JP4944608B2 - 改良された抗原結合親和性を有する、変更された抗体 - Google Patents

Description

本出願は、米国仮出願番号第６０／４９０，０８７号（２００３年７月２６日出願）に対し優先権を主張し、この内容の全体が本明細書中に参考として援用される。

本明細書全体にわたって引用される、任意の特許、特許出願および参考文献は、その全体が参考として援用される。

（発明の背景）
抗体は、精緻を極めた、自然界に存在する生物学的物質であり、病原体から生物体（人体）を防衛するためにきわめて重要な役割を果たしている。抗体は、一般に免疫グロブリンとも呼ばれており、四個のポリペプチド、すなわち相互に同じ二個の長鎖ポリペプチド（「重鎖」）と相互に同じ短い二個の短鎖ポリペプチド（「軽鎖」）とを含む。重鎖は、ジスルフィド結合によって軽鎖と対をなしており、二本の重鎖も相互に同様に結合して四量体を形成している。また、重鎖と軽鎖は、それぞれ一つの可変ドメインと一つ以上の定常領域とを含み、重鎖は、一つの可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）とそれに続く三つの定常領域（ＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３）とを含み、短鎖は一つの可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）とそれに続くただ一つの定常領域（Ｃ_Ｌ）とを含む。

軽鎖および重鎖の各対の可変ドメインは、抗原と接触する部位を形成する。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ両者は、同じ全体的構造を有していて、４個のフレームワーク構造（ＦＲ）を含み、それらの配列は比較的保存され、３個の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結されている（非特許文献１を参照；さらに非特許文献２も参照）。４個のフレームワーク領域は概ねβシート配座を取っており、そして、ＣＤＲはβシート構造を連結していて、一部のケースではβシート構造の一部をなしている。Ｖ_ＨおよびＶ_ＬのＣＤＲは、ＦＲによってごく近接した位置を保持し、ＣＤＲ内のアミノ酸残基は抗原に結合する。可変ドメインの構造に関しては、非特許文献３、非特許文献４および非特許文献５による、さらに詳しい解説を参照されたい。

研究者は、抗体の機能を研究したり、治療剤としてのその有用性を向上したりするためにさまざまな方法で抗原を修飾してきた。最も初期に行われた修飾例では、研究者は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを発現させるために、二本鎖ＤＮＡ配列を使用し、定常領域の配列は全く使用しなかった（たとえば特許文献１；Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ．を参照）。別のフラグメントやキメラ抗体も作られている。一般にはＣＤＲグラフト抗体と呼ばれている別の特定タイプのキメラは、種が異なる二つの抗体からの配列を含む（たとえば、ヒトの抗体中に存在する天然ＣＤＲの代わりにネズミのＣＤＲが使用されている；たとえば、特許文献２を参照）。研究者は、この種の抗体が純粋なヒト抗体と比較して、人体に対して異物性が高くないことを期待したが、実際には、この種の抗体は、少なくともいくつかのケースでは、抗原に対する抗体の親和性が低下したためにその使用には制約がある。親和性を高める試みとして、ＣＤＲグラフト抗体のＦＲ中のアミノ酸の一部が、アクセプター分子のそれ（ヒト抗体）からＣＤＲに供与した抗体のそれに修飾された（たとえば、ネズミの抗体のそれ；特許文献３；特許文献４；特許文献５；および特許文献６を参照）。

したがって、強い免疫応答は誘発しないが抗原には強く結合する抗体およびこのような抗体を同定するための方法に対する要求は依然としてつづいている。
欧州特許第０ ０８８ ９９４号明細書 米国特許第５，２２５，５３９号明細書 米国特許第５，５８５，０８９号明細書 米国特許第５，６９３，７６１号明細書 米国特許第５，６９３，７６２号明細書 米国特許第６，１８０，３７０号明細書 Ｋａｂａｔほか、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８３年 Ｃｌｏｔｈｉａほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９８７年、１９６：９０１〜９１７ Ｐｏｌｊａｋほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７３年、７０：３３０５〜３３１０ Ｓｅｇａｌほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７４年、７１：４２９８〜４３０２ Ｍａｒｑｕａｒｔほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９８０年、１４１：３６９〜３９１

（発明の要旨）
本発明の一部分は、体の親和性は（または、抗原に結合するそのフラグメント）抗体内のアミノ酸残基を修飾することによって高めることができるという発見に基づいている。その修飾は、全体的にまたは部分的に、抗体と、それに結合する抗原との間の静電的力のコンピューターによる分析に基づいている。そのコンピューター計算による分析は、溶媒（たとえば、水、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、血漿または血液などの水性溶媒）中で抗体とその抗原との間の結合に影響を及ぼす静電力を発生する、抗体内の電荷分布に基づいて行われる。コンピューター計算法は、問題の標的部位と幾何学に対する静電的補償を規定する（不利に働く脱溶媒和エネルギーと有利に働く抗原−抗体複合体の相互作用との間の最適な相殺）。

具体的には、本発明は、抗体と抗原とが溶媒中で結合したときの最適電荷分布と、それに関連する両者間の結合自由エネルギー変化とを計算して、修飾するための個々の残基の位置を確認することができる指標または規則を提供する。また、本発明は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏに修飾のサブセットを構築し、それから結合自由エネルギーと好ましい修飾の選択とを再計算して、確認された残基位置の適切な修飾、たとえば側鎖の化学の選択に指針を与える規則をも提供する。

このように、本発明は、他の方法と違って、抗体と抗原との間の正味電荷が単に反対であることが有利であるという推定結論による単なる電荷の包括的な整列か、または電荷対整列には限定されない、といういくつかの利点を持つ。むしろ、本発明は、抗原−抗体複合体の結合親和性を修飾するために使用すべき正確な残基位置と側鎖の化学とを明らかにするための（典型的な抗体は、鎖間および鎖内にジスルフィド結合を有する最大４本のポリペプチド鎖と、６個のＣＤＲ結合表面、および鎖間界面を含むことを考慮に入れた場合に適切な）より精密な分析方法を提供する。

さらに、本発明は、溶媒内で抗体が抗原に結合するときの結合相互作用を完全に説明する。

また、重要なことは、本発明は、他の方法では確認ができないか、試行するには不適当として見過ごしてしまうかもしれない抗原結合を変える抗原修飾の備えをしていることである。

一つの面では、本発明は、抗体と、抗体が結合する抗原との間の複合体の構造（たとえば三次元構造）に対応するデータを提供する過程と、そのデータを使って、抗体と抗原との間の結合自由エネルギーに対する静電的寄与を引き下げる（すなわち、最適化するか、より負にする）であろう抗体内（たとえば、一つ以上のＣＤＲ内）の電荷分布（たとえば複数極または点電荷の集まり）の表示を決定する過程と、電荷分布（すなわち、決定された最適な電荷分布）に対応する（より良く対応する）修飾抗体を創出するために、抗体内（たとえば、一つ以上のＣＤＲ内）の一個以上のアミノ酸残基を修飾する過程とを含む、抗体の抗原への結合親和性を調節する方法を特徴づける。得られる結果は、抗原−抗体間の相互作用の調節（たとえば、向上、変更など）に使用できる電荷分布である。たとえば、もし正味の総電荷が−１である最適化された抗体のアミノ酸残基の側鎖、親抗体の第一抗体と呼ぶこともある最初の抗体の対応アミノ酸残基を、親抗体のバリアントで、本明細書中で第二抗体（以前に修飾されていて、先行抗体の反復修飾である抗体の修飾を指す場合は、さらに第三または第四抗体）と呼ぶこともある修飾抗体を創出するために、側鎖に負の電荷を有するアミノ酸残基で置換することができる。

関連する面では、本発明は、溶媒中で抗原に結合したときに、抗体のアミノ酸の最適電荷分布と、それに付随する抗体の結合自由エネルギー変化の空間表示を決定することによって抗体の抗原に対する結合親和性を調節する方法；抗原に結合したときに、抗体の結合自由エネルギーを変えるために修飾すべき抗体のアミノ残基の位置の少なくとも一つの候補を確認する方法；および置換によって、抗体の抗原に対する結合親和性が調節されるように前記アミノ酸の位置を置換するために選ばれるアミノ酸残基を選択する方法を提供する。

さらに後で述べるように、一旦電荷分布が決定されると、抗体中の一つ以上のアミノ酸残基（たとえば、ＣＤＲ中の一個以上の残基、たとえば２〜１０個の残基、またはそれより多い残基、たとえばすべてではないにしても最多数のＣＤＲ残基、および自由選択的にＣＤＲ中のみ）は、その電荷分布に合致するように、あるいはより良く合致するように修飾することができる。たとえば、アミノ酸残基は別の天然アミノ酸残基または自然に存在しない（非天然）残基で置き換えることができる。置換は保守的なアミノ酸置換であってもよいし、そうでなくてもよい。いくつかの例では、一つ以上のアミノ酸残基を削除するか、挿入して電荷を変えることが望まれるかもしれない。

たとえば、抗体の準備に先立って抗原−抗体間で形成される複合体の構造データが使用できるいくつかの例では、親抗体の配列（またはその抗体の一つ以上のＣＤＲ配列）が分かってさえすればよい。この方法は、親抗体を含む抗原−抗体複合体内の電荷分布に関する情報を保有しているか入手できさえすれば実施可能である。すなわち、その情報は、抗原に対する修飾抗体の親和性が改善されるように、修飾抗体を修飾するために使用される。別の例では、本発明の方法は、ヒト抗体だけからなる抗体の親和性を変えるため、あるいはヒトのＦＲおよびヒトのＣＤＲを含む、抗原に結合するフラグメントの親和性を変える（または最適化する）ために使用でき、たとえば、親和性成熟させて抗原に対する結合親和性を改善するために使用することができる。ヒト抗体だけからなる抗体としては、ヒト血漿から得られる抗体か（ただし、このやり方は普通に行われるやり方ではない）、ｉｎ ｖｉｖｏで発生させた抗体（たとえばヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニックマウス内で発生させた抗体；米国特許第６，１５０，５８４号を参照）を使用することができる。

本発明の方法において、親抗体および修飾抗体は種が異なっていてもよいし、種が同じであってもよい（たとえば、親抗体が非ヒト抗体（たとえばネズミの抗体）であり、修飾抗体がヒト抗体であってもよい）。さらに抗体は、綱（ｃｌａｓｓ）または亜綱（ｓｕｂｃｌａｓｓ）が同じであってもよいし、違っていてもよい。その起源または綱の異同には関係なく、二つの抗体の配列の一部分が互いに同じであってもよい。たとえば、親抗体のＦＲは修飾抗体のＦＲと同じであってもよい。これは、たとえば、親抗体がヒト抗体であるのに対して、修飾抗体は一つ以上の非ヒトＣＤＲを含む点だけが親抗体と違っているという場合に起こるだろう（たとえば、改質抗体では、最初のヒトＣＤＲの一つ以上が非ヒト（たとえばネズミの）ＣＤＲで置換されていた）。

本発明の方法は、自然抗体の構造を有する抗体で行いことができる。たとえば、本発明の方法は、ＩｇＧ分子の構造（二本の完全長重鎖および二本の完全長軽鎖）を有する抗体で行うことができる。かくして、いくつかの実施例では親抗体および／または修飾抗体は、抗体のＦｃ領域を含むことができる（たとえば、ヒト抗体のＦｃ領域）。しかし、本発明は完全抗体でなくても実施することができる。すなわち、本発明の方法は、以下に記述するフラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントまたは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ））を含む、抗原に結合する抗体フラグメントで行うことができる。「フラグメント」は、自然抗体の小さな変化を構成することができる。たとえば、抗体フラグメントは、「完全な」抗体のアミノ酸残基の少数を除いてすべてを含むことができる（たとえば、Ｖ_ＨまたはＶ_ＬのＦＲを切りつめることができる）。

方法が、ＦＲの全部存在する完全抗体で行うか、ＦＲの一部が存在する完全抗体のフラグメントで行うかに関係なく、そのＦＲの配列は野生型抗体でもよい。あるいはＦＲは変異を含んでいてもよい。たとえば、本発明の方法は、野生型ＦＲの相当するアミノ酸残基とは異なる一つ以上のアミノ酸残基を含むフレームワーク領域（たとえば、ヒトＦＲ）を含む親抗体で行うことができる。変異は、アミノ酸残基を別の種の対応する抗体アミノ酸残基に変える変異であってもよい。たとえば、その点を除けばヒトのＦＲであるＦＲがネズミの残基を含む可能性がある（このような変異は、当技術分野では「戻り変異（ｂａｃｋ−ｍｕｔａｔｉｏｎ）」と呼ばれている）。たとえば、ヒト抗体のフレームワーク領域は非ヒト抗体の同じ位置のアミノ酸残基に「戻り変異」する可能性がある。本発明の方法では、このような戻り変異した抗体を「親抗体」として使用することができる。このケースでは、「修飾」抗体が完全なヒトＦＲを含むことができる。ＦＲにおける変異は、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌのいずれか（またはＶ_ＨおよびＶ_Ｌの両方）のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４のいずれでも起こる可能性がある。約１０個までの残基、または１１個以上の残基（たとえば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４の１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個または１１個以上の残基が、天然の残基（たとえばヒトの残基）から別の残基（対応する位置に、たとえばドナー残基、たとえばネズミの残基））が、別の残基に変異する可能性がある。直ちにＣＤＲの側面を囲む残基は、変異しうる残基の中に入る。

一つの実施形態では、本発明の方法は完全に非ヒト（たとえばネズミの抗体）の親抗体およびヒトのＦｃ領域および完全にヒトのＦＲを含む修飾抗体で行われる。

いくつかの実施形態では、親抗体と修飾抗体の相対的親和性（たとえば本発明の親抗体、修飾抗体または変化抗体）は、ある所定の抗原に対する改質抗体の親和性が、その抗原に対する親抗体の親和性と少なくとも同程度の親和性であるような、相対的親和性であってもよい。たとえば、抗原に対する改質抗体の親和性は、抗原に対する親抗体の親和性より、少なくとも（または約）１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、５、８、１０、５０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５または１０^６、１０^７、または１０^８（またはこれらの数の間の範囲または数値）倍大きいことが可能である。

本発明の方法は、たとえばより良い薬物動態、抗原に対する結合特異性、関連する抗原エピトープ間の混線の低減などのために、低い親和性が望まれる場合は、抗体の親和性を低くして使用することもできる。たとえば、抗原に対する改質抗体の親和性は、抗原に対する親抗体の親和性より、少なくとも（または約）１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、５、８、１０、５０、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５または１０^６、１０^７、または１０^８（またはこれらの数の間の範囲または数値）倍小さいことが可能である。

本発明の方法は反復が可能である。上で述べたように、発現した抗体は、再モデル化することができ（たとえばｉｎ ｓｉｌｉｃｏまたは実験的に、たとえば、実験データを使って）、抗原への結合をもっと良くするために再度変化させることができる。たとえば、上記の手順のあとに次にあげる手順、すなわち、修飾抗体と抗原の間の複合体の構造に対応するデータを得る手順； そのデータ（親抗体「ラウンド」得られ、使用されるデータと区別するため「追加データ」と呼ぶことができる）を使って、修飾抗体と抗原との間の結合自由エネルギーに対する静電的寄与を最小にする修飾抗体のＣＤＲの追加電荷分布の表現を決定する手順； そして抗原に結合する第三またはそれより先の修飾抗体を発現する手順を付け加えることができる。ここで、第三の抗体は、修飾抗体のＣＤＲとは少なくとも一つのアミノ酸が異なり、追加電荷分布に対応する成熟ＣＤＲを有する。それでも成熟追加ラウンドを行うことができる。すぐ上で述べた方法では、形成される抗体は抗原と複合体を形成して（すなわち、抗原に結合するにまかせる）、静電的寄与を最小限にする電荷分布を得るために使用される。次に、第四またはそれから先の修飾抗体が作られ、修飾を含み、抗原への結合を良くする電荷分布によって支配されることになろう。以下同様。

上で注記したように、修飾抗体（または修飾抗体の代わりに機能する後続抗体）は、修飾されたＣＤＲを含むため、抗原−抗体複合体における静電力が改善される（最適化される）。現在、静電力を調べるために使用されるソフトウェアは、最適電荷分布をモデル化し、ユーザーは、どのアミノ酸置換または変化が電荷分布を改善するかを決定する。したがって、そのような手順（たとえば、抗原への結合を改善するために、モデル化された最適電荷分布を点検し、配列の修飾を決定する手順）は、ここで特許請求される方法の一部であるか、一部となりうる。しかし、プラグラムが将来アミノ酸の置換（または変化）の選択を含むように、ソフトウェアを修飾することは難しくないので、そこで必要なことは単にその出力を検査して示唆される変更（または変更したければいくらか変えること）を実施するだけであろう。

本発明の方法は、抗体（またはそのフラグメント）を「作る」方法として特徴づけることができよう。「作る（ｐｒｏｄｕｃｅ）」という用語は、自然に存在しない抗体（またはそのフラグメント）を「作る（ｍａｋｅ）」、「発生する（ｇｅｎｅｒａｔｅ）」または「設計する（ｄｅｓｉｇｎ）」ことを意味する。作られた抗体は、その配列（たとえば、そのＣＤＲおよびＦＲ）がその構築に使用された抗体のいずれよりも「成熟」していると見なすことができるかもしれない。作られた抗体は、抗原に対してより強い親和性を持つかもしれないが、本発明の方法は、親和性を改善した抗体を作る方法に限定されるものではない。たとえば、本発明の方法は、この方法によって修飾される前に抗体が抗原に対して持っていたのとほぼ同じ親和性を有する抗体を作ることができる。従来技術に記載されているように、ヒト抗体を修飾してネズミのＣＤＲを組み込むと、出来上がったＣＤＲグラフト抗体は、その抗原に対する親和性を失ってしまっている可能性がある。そこで、たとえば本発明の方法をＣＤＲグラフト抗体に適用する場合に、従来のＣＤＲグラフトでは起きるであろう親和性の喪失（部分的にまたは完全に喪失）を防止すれば、本発明の方法は有用であり好結果をもたらす。

本発明の方法は、結合自由エネルギーに対する静電的寄与を最小にすることに加えて、さらに結合自由エネルギーに対するファンデルワールスまたは溶媒が接近しうる表面の寄与をも最小にすることも含むことができる。このようなコンピューター計算によるさらなる分析では、単に静電的寄与を最小化して実現した以上にさらに結合自由エネルギーが低下するように、親抗体ＣＤＲの追加的アミノ酸を変えて修飾抗体を発生することが可能である。本発明の方法および構成では、１個程度のわずかなＣＤＲ残基を、そして５０個程度の多くのＣＤＲ残基を修飾することも可能である。本発明の方法および構成によれば、最も普通には、１ないし１０（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）個のアミノ酸残基が変更される。

本発明の方法のいずれによって作られる抗体も、本発明、それらの抗体を含む薬学的組成物、およびそのような抗体をコードする核酸の範囲内である。さらに、本発明は上記の方法で見つけだされた修飾抗体（またはそのポリペピチドまたはフラグメント）を発現するベクターをも包含する。これらのベクターは、細胞系を変換するために使用することができるし、そのような形質転換（たとえば移入）された細胞は本発明の範囲内である。

本発明の一つ以上の実施形態の詳細は以下で述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の説明と特許請求項とから明らかとなろう。

（発明の詳細な説明）
明細書および請求項の理解を助けるために、下記の定義をしておくことが有益である。

（定義）
本明細書で使用される「構造」または「構造データ」という用語は、原子、分子、化合物、アミノ酸残基およびその一部、ならびに高分子およびその一部が占める三次元空間における既知の予測された位置および／またはモデル化された位置を含む。分子／原子レベルで構造を確認しおよび／または予測するには、Ｘ線結晶構造解析法、ＮＭＲ構造モデル化法など、いくつかの方法を使用することができる。

本明細書で使用される「結合親和性」という用語は、結合の強さを含む。それゆえ、この用語は実際の結合親和性ばかりでなく、見かけの親和性も含む。実際の親和性は、会合速度と解離速度との比である。それゆえ、結合親和性を与えることまたは最適化することの中には、結合親和性を所望のレベルにするためにこれらの成分の一方または両方を変えることが含まれる。見かけの親和性は、たとえば相互作用の親和力を含むことができる。たとえば二価の変更された可変領域結合フラグメントは、その結合能力（ｖａｌｅｎｃｙ）のため、変更または最適化された結合親和性を発揮することができる。結合親和性は、本発明の方法における残鎖変更の選択に寄与するこのようなモデル化でもって、モデル化することもできる。

本明細書で使用される「結合自由エネルギー」または「結合の自由エネルギー」という用語は、既存技術が認識している意味、具体的には溶媒中の抗原−抗体相互作用に適用される意味を含む。結合自由エネルギーが低下すると抗原−抗体間の親和性は高まり、結合自由エネルギーが増大すると抗原−抗体間の親和性は低下する。

