ES2692811T3 - Cepa bacteriana para expresión de proteína recombinante que tiene los genes DEGP deficiente de proteasa que retiene actividad chaperona y TSP y PTR desactivados génicamente - Google Patents

Cepa bacteriana para expresión de proteína recombinante que tiene los genes DEGP deficiente de proteasa que retiene actividad chaperona y TSP y PTR desactivados génicamente Download PDF

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Abstract

Una célula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende: a. un gen Tsp mutado, en la que el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene un 50 % o menos de la actividad proteasa de una Tsp no mutada de tipo silvestre o es un gen Tsp mutado por desactivación génica; en la que la célula es isogénica de una célula W3110 de E. coli, excepto por el gen Tsp mutado y opcionalmente una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína de interés.

Description

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DESCRIPCION
Cepa bacteriana para expresion de protema recombinante que tiene los genes DEGP deficiente de proteasa que retiene actividad chaperona y TSP y PTR desactivados genicamente
La invencion se refiere a una cepa hospedadora bacteriana recombinante, particularmente E. coli. La invencion se refiere tambien a un metodo para producir una protema de interes en tal celula.
Antecedentes de la invencion
Las celulas bacterianas, tales como E. coli, se usan comunmente para producir protemas recombinantes. Hay muchas ventajas en usar celulas bacterianas, tales como E. coli, para producir protemas recombinantes, particularmente debido a la naturaleza versatil de las celulas bacterianas como celulas hospedadoras que permiten la insercion genica a traves de plasmidos. E. coli se ha usado para producir muchas protemas recombinantes, incluyendo insulina humana.
A pesar de las muchas ventajas de usar celulas bacterianas para producir protemas recombinantes, hay todavfa limitaciones significativas que incluyen la dificultad de producir protemas sensibles a proteasa. Las proteasas desempenan un papel importante en el recambio de protemas antiguas y mal plegadas en el periplasma y citoplasma de E. coli. Las proteasas bacterianas actuan degradando la protema de interes recombinante, reduciendo asf significativamente a menudo el rendimiento de protema activa.
Se han identificado una serie de proteasas bacterianas, En E. coli se han identificado proteasas que incluyen proteasa III (ptr), DegP, OmpT, Tsp, prlC, ptrA, ptrB, pepA-T, tsh, espc, eatA, clpP e Ion.
La protema proteasa III (ptr) es una proteasa periplasmica de 110 kDa que degrada protemas de alto peso molecular.
La Tsp (tambien conocida como Prc) es una proteasa periplamica de 60 kDa. El primer sustrato conocido de Tsp fue la protema 3 de union a penicilina (PBP3) (“Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli”; Nagasawa H, Sakagami Y, Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y. J Bacteriol. Nov. de 1989; 171(11): 5890-3 y “Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3”; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacteriol. agosto de 1991; 173(15): 4799-813), pero se descubrio mas tarde que la Tsp era tambien capaz de escindir protemas de cola de fago y, por lo tanto, se renombro como proteasa espedfica de cola (Tsp) (Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)). Silber et al. (“Deletion of the prc(tsp) gene provides evidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12”; Silber, K.R., Sauer, R.T.; Mol Gen Genet 1994 242:237-240) describe una cepa de delecion de prc (KS1000) en la que se creo la mutacion reemplazando un segmento del gen pcr por un fragmento que comprendfa un marcador Kanr.
La DegP (tambien conocida como HtrA) es una protema de 46 kDa que tiene funcion dual como chaperona y proteasa (“Families of serine peptidases”; Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994; 244:19-61).
Es conocido desactivar genicamente proteasas bacterianas para afectar al rendimiento de la protema recombinante.
Georgiou et al. (“Construction and characterization of Escherichia coli strains deficient in multiple secreted proteases: protease III degrades high-molecular-weight substrates in vivo”. Baneyx F, Georgiou G.J Bacteriol. abril de 1991; 173(8): 2696-703) estudiaron los efectos sobre las propiedades de crecimiento y la estabilidad de protema de cepas de E. coli deficientes en proteasa III construidas por inactivacion insercional del gen ptr y se observo un aumento de la expresion de un polipeptido secretado sensible a proteasa. Se produjo tambien una cepa que comprendfa la mutacion ptr y era tambien deficiente en la proteasa secretada DegP, y se encontro que tema una tasa de crecimiento reducida y un aumento de la expresion proteica. En Georgiou et al., se construyeron cepas de E. coli deficientes en proteasa III y/o DegP a partir de la cepa parental KS272 que comprende ya una serie de mutaciones genomicas.
El documento US 5264365 (Georgiou et al.) divulga la construccion de hospedadores de Escherichia coli deficientes en proteasa que, cuando se combinan con un sistema de expresion, son utiles para la produccion de polipeptidos proteolfticamente sensibles.
Meerman et al. (“Construction and characterization of Escherichia coli strains deficient in All Known Loci Affecting the Proteolytic Stability of Secreted Recombinant Proteins”. Meerman H. J., Georgeou G., Nature Biotechnology, 1994 Nov; 12; 1107-1110) divulgan cepas de E. coli que comprenden mutaciones en rpoH, el factor sigma de ARN polimerasa responsable de la smtesis de protema de choque termico, y diferentes combinaciones de mutaciones en genes de proteasa incluyendo DegP, proteasa III, Tsp (Prc) y OmpT, donde se causaron mutaciones nulas de los genes de proteasa por mutaciones insercionales. En Meerman et al, se construyeron cepas de E. coli deficientes en una o mas de Tsp, proteasa III y DegP a partir de la cepa parental KS272 que comprende ya una serie de mutaciones genomicas.
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El documento US 5508192 (Georgiou et al.) divulga un metodo de produccion de polipeptidos recombinantes en hospedadores bacterianos deficientes en proteasa y constructos de bacterias deficientes en una, dos, tres y cuatro proteasas que portan tambien una mutacion en el gen rpoH.
Chen et al describe la construccion de cepas de E. coli portadoras de diferentes combinaciones de mutaciones en prc (Tsp) y DegP creadas por amplificacion de las regiones en direccion 5' y en direccion 3' del gen y ligamiento de estas conjuntamente en un vector que comprende marcadores de seleccion y una mutacion sprW148R (“High-level accumulation of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (ADegP Aprc spr W148R) host strain”. Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bioeng. 5 de marzo de 2004; 85(5): 463-74). La combinacion de mutaciones ADegP, Aprc y W148Rspr se encontro que proporcionaba los mayores niveles de cadena ligera de anticuerpo, cadena pesada de anticuerpo y F(ab')2-LZ. El documento EP1341899 divulga una cepa de E. coli que es deficiente en DegP y prc cromosomicos que codifican las proteasas DegP y Prc, respectivamente, y alberga un gen spr mutante que codifica una protema que suprime fenotipos de crecimiento exhibidos por cepas que albergan mutantes de prc.
Kandilogiannaki et al (Expression of a recombinant human anti-MUCl scFv fragment in protease-deficient Escherichia coli mutants. Kandilogiannaki M, Koutsoudakis G, Zafiropoulos A, Krambovitis E. Int J Mol Med. junio de 2001; 7(6): 659-64) describe la utilizacion de una cepa deficiente en proteasa para la expresion de una protema scFv.
Las cepas bacterianas deficientes en proteasa usadas anteriormente para expresar protemas recombinantes comprenden mutaciones adicionales de genes implicados en el metabolismo celular y la replicacion de ADN tales como, por ejemplo, phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi y pro en cepas de E. coli. Estas mutaciones pueden tener muchos efectos nocivos sobre la celula hospedadora, incluyendo efectos sobre el crecimiento celular, estabilidad, rendimiento de expresion de protema recombinante y toxicidad. Las cepas que tienen una o mas de estas mutaciones genomicas, particularmente cepas que tienen un alto numero de estas mutaciones pueden exhibir una perdida de aptitud que reduce la tasa de crecimiento bacteriano a un nivel que no es adecuado para la produccion de protema industrial. Adicionalmente, cualquiera de las mutaciones genomicas anteriores puede afectar a otros genes en cis y/o en trans de modos daninos impredecibles, alterando sf el fenotipo, aptitud y perfil proteico de la cepa. Adicionalmente, el uso de celulas fuertemente mutadas no es generalmente adecuado para producir protemas recombinantes para uso comercial, particularmente productos terapeuticos, porque tales cepas tienen generalmente rutas metabolicas defectivas y por ello pueden crecer mal o nada en absoluto en medios mmimos o definidos qmmicamente.
Las cepas bacterianas deficientes en proteasa comprenden tfpicamente tambien mutaciones de desactivacion genica de uno o mas genes que codifican proteasa que se han creado por insercion de una secuencia de ADN en la secuencia de codificacion genica. La secuencia de ADN insertada codifica tfpicamente un marcador de seleccion tal como un gen de resistencia a antibiotico. Aunque este metodo de mutacion puede ser eficaz para desactivar genicamente la proteasa diana, hay muchas desventajas asociadas a este metodo. Es una desventaja que la insercion de ADN extrano, tal como un gen de resistencia a antibiotico, causa desestabilizacion del genoma del hospedador, lo que puede dar como resultado cualquier numero de efectos indeseados, incluyendo la sobreexpresion de protemas daninas y/o la regulacion negativa o desactivacion genica de otras protemas esenciales. Este efecto es particularmente evidente para aquellos genes colocados inmediatamente en direccion 5' o 3' del gen de proteasa diana. Una desventaja adicional de la insercion de ADN extrano, particularmente genes de resistencia a antibiotico, es las modificaciones fenotfpicas desconocidas en la celula hospedadora que pueden afectar a la expresion de la protema diana y/o al crecimiento de la celula hospedadora y pueden hacer tambien a la celula hospedadora inadecuada para la produccion de protemas pretendidas para uso terapeutico. Las protemas de resistencia a antibiotico son particularmente desventajosas por los requisitos de bioseguridad de la fabricacion a gran escala, particularmente para la produccion de productos terapeuticos para administracion humana. Es una desventaja adicional de la insercion de marcadores de resistencia a antibiotico la carga metabolica sobre la celula creada por la expresion de la protema codificada por el gen de resistencia a antibiotico. El uso de marcadores de resistencia a antibiotico para uso como marcadores para manipulaciones geneticas tales como mutaciones de desactivacion genica esta tambien limitado por el numero de diferentes marcadores de resistencia a antibiotico disponibles.
Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de proporcionar nuevas cepas bacterianas que proporcionen medios ventajosos para producir protemas recombinante.
Compendio de la invencion
Es un objetivo de la presente invencion resolver uno o mas de los problemas descritos anteriormente.
En un primer aspecto, la presente invencion proporciona una celula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende:
a. un gen Tsp mutado, en el que el gen Tsp mutado codifica una protema Tsp que tiene un 50 % o menos de la actividad proteasa de una Tsp no mutada de tipo silvestre o es un gen Tsp mutado por desactivacion genica;
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en la que la celula es isogenica de una celula W3110 de E. coli, excepto por el gen Tsp mutado y opcionalmente una secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes.
Ademas, la presente invencion proporciona una celula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende:
a. un gen Tsp mutado, en el que el gen Tsp mutado codifica una protema Tsp que tiene un 50 % o menos de la actividad proteasa de una Tsp no mutada de tipo silvestre o es un gen Tsp mutado por desactivacion genica; y
b. un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona pero no actividad proteasa,
en la que la celula es isogenica de una celula W3110 de E. coli, excepto por los genes Tsp y DegP mutados y opcionalmente una secuencia polinucleotidica que codifica una protema de interes.
Ademas, la presente invencion proporciona una celula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende:
a. un gen Tsp mutado, en el que el gen Tsp mutado codifica una protema Tsp que tiene un 50 % o menos de la actividad proteasa de una Tsp no mutada de tipo silvestre o es un gen Tsp mutado por desactivacion genica; y
b. un gen ptr mutado por desactivacion genica,
en la que la celula es isogenica de una celula W3110 de E. coli, excepto por los genes Tsp y ptr mutados y opcionalmente una secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes.
Se divulga tambien una celula que comprende un gen ptr mutado, en la que el gen ptr mutado codifica una protema proteasa III que tiene actividad proteasa reducida o es un gen ptr mutado por desactivacion genica y ningun gen de proteasa mutado adicional. Por consiguiente, la divulgacion describe una celula que es isogenica de una celula bacteriana de tipo silvestre, excepto por el gen ptr mutado y opcionalmente una secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes.
Se divulga adicionalmente una celula que comprende un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida y ningun gen de proteasa mutado adicional. Por consiguiente, la divulgacion describe una celula que es isogenica de una celula bacteriana de tipo silvestre, excepto por el gen DegP mutado y opcionalmente una secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes.
Se divulga adicionalmente una celula que comprende un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida, un gen ptr mutado en el que el gen ptr mutado codifica una protema proteasa III que tiene actividad proteasa reducida o es un gen ptr mutado por desactivacion genica y ningun gen de proteasa mutado adicional. Por consiguiente, la divulgacion describe una celula que es isogenica de una celula bacteriana de tipo silvestre excepto por el gen DegP mutado y el gen ptr mutado y opcionalmente una secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes.
En una realizacion preferida, el gen ptr mutado y/o el gen Tsp mutado a los que se hace referencia anteriormente son mutaciones de desactivacion genica.
Los presentes inventores han encontrado que una cepa hospedadora bacteriana isogenica de una celula bacteriana de tipo silvestre, excepto por las una o mas proteasas mutadas anteriores, proporciona un hospedador ventajoso para producir una protema de interes recombinante. Las celulas de E. coli proporcionadas por la presente invencion tienen actividad proteasa reducida en comparacion con una celula no mutada, lo que puede reducir la proteolisis de una protema de interes recombinante, particularmente protemas de interes que son proteoltticamente sensibles. Ademas, la celula de E. coli segun la presente invencion porta solo las mutaciones mmimas de la secuencia genomica para introducir una o mas de las mutaciones de proteasa anteriores y no porta ninguna otra mutacion que pueda tener efectos nocivos sobre el crecimiento celular y/o la capacidad de expresar una protema de interes.
Una o mas de las celulas de E. coli proporcionadas por la presente invencion pueden proporcionar un alto rendimiento de la protema de interes recombinante. Una o mas de las celulas de E. coli proporcionadas por la presente invencion pueden proporcionar una tasa de produccion rapida de una protema de interes. Una o mas de las celulas de E. coli pueden proporcionar un rendimiento inicial rapido de la protema de interes recombinante. Adicionalmente, una o mas celulas de E. coli pueden mostrar buenas caractensticas de crecimiento.
En un segundo aspecto, la divulgacion describe una celula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende:
a. un gen Tsp mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen; y/o
b. un gen ptr mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen; y
c. opcionalmente un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una celula de E. coli que comprende un gen Tsp mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de 5 terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen.
