ES2792350T3 - Secuencia señal secretora de organismos eucariotas para la expresión recombinante en organismos procariotas - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión para expresar un polipéptido diana en una célula procariota que comprende un promotor operablemente ligado a un polinucleótido codificador de un polipéptido diana operablemente ligado a una secuencia líder para secreción de organismos eucariotas, teniendo la secuencia líder para secreción de organismos eucariotas que codifica un péptido señal la secuencia MLKRSSWLATLGLLTVASVSTIVYA (SEQ ID NO 1) o su equivalente funcional.

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencia señal secretora de organismos eucariotas para la expresión recombinante en organismos procariotas La presente invención se refiere a un procedimiento para la expresión de un polipéptido en una célula procariota usando secuencias líder secretoras de organismos eucariotas.

Es útil en la producción de polipéptidos recombinantes que el polipéptido de interés pueda exportarse a partir de la célula en que se expresa. Los sistemas de expresión se diseñan, por lo tanto, de manera ventajosa, para que se permita dicha exportación, o secreción. La secreción del polipéptido recombinante de la célula hospedadora implica comúnmente el uso de péptidos señal, que se encuentran en la mayoría de las proteínas eucariotas y procariotas exportables del citoplasma. Los péptidos señal empleados en dichos sistemas de expresión son típicamente naturales para el hospedador de expresión, por ejemplo, se han usado extensamente los péptidos señal PhoA, MalB y OmpA de Escherichia coli para secretar polipéptidos al periplasma de ese organismo. Naturalmente, el uso de hospedadores procariotas implica el uso de péptidos señal procariotas. Las secuencias líder de secreción en organismos procariotas que codifican péptidos señal adecuados se incluyen comúnmente, por lo tanto, en los sistemas de expresión de organismos procariotas.

La expresión de proteínas eucariotas usando hospedadores de expresión de organismos procariotas a menudo lleva a una secreción altamente impredecible e inconsistente de polipéptidos recombinantes. El uso de muchos péptidos señal de organismos eucariotas en diferentes sistemas da como resultado sistemas de expresión ineficaces, siendo habituales bajos rendimientos. Además, se pueden plantear problemas con el mal procesamiento del péptido señal, que se puede eliminar de manera inadecuada o escindirse de manera incompleta. Así, hay la necesidad de péptidos señal de secreción de organismos eucariotas que da como resultado una expresión y secreción eficaces de polipéptidos recombinantes en hospedadores procariotas.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión para expresar un polipéptido diana en una célula procariota que comprende un promotor operablemente unido a un polinucleótido codificador de un polipéptido diana operablemente unido a una secuencia líder secretora de organismos eucariotas, teniendo la secuencia líder secretora de organismos eucariotas codificadora de un péptido señal la secuencia

o su equivalente funcional.

Un péptido señal funcionalmente equivalente es uno que comparte el 70 % o más de identidad con una secuencia de aminoácidos, preferiblemente el 75 % o más de identidad, más preferiblemente el 80 % o más de identidad y lo más preferiblemente el 90 % o más de identidad, como el 95 % de identidad o más, y que conserva la capacidad de secretar el polipéptido diana a partir de una célula procariota.

En muchas realizaciones, las secuencias de ADN que se unen de manera operable son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en el mismo marco de lectura.

Preferiblemente, el ligamiento entre la secuencia líder secretora y el polinucleótido que codifica el polipéptido diana es tal que la secuencia peptídica señal se une al N-terminal del polipéptido diana. En algunas realizaciones, el polipéptido diana comprende una etiqueta N-terminal, siendo el ligamiento entre la secuencia líder secretora y el polinucleótido que codifica el polipéptido diana de manera que esté unida la secuencia peptídica señal a la etiqueta, preferiblemente al N-terminal de la etiqueta.

Se describen además polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos codificadora de un péptido señal con secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO 1), o su equivalente funcional, operablemente unidas a una secuencia de nucleótidos codificadora de un polipéptido recombinante.

La secuencia líder secretora de organismos eucariotas se une preferiblemente al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido diana. El nucleótido codificador del péptido señal a) tiene preferiblemente la secuencia

CAT AT GCT GAAACGTT CTT CTTGGCT GG

CAACT CT GGGTCT GCTGACTGTTGC ATCCGT AAGCACT ATT GTGTATGCA (SEQ ID

NO 6).