本明細書で使用される「最適電荷分布の空間表示」という用語は、抗体または抗原−抗体複合体に対する電荷分布のモデル化を含み、抗体が抗原に結合したときの抗体の自由エネルギーに対する静電的寄与は、親抗体の電荷分布および／または抗体が抗原に結合したときの親抗体の電荷分布の既知および／またはモデル化表示と比較して、最適化（最小化）されている。最適電荷分布のモデル化は、抗体および／または抗原−抗体複合体の既知の構造および／またはモデル化構造を入力として組み込むｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法によって到達可能である。溶媒中における抗原−抗体複合体の静電的結合自由エネルギーを、抗体の脱溶媒和、抗原−抗体間相互作用および抗原の脱溶媒和の項に関する総和として表現するには、応答連続体モデル（たとえば、線形化ポアソン−ボルツマン式）を使用することができる。このｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法の特徴は、本発明のモデル化電荷分布の中で電荷分布を表示する場合に、単極、双極および四重極項を取り入れて、抗体が非結合状態と結合状態との間を遷移する間の、抗体残基の溶媒和／脱溶媒和エネルギーを広範囲にわたって評価できる点にある。抗原−抗体複合体に対する最適電荷分布の空間表示をモデル化する過程に、ファンデルワールス力、溶媒が接近できる表面の力などを追加して取り入れることもできる。

本明細書で使用される「溶媒」という用語は、技術が認識する最も広い意味を含み、本発明の抗体がその中に溶解および／または存在するいかなる液体をも指す。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクロナール抗体（完全長モノクロナール抗体を含む）、ポリクロナール抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体およびその抗原に結合したフラグメント、たとえば、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、および単ドメイン抗体フラグメント（ＤＡｂ）を含む。

本明細書で使用される「抗原」という用語は、抗体が特異的に結合する存在種（たとえば、タンパク質またはペプチド）を含み、本明細書で定義される親抗体および修飾抗体が結合する、あらかじめ決められた抗原を含む。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、またはその他の天然化合物または合成化合物が可能である。好ましくは、標的抗原はポリペプチドである。

本明細書で使用される「ＣＤＲ」という用語は、たとえばＫａｂａｔ、ＣｌｏｔｈｉａまたはＭａｃＣａｌｌｕｍほか（たとえば、Ｋａｂａｔほか、ＩＮ “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， １９８３を参照； Ｃｌｏｔｈｉａほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７； およびＭａｃＣａｌｌｕｍほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５（１９９６）； 引用により、その全内容をここに組み込む）に記載の相補的決定領域を含む。

上記引用文献のそれぞれに記載されているように、典型的にはＣＤＲを取り囲むアミノ酸残基の位置を比較のために下に示す。

本明細書で使用される「可変領域」という用語は、その分子に抗原への結合をもたらす抗体アミノ酸末端部分を含むが、定常領域ではない。この用語は、たとえば、可変領域全体の結合機能の一部またはすべてを保有する抗原結合フラグメントを含めることを意図したものである。

本明細書で使用される「フレームワーク領域」という用語は、ＣＤＲの間にあって、ＣＤＲを隔てる抗体配列を含む。それゆえ、可変領域のフレームワークは、長さが約１００〜１２０個のアミノ酸からなるが、ＣＤＲの単に外にあるアミノ酸を参照することを意図してものである。重鎖可変領域の具体例と、Ｋａｂａｔらが定義したＣＤＲに関しては、フレームワーク領域１が、アミノ酸１〜３０を包含する可変領域のドメインに相当し、領域２が、アミノ酸３６〜４９を包含する可変領域のドメインに相当し、領域３が、アミノ酸６６〜９４を包含する可変領域のドメインに相当し、領域４がアミノ酸１０３から可変領域の終わりまでの可変領域ドメインに相当する。軽鎖のフレームワーク領域も同様に軽鎖可変領域ＣＤＲのそれぞれによって隔てられている。同様に、ＣｌｏｔｈｉａらまたはＭｃＣａｌｌｕｍらの定義を使えば、上記のように、フレームワーク領域境界線は各ＣＤＲ末端によって隔てられる。

本明細書で使用される「修飾された」または「変更された」という用語は、変化を受けた位置の親アミノ酸配列と比較して、たとえばＣＤＲ、フレームワーク領域、または両者において１個以上のアミノ酸が変更されて抗体または抗原に結合する抗体フラグメントを含む。修飾または変更された抗体は、典型的には、別のアミノ酸残基、その関連する側鎖の化学的性質、または一個以上のアミノ酸残基の挿入または削除で置換された１個以上の残基を有する。

本明細書で使用される「親抗体」、「元の抗体」、「出発抗体」、「野生型」または「最初の抗体」という用語は、抗原−抗体間の結合親和性を本発明の方法で修飾することが望まれる抗体を含む。すなわち、親抗体は、本発明の方法が行われる投入抗体を表す。親ポリペプチドには元々の（すなわち自然）抗体配列（自然対立遺伝子のバリアントを含む）か、自然配列の、前から存在するアミノ酸配列に修飾（たとえば挿入、削除および／またはその他の変更）を加えた配列を含むことができる。親抗体には、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体が可能である。

本明細書で使用される「抗体バリアント」、「修飾された抗体」、「修飾アミノ酸」、「変異体」、または「第二抗体」、「第三抗体」などという表現は、親抗体のアミノ酸配列とは異なるアミノ配列を有する抗体を含む。好ましくは、抗体バリアントは、非天然アミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを含む。このようなバリアントは、親抗体と配列の同一性または類似性が１００％未満でなければならない。好ましい実施形態では、親抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのどちらかのアミノ酸配列の同一性または類似性が約７５％〜１００％未満、より好ましくは約８０％〜１００％未満、より好ましくは約８５％〜１００％未満、より好ましくは約９０％〜１００％未満、そして最も好ましくは約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列を有する。本明細書では、この配列に関する同一性または類似性は、配列の同一性をできるだけ高くするために必要であれば、配列を一列に並べて間隙を導入したあとで、親抗体の残基と同一（すなわち同じ残基）である、候補配列におけるアミノ酸残基の百分率で定義される。典型的には、可変ドメインの外の抗体配列におけるＮ−末端、Ｃ−末端または内部の伸張、削除または挿入は、配列の同一性または類似性に影響を及ぼすとは解釈されない。抗体バリアントは、一般に、その１個以上の超可変領域に、またはそれらの領域に隣接して１個以上のアミノ酸の変化を含むバリアントである。本発明の修飾された抗体は、表現されてもよいし、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでモデル化されてもよい。

本明細書で使用される「候補アミノ酸残基部分」という用語は、本発明の抗体内に確認されたアミノ酸位置を含み、かつ候補アミノ酸の置換は、変更、削除、挿入または別のアミノ酸で置換すると、抗体の電荷分布に影響を及ぼすことが、モデル化され、予測され、または知られている。

本明細書で使用される「選択されるアミノ酸」という用語は、抗体内の候補アミノ酸位置に置換するアミノ酸として、本発明の方法によって置換のために選択されるアミノ酸残基を意味する。候補アミノ酸残基の位置を選択されたアミノ酸で置換すると、抗原−抗体複合体に対する静電的寄与を高めるか、引き下げるかのいずれかである。

本明細書で使用される「アミノ酸の変更」または「前記アミノ酸に関する変更」という用語は、所定アミノ酸配列のアミノ酸配列の変化を含む。模範的な変更としては、挿入、置換および削除を挙げることができる。

本明細書で使用される「アミノ酸の修飾」という用語は、所定のアミノ酸配列における既存のアミノ酸残基の側鎖の化学的性質を、たとえばアミノ酸の置換によって、別の異なるアミノ酸残基の側鎖の化学的性質で置換することを含む。本発明の個々のアミノ酸の修飾は、次のいずれか一つから選択される：（１）非極性側鎖を持つアミノ酸の組み、たとえばＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、（２）側鎖に負の電荷を持つアミノ酸の群、たとえばＡｓｐ、Ｇｌｕ、（３）側鎖に正の電荷を持つアミノ酸の群、たとえばＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、および（４）無電荷の極性の側鎖を持つアミノ酸の群、たとえばＡｓｎ、ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびこれにＣｙｓ、Ｇｌｙ、ＭｅｔおよびＰｈｅを加えた群。

本明細書で使用される「天然アミノ酸残基」という用語は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸の残基であって、一般にアラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌｅｕ）；リシン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群から選択される。

本明細書で使用される「非天然アミノ酸」という用語は、上に挙げた天然アミノ酸の残基以外のアミノ酸残基を含み、ポリペプチド鎖において隣接アミノ酸残基と共有結合によって結合することができる。非天然アミノ酸残基の例を挙げれば、ノルロイシン、オミチン、ノルバリン、ホモセリンや、Ｅｌｌｍａｎほか、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１〜３３６（１９９１）に記載されているその他のアミノ酸残基などがある。このような非天然アミノ酸残基を合成するには、Ｎｏｒｅｎほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎほか、上記文献に記載された方法を使用することができる。要約して述べれば、これらの方法は、サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸残基で化学的に活性化したのち、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを転写、翻訳することを含む。

本明細書で使用される「露出した」アミノ酸残基という用語は、アミノ酸残基が溶液中のポリペプチド（たとえば抗体またはポリペプチド抗原）中に存在するとき、アミノ酸残基の表面の少なくとも一部が、ある程度溶媒に露出しているアミノ酸残基を含む。残基が露出しているか否かを判定するには、分子模型またはポリペプチドの構造の分析を含め、さまざまな方法が利用できる。

本明細書で使用される「処置」という用語は、治療処置と予防的処置の両方を意味する。処置を必要とするものは、すでに障害を有するもののほか、障害を予防すべきものも含む。

本明細書で使用される「障害または疾患（病気）」という用語は、抗体バリアントによる処置によって利益を受ける状態を指す。

本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」または「宿主細胞」という用語は、「形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）」、「形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ）」、または「移入細胞」およびそれらの子孫を含む。本発明の範囲内の宿主には、原核細胞、たとえばＥ．ｃｏｌｉ、酵母細胞、たとえば下等真核細胞、昆虫細胞、高等細胞、たとえば脊椎動物、たとえば哺乳動物、たとえばチャイニーズハムスター卵細胞およびＮＳＯミエローマが含まれる。

（詳細な説明）
（概観）
最適化された抗体（または抗原に結合するそのフラグメント）を得るには本明細書に記載する方法を使用することができる。最適化された抗原−抗体複合体の電荷分布と元の抗原−抗体複合体の電荷分布との間に違いがある場合（違いが大きいほど違いの重要性が高まる）、コンピューター計算による分析から所定抗体内の位置が確認される。抗体が、溶媒中で抗原と結合している場合、電荷分布のこのような違いは、抗体の結合自由エネルギーの変化とも関連している。このような位置のアミノ酸残基は、元の抗体における静電力が、最適化された抗体における静電力にもっと近づき、それによって抗体が、溶媒中で抗原と結合している場合、抗体の結合自由エネルギーを調節するように変えることができる。抗体への変更は、本明細書に記載する個々の指針または規則の組みにしたがって行われる。

（機能向上のための抗体修飾規則）
本発明の規則は次のように適用することができる。抗体の抗原結合親和性を調節するため、たとえばこのような結合を向上または回復するには、まず配列および／または構造に関する基本データを入手する。次に、親和性の改善された変異体を示唆するために、静電荷最適化法を適用する。典型的には、まず、結合にとって最適状態に近いＣＤＲ残基の位置を決めるために静電荷最適化を使用する（ＬｅｅおよびＴｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０６：８６８１〜８６９０，１９９７；ＫａｎｇａｓおよびＴｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０９：７５２２〜７５４５，１９９８）。次に、一つ以上のＣＤＲの変異（すなわち修飾）を、さらにコンピューター計算による分析にかける。これらの計算結果に基づいて、本発明の規則にしたがって、一つ以上の修飾を持つ修飾抗体のサブセットに対して結合親和性を決定する。

連続体静電モデルを使って、抗体のＣＤＲの各アミノ酸の側鎖に対して静電荷最適化を実行することができる。電荷の最適化によって原子中心の電荷が得られるが、必ずしも実際の変異を与えるものではない。したがって、関係する位置における天然側鎖特性値を表すことを強いられる様々な制約の下で一回の最適化を実行することができる。たとえば、原子の電荷がある特定の値、たとえば０．８５電荷単位を超えなかった追加的制約の下で側鎖の正味電荷−１、０、＋１に対して最適化を実行することができる。次に、最適化で観察される静電結合自由エネルギーにおけるポテンシャル・ゲインに基づいて、候補アミノ酸側鎖位置およびこれらの位置における残基の修飾を決定する。

負の残基から、全く電荷を持たない側鎖同形体（ｓｉｄｅｃｈａｉｎ ｉｓｏｓｔｅｒｅ）、すなわち形が同じであって、原子上に電荷が存在しないか部分的な電荷しか持たない残基に移行したときの結合自由エネルギーの差（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を計算することができる。負の数は結合親和性の増大を予測している。結合自由エネルギーの差を計算するためには、側鎖の正味電荷が−１、０または＋１における最適電荷分布を使用できる。

結合自由エネルギーが有利（ΔＧ＜−０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）で負の残基から、全く電荷を持たない側鎖同形体、すなわち形が同じであって、原子上に電荷が存在しないか部分的な電荷しか持たない残基への移行を伴う例では、修飾は、非極性側鎖を持つアミノ酸の群、たとえばＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌから選択される。

側鎖の電荷分布が最適で、かつその正味の電荷が−１でもって得ることができる結合自由エネルギーの差が有利（ΔＧ＜−０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）な場合、修飾は、側鎖に負の電荷を持つアミノ酸の群、たとえばＡｓｐ、Ｇｌｕから選択される。

同様に、側鎖の電荷分布が最適で、かつその正味の電荷が＋１でもって得ることができる結合自由エネルギーの差が有利（ΔＧ＜−０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）な場合、修飾は、側鎖に正の電荷を持つアミノ酸の群、たとえばＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓから選択される。

最後に、側鎖の電荷分布が最適で、かつその正味の電荷が０でもって得ることができる結合自由エネルギーの差が有利（ΔＧ＜−０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）な場合、修飾は、無電荷の極性側鎖を持つアミノ酸の群、たとえばＡｓｎ、ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、そしてこれにＣｙｓ、Ｇｌｙ、ＭｅｔおよびＰｈｅを加えた群から選択される。

本明細書に記載するように、設計された修飾抗体はｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を使って構築することができ、結合エネルギーが再計算される。修飾側鎖の構築は、各側鎖に対して最も好ましい位置を決定するために二面角を６０゜ずつ増やしながらＣＨＡＲＭＭで回転異性体の二面角をスキャニングすることによって行うことができる。次ぎに、ポアソン−ボルツマンの静電エネルギー項と、ファンデルワールスエネルギーおよび埋没表面面積に関する追加項とを使って、野生型（親）複合体および変異（修飾）複合体の結合エネルギーを計算する。

次に、必要に応じて、たとえばｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法か、追加的な実験構造／機能データに基づく方法を反復したあとで、これらの修飾に対するコンピューター計算結果を再評価する。

これらの規則によっていくつかの予測が可能となり、それらの予測は次のように分類することができる：
１）相互作用界面における修飾。結合すると一部が埋没してしまう抗体上の残基が関係する（相互作用は、抗原と水素結合を形成することで改善される）；
２）抗体上の極性残基の修飾。極性残基は結合によって埋没してしまうため、脱溶媒和によって不利を招くが、抗原とは何ら直接的な静電相互作用をしない（通常、修飾して野生型残基と形状が似た疎水性残基にするか、好ましい静電相互作用を行うことができる残基を導入することで改善される）；および
３）非相補的ポテンシャル領域にある抗体上の表面残基を修飾する。この修飾は、結合界面における充填相互作用を乱さないで抗原−抗体間の遠距離静電相互作用を改善すると考えられる。

このように実施すれば、本発明の規則は、好結果を与える親和性の変更の予測、たとえば側鎖を修飾して親和性を高める予測を可能にする。これらの知見は、一般化した３つのタイプの修飾に分類することができる。第一のタイプの修飾は、抗原上の電荷を持つ基と向かい合って界面に水素結合が可能な残基を含む。第二のタイプの修飾は、結合によって脱溶媒和という不利を招くが、静電的逆相互作用をしない埋没極性残基を含む。第三のタイプの修飾は、遠距離静電相互作用を含む。

第一の修飾タイプは、このタイプの残基が、本質的に、抗原の満たされていない水素と、水素結合を形成するため、基本的な物理／化学的考察を点検することによって決定される。本発明の方法は、他の方法と異なり、脱溶媒和という犠牲よりも相互作用エネルギーによる有益性の方が上回るという驚くべき残基修飾を可能にする。

第二の修飾タイプは、さらに別の修飾の集まりで、エネルギーは、主として、非極性相互作用を維持したままで不利な脱溶媒和を排除した結果として得られる。

第三の修飾タイプは、親和性の大幅な上昇の可能性を示す遠距離相互作用が関係する。このタイプの修飾は、抗原と直接接触しないため抗原−抗体界面における微妙な相互作用への攪乱が少ないという点で特に興味深い。

それゆえ、本発明の規則にしたがって候補アミノ酸の位置に対する所望の側鎖の化学的性質を決めたら、本明細書にさらに記載するように、たとえば置換、挿入または削除によって残基の位置を修飾または変更する。

抗体の修飾に対する上記の規則以外に、いくつかの決定要因、たとえば溶媒効果を、最適電荷分布の最初の（そしてそれにつづく）計算に入れることができる。

（抗体または抗原に結合する抗体フラグメントの入手）
非自然抗体（抗原に結合する抗体フラグメント）を作ることを目的とする本発明の方法は、そうしなければならないという訳ではないが、抗体を入手することから始めることができる。本明細書ではこの抗体は「親抗体」あるいはときどき「最初の抗体」と呼ばれる。この抗体は、その抗体（すなわち親抗体）の中の、または親抗体に類似する配列または親抗体の一部を含む配列を有する修飾抗体または変更を加えた抗体の中の一つ以上のアミノ酸残基の修飾または変更を可能にする情報の入手に使用できる。たとえば、本明細書に記載されているように、いわゆるＣＤＲグラフトまたは移植を行うために、標準的な遺伝子工学の技術を使って、親抗体の一つ以上のＣＤＲ（またはその一部）を修飾抗体の対応するＣＤＲで置き換えることができる。したがって、本明細書の方法は、哺乳動物（たとえばネズミまたは霊長類）のモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体で始めることができる。

親抗体または本発明の修飾抗体は、当業者が知る供給源から入手することもできるし、あるいは当業者が知る技術によって作ることもできる。たとえば、親抗体は、別の供給源または種、たとえばネズミから誘導される、ＣＤＲ領域を持つＣＤＲグラフト抗体であってもよいし、ヒト化抗体であってもよい。

親抗体または本発明の修飾抗体は、モノクロナール抗体のフォーマット内にあることが可能である。モノクロナール抗体を作る方法は、従来技術（たとえばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７，１９７５を参照）ばかりでなく、免疫グロブリンをコードするＤＮＡを安定的にミエローマ細胞に導入する技術の中でも知られている（たとえばＯｉほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：８２５〜８２９，１９８３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１３７３〜１３７８，１９８３；およびＯｃｈｉほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６３５１〜６３５５，１９８３）。ｉｎ ｖｉｔｒｏで行う変異誘発およびＤＮＡの移入を含め、これらの技術は、組み換え免疫グロブリンの構築を可能にする。これらの技術は、本発明の方法において使用される親抗体および修飾抗体の調製に使用することもできるし、これらの方法から生れる修飾抗体を作るために使用することもできる。あるいは、抗体フラグメント（ｓｃＦｖおよびＦａｂ）をＥ．ｃｏｌｉの中で作ることもできる（作る方法および細胞宿主についてはさらに下で述べる）。

親抗体または本発明の修飾抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭの群の抗体であってもよい。

上で触れたように、本発明の方法は四量体より大きな多量体の抗体（Ｇ群（ＩｇＧ）の免疫グロブリンの構造を有する抗体）に適用することができる。たとえば、抗体を修飾する方法は、抗原に結合する抗体であれば、いずれの抗体であってもそのフラグメントに対して行うことができる。そのフラグメントは組み換え技術によって作ることもできるし、合成することもでき、あるいはタンパク質分解酵素で抗体を消化して作ることもできる。たとえばフラグメントはＦａｂフラグメントでもよい。パパインによる消化は、鎖間（すなわちＶ_Ｈ−Ｖ_Ｈ）のジスルフィド結合より先に、二つの重鎖を連結する領域で抗体を切断する。その結果、軽鎖と、重鎖のＶ_ＨドメインとＣ_ＨＩドメインを含む同じ二つのフラグメントを形成する。別の方法では、フラグメントはＦ（ａｂ’）_２であってもよい。これらのフラグメントは、鎖間のジスルフィド結合よりあとで重鎖を切断するペプシンで抗体を消化して作ることができ、抗原に結合する両サイトを含むフラグメントが生成する。さらに別の方法は、「一本鎖」の抗体を使用することである。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントはさまざまな方法で構築することができる。たとえばＶ_ＨのＣ末端がＶ_ＬのＮ末端に結合していてもよい。典型的には、Ｖ_ＨとＶ_Ｌの間にリンカー（たとえば（ＧＧＧＧＳ）_４）を挿入する。しかし鎖を連結することができる順序は逆にすることができ、検出または生成を容易にするタグ（たとえばＭｙｃ−、Ｈｉｓ−またはＦＬＡＧ−タグ）を導入することができる（本発明のいかなる抗体または抗体のフラグメントにも取り付けることができるタグ；その使用はｓｃＦｖに限定されるものではない）。したがって、そしてあとで言及するように、タグを付けた抗体は本発明の範囲内である。別の実施形態では、本明細書に記載する方法に使用される抗体またはそれらの方法で作られる抗体は、重鎖の二量体または軽鎖の二量体であってもよい。さらに、抗体の軽鎖もしきは重鎖、またはその一部、たとえば単一ドメイン抗体（Ｄａｂ）も使用することができる。

