ES2627826T3 - Cepa bacteriana hospedadora que expresa DsbC recombinante y que tiene una actividad Tsp reducida - Google Patents

Abstract

Una célula bacteriana gram-negativa recombinante, caracterizada porque la célula: a) comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC; b) tiene un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene una reducción de la actividad proteasa en comparación con una célula de tipo silvestre, c) comprende un gen spr mutado que codifica una proteína spr mutante capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado, y d) tiene un genoma que es isogénico al de la cepa de E. coli de tipo silvestre W3110, excepto por el gen Tsp mutado y el gen spr mutado.

Description

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de interés se puede producir en menos tiempo en comparación con una célula que comprende un gen Tsp mutado. La tasa de producción de una proteína de interés más rápida puede ser especialmente significativa durante el período de crecimiento inicial de la célula, por ejemplo, durante las primeras 5, 10, 20 o 30 horas después de la inducción de la expresión de la proteína.

Las células de acuerdo con la presente invención expresan preferiblemente un rendimiento máximo en el periplasma y/o el medio de aproximadamente 1,0 g/L, 1,5 g/L, 1,8 g/L, 2,0 g/L, 2,4 g/L, 2,5 g/L, 3,0 g/L, 3,5 g/L o 4,0 g/L de una proteína de interés.

Las células proporcionadas por la presente invención han reducido la actividad proteasa en comparación con una célula de tipo silvestre, lo que puede reducir la proteólisis de una proteína recombinante de interés, en particular las proteínas de interés que son proteolíticamente sensibles a la proteasa Tsp. Por lo tanto, las células proporcionadas por la presente invención proporcionan un mayor rendimiento de proteínas intactas, preferiblemente de la proteína de interés y un rendimiento inferior, o preferiblemente una falta de fragmentos proteolíticos de proteínas, preferentemente de la proteína de interés, en comparación con una célula bacteriana de tipo silvestre.

El experto en la materia será capaz con facilidad de someter a ensayo un clon celular candidato para observar si tiene el rendimiento deseado de una proteína de interés, usando métodos bien conocidos en la técnica que incluyen un método de fermentación, ELISA y HPLC de la proteína G. Los métodos de fermentación adecuados se describen en Humphreys D P, et al. (1997). Formation of dimeric Fabs in E. coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab' expression levels, tail piece sequences and growth conditions. J. IMMUNOL. METH.

209: 193-202; Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N. Bowering L. Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Journal of Biotechnology. 135(4):358-65, 2008 Jul 31; Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Artículo de Revista] Proteomics. 1(9):1133-48, 2001 Sep; y Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U. Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S. Pluckthun A. Riesenberg D. High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions, Artículo de Revista. Research Support, Non-U.S. Gov't Applied Microbiology & Biotechnology. 46(5-6):524-32, 1996 Dic. La persona experta también será capaz fácilmente de someter a ensayo la proteína secretada para observar si la proteína está plegada correctamente usando métodos bien conocidos en la técnica, tales como HPLC de la proteína G, dicroísmo circular, RMN, cristalografía de rayos X y métodos de medición de la afinidad de epítopos.

En una realización, la célula de acuerdo con la presente invención también expresa una o varias proteínas adicionales del modo siguiente:

 una o varias proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas, tales como FkpA, Skp, SurA, PPiA y PPiD; y/o

 una o varias proteínas capaces de facilitar la secreción o translocación de proteínas, tales como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY y Lep; y/o

 una o varias proteínas capaces de facilitar la formación de enlaces disulfuro, tales como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

Una o varias de las proteínas anteriores puede(n) estar integrada(s) en el genoma de la célula y/o insertada(s) en un vector de expresión.

En una realización, la célula de acuerdo con la presente invención no comprende un polinucleótido recombinante que codifica una o varias de las siguientes proteínas adicionales:

 una o varias proteínas capaces de facilitar el plegamiento de proteínas, tales como FkpA, Skp, SurA, PPiA y PPiD;

 una o varias proteínas capaces de facilitar la secreción o translocación de proteínas, tales como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY y Lep; y

 una o varias proteínas capaces de facilitar la formación de enlaces disulfuro, tales como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

En realizaciones de la presente invención, la célula comprende además un gen spr mutado. La proteína spr es una proteasa periplásmica de E. coli unida a la membrana.

La secuencia de aminoácidos de tipo silvestre de la proteína spr se muestra en SEQ ID NO: 21 con la secuencia señal en el extremo N-terminal y en SEQ ID NO: 22 sin la secuencia señal de 26 aminoácidos (según el número de registro P0AFV4 de UniProt). La numeración de los aminoácidos de la secuencia de la proteína spr en la presente

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invención incluye la secuencia señal. Por consiguiente, el aminoácido 1 de la proteína spr es el primer aminoácido (Met) mostrado en SEQ ID NO: 21.

En las realizaciones en las que la célula de acuerdo con la presente invención comprende un gen spr mutado, el gen spr mutado es preferiblemente el gen spr cromosómico de la célula. El gen spr mutado codifica una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Las células que son portadoras de un gen Tsp mutado pueden tener una buena tasa de crecimiento celular, pero una limitación de esas células es su tendencia a la lisis, especialmente a altas densidades celulares. En consecuencia, el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado es una tendencia a la lisis, especialmente a altas densidades celulares. Las células que son portadoras de un gen Tsp mutado también muestran un crecimiento termosensible con baja osmolaridad. Sin embargo, las mutaciones spr realizadas mediante las células de la presente invención, cuando se introducen en una célula que tiene una reducción de la actividad Tsp, suprimen el fenotipo Tsp reducido y, por lo tanto, la célula muestra una lisis reducida, particularmente con una alta densidad celular. El fenotipo de crecimiento de una célula puede ser medido fácilmente por una persona experta en la técnica durante una técnica de agitación en matraz o de fermentación de alta densidad celular. La supresión del fenotipo de lisis celular se puede observar a partir de la tasa de crecimiento mejorada y/o la producción de proteína recombinante, en particular en el periplasma, mostrada por una célula que es portadora de spr mutante y en la que se ha reducido la actividad Tsp en comparación con una célula portadora del mutante Tsp y una spr de tipo silvestre.