La divulgacion describe tambien una celula que comprende un gen ptr mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen.
10 En una realizacion, la presente invencion proporciona una celula de E. coli que comprende un gen DegP mutado que codifica una protema DegP mutada que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida y un gen Tsp mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen.
15 En una realizacion, la presente invencion proporciona una celula de E. coli que comprende un gen ptr mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen y un gen Tsp mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del 20 codon de terminacion del gen.
Se divulga adicionalmente una celula que comprende un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida y un gen ptr mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen.
25 En una realizacion, la presente invencion proporciona una celula de E. coli que comprende un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida, un gen ptr mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen y un gen Tsp mutado por desactivacion genica que comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen 30 y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen.
La celula descrita en el segundo aspecto supera las desventajas anteriormente descritas de metodos de mutacion por desactivacion genica que emplean insercion de ADN usados tfpicamente en la tecnica para proporcionar cepas deficientes en proteasa. En la presente invencion, las mutaciones por desactivacion genica del gen ptr y/o el gen Tsp 35 se proporcionan por una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen. Una mutacion, tal como una mutacion puntual con cambio de sentido, en el codon de iniciacion del gen de desactivacion genica diana, asegura que el gen diana no comprenda un codon de iniciacion adecuado en el inicio de la secuencia de codificacion. La insercion de uno o mas codones de terminacion colocados entre el codon de iniciacion y el codon 40 de terminacion del gen asegura que, incluso si se inicia la transcripcion del gen, no se transcribira la secuencia de codificacion completa. El genoma hospedador requena una desestabilizacion minima para mutar el codon de iniciacion y/o insertar uno o mas codones de terminacion, minimizando asf los efectos nocivos de la desestabilizacion del genoma sobre la expresion de la protema diana y/o el crecimiento de la celula hospedadora. La celula de E. coli de la presente invencion puede ser tambien mas adecuada para la produccion de protemas 45 pretendidas para uso como productos terapeuticos debido a la desestabilizacion minima del genoma celular.
En un tercer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para producir una protema de interes recombinante que comprende expresar la protema de interes recombinante en una celula de E. coli recombinante de la presente invencion.
Breve descripcion de los dibujos
50 La Figura 1a muestra el extremo 5' de las secuencias proteica y genica de ptr de tipo silvestre (proteasa III) y ptr mutado por desactivacion genica (proteasa III).
La Figura 1b muestra el extremo 5' de las secuencias proteica y genica de Tsp de tipo silvestre y Tsp mutado por desactivacion genica.
La Figura 1c muestra una region de las secuencias proteica y genica de DegP de tipo silvestre y DegP mutado.
55 La Figura 2 muestra el crecimiento de la cepa MXE001 de E. coli portadora de un gen Tsp mutado por desactivacion
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genica y la cepa MXE005 de E. coli portadora de un gen Tsp mutado por desactivacion genica y un gen DegP mutado en comparacion con W3110 de E. coli de tipo silvestre.
La Figura 3 muestra la expresion de un Fab' en MXE005 y MXE001 en comparacion con W3110 de tipo silvestre.
La Figura 4 muestra el crecimiento de la cepa MXE004 de E. coli portadora de un gen Tsp mutado por desactivacion genica y una proteasa III mutada por desactivacion genica en comparacion con W3110 de tipo silvestre.
La Figura 5 muestra la expresion de un Fab' en MXE004 y W3110.
La Figura 6 muestra la expresion de un Fab en MXE001, MXE004, MXE005 y W3110.
La Figura 7 muestra la expresion de cadena ligera (cadena L), cadena pesada (cadena H) y Fab' durante un experimento de fermentacion para MXE001, MXE005 y W3110 de tipo silvestre.
La Figura 8 muestra los resultados de un analisis de transferencia Western para W3110 de tipo silvestre, MXE001 y MXE005 que muestran la fragmentacion relativa de un Fab'.
La Figura 9 muestra el perfil de crecimiento de MXE001 en comparacion con W3110 de control.
La Figura 10 muestra el rendimiento de Fab' del sobrenadante (lmeas de puntos) y periplasma (lmeas continuas) de la cepa MXE001 de E. coli en comparacion con W3110 de E. coli de control.
La Figura 11 muestra el rendimiento de Fab' total de sobrenadante y periplasma de la cepa MXE001 de E. coli en comparacion con W3110 de control.
La Figura 12 muestra la tasa de produccion espedfica de Fab' de la cepa MXE001 de E. coli en comparacion con W3110 de control.
La Figura 13 muestra el perfil de crecimiento de MXE004 y MXE005 en comparacion con W3110 de control.
La Figura 14 muestra rendimientos de Fab' de sobrenadante (lmeas de puntos) y periplasma (lmeas continuas) de las cepas MXE004, MXE005 y el control W3110 de E. coli.
La Figura 15 muestra el rendimiento de Fab' total de sobrenadante y periplasma de las cepas MXE004 y MXE005 de E. coli.
La Figura 16 muestra la tasa de produccion espedfica de Fab' de las cepas MXE004 y MXE005 y el control W3110 de E. coli.
La Figura 17 muestra el perfil de crecimiento de las cepas W3110, MXE001, MXE004 y MXE005 de E. coli en comparacion con las cepas XL1 Blue, TOP10, Stbl 3 y Sure de E. coli.
Breve descripcion de las secuencias
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADN del gen Tsp no mutado incluyendo los 6 nucleotidos ATGAAC en direccion 5' del codon de iniciacion.
La SEQ ID NO: 2 es la secuencia aminoaddica de la protema Tsp no mutada.
La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ADN de un gen Tsp mutado por desactivacion genica incluyendo los 6 nucleotidos ATGAAT en direccion 5' del codon de iniciacion.
La SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ADN del gen de proteasa III no mutado.
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia aminoaddica de la protema proteasa III no mutada.
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de ADN de un gen de proteasa III mutado por desactivacion genica.
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de ADN de un gen DegP no mutado.
La SEQ ID NO: 8 es la secuencia aminoaddica de la protema DegP no mutada.
La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de ADN de un gen DegP mutado.
La SEQ ID NO: 10 es la secuencia aminoaddica de una protema DegP mutada.
La SEQ ID NO: 11 es la secuencia aminoaddica de la region variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TNF.
La SEQ ID NO: 12 es la secuencia aminoaddica de la region variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-TNF.
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La SEQ ID NO: 13 es la secuencia aminoaddica de la cadena ligera de un anticuerpo anti-TNF.
La SEQ ID NO: 14 es la secuencia aminoaddica de la cadena pesada de un anticuerpo anti-TNF.
La SEQ ID NO: 15 es la secuencia del cebador oligonucleotidico 3' de la region del gen Tsp mutado que comprende el sitio de restriccion Ase I.
La SEQ ID NO: 16 es la secuencia del cebador oligonucleotidico 5' de la region del gen Tsp mutado que comprende el sitio de restriccion Ase I.
La SEQ ID NO: 17 es la secuencia del cebador oligonucleotidico 3' de la region del gen de proteasa III mutado que comprende el sitio de restriccion Ase I.
La SEQ ID NO: 18 es la secuencia del cebador oligonucleotfdico 5' de la region del gen de proteasa III mutado que comprende el sitio de restriccion Ase I.
La SEQ ID NO: 19 es la secuencia del cebador oligonucleotfdico 5' de la region del gen DegP mutado que comprende el sitio de restriccion Ase I.
La SEQ ID NO: 20 es la secuencia del cebador oligonucleotfdico 3' de la presion del gen DegP mutado que comprende el sitio de restriccion.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas de la invencion
En un primer aspecto de la presente invencion, los presentes inventores han proporcionado una celula de E. coli recombinante adecuada para expresar una protema de interes que comprende solo las mutaciones irnnimas del genoma requeridas para introducir una o mas mutaciones de proteasa. En un segundo aspecto de la divulgacion, la celula bacteriana comprende mutaciones por desactivacion genica de Tsp y/o proteasa III, en el que el gen Tsp y/o de proteasa III comprende una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen.
Las celulas de E. coli proporcionadas por la presente invencion tienen actividad proteasa reducida en comparacion con celulas no mutadas, lo que puede reducir la proteolisis de una protema de interes recombinante, particularmente protemas de interes que son proteoltticamente sensibles. Por lo tanto, una o mas de las celulas de E. coli proporcionadas por la presente invencion pueden proporcionar mayor rendimiento de la protema de interes recombinante intacta y menor rendimiento, o preferiblemente ningun rendimiento, de fragmentos proteolfticos de la protema de interes en comparacion con una celula bacteriana no mutada.
El especialista en la materia sena capaz de ensayar facilmente un clon de celula candidata para ver si tiene el rendimiento deseado de una protema de interes usando metodos bien conocidos en la materia, incluyendo un metodo de fermentacion, ELISA y HPLC de protema G. Se describen metodos de fermentacion adecuados en Humphreys D P, et al. (1997). “Formation of dimeric Fabs in E. coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab' expression levels, tail piece sequences and growth conditions”. J. IMMUNOL. METH. 209: 193-202; Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N. Bowering L. Larsson G. “Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli”, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Journal of Biotechnology. 135(4): 358-65, 31 de julio de 2008; Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. “Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes”. [Journal Article] Proteomics. 1(9): 1133-48, sep. de 2001 y Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U. Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S. Pluckthun A. Riesenberg D. “High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions”, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Applied Microbiology & Biotechnology. 46(5-6): 52432, diciembre de 1996. El especialista sena tambien capaz de ensayar facilmente protema secretada para ver si la protema esta correctamente plegada usando metodos bien conocidos en la materia, tales como HPLC de protema G, dicndsmo circular, RMN, cristalograffa de rayos X y metodos de medida de la afinidad de epttopo.
Una o mas de las celulas de E. coli recombinantes de la presente invencion pueden exhibir un rendimiento de protema significativamente mejorado en comparacion con una celula bacteriana no mutada. El rendimiento de protema mejorado puede ser el rendimiento de protema periplasmica y/o el rendimiento de protema sobrenadante. Una o mas de las celulas de E. coli recombinantes de la presente invencion pueden ser capaces de una tasa de produccion mas rapida de una protema de interes y, por lo tanto, puede producirse la misma cantidad de una protema de interes en un tiempo mas corto en comparacion con una celula bacteriana no mutada. La tasa de produccion mas rapida de una protema de interes puede ser especialmente significativa durante el periodo de crecimiento inicial de la celula de E. coli, por ejemplo, durante las primeras 5, 10, 20 o 30 horas despues de la induccion de la expresion de protema.
Las celulas de E. coli segun la presente invencion comprenden una mutacion de Tsp, que es preferiblemente la mutacion de desactivacion genica, sola o en combinacion con una mutacion de DegP o una mutacion de proteasa III. Estas celulas de E. coli exhiben un mayor rendimiento y un rendimiento inicial mas rapido de una protema de interes
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en comparacion con una celula no mutada. Son ejemplos de tales estirpes celulares que comprenden el gen Tsp mutado solo o en combinacion con el gen DegP mutado o el gen ptr mutado las cepas de celulas E. coli mutantes MXE001 que tiene genotipo ATsp y depositada el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13444, MXE004 que tiene genotipo ATsp Aptr y depositada el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13447, y MXE005 que tiene genotipo ATsp, DegP S210A y depositada el 21 de mayo de 209 en la National Collection of Type Cultures, HpA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13448.
Adicionalmente, una o mas de las celulas de E. coli pueden mostrar buenas caractensticas de crecimiento, incluyendo crecimiento y/o reproduccion celular, que pueden ser sustancialmente las mismas que una celula bacteriana no mutada o mejoradas en comparacion con una celula bacteriana no mutada.
El genoma de la celula de E. coli segun la presente invencion ha tenido una desestabilizacion minima del genoma en comparacion con una celula de tipo silvestre, reduciendo asf los efectos nocivos de otras mutaciones encontradas tfpicamente en celulas hospedadoras sobre la expresion de otras protemas celulares. Por consiguiente, una o mas celulas hospedadoras de E. coli recombinantes segun el primer aspecto de la presente invencion pueden exhibir expresion de protema mejorada y/o caractensticas de crecimiento mejoradas en comparacion con celulas que comprenden mutaciones genomanipuladas adicionalmente de la secuencia genomica.
El genoma de la celula segun el segundo aspecto de la divulgacion ha tenido una desestabilizacion minima del genoma para introducir las mutaciones de desactivacion genica, reduciendo asf los efectos nocivos de crear desactivaciones genicas de proteasa insertando ADN, tal como marcadores de resistencia a antibiotico. Por consiguiente, una o mas celulas hospedadoras recombinantes segun el segundo aspecto de la divulgacion pueden exhibir una expresion de protema mejorada y/o caractensticas de crecimiento mejoradas en comparacion con celulas que comprenden mutaciones de desactivacion genica de proteasa creadas mediante la insercion de ADN, tal como marcadores de resistencia a antibiotico.
Las celulas de E. coli proporcionadas por la presente invencion son tambien mas adecuadas para uso para producir protemas terapeuticas en comparacion con celula que comprenden desestabilizaciones adicionales del genoma celular.
La presente invencion se describira ahora con mas detalle. Todas las realizaciones descritas en la presente memoria hacen referencia al primer, segundo y tercer aspectos de la divulgacion a menos que se afirme espedficamente otra cosa.
Los terminos “protema” y “polipeptido” se usan intercambiablemente en la presente memoria, a menos que el contexto indique otra cosa. “Peptido” pretende hacer referencia a 10 o menos aminoacidos.
El termino “polinucleotido” incluye un gen, ADN, ADNc, ARN, ARNm, etc. a menos que el contexto indique otra cosa.
Como se usa en la presente memoria, el termino “comprende” en el contexto de la presente memoria descriptiva debena interpretarse como “incluye”.
Celula no mutada o celula de control en el contexto de la presente invencion significa una celula del mismo tipo que la celula de E. coli recombinante de la invencion en la que la celula no se ha modificado para portar las mutaciones de proteasa anteriores. Por ejemplo, una celula no mutada puede ser una celula de tipo silvestre y puede derivar de la misma poblacion de celulas hospedadoras que las celulas de E. coli de la invencion antes de la modificacion para introducir la una o mas mutaciones.
Las expresiones “celula”, “estirpe celular”, “cultivo celular” y “cepa” se usan intercambiablemente.
El termino “isogenico” en el contexto de la presente invencion significa que el genoma de la celula de E. coli de la presente invencion tiene la misma secuencia genomica en comparacion con una cepa de E. coli de tipo silvestre, excepto por los genes de proteasa mutados espedficos y opcionalmente un polinucleotido que codifica una protema de interes.
