, con el fin de lograr una regulación estricta de la región promotora de melibiosa. La melibiosa generalmente se añade después de que el cultivo ha alcanzado una DO600 apropiada dependiendo del sistema de cultivo. Por lo general, la cantidad de melibiosa en el medio del huésped procariota cultivado está entre 0,01 y 100 g/l, preferiblemente entre 0,1 y 10 g/l, más preferiblemente 1 y 5 g/l. Para el cultivo por lotes el OD600 usual es usualmente 0,4 o más alto. Intervalos de pH apropiados son, por ejemplo, 6-8, preferiblemente 7-7,5, las temperaturas de cultivo apropiadas están entre 10 y 40, preferiblemente entre 20 y 37°C. Las células se incuban por lo general tanto tiempo como sea necesario hasta que la máxima cantidad de producto expresado se ha acumulado, preferiblemente entre 1 hora y 20 días, más preferiblemente entre 5 horas y 3 días. La cantidad de producto expresado depende del sistema de cultivo utilizado. En un cultivo de matraz de agitación se puede producir normalmente un producto expresado en la cantidad de 0,5 g/l de medio de cultivo con un huésped transformado con el vector de la presente invención. Usando un cultivo de fermentador en un lote y/o modo de alimentación por lotes se puede obtener el producto expresado en una cantidad de, por lo general, más de 0,5 g/l de caldo de fermentación, preferiblemente más de 1 g/l, más preferiblemente más de 1,3 g/l.

Después de la expresión en la célula huésped, el producto expresado, tal como el polipéptido de interés puede entonces recuperarse a partir del cultivo de células huésped. Cuando el polipéptido de interés son cadenas de inmunoglobulina, la cadena pesada y la cadena ligera son normalmente cada una expresadas en la célula huésped y

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(El sitio de unión para CRP2 se resalta en color gris claro y los sitios de unión para MelR se resaltan en negro)

Los fragmentos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se aislaron mediante el kit de extracción por gel de QiaexII de Qiagen (Hilden, Alemania). Los fragmentos aislados se cortaron con ClaI y AflII y se ligaron a pBW22 ClaI/AFII-corte (Wilms et al., 2001, Biotechnology and Bioengineering, 73 (2), 95-103). El plásmido resultante que contiene el promotor melAB2 consiste en la secuencia SEQ ID NO. 1 (pBLL7) que se muestra en la figura 1. Los plásmidos resultantes que contienen el promotor prp (pBLL5) y el promotor gutA (pBLL6) son idénticos a excepción de la región del promotor ligado. La secuencia de los fragmentos promotores insertados se confirmó por secuenciación (Microsynth GmbH, Balgach, Suiza).

Ejemplo 2

Construcción de los plásmidos de expresión del Fragmento Fab

Como una alternativa a un promotor lac inducible por IPTG (plásmido pMx9-HuCAL-Fab-H, Knappik et al., 1985, Gene 33, 103-119), se analizaron diferentes sistemas de expresión regulados positivamente por su capacidad para producir fragmentos de anticuerpos Fab-H. El fragmento Fab-H fue amplificado fuera del plásmido pMx9-HuCALFab-H por PCR utilizando los cebadores Fab-5 (5'-aaa cat atg aaa aag aca gct atc-3') y Fab-3 (5'-aaa aag ctt tta tca gct ttt cgg ttc-3'). El fragmento de PCR se cortó con NdeI y HindIII y se insertó en pBW22 NdeI/HindIII-corte para crear el plásmido pBW22-Fab-H que contiene el promotor rhaBAD L ramnosa-inducible (Volff et al., 1996, Mol. Microbiol. 21,1037-1047). El mismo fragmento de PCR se insertó en los diferentes plásmidos de expresión con promotores inducibles. Los plásmidos de expresión pBLL15 resultantes (putativos) que contienen Fab-H y el promotor melAB2 (SEQ ID NO. 3) se muestran en la figura. 2. Se obtuvieron plásmidos equivalentes que contenían el promotor prp (pBLL13) y el promotor gutA (pBLL14). La secuencia del inserto Fab-H del plásmido pBW22-Fab-H fue confirmada por secuenciación.