本発明の方法は反復的であるので、本抗体は自然抗体でなくてもよい。抗体を修飾する過程は必要な回数だけくり返すことができるため、出発抗体（または抗原に結合するその抗体のフラグメント）は、完全に非ヒト抗体またはヒトＦＲおよび非ヒト（たとえばネズミ）ＣＤＲを含む抗体であってもよい。すなわち、「親抗体」は、抗体の親和性を改善するために、すなわち抗体を親和成熟させるために本発明の方法を行うＣＤグラフト抗体であってもよい。上で触れたように、親和性は、自然ヒト抗体（ＦＲドナー）の、その抗原に対する親和性とほぼ同じ程度（これよりそれほど悪くない程度）までしか改善することはできない。したがって、「親抗体」を２種類以上（たとえばヒトＦＲと非ヒトＣＤＲ）の配列を含む抗体を含め、早期の一回以上の修飾ラウンドで作られる抗体とすることができる。本発明の方法は、非ヒト（たとえばネズミ）抗体からの一つ以上のＣＤＲとヒト抗体のＦＲとを含む「親抗体」の使用を包含する。別の実施形態では、親抗体は完全なヒト抗体とすることができる。

言うまでもなく、構造が使用できる場合は、その構造を使ってコンピューター分析を初めてもよい。

（抗原−抗体の構造データに基づく本発明の方法）
タンパク質は、そのアミノ酸配列と、ある一つのタンパク質（またはタンパク質を含む複合体）が入れられる溶媒とによって支配される三次元構造に折り畳まれていることはよく知られている。タンパク質の三次元構造はその生物学的活性および安定性に影響を与える。その構造はいくつかの方法で決定しあるいは推測することができる。一般に、経験的方法では物理生化学的分析法が使用されている。さらに、既知の三次元構造を持つ一つ以上の同族体タンパク質（またはタンパク質複合体）の三次元構造のモデル構築を使って三次構造を予測することができる。タンパク質の構造決定法としておそらく最もよく知られている方法はＸ線結晶構造解析法（したがって、「構造」という用語に代わって「結晶構造」という用語を使用することができる）であろう。しかし、円二色性、光散乱または放射エネルギーの吸収および放出を測定して推定することもできる。他の有用な方法として中性子回折法や核磁気共鳴法（ＮＭＲ）もある。これらの方法は、いずれも当業者によく知られた方法であり、標準的な教科書（たとえば、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版、Ｗ．Ｊ．Ｍｏｏｒｅ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｎ．Ｊ．，１９７２，またはＰｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋ．Ｅ．Ｖａｎ Ｈｏｌｄｅ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｎ．Ｊ．，１９７１））および数多くの出版物に詳しく解説されている。これらの方法はいずれも抗体または抗原−抗体を含む複合体の構造決定に使用することができる。次に、その構造は、本発明の方法にしたがって分析することができ、たとえば、本発明の方法の一つ以上の手順に生かすことができる。

同様に、これらの方法やこれに類する方法は、たとえば一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメントなどからなるフラグメントを含め、抗体フラグメントに結合する抗原の構造を得るために使用できる。抗体、抗体フラグメント、またはｓｃＦｖ抗原複合体の結晶を作製する方法は、たとえばｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｓｅｎほか（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１３６７９〜１３６８４，１９９９、これを参照することによりここに組み込む）によって報告されている。

（コンピューター分析）
本発明の方法を実施するに当たって使用される基本的な計算式は、たとえば米国特許第６，２３０，１０２号に記載されている。参照することによりその全内容を本願明細書に組み込む。

上で触れたように、抗体の変更は、抗体とそれが結合する抗体との間に働く静電力をコンピューター分析した結果にしたがい、好ましくは、本明細書に記載する本発明の個々の指針または規則にしたがって行われる。このコンピューター分析によれば抗体内の最適電荷分布の予測が可能であり、コンピューターシステムで電荷分布を表示する一つの方法は、多極子の集まりとして表示する方法である。別の表示方法としては、抗体の各原子の位置に存在する点電荷の集まりとして表示する方法もある。電荷分布（好ましくは最適電荷分布）が決まれば、その電荷分布にマッチするように、あるいはより良くマッチするように修飾が行われる。

コンピューター分析は、米国特許第６，２３０，１０２号に記載の計算をコンピューターで実行する過程を通して行うことができる。本明細書では抗原−抗体間の結合の実際の状況が考慮されるようにコンピュータープログラムを修正する（本発明の方法は、他の方法と違い、たとえば溶媒、遠距離静電相互作用、および溶媒中における抗体とその抗原との間の結合における誘電効果を考慮する）。「成熟させた」抗体とその抗原との間の結合自由エネルギーに対する静電的な寄与を（修飾しない（「出発」または「親」）抗体のそれと比較して）最小にする電荷分布を、「成熟させた」抗体上に実現するために抗体の構造に加えるべき修飾を確認するため、上記計算過程が援用される。ここに記載する演算（さらに詳細は米国特許第６，２３０，１０２号）を実行するコンピューターシステム（または装置）には、典型的には、情報をユーザーに表示する出力装置（たとえば、ＣＲＴ表示装置、ＬＣＤ、プリンター、通信機器たとえばモデム、音声出力装置、その他）が含まれる。さらに、方法を部分的にまたは全体を実行するための命令は、その命令を実行するための電子装置で使用するに適する媒体に伝達される。このように、本発明の方法は、ソフトウェア（たとえばコンピューターが理解できる命令）およびハードウェア（たとえばコンピューター、ロボット装置およびチップ）を含む処理能力の高いアプローチに変更可能である。コンピューターを通して実行される過程は、特定のコンピューター・プラットフォーム、特定のプロセッサー、または特定の高水準プログラム言語に限定されない。

有用な過程が添付資料Ａ（米国特許第６，２３０，１０２号）に記載されており、さらに詳細な記述は添付資料Ｂ（ＬｅｅおよびＴｉｄｏｒ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０６：８６８１〜８６９０，１９７７；両資料のそれぞれは参照によりここに組み込まれる）。

（親和性の分析）
親和性、親和力および／または特異性は様々な方法で測定することができる。一般に、そして親和性を規定または測定する精密な方法には関係なく、本発明の方法によって抗体が作られる場合、本発明の方法は抗体の親和性を改善し、その抗体は、それが作られる抗体と比較して、その臨床的応用のいかなる面においても優れている（たとえば、修飾された抗体を、それが作られる抗体より低用量または低投与回数で、またはより便利な投与経路で投与できるとき、本発明の方法は有効または成功であると考えられる）。

より具体的には、抗体とそれが結合する抗原との間の親和性は、たとえばＢｉａＣｏｒｅアッセイまたはＫｉｎＥｘＡ^ＴＭ３０００アッセイ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）から入手できる）を含め、さまざまな検定法によって測定できる。後者のアッセイは、ＶＬＡ１Ｉドメインに対するＡＱＣ２ ｓｃＦｖ変異体の親和性の測定に使用される（下記実施例を参照）。要するに、共溶媒を使って抗原をセファローズ・ビーズに被覆する（下記実施例では、抗原は、ＶＬＡ１Ｉドメインタンパク質であるが、本発明の方法に使用される抗原は、興味の対象となる抗原であればいかなる抗原でも可能である（たとえば、癌抗原；細胞表面タンパク質または分泌タンパク質；病原体の抗原（たとえばバクテリア抗原またはウイルス抗原（たとえば、ＨＩＶ抗原、インフルエンザ抗原または肝炎抗原））またはアレルゲン）。（しかし、ここに記載する方法が広く一般的に応用できることは理解されよう。これらの方法は、特定の抗原や特定の抗原群に結合する抗体を作ることに限定されるものではない）。

当業者であれば、親和性の決定が、ただ一つの最後の数字を見るほど単純なものでないことは理解していただけよう。抗体は二本の腕を持つため、その見かけの親和性は、可変領域と抗原との間の本来の親和性（これは親和力によるものと考えられている）より、はるかに強いのが普通である。本来の親和性はｓｃＦｖフラグメントかＦａｂフラグメントを使って測定できる。

（キメラ抗体および抗体フラグメント）
「キメラ抗体」という用語は、たとえばペプチド結合またはペプチドリンカーによって非相同タンパク質またはそのペプチドに結合する免疫グロブリン分子の少なくとも抗原に結合する部分を含むタンパク質を記述するために使用される。「非相同」タンパク質は非免疫グロブリンでもよいし、種、綱または亜綱が異なる免疫グロブリンの一部であってもよい。

このような抗体を作ることができる過程は数多くある。たとえば、少なくともＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするＤＮＡ配列および非相同タンパク質（またはそのペプチド（このペプチドの長さは、非免疫グロブリン分子（すなわち免疫グロブリンと配列が実施的に同じでないペプチド）であることを認識できるに十分な長さである））をコードする配列に動作可能的に連結するプロモーターを含む発現ベクターを調製することができる。もし必要な場合または望まれる場合は、相補可変ドメイン（すなわち、親発現ベクターがＶ_Ｈをコードするときは、第二発現ベクターはＶ_Ｌをコードし、逆の場合も同様）をコードするＤＮＡ配列に動作可能的に連結するプロモーターを含む第二の発現ベクターを調製することができる。次に、細胞系（たとえば、不死化した哺乳動物の細胞系）を発現ベクターの一方または両方で形質転換し、キメラ可変ドメインまたはキメラ抗体の発現が可能な条件下で培養することができる（たとえば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒほか、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ／８５／００３９２を参照）。Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒほかが、親発現ベクターによって完全な可変ドメインがコードされたキメラ抗体を作ったのに対して、本法は本発明の修飾抗体の発現に使用でき、抗体は、全長重鎖および軽鎖またはそのフラグメントを含む（たとえば、本明細書に記載のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２またはｓｃＦｖフラグメント）。本法はキメラ抗体の発現に限定されるものではない。

本明細書に記載の方法によって作られる抗体は、他の抗体と全く同様に標識することができる。本発明は本発明の方法によって作られ、かつ検出可能な標識、たとえば放射性標識（たとえばＰ^３２またはＳ^３５）、酵素（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）など）、発色団または量子ドットを含む蛍光団で標識される抗体を包含する。標識された抗体は、多様な細胞タイプまたは組織タイプに対する診断に使用される（多くの診断アッセイはタンパク質抗原（たとえばＰＳＡ）の検出に頼っている）。ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで画像化する場合、本明細書に記載の方法で作られた変更を加えた抗体に薬剤、たとえばＮＭＲ造影剤、Ｘ線造影剤または量子ドットなどを追加使用して標識できる。抗体およびそのフラグメントを含め、ポリペプチドに検出可能な薬剤を結合させる方法は公知である。抗体を不溶性支持体（たとえばビーズ、ガラスまたはプラスチックのスライド板など）に結合することも可能である。

（修飾抗体の構築）
抗体の配列（たとえば、ＣＤＲグラフト抗体、それとは別の修飾抗体または「ヒト化」抗体）が決まったら、分子生物学の分野でよく知られている技術を使って抗体を作ることができる。さらに具体的には、ある核酸配列（たとえば、所望のタンパク質産生物をコードするＤＮＡ配列（たとえば修飾重鎖または軽鎖；その可変ドメイン、または抗原に結合するその別のフラグメント））を持った宿主細胞を形質転換して広範囲のポリペプチドを作るために組み換えＤＮＡ法を使うことができる。

さらに具体的には、調製方法は、上記キメラ抗体の場合と同様に行うことができる。たとえば変更を加えた可変ドメインをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成によって調製することができる。可変ドメインは、抗原に結合しやすくするために一つ以上の残基（たとえば、ＣＤＲ内の残基）を修飾する前か後に、ヒト・アクセプター分子のＦＲおよびドナーのＣＤＲ、たとえばネズミのＣＤＲを含む可変ドメインであってもよい。これは、アクセプター抗体のフレームワーク領域の配列およびドナー抗体の少なくともＣＤＲ配列を決定することで容易になる。別の調製方法として、プライマーによるオリゴヌクレオチド部位変異誘発法によって、変更を加えた可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を調製することができる。この方法には、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドと、変異点を含むＤＮＡ一本鎖を混成し、その一本鎖をオリゴヌクレオチド伸張のテンプレートにして、変異を含む鎖を作ることを含む。この技法は、さまざまな変形があるが、たとえばＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００，１９８２）、Ｎｏｒｒｉｓほか（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：５１０３〜５１１２，１９８３）、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（ＤＮＡ ３：４７９〜４８８，１９８４）およびＫｒａｍｅｒほか（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４７５〜６４８５，１９８２）によって記載されている。

配列に変異を導入する方法には別の方法も知られており、本明細書に記載する変更を加えた抗体を創出するために使うことができる（たとえば、Ｃａｒｔｅｒほか、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１〜４４４３，１９８５を参照）。部位指向変異誘発に使われるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成によって合成することもできるし、適当な制限酵素を使ってドナー抗体の可変ドメインをコードするＤＮＡから分離することもできる。

（修飾抗体を発現させるための宿主細胞および細胞系）
本明細書に記載する親抗体または修飾抗体は、培養基中で宿主細胞または細胞系によって（最終的な形か中間の形で）発現させることが可能である。これらの抗体はｉｎ ｖｉｖｏで細胞中に発現させることができる。変更を加えて抗体を産生するように形質変換（たとえば移入）される細胞系には、不死化した哺乳動物細胞系、たとえばリンパ球様細胞起源の細胞系（たとえば、ミエローマ、融合細胞腫、トリオーマ、クアドローマの細胞系）が可能である。細胞株には、ウイルス（たとえばＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）による形質転換で不死化した正常なリンパ球様細胞、たとえばＢ細胞も含むことができる。

変更を加えた抗体を作るために使われる細胞系は、典型的には、哺乳動物細胞系であるが、他の生物（バクテリアおよび酵母など）からの細胞系も使用できる。Ｅ．ｃｏｌから誘導されたバクテリア株が、特に、たとえばファージディスプレイに使用できる。

不死化したリンパ球様細胞系の中には、たとえばミエローマ細胞系のように正常な状態で分離されたＩｇ軽鎖または重鎖を分泌するものがある。本発明の過程で調製された、変更を加えた抗体を発現するベクターでこのような細胞系を形質転換する場合、正常に分泌すされる鎖が、上で調製したベクターによってコードされたＩｇ鎖の可変ドメインと相補的である限り、プロセスの残りの手順を実行する必要はない。

もし不死化した細胞系が相補的鎖を分泌しない場合は、適当な相補的鎖かまたはそのフラグメントをコードするベクターを細胞に導入する必要があろう。

不死化した細胞系が相補的軽鎖または重鎖を分泌する場合は、たとえば適当なバクテリアの細胞をベクターで形質変換したのち、そのバクテリア細胞壁を不死化細胞系と融合させて（たとえば、スフェロプラストの融合によって）形質変換細胞系を作ることができよう。あるいは、電気穿孔法によってＤＮＡを不死化した細胞系に直接導入することもできよう。

（医薬製剤およびその使用）
予防的適用では、症状が進行する過程で現れる障害の生物化学的、組織学的および／または行動上の症状、その合併症および中間的病理学的表現型を含む障害のリスクを排除または減らすため、程度を軽減するため、または障害の発症を遅らせるために十分な量の薬学的組成物または薬剤が、障害を患う対象に投与される。治療的適用では、障害の進行過程において、障害の合併症および中間的病理学的表現型を含む障害の（生物化学的、組織学的および／または行動上の）症状を治癒または少なくとも部分的に阻止するために、十分な量の組成物または薬剤が、そのような障害が疑われる患者またはすでにそのような障害を患っている対象に投与される。

疾患を処置するための、本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、処置対象の生理的状態、処置対象がヒトか動物か、処置が予防的か治療的かを含め、多くの異なる要因によって変化する。処置対象は普通ヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含め、ヒト以外の哺乳動物の処置も可能である。

抗体による受動免疫に対しては、宿主の体重１ｋｇ当たりの用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ、そして通常は０．０１〜２０ｍｇの範囲である。たとえば、体重１ｋｇ当たりの用量は１ｍｇまたは１０ｍｇ、または１〜１０ｍｇの範囲内、たとえば少なくとも１ｍｇとすることができる。処置対象に対する投与は、そのような量を毎日、一日おきに、または週にそれぞれ一回、あるいは試験的な分析に基づいてこれらとは別のスケジュールにしたがって行うことができる。例示的な処置は、比較的長期間、たとえば少なくとも６か月間にわたって多回投与を前提とする。さらに別の例示的な処置レジームは、２週間ごとに一回または３か月ないし６か月ごとに一回の投与を前提とする。例示的な用量スケジュールは、毎日連続的に１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、一日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週６０ｍｇ／ｋｇである。方法によっては、結合特異性が異なる２種類以上のモノクロナール抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の用量はいずれも上記の範囲内である。

抗体は通常複数回にわたって投与される。各投与間の間隔は、一週間、一か月、一年のいずれも可能である。ある方法では、血漿中の抗体濃度が１〜１０００ｍｇ／ｍｌとなるように調節され、別の方法では２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように調節される。さらに別の方法では、持続的放出製剤の形で投与することができ、その場合は投与回数を減らすことができる。用量と回数は、処置対象の体内における半減期によって変わる。一般的には、ヒト抗体が最も半減期が長く、それにつづいてヒト化抗体、キメラ抗体、非ヒト抗体の順に半減期は短くなる。

投与量と投与回数は、行う処置が予防的か治療的かによって変わる可能性がある。予防的適用の場合は、まだ病的状態にない処置対象に対して、処置対象の抵抗力を高めるために、本発明の抗体かまたはそのカクテルを含む組成物が投与される。そのような場合の量は「予防的有効量」であると定義される。この使用の場合、具体的な用量はやはり処置対象の健康状態と全般的な免疫状態に依存するが、一般的には一回当たり０．１〜２５ｍｇ、特に０．５〜２．５ｍｇの範囲である。比較的長い間隔をおいて長期にわたって投与される場合は比較的低用量である。処置対象によっては生存中ずっと処置を受け続けることもある。

治療的適用の場合は、疾患の進行が遅くなるまで、あるいは停止するまで、そして好ましくは処置対象の疾患の症状が部分的にあるいは完全に改善されるまで、比較的短い期間の間に比較的高い用量を必要とすることがある（たとえば、一回当たり抗体約１〜２００ｍｇ、普通には５〜２５ｍｇの用量が使用される）。そのあとは、患者に予防的レジームを適用することができる。

予防的および／または治療的処置に対して、治療薬は、非経口、外用、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内に投与することができる。タンパク質薬剤の最も典型的な投与経路は、血管内、皮下または筋肉内であるが、別の経路も有効である。方法によっては沈着物が蓄積している特定の組織、たとえば頭蓋内に薬剤が直接注入される。また、別の方法では、抗体は、持続的に放出される組成物または装置、たとえばＭｅｄｉｐａｄ^ＴＭ装置の形で投与される。タンパク質薬剤は、呼吸器官を通して、たとえば散剤吸入器を用いて投与される。

本発明の薬剤は、免疫障害の処置に少なくとも部分的に有効な別の薬剤と、自由選択的に組み合わせて投与することができる。

本発明の薬学的組成物は、本発明の少なくとも一つの抗体を、製薬学的に許容される担体に含めることができる。「製薬学的に許容される担体」とは、普通、有効成分を投与するために使用される医薬製剤の少なくとも一つの成分を指す。そのような担体は、公知の技術で使用されるあらゆる医薬賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）および投与のためのあらゆる形の送達媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を含むことができる。組成物は、たとえば注射液、水性懸濁液または水溶液、非水性懸濁液または溶液、固体および液体経口剤、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル剤、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、皮内パッチ、クリーム、ローション、錠剤、カプセル剤、持続的放出剤などが可能である。追加的な賦形剤としては、たとえば、着色料、味覚マスキング剤、溶解補助剤、懸濁剤、圧縮剤、腸内被覆剤、持続放出補助剤などが可能である。