Los ejemplos de mutaciones genicas implicadas en el metabolismo celular y la replicacion de ADN que se usan comunmente en cepas de E. coli en la materia, pero que no se usan en la celula de E. coli segun la presente invencion, incluyen phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi y pro.
La expresion “tipo silvestre” en el contexto de la presente invencion significa una cepa de una celula de E. coli como puede aparecer en la naturaleza o puede aislarse del entorno, que no porta ninguna mutacion genomanipulada. Es un ejemplo de una cepa de tipo silvestre de E. coli W3110, tal como la cepa W3110 K-12 (F"X" rph-1 INV(rrnD, rrnE) ilvG) (ATCC27325).
La celula de E. coli segun el primer aspecto de la presente invencion es isogenica de una celula W3110 de E. coli de tipo silvestre, excepto por el uno o mas genes de proteasa mutados y opcionalmente una secuencia polinucleotidica que codifica una protema de interes.
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La celula de E. coli de la presente invencion puede diferir adicionalmente de una celula de tipo silvestre por comprender un polinucleotido que codifica la protema de interes. En esta realizacion, el polinucleotido que codifica la protema de interes puede estar contenido en un vector de expresion adecuado transformado en la celula de E. coli y/o integrado en el genoma de la celula hospedadora de E. coli. En la realizacion en que el polinucleotido que codifica la protema de interes se inserta en el genoma del hospedador, la celula de E. coli de la presente invencion diferira tambien de una celula de tipo silvestre debido a la secuencia polinucleotfdica insertada que codifica la protema de interes. Preferiblemente, el polinucleotido esta en un vector de expresion en la celula de E. coli, causando asf una desestabilizacion minima del genoma de la celula hospedadora.
En ciertas realizaciones de la presente invencion, la celula de E. coli recombinante comprende un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida. Como se usa en la presente memoria, “DegP” significa un gen que codifica la protema DegP (tambien conocida como HtrA) que tiene funcion dual como chaperona y proteasa (“Families of serine peptidases”; Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994; 244: 19-61). La secuencia del gen DegP no mutado se muestra en la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la protema DegP no mutada se muestra en la SEQ ID NO: 8.
A bajas temperaturas, la DegP funciona como chaperona y a altas temperaturas la DegP tiene preferencia por funcionar como protesa (“A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein”. Cell, volumen 97, publicacion 3, paginas 339-347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) y “The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperaturas”, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658).
En las realizaciones en que la celula de E. coli comprende la mutacion de DegP, la mutacion de DegP en la celula de E. coli proporciona un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona, pero no actividad proteasa completa.
La expresion “que tiene actividad chaperona” en el contexto de la presente invencion significa que la protema DegP mutada tiene la misma o sustancialmente la misma actividad chaperona en comparacion con la protema DegP no mutada de tipo silvestre. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una protema DegP que tiene un 50 % o mas, un 60 % o mas, un 70 % o mas, un 80 % o mas, un 90 % o mas o un 95 % o mas de la actividad chaperona de una protema DegP no mutada de tipo silvestre. Mas preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una protema DegP que tiene la misma actividad chaperona en comparacion con DegP de tipo silvestre.
La expresion “que tiene actividad proteasa reducida” en el contexto de la divulgacion significa que la protema DegP mutada no tiene la actividad proteasa completa en comparacion con la protema DegP no mutada de tipo silvestre. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una protema DegP que tiene un 50 % o menos, un 40 % o menos, un 30 % o menos, un 20 % o menos, un 10 % o menos o un 5 % o menos de la actividad proteasa de una protema DegP no mutada de tipo silvestre. Mas preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una protema DegP que no tiene actividad proteasa.
La celula de E. coli no es deficiente de DegP cromosomico, concretamente las secuencias del gen DegP no se han eliminado o mutado para prevenir la expresion de cualquier forma de protema DegP.
Puede introducirse cualquier mutacion adecuada en el gen DegP para producir una protema que tenga actividad chaperona y actividad proteasa reducida. La actividad proteasa y chaperona de una protema DegP expresada a partir de una bacteria gramnegativa puede ensayarse facilmente por un especialista en la materia mediante cualquier metodo adecuado tal como el metodo descrito en Spiess et al. en el que se ensayaron las actividades proteasa y chaperona de DegP en MalS, un sustrato natural de DegP (“A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein”. Cell, volumen 97, publicacion 3, paginas 339347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) y tambien el metodo descrito en “The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperaturas”, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658.
La DegP es una serinproteasa y tiene un centro activo consistente en una triada catalftica de residuos aminoaddicos His105, Asp135 y Ser210 (“Families of serine peptidases”, Methods Enzymol., 1994, 244: 19-61 Rawlings N y Barrett A). La mutacion de DegP para producir una protema que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida puede comprender una mutacion, tal como una mutacion con cambio de sentido, de uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210. Por consiguiente, el gen DegP mutado puede comprender:
• una mutacion en His 105; o
• una mutacion en Asp135; o
• una mutacion en Ser210; o
• una mutacion en His105 yAsp135; o
• una mutacion en His105 ySer210; o
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• una mutacion en Asp135 ySer210; o
• una mutacion en His105, Asp135 y Ser210.
Uno, dos o tres de His 105, Asp135 y Ser210 pueden mutarse a cualquier aminoacido adecuado que de como resultado una protema que tenga actividad chaperona y actividad proteasa reducida. Por ejemplo, pueden mutarse uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210 a un aminoacido pequeno tal como Gly o Ala. Es una mutacion adecuada adicional cambiar uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210 a un aminoacido que tenga propiedades opuestas tales como mutar Asp135 a Lys o Arg, mutar His105 polar a un aminoacido no polar tal como Gly, Ala, Val o Leu y mutar Ser210 hidrofilo pequeno a un residuo grande o hidrofobo tal como Val, Leu, Phe o Tyr. Preferiblemente, el gen DegP comprende la mutacion puntual S210A, como se muestra en la Figura 1c, que se ha encontrado que produce una protema que tiene actividad chaperona pero no actividad proteasa (“A Temperature- Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein”. Cell, volumen 97, publicacion 3, paginas 339-347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).
La presente divulgacion describe tambien una celula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida, en la que el gen DegP comprende una mutacion en His 105; o una mutacion en Asp135; o una mutacion en His105 y Asp135; o una mutacion en His105 y Ser210; o una mutacion en Asp135 y Ser210; o una mutacion en His105, Asp135 y Ser210, como se discute anteriormente.
La DegP tiene dos dominios PDZ, PDZ1 (residuos 260-358) y PDZ2 (residuos 359-448), que median la interaccion protema-protema (“A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein”. Cell, volumen 97, publicacion 3, paginas 339-347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M). En una realizacion de la presente invencion, el gen degP se muta para eliminar el dominio PDZ1 y/o el dominio PDZ2. La delecion de PDZ1 y PDZ2 da como resultado la perdida completa de actividad proteasa de la protema DegP y una actividad chaperona rebajada en comparacion con la protema DegP de tipo silvestre, mientras que la delecion de cualquiera de PDZ1 o PDZ2 da como resultado un 5 % de actividad proteasa y actividad chaperona similar en comparacion con la protema DegP de tipo silvestre (“A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein”. Cell, volumen 97, pulicacion 3, paginas 339-347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).
El gen DegP mutado puede comprender tambien un sitio de restriccion de origen no natural silencioso, tal como Ase I, para ayudar a los metodos de identificacion y cribado, por ejemplo, como se muestra en la Figura 1c.
La secuencia preferida del gen DegP mutado que comprende la mutacion puntual S210A y un sitio marcador de restriccion Ase I se proporciona en la SEQ ID NO: 9 y la secuencia proteica codificada se muestra en la SEQ ID NO: 10. Las mutaciones que se han realizado en la secuencia de DegP mutada de SEQ ID NO: 9 se muestran en la Figura 1c.
En las realizaciones de la presente invencion en las que la celula de E. coli comprende un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida, una o mas de las celulas de E. coli proporcionadas por la presente invencion pueden proporcionar un rendimiento mejorado de protemas plegadas correctamente a partir de la celula respecto a celulas mutadas en las que el gen DegP se ha mutado para desactivar genicamente DegP previniendo la expresion de DegP, tal como DegP cromosomico deficiente. En una celula que comprende un gen DegP mutado por desactivacion genica que previene la expresion de DegP, la actividad chaperona de DegP se pierde completamente, mientras que en la celula de E. coli segun una realizacion de la presente invencion se retiene la actividad chaperona de DegP mientras que se pierde la actividad proteasa total. En estas realizaciones, una o mas celulas de E. coli segun la presente invencion tienen una menor actividad proteasa para prevenir la proteolisis de la protema mientras mantienen la actividad chaperona para permitir un plegado y transporte correctos de la protema en la celula hospedadora.
El especialista en la materia sera capaz de ensayar facilmente protema secretada para ver si la protema esta plegada correctamente usando metodos bien conocidos en la materia, tales como HPLC de protema G, dicrofsmo circular, RMN, cristalograffa de rayos X y metodos de medida de afinidad de epttopo.
En estas realizaciones, una o mas celulas de E. coli segun la presente invencion pueden tener un crecimiento celular mejorado en comparacion con celulas portadoras de un gen DegP mutado con desactivacion genica que previene la expresion de DegP. Sin desear limitarse por la teona, el crecimiento celular mejorado puede exhibirse debido a que la proteasa DegP retiene actividad chaperona que puede aumentar la capacidad de la celula de procesar todas las protemas que requieren actividad chaperona. Por consiguiente, la produccion de protemas plegadas correctamente necesarias para el crecimiento y reproduccion celular puede aumentarse en una o mas de las celulas de E. coli de la presente invencion en comparacion con celulas portadoras de una mutacion de desactivacion genica de DegP, mejorando asf las rutas celulares que regulan el crecimiento. Adicionalmente, las cepas deficientes en proteasa DegP conocidas son generalmente sensibles a la temperatura y no crecen tfpicamente a temperaturas mayores de aproximadamente 28 °C. Sin embargo, las celulas de E. coli segun la presente invencion no son sensibles a la temperatura y pueden crecer a temperaturas de 28 °C o mayores, incluyendo temperaturas de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 37 °C, que se usan tfpicamente para la produccion a escala industrial de protemas a partir de
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bacterias.
La presente divulgacion describe tambien celulas bacterianas gramnegativas que comprenden un gen ptr mutado por desactivacion genica. Como se usa en la presente memoria, “gen ptr” significa un gen que codifica proteasa III, una proteasa que degrada protemas de alto peso molecular. La secuencia del gen ptr no mutado se muestra en la SEQ ID NO: 4 y la secuencia de la protema proteasa III no mutada se muestra en la SEQ ID NO: 5.
En ciertas realizaciones de la presente invencion, la celula de E. coli recombinante comprende un gen Tsp mutado por desactivacion genica. Como se usa en la presente memoria, “gen Tsp” significa un gen que codifica la proteasa Tsp (tambien conocida como Prc) que es una proteasa periplasmica capaz de actuar sobre la protema de union a penicilina 3 (PBP3) y protemas de cola de fago. La secuencia del gen Tsp no mutado se muestra en la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de la protema Tsp no mutada se muestra en la SEQ ID NO: 2.
Un gen ptr mutado puede codificar una proteasa III que tiene un 50 % o menos, un 40 % o menos, un 30 % o menos, un 20 % o menos, un 10 % o menos o un 5 % o menos de la actividad proteasa de una protema proteasa III no mutada de tipo silvestre. Mas preferiblemente, el gen ptr mutado codifica una protema proteasa III que no tiene actividad proteasa. En esta realizacion, la celula de E. coli no es deficiente en ptr cromosomico, concretamente la secuencia del gen ptr no se ha eliminado ni mutado para prevenir la expresion de cualquier forma de protema proteasa III.
Puede introducirse cualquier mutacion adecuada en el gen ptr para producir una protema proteasa III que tiene actividad proteasa reducida. La actividad proteasa de una protema proteasa III expresada a partir de una bacteria gramnegativa puede ensayarse facilmente por un especialista en la materia mediante cualquier metodo adecuado en la materia.
En el primer aspecto de la presente invencion, el gen Tsp mutado codifica una protema Tsp que tiene un 50 % o menos, un 40 % o menos, un 30 % o menos, un 20 % o menos, un 10 % o menos o un 5 % o menos de la actividad proteasa de una protema Tsp no mutada de tipo silvestre. Mas preferiblemente, el gen Tsp mutado codifica una protema Tsp que no tiene actividad proteasa. En esta realizacion, la celula de E. coli no es deficiente en Tsp cromosomico, concretamente la secuencia del gen Tsp no se ha eliminado ni mutado para prevenir la expresion de cualquier forma de protema Tsp.
Puede introducirse en el gen Tsp cualquier mutacion adecuada para producir una protema que tiene actividad proteasa reducida. La actividad proteasa de una protema Tsp expresada a partir de una bacteria gramnegativa puede ensayarse facilmente por un especialista en la materia mediante cualquier metodo adecuado en la materia, tal como el metodo descrito en Keiler et al (“Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease*” THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 270, No. 48, publicacion de 1 de diciembre, pag. 28864-28868, 1995 Kenneth C. Keiler y Robert T. Sauer) en el que se ensayaron las actividades proteasa de Tsp.
Se ha resenado en Keiler et al (supra) que Tsp tiene un sitio activo que comprende los residuos S430, D441 y K455 y los residuos G375, G376, E433 y T452 son importantes para mantener la estructura de Tsp. Keiler et al (supra) resena los hallazgos de que los genes de Tsp mutados S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A y T452A no teman actividad proteasa detectable. Se resena adicionalmente que el gen Tsp mutado con S430C presentaba aproximadamente un 5-10 % de actividad de tipo silvestre. Por consiguiente, la mutacion de Tsp para producir una protema que tenga actividad proteasa reducida puede comprender una mutacion, tal como una mutacion con cambio de sentido, en uno mas de los residuos S430, D441, K455, G375, G376, E433 y T452. Preferiblemente, la mutacion de Tsp para producir una protema que tenga actividad proteasa reducida puede comprender una mutacion, tal como una mutacion con cambio de sentido, de uno, dos o los tres residuos de sitio activo S430, D441 y K455.
Segun el gen Tsp mutado puede comprender:
• una mutacion en S430; o
• una mutacion en D441; o
• una mutacion en K455; o
• una mutacion en S430 y D441; o
• una mutacion en S430 y K455; o
• una mutacion en D441 y K455; o
• una mutacion en S430, D441 y K455.
Uno o mas de S430, D441, K455, G375, G376, E433 y T452 puede mutarse a cualquier aminoacido adecuado que de como resultado una protema que tenga actividad proteasa reducida. Son ejemplos de mutaciones adecuadas S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A y T452A. El gen Tsp mutado puede
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comprender una, dos o tres mutaciones en los residuos de sitio activo, por ejemplo, el gen puede comprender:
• S430A o S430C; y/o
• D441A; y/o
• K455A o K455H o K455R.