Las células de acuerdo con la presente invención comprenden preferiblemente un gen spr mutante que codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o varios aminoácidos seleccionados a partir de N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147, H157 y W174, más preferentemente en uno o varios aminoácidos seleccionados a partir de C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 y W174. Preferiblemente, el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o varios aminoácidos seleccionados a partir de N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 y H157, más preferentemente en uno o varios aminoácidos seleccionados a partir de C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 y H157. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene ninguna mutación adicional. Preferiblemente, el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una mutación en uno o varios aminoácidos seleccionados a partir de N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 y G147, más preferentemente en uno o varios aminoácidos seleccionados a partir de S95, V98, Y115, D133, V135 y G147. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene ninguna mutación adicional.

Los presentes inventores han identificado mutaciones spr que son capaces de suprimir el fenotipo de crecimiento de una célula que comprende un gen Tsp mutado.

Los inventores también han encontrado sorprendentemente que las células que son portadoras de un gen recombinante DsbC, un nuevo gen spr mutado y que tienen una actividad reducida de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo silvestre, muestran una tasa de crecimiento celular incrementada y un aumento de la duración de la supervivencia celular, en comparación con una célula que comprende un gen Tsp mutado. Específicamente, las células que son portadoras de un gen DsbC recombinante, una mutación spr y que tienen una actividad reducida de la proteína Tsp, muestran un fenotipo reducido de lisis celular en comparación con las células que son portadoras de un gen Tsp mutado.

La mutación de uno o varios de los aminoácidos de spr anteriores puede ser cualquier mutación de sentido erróneo adecuada para uno, dos o tres de los nucleótidos que codifican el aminoácido. La mutación cambia el residuo del aminoácido a cualquier aminoácido adecuado, lo que se traduce en una proteína spr mutada, capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. La mutación de sentido erróneo puede cambiar el aminoácido a uno que tiene un tamaño diferente y/o tiene propiedades químicas diferentes, en comparación con el aminoácido de tipo silvestre.

En una realización, la mutación es en una, dos o tres de la tríada catalítica de residuos de aminoácidos de C94, H145 y H157 (Solution NMR Structure of the NlpC/P60 Domain of Lipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel Cysteine Peptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717).

Por consiguiente, el gen spr mutado puede comprender:

 una mutación en C94; o

 una mutación en H145; o

 una mutación en H157; o

 una mutación en C94 y H145; o

 una mutación en C94 y H157; o

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 una mutación en H145 y H157; o  una mutación en C94, H145 y H157. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene ninguna mutación adicional.

Uno, dos o tres de C94, H145 y H157 se pueden mutar a cualquier aminoácido adecuado, lo que se traduce en una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Por ejemplo, uno, dos o tres de C94, H145 y H157 se pueden mutar a un aminoácido pequeño tal como Gly o Ala. En consecuencia, la proteína spr puede tener una, dos o tres de las mutaciones C94A, H145A y H157A. Preferiblemente, el gen spr comprende la mutación de sentido erróneo H145A, que se ha encontrado que produce una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado.

La designación para un mutante por sustitución en la presente memoria consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra designa el aminoácido en la proteína de tipo silvestre. El número hace referencia a la posición del aminoácido en la que se está realizando la sustitución de aminoácido, y la segunda letra designa el aminoácido que se utiliza para remplazar al aminoácido de tipo silvestre.

En una realización preferida, la proteína spr mutante comprende una mutación en uno o varios aminoácidos seleccionados a partir de N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 y G147, preferiblemente una mutación en uno o varios aminoácidos seleccionados a partir de S95, V98, Y115, D133, V135 y G147. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene ninguna mutación adicional. Por consiguiente, el gen spr mutado puede comprender:

 una mutación en N31; o  una mutación en R62; o  una mutación en I70; o  una mutación en Q73; o  una mutación en S95; o  una mutación en V98; o  una mutación en Q99; o  una mutación en R100; o  una mutación en L108; o  una mutación en Y115; o  una mutación en D133; o  una mutación en V135; o  una mutación en L136; o  una mutación en G140; o  una mutación en R144; o  una mutación en G147.

En una realización, la proteína spr mutante comprende múltiples mutaciones en los aminoácidos:  S95 y Y115; o  N31, Q73, R100 y G140; o  Q73, R100 y G140; o  R100 y G140; o  Q73 y G140; o

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 Q73 y R100; o

 R62, Q99 y R144; o

 Q99 y R144.

Uno o varios de los aminoácidos N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 y G147 puede estar mutado a cualquier aminoácido adecuado, lo que se traduce en una proteína spr capaz de suprimir el fenotipo de una célula que comprende un gen Tsp mutado. Por ejemplo, uno o varios de N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 y R144 se pueden mutar a un aminoácido pequeño tal como Gly o Ala.

En una realización preferida, la proteína spr comprende una o varias de las siguientes mutaciones: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D o V135G, L136P, G140C, R144C y G147C. Preferiblemente, la proteína spr comprende una o varias de las siguientes mutaciones: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D o V135G y G147C. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene ninguna mutación adicional.

En una realización, la proteína spr tiene una mutación seleccionada a partir de N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D o V135G, L136P, G140C, R144C y G147C. En esta realización, la proteína spr preferiblemente no tiene ninguna mutación adicional.