Ejemplo 3

Expresión del fragmento Fab

La cepa W3110 (DSM 5911, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania) se transformó con los diferentes plásmidos de expresión. Los plásmidos se aislaron a partir de los clones que resultaron de las diferentes transformaciones y se controlaron a través de análisis de restricción. Excepto el plásmido pBLL14, todos los plásmidos tuvieron el patrón de restricción esperado. El plásmido pBLL14 re-aislado mostró un tamaño y patrón de restricción alterado que fue sugerido que era debido a eventos de recombinación. Por lo tanto, la cepa W3110 (pBLL14) no fue probada en los siguientes ensayos. Las cepas restantes fueron probadas por su capacidad de secretar fragmentos de anticuerpos Fab-H plegados activamente. Esta prueba de la productividad se realizó, como se describe en el ejemplo 4. Los siguientes inductores se añadieron a una concentración de 0,2%

pBW22-Fab-H monohidrato de L (+) -ramnosa

pBLL13 propionato de sodio

pBLL15 monohidrato de D (+) -Melibiosa

monohidrato de D (+) -rafinosa

D (+) -galactosa

Los resultados de los experimentos de hibridación en mancha se muestran en la figura 3.

Las cepas inducidas por de L-ramnosa y melibiosa W3110 (pBW22-Fab-H) y W3110 (pBLL15) mostraron prometedores resultados de la hibridación en mancha: el aumento de las señales con el tiempo y casi ninguna actividad de fondo. La porción de los fragmentos de anticuerpos plegados activamente se cuantificó a través de ELISA. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1: Resultados de ELISA de los derivados W3110 con los diferentes plásmidos de expresión. El tiempo después de la inducción se indica. Se midieron los cultivos no inducidos después de 22 ó 25 h como controles no inducidos y los resultados de la cepa W3110 (pMx9-HuCAL-Fab-H) y TG1F'-(pMx9-HuCAL-Fab-H) se utilizan como referencias. La concentración de Fab-H se da en mg/100 OD/L (n.d. no determinado) 5

plásmido: inductor 8 h 11,5/12 h 22/25 h 22/25 h

inducido: no inducido

en TG1F'

pMx9-HuCAL-Fab-H: IPTG nd Nd 68,64 84.56

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plásmido: inductor 8 h 11,5/12 h 22/25 h 22/25 h

en W3110

pMx9-HuCAL-Fab-H: IPTG nd Nd 140,56 8,14

pBW22-Fab-H: ramnosa 176,88 259,56 328,62 6,52

pBLL13: propionato nd 0,84 0,90 3,94

pBLL15: melibiosa 2,89 145,10 504,28 4,28

Todas las cepas crecieron bien sin ninguna inhibición de crecimiento en presencia o ausencia del inductor correspondiente hasta DO600 entre 4 y 6. Los plásmidos de expresión pBW22-Fab-H y pBLL15 llevaron a los títulos más altos de fragmentos de anticuerpos después de la inducción durante la noche. La cepa inducida por melibiosa W3110 (pBLL15) mostró un aumento retardado en la formación de fragmentos de anticuerpos activos en comparación con el sistema inducido por L-ramnosa (pBW22-Fab-H).

La cepa inducible por L-ramnosa W3110 (pBW22-Fab-H) se ensayó en el Sistema de Control de la Actividad de Respiración (RAMOS, ACBiotec, Jülich, Alemania), un sistema de medición novedoso para la determinación en línea de actividades de respiración en matraces de agitación. En comparación con el experimento del matraz de agitación normal, el título de anticuerpos (que se midió a través de ELISA) se duplicó (703,64 mg/L/100 DO600 después de 23 h de inducción). El crecimiento optimizado utilizando el equipo RAMOS favorece la producción de fragmentos de anticuerpos activos.