Preferiblemente, el gen Tsp comprende la mutacion puntual S430A o S430C.
En el primer aspecto de la presente invencion, la expresion “gen ptr mutado por desactivacion genica” y “gen Tsp mutado por desactivacion genica” en el contexto de la presente invencion significa que el gen comprende una o mas mutaciones, causando asf que la no expresion de la protema codificada por el gen proporcione una celula E. coli deficiente en la protema codificada por el gen mutado por desactivacion genica. El gen desactivado genicamente puede transcribirse parcial o completamente, pero no se traduce a la protema codificada.
El gen ptr mutado por desactivacion genica y/o gen Tsp mutado por desactivacion genica puede mutarse de cualquier modo adecuado, por ejemplo por una o mas de mutaciones de delecion, insercion, puntual, cambio de sentido, sin sentido y de desplazamiento de marco, causando la no expresion de la protema. Por ejemplo, el gen puede desactivarse genicamente por insercion de una secuencia de ADN extrana, tal como un marcador de resistencia a antibiotico, en la secuencia de codificacion del gen.
En una realizacion preferida del primer aspecto de la presente invencion, el gen no se muta por insercion de una secuencia de ADN extrana, tal como un marcador de resistencia a antibiotico, en la secuencia de codificacion del gen. Preferiblemente, el gen Tsp y/o el gen de proteasa III comprenden una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen, previniendo asf la expresion de la protema Tsp y/o de la protema proteasa III.
La celula segun el segundo aspecto de la divulgacion comprende mutaciones de desactivacion genica de Tsp y/o proteasa III donde el gen Tsp y el gen de proteasa III comprenden una mutacion en el codon de iniciacion del gen y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen, previniendo asf la expresion de la protema Tsp y/o la protema proteasa III.
Una mutacion en el codon de iniciacion del gen de desactivacion genica diana causa perdida de funcion del codon de iniciacion y asegura asf que el gen diana no comprenda un sitio de iniciacion adecuado al inicio de la secuencia de codificacion. La mutacion en el codon de iniciacion puede ser una mutacion de cambio de sentido de uno, dos o los tres nucleotidos del codon de iniciacion. Como alternativa, o adicionalmente, el codon de iniciacion puede mutarse por una mutacion de desplazamiento de marco de insercion o delecion.
El gen ptr y el gen Tsp comprenden cada uno un codon de iniciacion ATG. Si el gen comprende mas de un codon de iniciacion colocado adecuadamente, como se encuentra en el gen Tsp en que estan presentes dos codones ATG en el extremo 5' de la secuencia de codificacion, uno o ambos de los codones ATG pueden estar mutados con una mutacion con cambio de sentido.
En una realizacion preferida, el gen ptr se muta para cambiar el codon de iniciacion ATG a ATT, como se muestra en la Figura 1a. En una realizacion preferida, el gen Tsp se muta en el segundo codon ATG (codon 3) a TCG, como se muestra en la Figura 1b.
El gen ptr mutado por desactivacion genica y/o el gen Tsp mutado por desactivacion genica pueden comprender como alternativa o adicionalmente uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion del gen y en direccion 5' del codon de terminacion del gen. Preferiblemente, el gen ptr mutado por desactivacion genica y/o el gen Tsp mutado por desactivacion genica comprenden ambos una mutacion con cambio de sentido del codon de iniciacion y uno o mas codones de terminacion insertados.
El uno o mas codones de terminacion insertados son preferiblemente codones de terminacion en marco. Sin embargo, el uno o mas codones de terminacion insertados pueden ser como alternativa o adicionalmente codones de terminacion fuera de marco. Pueden requerirse uno o mas codones de terminacion fuera de marco para terminar la traduccion cuando un codon de iniciacion fuera de marco se cambia a un codon de iniciacion en marco por la insercion o delecion de una mutacion de desplazamiento de marco. El uno o mas codones de terminacion pueden introducirse mediante cualquier mutacion adecuada incluyendo una mutacion puntual con cambio de sentido y una mutacion con desplazamiento de fase. Los uno o mas codones de terminacion se introducen preferiblemente por una mutacion de desplazamiento de fase y/o una mutacion de insercion, preferiblemente mediante el reemplazo de un segmento de la secuencia genica por una secuencia que comprende un codon de terminacion. Por ejemplo, puede insertarse un sitio de restriccion Ase I que comprende el codon de terminacion TAA.
En una realizacion preferida, se muta el gen ptr para insertar un codon de terminacion en marco mediante insercion de un sitio de restriccion Ase I, como se muestra en la Figura 1a.
En una realizacion preferida, se muta el gen Tsp para eliminar “T” del quinto codon, causando asf un desplazamiento
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de marco que da como resultado codones de terminacion en los codones 11 y 16, como se muestra en la Figura 1b. En una realizacion preferida, se muta el gen Tsp para insertar un sitio de restriccion Ase I para crear un tercer codon de terminacion en marco en el codon 21, como se muestra en la Figura 1b.
En una realizacion preferida, el gen ptr mutado por desactivacion genica tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 6. Las mutaciones que se han realizado en la secuencia del gen ptr mutado por desactivacion genica de SEQ ID NO: 6 se muestran en la Figura 1a.
En una realizacion preferida, el gen Tsp mutado por desactivacion genica tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 3, que incluye los 6 nucleotidos ATGAAT en direccion 5' del codon de iniciacion. Las mutaciones que se han realizado en la secuencia de Tsp mutada por desactivacion genica de SEQ ID NO: 3 se muestran en la Figura 1b. En una realizacion, el gen Tsp mutado tiene la secuencia de ADN de nucleotidos 7 a 2048 de SEQ ID NO: 3.
Las mutaciones por desactivacion genica descritas anteriormente son ventajosas porque causan una desestabilizacion minima o nula del ADN cromosomico en direccion 5' o en direccion 3' del sitio del gen de desactivacion genica diana y no requieren la insercion y retencion de ADN extrano, tal como marcadores de resistencia a antibioticos, que pueden afectar a la aptitud de la celula para expresar una protema de interes, particularmente protemas terapeuticas. Por consiguiente, una o mas de las celulas de E. coli segun la presente invencion pueden exhibir caractensticas de crecimiento y/o expresion de protema mejoradas en comparacion con celulas en las que el gen de proteasa se ha desactivado genicamente por insercion de ADN extrano en la secuencia que codifica el gen.
Muchas mutaciones genomanipuladas, incluyendo mutaciones de desactivacion genica, implican el uso de marcadores de resistencia a antibiotico que permiten la seleccion e identificacion de celulas mutadas exitosamente. Sin embargo, como se discute anteriormente, hay una serie de desventajas al usar marcadores de resistencia a antibioticos.
Una realizacion adicional de la presente invencion supera las desventajas anteriores de usar marcadores de resistencia a antibiotico en la que los genes de proteasa mutados seleccionados de uno o mas de un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona pero no actividad proteasa; un gen ptr mutado que codifica proteasa IIII y un gen Tsp mutado que codifica proteasa Tsp se mutan para comprender uno o mas sitios marcadores de restriccion. Los sitios de restriccion se genomanipulan en el gen y no son de origen natural. Los sitios marcadores de restriccion son ventajosos porque permiten el cribado e identificacion de celulas modificadas correctamente que comprenden las mutaciones cromosomicas requeridas. Las celulas que se han modificado para portar uno o mas de los genes de proteasa mutados pueden analizarse por PCR de ADN genomico de lisados celulares usando pares oligonucleotfdicos disenados para amplificar una region del ADN genomico que comprende un sitio marcador de restriccion de origen no natural. El ADN amplificado puede analizarse entonces por electroforesis en gel de agarosa antes y despues de incubacion con una enzima de restriccion adecuada capaz de digerir el ADN en el sitio marcador de restriccion de origen no natural. La presencia de fragmentos de ADN despues de incubacion con la enzima de restriccion confirma que las celulas se han modificado exitosamente para portar el uno o mas genes de proteasa mutados.
En la realizacion en la que el gen ptr mutado por desactivacion genica tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 6, las secuencias cebadoras oligonucleotfdicas mostradas en la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 18 pueden usarse para amplificar la region del ADN que comprende el sitio de restriccion Ase I de origen no natural a partir del ADN genomico de celulas de E. coli transformadas. El ADN genomico amplificado puede incubarse entonces con la enzima de restriccion Ase I y analizarse por electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen ptr mutado en el ADN genomico.
En la realizacion en la que el gen Tsp mutado por desactivacion genica tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 3 o los nucleotidos 7 a 2048 de SEQ ID NO: 3, las secuencias cebadoras oligonucleotfdicas mostradas en la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16 pueden usarse para amplificar la region del ADN que comprende el sitio de restriccion Ase I de origen no natural a partir del ADN genomico de celulas de E. coli transformadas. El ADN genomico amplificado puede incubarse entonces con enzima de restriccion Ase I y analizarse por electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen Tsp mutado en el ADN genomico.
En la realizacion en la que el gen DegP mutado tiene la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 9, las secuencias cebadoras oligonucleotfdicas mostradas en la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20 pueden usarse para amplificar la region de ADN que comprende el sitio de restriccion Ase I de origen no natural a partir del ADN genomico de celulas de E. coli transformadas. El ADN genomico amplificado puede incubarse entonces con enzima de restriccion Ase I y analizarse por electroforesis en gel para confirmar la presencia del gen DegP mutado en el ADN genomico.
El uno o mas sitios de restriccion pueden introducirse mediante cualquier mutacion adecuada incluyendo mediante una o mas mutaciones de delecion, insercion, puntual, con cambio de sentido, sin sentido y con desplazamiento de marco. Puede introducirse un sitio de restriccion mediante la mutacion en el codon de iniciacion y/o la mutacion para introducir el uno o mas codones de terminacion, como se describe anteriormente. Esta realizacion es ventajosa porque el sitio marcador de restriccion es un marcador directo y unico de las mutaciones por desactivacion genica
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Puede insertarse un sitio marcador de restriccion que comprende un codon de terminacion en marco, tal como un sitio de restriccion Ase I. Esto es particularmente ventajoso porque el sitio de restriccion insertado sirve tanto como sitio marcador de restriccion como codon de terminacion para prevenir la transcripcion completa de la secuencia codificante del gen. Por ejemplo, en la realizacion en la que se introduce un codon de terminacion en el gen ptr mediante la introduccion de un sitio Ase I, esto crea tambien un sitio de restriccion, como se muestra en la Figura 1a. Por ejemplo, en la realizacion en la que se introduce un codon de terminacion en el gen Tsp en el codon 21 mediante la introduccion de un sitio Ase I, esto crea tambien un sitio de restriccion como se muestra en la Figura 1b.
Puede insertarse un sitio marcador de restriccion mediante la mutacion en el codon de iniciacion y opcionalmente una o mas mutaciones puntuales adicionales. En esta realizacion, el sitio marcador de restriccion es preferiblemente un sitio de restriccion EcoR I. Esto es particularmente ventajoso porque la mutacion en el codon de iniciacion crea tambien un sitio marcador de restriccion. Por ejemplo, en la realizacion en la que el codon de iniciacion del gen ptr se cambia a ATT, esto crea un sitio marcador EcoR I, como se muestra en la Figura 1a. Por ejemplo, en la realizacion en la que el codon de iniciacion (codon 3) del gen Tsp se cambia de ATG a TCG, como se muestra en la Figura 1b, una mutacion puntual adicional del codon 2 de AAC a ATT y la mutacion en el codon 3 de ATG a TCG crea un sitio marcador de restriccion EcoR I, como se muestra en la Figura 1b.
En el gen DegP, puede introducirse un sitio de restriccion marcador usando cambios de codon silenciosos. Por ejemplo, puede usarse un sitio Ase I como sitio marcador de restriccion silencioso, en el que el codon de terminacion TAA esta fuera de marco, como se muestra en la Figura 1c.
En las realizaciones de la presente invencion en las que el gen ptr y/o el gen Tsp se mutan para codificar una proteasa III o Tsp que tiene actividad proteasa reducida, pueden introducirse uno o mas sitios de restriccion marcadores usando cambios de codon silenciosos.
La celula de E. coli recombinante segun la presente invencion puede producirse mediante cualquier medio adecuado. El especialista en la materia conoce tecnicas adecuadas que pueden usarse para reemplazar una secuencia genica cromosomica por una secuencia genica mutada. Pueden emplearse vectores adecuados que permitan la integracion en el cromosoma hospedador por recombinacion homologa.
Se describen metodos de reemplazo genico adecuados, por ejemplo, en Hamilton et al. (“New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli”, Hamilton C. M. et al., Journal of Bacteriology Septiembre de 1989, Vol. 171, No. 9, pag. 4617-4622), Skorupski et al (“Positive selection vectors for allelic Exchange”, Skorupski K y Taylor R. K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al (“A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation”, Kiel J.A.K.W. et al, Mol Gen Genet 1987, 207: 294-301), Blomfield et al (“Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSC101 replicon”, Blomfield I.C. et al., Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) y Ried et al. (“An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis”, Ried J. L. y Collmer A., Gene 57 (1987) 239-246). Es un plasmido adecuado que posibilita una recombinacion/reemplazo homologo el plasmido pKO3 (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237).
Pueden identificarse cepas mutadas exitosamente usando metodos bien conocidos en la materia, incluyendo secuenciacion de ADN por PCR de colonia y cartograffa por enzimas de restriccion de PCR de colonia.
En la realizacion en la que la celula de E. coli comprende dos o tres de los genes de proteasa mutados, puede introducirse la proteasa mutada en la celula de E. coli en el mismo o diferentes vectores.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una celula de E. coli mutante de cepa MXE001 que tiene el genotipo ATsp y depositada el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13444.
Ademas, se divulga una celula de E. coli mutante de cepa MXE002 que tiene genotipo Aptr y depositada el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13445.
Ademas, se divulga una celula de E. coli mutante de cepa MXE003 que tiene genotipo DegP S210A y depositada el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13446.
En una realizacion adicional, la presente invencion proporciona una celula de E. coli mutante de cepa MXE004 que tiene genotipo ATsp Aptr y depositada el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13447.
En una realizacion, la presente invencion proporciona una celula de E. coli mutante de cepa MXE005 que tiene genotipo ATsp, DegP S210A y depositada el 12 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13448.
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Ademas, se divulga una celula de E. coli mutante de cepa MXE006 que tiene genotipo Aptr, DegP S210A y depositada el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13449.
En una realizacion, la celula de E. coli segun la presente invencion no porta un gen ompT mutado por desactivacion genica, tal como es deficiente en ompT cromosomico. En una realizacion, la celula de E. coli segun la presente invencion no porta ningun gen de proteasa mutado por desactivacion genica adicional.