En una realización adicional, la proteína spr tiene múltiples mutaciones seleccionadas a partir de:

 S95F e Y115F;

 N31Y, Q73R, R100G y G140C;

 Q73R, R100G y G140C;

 R100G y G140C;

 Q73R y G140C;

 Q73R y R100G;

 R62C, Q99P y R144C; o

 Q99P y R144C.

Preferiblemente, el gen spr mutante codifica una proteína spr que tiene una mutación seleccionada a partir de C94A, D133A, H145A y H157A.

En otra realización, el gen spr mutado codifica una proteína spr que tiene la mutación W174R. En una realización alternativa, la proteína spr no tiene la mutación W174R.

La célula de acuerdo con la presente invención tiene una actividad reducida de la proteína Tsp, en comparación con una célula de tipo silvestre. La expresión "actividad reducida de la proteína Tsp en comparación con una célula de tipo silvestre" significa que la actividad de Tsp de la célula está reducida en comparación con la actividad de Tsp de una célula de tipo silvestre. La célula puede estar modificada por cualquier medio adecuado para reducir la actividad de Tsp.

En una realización, la actividad reducida de Tsp procede de la modificación del polinucleótido endógeno que codifica Tsp y/o secuencias reguladoras de la expresión asociadas. La modificación puede reducir o detener la transcripción y traducción del gen Tsp o puede proporcionar la proteína Tsp expresada con actividad proteasa reducida en comparación con la proteína Tsp de tipo silvestre.

En una realización, se modifica la secuencia reguladora de la expresión asociada para reducir la expresión de Tsp. Por ejemplo, el promotor del gen Tsp puede mutarse para evitar la expresión del gen.

En una realización preferida, la célula de acuerdo con la presente invención es portadora de un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp con actividad proteasa reducida o un gen Tsp mutado inactivado. Preferiblemente el gen Tsp cromosómico está mutado.

Tal y como se usa en el presente documento, "gen Tsp" significa un gen que codifica la proteasa Tsp (también conocida como Prc) que es una proteasa periplásmica capaz de actuar sobre la proteína 3 que se une a penicilina (PBP3) y proteínas de la cola del fago. La secuencia del gen Tsp de tipo silvestre se muestra en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de la proteína Tsp de tipo silvestre se muestra en SEQ ID NO: 2.

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b.

un gen Tsp mutado que codifica una proteína Tsp que tiene actividad proteasa reducida o un gen Tsp mutado inactivado;

c.

un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de tipo chaperona y actividad proteasa reducida;

d.

un gen ptr mutado, en donde el gen ptr mutado codifica una proteína Proteasa III que tiene actividad proteasa reducida o es un gen ptr mutado inactivado;

e.

opcionalmente una OmpT mutada, en donde el gen OmpT mutado codifica una proteína OmpT que tiene actividad proteasa reducida o es un gen OmpT mutado inactivado; y

f.

opcionalmente un gen spr mutado.

Preferiblemente, en esta realización el genoma de la célula es isogénico a una célula bacteriana de tipo silvestre, excepto para las mutaciones anteriores b, c, d, e y f.

En realizaciones de la presente invención, la célula comprende un gen DegP mutado. Tal como se usa en este documento, "DegP" significa un gen que codifica una proteína DegP (también conocida como HtrA), que tiene doble función como chaperona y proteasa (familias de serina peptidasas; Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994;244:19-61). La secuencia del gen DegP sin mutar se muestra en SEQ ID NO: 7 y la secuencia de la proteína DegP sin mutar se muestra en SEQ ID NO: 8.

A bajas temperaturas, DegP actúa como una chaperona y a altas temperaturas DegP tiene una preferencia para actuar como una proteasa (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, volumen 97, publicación 3, páginas 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) y The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al. Microbiology 2008, 154, 3649-3658).

En las realizaciones en las que la célula comprende la mutación DegP, la mutación DegP en la célula proporciona un gen DegP mutado que codifica una proteína DegP que tiene actividad de tipo chaperona pero no una actividad proteasa completa.

La expresión "que tiene actividad de tipo chaperona" en el contexto de la presente invención, significa que la proteína DegP mutada tiene la misma actividad de tipo chaperona o sustancialmente la misma, en comparación con la proteína DegP de tipo silvestre sin mutar. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene 50% o más, 60% o más, 70% o más, 80% o más, 90% o más o 95% o más de la actividad de tipo chaperona de una proteína DegP de tipo silvestre sin mutar. Más preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tienen la misma actividad de tipo chaperona, en comparación con la de DegP de tipo silvestre.

La expresión "que tiene actividad proteasa reducida" en el contexto de la presente invención, significa que la proteína DegP mutada no tiene la actividad proteasa completa en comparación con la proteína DegP de tipo silvestre sin mutar. Preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que tiene 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de la actividad proteasa de una proteína DegP de tipo silvestre sin mutar. Más preferiblemente, el gen DegP mutado codifica una proteína DegP que no tiene actividad proteasa. La célula no carece de DegP cromosómica, es decir, las secuencias génicas de DegP no se han eliminado

o mutado para evitar la expresión de cualquier forma de proteína DegP.

Cualquier mutación adecuada se puede introducir en el gen DegP con el fin de producir una proteína que tiene actividad de tipo chaperona y actividad proteasa reducida. La actividad proteasa y chaperona de una proteína DegP expresada a partir de una bacteria gram-negativa, se puede comprobar fácilmente por una persona experta en la técnica a través de cualquier método adecuado, tal como el método descrito en Spiess et al., en el que se sometieron a ensayo las actividades proteasa y chaperona de DegP en MalS, un sustrato natural de DegP (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, volumen 97, publicación 3, páginas 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) y también el método descrito en The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al. Microbiology 2008, 154, 3649-3658.