本発明の薬剤は、有効治療薬の他に製薬的に許容されるさまざまな成分を含有する組成物の形で投与されることが少なくない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０））を参照。どのような形が好ましいかは、意図された投与法と治療的適用とに依存する。また、所望の製剤に応じて、動物またはヒトに投与する薬学的組成物を製剤化するために広く使用される送達媒体として規定される、製薬的に許容される無毒な担体または希釈剤を、組成物に含めることができる。希釈剤は、組み合わせの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンク液を挙げることができる。さらに、他の担体、アジュバント、または無毒で治療効果がなく免疫発現性もない安定化剤などを薬学的組成物に含めることもできる。

抗生物質を、有効成分を持続的に放出できるように製剤化することが可能なデポ注射液またはインプラント製剤の形で投与することができる。例示組成物は、モノクロナール抗体を５ｍｇ／ｍｌ含有し、５０ｍＭ ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌからなり、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整された水性緩衝液の形に配合される。モノクロナール抗体に好適な配合緩衝液の別の例は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０、１０％ショ糖、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む。

組成物は、典型的には、溶液か懸濁液の形の注射液として調製される。注射する前に液体送達媒体に溶解または懸濁させるに適した形の固体を調製することもできる。製剤はアジュバント効果を高めるために、リポソームまたは微粒子、たとえばポリラクチド、ポリグリコライドまたは共重合体の中に乳化させるか、カプセル化することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ ２８：９７（１９９７））。

（治療）
疾患または障害を患う処置対象の処置は、標準的な方法でモニターすることができる。一部の方法は、たとえば薬剤を投与する前の処置対象の抗体レベルまたはプロフィールのベースライン値を決め、それと、処置後のプロフィールまたはレベルに対する値とを比較することを前提としている。レベルまたはプロフィールの値が顕著に増加した（すなわち、同一試料のくり返し測定における実験誤差の典型的なバラツキ範囲、すなわちそのような測定の平均値からの標準偏差より大きい）場合は、処置によって成果があったことを意味する（すなわち、薬剤の投与によって所望の応答が達成された）。免疫応答の値に顕著な変化が見られなかったり低下した場合は、処置による成果がマイナスであったことを意味する。

別の方法では、対照群についてレベルまたはプロフィールの対照値（すなわち、平均値および標準偏差）が決定される。対照群の個体は、典型的には、それより以前に処置を受けたことはない。次に、治療薬の投与を受けた処置対象おレベルまたはプロフィールの平均値を対照値と比較する。対照値より顕著な増加が見られれば（たとえば、平均値から１標準偏差より大きい）、処置は成果があったこと、あるいは十分な成果があったことを示す。顕著な増加が見られなかったり減少した場合は、成果がマイナスであったか不十分であったことを意味する。一般に、レベルが対照値より増加し続けている間は、薬剤の投与も続けられる。対照値に対してレベルの増加が見られなくなったら処置の投与を中止するか用量および／または投与の頻度を減らすことができることを示している。

別の方法では、治療薬による処置を受けてきてレベルまたはプロフィールが、処置の応答に関して、プラトーに達した個体対照群から、レベルまたはプロフィールの対照値（たとえば平均値および標準偏差）が決定される。処置対象のレベルまたはプロフィールの平均値を対照値と比較する。もし処置対象の測定されたレベルが対照値と有意な違いがなければ（たとえば、１標準偏差より大きい）、処置を中止することができる。もし処置対象のレベルが対照値より著しく低ければ薬剤の投与が続けられる。処置対象のレベルが対照値より低い状態のまま持続する場合は処置の変更を示唆している可能性がある。

別の方法では、現在は処置を受けていないが以前に処置コースを受けていた対象が、処置の再開が必要か否かを決めるために、抗体レベルまたはプロフィールのモニターを受けている。この対象の測定レベルまたはプロフィールを、以前に処置コースを受けてこの対象が以前に到達した値と比較することができる。以前の測定より顕著に減少している（すなわち、同じ試料でくり返し測定したときの典型的な誤差範囲より大きい）ときは治療を再開できることを示唆している。別の比較方法として、処置対象の測定値を、処置コースを受けたあとの対象の集合に対して決定した対照値（平均値＋標準偏差）と比較することができる。さらに別の比較方法として、処置対象の測定値を、予防的な処置を受けて現在疾患の症状がない対象の集合、または治療的処置を受けて現在病状が改善している対象の集合の対照値と比較することができる。これらのケースはすべて、測定値が対照レベルより顕著に低い場合は、その対象に対して処置を再開すべきであることを示唆している。

抗体プロフィールは、投与後すぐに抗体濃度のピークに達し、そのあと指数関数的に減少する。その後投与しなければ、投与した抗体の半減期の長さによって、減衰曲線は数日から数か月の間に治療前のレベルに近づく。例をあげれば、いくつかのヒト抗体の半減期は２０日程度である。

いくつかの方法では、投与前に、対象の、所定の抗原に対する抗体ベースラインの測定を行い、そのあとすぐに抗体のピークレベルを決めるため２回目の測定を行う。それから抗体レベルの減衰をモニターするため、さらに一回以上の測定を行う。抗体レベルがベースラインまで、あるいはあらかじめ決めておいたベースラインから測定したピークに対する百分率（たとえば５０％、２５％、１０％）まで減衰したときに、さらに抗体を投与する。いくつかの方法では、ピークまたはその後に引き続いて測定したバックグラウンドからのレベルを、他の対象で有効な予防的または治療的処置レジームを定めるためにあらかじめ決めておいた比較基準レベルと比較する。もし測定された抗体レベルが比較基準レベルより顕著に低ければ（たとえば、平均値から、処置によって効果のあった対象の集合の比較基準値の１標準偏差を引いた値より小さい）、抗体の追加投与を示唆している。

さらに別の方法は、研究者または医師が障害を診断またはモニターするために日常的に頼よっていて、当業者によく知られた生理学的症状（たとえば肉体的症状または心的症状）を、処置の期間にわたってモニターすることを含む。

本発明をさらに明らかにするため、以下に実施例を挙げるが、これによって本発明の範囲が限定されるものではない。

（実施例）
特に断らない限り、全実施例を通して次に挙げる材料と方法を使用した。

（材料と方法）
本発明の実施には、特に断らない限り、化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、たとえば抗体技術）および電気泳動法で使用される通常の実験技術を使用する。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｕ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗほか，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ（１９９９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌほか、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照。

（抗体および抗原に結合する抗体フラグメントの調製）
抗体、具体的にはたとえばキメラ抗体、ヒト化抗体、モノクロナール抗体および一本鎖抗体の選択、クローニングおよび製造に関しては参照可能な文献記載が十分そろっている。また、ｈｕ５ｃ８ ｍＡｂのヒト化については以前に記載されている。Ｌｅｄｅｒｍａｎ，１９９２およびＫａｒｐｕｓａｓ，２００１をそれぞれ参照。この抗体はＡＴＣＣ（ＰＴＡ−４９３１）から入手できる。５ｃ８抗体は、ＮＳ０ミエローマ細胞中に安定に発現させて、これをタンパク質Ａおよびゲル濾過クロマトグラフィで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析ゲル濾過クロマトグラフィを行い、タンパク質が、ジスルフィドで連結された期待のテトラマーを形成したことを確認した。本発明の一本鎖抗体は、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ中に発現させ、それを標準的方法で免疫的に精製した。

（ＡＱＣ２ ｓｃＦｖの調製）
ＡＱＣ２ ｓｃＦｖは、プラスミドｐＫＪ２１７によって発現させた。このプラスミドは、１０６個のアミノ酸からなる軽鎖可変領域をコードするＡＱＣ２軽鎖の３１８個のヌクレオチドと、それに続いてフレーム内に、ＧＧＧＧＳリンカー構造の３コピーをコードする４５個のヌクレオチドとを含む。リンカーのあと、フレーム内に１２０個のアミノ酸からなるＡＱＣ２をコードする３６０個のヌクレオチドがつづく。重鎖可変領域のすぐ後にエンテロキナーゼ切断部位とｍｙｃタグおよびＨＩＳタグとがつづく。発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で行った。その発現はａｒａ−ＢＡＤプロモーターで駆動される。タンパク質は、バクテリオファージｆｄからｇ１１１ペプチドをコードする８０個のヌクレオチドフラグメントによって細胞周辺腔に向けられる。このペプチドは、細胞周辺腔に向かう間にタンパク質から切断された。

（５Ｃ８ Ｆａｂの調製）
５Ｃ８ Ｆａｂフラグメントは、ビシストロンプラスミドｐＢＥＦ０６４によって発現させた。第一のシストロンは、１１８個のアミノ酸からなる重鎖可変領域をコードする５Ｃ８重鎖の３５４個のヌクレオチドと、それに続いてフレーム内に、ヒトＩｇＧ１不変ドメインの最初の１０２個のアミノ酸をコードする３０６個のヌクレオチドと、６ヒスチジンタグをコードする１８個のヌクレオチドとを含む。第二のリボソーム結合点は重鎖シストロン末端のあとの７個のヌクレオチドにある。第二のシストロンは、１１１個のアミノ酸からなる５Ｃ８軽鎖可変領域をコードする３３３個のヌクレオチドと、それに続いてフレーム内に、１０７個のアミノ酸軽鎖不変ドメインをコードする２１個のヌクレオチドとを含む。発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で行った。その発現はａｒａ−ＢＡＤプロモーターで駆動される。重鎖および軽鎖は、ＯｍｐＡ（重鎖）およびＰｈｏＡ（軽鎖）細胞周辺腔局在化シグナルによって細胞周辺腔に向けられる。細胞周辺腔局在化シグナルは、細胞周辺腔に向かう間にタンパク質から切断された。

（結合アッセイ）
結合アッセイは、典型的にはＫｉｎＥｘＡ^ＴＭキットを使って行った。アッセイは、抗体（または抗原に結合するフラグメント）の希薄溶液を、キットのカラムに流すことによって行った。抗体（または抗原に結合する抗体フラグメント）の一部は、ビーズ上の抗原と相互作用する。次に、抗体（またはフラグメント）を、蛍光色素を結合した第二の抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使って検出した。抗体の濃度は、蛍光色素からの信号がタンパク質の濃度に比例する濃度に設定される。溶液相の相互作用親和性を得るため、抗体（またはフラグメント）を可溶性抗原の希釈系列と混合する。室温で３時間インキュベーションするか、４゜Ｃで一晩インキュベーションしてこれらのタンパク質（抗体および抗原）を平衡状態にする。抗原を含むカラムから混合物を溢流させる。シグナルは、溶液中にとどまっている未結合の抗体（または抗体フラグメント）の量に比例する。得られた結果を半対数方眼紙にプロットし、非線形回帰法によって二次曲線にフィットさせることができ、得られた曲線からＫ_Ｄ値が得られる。

（５Ｃ８−ＣＤ４０Ｌ結合アッセイ）
ＥＬＩＳＡ法に基づく競争結合アッセイを行った。アンチｃ−ｍｙｃ ｍＡｂ１０μｇ／ｍｌをＰＢＳ中、室温で２時間、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂのプレートに被覆した。非標識５Ｃ８ Ｆａｂ（変異体または野生型）の系列希釈液を作製し、同体積の一定濃度（３０ｎｇ／ｍｌ）ビオチン標識５Ｃ８ Ｆａｂ競合体（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）と混合したのちプレートに加えた。室温で２時間ほどインキュベーションしたのちプレートを洗浄し、それから結合したビオチン標識５Ｃ８ Ｆａｂ競争体をストレプタビジンＨＲＰで検出した。４個のパラメーター曲線のフィットから結合親和性が得られた。

（コンピューターモデリングによる測定基準および公式）
本発明にしたがって抗体を最適化するには、以下に述べる測定基準および公式を使用することができる。たとえば、抗体の結合状態における静電自由エネルギーと非結合状態における静電自由エネルギーの間の結合自由エネルギー差は、ΔＧ_{ｂｉｎｄｉｎｇ}＝Ｇ^{ｂｏｕｎｄ}−Ｇ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}で表すことができる（図１ａを参照）。誘電モデルにエントロピーとエンタルピーの両方に影響を及ぼす応答が含まれているため、静電エネルギーは自由エネルギーと見なされる。各状態の自由エネルギーは、抗体（Ｌ）、抗体（または抗原に結合する抗体フラグメント）（Ｒ）およびそれらの相互作用（Ｌ−Ｒ）を含むクーロン項と反応場（水和）の項の和として表される：

この式から結合自由エネルギーに関する次式が得られる。

式中、抗原および抗体の点電荷の幾何学は固定されて変わらないという事実をモデルに使用すれば、抗体および抗原のクーロン力自己寄与は消去される。さらに、式中、抗原と抗体は非結合状態では相互作用しないと考えられるので、Ｌ−Ｒ項は結合状態のみに起因する（しかし、抗原の電荷分布は、結合状態と非結合状態とで同じである必要はないことに注意しなければならない）。もし両者で異なるときは、これはΔＧ_{ｂｉｎｄｉｎｇ}に定数を加えるが、式（３）でΔＧ_ｖａｒを定義するときは省略できる。したがって、式（２）は静電結合自由エネルギーを、抗体および抗原の脱溶媒和の寄与（不利に働く）と、結合状態において溶媒によって遮蔽される静電相互作用（通常、有利に働く）との和として表す。目的は抗体の電荷分布を変えて静電結合自由エネルギーを最適化することであり、最後の項は単に定数を加えるものであるので、関係の変動結合エネルギーは次式によって定義される、

式中、式（２）の右辺（ＲＨＳ）の最初の２つの項は遮蔽された相互作用の項にまとめられ、定数項は省略されている。

および

であり、式中、Ｖ_Ｌ ^{ｓｔａｔｅ}は、表示された状態における抗体の電荷分布のみによる総静電ポテンシャルであり、Ｖ_{ｔｅｒｍ，Ｌ} ^{ｓｔａｔｅ}は、表示のようにクーロン項または反応場（水和）項であることに注意しなければならない。総和は、抗体（ｉ∈Ｌ）または抗原（ｊ∈Ｒ）における原子点電荷について行われる。式（５）の係数１／２は、抗体の電荷分布は自己誘導反応場と相互作用するという事実によっている。式（４）および（５）における３つの静電ポテンシャル、Ｖｃ_{ｏｕｎｔ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}、Ｖ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}およびＶ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}は、図１ｂに示す境界値問題を解くことによって、その与えられた幾何形状の項と電荷分布の項で表される。（抗体に対応する）電荷分布は半径Ｒの球に書き込まれる。球の中心を座標の原点（’記号が付かない）とするが、多極子の電荷分布は、ｚ軸に沿って距離ｄだけ平行移動した第二原点（’記号付き）について展開され、次式で表される。

ポテンシャルはあらゆる場所でポアソン式を満たす。球の中では次式で表される

式中、ＲＨＳの第一項はクーロンポテンシャル、第二項は反応場（水和）ポテンシャルであり、ｉに関する総和は抗体の点電荷に相当する。球の外では、クーロンポテンシャルと反応場ポテンシャルは、一つに合わせて次式で表すことができる。

Ａ_ｌ，ｍおよびＢ_ｌ，ｍは、境界条件によって決定されるものであり、Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）は球面調和関数である。式（７）のクーロン項は球面調和関数に展開され、電荷分布の多極子は球の中心について展開される。ここで多極子展開の原点は

に移される。

式中、Ｑ’_ｌ，ｍは、’系の原点

について展開された球形多極子である。

Ｊａｃｋｓｏｎによって使用されたＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）の定義を採用する（Ｊ．Ｄ．Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｅｌｅｃｔｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ，第２版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７５）。

式（１０）の表現は、ｒ’＞ｒ’ｉに対して成立する（すなわち、抗体の外で、もっと正確に言えば、その中心が

にあり、その半径が

と点電荷の間の最大距離である球の外で成立する）。式（７）に代入し、球面調和関数を含む項を組み合わせるため、第一のＹ_ｌ，ｍ（θ’，φ’）／ｒ’^ｌ＋１は、Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）／ｒ^ｌ＋１の点から拡張された。これは、Ｇｒｅｅｎｇａｒｄの結果を使って行われ（Ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｆｉｅｌｄｓ ｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．，１９８８）、ｒ＞ｄに対して

式中、

θ_ｄ＝０における形状が使用されているので、式（１２）のｍ’＝０の項のみが非消滅であり、その場合、式（１０）は次式となる。

式中、点

について多極子分布をとり、ポテンシャルを、大きな球の中心に関する球面関数の総和として表わした。上記式は次式でも書くことができる。

ここで、同じＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）を含む項はひとまとめにされる。それに反して、式（１４）では同じＱ’^＊ _ｌ，ｍを含む項が、ひとまとめにされる。

式（１５）を式（７）に代入し、ｒ＝Ｒまたは室温で境界条件をマッチさせると、

球内の水和（反応場）ポテンシャルは、

ここで、

Ｖ’は、明らかにされたＱ’^＊ _ｌ，ｍへの依存性によって、それぞれ書き換えることができる。Ｖ’_{ｃｏｕｌ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}は、式（２０）で与えられ、Ｖ’_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}は式（１９）で与えられるが、同じＱ’^＊ _ｌ，ｍを持つ項が集められるように書き換えられ、Ｖ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}は、Ｒ＝ａおよびｄ＝０として、式（１９）によって与えられる。

式（４）に代入すると、ΔＧ_{ｉｎｔ，Ｌ−Ｒ}のＱ’^＊ _ｌ，ｍへの依存性が明らかになる。

式中、最後の行で、Ｑ’^＊ _ｌ，ｍに依存しないα_ｌ，ｍは、式（２５）のＱ’^＊ _ｌ，ｍを乗じる係数であると定義される。各α_ｌ，ｍは、多極子の、ΔＧ_{ｉｎｔ，Ｌ−Ｒ}に対する寄与を表し、ΔＧ_ｖａｒを求めるために必要な、抗原の電子分布に関するすべての情報を含んでいる。ΔＧ_{ｉｎｔ，Ｌ}のために、式（５）をＱ’^＊ _ｌ，ｍの点から書き換えることは有用であり、多極子は、個々の電荷ｑｉより抗体の電荷分布を記述する。

は、多極子の展開の中心

について展開される。

球面座標では次式のように展開されることがＲｏｓｅによって明らかにされている（Ｍ．Ｅ．Ｒｏｓｅ，Ｊ．Ｍａｔｈ．＆Ｐｈｙｓ．３７，２１５（１９５８）；Ｍ．Ｅ．Ｒｏｓｅ，Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ａｎｇｕｌａｒ Ｍｏｍｅｎｔｕｍ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５７））。

式中、

そしてｙ_ｌ，ｍ

は、

を

で置き換えて得られる演算子である。
正のｍに対して、ラプラス方程式の解（すなわちｒ^ｌＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）またはＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）／ｒ^ｌ＋１）にｙ_ｌ，ｍ

が作用する場合、ｍ≧０に対して

二重の階乗は次のように定義される

そして球面偏導関数は

負のｍに対してｙ_ｌ，ｍ

を計算するため、Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）＝（−１）ｍＹ^＊ _ｌ，ｍ（θ，φ）が成立する事実および式（３４）の球面偏導関数の定義を使用し、ｍ≧０に対して

を得る。
そこで、結合した抗体の水和エネルギーは

式（３７）のｙ_ｌ，ｍ

の値を求めるため、式（３１）およびグラジエントの式を使用する（Ｍ．Ｅ．Ｒｏｓｅ，Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ａｎｇｕｌａｒ Ｍｏｍｅｎｔｕｍ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５７））。

式中、

Ｃ（ｌ’，１，ｌｍ−ｍ’，ｍ’）は、（Ｒｏｓｅの）表１に示す角運動量の研究でしばしば現れるベクトル加法（またはＣｌｅｂｓｃｈ−Ｇｏｒｄｏｎ）係数であり、ξ_ｍ’は球面単位ベクトルである。

したがって、

式（３８）〜式（４１）から

表１、式（３１）および式（３７）〜式（４２）を用いて、以下の中間結果が得られる

および結合状態における抗体の水和エネルギーを表す最終表現式として次式を得る。

式中、_{βｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}は、上記二つの式によって定義される。_{βｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}は、ｍ’ｍに対してゼロの値をとることに注意していただきたい。

式（４６）において、ｄ＝０、Ｒ＝αと置くと非結合抗体の水和エネルギーが得られる。

ここで、γ_ｌ，ｍは、式（４８）および式（４９）によって定義される。そこで、ｍに対する形式的依存性はないが、表記の便宜上、γ_ｌ，ｍはＩおよびｍの関数として書かれる。

そこで、ΔＧ_ｖａｒは抗体の電荷分布Ｑ’_ｌ，ｍの多極子（抗体の球の中心について展開される）およびＱ’_ｌ，ｍに依存しない要素α_ｌ，ｍ、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}およびγ_ｌ，ｍの関数として表されてきた。式（２６）、（４７）および（４９）を組み合わせると次式が得られる。