Ejemplo 4

Inducción de melibiosa en matraces de agitación

Se ensayó W3110 de E. coli que lleva el plásmido pBLL15 para determinar su capacidad de producir fragmentos de anticuerpos Fab-H plegados activamente. Se diluyeron (1:50) cultivos de una noche [en medio NYB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio) suplementado con 100 g/ml de ampicilina, 37°C.] en 20 ml de medio de glicerol fresco (como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65, mientras que se utilizó la solución de vitaminas, como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1 y se incubó a 30°C. Se añadió melibosa (0,2%) cuando los cultivos alcanzaron una DO600 de aproximadamente 0,4. Se tomaron muestras (1 ml) a diferentes intervalos de tiempo, se centrifugaron y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Las células congeladas fueron lisadas de acuerdo con el tratamiento con lisozima descrito anteriormente y los sobrenadantes se analizaron en hibridación en mancha y ensayos ELISA. Se obtuvieron 504,28 mg/L/100 DO600 de fragmentos de anticuerpos Fab-H funcionales.

Ejemplo 5

Ocurrencia de agregados de alto peso molecular

Con el fin de averiguar si se producen agregados de alto peso molecular, se llevó a cabo la transferencia Western de extractos de cepa W3110 (pBLL15), la cual mostró el título de anticuerpos más alto (Tabla 1), utilizando el conjugado de Fab-H + AP anti-humano. El cultivo se realizó como se describe en el ejemplo 4. Las muestras fueron tomadas después de 9, 12 y 23 horas después de la inducción con melibiosa. La transferencia Western de extractos de lisozima de las cepas W3110 (pBLL15) utilizando el conjugado de Fab-H + AP anti-humano se muestra en la figura

4. Las concentraciones más bajas de los agregados de alto peso molecular corresponden a los títulos más altos de los fragmentos de anticuerpos funcionales. La elección del sistema de expresión parece influir en la manera en que se forman los fragmentos de anticuerpo: funcional o en agregados.

Ejemplo 6

Influencia de los péptidos señal

Se utilizó la base de datos del genoma de E. coli para buscar los péptidos señal útiles que podrían ser utilizados en combinación con los fragmentos de Fab-H VL3-CL y VH-CH. Se eligieron las secuencias señal de las proteínas periplásmicas de unión para azúcares, aminoácidos, vitaminas e iones. Estas proteínas periplásmicas representan un grupo relativamente homogéneo que ha sido más ampliamente estudiado que otras proteínas periplásmicas. Puesto que son generalmente abundantes sus secuencias señal tienen que asegurar un transporte eficiente a lo largo de la membrana interna en el periplasma. Todas las combinaciones posibles del péptido señal Fab se comprobaron por su probabilidad del péptido de secuencia y del sitio de escisión utilizando el servidor web SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/#submission) como se muestra en la siguiente Tabla 2.

Péptido señal Probabilidad del Probabilidad del sitio de péptido señal escisión max

OmpA (E. coli) -proteína de la membrana

externa precursora

MKKTA IAIAV ALAGF ATVAQ A: APKDN (OmpA) 1,000 0,993

MKKTA IAIAV ALAGF ATVAQ A: DIELT (OmpA 1,000 0,971

VL3-CL, Fab-H)

PhoA (E. coli) precursor de la fosfatasa alcalinizada

VKQST IALAL LPLLF TPVTK A: RTPEM (PhoA) 0,996 0,765

MKQST IALAL LPLLF TPVTK A: QVQLK (PhoA-VH-CH, Fab-H) 0,999 0,784

PelB (Erwinia chrysantemi) precursor de pectato liasa

MKSLI TPITA GLLLA LSQPL LA: ATDTG (PelB) 1,000 0,999

MKSLI TPITA GLLLA LSQPL LA: DIELT (pelB-VL3 1,000 0,998

CL, Fab-H)

MKSLI TPITA GLLLA LSQPL LA: QVQLK (PelB-VH-CH, Fab-H) 1,000 0,998

PelB (Erwinia carotovora)– Precursor de pectato liasa

MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MA: ANTGG (PelB) 1,000 1,000

MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MA: DIELT (PelB-VL3 1,000 1,000

CL, Fab-H)

MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MA: QVQLK (PelB-VH 1,000 1,000

CH, Fab-H)

PelB (Xanthomonas campestris) -Precursor de pectato liasa

MKPKF STAAA ASLFV GSLLV IGVAS A: DPALE (PelB) 1,000 0,993

MKPKF STAAA ASLFV GSLLV IGVAS A: DIELT (pelB-VL3-CL, Fab-H) 1,000 0,985

MKPKF STAAA ASLFV GSLLV IGVAS A: QVQLK (PelB-VH 1,000 0,988

CH, Fab-H)

Lamb (E. coli) -Precursor de maltoporin (proteína del receptor lambda)

MMITL RKLPL AVAVA AGVMS AQAMA: VDFHG (LamB) 1,000 0,975

MMITL RKLPL AVAVA AGVMS AQAMA: DIELT (LambVL3-CL, Fab-H) 1,000 0,979

MM/TL RKLPL AVAVA AGVMS AQAMA: QVQLK (Lamb-VH-CH, Fab-H) 1,000 0,988

MalE (E. coli) -Precursor de la proteína de unión a maltosa

MKIKT GARIL ALSAL TTMMF SASAL A: KIEEG (MalE) 1,000 0,956

MKIKT GARIL ALSAL TTMMF sasal A: DIELT (MalE-VL3 1,000 0,978

CL, Fab-H)

MKIKT GARIL ALSAL TTMMF sasal A: QVQLK (MalE 1,000 0,990

VH-CH, Fab-H)

Bla (pBR322) (E. coli) -beta-lactamasa

MSIQH FRVAL IPFFA AFCLP VFA: HPETL (Bla) 1,000 1,000

MSIQH FRVAL IPFFA AFCLP VFA: DIELT (Bla-VL3 1,000 1,000

CL, Fab-H)

imagen8

XYF (E. coli) -Precursor de la proteína periplásmica de unión a D-xilosa MKIKN ILLTL CTSLL LTNVA AHA KEVKI (XylF) 1,000 0,996 MKIKN ILLTL CTSLL LTNVA AHA DIELT (XylF-VL3-1,000 0,992

CL, Fab-H) MKIKN ILLTL CTSLL LTNVA AHA QVQLK (XylF-VH-1,000 0,996

CH, Fab-H) FecB (E. coli) -Precursor de la proteína periplásmica de unión de dicitrato de hierro (III) MLAFI RFLFA GLLLV ISHAF A ATVQD (FecB) 1,000 0,975 MLAFI RFLFA GLLLV ISHAF A DIELT (FecB-VL3-1,000 0,989

CL, Fab-H) MLAFI RFLFA GLLLV ISHAF A QVQLK (FecB-1,000 0,990 VH-CH, Fab-H)

Se eligieron las siguientes seis combinaciones: -LamB-VL3-CL (precursor de la maltoporina) -MalE-VH-CH (precursor de la proteína de unión a maltosa) -Bla-VL3-CL (beta-lactamasa) -TReA-VH-CH (precursor de trehalasa periplásmica) -ArgT-VL3-CL (precursor de la proteína periplásmica de unión a lisina-arginina-ornitina) -FecB-VH-CH (precursor de la proteína periplásmica de unión a dicitrato de hierro (III)) Las fusiones de genes que generan el péptido señal (SP) para las fusiones VL3-CL y VH-CH se llevaron a cabo con

la superposición de los cebadores de PCR y se resumen en la siguiente la Tabla de amplificación 3.