La celula de E. coli segun la presente invencion puede comprender ademas una secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes. La secuencia polinucleotfdica que codifica la protema de interes puede ser exogena o endogena. La secuencia polinucleotfdica que codifica la protema de interes puede estar integrada en el cromosoma del hospedador o puede no estar no integrada en un vector, tfpicamente un plasmido.
En una realizacion, la celula de E. coli segun la presente invencion expresa una protema de interes. “Protema de interes” en el contexto de la presente memoria descriptiva pretende hacer referencia a un polipeptido para expresion, habitualmente un polipeptido recombinante. Sin embargo, la protema de interes puede ser una protema endogena expresada a partir de un gen endogeno en la celula hospedadora de E. coli.
Como se usa en la presente memoria, un “polipeptido recombinante” hace referencia a una protema que se construye o produce usando tecnologfa de aDn recombinante. La protema de interes puede ser una secuencia exogena identica a la protema endogena o una version mutada de la misma, por ejemplo con actividad biologica atenuada, o fragmento de la misma, expresada a partir de un vector exogeno. Como alternativa, la protema de interes puede ser una protema heterologa, no expresada normalmente por la celula de hospedadora de E. coli.
La protema de interes puede ser cualquier protema adecuada, incluyendo una protema terapeutica, profilactica o de diagnostico.
En una realizacion, la protema de interes es util en el tratamiento de enfermedades o trastorno que incluyen enfermedades y trastornos inflamatorios, enfermedades y trastornos inmunitarios y trastornos fibroticos y canceres.
La expresion “enfermedad o trastorno inflamatorio” y “enfermedad o trastorno inmunitario” incluye artritis reumatoide, artritis psoriasica, enfermedad de Still, enfermedad de Muckle Wells, psoriasis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, LSE (lupus sistemico eritematoso), asma, rinitis alergica, dermatitis atopica, esclerosis multiple, vasculitis, diabetes sacarina de tipo I, trasplante y enfermedad de injerto contra el hospedador.
La expresion “trastorno fibrotico” incluye fibrosis pulmonar idiopatica (FPI), esclerosis sistemica (o escleroderma), fibrosis renal, nefropatfa diabetica, nefropatfa de IgA, hipertension, enfermedad renal de etapa terminal, fibrosis peritoneal (dialisis peritoneal ambulatoria continua), cirrosis hepatica, degeneracion macular relacionada con la edad (DMRA), retinopatfa, fibrosis reactiva cardiaca, cicatrizacion, queloides, quemaduras, ulceras cutaneas, angioplastia, cirugfa de derivacion coronaria, artroplastia y cirugfa de cataratas.
El termino “cancer” incluye un nuevo crecimiento maligno que surge del epitelio, encontrado en piel o, mas comunmente, el revestimiento de organos corporales, por ejemplo: mama, ovario, prostata, pulmon, rinon, pancreas, estomago, vejiga o intestino. Los canceres tienden a infiltrarse en tejido adyacente y extenderse (metastatizarse) a organos distantes, por ejemplo a hueso, hugado, pulmon o cerebro.
La protema puede ser un polipeptido sensible proteolfticamente, concretamente protemas que tienden a escindirse, susceptibles de escindirse o escindidas por una o mas proteasas bacterianas gramnegativas, tales como de E. coli, en estado nativo o durante la secrecion. En una realizacion, la protema de interes es sensible proteolfticamente a una proteasa seleccionada de DegP, proteasa III y Tsp. En una realizacion, la protema de interes es sensible proteolfticamente a las proteasas DegP y proteasa III. En una realizacion, la protema de interes es sensible proteolfticamente a las proteasas DegP y Tsp. En una realizacion, la protema de interes es sensible proteolfticamente a las proteasas Tsp y proteasa III. En una realizacion, la protema de interes es sensible proteolfticamente a las proteasas DegP, proteasa III y Tsp.
Preferiblemente, la protema es un polipeptido eucariotico.
La protema de interes expresada por las celulas de E. coli segun la invencion pueden ser, por ejemplo, un inmunogeno, una protema de fusion que comprende dos protemas heterologas o un anticuerpo. Los anticuerpos para uso como protema de interes incluyen anticuerpos monoclonales, multivalentes, multiespedficos, humanizados, totalmente humanos o quimericos. El anticuerpo puede ser de cualquier especie, pero deriva preferiblemente de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano o un fragmento humanizado. El anticuerpo puede derivar de cualquier clase (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD o IgA) o subclase de molecula de inmunoglobulina y puede obtenerse de cualquier especie, incluyendo por ejemplo raton, rata, tiburon, conejo, cerdo, hamster, camello, llama, cabra o ser humano. Pueden obtenerse partes del fragmento de anticuerpo a partir de una o mas especies, por ejemplo los fragmentos de anticuerpo pueden ser quimericos. En un ejemplo, las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra.
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El anticuerpo puede ser una molecula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesadas y ligeras completas o un fragmento de las mismas, p. ej. VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, Fv, fragmento scFv, Fab-Fv o un anticuerpo de especificidad dual, tal como un Fab-dAb, como se describe en el documento PCT/GB2008/003331.
El anticuerpo puede ser espedfico de cualquier antigeno diana. El antigeno puede ser una protema asociada a celula, por ejemplo una protema de superficie celular sobre celulas tales como celulas bacterianas, celulas de levadura, linfocitos T, celulas endoteliales o celulas tumorales, o puede ser una protema soluble. Los antigenos de interes pueden ser tambien cualquier protema medicamente relevante tal como aquellas protemas reguladas positivamente durante enfermedad o infeccion, por ejemplo receptores y/o sus correspondientes ligandos. Los ejemplos particulares de protemas de superficie celular incluyen moleculas de adhesion, por ejemplo integrinas tales como integrinas pi, p. ej. VLA-4, E-selectina, P selectina o L selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 o receptor de CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulina 2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, similar a nectina 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antfgeno carcinoembrionario (CEA), globulina de grasa de leche humana (HMFG1 y 2), antigenos de MHC de clase I y MHC de clase II, KDR y vEgF y, cuando sea apropiado, receptores de las mismas.
Los antfgenos solubles incluyen interleucinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL- 16 o IL-17, tales como IL17A y/o IL17F, antfgenos vmcos, por ejemplo antfgenos de virus respiratorio sincitial o citomegalovirus, inmunoglobulinas tales como IgE, interferones tales como interferon a, interferon p o interferon y, factor de necrosis tumoral TNF (anteriormente conocido como factor de necrosis tumoral a), factor de necrosis tumoral p, factores estimulantes de colonias tales como as G-CSF o GMCSF y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF-a y PDGF-p y, cuando sea apropiado, receptores de los mismos. Otros antfgenos incluyen antfgenos de superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus tales como de la gripe, EBV, Hep A, B y C, agente de bioterrorismo, radionucleidos y metales pesados y venenos y toxinas de serpientes y aranas.
En una realizacion, el anticuerpo puede usarse para alterar funcionalmente la actividad del antfgeno de interes. Por ejemplo, el anticuerpo puede neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad de dicho antfgeno, directa o indirectamente.
En una realizacion preferida, la protema de interes expresada por las celulas de E. coli segun la presente invencion es un anticuerpo anti-TNF, mas preferiblemente un Fab' anti-TNF, como se describe en el documento WO01/094585.
Preferiblemente, la molecula de anticuerpo tiene especificidad por TNF humano (anteriormente conocido como TNFa), en el que la cadena ligera comprende la region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y la cadena pesada comprende la region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 12.
Preferiblemente, la molecula de anticuerpo que tiene especificidad por TNF humano es un Fab' y tiene una secuencia de cadena ligera que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 13 y una secuencia de cadena pesada que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 14.
Los inventores de la presente invencion han descubierto sorprendentemente que el rendimiento de Fab puede mejorarse mediante expresion en una o mas celulas de E. coli segun la presente invencion. Sin desear limitarse por la teona, el gen DegP mutado usado en las cepas de E. coli de la presente invencion que tiene actividad chaperona y actividad proteasa reducida mejora el rendimiento de Fab porque la actividad chaperona de DegP facilita el plegamiento correcto de Fab.
Despues de la expresion, los fragmentos de anticuerpo pueden procesarse adicionalmente, por ejemplo por conjugacion con otra entidad tal como una molecula efectora.
La expresion molecula efectora como se usa en la presente memoria incluye, por ejemplo, agentes antineoplasicos, farmacos, toxinas (tales como toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano o vegetal y fragmentos de la mismas, p. ej. ricina y fragmentos de la misma), protemas biologicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, polfmeros de origen sintetico o natural, acidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej. ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionucleidos, particularmente radioyodo, radioisotopos, metales quelados, nanopartmulas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que puedan detectarse por espectroscopfa por RMN o REE. Las moleculas efectoras pueden enlazarse con el anticuerpo o fragmento del mismo mediante cualquier metodo adecuado, por ejemplo un fragmento de anticuerpo puede modificarse para enlazar al menos una molecula efectora como se describe en los documentos WO05/003171 o WO05/003170. Los documentos WO05/003171 o WO05/003170 describen tambien moleculas efectoras adecuadas.
En una realizacion, el anticuerpo o fragmento del mismo, tal como un Fab, se PEGila para generar un producto con las propiedades requeridas, por ejemplo similares a los anticuerpos enteros, si se requiere. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un Fab' anti-TNFa PEGilado como se describe en el documento WO01/094585, que tiene
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preferiblemente enlazado en uno de los residuos de cistema en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo derivado de lisilmaleimida, en el que cada uno de los dos grupos amino del residuo de lisilo tiene ligado covalentemente al mismo un residuo de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da, de tal modo que el peso molecular medio total de los residuos de metoxipoli(etilenglicol) sea de aproximadamente 40.000 Da, mas preferiblemente el grupo derivado de lisilmaleimida es [1-[[[2-[[3-(2,5-dioxo-1- pirrolidinil)-1-oxopropil]amino]etil]amino]carbonil]-1,5-pentanodiil]bis(iminocarbonilo).
La celula de E. coli puede comprender tambien secuencias polinucleotfdicas adicionales que codifican una o mas protemas de interes adicionales.
El polinucleotido que codifica la protema de interes puede expresarse como una fusion con otro polipeptido, preferiblemente una secuencia senal u otro polipeptido que tiene un sitio de escision espedfico en el extremo N del polipeptido maduro. La secuencia senal heterologa seleccionada debena ser una reconocida y procesada por la celula hospedadora de E. coli. Para celulas hospedadoras de E. coli que no reconocen ni procesan la secuencia senal nativa o de polipeptido eucariotico, se sustituye la secuencia senal por una secuencia senal procariotica. Las secuencias senal adecuadas incluyen OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA y DsbC.
En una realizacion, se emplea un modulo de expresion en la presente invencion para portar el polinucleotido que codifica la protema de interes que comprende tfpicamente una o mas secuencias codificantes de protema que codifican una o mas protemas de interes y una o mas secuencias reguladoras de expresion. La una o mas secuencias reguladoras de expresion pueden incluir un promotor. La una o mas secuencias reguladoras de expresion pueden incluir tambien una region 3' no traducida tal como una secuencia de terminacion. Se discuten promotores adecuados con mas detalle a continuacion.
En una realizacion, la celula de E. coli segun la presente invencion comprende un vector, tal como un plasmido. El vector comprende preferiblemente uno o mas modulos de expresion como se definen anteriormente.
El vector para uso en la presente invencion puede producirse insertando un modulo de expresion como se define anteriormente en un vector adecuado. Como alternativa, las secuencias reguladoras de expresion para dirigir la expresion de la secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes pueden estar contenidas en el vector y por tanto puede requerirse solo la region codificante del polinucleotido para completar el vector.
Los ejemplos de vectores que pueden emplearse para transformar la celula hospedadora de E. coli con un polinucleotido segun la invencion incluyen:
• un plasmido tal como pBR322 o PACYC184, y/o
• un vector vmco tal como un fago bacteriano
• un elemento genetico transponible tal como un transposon.
Estan disponibles muchas formas de vector de expresion. Tales vectores comprenden habitualmente un origen de replicacion de ADN de plasmido, un marcador seleccionable de antibiotico, un promotor y un terminador transcripcional separados por un sitio de multiclonacion (modulo de expresion) y una secuencia de ADN que codifica un sitio de union a ribosoma.
Los promotores empleados en la presente invencion pueden ligarse con el polinucleotido relevante directamente o como alternativa localizarse en una posicion apropiada, por ejemplo en un vector tal que, cuando se inserta el polipeptido relevante, el promotor relevante pueda actuar sobre el mismo. En una realizacion, el promotor se localiza antes de la porcion codificante del polinucleotido sobre el que actua, por ejemplo un promotor relevante antes de cada porcion codificante de polinucleotido. “Antes” como se usa en la presente memoria pretende implicar que el promotor esta localizado en el extremo 5' con respecto a la porcion polinucleotfdica codificante.
Los promotores pueden ser endogenos o exogenos de las celulas hospedadoras de E. coli. Los promotores adecuados incluyen Lac, tac, trp, PhoA, Ipp, Arab, Tet y T7.
Uno o mas promotores empleados pueden ser promotores inducibles.
Las unidades de expresion para uso en sistemas bacterianos contienen generalmente tambien una secuencia ribosomica de Shine-Dalgarno (S. D.) ligada operativamente con el ADN codificante del polipeptido de interes.
En las realizaciones de la presente invencion en las que una secuencia polinucleotfdica comprende dos o mas secuencias codificantes de dos o mas protemas de interes, por ejemplo una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo, la secuencia polinucleotfdica puede comprender una o mas secuencias de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) que permiten la iniciacion de la traduccion en el medio de un ARNm. Una secuencia de IRES puede estar situada entre secuencias polinucleotfdicas codificantes para potenciar la traduccion separada del ARNm produciendo las secuencias polipeptfdicas codificadas.
Los terminadores pueden ser endogenos o exogenos de las celulas hospedadoras de E. coli. Es un terminador
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adecuado rrnB.
Pueden encontrarse reguladores transcripcionales adecuados adicionales, incluyendo promotores y terminadores y metodos de orientacion a protema, en "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli" Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Septiembre de 1996, pag. 512-538.
Las realizaciones de la invencion descritas en la presente memoria con referencia al polinucleotido se aplican igualmente a realizaciones alternativas de la invencion, por ejemplo vectores, modulos de expresion y/o celulas hospedadoras de E. coli que comprenden los componentes empleados en las mismas, siempre que el aspecto relevante pueda aplicarse a las mismas.
Segun un tercer aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para producir una protema de interes recombinante que comprende expresar la protema de interes recombinante en una celula de E. coli recombinante de la presente invencion.