DegP es una serina proteasa y tiene un centro activo que consiste en una triada catalítica de residuos de aminoácidos de His105, Asp135 y Ser210 (Families of serine peptidases, Methods Enzymol., 1994, 244:19-61 Rawlings N y Barrett A). La mutación DegP para producir una proteína que tiene actividad de tipo chaperona y actividad proteasa reducida puede comprender una mutación, tal como una mutación de sentido erróneo en uno, dos o tres de His105, Asp135 y Ser210.

Por consiguiente, el gen DegP mutado puede comprender:

 una mutación en His105; o

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o varios de los codones de parada, como se ha descrito anteriormente. Esta realización es ventajosa debido a que el sitio del marcador de restricción es un marcador directo y único de las mutaciones inactivadoras de genes introducidas.

Un sitio de marcador de restricción se puede insertar, el cual comprende un codón de parada en marco, tal como un sitio de restricción Ase I. Esto es particularmente ventajoso debido a que el sitio de restricción insertado sirve como un sitio de marcador de restricción y un codón de parada para evitar la transcripción completa de la secuencia que codifica el gen. Por ejemplo, en la realización en la que un codón de parada se introduce en el gen ptr mediante la introducción de un sitio Ase I, esto también crea un sitio de restricción, como se muestra en la Figura 5a. Por ejemplo, en la realización en la que un codón de parada se introduce en el gen Tsp en el codón 21 mediante la introducción de un sitio Ase I, esto también crea un sitio de restricción, como se muestra en la Figura 5b.

Un sitio de marcador de restricción se puede insertar mediante la mutación del codón de inicio y, opcionalmente, una

o varias mutaciones puntuales adicionales. En esta realización, el sitio del marcador de restricción es preferiblemente un sitio de restricción EcoR I. Esto es particularmente ventajoso debido a que la mutación del codón de inicio también crea un sitio de marcador de restricción. Por ejemplo, en la realización en la que el codón de inicio del gen ptr se cambia a ATT, esto crea un sitio marcador EcoR I, como se muestra en la Figura 5a. Por ejemplo, en la realización en la que el codón de inicio (codón 3) del gen Tsp se cambia de ATG a TCG, como se muestra en la Figura 1b, una mutación puntual adicional en el codón 2 de AAC de AAT y una mutación en el codón 3 de ATG a TCG, crea un sitio de restricción marcador EcoR I, como se muestra en la Figura 5b.

En la realización de la presente invención, en donde la célula es portadora de un gen OmpT mutado, uno o varios de los sitios de restricción se pueden introducir mediante cualquier mutación adecuada, incluyendo mediante una o varias deleciones, inserciones, mutaciones puntuales, de sentido erróneo, sin sentido y de desplazamiento del marco. Por ejemplo, en la realización en la que el gen OmpT comprende las mutaciones D210A y H212A, estas mutaciones introducen un sitio de restricción HindIII silencioso que se puede utilizar como marcador de selección.

En el gen DegP o el gen spr, un sitio de restricción marcador se puede introducir usando cambios a codones silenciosos. Por ejemplo, un sitio Ase I se puede utilizar como un sitio de restricción silencioso marcador, en el que el codón de parada TAA está fuera de marco, como se muestra en la Figura 5c para el gen DegP mutado.

En las realizaciones de la presente invención, en donde el gen ptr y/o el gen Tsp están mutados para codificar una Proteasa III o Tsp que tiene actividad proteasa reducida, se pueden introducir uno o varios sitios de restricción marcadores usando cambios a codones silenciosos.

Cualquier bacteria gram-negativa adecuada se puede utilizar como la célula parental para la producción de la célula recombinante de la presente invención. Una bacteria gram-negativa adecuada incluye Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Erwinia carotovora, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y E. coli. Preferiblemente la célula parental es E. coli. Cualquier cepa adecuada de E. coli se puede usar en la presente invención, pero se emplea preferiblemente una cepa W3110 de tipo silvestre, tal como W3110 K-12.

Un inconveniente asociado con las cepas bacterianas que carecen de proteasas, creadas previamente y utilizadas para expresar proteínas recombinantes, es que comprenden mutaciones adicionales en genes implicados en el metabolismo celular y la replicación del ADN, tales como por ejemplo phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi y pro en cepas de E. coli. Estas mutaciones pueden tener muchos efectos deletéreos en la célula hospedadora, incluidos los efectos sobre el crecimiento celular, la estabilidad, el rendimiento de la expresión de proteínas recombinantes y la toxicidad. Las cepas que tienen una o varias de estas mutaciones genómicas, en particular las cepas que tienen una cantidad elevada de estas mutaciones, pueden mostrar una pérdida de capacidad, lo que reduce la tasa de crecimiento bacteriano a un nivel que no es adecuado para la producción de proteínas a escala industrial. Además, cualquiera de las mutaciones genómicas anteriores puede afectar a otros genes en cis y/o en trans de forma perjudicial impredecible, alterando de este modo el fenotipo de la cepa, la capacidad y el perfil de proteínas. Además, el uso de células fuertemente mutadas no es generalmente adecuado para la producción de proteínas recombinantes para uso comercial, en particular de agentes terapéuticos, debido a que tales cepas tienen generalmente vías metabólicas defectuosas y por lo tanto pueden crecer mal o no crecer nada en medios mínimos o químicamente definidos.

En una realización preferida, las células solo son portadoras de las mutaciones mínimas para introducir el polinucleótido recombinante que codifica DsbC; la modificación requerida para reducir la actividad de la proteína Tsp y opcionalmente el gen spr mutado. Solo se realizan mutaciones mínimas en el genoma de la célula para introducir un polinucleótido recombinante y mutaciones. Las células no son portadoras de ninguna otra mutación, lo que puede tener efectos nocivos sobre el crecimiento de la célula y/o la capacidad para expresar una proteína de interés. En consecuencia, una o varias de las células hospedadoras recombinantes de la presente invención pueden mostrar una expresión proteica mejorada y/o características de crecimiento mejoradas en comparación con células que comprenden mutaciones por ingeniería genética adicionales en la secuencia genómica. Las células proporcionadas por la presente invención son también más adecuadas para el uso en la producción de proteínas terapéuticas, en comparación con células que comprenden alteraciones adicionales en el genoma celular.