Los promotores que se pueden emplear en los vectores según la presente invención comprenden promotores constitutivos o inducibles. En muchas realizaciones preferidas, el promotor es un promotor eucariota. Ejemplos de promotores eucariotas que pueden emplearse incluyen:

a) promotores dependientes de la ARN polimerasa del fago, en particular sistemas promotores dependientes de la ARN polimerasa de T7, preferiblemente los promotores de T7 sencillos, incluyendo los descritos por Studier and Moffat, J. Mol. Biol. 189:113-130 (1986), incorporado en la presente memoria por referencia, especialmente un promotor del gel 10 de T7 y

b) sistemas promotores a base de ARN polimerasa de hospedadores, especialmente sistemas promotores a base de ARN polimerasa de E. coli.

Ejemplos de promotores preferidos que pueden emplearse incluyen promotor de gen 10 de T7, T7A1, T7A2, T7A3, ApL, ApR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA y rrnB.

Cuando se emplea un sistema promotor dependiente de la ARN polimerasa de T7, se reconocerá que es necesaria una fuente de ARN polimerasa de T7, que se proporciona por métodos conocidos en la técnica, y comúnmente por inserción de un profago ADE3 que expresa la polimerasa del fago requerida en la cepa hospedadora para crear cepas hospedadoras lisogénicas. La ARN polimerasa de T7 también puede suministrarse a la célula por infección con un fago transductor A especializado que transporta el gen para la ARN polimerasa de T7.

Las secuencias operadoras que pueden emplearse en el vector de expresión según la presente invención incluyen lac, gal, deo y gln. Pueden emplearse una o más secuencias operadoras que sean palíndromos perfectos. En muchas realizaciones preferidas se emplean dos secuencias operadoras que son palíndromos perfectos, lo más ventajoso que una secuencia operadora esté situada en dirección 3' del promotor y que una secuencia operadora esté situada en dirección 5' del promotor. Cuando se emplean dos sistemas operadores, las secuencias operadoras se espacian preferiblemente para el máximo control del promotor. En muchas realizaciones, el espaciamiento es de 85 a 150 pares de bases, preferiblemente de 90 a 126 pares de bases, y lo más preferiblemente de 91 o 92 pares de bases. En algunas realizaciones, una secuencia operadora se solapa con el punto de inicio transcripcional.

Se reconocerá que se emplea comúnmente el sistema operador con una secuencia represora apropiada. Las secuencias represoras producen proteína represora, por ejemplo, la secuencia del gen lacI cuando se usan los operadores lac. También pueden usarse otras secuencias represoras lac, por ejemplo, puede usarse la secuencia lacIQ para incrementar el nivel de proteína represora lac. La secuencia represora también puede proporcionarse por el genoma de la célula hospedadora o por el uso de un plásmido compatible adicional.

El vector de expresión puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora, pero está comprendido preferiblemente en un elemento extracromosómico como un plásmido. Alternativamente, el vector de expresión puede incorporarse en el fago o en vectores víricos y estos pueden dispensar el sistema de expresión en el sistema de la célula hospedadora. Los vectores de expresión pueden ensamblarse por métodos conocidos en la técnica. El vector de expresión, en particular cuando el vector comprende un plásmido, también comprende típicamente uno o más de lo siguiente: un marcador seleccionable, por ejemplo, una secuencia que confiere resistencia a los antibióticos y una secuencia de estabilidad cer.

El vector de expresión de la presente invención puede emplearse para expresar polipéptidos, especialmente proteínas en células hospedadoras procariotas. Ejemplos de células procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo, células bacterianas gram-negativas, incluyendo E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marsescens, Pseudomonas putida y Pseudomonas aeruginosa, y células bacterianas gram-positivas incluyendo Bacillus subtilis. Son células hospedadoras preferidas las bacterias, en particular enterobacterias, preferiblemente E coli, y especialmente sus cepas B o K12.

El vector de expresión de la presente invención se emplea comúnmente en forma de plásmido. Los plásmidos pueden ser plásmidos que se replican autónomamente o plásmidos integrativos.