α_ｌ，ｍのみが抗原の電荷に依存し、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}とγ_ｌ，ｍは、結合した状態と非結合の状態の形状にのみ依存することに注意しなければならない。ΔＧ_ｖａｒ ^ｏｐｔは実量であるのに対して、α_ｌ，ｍおよびＱ’_ｌ，ｍは複合体であり、積α_ｌ，ｍＱ’^＊ _ｌ，ｍおよびＱ’^＊ _ｌ，ｍＱ’_ｌ’，ｍは、Ｙ^＊ _ｌ’，ｍ（θ’，φ’）_Ｙｌ，ｍ（θ，φ）の形の項に関する総和を含む。β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}とγ_ｌ，ｍは、実数であることに留意していただきたい。次に、ΔＧ_ｖａｒ ^ｏｐｔは、

（式中、ｍに関する総和は、ｌ＝０に対して除外される）
Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）＝（−１）^ｍＹ^＊ _ｌ，ｍ（θ，φ）および

であることに再度注目すれば、式（５１）のようにα_ｌ，ｍとＱ’_ｌ，ｍの実数部と虚数部の項で書き換えられる。

新しい変数ＲｅＱ’_ｌ，ｍおよびＩｍＱ’_ｌ，ｍは、下記のようにＱ_ｉで再指数づけし再表記され、

α_ｉ、β_ｉｊおよびγ_ｉを作り出すために類似の変形が使用される。そこで、式（５１）は次式、

または行列表示

の形に書き換えることができる。
式中、

はＱ_ｉによって形成されるベクトルであり、

はα_ｉによって形成されるベクトルである。

は、（β_ｉｊ−δ_ｉｊγ_ｉ）によって形成される対称行列であり、式（５８）に到達するため平方の完成が使用されてきた。式（５７）の

は、抗体の脱溶媒和による不利（ペナルティ）に相当し、化学的に妥当な形状に対してはゼロより大きくなければならないため、

は正の有限値であり、ΔＧ_ｖａｒの極値は最小値である（Ｇ．Ｓｔｒａｎｇ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ−Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｓｓ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，Ｍａｓｓ．，１９８６））。

式（５８）から多極子の最適値

および最小変動結合エネルギーΔＧ_ｖａｒ ^ｏｐｔが得られる。

が正の有限値であるため、ΔＧ_ｖａｒ ^ｏｐｔは常に負である。

単極（全電荷）を固定して（Ｑ１＝

）、最適多極子分布を求めるには、残りの最適多極子に対する式（ｉ≠１）は次のとおりである。

これは式（５９）と類似する。

ｉ_ｍａｘ＝（ｌ_ｍａｘ＋ｉ）^２でディメンジョンを打ち切った上記行列方程式は、比較的少ないコンピューターリソースによって数値的に解くことができる。α_ｉおよびβ_ｉｊは、無限個の項にわたる総和を含むため、式（２５）および式（４６）の最も内部まで入る和を途中で打ち切るためにはｌ_ｃｕｔの第二カットオフ値を使う必要がある。ｌ_ｍａｘおよびｌ_ｃｕｔは十分大きいので、ΔＧ_ｖａｒ ^ｏｐｔは収束し、多極子を多く含めるほど利点が増すということは基本的にはなくなる。

本章では、所定の抗原と形状に対して、緊密に結合する抗体を多極子の集まりと見なしてその電荷分布を求める方法を記述してきた。被検抗体について、結合自由エネルギーの最適値からのずれは、式（５８）から式（６０）を差し引き、式（５９）を使って

を消去することによって計算することができる。

（実施例１）
（抗原に結合する抗インテグリン抗体の親和性を改善する方法）
この実施例では、治療に関係する標的抗体の抗原結合親和性を改善する方法について記述する。

基本的原理の裏付けとして、本発明の方法を、細胞表面に存在するコラーゲンおよびラミニンに対するレセプターであるＶＬＡ−１インテグリンに対する抗体、具体的には、マウスにおいて、親和性の成熟によってヒトＶＬＡ−１レセプターに対して活性化させたモノクロナール抗体ＡＱＣ２に適用した。ＡＱＣ２は、ＶＬＡ−１インテグリンが関与する病理過程を阻害する（たとえばＷＯ ０２／０８３８５４）。

ＡＣＱ２の２個所が変異したバリアントがＶＬＡ−１に結合するときの親和性は、野生型抗体のそれの１００分の１である。この結合を回復させようとする努力の中で、親和性が改善された変異体を示唆するため、静電荷最適化の技法を二段階の手順で抗原−抗体複合体の結晶構造に適用した。まず、結合にとって最適に近いＣＤＲ残基の位置を決めるため、静電荷の最適化を行った（ＬｅｅおよびＴｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０６：８６８１〜８６９０，１９９８；ＫａｎｇａｓおよびＴｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０９：７５２２〜７５４５，１９９８）。次に、コンピューター解析を進めるためにＣＤＲ変異の集合を定めた。これらの計算結果に基づいて、ただ一つの変異を有する３６種類の修飾抗体（すなわち３６種類の「単変異体」）と二つの変異を有する１０種類の抗体（すなわち１０種類の「複変異体」）とについて結合親和性を求めた。２６種類の単変異体は、野生型抗体より静電的に好ましいであろうと予測され、１５種類はファンデルワルスエネルギー項および溶媒が近づきうる表面積の項を含む完全エネルギー関数とより良く結合するであろうと予測された。これらの項は、静電力とは無関係であるが、設計された変異が他の残基と接触せず、埋没した表面積を大きくは低下させることがないように計算された。複合体を形成するときに埋没表面積が増すことは通常有益である（下表の「全エネルギー」の欄を参照）。さらに、複変異体が多いことは、野生型複合体より好ましいこと、そしてその効果は、単変異体に対して一部加算的であることが予測された。

変異の予測は、次のように分類することができる：（１）相互作用界面における変異を含む予測。結合すると一部が埋没してしまう残基が変異に関係する（相互作用は、抗体と水素結合を形成することで改善される）；（２）抗体上の極性残基の変異を含む予測。極性残基は、結合によって埋没してしまうため、脱溶媒和によって不利を招くが、抗体とは何ら直接的な静電相互作用をしない、（通常、変異によって野生型の残基と形が似た疎水性残基にするか、好ましい静電相互作用を行うことができる残基を導入することで改善される）；および（３）非相補的ポテンシャル領域にある抗体上の表面残基の変異を含む予測。これらの変異は、結合界面における充填相互作用を乱さないで、抗原−抗体間の遠距離静電相互作用を改善すると考えられる。

電荷の最適化の結果に基づいて、コンピューター分析のための変異を決定した（最適電荷分布および現在の残基よりも最適に近い設計の変異を検討した。この手順は検査によって行った）。電荷の最適化は原子の中心に電荷を与えたが、実際の変異をもたらさなかった。電荷最適化の１ラウンドは、天然の側鎖特性を表すためのさまざまな制約条件を課して実行した。たとえば、側鎖の正味の電荷を−１、０＋１とし、原子の電荷が電子単位の絶対値で０．８５を超えないという制約を加えて最適化を行った。

プログラムＣＨＡＲＭＭ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、水素を加える標準的手順を使ってＶＡＬ−１／ＡＱＣ２複合体（ＰＢＤコード：１ＭＨＰ）の結晶構造を作成した。Ｎ−アセトアミドおよびＮ−メチルアミドのパッチをＮ末端とＣ末端にそれぞれ適用した。複合体の一つの残基２８８〜２９３に密度の欠落が見つかったが（モデル１）、その密度を修復することはしなかった。連続体静電モデルを使って、ＡＣＱ２抗体のＣＤＲのアミノ酸の各側鎖に静電荷の最適化を実行した。つづいて、最適化で観察された静電結合エネルギーにおけるポテンシャル・ゲインに基づいて、適切が側鎖の変異を決定した。各側鎖に対してそれぞれ最も望ましい位置を決めるため、ＣＨＲＡＭＭを使って、二面角を６０゜ずつ増やしながらロータマーの二面角スキャンを実行し側鎖を構築した。次に、ポアソン−ボルツマンの静電エネルギー項と追加項とを使って野生型複合体および変異体の複合体に対する結合エネルギーを計算した。

ヒト化した中和抗体（ＡＱＣ２）のＦａｂフラグメントと複合体を形成したα１インテグリンのＩドメインの結晶構造をｐＨ７．４０で２．８Åまで解いた。非対称単位胞には複合体が２個存在した。マンガン（ＭＮ）原子は両錯体とも錯体界面に存在し、その相互作用の大部分はＩドメインに由来するものであった。抗体からのＡｓｐ１０１は、コラーゲングルタメートの相互作用を擬している。

ＡＱＣ２重鎖のＣＤＲ可変ループ２に対して得られた最適化の結果を次表（表２）に示す。Ｍｕｔ（変異エネルギー）の欄は本来の残基と、全く電荷を持たない側鎖同形体、すなわち形が同じであって原子上に電荷が存在しないか部分的な電荷しか持たない残基との間の結合自由エネルギーの差に相当する。負の数は予測される結合親和性の増加を示す。Ｏｐｔ−１の欄は、側鎖の電荷分布が最適な場合と側鎖の正味の電荷が−１の場合とに得られる結合自由エネルギーの差に相当する。Ｏｐｔ０の欄とＯｐｔ１の欄は、それぞれ側鎖の電荷分布が最適な場合と側鎖の正味の電荷が０および＋１の場合とに得られる結合自由エネルギーの差に相当する。これらの結果と目で検査した結果とに基づいてこれらの結合自由エネルギーの改善を生かすことができる変異が設計される。たとえば、ＴＨＲ５０から、無電荷の同形体のＶＡＬに変えると、予測変異エネルギー−０．５２ｋｃａｌ／ｍｏｌが使用される。ＬＹＳ６４をＧＬＵに変えると、正味電荷が−１への変異に対して予測される−１．４２ｋｃａｌ／ｍｏｌの最大自由エネルギーゲインが使用される。

下記の規則に従い、コンピューター計算によって変異体の設計の選択をさらに検討した。

たとえば、モデル計算で変異エネルギー（Ｍｕｔ，本来の残基から、全く電荷を持たない側鎖の同形体、すなわち形が同じであって原子上に電荷が存在しないか部分的な電荷しか持たない残基に変えることに伴う結合自由エネルギーの差（ｋｃａｌ／ｍｏｌに相当する）が好ましかった例（たとえばΔＧ＜−０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）では、側鎖が極性を持たないアミノ酸の群、たとえば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌからの変異が選ばれた。

（側鎖の電荷分布が最適な場合と側鎖の正味の電荷が−１の場合とでそれぞれ得られる結合自由エネルギーの差に相当する）Ｏｐｔ−１のエネルギーが好ましかった（たとえばΔＧ＜−０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）ときは、側鎖が負の電荷を有するアミノ酸群、たとえばＡｓｐ、Ｇｌｕからの変異が選ばれた。

同様に、（側鎖の電荷分布が最適な場合と側鎖の正味の電荷が＋１の場合とでそれぞれ得られる結合自由エネルギーの差に相当する）Ｏｐｔ＋１のエネルギーが好ましかった（たとえばΔＧ＜−０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）ときは、側鎖が正の電荷を有するアミノ酸群、たとえばＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓからの変異が選ばれた。

最後に、（側鎖の電荷分布が最適な場合と側鎖の正味の電荷が０の場合とでそれぞれ得られる結合自由エネルギーの差に相当する）Ｏｐｔ０のエネルギーが好ましい（たとえばΔＧ＜−０．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）ときは、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸群、たとえばＣｙｓ、Ｇｌｙ、およびＰｈｅに追加される、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒからの変異が選ばれた。

上で述べたように、設計変異体をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで構築し、結合エネルギーを再計算する。変異をコンピューターで計算した結果を下に示す。数字は野生型から変異体に変えたときの結合親和性の変化を表す（値が負の変異体の方が好ましい）。エネルギーの値は２種類のモデルの平均値を表す。

表の結果からわかるように、コンピューターによる上記計算法は、親和性を高める側鎖の変異を予測する手段として好成績を収めた。これらの知見から変異は３つの一般的なグループに分類された。第一の変異のタイプは、抗原上の電荷を有する基と向かい合って界面に水素結合が可能な基が関係する；第二の変異のタイプは、結合するときに脱溶媒和という不利を招くが、静電相互逆作用をしない埋没した極性残基が関係する；第三の変異のタイプは、遠距離静電相互作用が関係する。

第一の変異タイプは、このタイプの残基が、本質的に、抗原の満たされていない水素と水素結合を形成するため、基本的な物理／化学的考察を点検することによって決定される。脱溶媒和という犠牲よりも相互作用エネルギーによる有益性の方が上回るように見える場合がほとんどであったことは驚くべきことである。第二の変異タイプは、比較的直感性の少ない変異のタイプまたは集まりで、エネルギーは、主として、非極性相互作用を維持したままで不利な脱溶媒和を排除した結果として得られる。第三の変異タイプは、親和性の大幅な上昇の可能性を示す遠距離相互作用が関係する。これらのタイプの変異は、抗原と直接接触させないため、抗原−抗体界面で微妙な相互作用に対して攪乱が少ないはずであるという点で特に興味深い。

上で述べたように、得られた計算データにしたがってＡＣＱ２（一本鎖Ｆｖ変異体）の変異体を発生させ、その親和性を上記ＫｉｎＥｘＡ^ＴＭアッセイによって測定した。現在までに発生させた変異体を次表に示す。親和性のアッセイを行ったものについては、「Ｋｄ」で示した欄に結果が挙げてある。出発ＡＣＱ２一本鎖Ｆｖの親和性は２５ｎＭであった。

ＡＱＣ２に対しては下記の変異も行った：重鎖の修飾：Ｒ３１Ｋ、Ｒ３１Ｆ、Ｒ３１Ｅ、Ｈ５６Ｆ、Ｙ５８Ｅ、Ｙ５８Ｑ、Ｙ５９Ｄ、Ｙ５９Ｅ、Ｌ６０Ｅ；軽鎖の修飾：Ｎ３０Ｌ、Ｎ３０Ａ、Ｎ３０Ｉ、Ｈ３１Ｋ、Ｌ４９Ｋ、Ｌ４９Ｒ、Ｌ４９Ｈ、Ｗ９５Ｅ、Ｗ９５Ｄ。

（実施例２）
（抗原に結合する抗ＣＤ１５４抗体の親和性を改善する方法）
この実施例では、治療に関係する標的抗原に対して、抗体の結合親和性を改善する方法について記述する。

免疫応答の仲介に関係するタンパク質のＴＮＦファミリーの一つであるヒトＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ４０Ｌの名称でも知られる。たとえば、Ｙａｍａｄａほか、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７３：Ｓ３６〜９（２００２）；Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋほか、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５８：４〜４３（２００１）；Ｋｉｒｋほか、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ。Ｂ．Ｓｃｉ．３５６：６９１〜７０２（２００１）；Ｆｉｕｍａｒａほか、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１３：２６５〜７４（２００１）；およびＢｌａｎｃｏｎｅほか、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．３（４）：３５４〜５３（１９９９）を参照）に対する抗体は、マウスにおいて親和性の成熟によって活性化された。上記の研究などから５ｃ８モノクロナール抗体が開発され、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌが仲介する病理過程を阻害することが明らかにされた。

５ｃ８／ＣＤ４０Ｌ間の親和性相互作用を高めようとする努力の中で、親和性が改善された変異体を示唆するため、静電荷最適化の技法を二段階の手順で抗原−抗体複合体の結晶構造に適用した。まず、結合にとって最適に近いＣＤＲ残基の位置を決めるため、静電荷の最適化を行った（ＬｅｅおよびＴｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０６：８６８１〜８６９０；ＫａｎｇａｓおよびＴｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０９：７５２２〜７５４５，１９９８）。次に、コンピューター解析を進めるためにＣＤＲ変異の集合を定めた。これらの計算結果に基づいて、ただ一つの変異を有する２３種類の修飾抗体（すなわち２３種類の「単変異体」）について結合親和性を求めた。８種類の単変異体は、静電エネルギー項および、ファンデルワールスエネルギー項および溶媒が近づきうる表面積の項を含む完全エネルギー関数の点で、野生型抗体より好ましいと予測された。これらの項は、静電力とは無関係であるが、設計された変異が他の残基と接触せず、埋没した表面積を大きくは低下させることがないように計算された。複合体を形成するときに埋没表面積が増すことは通常有益である（下表の「全エネルギー」の欄を参照）。

変異の予測は、次のように分類することができる：（１）相互作用界面における変異を含む予測。結合すると一部が埋没してしまう残基が変異に関係する（相互作用は、抗体と水素結合を形成することで改善される）；（２）抗体上の極性残基の変異を含む予測。極性残基は、結合によって埋没してしまうため、脱溶媒和によって不利を招くが、抗体とは何ら直接的な静電相互作用をしない、（通常、変異によって野生型の残基と形が似た疎水性残基にするか、好ましい静電相互作用を行うことができる残基を導入することで改善される）；および（３）非相補的ポテンシャル領域にある抗体上の表面残基の変異を含む予測。これらの変異は、結合界面における充填相互作用を乱さないで、抗原−抗体間の遠距離静電相互作用を改善すると考えられる。

電荷の最適化の結果に基づいて、コンピューター分析のための変異を決定した（最適電荷分布および現在の残基よりも最適に近い設計の変異を検討した。この手順は検査によって行った）。電荷の最適化は原子の中心に電荷を与えたが、実際の変異をもたらさなかった。電荷最適化の１ラウンドは、天然の側鎖特性を表すためのさまざまな制約条件を課して実行した。たとえば、側鎖の正味の電荷を−１、０＋１とし、原子の電荷が電子単位の絶対値で０．８５を超えないという制約を加えて最適化を行った。

プログラムＣＨＡＲＭＭ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用し、水素を加える標準的手順を使ってＣＤ４０Ｌ／５ｃ８複合体（ＰＢＤコード：１Ｉ９Ｒ）の結晶構造を作成した。Ｎ−アセトアミドおよびＮ−メチルアミドのパッチをＮ末端とＣ末端にそれぞれ適用した。連続体静電モデルを使って、ＡＣＱ２抗体のＣＤＲのアミノ酸の各側鎖に静電荷の最適化を実行した。つづいて、最適化で観察された静電結合エネルギーにおけるポテンシャル・ゲインに基づいて、適切が側鎖の変異を決定した。各側鎖に対してそれぞれ最も望ましい位置を決めるため、ＣＨＲＡＭＭを使って、二面角を６０゜ずつ増やしながらロータマーの二面角スキャンを実行し側鎖を構築した。次に、ポアソン−ボルツマンの静電エネルギー項と追加項とを使って野生型複合体および変異体の複合体に対する結合エネルギーを計算した。

ヒト化した中和抗体（５ｃ８）のＦａｂフラグメントと複合体を形成したＣＤ４０リガンドの結晶構造をｐＨ６．５０で３．１Åまで解いた。天然ＣＤ４０Ｌは３量体であるため、複合体には３個の５ｃ８ Ｆａｂ分子と５個のＣＤ４０Ｌ分子が存在する。それらの分子は複合体の中で３個の独立したＣＤ４０Ｌ／５ｃ８界面を形成する。各５ｃ８ Ｆａｂに亜鉛（ＺＮ）原子が結合していたので、計算にはそれを入れた。計算は３つの界面に対してそれぞれ独立して行い、３個の部位すべてに対して野生型より好ましいことがわかったアミノ酸の置換を探した。

３個すべての５ｃ８分子に対して５ｃ８短鎖のＣＤＲ可変ループ１に対して得られた最適化の結果を次表（表５）に示す。Ｍｕｔ（変異エネルギー）の欄は本来の残基と、全く電荷を持たない側鎖同形体、すなわち形が同じであって原子上に電荷が存在しないか部分的な電荷しか持たない残基との間の結合自由エネルギーの差に相当する。負の数は予測される結合親和性の増加を示す。Ｏｐｔ−１の欄は、側鎖の電荷分布が最適な場合と側鎖の正味の電荷が−１の場合とに得られる結合自由エネルギーの差に相当する。Ｏｐｔ０の欄とＯｐｔ１の欄は、それぞれ側鎖の電荷分布が最適な場合と側鎖の正味の電荷が０および＋１の場合とに得られる結合自由エネルギーの差に相当する。これらの結果と目で検査した結果とに基づいてこれらの結合自由エネルギーの改善を生かすことができるであろう変異が設計される。たとえば、ＳＥＲ３１から、無電荷の同形体のＶＡＬに変えると、予測変異エネルギー−１．２３〜−０．６８ｋｃａｌ／ｍｏｌが使用される。ＧＬＮ２７をＧＬＵに変えると、正味電荷が−１への変異に対して予測される−１．２１〜−０．８８ｋｃａｌ／ｍｏｌの最大自由エネルギーゲインが使用される。

上で述べたように、設計変異体をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで構築し、結合エネルギーを再計算した。変異をコンピューターで計算した結果を下に示す。数字は野生型から変異体に変えたときの結合親和性の変化を表す（値が負の変異体の方が好ましい）。エネルギーの値は、５ｃ８の３本すべての鎖のエネルギーである。

表の結果からわかるように、コンピューターによる上記計算法は、親和性を高める側鎖の変異を予測する手段として好成績を収めた。これらの知見から変異は３つの一般的なグループに分類された。第一の変異のタイプは、抗原上の電荷を有する基と向かい合って界面に水素結合が可能な基が関係する；第二の変異のタイプは、結合するときに脱溶媒和という不利を招くが、静電相互逆作用をしない埋没した極性残基が関係する；第三の変異のタイプは、遠距離静電相互作用が関係する。