Cebador: Plantilla Fragmento

LamB-VL3-CL

lamB-5 Lamb-3: ADN genómico de E. coli W3110 lamB-SP

lamB-VL3-5 VL3-3: pMx9-HuCAL-Fab-H-S-S VL3-CL

lamB-5 VL3-3: lamB-SP / VL3-CL lamB-VL3-CL

MalE-VH-CH

malE-5 male-3: ADN genómico de E. coli W3110 malE-SP

malE-VH-CH VH-3: pMx9-HuCAL-Fab-H VH-CH

malE-5 VL3-3: malE-SP / VH-CH malE-VH-CH

Bla-VL3-CL

bla-5 bla-3: ADN genómico de E. coli W3110 bla-SP

bla-VL3-5 VL3-3: pMx9-HuCAL-Fab-H-S-S VL3-CL

bla-5 VL3-3: bla-SP / VL3-CL bla-VL3-CL

TreA-VH-CH

treA-5 treA-3: ADN genómico de E. coli W3110 treA-SP

treA-VH-CH VH-3: pMx9-HuCAL-Fab-H-S-S VH-CH

treA-5 VH-3: treA-SP / VH-CH treA-VH-CH

5

10

15

20

25

30

Cebador: Plantilla Fragmento

ArgT-VL3-CL

argT-5 argT-3: ADN genómico de E. coli W3110 argT-SP

argT-VL3-5 VL3-3: pMx9-HuCAL-Fab-H VL3-CL

argT-5 VL3-3: argT-SP / VL3-CL argT-VL3-CL

FecB-VH-CH

fecB-5 fecB-3: ADN genómico de E. coli W3110 fecB-SP

fecB-VH-CH VL3-3: pMx9-HuCAL-Fab-H-S-S VH-CH

fecB-5 VL3-3: fecB-SP / VH-CH fecB-VH-CH

Las fusiones de las secuencias del péptido señal con las secuencias VL3-CL y VH-CH se realizaron como se describe en otro lugar (Horton, RM, Hunt, HD, Ho, SN, Pullen, JK y Pease, LR (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68). Los genes SP-VL3-CL se cortaron con enzimas de restricción NdeI y PstI y se ligaron en NdeI/PstI corte pBW22 y en pBLL7. Los plásmidos resultantes se cortaron con PstI y HindIII y se ligaron a los genes PstI/HindIII corte SP-VH-CH. Ya que la integración de los genes bla-VL3-CL y FecB-VH-CH no fue posible solo el plásmido de expresión de Fab-H que contiene los genes lamB-VL3-CL y malE-VH-CH pudo ponerse a prueba. Se obtuvo un plásmido de expresión de lamB-VL3-CL/malE-VH-CH que contiene el promotor inducible por L-ramnosa (pAKL14). Los genes Lamb-VL3-CL/malE-VH-CH que fueron aislados del plásmido pAKL15 (ejemplo 7) como el fragmento AflII/HindIII se ligaron en AflII/HindIII-corte pBLL7 para obtener pAKL15E. La Fig. 5 ilustra el plásmido de expresión pAKL15E que contiene el promotor inducible por melibiosa y lamB-VL3-CL/malE-VH-CH (SEQ ID. NO. 4).

Ejemplo 7

Influencia de las regiones de inicio de la traducción sobre la expresión de Fab

Los genes Fab-H del plásmido pAKL14 y el plásmido pAKL15E contienen la misma secuencia de ADN 5' del codón de inicio (región de iniciación de la traducción) mientras que en el plásmido original pMx9-HuCAL-Fab-H las regiones de iniciación de la traducción de ambos genes Fab-H son diferentes. Una comparación de las regiones de iniciación de la traducción de las secuencias del plásmido pMx9-HuCAL-Fab-H y pAKL14/pAKL15E se muestra en la siguiente

Tabla 4:

pMx9-HuCAL-Fab-H: ompA-VL3-CL gagggcaaaaa atg

phoA-VH-CH: aggagaaaataaa atg

pAKL14/pAKL15E: lamB-VL3-CL aggagatatacat atg

malE-VH-CH: aggagatatacat atg

La productividad de la cepa W3110 (pAKL14) se probó en matraces de agitación como se describe en el ejemplo 4. La cepa creció bien en presencia o ausencia de L-ramnosa. Eso significa que la producción de Fab-H no influyó en la viabilidad de las células.