El vector de expresión de la presente invención se emplea ventajosamente para la fabricación de polipéptidos, especialmente proteínas recombinantes, cultivando células recombinantes.

Los polipéptidos que pueden expresarse por el procedimiento de la presente invención incluyen proteínas y péptidos terapéuticos, incluyendo citocinas, factores de crecimiento, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, polipéptidos de tipo inmunoglobulina, enzimas, vacunas, hormonas peptídicas, quimiocinas, receptores, fragmentos de receptores, cinasas, fosfatasas, isomerasas, hidroliasas, factores de transcripción y polipéptidos de fusión.

Los anticuerpos que pueden expresarse incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpos con actividad biológica, incluyendo formas multivalentes o multiespecíficas de cualquiera de lo anterior.

Los anticuerpos naturales comprenden típicamente cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable (V^h) y una región constante (C^h), comprendiendo la región C^h en su forma nativa tres dominios, C^h1, C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera comprende una región variable (V^l) y una región constante que comprende un dominio, CL.

Las regiones V^h y V^l pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementaridad (CDR, en inglés), entremezcladas con regiones que sean más conservadoras, denominadas regiones marco (FR, en inglés). Cada V^h y V^l está formada por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde amino terminal a carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Los fragmentos de anticuerpos que pueden expresarse comprenden una porción de un anticuerpo intacto, teniendo dicha porción una actividad biológica deseada. Los fragmentos de anticuerpos generalmente incluyen al menos un sitio de unión de antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen: (i) fragmentos Fab que tienen dominios V^l, C^l, V^h y C^h1 ; (ii) derivados de Fab, como un fragmento Fab' con uno o más residuos cisteína en el C-terminal del dominio C^h1, que pueden formar fragmentos bivalentes por puentes disulfuro entre dos derivados de Fab; (iii) fragmento Fd que tiene los dominios V^h y C^h1 ; (iv) derivados de Fd, como los derivados de Fd que tienen uno o más residuos cisteína en el C-terminal del dominio C^h1 ; (v) fragmentos Fv que tienen los dominios V^l y V^h de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) moléculas de anticuerpo de una sola cadena como los anticuerpos Fv de una sola cadena (scFv) en que los dominios V^l y V^h están ligados mediante enlaces covalentes; (vii) el polipéptido con dominio V^h o V^l sin dominios de región constante ligados a otro dominio variable (un polipéptido con dominio V^h o V^l) que tiene o no dominios de región constante (por ejemplo, V^h-V^h, V^h-V^l o V^l-V^l) (viii) fragmentos de anticuerpos con dominio, como fragmentos que consisten en un dominio V^h, o un dominio V^l, y fragmentos de unión al antígeno del dominio V^h o el dominio V^l, como regiones CDR aisladas; (ix) los denominados «diacuerpos» que comprenden dos sitios de unión al antígeno, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada (V^h) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V^l), en la misma cadena polipeptídica y (x) los denominados anticuerpos lineales que comprenden un par de segmentos Fd en tándem que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno.

Los fragmentos de anticuerpos preferidos que pueden prepararse son anticuerpos de dominio variable único de mamíferos, siendo un fragmento de anticuerpo que comprende un dominio de polipéptido plegado que comprende secuencias características de dominios variables de inmunoglobulina y que se une específicamente a un antígeno (es decir, constante de disociación de 500 nM o menor, como 400 nM o menor, preferiblemente 250 nM o menor y lo más preferiblemente 100 nM o menor), y que se une al antígeno como un único dominio variable; esto es, sin dominio variable complementario. Los anticuerpos de dominio variable únicos incluyen dominios variables de anticuerpos completos, así como dominios variables modificados, por ejemplo, en que uno o más bucles se han reemplazado por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpos o de dominios variables de anticuerpo que han sido truncados o comprenden extensiones N- o C-terminal, así como fragmentos plegados de dominios variables. Los dominios variables únicos preferidos que pueden prepararse se seleccionan del grupo de V^h y V^l, incluyendo Vkappa y Vlambda. Lo más preferiblemente, los dominios variables únicos son dominios humanos o de camélidos, incluyendo dominios de camélidos humanizados.