第一の変異タイプは、このタイプの残基が、本質的に、抗原の満たされていない水素と水素結合を形成するため、点検によって解決された。ほとんどのケースで脱溶媒和というコストよりも相互作用エネルギーによる有益性の方が上回るように見えたことはおどろくべきことである。第二の変異タイプは、比較的直感性の少ない変異タイプまたは集まりで、エネルギーは、主として、非極性相互作用を維持したままで不利な脱溶媒和を排除した結果として得られる。第三の変異タイプは、親和性の大幅な上昇の可能性を示す遠距離相互作用が関係する。これらのタイプの変異は、抗原と直接接触させないため、抗原−抗体界面で微妙な相互作用に対して攪乱が少ないという点で特に興味深い。

上で述べたように、得られた計算データにしたがって５ｃ８（Ｆａｂフラグメント）の変異体を発生させ、ＣＤ４０Ｌに対する親和性を上記ＫｉｎＥｘＡ^ＴＭアッセイによって測定した。現在までに発生させた二、三の変異体の結果を次表に示す。親和性のアッセイを行ったものについては、「ＩＣ５０」で示した欄に結果が挙げてある。出発５ｃ８ ＦａｂのＣＤ４０Ｌに対する親和性は０．８１ｎＭであった。

かくして、本発明の方法は、治療に関係する抗体の親和性の成熟を可能にするものであると結論された。

（等価物）
日常的実験手法を使うだけでも、当業者にとっては、本願明細書に記載する本発明の個々の実施形態の等価物が数多く存在する。このような等価物は特許請求の範囲に包含されるものである。
（１２）米国特許
（１０）特許番号： 第６，２３０，１０２ Ｂ１号
Ｔｉｄｏｒほか
（４５）特許日：２００１年０５月０８日
（５４）溶媒中におけるリガンドと分子との間の結合において、結合に対する静電的寄与を最小にする電荷分布を確認するためのコンピューターシステムおよび方法、ならびにそれらの使用
（７５）発明者：Ｂｒｕｃｅ Ｔｉｄｏｒ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ；Ｌｅｅ−Ｐｅｎｇ
Ｌｅｅ；Ｓａｒａ Ｅ．Ｄｅｍｐｓｔｅｒ，両人はＣａｍｂｒｉｄｇｅ、 全員マサチューセッツ州（米国）
（７３）特許権者：マサチューセッツ工科大学（米国）
（＊）注：権利の放棄を条件として、本特許の期限は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１５４（ｂ）の規定により０日まで延長または調整される。
（２１）出願番号：第０９／０５５，４７５号
（２２）出願日：１９９８年０４月０３日
関連する米国特許出願データ
（６０）１９９７年０４月０４日出願、仮出願第６０／０４２，６９２号
（５１）国際特許分類 Ｇ０１Ｎ ３３／４８；Ｇ０１Ｎ ３３／５０；
Ｇ０１Ｎ ３３／００
（５２）米国特許分類 ７０２／１９；７０２／２０；４３６／８９；
３６４／４９６；３６４／５７８
（５８）調査分野
（５６）引用された文献
米国特許文献

他の刊行物

（リストは次頁に続く）
主任審査官 Ｊｏｈｎ Ｂｒｕｓｃａ
副審査官 Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｓｉｕ
（７４）代理人：Ｗｏｌｆ，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ＆ Ｓａｃｋｓ
（５７）要約
コンピューターを援用する本発明の方法は、リガンドの性質を決める方法を含み、その方法は、タンパク質またはその他の標的分子、たとえば標的ＨＩＶと結合するリガンドを設計するために使用できる。この方法は、ある一つの標識部位および幾何形状に対する静電的補完を定義する。静電的補完の定義は、明確な構造およびコンビナトリアル・ライブラリーの設計またはバイアスを通じてリガンドを見つけだすために、標的部位に対する立体的補完と一緒に使用することができる。静電的補完を明確に定義すること、すなわち不利に働く脱溶媒和エネルギーと好ましい相互作用との間で最適な相殺が行われることが、リガンドの設計に有用であることが発見された。この方法は、物理的原理に基づく最適リガンドの性質を明確にすることで、設計の問題を根本からひっくり返すものである。これらの性質は、試行リガンドを比較することができる明確かつ正確な標準としての役立つのみならず、既存リガンドを修飾するときおよび新規リガンドを最初から構築するときにテンプレートとして使用可能な明確かつ正確な標準としても役立つ。ある一つの目標部位に対する静電的補完は、ある一つの溶媒中で分子上結合部位での結合に対する静電的寄与が最小となる電荷分布によって定義される。コンピューターシステムにおける電荷分布を表す一つの方法は、多極子の集合として表す方法である。この最適な電荷分布に合致する点電荷を持つ分子を確認することで、リガンドの確認、薬物の設計およびコンビナトリアル・ライブラリーの設計に使用できる可能性がある。
請求項６ 図面５枚
他の刊行物

溶媒中におけるリガンドと分子との間の結合において、結合に対する静電的寄与を最小にする電荷分布を確認するためのコンピューターシステムおよび方法、ならびにそれらの使用
関連する出願は、３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）に基づき、「溶媒中におけるリガンドと分子との間の結合において、結合に対する静電的寄与を最小にする電荷分布を確認するためのコンピューターシステムおよび方法、ならびにそれらの使用」の名称で１９９７年４月４日に出願された米国仮特許出願第６０／０４２，６９２号の特恵を請求する。

政府の支援
本研究は、一部米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの助成金（交付番号ＧＭ４７６７８およびＧＭ５６５５２）によって行われた。したがって、米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、合理的ドラッグデザイン（薬物設計法）に関し、具体的には溶媒中におけるリガンドとその標的分子との間の結合に対する静電的寄与を最小にする、リガンド上の電荷分布の予測に基づく合理的ドラッグデザインに関する。さらに本発明は、そのような予測をし、結合力を高めたリガンドを作るための方法およびツール、ならびにそのようにして作られるリガンドの判定および治療への使用にも関する。

発明の背景
コンピューターによる合理的ドラッグデザインには大きく分けて二つの方法がある：一つは、分子全体をふるいにかける方法であり、もう一つは局所的に調べて分子の断片をつなぎ合わせるか、親構造に部分構造を接ぎ木して分子を構築する方法である。ＤＯＣＫは分子全体を扱うアルゴリズムの一例であり、目的標的部位を補う形を見つける手順を使用する（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｚほか、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９（１９８２）（Ｋｕｎｚ）；Ｒ．Ｌ．ＤｅｓＪａｒｌａｉｓほか、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：７２２（１９８８）（ＤｅｓＪａｒｌａｉｓ）。（相補的形との重なりを計算して）形が標的部位に適合しない分子をまず消去したのち、近似エネルギー関数で残る分子の等級づけを試みることで大規模化合物データベースをコンピューター的に「ふるいにかける」ことができる。この手法は標的部位に結合するいくつかのリガンドを確認する上で成果を上げてきた。しかし残念なことに、Ｘ線結晶構造解析によって、リガンドの結合が予想どおりには起こらず、しばしば異なることが明らかにされている。予測と事実との間にくい違いが生じる理由の一つとして、形状相補性アルゴリズムは、極めて不適格な試行リガンドを除外するには有効であるが、それより高いレベルで結合の詳細を規定するには近似エネルギー関数の厳密性が低すぎることが考えられる。

ＭＣＳＳ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｐｙ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｅａｒｃｈ）アルゴリズムは、最も広く使用されている断片組立て方式によるリガンド設計法の一つである（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９（１９８５）；Ａ．ＭｉｒａｎｋｅｒおよびＫａｒｐｌｕｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．１１：２９（１９９１）；およびＡ．Ｃａｆｌｉｓｃｈほか、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：２１４２（１９９３））。その基本的な考え方は結合部位の領域を探して官能基（カルボニル、アミド、アミン、カルボキシレート、ヒドロキシルなど）のライブラリーを表すプローブを使って特に好ましい相互作用エネルギーを有する場所を判断することである。結合部位にうまくプローブを置くことができたら、さまざまなサブセットを連結してコヒーレントな分子を構築する。この問題を解決する方法として二つの手法が開発されている。一つは、官能基を連結するためにデータベースからの小さい分子をフィットさせる方法であり（ＨＯＯＫ）（Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎほか、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．１９：１９９！９９５））、もう一つは、シミュレーションしたアニーリングプロトコルを使って、フラグメント間にリンカー原子と結合を構築して共有結合の形状と非結合相互作用が好適なリガンド候補を発生させる方法（ＤＬＤ，ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ）（Ａ．ＭｉｒａｎｋｅｒおよびＫａｒｐｌｕｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．１１：２９〜３４（１９９１）および２３：４７２（１９９５））である。

現在行われている合理的薬物設計法は、標的部位の水素結合基をおおまかに補償すると思われる新しい刺激に富む形状を示唆するには有用である。しかし残念ながら現在使用されている方法では近似の精度が十分でなく、候補を正確にランクづけするには問題がある。このように、コンピューター計算のアルゴリズムには、結合部位および形成される複合体を分析するアルゴリズムと、リガンドやその他の薬物候補を合理的デザインするためのアルゴリズムの両方が存在するが、構造に基づくデザインは精密さと決定性の面での努力が必要である。

発明の要約
従来技術の限界は（ｉ）標的分子およびリガンド候補の非結合状態および結合状態の両方で働いている溶媒和、誘電効果および長距離静電効果の厳密な取扱い方法と、（ｉｉ）示唆されたリガンド（候補）をランキングづけするための詳細な定量的方法を提供することによって解消される。本法は、溶媒、遠距離静電相互作用および誘電効果の取扱いが粗いことと、標的分子とリガンド候補の非結合状態に対する適切な取扱法が欠けていることが、合理的なデザインおよびあらかじめ選び出した標的分子に結合させる新しいリガンド候補の確認を制限してきた原因であるという発見に基づいている。本発明によるコンピューターの使用は、溶媒との相互作用が、リガンドとその相補的標的分子との間の相互作用と交換されるという、リガンド／標的分子の結合の交換的な性格を考慮する方法を提供して上記の制限を解消する。ここに開示する方法は、溶媒中におけるリガンドとその標的分子との間の結合における溶媒効果、遠距離静電効果および誘電効果を考慮する点で従来技術の方法と異なる。

したがって、一つの実施形態では、標的分子の形を三次元表示して、溶媒中で標的分子（たとえば、レセプター、酵素）に結合するためのリガンドの性質を確認する方法が提供される。この方法には、どのような形が標的分子の選び出した形に（マッチする）ために相補的か、三次元で定義されるリガンドの形を選択することと、溶媒中でリガンドと標的分子の間の結合に対する静電的寄与を最小にする、リガンド上の電荷分布の表現を判定することとが含まれる。いくつかの実施形態では、電荷分布は、多極子の集合によって表される。別の実施形態では、本発明の方法には、さらに、電荷分布の表現と一致する点電荷を持つ分子を確認する工程が含まれる。

これらの方法は、既知リガンドを有する標的分子と結合させるために結合力を高めたリガンドの設計に特に有用である。本明細書で使用する「結合力を高めたリガンド」という用語は、標的分子に対する既知リガンドの構造を基礎にした構造を有するが、本明細書で開示する方法によって、溶媒中においてリガンドと標的分子との間の結合に対する静電的寄与を最小にする電荷分布を持つように修飾されたリガンドを指す。したがって、コンピューターを援用する本発明の方法は、既知または予測可能な三次元構造を有する標的分子に結合させるためのこのような修飾リガンドを確認する合理的なドラッグデザイン法を提供する。この方法は、標的分子の選び出された部分の形に合致する、三次元的に定義されたリガンドの形を選択することと、溶媒中においてリガンドと標的分子との間の結合に対する静電的寄与を最小にする電荷分布の表現を判定することとを含む。

特許請求範囲の方法によってリガンドが確認される標的分子は、三次元表示されるその分子の形が既知であるか予測が可能である。そのような標識分子には生体高分子と非生体高分子が含まれる。生体高分子の例としては、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、およびそれらの混合物（たとえば、糖タンパク質、脂質タンパク質など）を挙げることができる。非生体高分子の例としては、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンキシド、ポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコライド、ポリシロキサン、ポリウレタン、アルキルセルロース、アクリル酸およびメタクリル酸のポリナー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（ブチック酸）（ｐｏｌｙ（ｂｕｔｉｃ ａｃｉｄ））、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コカプロラクトン）およびこれらの共重合体を挙げることができる。

本明細書で使用される「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸で構成されるさまざまな生体高分子、たとえばレセプター、ホルモンおよび酵素を包含する語として使用され、相互に置き換えが可能である。本明細書において使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」または「レセプター」への参照は、広く類似構造、たとえば脂質タンパク質、糖タンパク質、他の有機基または無機基が結合したタンパク質、および複数鎖および複数ドメインポリペプチド構造、たとえば巨大酵素およびウイルスに適用可能であり、非生体高分子を含む。これらの実施例においては、リガンドとタンパク質分子の間の結合に対する静電的寄与に関する類似の問題が存在する。

いくつかの実施形態では、標的分子はタンパク質であり、溶媒中で既知三次元構造を有するタンパク質に結合させる新規および／または改善したリガンドを確認するために、コンピューターを援用する本発明の方法が使用される。リガンドおよびタンパク質の既知の結合パートナーとしては、ホルモン／レセプター、コファクターまたは阻害物質／酵素、抗原／抗体などを挙げることができる。リガンドが以前に確認されているタンパク質に対して、修飾されていない（天然）リガンドの電荷分布と比較して、改善されるリガンドとタンパク質との間の結合に対する静電的寄与を最小にする電荷分布を、「改善される」リガンド上に実現するために、既知のリガンド構造に加えるべき修飾を確認するために本発明の方法が使用される。本発明の方法によって「改善される」リガンドを確認するための出発点として使用されるリガンド／タンパク質結合パートナーの例を「実施例」の中であげる。

別の態様では、タンパク質である標的分子に結合する新規のおよび／または結合力を高めたリガンドを確認する方法が提供される。タンパク質は折り畳まれた三次元構造をとり、その構造はアミノ酸配列（）およびそのタンパク質に供される溶媒によって支配されることが知られている。タンパク質の生物活性および安定性は、そのタンパク質の三次元構造に依存する。タンパク質の三次元構造はいくつかの方法で決定または予測することができる。タンパク質の構造を決める最良の方法は、Ｘ線結晶構造解析法である。タンパク質の三次元構造を推定するには、円二色性、光散乱法、または放射エネルギーの吸収および放出の測定も使用可能である。タンパク質の構造は中性子回折や核磁気共鳴（ＮＭＲ）などの方法を使って決定することもできる。これらの方法はいずれも当業者によく知られた方法であり、標準的な教科書（たとえば、Ｐｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ Ｅｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｗ．Ｊ．，Ｐｒｅｎｔｉｓｓ−Ｈａｌｌ，Ｎ．Ｊ．（１９７２）およびＰｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖａｎ Ｈｏｌｄｅ，Ｋ．Ｅ．，Ｐｒｅｎｔｉｓｓ−Ｈａｌｌ，Ｎ．Ｊ．（１９７１））にも記載されている。上記の方法を使用して天然タンパク質によく現れるいくつかのパターンが確認されており、その中でも、最も多く見られる構造は、βシートに対して平行なαヘリックス構造およびとβシートに対して反平行なαヘリックス構造である。たとえば、Ｒ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎほか、Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９６９）を参照。タンパク質二次構造のヘリックス、シートおよび曲がり構造が活性な分子の三次構造を作り出している。タンパク質の三次元構造は、物理生化学的分析法を使って実験的に決定できるか、三次元構造がわかっている一つ以上の同族タンパク質の三次元構造のモデル構築を利用して推測することができる。

コンピューターを援用する本発明の方法は、標的分子に対する既知リガンドの構造に基づきながら、一方で、本発明によって構造を修飾し、溶媒中で改善されたリガンドと標的分子との間の結合に対する静電的寄与が最小の電荷分布を持つように改善されたリガンドの設計に特に有用である。本明細書では、このような改善されたリガンドを「結合力を高めたリガンド」と呼ぶ。したがって、本発明の方法は、分子および溶媒への結合に対する静電的寄与が少なくなるリガンド構造の最適化および選択の出発点として立体配座が既知のリガンドを使用する。たとえば、本発明の方法は、酵素（たとえば、ＨＩＶ−１プロテアーゼ）の改善された（結合力を高めた）コファクターまたは阻害物質を作るために使用される。

コンピューターを援用する本発明の方法は、最適な結合（結合に対する静電的寄与の最小化）によって既知のレセプターにぴったり適合する改善されたホルモンまたはその他のリガンドの設計も提供する。本発明の方法は、レセプター部位との結合の選択性と安定性を高めた薬物の設計および製造を可能にするため、特にドラッグデザインに有用である。レセプター部位との結合を高めたリガンドの設計が使用でき、それによって用量を多くしたときに付随して起きるおそれがある副作用および／または毒性を減らすことができる。レセプターに対して改善されたリガンドの設計は、結合の性質が改善されたリガンドを確認するための基準として使われる元のリガンドより有効性の高い薬物の確認を可能にする。したがって、タンパク質に対する既知リガンドは、改善されたリガンドを設計するための出発点として使用できる。その場合、改善の判定は、タンパク質に対するリガンドの結合性が改善されたか否かによって行われ、その結合性は、溶媒中でリガンドと標的分子との間の結合に対する静電的寄与が最小の電荷分布を持つリガンドの選択にかかっている。このように、本発明の方法は、抗体との結合の選択性および親和性を高めるために抗原およびエピトープのカスタマイズを可能にするとともに、その他のレセプターや標的分子に結合する新規および／または改善されたリガンドの設計および選択を提供もする。

ここに開示する方法によって確認されるリガンドは、免疫診断やの他の診断を行うために検出可能なラベル、たとえば放射性ラベル、酵素、発色団などでラベルすることができる。これらのラベル化剤はさまざまな診断用検体中標識分子の検出に使用できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われる画像法に対してここで確認されるリガンドはさらに別の物質、たとえばＮＭＲ造影剤またはＸ線造影剤で標識することができる。検出可能な物質をポリペプチドまたは反応性アミノ基を有する別の小分子に結合する方法は、当分野で知られている。診断アッセイを容易にするために、リガンドを不溶支持体に結合させることもできる。

コンピューターで支援される本発明の方法は、タンパク質の選択した部分の形にマッチする形および、溶媒中でリガンドとタンパク質との間の結合に対する静電的寄与が最小の電荷分布を持つ形を三次元データベースで探すにも有用である。別の方法として、三次元データベースは、溶媒中で修飾したリガンドとタンパク質との間の結合に対する静電的寄与が最小の電荷分布を持つためのこの基準を満たすデータベースの分子に修飾を加えたリガンドの形だけに基づいて選択することができる。三次元データベースを比較する検索アルゴリズムは文献から入手可能である。たとえば、たとえば、Ｖ．Ｂａｌａｊｉほかに付与された米国特許第５，６１２，８９５号、「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｉｍｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」およびその中に引用されている文献を参照、さらにＯｍｉｃｈｉｎｓｋｉほかに付与された米国特許第５，０８１，５８４号、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ」およびＨａｒｄｍａｎに付与された米国特許第４，９３９，６６６号、「Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」も参照。

本発明の方法で確認される新規および／または「改善された」リガンドは、それぞれ、標準的合成法または組み換え法を使って調製され、その生物活性が試験される。生物活性を示すこれらの化合物は、候補となるペプチド模倣物質である。生物活性を示さないこれらの物質は、標的分子にリガンドを結合させるために不可欠なリガンドの部分構造をさらに規定するための助けになる。本明細書で使用される「ペプチド模倣物質（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」とは、広く、ペプチド模倣化合物を指す。たとえばモルヒネはペプチドエンドルフィンのペプチド模倣物質である。

既知化合物のデータベース（たとえば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ，Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌｅｎｓｆｉｅｌｄ Ｒｏａｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ２ １ＥＷ，栄独；およびＡｌｌｅｎ，Ｆ．Ｈ．ほか、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｂ３５：２３３１（１９７９）））も標的分子の選択される部分構造の形を相補する（に合致させる）ために使用される立体（形状）パラメーターを含む構造を検索することができる。望む立体パラメーターを含むことが見いだされる化合物を検索して、検索されたその化合物の中でどの化合物が所望の電荷分布を有するか、あるいは溶媒中でリガンドと標的分子との間の結合に対する静電的寄与を最小にする所望の電荷分布を持つように修飾できるかを判定するために分析される。