Las nuevas construcciones del péptido señal (en combinación con las señales de iniciación de la traducción modificada) de nuevo aumentaron el título del fragmento del anticuerpo de 328,62 mg/L/100 DO600 (plásmido pBW22-Fab-H que contiene la construcción del gen MOR a partir del plásmido pMx9-HuCAL-Fab-H) a 596,14 mg/L/100 DO600 (plásmido pAKL14) y a 878,86 mg/L/100 DO600 (plásmido pAKL15E). La secuenciación de los genes de lamB-VL3-CL y malE-VH-CH en pAKL14 reveló tres intercambios de bases que se supone que se deben a la construcción de los genes de fusión por dos reacciones de PCR consecutivas. Los intercambios de bases dieron lugar a los siguientes cambios de aminoácidos (los aminoácidos incorrectos son enfatizados):

VL3-CL (pAKL14) -pI = 4,85

imagen9

VH-CH (pAKL14) -pI = 9,52

imagen10

5 La cadena ligera de Fab-H lleva dos errores (D50N, K63N) y la cadena pesada un cambio de aminoácido (F156L). Para restaurar la secuencia de Fab-H original, dos fragmentos del plásmido pAKL14 (fragmento 138 bp SexAI/BamHI y 310 bp BssHII/HindIII) se intercambiaron contra los fragmentos homólogos del plásmido pBW22Fab-H (que lleva la secuencia del gen Fab-H sin cambios). El plásmido resultante pAKL15 lleva la secuencia Fab-H correcta. El intercambio de los tres aminoácidos no tuvo efecto aparente en las propiedades globales de Fab-H ya

10 que el pI fue sin cambio. Por lo tanto, la capacidad de la cepa W3110 (pAKL15) para producir fragmentos de anticuerpos Fab-H funcionales se supuso que era similar a la cepa W3110 (pAKL14) y no fue analizada.

La productividad del fragmento de anticuerpo Fab-H se pudo aumentar utilizando diferentes estrategias de optimización. La siguiente Tabla 5 resume las mejoras:

Cepa: Mejora Concentración del anticuerpo Fab-H funcional (mg/L/100 OD) Incremento de actividad

TG1F’-(pMx9-HuCAL-Fab-H): cepa MOR 84,56

W3110 (pMx9-HuCALFab-H): Línea de fondo de la cepa 140,45 1,7

W3110 (pBW22-Fab-H): Sistema de expresión (Ramnosa) 328,62 3,9

W3110 (pBLL15): Sistema de expresión (Melibiosa) 504,28 6

W3110 (pAKL14): Traducción del péptido señal (Ramnosa) 596,14 7

W3110 (pAKL15E): Traducción del péptido señal (Melibiosa) 878,86 10,4

Las cepas que produjeron altos títulos de anticuerpos Fab-H se analizaron mediante SDS-PAGE (Fig. 6). Las

15 concentraciones más altas funcionales de Fab-H se midieron en cepas que produjeron una cantidad equilibrada de cadena ligera y pesada (carriles 4 y 5). Las cepas inducibles de L-ramnosa, que llevan el fragmento Fab-H tales como W3110 (pBW22-Fab-H) (carril 3) sobreproducen fuertemente la cadena ligera.

Ejemplo 8

Inducción de melibiosa en matraces de agitación

20 Se ensayó W3110 de E. coli que lleva el plásmido pAKL15E para determinar su capacidad de producir fragmentos de anticuerpos Fab-H plegados activamente. Se diluyeron (1:50) cultivos de una noche [en medio NYB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio) suplementado con 100 g/ml de ampicilina, 37°C.] en 20 ml de medio de glicerol fresco (como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65, mientras que se utilizó la solución de vitaminas, como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1 y se incubó a

25 30°C. Se añadió melibiosa (0,2%) cuando los cultivos alcanzaron una DO600 de aproximadamente 0,4. Se tomaron muestras (1 ml) a diferentes intervalos de tiempo, se centrifugaron y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Las

Claims

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