Cuando el polipéptido diana comprende dos o más cadenas para secretar, en particular cuando el polipéptido diana es un anticuerpo de fragmento que comprende dos o más cadenas, cada una de las cadenas se une a un líder de secreción según la presente invención y los polinucleótidos que codifican a dichos polipéptidos se diseñan de acuerdo con esto. Los líderes de secreción empleados pueden ser iguales o diferentes.

De acuerdo con esto, la presente invención también proporciona un método para la producción de un polipéptido diana que comprende expresar un vector según el primer aspecto de la presente invención en una célula hospedadora procariota.

El sistema de expresión se expresa por métodos conocidos en la técnica para las células empleadas. Los métodos de expresión preferidos incluyen el cultivo de células hospedadoras en medio de crecimiento, especialmente por fermentación, y recuperación después del polipéptido expresado. El término «medio de crecimiento» se refiere a un medio nutriente usado para cultivar células hospedadoras. En muchas realizaciones, se emplea una solución nutriente. Los medios de crecimiento adecuados para células hospedadoras determinadas y métodos de recuperación de polipéptidos son conocidos en la técnica.

Puede inducirse la expresión por adición de un inductor como isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), análogos de IPTG como isobutil-C-galactósido (IBCG), lactosa o melibiosa. Pueden usarse otros inductores y se describen más extensamente en otro sitio (por ejemplo, véase The Operon, eds. Miller and Renznikoff (1978)). Los inductores pueden usarse de manera individual o combinados.

Preferiblemente, la secuencia peptídica señal se une al N-terminal del polipéptido recombinante. En algunas realizaciones, el polipéptido recombinante comprende una etiqueta N-terminal, estando unida la secuencia peptídica señal a la etiqueta, preferiblemente al N-terminal de la etiqueta.

Los polinucleótidos que comprenden un promotor procariota operablemente ligado a una secuencia de nucleótidos codificadora de un péptido señal con la secuencia

o su equivalente funcional, operablemente ligada a una secuencia de nucleótidos codificadora de un polipéptido recombinante forman otro aspecto de la presente invención.

Preferiblemente, la secuencia peptídica señal se une al N-terminal del polipéptido diana. En algunas realizaciones, el ligamiento entre la secuencia líder de secreción y el polinucleótido codificador del polipéptido diana es de manera que el polipéptido diana comprende una etiqueta N-terminal, estando unida la secuencia peptídica señal a la etiqueta, preferiblemente al N-terminal de la etiqueta.

La presente invención se ilustra sin limitación por los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

TAR1-5-19 es un anticuerpo con dominio V^l único anti-TNF. Se obtuvo la secuencia de aminoácidos de la Solicitud de Patente Internacional WO2005/035572.

Construcción de cepas

Cepa 1

Se preparó un polinucleótido con la secuencia:

C AT ATGCT G AAAC GTT CTT CTT GGCTG G CAACT CTG GGT CTGCT GACT GTTGCAT CC GT AAGCACT ATT GT GTATGCAGACAT CC AAAT GAC CC AGT C CCCTT CTT CT CT G AGCG CGTCTGTGGGTGATCGTGTGACCATCACTTGCCGTGCTTCTCAATCCATCGATTCCT ACCTGC ACTGGT AT C AACAG AAACC AG GC AAGGC GCCG AAACT G CT GATTT ACT CCG CGTCTGAGCTG C AGTCTGGTGTG CCG AGCCGTTTCT CTG GCTCTGGTTCC GGTACC GACTT C ACT CT G ACCAT CT CTT CT CT GCAGC CGG AGG ATTT CGCAACTT ACT ACTGCC AACAAGTCGTGTGGCGTCCGTTTACCTTCGGTCAGGGCACGAAAGTGGAAATTAAAC GTTGATGACTCGAG (SEQ ID NO 11)

(donde los nucleótidos subrayados indican el polinucleótido codificador para la secuencia peptídica señal de organismos eucariotas

como fragmento NdeI/XhoI. Este fragmento se clonó en el vector pAVE011, preparado como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 2007/088371, usando los sitios de restricción Nde I y Xho I en el vector. Se identificaron clones recombinantes por digestión de restricción y se confirmó por secuenciación. Se transformó un clon de plásmido en la cepa W3110 de E. coli. Se mezcló una cantidad igual de cultivo durante la noche con el 40 % de glicerol y se tomaron alícuotas en crioviales para almacenamiento a -70 °C.