La celula de E. coli y protema de interes empleadas preferiblemente en el metodo de la presente invencion se describen con detalle anteriormente.
Cuando el polinucleotido codificante de la protema de interes es exogena, el polinucleotido puede incorporarse a la celula hospedadora de E. coli usando cualquier medio adecuado conocido en la materia. Tfpicamente, el polinucleotido se incorpora como parte de un vector de expresion que se transforma en la celula de E. coli. Por consiguiente, en un aspecto la celula de E. coli segun la presente invencion comprende un modulo de expresion que comprende el polinucleotido codificante de la protema de interes.
La secuencia polinucleotidica puede transformarse en una celula usando tecnicas estandares, por ejemplo empleado cloruro de rubidio, PEG o electroporacion.
El metodo segun la presente invencion puede emplear tambien un sistema de seleccion para facilitar la seleccion de celulas de E. coli estables que se han transformado exitosamente con el polinucleotido codificante de la protema de interes. El sistema de seleccion emplea tfpicamente la cotransformacion de una secuencia polinucleotfdica codificante de un marcador de seleccion. En una realizacion, cada polinucleotido transformado en la celula de E. coli comprende ademas una secuencia polinucleotfdica que codifica uno o mas marcadores de seleccion. Por consiguiente, la transformacion de polinucleotido que codifica la protema de interes y el uno o mas polinucleotidos que codifican el marcador ocurre conjuntamente y el sistema de seleccion puede emplearse para seleccionar aquellas celulas de E. coli que producen las protemas deseadas.
Las celulas capaces de expresar el uno o mas marcadores son capaces de sobrevivir/crecer/multiplicarse en ciertas condiciones impuestas artificialmente, por ejemplo la adicion de una toxina o antibiotico, debido a las propiedades dotadas por el componente polipeptidico/genico o polipeptfdico del sistema de seleccion incorporado a las mismas (p. ej., resistencia a antibiotico). Aquellas celulas que no pueden expresar el uno o mas marcadores no son capaces de sobrevivir/crecer/multiplicarse en las condiciones impuestas artificialmente. Las condiciones impuestas artificialmente pueden elegirse para ser mas o menos rigurosas, segun se requiera.
Puede emplearse cualquier sistema de seleccion adecuado en la presente invencion. Tfpicamente, el sistema de seleccion puede estar basado en la inclusion en el vector de uno o mas genes que proporcionen resistencia a un antibiotico conocido, por ejemplo un gen de resistencia a tetraciclina, cloranfenicol, kanamcina o ampicilina. Pueden seleccionarse las celulas de E. coli que crecen en presencia de un antibiotico relevante, ya que expresan tanto el gen que da resistencia al antibiotico como la protema deseada.
En una realizacion, el metodo segun la presente invencion comprende ademas la etapa de cultivar la celula de E. coli transformada en un medio para expresar asf la protema de interes.
Puede usarse un sistema de expresion inducible o un promotor constitutivo en la presente invencion para expresar la protema de interes. Los sistemas de expresion inducibles y promotores constitutivos son bien conocidos en la materia.
Puede usarse cualquier medio adecuado para cultivar la celula de E. coli transformada. El medio puede adaptarse para un sistema de seleccion espedfico, por ejemplo el medio puede comprender un antibiotico para permitir que solo aquellas celulas de E. coli que se hayan transformado exitosamente crezcan en el medio.
Las celulas de E. coli obtenidas a partir del medio pueden someterse a cribado y/o purificacion adicional segun se requiera. El metodo puede comprender ademas una o mas etapas para extraer y purificar la protema de interes segun se requiera.
El polipeptido puede recuperarse de la cepa, incluyendo del citoplasma, periplasma o medio de cultivo.
El metodo o metodos espedficos usados para purificar una protema dependen del tipo de protema. Los metodos adecuados incluyen fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio ionico; precipitacion con etanol; HPLC en fase inversa; cromatograffa de interaccion hidrofoba; cromatograffa en sflice; cromatograffa en una resina
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de intercambio ionico tal como S-SEPHAROSE y DEAE; cromatoenfoque; precipitacion con sulfato de amonio y filtracion en gel.
Los anticuerpos pueden separarse adecuadamente del medio de cultivo y/o extracto de citoplasma y/o extracto de periplasma mediante procedimientos de purificacion de anticuerpo convencionales tales como, por ejemplo, protema A-Sepharose, cromatograffa de protema G, cromatograffa de protema L, resinas en modo mixto tiofflicas, marcaje His, marcaje FLAG, cromatograffa de hidroxiapatito, electroforesis en gel, dialisis, cromatograffa de afinidad, fraccionamiento/precipitacion con sulfato de amonio, etanol o PEG, membranas de intercambio ionico, cromatograffa de adsorcion de lecho expandido (EBA) o cromatograffa de lecho movil simulado.
El metodo puede incluir tambien una etapa adicional de medida de la cantidad de expresion de la protema de interes y seleccion de las celulas de E. coli que tienen altos niveles de expresion de la protema de interes.
Pueden efectuarse una o mas etapas de metodo descritas en la presente memoria en combinacion en un recipiente adecuado tal como un biorreactor.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Generacion de cepas de celulas de E. coli mutantes
La cepa de celula hospedadora usada era W3110de genotipo: F-LAM-IN (rrnD-rrnE)l rphl (ATCC n° 27325). W3110A, como se muestra en las figuras, es un lote diferente de W3110.
Se generaron las siguientes cepas de celulas de E. coli mutantes usando un sistema de vector de reemplazo genico que usa el plasmido de recombinacion/reemplazo homologo pKO3 (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237).
Cepa de celula de E. coli mutante
Genotipo
MXE001
ATsp
MXE004
ATsp, Aproteasa III
MXE005
ATsp, DegP S210A
Se deposito la cepa MXE001 el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13444.
Se deposito la cepa MXE004 el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13447.
Se deposito la cepa MXE005 el 21 de mayo de 2009 en la National Collection of Type Cultures, HPA, Reino Unido, con numero de acceso NCTC13448.
Se desplazaron los modulos de integracion de Tsp, proteasa III y DegP como fragmentos de restriccion de Sal I, Not I a plasmidos pKO3 de restriccion similar.
El plasmido usa el mutante sensible a la temperatura del origen de replicacion de pSC101 (RepA) junto con un marcador de cloranfenicol para forzar y seleccionar eventos de integracion cromosomica. El gen sacB que codifica levansucrasa es letal para E. coli crecida en sacarosa y, por ello se usa (junto con el marcador de cloranfenicol y el origen de pSC101) para forzar y seleccionar eventos de desintegracion y curacion de plasmido. Esta metodologfa se ha descrito anteriormente (Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 y Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). El sistema pKO3 retira todos los marcadores selectivos del genoma hospedador excepto del gen insertado.
Se construyeron los siguientes plasmidos.
pMXE191 que comprende el gen Tsp mutado por desactivacion genica como se muestra en la SEQ ID NO: 3 que comprende los marcadores de restriccion EcoR I y Ase I.
pMXE192 que comprende el gen de proteasa III mutado por desactivacion genica como se muestra en la SEQ ID NO: 6 que comprende los marcadores de restriccion EcoR I y Ase I.
pMXE192 que comprende el gen DegP mutado como se muestra en la SEQ ID NO: 9 que comprende un Ase I.
Se transformaron entonces estos plasmidos en celulas W3110 de E. coli qmmicamente competentes preparadas usando el metodo encontrado en Chung CT et al. “Transformation and storage of bacterial cells in the same
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solution”. PNAS 86: 2172-2175 (1989).
Dia 1. Se mezclaron 40 pl de celulas de E.coli con 1 pl (10 pg) de ADN de pKO3 en una cubeta de electroporacion BioRad enfriada de 0,2 cm antes de electroporacion a 250o V, 25 pF y 200 Q. Se anadieron 1000 pl de 2xPY inmediatamente y se recuperaron las celulas por agitacion a 250 rpm en una incubadora a 30 °C durante 1 hora. Se diluyeron las celulas en serie 1/10 en 2xPY antes de sembrar alfcuotas de 100 pl sobre placas de agar 2xPY que contema cloranfenicol 20 pg/ml precalentadas a 30 °C y 43 °C. Se incubaron las placas durante una noche a 30 °C y 43 °C.
D^a 2. El numero de colonias crecidas a 30 °C daba una estimacion de la eficacia de electroporacion, mientras que las colonias que sobreviven al crecimiento a 43 °C representan eventos de integracion potenciales. Se eligieron colonias individuales de la placa de 43 °C y se resuspendieron en 10 ml de 2xPY. Se sembraron 100 pl de esto en placas de agar 2xPY que conteman sacarosa al 5 % (p/v) precalentadas a 30 °C para generar colonias individuales. Se incubaron las placas durante una noche a 30 °C.
Dia 3. Las colonias representan aqu eventos de desintegracion y curacion de plasmido simultaneos potenciales. Si los eventos de desintegracion y curacion sucedfan tempranamente en el crecimiento, entonces el grueso de la masa de colonias sera clonal. Se eligieron colonias individuales y se sembraron por duplicado en agar 2xPY que contema cloranfenicol 20 pg/ml o sacarosa al 5 % (p/v). Se incubaron las placas durante una noche a 30 °C.
Dia 4. Las colonias que tanto crecen en sacarosa como mueren en cloranfenicol representan eventos de reemplazo cromosomico y de curacion de plasmido potenciales. Se eligieron estas y se cribaron por PCR con un oligonucleotido espedfico de mutacion. Las colonias que generaron una banda de PCR positiva del tamano correcto se recortaron para producir colonias individuales en agar 2xPY que contema sacarosa al 5 % (p/v) y se incubaron las placas durante una noche a 30 °C.
Dia 5. Se usaron colonias individuales de E. coli positivas de PCR, sensibles a cloranfenicol y resistentes a sacarosa para elaborar celulas qmmicamente competentes en soluciones madre de glicerol, y actuan como moldes de PCR para una reaccion PCR con oligos flanqueantes 5' y 3' para generar un producto de PCR para secuenciacion de ADN directa usando polimerasa Taq.
Se ensayaron las cepas celulares MXE001, MXE004 y MXE005 para confirmar la modificacion exitosa de ADN genomico portador de uno o mas genes de proteasa mutados por amplificacion por PCR de la region de cada gen de proteasa mutada que comprende un sitio de restriccion Ase I de origen no natural, como se muestra en las Figuras 1a, 1b y 1c, usando cebadores oligonucleotidicos. Se analizaron entonces las regiones amplificadas del ADN por electroforesis en gel antes y despues de incubacion con enzima de restriccion Ase I para confirmar la presencia del sitio de restriccion Ase I de origen no natural en los genes mutados. Se llevo a cabo el metodo como sigue:
Se usaron los siguientes oligos para amplificar, usando PCR, ADN genomico de lisados de celulas de E. coli preparadas a partir de MXE001, MXE004, MXE005 y W3110:
6284 Tsp 3’
6283 Tsp 5’
6362 Protease III 3’ 6361 Protease III 5’ 6282 DegP 5'
6281 DegP 3'
5’-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3' (SEQ ID NO: 15) 5’-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3' (SEQ ID 16) NO: 5’-GTGCCAGGAGATGCAGCAGCTTGC-3’ (SEQ ID NO 17) 5’-TTTGCAGCCAGTCAGAAAGTG-3' (SEQ ID NO: 18) 5’-CTGCCTGCGATTTTCGCCGGAACG-3’ (SEQ ID NO 19) 5’-CGCATGGTACGTGCCACGATATCC-3’ (SEQ ID NO 20)
Se prepararon los lisados calentando una colonia individual de celulas durante 10 minutos a 95 °C en 20 pl de tampon 1x PCR. Se dejo enfriar la mezcla a temperatura ambiente y entonces centrifugacion a 13.200 rpm durante 10 minutos. Se retiro el sobrenadante y se marco como “lisado celular”.
Se amplifico cada cepa usando cada par de oligos par de Tsp, par de proteasa III y par de DegP.
Se amplifico el ADN usando un procedimiento de PCR estandar.
5 ul tampon x10 (Roche)
1 ul mezcla de dNTP (Roche, mezcla 10 mM)
1.5 ul oligo 5' (5 pmol)
1.5 ul oligo 3' (5 pmol)
2 ul lisado celular
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0,5 ul
ADN polimerasa Taq (Roche 5U/ul)
38,5 ul
H2O
Ciclo de
PCR
94 °C
1 minuto
94 °C
1 minuto)
55 °C
1 minuto) repetido durante 30 ciclos
72 °C
1 minuto)
72 °C
10 minutos
Una vez se completaron las reacciones, se retiraron 25 ul a un tubo de microcentnfuga nuevo para digestion con Ase I. Se anadieron a los 25 ul de reaccion PCR 19 ul de H2O, 5 ul de tampon 3 (NEB), 1 ul de Ase I (NEB), se mezclo y se incubo a 37 °C durante 2 horas.
Se anadieron a la reaccion PCR restante 5 ul de tampon de carga (x6) y se cargaron 20 ul en 200 ml de gel de agarosa con TAE al 0,8 % (Invitrogen) mas bromuro de etidio (5 ul de solucion madre de 10 mg/ml) y se ejecuto a 110 voltios durante 1 hora. Se cargaron 10 ul de marcador de tamano (marcador de ADN Perfect de 0,1-12 Kb, Novagen) en el carril final.
Una vez se completaron las digestiones con Ase I, se anadieron 10 ul de tampon de carga (x6) y se cargaron 20 ul en gel de agarosa con TAE al 0,8 % (Invitrogen) mas bromuro de etidio (5 ul de solucion madre 10 mg/ml) y se ejecuto a 100 voltios durante 1 hora. Se cargaron 10 ul de marcador de tamano (marcador de ADN Perfect de 0,1-12 Kb, Novagen) en el carril final.
Se visualizaron ambos geles usando un transiluminador de UV.
Todos los fragmentos genomicos amplificados mostraron la banda de tamano correcto de 2,8 kb para Tsp, 1,8 kb para proteasa III y 2,2 kb para DegP.
Despues de digestion con Ase I, esto confirmo la presencia de sitios Ase I introducidos en las cepas deficientes de proteasa pero no en el control de W3110.
MXE001: Se amplifico ADN genomico usando el conjunto de cebadores de Tsp y se digirio el ADN resultante con Ase I, produciendo bandas de 2,2 y 0,6 kpb.
MXE004: Se amplifico ADN genomico usando el conjunto de cebadores de Tsp y el conjunto de cebadores de proteasa III y se digirio el ADN resultante con Ase I, produciendo bandas de 2,2 y 0,6 kpb (fragmentos de Tsp) y bandas de 1,0 y 0,8 kbp (fragmentos de proteasa III).