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obtener a partir de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina y se puede obtener a partir de cualquier especie, incluyendo, por ejemplo, ratón, rata, tiburón, conejo, cerdo, hámster, camello, llama, cabra o ser humano. Las porciones del fragmento de anticuerpo se pueden obtener de más de una especie, por ejemplo los fragmentos de anticuerpo pueden ser quiméricos. En un ejemplo las regiones constantes son de una especie y las regiones variables de otra.

El anticuerpo puede ser una molécula de anticuerpo completa con cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o un fragmento del mismo, por ejemplo, VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2, Fv, fragmento scFv, Fab-Fv,

o un anticuerpo con especificidad dual, tal como un Fab-dAb, como se describe en el documento PCT/GB2008/003331.

El anticuerpo puede ser específico de cualquier antígeno diana. El antígeno puede ser una proteína asociada a una célula, por ejemplo una proteína de la superficie celular sobre células tales como células bacterianas, células de levadura, linfocitos T, células endoteliales o células tumorales, o puede ser una proteína soluble. Los antígenos de interés también pueden ser cualquier proteína importante desde el punto de vista médico, tales como las proteínas hiperreguladas durante una enfermedad o infección, por ejemplo receptores y/o sus correspondientes ligandos. Ejemplos particulares de proteínas de la superficie celular incluyen moléculas de adhesión, por ejemplo integrinas tales como integrinas β1, por ejemplo, VLA-4, E-selectina, P-selectina o L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 o CSF1-Receptor, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectina de tipo 2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembrionario (CEA), globulina de grasa de la leche humana (HMFG1 y 2), antígenos del MHC de clase I y de clase II, KDR y VEGF, y cuando sea apropiado, receptores de los mismos.

Los antígenos solubles incluyen interleucinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL16 o IL-17, tales como IL17A y/o IL17F, antígenos virales, por ejemplo antígenos del virus respiratorio sincitial o citomegalovirus, inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones tales como interferón α, interferón β o interferón γ, factor de necrosis tumoral TNF (anteriormente conocido como factor de necrosis tumoral-α), factor de necrosis tumoral-β, factores estimulantes de colonias tales como G-CSF o GM-CSF, y factores de crecimiento derivados de plaquetas tales como PDGF-α, y PDGF-β y cuando sea apropiado, receptores de los mismos. Otros antígenos incluyen antígenos de la superficie celular bacteriana, toxinas bacterianas, virus, tales como de la gripe, EBV, HepA, B y C, agentes de terrorismo biológico, radionúclidos y metales pesados, y venenos y toxinas de serpientes y arañas.

En una realización, se puede utilizar el anticuerpo para alterar funcionalmente la actividad del antígeno de interés. Por ejemplo, el anticuerpo puede neutralizar, suscitar antagonismo o suscitar agonismo de la actividad de dicho antígeno, directa o indirectamente.

La presente invención también proporciona una célula bacteriana gram-negativa recombinante que comprende un polinucleótido recombinante que codifica DsbC, un gen Tsp mutado, en donde el gen Tsp mutado codifica una proteína Tsp que tiene actividad proteasa reducida o es un gen Tsp mutado inactivado, y una secuencia de polinucleótido que codifica un anticuerpo o un fragmento que se une a antígeno del mismo, específico de TNF. En una realización preferida, la célula comprende además un gen spr mutante que codifica una proteína spr mutante.

En una realización preferida, la proteína de interés expresada por las células de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo anti-TNF, más preferiblemente un Fab’ anti-TNF, como se describe en el documento WO01/094585.

En una realización, el anticuerpo que tiene especificidad para TNFα humano, comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 28 para CDRH1, la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 34 para CDRH2 o la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 30 para CDRH3.

En una realización el anticuerpo comprende una cadena ligera en donde el dominio variable comprende una CDR que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 31 para CDRL1, la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 32 para CDRL2 o la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 33 para CDRL3.

Las CDRs proporcionadas en las SEQ IDS NOs: 28 y 30 a 34 mencionadas anteriormente se obtienen a partir de un anticuerpo monoclonal de ratón hTNF40. Sin embargo, SEQ ID NO: 29 consiste en una CDR híbrida. La CDR híbrida comprende una parte de CDR2 de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal de ratón hTNF40 (SEQ ID NO: 34) y una parte de CDR2 de la cadena pesada procedente de una secuencia humana de la región V de la línea germinal del grupo 3.

En una realización, el anticuerpo comprende una cadena pesada en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO:28 para CDRH1, la secuencia mostrada en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:34 para CDRH2 o la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 30 para CDRH3 y una cadena ligera en la que el dominio variable comprende una CDR que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 31 para CDRL1, la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 32 para CDRL2 o la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 33 para CDRL3.