Cepa 4 (Comparativo)

Se preparó la cepa 4 por el método empleado para la cepa 1, excepto que el polinucleótido preparado tubo la secuencia:

CATATGAAACTGCTGCTGCTGTCTGCTCTGCTGGGTTGTCTGGCTACTGCGTATGCC GATATCCAAATGACTCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGCAAGCGTGGGCGATCGTGTC ACT AT C ACCT GCCGT GC G AGCCAGT CT AT CG ACT CTT ACCT G C ATTGGT ACCAGC AA AAACCGGGCAAAGCTCCTAAACTGCTGATCTACTCCGCGTCTGAACTGCAGTCTGGC GTTCCGTCTCGTTTCTCTGGCAGCGGTAGCGGCACTGACTTTACCCTGACCATCTCC TCCCTGCAGCCAGAAGATTTTGCGACTTACTATT GCC AGCAGGT GGT GTGGCGCCC GTTCACCTTCGGTCAGGGCACCAAGGTGGAAATTAAGCGTTGATAACTCGAG (SEQ

ID NO 14)

donde los nucleótidos subrayados indican el polinucleótido codificador para la secuencia peptídica señal de organismos eucariotas

MKLLLLSALLGCLATAYA (SEQ ID NO 15).

Cepa 6 (Comparativo)

Se preparó la cepa 6 por el método empleado para la cepa 1, excepto que el polinucleótido preparado tubo la secuencia:

CATATGAAAGTTTCTGCTGCTCTGCTGTGGCTGCTGCTGATTGCTGCTGCTTTCTCTC CGCAGGGTCTGGCCGATATCCAGATGACTCAGTCCCCATCTAGCCTGAGCGCGTCT GTGGGCGACCGTGTGACTATCACCTGCCGTGCGAGCCAGTCTATCGACTCCTACCT GCATTGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCTCCGAAACTGCTGATTTACTCCGCTTC CGAACTGCAGTCTGGCGTACCATCTCGCTTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACT TTACCCT G ACT AT CTCCTCTCT GC AGCCG GAG GATTTCGCAACGTATT ATT GT C AG CA AGTCGTTTGGCGCCCTTTCACCTTCGGTCAGGGCACCAAAGTGGAGATCAAGCGTTG ATAACTCGAG (SEQ ID NO 17)

donde los nucleótidos subrayados indican el polinucleótido codificador para la secuencia peptídica señal de organismos eucariotas

MKVSAALLWLLLIAAAFSPQGLA (SEQ ID NO 18).

Cepa 7 (Comparativo)

Se preparó la cepa 7 por el método empleado para la cepa 1, excepto que el polinucleótido preparado tubo la secuencia:

C AT AT G AAAGCGTTT CCAACCTT CGCACT GCT GTTT CTG GTT CT GCT GTTTT CCGCTC ACGTTAG CG ATGCTG ATATCCAAATG ACC CAG AG CCC AAG CTCTCTGTCCG CAAGCG TAGGTGACCGTGTTACGATCACCTGCCGTGCGAGCCAGTCTATCGATTCCTACCTGC ACTGGTATC AG CAG AAGCC AG GC AAGG CTC CG AAACTG CTGATCTACTCTG CTTCCG AGCTGCAGTCCGGCGTTCCGTCTCGCTTCTCCGGTTCTGGCTCCGGTACCGACTTCA CGCT GACCATCT CTTCT CTGCAGCCGGAAGACTT CGCTACTT ACT ACTGT CAGCAGG TTGTTTGGCGTCCGTTTACTTTCGGCCAGGGTACCAAAGTAGAAATCAAACGTTAATA ACTCGAG (SEQ ID NO 19)

donde los nucleótidos subrayados indican el polinucleótido codificador para la secuencia peptídica señal de organismos eucariotas

MKAFPTFALLFLVLLFSAHVSDA (SEQ ID NO 20).