MXE005: Se amplifico ADN genomico usando el conjunto de cebadores de Tsp y el conjunto de cebadores de DegP y se digirio el ADN resultante con Ase I, produciendo bandas de 2,2 y 0,6 kpb (fragmentos de Tsp) y bandas de 1,25 y 0,95 kpb (fragmentos de DegP).
El ADN amplificado por PCR de W3110 no se digirio con la enzima de restriccion Ase I.
Se construyo el plasmido pMXE117 (pTTO CDP870 o 40.4), un vector de expresion de Fab' CDP870 (un Fab' anti- TNF), usando metodologfas de clonacion de restriccion convencionales que pueden encontrarse en Sambrook et al 1989, “Molecular cloning: a laboratory manual”. CSHL press, N.Y. El plasmido pMXE1 17 (pTTO CDP870 o 40.4) contema los siguientes rasgos: un promotor tac fuerte y una secuencia operadora lac. Se transcribieron los genes de cadena ligera y pesada de Fab en forma de un mensaje dicistronico individual. Se fusiono el ADN codificante del peptido senal de la protema OmpA de E. coli con el eXtremo 5' de ambas secuencias genicas de cadena ligera y pesada, que dirigfan la translocacion de los polipeptidos al periplasma de E. coli. Se termino la transcripcion usando un terminador de transcripcion dual rrnB tlt2. El gen laclq codificaba la protema represora Lac I expresada constitutivamente. Esta transcripcion reprimida del promotor tac hasta desrrepresion se indujo por la presencia de alolactosa o IPTG. El origen de replicacion usado era p15A, que mantema un bajo numero de copias. El plasmido contema un gen de resistencia a tetraciclina para seleccion de antibiotico.
Se transformo entonces pMXE117 en celulas deficientes en proteasas qmmicamente competentes (cepas MXE001, MXE004 y MXE005) y celulas W3110 preparadas usando el metodo encontrado en Chung C.T et al. “Transformation and storage of bacterial cells in the same solution”. PNAS 86: 2172-2175 (1989).
Ejemplo 2- Expresion de un Fab anti-TNFa en cepas de E. coli mutadas usando cultivos de matraz agitado
Se ensayaron las cepas MXE001, MXE004 y MXE005 en un experimento de matraz agitado que compara el
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crecimiento y la expresion de un Fab' anti-TNFa contra W3110.
Se efectuo el protocolo experimental de matraz agitado usado como sigue:
Preparacion de celulas adaptadas a medio definido.
Se eligio una colonia individual en 5 ml de caldo 2xPY (1 % de Phytone, Difco, 0,5 % de extracto de levadura, Difco, 0,5 % de NaCl) mas tetraciclina (Sigma) a 10 ug/ml y se dejo crecer durante una noche a 37 °C con agitacion a 250 rpm. Se usaron 100 ul de este cultivo de una noche para inocular 200 ml de medio SM6E qmmicamente definido (descrito en Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320) mas tetraciclina 10 ug/ml, crecido durante una noche a 30 °C con agitacion a 250 rpm. Se usaron 100 ul de este segundo cultivo de una noche para inocular un segundo matraz de medio SM6E de 200 ml mas tetraciclina 10 ug/ml. Se dejo crecer este hasta que el cultivo alcanzo una DO600 de aproximadamente 2. Se centrifugaron los cultivos brevemente para recoger celulas antes de resuspender en 100 ml de SM6E. Se anadio glicerol a una concentracion final del 12,5 % antes de almacenar alfcuotas de “celulas adaptadas” a -80 °C.
Experimento de matraz de cultivo de 200 ml
Se iniciaron cultivos de matraz agitado mediante la adicion de una alfcuota de 2 ml de medio definido descongelado de “celulas adaptadas” a 200 ml de medio SM6E mas tetraciclina 10 ug/ml. Se dejaron crecer estos durante una noche a 30 °C con agitacion a 250 rpm. Cada cepa que se ensaya se dejo crecer por triplicado.
Se indujo en cultivos crecidos hasta DO600 de 2,0 la produccion de protema heterologa mediante la adicion de IPTG 200 uM. Se tomaron muestras de cultivo de 1 ml a 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h y 24 h y, despues de centrifugacion a 13.200 rpm durante 5 minutos, se resuspendio el sedimento celular en 200 ul de tampon de extraccion periplasmica (TrisCl 100 mM/EDTA 10 mM pH 7,4). Se agitaron los extractos periplasmicos a 250 rpm durante una noche a 30 °C. El dfa siguiente, se centrifugaron los extractos durante 10 minutos a 13.200 rpm, se decanto el sobrenadante y se almaceno a -20 °C como “extracto periplasmico”. Se desecho el sedimento de celulas gastadas.
Cuantificacion de ELISA
Se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos durante una noche a 4 °C con AB141 (CH1 de conejo anti-humano, UCB) a 2 jgmM en PBS. Despues de lavar 3x con 300 ul de tampon de muestra/conjugado (PBS, BSA al 0,2 % (p/v), Tween 20 al 0,1 % (v/v)), se efectuaron diluciones en serie 1/2 de muestras y patrones en la placa en 100 jl de tampon de muestra/conjugado y se agito la placa a 250 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar 3x con 300 ul de tampon de lavado (PBS, 0,1 % de Tween 20 (v/v)), se anadieron 100 jl del anticuerpo de revelado 6062 (kappa de conejo anti-humano, conjugado con HRP, The Binding Site, Birmingham, RU) despues de dilucion a 1/1000 en tampon de muestra/conjugado. Se agito entonces la placa a 250 rpm a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar con 3x 300 ul de tampon de lavado, se anadieron 100 jl de sustrato TMB (mezcla 50:50 de solucion de TMB (Calbiochem):H2Od) y se registro la A630 usando un lector de placas automatizado. Se calculo la concentracion de Fab' en los extractos periplasmicos por comparacion con patrones de Fab' purificados del isotipo apropiado.
La Figura 2 muestra el crecimiento de MXE005 y MXE001 en comparacion con W3110 de tipo silvestre. La Figura 3 muestra la expresion mejorada de Fab' de las cepas MXE005 y MXE001 en comparacion con W3110 de tipo silvestre.
La Figura 4 muestra el crecimiento de MXE004 y W3110 y la Figura 5 muestra la expresion de Fab' en MXE004 y W3110, donde puede verse que la expresion de MXE004 era mayor que de W3110.
Ejemplo 3 - Expresion de un Fab de raton anti-mIL13 en cepas de E. coli mutadas usando cultivos de matraz agitado
Se transformaron las cepas MXE001, MXE004, MXE005 y celulas W3110 de tipo silvestre con el plasmido pMKC006 que expresa un Fab' anti-mIL13 murinizado y se ensayaron usando el mismo metodo de matraz agitado descrito en el Ejemplo 2, excepto que el experimento se detuvo despues de 6 horas en lugar de 24 horas.
La Figura 6 muestra la expresion de un Fab de raton anti-mIL-13 en MXE001, MXE004, MXE005 y W3110, donde puede verse que MXE001, MXE004 y MXE005 muestran mayor expresion de Fab en comparacion con W3110.
Ejemplo 4- Analisis de la expresion de cadena ligera y pesada a partir de cepas de E. coli mutadas
Se transformaron extractos periplasmicos de la cepa MXE005 y celulas W3110 de tipo silvestre con el plasmido pMXE117, del experimento de matraz agitado descrito en el Ejemplo 2, y se ensayaron usando un ensayo de union de resonancia de plasmon de superficie efectuado usando un instrumento BIAcore™ 2000 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia). Se inmovilizo el Fab' anti-TNF sobre chips sensores CM5 usando qmmica de NHS/EDC estandar. Se inactivaron los esteres de NHS residuales con hidrocloruro de etanolamina (1 M).
Se capturaron los fragmentos Fab' por un anticuerpo monoclonal inmovilizado anti-cadena pesada o monoclonal
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inmovilizado anti-cadena ligera en celdas de flujo separadas. Se revelo la presencia del Fab' unido por union del anticuerpo monoclonal complementary (anti-cadena ligera o anti-cadena pesada) en una segunda etapa. Los altos niveles de anticuerpo inmovilizado aseguran que las medidas se efectuan en condiciones de transporte de masa limitado, en que la contribucion de la constante de la velocidad de asociacion a la union es baja en comparacion con la contribucion realizada por la concentracion de Fab' en la muestra. El anticuerpo monoclonal en fase de disolucion usado en la segunda etapa se pasa sobre la superficie a una alta concentracion, de modo que la union no esta limitada por la constante de velocidad de asociacion de esta interaccion.
Los fragmentos de Fab' ensamblados y cadenas no ensambladas correctamente plegadas se detectan ambos durante la primera etapa de captura. La union del segundo anticuerpo es solo con un fragmento de Fab' intacto. Por lo tanto, el analisis de la union relativa en el primer y segundo pasos revela la presencia de cadena ligera no ensamblada en exceso o bien cadena pesada no ensamblada en exceso en la muestra de Fab' y proporciona informacion sobre la estequiometna del ensamblaje.
Se efectuaron los ensayos en ambas configuraciones para cada muestra, y se ejecuto cada muestra por duplicado y en orden aleatorio.
(i) Cuando tema que determinarse la concentracion de Fab' ensamblado por captura de cadena ligera, se inyectaron muestras y patrones (a 10 gl/min) sobre HP6053 inmovilizado, seguido de una segunda etapa en que se pasaba HP6045 a 30o Rg/ml sobre la superficie en fase de disolucion.
(ii) Cuando tema que determinarse la concentracion de Fab' ensamblado por captura de cadena pesada, se inyectaron muestras y patrones (10t a tOjuVmin) sobre HP6045 inmovilizado, seguido de una segunda etapa en que se pasaba HP6053 a 5001lug/ml sobre la superficie en fase de disolucion. En ambos casos, se regenero la superficie con 10 gi of 30mM de HCl 30 mM a 30 l/min.
Se leyo el numero de unidades de resonancia determinado usando BlAevaluation 3.1 (Pharmacia Biosensor AB) frente a una curva patron.
La Figura 7 muestra la expresion de cadena ligera (cadena L), cadena pesada (cadena H) y Fab durante el transcurso de una tanda de fermentacion, donde se muestra una mayor expresion de cadena ligera, cadena pesada y Fab' a partir de MXE001 despues de 2 horas, 4 horas y 6 horas en comparacion con W3110. La Figura 7 muestra una mayor expresion de cadena ligera despues de 6 horas a partir de MXE005 en comparacion con W3110 y una mayor expresion de Fab' a partir de MXE005 despues de 2 horas, 4 horas y 6 horas en comparacion con W3100.
Ejemplo 5 - Analisis de la actividad de proteolisis de cepas de E. coli mutadas para Fab'
Se ensayaron extractos periplasmicos de las cepas MXE001, MXE005 y celulas W3110 de tipo silvestre transformadas con plasmido pMXE117 del experimento de matraz agitado del ejemplo 2 en un analisis de transferencia Western que compara la proteolisis de un Fab' anti-TNFa como sigue:
Se calentaron a 85 °C durante 5 minutos 12 ul de cada extracto periplasmico mas 4 ul de tampon de carga de PAGE-SDS (Invitrogen), se dejaron enfriar a 25 °C y se centrifugaron entonces brevemente antes de cargar en un gel Bis-Tris al 4-12 % de NuPAGE (Invitrogen) preparado anteriormente. Se usaron marcadores de tamano SeeBlue 2 (Invitrogen) para la estimacion del peso molecular. Se sometio a electroforesis el gel durante 1 hora a 150 V antes de transferencia de protemas sobre membrana de PVDF prehumedecida (Invitrogen) usando inmunotransferencia a 150 mA durante 2 horas. Se bloqueo la membrana durante 1 h en “tampon de bloqueo” (PBS, 3 % (p/v) de leche en polvo, 0,1 % (v/v) de Tween 20 (Sigma)) con agitacion suave. Se aplico un Fab' policlonal de conejo anti-humano (UCB) a una dilucion de 1 a 1000 en 5 ml de tampon de bloqueo y se incubo a temperatura ambiente durante 1 hora con agitacion suave. Se lavo la membrana tres veces durante 5 min cada vez con agitacion suave con tampon de bloqueo. Se aplico un anticuerpo secundario (IgG de burro anti-conejo conjugado con HRP (Jackson)) a una dilucion de 1 a 5000 en tampon de bloqueo con incubacion a temperatura ambiente durante 1 hora con agitacion suave. Se lavo la membrana cuatro veces durante 5 minutos cada vez con agitacion en primer lugar con tampon de bloqueo seguido de PBS, 0,1 % de Tween, durante dos lavados y entonces PBS para el lavado final. Se visualizo la transferencia usando sustrato Metal Enhanced Dab (Thermo Scientific).
La Figura 8 muestra los resultados del analisis de transferencia Western en que W= W3110, 1= MXE001 (ATsp) y 5= MXE005 (ATsp, DegP S210A). Se cree que la fragmentacion alrededor de 14 kDa representa fragmentos proteolfticos de la cadena ligera del Fab' expresado. Puede verse que MXE001 y MXE005 tienen menos productos proteolizados en comparacion con W3110 de tipo silvestre alrededor de la marca de 14 kDa. Sin limitarse por la teona, este dato sugiere que el Fab' anti-TNFa es susceptible de proteolisis porTsp y DegP.
Ejemplo 6- Crecimiento de cepas de E. coli mutadas y expresion de Fab' en cepas de E. coli mutadas usando fermentaciones de alta densidad.
La cepa MXE005 y las celulas W3110 de tipo silvestre transformadas con plasmido pMXE117 se ensayaron en experimentos de fermentacion que comparan crecimiento y expresion de un Fab' anti-TNFa.
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Medio de crecimiento.
El medio de crecimiento de fermentacion estaba basado en medio SM6E (descrito en Humphreys et al., 2002, “Protein Expression and Purification”, 26, 309-320) con 3,86 g/l de NaH2PO4H2O y glicerol 112 g/l.
Inoculo. Se dejaron crecer los cultivos de inoculo en el mismo medio suplementado con tetraciclina 10 pg/ml. Se incubaron los cultivos a 30 °C con agitacion durante aproximadamente 22 horas.
Fermentacion. Se sembraron fermentadores (2,5 litros de volumen final) con cultivo de inoculo a DO600 de 0,3-0,5. Se mantuvo la temperatura a 30 °C durante la fase de crecimiento y se redujo a 25 °C antes de la induccion. Se mantuvo la concentracion de oxfgeno disuelto por encima de 30 % de saturacion del aire por agitacion variable y flujo de aire. Se controlo el pH de cultivo a 7,0 por titulacion automatica con NH4OH al 15 % (v/v) y H2SO4 con. al l0 % (v/v). Se controlo la espumacion mediante la adicion de una solucion Struktol J673 al 10 % (v/v) (Schill y Seilacher).