コンピューターを援用する本発明の方法にしたがって確認されるリガンドの生物活性および／または標的分子に対する結合親和性が評価される。最も好ましい生物活性を有するリガンドの確認には反復法が使用される。たとえば、複雑な化学コンビナトリアル・ライブラリーにおいて、酵素阻害物質の生物活性な立体配座を確認する反復法について記述するＰＣＴ ＷＯ １９３５９，“Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｍａｋｉｎｇ Ｘａｎｔｈｅｎｅ ｏｒ Ｃｕｂａｎｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”を参照。次に、ペプチド模倣物質を設計するために、あるいは有機構造の三次元データベースを検索して、有望なペプチド模倣物質について示唆を得るために生物活性な立体配座が使用される。本発明の方法を使って確認された「改善された」リガンドまたは新規リガンドを試験するには、それぞれ標準的な生理学的、薬理学的および生化学的試験法が使用される。生物活性を評価するために使用する具体的プロトコルは、試験しようとする化合物によって変わる。この種の分析は、これらの標的分子（たとえばＨＩＶプロテアーゼ、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質）に結合する既知リガンドに適用して、生物学的に重要な標的分子に対して結合力を高めたリガンドを設計することができる。

図面の簡単な説明
図面において、
図１は、コンピューターを援用する本発明の方法の一つの実施形態を説明するブロックダイヤグラムである。
図２は、コンピューターを援用する本発明の方法を実行するために使用することができるコンピューターシステムのブロックダイヤグラムである。
図３は、コンピューターを援用する本発明の方法の基礎となっている化学的原理を説明する模式図である。
図４は、ＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害物質の構造式である。
図５は、問題の幾何的形状を説明する図である。

発明の詳細な説明
添付図面を参照しながら以下の詳細な説明を読めば、コンピューターを援用する本発明の方法をさらによく理解できよう。参照番号と構造とは対応させてあり、上で引用された参照文献および以下の説明で引用される参照文献は、この参照により組み込まれる。

コンピューターを援用する本発明の方法は、リガンドの性質を決定する方法を含み、その方法は、タンパク質またはその他の標的分子、たとえば標的ＨＩＶと結合するリガンドの設計に使用される。この方法は、ある一つの標識部位および幾何形状に対する静電的補完を定義する。静電的補完の定義は、明確な構造およびコンビナトリアル・ライブラリーの設計またはバイアスを通じてリガンドを見つけだすために、標的部位に対して立体的補完と一緒に使用される。

静電的補完を明確に定義すること、すなわち不利に働く脱溶媒和エネルギーと好ましい相互作用との間で最適な相殺が行われることが、リガンドの設計に有用であることが発見された。この方法は、物理的原理に基づく最適リガンドの性質を明確にすることで、設計の問題を根本からひっくり返すものである。これらの性質は、試行リガンドを比較することができる明確かつ正確な標準としての役立つのみならず、既存リガンドを修飾するときおよび新規リガンドを最初から構築するときにテンプレートとして使用可能な明確かつ正確な標準としても役立つ。

ある一つの目標部位に対する静電的補完は、ある一つの溶媒中で分子上結合部位での結合に対する静電的寄与が最小となる電荷分布によって定義される。コンピューターシステムにおける電荷分布を表現する一つの方法は、多極子の集合として表す方法である。この最適な電荷分布に一致する点電荷を持つ分子を確認することで、リガンドの確認、薬物の設計およびコンビナトリアル・ライブラリーの設計に使用できる可能性がある。

次に図を参照しながら説明する。図１はコンピューターを援用する本発明の方法の一つの実施形態を表す。この実施形態は一つ以上のコンピュータープログラムをコンピューターシステム上で実行することによって行うことができる。その一例を次に述べる。リガンドに対して設計すべき分子３０が定義されると、分子分析ツール３２が分子の可能な立体配座または形状３４を出力する。このような立体配座を出力するシステムとしては、Ｘ線結晶構造解析法、同族性のモデル化、核磁気共鳴画像法、ＫｕｎｔｚおよびＤｅｓＪａｒｌａｉｓが挙げているような解析法を含めていくつかの方法を使用できるが、もちろんこれらに限られるものではない。分子上の所望結合点または活性点３６および、指示された結合点で分子と結合するために望まれるリガンドの形３８もコンピューターシステムに入力される。

分子形状の三次元表示、三次元の位置で定義される分子上結合部位の表示、およびやはり三次元で定義される所望リガンド形状の表示が与えられると、ある一つの溶媒中で結合部位での結合に対する静電的寄与を最小にする電荷分布を決めるために、あとで詳しく説明する静電気連続体アナライザー４０が使用される。したがって、アナライザー４０は、出力として、結合に対する静電的寄与を最小にする電荷分布４２を表示する。

電荷分布４２は所望のリガンド形状をした候補リガンド４４と組み合わせて使用される。候補リガンドの形と点電荷を解析するアナライザー４６は、どの候補リガンドが最適電荷分布４２に最も近いかを判定する。アナライザー４６は、結合部位に対する候補リガンド４８を出力する。同様に、コンビナトリーライブラリー５２を作成するために最適電荷４２との近さで候補リガンド４４をふるいにかけるためにスクリーニングシステム５０を使用することもできる。この種のコンビナトリアル・ライブラリーは、所望の特性を持つもっと複雑な分子の創出にも使用可能である。

次に図２を参照しながら説明する。適切なコンピューターシステム６０であれば、典型的にはユーザーに情報を表示する出力装置６２が含まれる。そのコンピューターシステムは中央ユニット６１を含み、それには出力装置６２以外に入力装置６４、たとえばキーボードが接続される。中央ユニット６１は一般にプロセッサー６６を含み、接続機構７０を介して記憶装置６８に接続される。入力装置６４も出力装置６２と同様、接続機構７０を介してプロセッサー６６および記憶装置６８に接続される。

コンピューターシステムには一つ以上の出力装置が接続可能であることを認識する必要がある。出力装置の例を挙げれば、ブラウン管（ＣＲＴ）表示装置、液晶表示装置（ＬＣＤ）、プリンター、通信機器、たとえばモデム、そして音声出力装置などがある。コンピューターシステムには一つ以上の入力装置が接続可能であることを認識する必要がある。入力装置の例を挙げれば、キーボード、キーパッド、トラックボール、マウス、ペンとタブレット、通信機器、音声入力装置およびスキャナーなどがある。コンピューターを援用する本発明の方法は、コンピューターシステムと組み合わせて使用される特定の入力装置もしくは出力装置、または本明細書に記載する装置に限定されるものではないことを認識すべきである。

コンピューターシステム６０は、高水準コンピュータープログラム言語、たとえば「フォートラン」または「パスカル」を使用するプログラム可能な汎用コンピューターシステムであってもよい。コンピューターシステムは、特別にプログラムされてもよいし、特別な目的に使用されるハードウェアでもよい。汎用コンピューターシステムでは、プロセッサーは、典型的には市販のプロセッサーであり、たとえばインテル社のｘ８６シリーズおよびモトローラ社の６８０Ｘ０シリーズのマイクロプロセッサーである。このようなマイクロプロセッサーは、オペレーティングシステムとも呼ばれるプログラム、たとえばＵＮＩＸ（登録商標）、ＤＯＳおよびＶＭＳを実行し、他のコンピュータープログラムの実行を制御したり、スケジューリング、デバギング、入力／出力制御、アカウンティング、コンパイル、記憶域の割当て、データ管理およびメモリ管理、通信制御と関連する動作を行う。一つの実施形態は、ＰＡ−７２００チップ（９９ＭＨｚ）を搭載したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ９０００／７３５コンピューターを使って実行された。プロセッサーおよびオペレーティングシステムはコンピューター・プラットフォームを規定し、高水準プログラム言語によるアプリケーションプログラムは、このプラットフォームに合わせて書かれる。

記憶装置は、典型的には、コンピューターが読み書きできる非揮発性記憶媒体を含み、その例を挙げれば磁気ディスク、フラッシュメモリおよびテープなどである。ディスクには、着脱可能なフロッピー（登録商標）ディスクや固定されたハードディスクが可能である。ディスクは、典型的にはバイナリー形式、すなわち１と０の配列として解釈される形式でシグナルを保存するトラックを具備する。このようなシグナルは、マイクロプロセッサーによって実行されるアプリケーションプログラムや、ディスク上に保存され、アプリケーションプログラムによって処理すべき情報を定義する。典型的には、動作中、プロセッサーは、非揮発性記録媒体からデータを読み出して、典型的には揮発性ランダムアクセス、メモリ（ＤＲＡＭ）またはスタティックメモリ（ＳＲＡＭ）である集積回路記憶エ素子に移す。集積回路記憶素子は、プロセッサーによるアクセスがディスクより速い。一般にプロセッサーは、集積回路メモリの中でデータを扱い、処理が終了した時点でデータをディスクにコピーする。ディスクと集積回路記憶素子との間のデータの動きを管理する機構にはさまざまなタイプのものが知られているが、本発明の方法はそれらに限定されるものではない。さらに、本発明の方法が特定の記憶装置に限定されるものでないことは認識すべきである。

コンピューターを援用する本発明の方法が、特定のコンピューター・プラットフォーム、特定のプロセッサー、または特定の高水準プログラム言語に限定されるものでないことを認識すべきであり。加えて、コンピューターシステム６０はマルテプロセッサーコンピューターシステムであってもよく、あるいはコンピューターネットワークで接続された複数コンピューターを含んでもよい。
リガンドの性質の定義
連続体計算法を使って、静電相互作用の相補的なリガンドの性質を定義する方法の概略を図３に示す。静電相互作用が交換的性格を有するため、結合状態で見られる外見的に「強い」静電引力は結合平衡を不安定化するが、おそらく特異性に寄与するものと思われる。すなわち、極性基および電荷を持つ基を埋没するために引き起こされるかなり大きな脱溶媒和による不利により、高分子の会合に対する静電気の正味の寄与は全体として不利である。部位に極性基および電荷を有する基を持つ、ある一つの固定された標的に対してリガンドを設計する場合、結合に対する寄与が最も有利となり不安定化が極力小さくなるように、脱溶媒和と相互作用エネルギーのバランスを図ることが重要である。次に述べる方法は、理想化した幾何形状と連続体静電モデルを使ってこの問題を解決し、ただ一つの正確に解かれる最適解を与える。

球形リガンドを任意な形をしたレセプターに結合して球形複合体を形成する場合については、結合自由エネルギーはリガンドの電荷多極子の観点から表される。多極子に関して結合自由エネルギーを最小にすることにより、（ｉ）ある一つの幾何形状に対して最も緊密な結合リガンドを定義する最適な多極子分布がただ一つ存在する、（ｉｉ）この多極子分布は、ΔＧ_{ｂｉｎｄｉｎｇ}に相当する（ｉｉｉ）この最適状態で、リガンドの脱溶媒和によって不利になる大きさは、複合体の好ましい分子間静電相互作用のちょうど半分である、および（ｉｖ）最適状態に近い電荷分布に対する結合自由エネルギーの喪失は、最適と比較することで簡単に計算される。多極子に関する結合自由エネルギーを最小にすることは、高分子およびリガンドのエネルギーの記述として認められている連続体モデルから、最適リガンドに対する記述子の集合、すなわち多極子の集合に至る明確で曖昧さのない道である。この方法が広く適用できるためには、球幾何形状に対する必要条件が除外される。したがって、高分子およびリガンドの形状は任意の形であり、そのままの状態で取り扱われる。

球形の場合は、最適化に対する変動結合エネルギーは次のように定義される：

この式には３つの項が含まれているが、本明細書ではそれぞれ別々に論じる。一番目の項は、リガンド−レセプターの遮蔽された相互作用の項で、リガンドの電荷分布の各多極子とレセプターの点電荷との相互作用からの寄与を含む。これらの寄与は、係数、すなわち解析的に計算されるα_ｌ，ｍおよびリガンド多極子（Ｑ’_ｌ，ｍ）によって明らかにされる。

第二項は、リガンドの電荷分布による結合状態での反応場エネルギーＧ^{ｂｏｕｎｄ} _{ｈｙｄ，Ｌ}である。リガンドの多極子分布は、一般に、結合状態における球の範囲の中心ではない点について展開されるが、幾何形状は方位角対称でもって選択されるため、第二項は、ｍが同じ値の多極子成分のすべてのペアからの寄与を持つ。

第三項は、非結合状態の溶媒和エネルギーであり、各多極子成分からの寄与を含む。多極子の展開はリガンド球の中心について展開されるため、また球面調和関数の直交性のため、すべての交差項が消去されて（４）式が得られる。

上の３つの方程式を組み合わせ、

行列表記に変換すると、平方が完成し、Ｑ’^ｏｐｔ _ｌ，ｍに対して解くと、最適変動結合エネルギーが得られる。変動結合エネルギーからの項で、無視される項は、ある一つの幾何形状に対して一定であり、これらの項は最適結合リガンドの多極子を記述する。この過程のもっと詳細な記述はＬ．Ｐ．ＬｅｅおよびＢ．Ｔｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，１０６：８６８１〜８６９０（１９９７）に記載されており、参照によりここに組み込む。その一部は、「Ａｐｐｅｎｄｉｘ」（後記）に見ることができる。

上記および「Ａｐｐｅｎｄｉｘ」のＬｅｅおよびＴｉｄｏｒに概略が記載されている処理の種類を実行するためのコンピュータープログラムの処理系は、入力として式５９および６１の行列サイズを決める値ｌ_ｍａｘ（Ａｐｐｅｎｄｉｘを参照）、式２５および４６の最も内部の総和を途中で打ち切るｌ_ｃｕｔ（Ａｐｐｅｎｄｉｘを参照）、標的およびリガンドの形を示す問題の幾何形状、および最適の単極子を自由とするかある値に固定するかを入力として受け入れることができる。問題の幾何形状には、結合状態とリガンド球の両方の中心の半径およびＺ座標、および系における各部分原子電荷の大きさの座標が含まれる。誘電定数∈_１および∈_２は特定の問題によって決められる。α_ｉ、β_ｉｊおよびγ_ｉの値を評価したのち、たとえばＬＵの分解による式５９および６１の行列の解がつづく（Ａｐｐｅｎｄｉｘを参照）。定常点が最小であったことを確認するために、Ｂ行列の固有値を得ることができる。たとえば６４ビットまたは他の適当なフォーマットを使って、すべての実浮動小数点値を表わしてもよい。Ｐｒｅｓｓほか、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｉｐｅｓ ｉｎ Ｃ：Ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８８に記載の定義にしたがって、適切なサブルーチンの使用可能なバージョンか精度を高めたバージョンを使って、行列代数計算を行ってもよい。実行した場合、プログラムの出力は、（多極子を使った）最適電荷分布、定常点の性格およびα、β、γ値を記録したファイルを表示する。行列方程式を解くために直接法、すなわちＬＵの分解が使われたため、時間スケールには（ｌ_ｍａｘ）^６が使われ、メモリのスケールには（ｌ_ｍａｘ）^４が使われた。このプログラムの出力は、行列方程式の特にまばらな行列の原因を明らかにすることによって改善されるかもしれない。最適化は、反復法、たとえば共役グラジエント法または各種緩和法で行列方程式を解いて得られるかもしれない。この方法は、対称性の高い電荷分布を使用し、αヘリックスの末端をレセプターとして実行され検査されている。

この方法は、任意の形をした分子に拡張され、対応する行列の係数を計算するために反復数値計算法が使用され、能率を上げるために、リガンドの体積空間を貫通して分散したいくつかの中心が使われ、個々の多極子の展開がその中心に置かれる。

この方法を非球形の形状に拡張するときは次の形をとる。すなわち、α_ｌ，ｍは同じ特徴を維持するが、方位角における整列がもはや使えないため、_{βｌ，ｍ，ｌ’，ｍ}は、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}となり、非球形表面に対しては、球面調和関数の直交性が交差項を消去しないため、γ_ｌ，ｍは、γ_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}となる。そこで、非常によく似た行列方程式が見いだされる。

この式は球形の場合に使われるのと同じ行列法か、たとえば上記Ｐｒｅｓｓらによって記載の定義にしたがって、適切なサブルーチンの使用可能なバージョンか精度を高めたバージョンを使って、特異値分解によって解くことができる。しかし対応する行列係数を計算するには数値計算を使用してもよい。上の特殊な場合については、速く計算するために閉じた形の式を誘導してもよい。同じ行列係数（α_ｌ，ｍ、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}およびγ_ｌ，ｍ）を反復数値法を使って計算する場合は、計算要件が大幅に増える。

別の方法として、リガンドを、より多くの中心を使って記述し、各中心は少数の多極子で記述してもよい。極端な場合、各リガンドは点電荷の位置で構成することができ、現在５００個が可能で、各中心でｌ_ｍａｘ＝０として、３週間の計算時間で計算することができよう。最良の解は中間的で、各中心にｌ_ｍａｘ＝２（単極子、双極子および四極子の項）かその程度の位置がおよそ１０個所存在する可能性が高い。低次多極子が分布する中心は、任意のリガンド電荷分布を記述するための効率的かつ正確な方法かもしれない。この方法は分離した多極子中心間の相互作用を考慮に入れるように適切な工夫がされてきた。球形の形状を使った結果によれば、多極子を一つではなく二つ配することによって、多極成分の数を約１／４にしても、最適電荷分布を同等に記述することができ、その結果、時間を基本的に１／４にまで短縮することができる。

別の方法として、二つのスキームを行列係数の反復数値計算に使用することができる。第一のスキームは、差分ポアソン−ボルツマン（ＦＤＰＢ）ソルバー、たとえばＤＥＬＰＨＩ（Ｉ．Ｋｌａｐｐｅｒ，Ｒ．Ｈａｇｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｆｉｎｅ，Ｋ．ＳｈａｒｐおよびＢ．Ｈｏｎｉｇ）に変更を加えたものである。Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｏｆ Ｃｕ−Ｚｎ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ： Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｏｎｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ａｎｄ ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ ｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃ．，Ｇｅｎｅｔ．１：４７〜５９（１９８６）、Ｍ．Ｋ．Ｇｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ａ．ＳｈａｒｐおよびＢ．Ｈ．Ｈｏｎｉｇ．Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｅｒｒｏｒ ａｓｓｅｓｍｅｎｔ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．９：３２７３３５（１９８８）およびＵＨＢＤ（Ｂ．Ａ．Ｌｕｔｙ，Ｍ．Ｅ．およびＪ．Ａ．ＭｃＣａｍｍｏｎ．Ｓｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｎｉｔｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ Ｐｏｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｚｍａｎｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１３：１１１４〜１１１８（１９９２），Ｍ．Ｚａｃｈａｒｉａｓ，Ｂ．Ａ．Ｌｕｔｙ，Ｍ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｍｃａｍｍｏｎ．Ｐｏｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｚｍａｎｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ λ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６３：１２８０〜１２８５（１９９２）），そして第二のスキームは、境界要素法（ＢＥＭ）に部分的な変更を加えた方法である（Ｒ．Ｊ．Ｚａｕｈａｒ ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｔｈｅ ｒｉｇｏｒｏｕｓ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｔｅｎｔａｌ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．９：１７１〜１８７（１９８８），Ｒ．Ｂｈａｒａｄｗａｊ，Ａ．Ｗｉｎｄｅｍｕｔｈ，Ｓ．Ｓｒｉｄｈａｒａｎ，Ｂ．Ｈｏｎｉｇ，ａｎｄ Ａ．Ｎｉｃｏｌｌｓ．Ｔｈｅ ｆａｓｔ ｍｕｌｔｉｐｏｌｅ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ：Ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１６：８９８〜９１３（１９９５））。これらの変更法は、点電荷ではなく多極子で表現することができる。

たとえば、さらに複雑な方法には次の点が含まれる。各中心の各極成分に対して、反復連続体計算を実行して、各極成分とレセプター点電荷との遮蔽クーロン力相互作用（基本的にはα_ｌ，ｍ）、各極成分と自身の反応場、および結合状態（基本的にはβ_{ｌ，ｍｌ’，ｍ’}）および非結合状態（基本的にはγ_{ｌ，ｍ，ｌ’ｍ’}）における、系内の他の各極成分の反応場との相互作用が決定される。３週間のＣＰＵ時間の下では９９個の極成分で表されるリガンド（たとえば、それぞれにｌ_ｍａｘ＝２の中心が１１）が必要であろうと見込まれる。多くの適用例に対してはこの半分の中心と半分の時間で十分かもしれない。中心からかなり離れた位置の複雑な電荷分布を正確に記述するためには、一つの中心の周りの多極子の分布は、多くの包括的な項を使用する。展開のためにいくつかの中心を空間に配分することで、多くの、しかしより少ない、やや局限化した項で同じく正確に記述することができる。

リガンドを見つけだすために分子記述子を使用する
再び図１を参照しながら説明する。どの候補リガンドが最適に最も近い電荷分布を持つかを判定するためには、上記手順で定義される電荷分布４２が使用できるかもしれない。リガンドの構造を新たに構築するため、あるいは化合物データベースをふるいにかけるため、あるいはコンビナトリアル・ライブラリーの設計またはバイアスに、電荷分布および分子の形の記述を使用することができる。

リガンドを見つけだす過程の中で、細部にわたる点電荷分布を、上記の方法を使って決定された多極子の分布にフィットさせる。次に、分子フラグメントおよび／または分子を点電荷分布にフィットさせる。最後に、点電荷およびフラグメントの両者を、以下に記述するコンビナトリアル・ライブラリーの設計に使用することができる。