Evaluación del frasco de agitación

Se inocularon 10 gl de la disolución madre de glicerol descongelada en 5 ml de caldo Luria (LB, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de triptona y 5 g/l de cloruro sódico) enriquecido con tetraciclina (10 gg/ml) y glucosa (1 g/l). Esto se incubó a 37 °C en un agitador orbital durante 16 h. Después se usaron 500 gl de este cultivo para inocular dos matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo Luria (composición como se describió anteriormente). Se incubaron los matraces a 37 °C, a 21 rad/s (200 rpm) en un matraz orbital. Se vigiló el crecimiento hasta OD600 = 0.5-0.7. En este punto se indujo un matraz con IPTG (isopropil-.p.-D-1-tiogalactopiranósido) a una concentración final de 0.1 mM mientras que se dejó sin inducir el segundo matraz y se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente durante 22 horas, durante lo cual se tomaron muestras para medición del crecimiento y acumulación de TAR1-5-19 en las células bacterianas. Se determinaron los niveles de acumulación de TAR1-5-19 usando geles SDS-PAGE teñidos con SimplyBlue de lisados de células enteras de las bacterias muestreadas. Las células recogidas se sometieron además a fraccionamiento de células por choque osmótico para aislar la fracción celular que contenía las proteínas que se habían dividido en la fracción periplásmica de E. coli soluble y el nivel de acumulación en diferentes fracciones determinadas usando geles de SDS-PAGE teñidos con SimplyBlue. La fracción OS1 (OS = choque osmótico, por sus siglas en inglés) es el sobrenadante recuperado después de lavar las células recogidas en tampón que contiene sacarosa, la fracción de OS2 es el sobrenadante recuperado después de lavar con un tampón de resistencia iónica baja, el medio «sobrenadante/crecimiento» es el medio de crecimiento residual sin células residuales y el «botón de células» es el botón de células después de fraccionamiento por choque osmótico. El polinucleótido diana secretado correctamente se detecta en la fracción OS1 o en la fracción OS2 o en la fracción sobrenadante/medio de crecimiento.

En la figura 1 se muestran datos del método de frasco de agitación para la cepa 1. Se puede observar que se detectó una proteína secretada del peso molecular esperado en las fracciones de choque osmótico. Esta banda se confirmó con posterioridad que era TAR1-5-19 por secuenciación de aminoácidos N-terminal. También fue evidente el bajo nivel de reparto de TAR1-5-19 en el medio de crecimiento (ruta 2).

La cepa 4 no acumuló proteína secretada detectable usando geles de SDS-PAGE teñidos con SimpIyBlue.

No se detectó proteína secretada del peso molecular esperado en las fracciones de choque osmótico para la cepa 6 o la cepa 7.

Evaluación del fermentador de la cepa 1

Se cultivaron los inóculos de fermentación para la cepa 1 añadiendo 200 gl de la disolución madre de glicerol a un frasco de agitación deflectado de 2.0 l que contenía 200 ml de caldo Luria (LB) que contenía 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona, 10 g/l de cloruro de sodio, 10 g/l de glucosa y 15 mg/l de tetraciclina. Se cultivó el inóculo durante 10 h a 37 °C en una incubadora con agitador con una agitación de 21 rad/s (200 rpm). Se usaron 20 ml de inóculo del frasco de agitación para inocular un fermentador de 5 l de volumen de trabajo que contenía 4 l de medio de crecimiento discontinuo. Se llevó a cabo la fermentación en las condiciones de operación descritas más adelante. Se controló la temperatura a 37 °C durante las primeras 7-7.5 horas, después se redujo a 30 °C durante un periodo de 2 horas y se controló a 30 °C durante el resto de la fermentación. Se controló el pH a 7.0 por adición automática del 25 % (p/v) de hidróxido de amonio. El punto de ajuste de la tensión de oxígeno disuelto (dOT) fue el 30 % de saturación del aire y se controló por ajuste automático de la velocidad del agitador del fermentador desde un mínimo de 26 rad/s (250 rpm) hasta un máximo de 157 rad/s (1500 rpm) y enriquecimiento de oxígeno a la corriente del gas de entrada. El flujo de aire por todo el recipiente del fermentador fue 0.5 v/v/min.

La composición del medio de crecimiento discontinuo se proporciona en la tabla 1.

Tabla 1

La composición de la alimentación de glicerol/sulfato de amonio se proporciona en la tabla 2.