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proteína. En una realización preferida, los residuos de la superficie de la proteína PhoS se alteran con el fin de reducir el pI de la proteína. Preferiblemente se evitan los residuos que han estado implicados por ser importantes en el enlace fosfato (Bass, documento de patente de EE.UU. nº 5.304.472) para mantener una proteína PhoS funcional. Preferiblemente se dirigen a los residuos de lisina que se proyectan lejos de la superficie de la proteína o que están en grandes grupos de residuos básicos o cerca de ellos. En una realización, la proteína PhoS tiene un marcador de hexa poli(ácido aspártico) fijado al extremo C-terminal mientras que se dirigen a los residuos de la superficie en el extremo opuesto de la molécula para su sustitución. Residuos de lisina seleccionados preferiblemente se sustituyen por ácido glutámico o ácido aspártico para conferir un mayor potencial de cambio de pI que cuando se cambian los residuos neutros a los ácidos. La designación para un mutante por sustitución en la presente memoria consiste en una letra seguida de un número seguido de una letra. La primera letra designa el aminoácido en la proteína de tipo silvestre. El número hace referencia a la posición del aminoácido en la que se está realizando la sustitución del aminoácido, y la segunda letra designa el aminoácido que se utiliza para remplazar al aminoácido de tipo silvestre. En mutaciones preferidas de PhoS, los residuos de lisina de la presente invención (K) 275, 107, 109, 110, 262, 265, 266, 309, 313 están sustituidos por ácido glutámico (E) o glutamina (Q), como mutaciones simples o combinadas, además, la lisina (K)318 puede estar sustituida por ácido aspártico (D) como una mutación simple o combinada. Preferiblemente las mutaciones individuales son K262E, K265E y K266E. Preferiblemente las mutaciones combinadas son K265/266E y K110/265/266E. Más preferiblemente, todas las mutaciones se combinan con el marcador de poli(ácido aspártico) (poliD) fijado al extremo C-terminal y opcionalmente también con la sustitución K318D. En una realización preferida las mutaciones dan lugar a una reducción del pI de al menos 2 unidades. Preferiblemente, las mutaciones de la presente invención reducen el pI de PhoS desde 7,2 a entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5,5. En una realización de la presente invención, el pI de la proteína PhoS de E. coli se reduce desde 7,2 hasta aproximadamente 4,9, aproximadamente 4,8 y aproximadamente 4,5 utilizando las mutaciones poliD K318D, poliD K265/266E y poliD K110/265/266E respectivamente.

La célula bacteriana gram-negativa recombinante según la presente invención se puede producir por cualquier medio adecuado.

En las realizaciones de la presente invención en las que el gen Tsp cromosómico está mutado y opcionalmente uno

o varios de los genes cromosómicos spr, DegP, ptr y OmpT están mutados, el experto conoce las técnicas adecuadas que se pueden usar para sustituir una secuencia de gen cromosómico por una secuencia de gen mutado. Se pueden emplear vectores adecuados, los cuales permiten la integración en el cromosoma hospedador mediante recombinación homóloga. En la realización en la que la célula comprende dos o tres de los genes mutados anteriores, los genes mutados se pueden introducir en la bacteria gram-negativa en el mismo vector o en diferentes vectores.

Se describen métodos de sustitución de genes adecuados, por ejemplo, en Hamilton et al. (New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli, Hamilton C. M. et al., Journal of Bacteriology Sept. 1989, Vol. 171, nº 9 p 4617-4622), Skorupski et al (Positive selection vectors for allelic exchange, Skorupski K y Taylor R. K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al. (A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation, Kiel J.A.K.W. et al., Mol Gen Genet 1987, 207:294-301), Blomfield et al. (Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSC101 replicon, Blomfield I. C. et al., Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) y Ried et al. (An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis, Ried J. L. y Collmer A., Gene 57 (1987) 239-246). Un plásmido adecuado que permite la recombinación/sustitución homóloga es el plásmido pKO3 (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237).

El experto conoce las técnicas adecuadas que se pueden emplear para insertar el polinucleótido recombinante que codifica DsbC. El polinucleótido recombinante que codifica DsbC puede estar integrado en el genoma de la célula usando un vector adecuado, tal como el plásmido pKO3.

Alternativa o adicionalmente, el polinucleótido recombinante que codifica DsbC puede no estar integrado en un casete de expresión recombinante. En una realización, un casete de expresión se emplea en la presente invención para ser portador del polinucleótido que codifica DsbC que normalmente comprende una secuencia que codifica una proteína que codifica DsbC y una o varias secuencias reguladoras de la expresión. Una o varias de las secuencias reguladoras de la expresión pueden incluir un promotor. Una o varias de las secuencias reguladoras de la expresión también pueden incluir una región no traducida 3' tal como una secuencia de terminación. Los promotores adecuados se describen con más detalle a continuación.

En una realización, se emplea un casete de expresión en la presente invención que es portador del polinucleótido que codifica la proteína de interés y/o el polinucleótido recombinante que codifica DsbC que comprende normalmente una o varias secuencias reguladoras de la expresión, una o varias secuencias codificantes que codifican una o varias proteínas de interés y/o una secuencia codificante que codifica DsbC. Una o varias de las secuencias reguladoras de la expresión pueden incluir un promotor. Una o varias de las secuencias reguladoras de la expresión también pueden incluir una región no traducida 3' tal como una secuencia de terminación. Los promotores adecuados se describen con más detalle a continuación.

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tidos que codifican DsbC y la proteína de interés están bajo el control de promotores distintos, el promotor pueden ser promotores inducibles independientemente.

Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contienen generalmente una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada funcionalmente al ADN que codifica el polipéptido de interés. El promotor se puede eliminar del ADN de origen bacteriano mediante digestión con enzimas de restricción e insertar en el vector que contiene el ADN deseado.

En las realizaciones de la presente invención en las que una secuencia de polinucleótido comprende dos o más secuencias que codifican dos o más proteínas de interés, por ejemplo una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo, la secuencia de polinucleótido puede comprender una o varias secuencias internas de sitios de entrada al ribosoma (IRES) que permiten la iniciación de la traducción en el centro de un ARNm. Una secuencia IRES puede estar situada entre las secuencias de polinucleótidos codificantes para potenciar una traducción independiente del ARNm para producir las secuencias de polipéptidos codificados.