Se realizaron una serie de adiciones en diferentes pasos de la fermentacion. Cuando la concentracion de biomasa alcanzo aproximadamente una DO600 de 40, se anadieron sales de magnesio y NaH2PO4H2O. Se realizaron adiciones adicionales de NaH2PO4H2O antes y durante la fase de induccion para asegurar que el fosfato se mantema en exceso. Cuando el glicerol presente al inicio de la fermentacion se agoto (DO600 de aproximadamente 75), se aplico una alimentacion continua de glicerol al 80 % (p/p). En el mismo punto de la fermentacion, se aplico una alimentacion de IPTG 170 pM. Se tomo el inicio de la alimentacion de IPTG como el inicio de la induccion. Se ejecutaron las fermentaciones tfpicamente durante 70-73 horas a las tasas de alimentacion de glicerol menores (0,5
2,5 ml/h) y 50-60 h a las tasas de alimentacion de glicerol mayores (5,4-10,9 ml/h).
Medida de la concentracion de biomasa y tasa de crecimiento. Se determino la concentracion de biomasa midiendo la densidad optica de cultivos a 600 nm.
Extraccion periplasmica. Se recogieron celulas de muestras de cultivo por centrifugacion. Se retuvo la fraccion sobrenadante (a -20 °C) para analisis adicional. Se resuspendio la fraccion de sedimento celular al volumen de cultivo original en tampon de extraccion (Tris-HCl 100 mM, EDTA 10 mM; pH 7,4). Despues de incubacion a 60 °C durante aproximadamente 16 horas, se clarifico el extracto por centrifugacion y se retuvo la fraccion sobrenadante (a -20 °C) para analisis.
Cuantificacion de Fab'. Se determinaron las concentraciones de Fab' en extractos periplasmicos y sobrenadantes de cultivo por ELISA de ensamblaje de Fab' como se describe en Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320.
La Figura 9 muestra el perfil de crecimiento de MXE001 en comparacion con W3110 de control, que muestra que los perfiles de control son sustancialmente los mismos durante aproximadamente 35 horas.
La Figura 10 muestra el rendimiento de Fab de sobrenadante (lmeas de puntos) y periplasma (lmeas continuas) de la cepa de E. coli MXE001 en comparacion con W3110 de control. La cepa MXE001 muestra mayor expresion de Fab' periplasmica hasta aproximadamente 30 horas y una expresion de Fab' en sobrenadante significativamente superior durante todo el periodo de fermentacion.
La Figura 11 muestra el rendimiento de Fab' total de sobrenadante y periplasma de la cepa de E. coli MXE001 en comparacion con W3110 de control, donde puede verse que la cepa MXE005 produda mayor rendimiento de Fab' en comparacion con W3110 de control.
La Figura 12 muestra la tasa de produccion espedfica de Fab' de la cepa de E. coli MXE001 en comparacion con W3110 de control, donde puede verse que MXE001 tiene una tasa de produccion espedfica significativamente mayor en comparacion con W3110.
La Figura 13 muestra el perfil de crecimiento de MXE004 y MXE005 en comparacion con W3110 de control. Los perfiles de crecimiento de MXE004 y MXE005 son mas rapidos durante el periodo inicial de aproximadamente 35 horas en comparacion con W3110 de control.
La Figura 14 muestra los rendimientos de Fab' de sobrenadante (lmeas de puntos) y periplasma (lmeas continuas) de las cepas de E. coli MXE004, MXE005 y control W3110. La cepa MXE005 muestra mayor rendimiento de Fab' de periplasma durante aproximadamente 28 horas en comparacion con el control y un rendimiento de Fab' de sobrenadante significativamente mayor en comparacion con el control durante todo el periodo de fermentacion. La cepa MXE004 muestra mayor rendimiento de Fab' de periplasma durante aproximadamente 20 horas en comparacion con el control y un rendimiento de Fab' de sobrenadante significativamente mayor en comparacion con el control durante todo el periodo de fermentacion.
La Figura 15 muestra el rendimiento de Fab' de sobrenadante y periplasma de las cepas de E. coli MXE004 y MXE005, donde puede verse claramente que las cepas MXE004 y MXE005 produdan un rendimiento significativamente mayor en comparacion con el control.
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La Figura 16 muestra la tasa de produccion espedfica de las cepas de E. coli MXE004 y MXE005 y el control W3110, donde puede verse que MXE004 y MXE005 tienen una tasa de produccion espedfica significativamente mayor en comparacion con W3l10.
Ejemplo 7- Crecimiento de las cepas de E. coli mutadas MXE001, MXE004 y MXE005 en comparacion con W3110 y cepas de E. coli altamente mutadas en experimentos de matraz agitado
Se analizaron las siguientes cepas en un experimento de matraz agitado para valorar la tasa de crecimiento::
Cepas de E. coli mutadas MXE001, MXE004 y MXE005 derivadas de W3110 (Ejemplo 1)
Cepa de E. coli de tipo silvestre W3110
SURE (Stratagene) que tiene el genotipo: endAI glnV44 thi-1 gyrA96 relAI lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 uvrC e14- A(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 F'[proAB+ lacIq lacZAM15 Tn10]
STBL3 (Invitrogen) que tiene el genotipo: F- glnV44 recA13 mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 xyl-5 leu mtl-1
TOP10 (Invitrogen) que tiene el genotipo: F- mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) $80lacZAM15 AlacX74 nupG recA1 araD139 A(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endAI
y
XL1-Blue (Stratagene) que tiene el genotipo endAI gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relAI lac glnV44 F'[::Tn10proAB+ lacIq A(lacZ)M15] hsdR17(rK‘mK+)
Se eligio una unica colonia en 5 ml de caldo LB (10 g de Tryptone, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl por litro) y se dejo crecer durante una noche a 37 °C con agitacion a 250 rpm. Se uso el cultivo de una noche para inocular 75 ml de caldo LB a una DO660 de 0,1 (n= 2). Se dejaron crecer los cultivos a 37 °C con agitacion a 250 rpm, se retiraron muestras de 0,2 ml cada hora y se registro la DO600. Se represento entonces la DO600 frente al tiempo en horas y se muestran los resultados en la Figura 17. Puede verse por la Figura 17 que las cepas de E. coli fuertemente mutadas tienen una menor tasa de crecimiento en comparacion con MXE001, MXE004, MXE005 y W3110.
Listado de secuencias
<110> UCB PHARMA S.A.
<120> CEPA HOSPEDADORA BACTERIANA <130> G0091 <160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 2049 <212> ADN <213> E. coli
<400> 1

Claims (22)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una celula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende:
    a. un gen Tsp mutado, en la que el gen Tsp mutado codifica una protema Tsp que tiene un 50 % o menos de la actividad proteasa de una Tsp no mutada de tipo silvestre o es un gen Tsp mutado por desactivacion genica;
    en la que la celula es isogenica de una celula W3110 de E. coli, excepto por el gen Tsp mutado y opcionalmente una secuencia polinucleotidica que codifica una protema de interes.
  2. 2. Una celula segun la reivindicacion 1, en la que el gen Tsp mutado por desactivacion genica comprende una mutacion en el codon de iniciacion genica y/o uno o mas codones de terminacion colocados en direccion 3' del codon de iniciacion genica y en direccion 5' del codon de terminacion genica.
  3. 3. Una celula segun las reivindicaciones 1 o 2, en la que la celula comprende un gen Tsp mutado por desactivacion genica.
  4. 4. Una celula segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la celula es la cepa MXE001 depositada en la National Collection of Type Cultures, HPA, RU con numero de acceso NCTC13444.
  5. 5. Una celula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende:
    a. un gen Tsp mutado, en la que el gen Tsp mutado codifica una protema Tsp que tiene un 50 % o menos de la actividad proteasa de una Tsp no mutada de tipo silvestre o es un gen Tsp mutado por desactivacion genica; y
    b. un gen DegP mutado que codifica una protema DegP que tiene actividad chaperona pero no actividad proteasa,
    en la que la celula es isogenica de una celula W3110 de E. coli, excepto por los genes Tsp y DegP mutados y opcionalmente una secuencia polinucleotidica que codifica una protema de interes.
  6. 6. Una celula segun la reivindicacion 5, en la que la celula es la cepa MXE005 depositada en la National Collection of Type Cultures, HPA, RU con numero de acceso NCTC13448.
  7. 7. Una celula bacteriana gramnegativa recombinante que comprende:
    a. un gen Tsp mutado, en la que el gen Tsp mutado codifica una protema Tsp que tiene un 50 % o menos de la actividad proteasa de una Tsp no mutada de tipo silvestre o es un gen Tsp mutado por desactivacion genica; y
    b. un gen ptr mutado por desactivacion genica,
    en la que la celula es isogenica de una celula W3110 de E. coli, excepto por los genes Tsp y ptr mutados y opcionalmente una secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes.
  8. 8. Una celula segun la reivindicacion 7, en la que la celula es la cepa MXE004 depositada en la National Collection of Type Cultures, HPA, RU con numero de acceso NCTC13447.
  9. 9. Una celula segun cualquier reivindicacion anterior, en la que el gen DegP mutado, el gen ptr mutado y/o el gen Tsp mutado se mutan para comprender uno o mas sitios marcadores de restriccion.
  10. 10. Una celula segun la reivindicacion 9, en la que el gen ptr mutado por desactivacion genica y/o el gen Tsp mutado por desactivacion genica se mutan para comprender un sitio marcador de restriccion que comprende un codon de terminacion en marco.
  11. 11. Una celula segun la reivindicacion 9, en la que el sitio marcador de restriccion es un sitio de restriccion Ase I.
  12. 12. Una celula segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que el gen ptr mutado por desactivacion
    genica y/o el gen Tsp mutado por desactivacion genica comprenden un sitio marcador de restriccion creado por una
    mutacion con cambio de sentido en el codon de iniciacion genica opcionalmente una o mas mutaciones puntuales adicionales.
  13. 13. Una celula segun la reivindicacion 12, en la que el sitio marcador de restriccion es un sitio marcador EcoR I.
  14. 14. Una celula segun cualquiera de las reivindicaciones 7, o 9 a 13, en la que el gen ptr mutado por
    desactivacion genica comprende la SEQ ID NO: 6.
  15. 15. Una celula segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el gen Tsp mutado por desactivacion genica comprende la SEQ ID NO: 3.
  16. 16. Una celula segun cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, o 9 a 15, en la que el gen DegP mutado
    comprende la mutacion S210A.
  17. 17. Una celula segun la reivindicacion 16, en la que el gen DegP mutado comprende la SEQ ID NO: 9.
  18. 18. Una celula segun cualquier reivindicacion anterior, en la que la celula comprende adicionalmente una secuencia polinucleotfdica que codifica una protema de interes.
    5 19. Una celula segun la reivindicacion 18, en la que la secuencia polinucleotidica que codifica la protema de
    interes es exogena.
  19. 20. Una celula segun la reivindicacion 19, en la que la celula comprende un modulo de expresion o un vector que comprende la secuencia polinucleotidica que codifica la protema de interes.
  20. 21. Una celula segun cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en la que la protema de interes es un 10 anticuerpo o un fragmento de union a antigeno del mismo.
  21. 22. Una celula segun la reivindicacion 21, en la que el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo es espedfico de TNF.
  22. 23. Un metodo para producir una protema de interes recombinante que comprende expresar la protema de interes recombinante en una celula bacteriana gramnegativa recombinante como se define en cualquiera de las
    15 reivindicaciones 1 a 22.
    Ptr de tipo silvestre (proteasa III) 5'
    * M PRS TWFKA LLLLV
    TGA ATG CCC CGC AGC ACC TGG TTC AAA GCA TTA TTG TTG TTA GTT
    A L W A P L S GCC CTT TGG GCA CCC TTA AGT
    Aptr mutado (proteasa III) 5'
    EcoRI
    * I PRSTWFKA LLLLV
    TGA ATT CCC CGC AGC ACC TGG TTC AAA GCA TTA TTG TTG TTA GTT
    Ase I
    A L W A H * C
    GCC CTT TGG GCA CAT TAA TGT
    Figura 1b
    Tsp de tipo silvestre 5'
    MNMFFRLT ALA G L LA ATG AAC ATG TTT TTT AGG CTT ACC GCG TTA GCT GGC CTG CTT GCA
    I A G Q T F A
    ATA GCA GGC CAG ACC TTC GCT
    ATsp mutado 5'
    EcoRI
    MNSFLGLPR * L ACL Q ATG AAT TCG TTT TTA GGC TTA CCG CGT TAG CTG GCC TGC TTG CAA
    Ase /
    * Q A R H * L
    TAG CAG GCC AG A CAT TAA TTG
    DegP de tipo silvestre
    202 D A A I NRG NSGG 949 GAT GCA GCG ATC AAC CGT GGT AAC TCC GGT GGT
    DegP mutado S210A
    Ase /
    202 DAAINRGNAGG 949 GAT GCA GCG ATT AA7CGT GGT AAC GCC GGT GGT
    imagen1
    *■
    Tiempo (horas)
    W3110 pMXEl 17 MXE005 (DegP S210A. A Tsn) W3110pMXE117 MXEOOl(ATsp)
    pMXE117
    ug/inl/DO
    imagen2
    009 oa
    imagen3
    np/ml/O
    imagen4
    Q 5 1 12 2 3
    Tiempo (horas)
    “•“W3110 pMXEI 17 “■“MXE004
    ii(; FAB/ ml/ DO
    imagen5
    imagen6
    MXE(X)5,24h
    imagen7
    W = W3110 I = MXE001 (ATsp)
    5 = MXE005 (ATsp, DegP S210A)
    imagen8
    imagen9
    Fab' mg/1
    imagen10
    Fab' mg/l
    imagen11
    "Control
    "MXEOOI
    Tiempo posinduccion
    mg de FAB total/l/DO/h
    imagen12
    imagen13
    FabT mg/l
    imagen14
    Tiempo posinduccion (horas)
    sobrenadante de sobrenadantede --a-- sobrenadantede
    control MXE004 MXEQ05
    control MXE004 (-Tsp, -ptr3) -a- MXL005 (-Tsp, DegP)
    Fab’ mg/l
    imagen15
    Tiempo posinduccion (horas)
    control MXE004 (-Tsp, -prt3) MXE005 (-Tsp, DcgP)
    mg de Fab' total/l/DO/h
    O O O O O O p
    O 1 K3 CO +>■ IJ1 05
    o o o o o o o
    imagen16
    Figura 16
    U09 oil'
    imagen17
    imagen18
ES15182886.0T 2009-09-24 2010-09-23 Cepa bacteriana para expresión de proteína recombinante que tiene los genes DEGP deficiente de proteasa que retiene actividad chaperona y TSP y PTR desactivados génicamente Active ES2692811T3 (es)

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