Tabla 2

Se llevaron a cabo las fermentaciones en modo discontinuo hasta la reducción de la fuente de carbono (es decir, glicerol) que ocurrió ca. 10 h postinoculación y se caracterizó por una elevación brusca de dOT. Se inició la fermentación del lote alimentado en el punto de agotamiento de la fuente de carbono por la adición de una alimentación de glicerol/sulfato de amonio a una velocidad de alimentación de 2.6-2.9 gramos de alimentación por litro de medio por hora. Se llevó a cabo inducción por adición de IPTG a una concentración final de 0.125 mM una vez que el nivel de biomasa en la fermentación alcanzara OD600 = 45-55. Se continuó la fase de lote alimentado durante 46 h postindución. Después se recogieron las células y el medio de crecimiento sin células residuales. Se sometieron además las células recogidas a fraccionamiento de células por choque osmótico para aislar la fracción celular que contenía las proteínas que se habían repartido en la fracción periplásmica de E. coli soluble.

La acumulación de TAR1 -5-19 en el extracto periplásmico soluble y el medio de crecimiento residual se estimó como se describió anteriormente. Se logró un alto nivel de secreción de TAR-5-19. En la figura 2 se presentan los datos de la cepa 1. Se puede observar que se secreta TAR1-5-19 y se acumula en el medio de crecimiento (S/N). Se estimó que el título era 400 mg/l de cultivo. La fracción del botón residual a continuación de la fracción periplásmica (figura 2, ruta 9) indica la acumulación de TAR1-5-19 con el líder de secreción. Será evidente para los expertos en la técnica que la optimización adicional de la fermentación y las condiciones de inducción incrementarían la secreción de TAR1-5-19 incluso incrementando más el título.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión para expresar un polipéptido diana en una célula procariota que comprende un promotor operablemente ligado a un polinucleótido codificador de un polipéptido diana operablemente ligado a una secuencia líder para secreción de organismos eucariotas, teniendo la secuencia líder para secreción de organismos eucariotas que codifica un péptido señal la secuencia MLKRSSWLATLGLLTVASVsT iVYA (SEQ ID NO 1) o su equivalente funcional.

2. Un vector de expresión según la reivindicación 1, en donde la secuencia peptídica señal equivalente funcional presenta el 90 % o más de identidad con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 1).

3. Un vector de expresión según cualquier reivindicación precedente, en donde el polinucleótido operablemente ligado al polipéptido diana se une al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido diana.

4. Un vector de expresión según cualquier reivindicación precedente, en donde el vector es un plásmido.

5. Un vector de expresión según cualquier reivindicación precedente, en donde el polipéptido diana se selecciona del grupo que consiste en citocinas, factores de crecimiento, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, polipéptidos de tipo inmunoglobulina, enzimas, vacunas, hormonas peptídicas, quimiocinas, receptores, fragmentos de receptores, cinasas, fosfatasas, isomerasas, hidroliasas, factores de transcripción y polipéptidos de fusión.

6. Un método para la producción de un polipéptido diana que comprende expresar un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en una célula hospedadora procariota.

7. Un método según la reivindicación 6, en donde la célula hospedadora procariota se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marsescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida y Bacillus subtilis.

8. Un microorganismo procariota que comprende un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Un microorganismo según la reivindicación 8, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marsescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus subtilis.

10. Un polinucleótido que comprende un promotor procariota operablemente ligado a una secuencia de nucleótidos codificadora de un péptido señal con la secuencia MLKRSSWLATLGLLTVASVSTIVYA (SEQ ID NO 1) o su equivalente funcional, operablemente ligada a una secuencia de nucleótidos codificadora de un polipéptido recombinante.

11. Uso de un polinucleótido codificador de un péptido señal con la secuencia MLKRSSWLATLGLLTVASVSTIVYA (SEQ ID NO 1) o su equivalente funcional, para la expresión de un polipéptido diana en una célula procariota.

12. Uso de un péptido señal con la secuencia MLKRSSWLATLGLLTVASVSTIVYA (SEQ ID NO 1) o su equivalente funcional, para la secreción de un polipéptido diana en una célula procariota.

13. Un método para producir un polipéptido diana que comprende:

a) cultivar una célula hospedadora procariota que comprende un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para expresar de ese modo el polipéptido diana y

b) recuperar el polipéptido diana.