El vector de expresión también comprende preferiblemente un mensaje dicistrónico para producir el anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a antígeno, tal y como se describe en el documento WO 03/048208 o WO2007/039714. Preferiblemente, el cistrón aguas arriba contiene ADN que codifica la cadena ligera del anticuerpo y el cistrón aguas abajo contiene ADN que codifica la cadena pesada correspondiente, y la secuencia intergénica dicistrónica (IGS) comprende preferiblemente una secuencia seleccionada a partir de IGS1 (SEQ ID NO: 36), IGS2 (SEQ ID NO: 37), IGS3 (SEQ ID NO: 38) y IGS4 (SEQ ID NO: 39).

Los terminadores pueden ser endógenos o exógenos con relación a las células hospedadoras. Un terminador adecuado es rrnB.

Unos reguladores transcripcionales adecuados adicionales incluyen promotores y terminadores y los métodos de direccionamiento de proteínas se pueden encontrar en "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in "Escherichia coli" Sawas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996, p 512-538.

El polinucleótido DsbC insertado en el vector de expresión comprende preferiblemente el ácido nucleico que codifica la secuencia señal de DsbC y la secuencia que codifica DsbC. El vector contiene preferiblemente una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o varias células hospedadoras seleccionadas, preferiblemente que se replique independientemente del cromosoma hospedador. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias.

En una realización, la DsbC y/o la proteína de interés comprende un marcador de histidina en el extremo N-terminal y/o C-terminal.

La molécula de anticuerpo puede ser secretada desde la célula o estar dirigida al periplasma mediante secuencias señal adecuadas. Alternativamente, las moléculas de anticuerpo se pueden acumular en el citoplasma de la célula. Preferiblemente la molécula de anticuerpo está dirigida al periplasma.

El polinucleótido que codifica la proteína de interés se puede expresar como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal del polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada por la célula hospedadora. Para las células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del polipéptido natural o eucariota, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota. Las secuencias señal adecuadas incluyen OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA y DsbC.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o varios de los componentes anteriormente enumerados, emplea técnicas de ligación convencionales. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se escinden, se adaptan y se ligan de nuevo en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

En una realización preferida de la presente invención, la presente invención proporciona un vector multicistrónico que comprende la secuencia de polinucleótido que codifica DsbC y la secuencia de polinucleótido que codifica una proteína de interés. El vector multicistrónico se puede producir por un método de clonación ventajoso que permite una clonación secuencial repetida de secuencias de polinucleótidos en un vector. El método utiliza extremos cohesivos compatibles de una pareja de sitios de restricción, tales como los extremos "AT" de los sitios de restricción Ase I y Nde I. Una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia codificante y que tiene extremos cohesivos compatibles, tales como un fragmento AseI-NdeI, se puede clonar en un sitio de restricción en el vector, tal como Nde I. La inserción de la secuencia de polinucleótido destruye el sitio de restricción 5’ pero crea un nuevo sitio de restricción 3', tal como Nde I, que después se puede utilizar para insertar una secuencia de polinucleótido adicional que comprende extremos cohesivos compatibles. El proceso se puede repetir después para insertar secuencias adicionales. Cada secuencia de polinucleótido insertada en el vector comprende una secuencia no codificadora en 3' del codón de parada que puede comprender un sitio Ssp I para el escrutinio, una secuencia de unión al ribosoma de Shine Dalgarno, un espaciador rico en A y un sitio NdeI que codifica un codón de inicio.

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Una representación esquemática de la creación de un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una cadena ligera de un anticuerpo (LC), una cadena pesada de un anticuerpo (HC), una secuencia de polinucleótido DsbC y una secuencia de polinucleótido adicional, se muestra en la Figura 6.

Las cepas mutadas con éxito se pueden identificar usando procedimientos bien conocidos en la técnica, que incluyen la secuenciación de ADN con PCR de colonias y el cartografiado con enzimas de restricción y PCR de colonias.

Las realizaciones de la invención descritas en este documento con referencia al polinucleótido, se aplican igualmente a realizaciones alternativas de la invención, por ejemplo, vectores, casetes de expresión y/o células hospedadoras que comprenden los componentes empleados en la misma, por lo que el aspecto relevante se puede aplicar a las mismas.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una proteína recombinante de interés que comprende expresar la proteína recombinante de interés en una célula bacteriana gram-negativa recombinante como se ha descrito anteriormente en el primer o segundo aspecto de la presente invención. El método para producir una proteína recombinante de interés comprende:

a.

cultivar una célula bacteriana gram-negativa recombinante como se ha definido anteriormente en un medio de cultivo en condiciones eficaces para expresar la proteína recombinante de interés y el polinucleótido recombinante que codifica DsbC; y

b.

recuperar la proteína recombinante de interés a partir del periplasma de la célula bacteriana gram-negativa recombinante y/o el medio de cultivo.

La célula bacteriana gram-negativa y la proteína de interés empleadas preferiblemente en el método de la presente invención, se han descrito con detalle anteriormente.

Cuando el polinucleótido que codifica la proteína de interés es exógeno, el polinucleótido se puede incorporar en la célula hospedadora usando cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Como se ha descrito anteriormente, normalmente el polinucleótido se incorpora como parte de un vector de expresión que se transforma en la célula. Por consiguiente, en un aspecto, la célula de acuerdo con la presente invención comprende un casete de expresión que comprende el polinucleótido que codifica la proteína de interés y un casete de expresión que comprende el polinucleótido que codifica DsbC.

La secuencia del polinucleótido que codifica la proteína de interés y la secuencia del polinucleótido que codifica DsbC se pueden transformar en una célula utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, empleando cloruro de rubidio, PEG o electroporación.

El método de acuerdo con la presente invención también puede emplear un sistema de selección para facilitar la selección de las células estables que han sido transformadas con éxito con el polinucleótido que codifica la proteína de interés. El sistema de selección emplea normalmente una cotransformación de una secuencia de polinucleótido que codifica un marcador de selección. En una realización, cada polinucleótido transformado en la célula comprende además una secuencia de polinucleótido que codifica uno o varios marcadores de selección. Por consiguiente, la transformación de los polinucleótidos que codifican DsbC y la proteína de interés y uno o varios de los polinucleótidos que codifican el marcador, se produce conjuntamente y el sistema de selección se puede emplear para seleccionar las células que producen las proteínas deseadas.

Las células capaces de expresar uno o varios de los marcadores, son capaces de sobrevivir/crecer/multiplicarse bajo ciertas condiciones impuestas artificialmente, por ejemplo, la adición de una toxina o antibiótico, debido a las propiedades con las que están dotadas gracias al polipéptido/gen o el componente de polipéptido del sistema de selección incorporado en las mismas (por ejemplo, resistencia a antibióticos). Las células que no son capaces de expresar uno o varios de los marcadores no son capaces de sobrevivir/crecer/multiplicarse en las condiciones impuestas de modo artificial. También puede elegirse que las condiciones impuestas de modo artificial sean más o menos vigorosas, según se requiera.

En la presente invención puede emplearse cualquier sistema de selección adecuado. Normalmente, el sistema de selección puede estar basado en la inclusión en el vector de uno o varios genes que proporcionan resistencia a un antibiótico conocido, por ejemplo, un gen de resistencia a tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina o ampicilina. Las células que crecen en presencia de un antibiótico relevante se pueden seleccionar ya que expresan tanto el gen que proporciona resistencia al antibiótico como la proteína deseada.

En una realización, el método según la presente invención comprende además la etapa de cultivar la célula transformada en un medio para expresar de este modo la proteína de interés.

Un sistema de expresión inducible o un promotor constitutivo se pueden usar en la presente invención para expresar la proteína de interés y/o la DsbC. Los sistemas de expresión inducible y los promotores constitutivos adecuados son bien conocidos en la técnica.

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1,5 μl

oligo 5' (5 pmol)

1,52 μl

oligo 3' (5 pmol)

2 μl

Lisado celular

0,5 μl

Taq ADN polimerasa (Roche 5U/μl )

38,5 μl

H2O

Ciclo de PCR.

94°C

1 minuto

94°C

1 minuto)

55°C

1 minuto) repetido durante 30 ciclos

72°C

1 minuto)

72°C

10 minutos

Una vez completadas las reacciones, se extrajeron 25 μl a un nuevo tubo de microcentrífuga para la digestión con Ase I. A los 25 μl de reacción de PCR se añadieron 19 μl de H2O, 5 μl de tampón 3 (NEB), 1 μl de Ase I (NEB), se mezclaron e incubaron a 37°C durante 2 horas.

A la reacción PCR restante se añadieron 5 μl de tampón de carga (x6) y se cargaron 20 μl sobre 200 ml de gel de agarosa TAE al 0,8% (Invitrogen) más bromuro de etidio (5 μl de 10 mg/ml de solución madre) y se ejecutaron a 100 voltios durante 1 hora. Se cargaron 10 μl de marcador de tamaño (Perfect DNA marker 0,1-12 Kb, Novagen) en el carril final.

Una vez terminadas las digestiones con Ase I, se añadieron 10 μl de tampón de carga (x6) y se cargaron 20 μl sobre un gel de agarosa TAE al 0,8% (Invitrogen) más bromuro de etidio (5 μl de 10 mg/ml de solución madre) y se ejecutaron a 100 voltios durante 1 hora. Se cargaron 10 μl de marcador de tamaño (Perfect DNA marker 0,1-12 Kb, Novagen) en el carril final. Se visualizaron ambos geles empleando un transiluminador de UV.

El fragmento genómico amplificado presentaba la banda de tamaño correcto de 2,8 Kb para Tsp. Después de una digestión con Ase I, ésta confirmó la presencia de los sitios de Ase I introducidos en la cepa MXE001 carente de Tsp pero no en el control W3110.

MXE001: El ADN genómico se amplificó utilizando el conjunto de cebador Tsp y el ADN resultante se digirió con Ase I para producir bandas de 2,2 y 0,6 Kbp.

El ADN amplificado por PCR de W3110 no fue digerido por la enzima de restricción Ase I.

Ejemplo 2 Generación de líneas celulares que son portadoras del gen spr mutado y líneas celulares que sonportadoras del gen Tsp mutado y el gen spr mutado

Se generaron y seleccionaron mutaciones de spr para utilizar un ensayo de complementación.

Se mutó el gen spr utilizando el kit de PCR de diversidad de mutagénesis aleatoria de Clontech® que introducía 1 a 2 mutaciones por 1.000 pb. El ADN de la PCR con spr mutada se clonó en un vector de expresión inducible [pTTO CDP870] que expresaba Fab' CDP870 junto con el mutante spr. Esta ligación se electrotransformó a continuación en la cepa MXE001 (ΔTsp) de E. coli preparada utilizando el método encontrado en Miller, E.M. y Nickoloff, J.A., "Escherichia coli electrotransformation" en Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (compilador), Humana Press, Totowa, N.J., 105 (1995). Se utilizó el protocolo siguiente, se añadieron 40 μl de MXE001 electrocompetente, 2,5 μl de la ligación (100 pg de ADN) a una cubeta de electroporación de 0,2 cm, se llevó a cabo la electrotransformación utilizando BioRad Genepulser Xcell con las siguientes condiciones, 2.500 V, 25 µF y 200 Ω. Después de la electrotransformación, se añadió 1 ml de SOC (Invitrogen) (precalentado a 37°C) y las células se dejaron recuperar a 37°C durante 1 hora con agitación suave.

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