最適を記述する多極子の分布とよくフィットする点電荷を定義するためには、少なくとも二乗フィッティング法を使用することができる。たとえば、ＦＤＰＢ計算で使用される間隔に近い間隔を持つ格子点の正則立方格子を使用できよう。これは、電荷を持つ格子点に対してマッピングされた任意の点電荷を反対方向にマッピングするためにＰＤＰＢコードに使われる同じ三線関数を使って達成できる。（Ｋｌａｐｐｅｒを参照）。点電荷の集合が、多極子で表現される静電荷分布と十分なフィットを与えることができるか否かは、多極子それ自体に代わってぴったり適合した点電荷分布を使ったときの結合自由エネルギーの低下を比較することによって判定できる。間隔が０．５Åの格子点立体格子を使った試行によって、点電荷のフィットによる結合エネルギー損失の計算値は、０．００１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ未満であることが示される。さらに、得られた割付け点電荷は妥当な大きさ（ほぼすべての点電荷で０．１０ｅ未満）であり、分子フラグメントへのフィットが可能と考えられる。この実施形態では、電荷分布の記述がやや非局在的である多極子が、局所格子による点電荷の記述に変換される結果、分子はフィット可能である。

電荷をフィットさせるとき、設定点が有効であるか否かは、結合エネルギーの損失をどれだけ少なくできるかによって測れようし、分子または分子のフラグメントを点電荷からいかに単純に構築できるかによって測ることもできよう。官能基および分子のフィットには上で述べたように立方格子が使用される。もっと分子を基礎にした格子が使用できるかもしれないし、一緒に組み込まれる普通の結合価（ｓｐ、ｓｐ^２およびｓｐ^３）に対する結合性を格子の中に含めることができるかもしれない。加えて、点電荷の密度が一様であることは不利かもしれない。むしろリガンド表面近くの点電荷密度が高いほど有効なフィットが得られる可能性がある。

点電荷の分布が与えられると、分子または分子フラグメントへのフィットには数通りのやり方が考えられる。たとえば、点電荷分布に基づいて個々の関数群を好ましい位置に適合させるために、分子フラグメントおよび点電荷のデータベース（たとえば、フラグメントのＰＡＲＳＥパラメータセットから作成されたライブラリー（Ｄ．Ｓｉｔｋｏｆｆ，Ｋ．ＳｈａｒｐおよびＢ．Ｈｏｎｉｇ，Ａｃｃｕｒａｔｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍｏｄｅｌｓ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９８：１９７８〜１９８８（１９９４））が使用されるかもしれない。もしリガンド体積の中で各フラグメントをすべての位置とすべての方向に対して試行する必要があるとするとなると、この合致作業過程は非常に大きなスキャニングサーチになる可能性がある。しかし、点電荷分布に対して正則立体格子を使えば時間の取り方をかなり改善することができる可能性がある。その「診断に関わる」格子点電荷の集合を決めるためには、比較的小さい格子区間に限って、各フラグメントをスキャンすればよいだろう。これらの診断は、すべてのライブラリーフラグメントに対して、たとえばハッシュテーブルの形に編集することができよう。点電荷値のクラスターは、ハッシュテーブルに照会したりフラグメントをフィットさせるために使用することができよう。ハッシュテーブルは、同じ格子間隔が維持される限り、多くの異なる標的および最適化に対してくり返し使用できる。

この方法とコンピューターを援用する本発明の方法とでは、選択するための理論的基礎が大きく違っているが、フラグメントが置かれたあとは、それらをフィットさせて分子に組み立てる問題は、上記ＭＣＳＳアルゴリズムで取り扱われる問題と同様である。開発された二つの解は、ここでの使用に合うように変更しようと思えば変更することができる。上に記述したＨＯＯＫ法では、小分子データベースが、フラグメントを一つにフィットさせるためのリンカーとして使用されるが、一般的には、剛性を導入しようとする試みも同時に行われる。上記動的リガンド法（ＤＬＤ）では、炭素原子の海とフラグメントとが重ね合わせられ、各炭素の占有が拡大収縮でき、新しい炭素リンカーの合体に結合の生成および切断を使用するシミュレーション・アニーリング法が使われる。いずれの方法でも、比較的歪みの少ないリガンドを創出するため、一般に、各フラグメントを多少動かすことは容認している。運動が、計算結合エネルギーに対して、どのように影響を及ぼすかに基づく正確な運動ペナルティ関数が使用されるかもしれない。ＤＬＤを基礎にした手法の方が、融通性に富むため、他の手法より良いかもしれない。

別の方法では、分子を順次成長させながらリガンドの体積を埋め、点電荷をフィットさせることも可能である。直截的なスキームでは、点電荷にフィットする場所に一つのフラグメントを置くことと、第一のフラグメントと結合させることができる他のフラグメントを探し、結合によるねじれを通じてそれらの相対的な向きを調整することとが含まれる。この手順は樹木のように実行して大量のリガンドを作り出すことができる。各新しいフラグメントを採用するか採用しないかを決めるには、利点かまたは距離の適切な数字が適用される。この方法では、ファンデルワールス力の項とねじれによる項以外に、定義された最適の体積および電荷分布に対するフィットも含む、ポテンシャルを使うことができよう。

さらに別の方法は、「ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔ」リガンドの設計である。最適の多極子分布は、可能な限り最も少ない点電荷にフィットする。この最適化の方法は、計算結合エネルギーが、ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ単位で最適値の十分のいくつか以内の、比較的少数の点電荷を見つけだすことを含む。相補的ヌクレオチド塩基での研究から、天然の場合より良い相補的「塩基」が、わずか１／３の点電荷を使って再構築できること、すなわち、わずか４個の点電荷でアデニンに対する補体を構築することが可能であり、かつこの補体はアデニンよりも強く結合することを示唆している。点電荷数を少なくしたこれらのリガンドは、多少様式は違っているが、パートナーとワトソン・クリックの水素結合を維持する。非常に少ない必要点電荷数を含むリガンドのモデルは、さらに手の加わったリガンドであれば含むべき重要な補償相互作用を表すことができる。これらのリガンドは、それを基にしてコンピューターによる分子デザインをさらに進めるべき有用な足場またはシーズとして、あるいはそれに関してコンビナトリアル合成戦略が有用に構築されうるであろう有用な足場またはシーズとして役立つかもしれない。ウイルスは、触媒部位を標的にする小さいリガンドに対して抵抗性を獲得することが極めてむずかしいため、もしこれらのリガンドが十分な強さで結合すれば、特に有用な治療薬となりうる可能性がある。

コンビナトリアル・ライブラリーの設計
図１の５０に示すコンビナトリアル・ライブラリーの設計についてさらに詳しく説明する。新たに合理的なドラッグデザインにコンピューターを援用して分子のモデル化を行うことは古くから興味を持たれたテーマであるが、この方法をリガンドの発見に使用できる方法は他にない。特に、この方法は化学的空間の比較的狭い領域を定義するために使用でき、この限定された空間を徹底的に探索するコンビナトリアル・ライブラリーを設計することが可能である。最も野心的なコンビナトリアル化学の合成容量の有限性を考えると、このメカニズムは合成の多様性をできるだけ可能性の高い方向に向けることができる。

やはりここでも、コンピューターによるこの方法にはいくつかの代替実施法がある。一つの実施法は、最適多極子にフィットする点電荷の詳細な格子で始まり、一つ以上の官能基を受け入れるにふさわしいポケットに相当する空間領域にグリッドを隔離する。次に、全体的な大きさと特徴、たとえば、正に帯電した、負に帯電した、極性が大きい、極性が中程度の、極性が小さい、または疎水性といった特性を付与するために形状および点電荷が使用される。コンビナトリアル合成を好適なリガンドの発生に向けるために、これらの性質の定義を使用することができる。

コンピューターを援用する本発明の方法のコンピューター計算の面を説明してきたが、ここで生物学的モデル系について若干述べることにする。

生物学的モデル系
（実施例１） クラスＩＩ 主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質
はじめに
主要組織適合複合体タンパク質（ＭＨＣ）は、タンパク質分解された細胞内ペプチドのサンプルをＴ細胞に示すことがその役割である構造を提示する細胞表面の抗原である。Ｔ細胞によってペプチドを「異物」と認識することが、免疫応答を誘導する。この応答には、抗原を提示する細胞（通常、クラスＭＨＣ）を殺すか、Ｂ細胞の活性化（通常、クラスＩＩ ＭＨＣ）を含め、免疫系のさまざまな要素によって攻撃を制御するリンホカインを分泌することを含む。各個体が持つ組織適合タンパク質の数は限られているが、提示するペプチドの数は実質的に無限であるため、各ＭＨＣ分子は多様なペプチドを呈示する能力を持つ。構造研究から高い親和性とやや低い特異性を発現する機構に関しては、クラスＩＭＨＣ分子とクラスＩＩＭＨＣ分子とで使用する機構が別であることが明らかにされている（Ｉ．Ｊ．ＳｔｅｍおよびＤ．Ｃ．Ｗｉｌｅｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：２４５（１９９４））。

インフルエンザウイルス由来ペプチドと複合体を形成したＨＬＡ−ＤＲ１クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質の構造は明らかにされている（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６８：２１５（１９９４））。インフルエンザ・ヘマグルチニン残基３０６〜３１８（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）と複合したＨＬＡ−ＤＲ１の本来の構造は、別のクラスＩＩ ＭＨＣ複合体で確認されている結合および認識のいくつかの重要な特徴を明らかにした。このタンパク質は、細胞表面側に２つの免疫グロブリン類似ドメインと細胞外側に一対のαヘリックスとを含む８本のストランドからなるβシートからなる。ペプチド結合部位は、２本のヘリックスの間の裂け目で、βシートで支持されている。ペプチドは、伸張したいちじるしくねじれた立体配座で結合し、タイプＩＩポリプロリンのらせん状立体配座と類似している。Ｎ末端とＣ末端は部位の外側に延びている。ペプチドとタンパク質との間の水素結合の大部分（１５のうち１２）はペプチド主鎖基に見られ、いかにしてタンパク質が多くの異なるペプチドを認識するかを説明するのに役立つ。観察されるペプチドの立体配座は、各ペプチド側鎖を３方向のうちの１つの方向に強制的に向かせている：側鎖の５つ（Ｙ３０８、Ｑ３１１、Ｔ３１３、Ｌ３１４、およびＬ３１６）は、ＭＨＣ分子表面のポケットの中に向けられており、基本的には埋没している。側鎖のうちの６つ（Ｋ３０７、Ｖ３０９、Ｋ３１０、Ｎ３１２、Ｋ３１５、およびＴ３１８）は、結合部位から外に向かって遠ざかるようにＴ細胞の方に向いている。残る２つの側鎖（Ｐ３０６およびＡ３１７）は、部位を横切るように向いている。ＭＨＣと広範囲に接触させる残基は、接近するＴ細胞レセプターと相互作用する位置をとっている残基と、大部分が異なっている。５つのポケットのうちの最も深いポケットは、Ｔｙｒ３０８を収容するが、結合に関する研究からはチロシン、フェニルアラニンまたはトリプトファンのいずれもが可能であることが明らかにされている。異なるクラスＩＩ ＭＨＣ対立遺伝子は、５つの埋没側鎖を収容する５つのポケットでの置換を含む。これらの相互作用における変化は、ペプチドの特異性のアロタイプの違いによるものと考えられる。個体は、それぞれＭＨＣ分子のアロタイプの補体が違うため、各個体の免疫応答のプロフィールが違っている。

個々のクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合するペプチドの相対的親和性は、ペプチドの相対的抗原性に原因があると考えられる。ファージディスプレイによる選択性および増幅の研究から、各アミノ酸が高親和性ペプチドの個々の位置に現れる頻度が決定されている（Ｊ．Ｈａｍｍｅｒほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１００７（１９９２）およびＪ．Ｈａｍｍｅｒほか、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４４５６（１９９４））。最も強いアンカー位置は、主としてＴｙｒ（４８％）、Ｐｈｅ（２５％）、またはＴｒｐ（１３％）に見られるように、１位の大きな芳香環であると判定された。Ｍｅｔ（５０％）およびＬｅｕ（２８％）に見られる４位は、長い疎水構造であった。Ａｌａ（３２％）およびＧｌｙ（２２％）に見られる６位は小さい残基であった。９位は一般にＬｅｕ（４５％）で見られた（Ｊ．Ｈａｍｍｅｒほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１００７（１９９２））。数は非常に少なかったが、位置のいかんを問わず負に帯電した側鎖が回収された。このデータは、本発明の方法のコンピューターによる方法論の有効性を確認するために有用な相対的親和性の有用な半定量的な組みを提供する。

試験法および有効性の確認
本明細書に開示する、コンピューターを援用してペプチド結合部位を分析し結合力を高めたリガンドを設計する方法論を試験するため、クラスＩＩ ＭＨＣ ＨＬＡ−ＤＲ１系を使用する。試験法と有効性の確認は、結合したウイルスペプチドを含む結晶構造を最初に使用するいくつかの作業からなる（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６８：２１５（１９９４））。これらの試験方法は、（ｉ）観察される結合ペプチドが良い結合体であることを認識すること、（ｉｉ）既知の有害なペプチドの変異は好ましくないことを認識すること、（ｉｉｉ）既知の結合力を高めたペプチドの変異は好ましいことを認識すること、（ｉｖ）個々の表面ポケットの中の結合性疎水性残基、極性残基、および電荷を有する残基の既知のパターンを再現すること、および（ｖ）既知のペプチド主鎖の立体配座および接触を再生することが、できることを確認するように計画されている。

結合ペプチド複合体の分析
本明細書に開示する方法を使って、ＨＬＡ−ＤＲ１へのウイルスペプチドの結合を分析する。その概要を簡単に述べる。結合ペプチドの電荷分布を再現するために本明細書に開示する戦略を使用する。ペプチドの各原子上に可変点電荷を置き、結合自由エネルギーを最適にする電荷の値をコンピューターで計算する。これらの点電荷を実際の点電荷と比較して、計算最適値と比較した、ペプチドの親和性の低下を計算することができる。ウイルスペプチドの計算と実際の点電荷との間の点電荷からのずれは、結合力を高めたペプチドの設計が可能であることを示唆する。このようにして、既知リガンドとその結合の相手の構造に基づいて結合力を高めたリガンドの設計に関する、特許請求の方法の有用性の主張を確認するため、一連の試験結果を使用する。

結合力を高める変異と弱める変異
相対的親和性試験は、最初、同形または近似的同形置換を使って行う。ファージディスプレイの研究によるＨａｍｍｅｒらのデータから、１位はＰｈｅよりＴｙｒが好ましく、４位はＧｉｎよりＭｅｔまたはＬｅｕが好ましく、下線を付けた残基は、結合ペプチド構造中の残基である（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６８：２１５（１９９４），Ｊ．Ｈａｍｍｅｒほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１００７（１９９２）およびＪ．Ｈａｍｍｅｒほか、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４４５６（１９９４））。本明細書に開示する方法は、これらの変異による親和性の計算に使用される。

本明細書に開示するリガンドの設計に対する新しい戦略は、レセプター（または他の標的分子、たとえば抗体または酵素）のある立体配座で開始し、この立体配座を最適に相補するリガンドの性質を見つけだすことである。試験では、リガンドの最適電荷分布を明確にするために不可欠な前提条件であるリガンドの電荷分布の違いによる親和性の違いを検出できるか、本明細書に記載のアッセイを行った。前の段落で述べたように点電荷の大きさを最適化した場合、Ｔｙｒ１ヒドロキシル基による極性は変化せず、Ｖａｌ１のそれは増大し、Ｇｌｎ４およびＴｈｒ６のそれは減少することが予想され、Ｈａｍｍｅｒほかの静電的傾向を反映している（Ｊ．Ｈａｍｍｅｒほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１００７（１９９２）およびＪ．Ｈａｍｍｅｒほか、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４４５６（１９９４））。

極性側鎖および非極性側鎖のパターン
ペプチド原子の既知の位置への参照なしにペプチド結合部位を調べるために、コンピューターを援用する本発明の方法が使用される。この検査は二通りのやり方で行われる。一つのやり方では、５つの主要ポケットのそれぞれが、その部位の電荷分布の個々の最適化を通して検査される。もう一つのやり方では、５つの主要ポケットが、一括して、一つの計算で最適化された部位全体に対する電荷分布でもって検査される。結果を比較して部位同志の結合の度合いを明らかにする。実験研究によれば部位同志の結合はできるだけ小さくすべきであることが示唆されている（Ｊ．Ｈａｍｍｅｒほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３（１９９４））。球を充填して、相補的な形をした領域を構築し、部位への結合を最適にする多極子電荷分布を計算する。多極子を直接調べることと、部位と相補的な格子化点電荷分布を構築することとを併用し、各部位が、疎水性基、極性基、正の電荷を持つ基および負の電荷を持つ基をよく受け入れるか否かによって、これらの部位を分類する。試験では混合した特性を示し、部位は疎水性が強いが、いくつかの局在化した極性基を受け入れるといったことがあるかもしれない（おそらくＴｙｒ１がこのタイプでろう）。結果を評価するため、既知部位の特性が比較される。もし計算に使用するペプチドの脱溶媒和による不利（結合状態の立体配座で剛直なペプチドの場合に生じるのではないかと思われる）が、実際のリガンドのファージディスプレイ研究によるペナルティと大きく違えばくい違いが生じる可能性がある。しかし、脱溶媒和は、極性基および電荷を有する基によって支配され、これらの基は、非結合状態では溶媒に曝され、観察されたところによれば、伸張したねじれ立体配座をとるはずなので、当発明者はこのくい違いは問題になるほどではないと予想する。

主鎖のトレースおよび接触
主鎖のトレースは、実質的にすべての結合するペプチドに対して不変であると考えられるため、部位は主鎖の接触を強力に支配するものと予想される。したがって、本明細書に開示する方法の有効性をさらに確認するために、コンピューターを援用する本発明の方法を、結晶構造解析法で観察される主鎖の位置を再発生させるために使用する。上記の方法を使って、ペプチド主鎖結合領域における最適リガンドの分布多極子の記述を確認し、それから記述を格子状点電荷の場に変換し、それから、部位の壁との立体的な重ならないようにしながら、ペプチドアミド基（Ｎ−メチルアセトアミド）を、最小二乗法によって電荷場にフィットさせる。

結合力を高めるための設計
一般に、リガンドの結合力を高める設計を行う場合、既知リガンドが部位を十分活用していないときは、その機会の場所を明らかにする戦略がとられる。そのためには、個々の基が、好ましい相互作用で取り戻すよりも、脱溶媒和で多くのエネルギーを費やす基および、リガンドにしようとしている基との結合が計算による最適からかけ離れている結合部位の確認が行われる。上で行った計算（「試験法および有効性の確認」の項）を再分析して該当する機会を探し出す。

結合したペプチド複合体の分析
結合に対するその全静電的寄与が不利な官能基（ペプチド鎖と結合部位の両方に含まれる側鎖または主鎖の極性基）を検出するためには、上で述べた静電項の完全な解剖を行うことである（すなわち、疎水性基への変異をコンピューターで計算して結合を強化する）。この静電項の解剖で示唆されることは、より安定した複合体を作るために、ペプチドの標的領域（たとえそれが主鎖であっても）を疎水基に修飾することである。当発明者は、この戦略を使ってＡｒｃリプレッサーのバリアントに安定化のための３つの変換を確認することができた（Ｚ．Ｓ．Ｈｅｎｄｓｃｈほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：７６２１（１９９６））。結合に対して不利に働くＭＨＣタンパク質基は、ペプチドを修飾してそのペプチドとの相互作用を改善することで良くすることが可能である。これらの機会は、ウイルスペプチド原子の点電荷を再最適化するコンピューターによる計算も含め、平行して行ういくつかの研究で確認できる（上記を参照）。このような平行して行われる確認は、提示された部位を修飾して結合を強化できるというさらなる証拠を得るために使用される。

極性側鎖および非極性側鎖
個々のポケットの最適化だけでなく部位全体の最適化も、標的分子への結合を高めたリガンドを確認するための示唆された詳細な変化源として使用できることが予想される。このような最適化を行う場所の選択に当たっては、実際の電荷分布と最適化された電荷分布および対応する結合エネルギーの間のくい違いとして求められる自由エネルギーゲインの取り戻し量が最大となる領域が最初に選択される。このような領域として挙げられる領域は次の３つである：１位の結合ポケット、ペプチド主鎖の結合領域（下記を参照）、およびウイルスペプチドの研究で溶媒クラスターが占有するポケット（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６８：２１５（１９９４））。位置１にはウイルスペプチド複合体のＴｙｒが収容される（Ｌ．Ｊ．Ｓｔｅｒｎ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６８：２１５（１９９４））が、ＰｈｅまたはＴｒｐもしばしば見いだされる（Ｊ．Ｈａｍｍｅｒほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１００７（１９９２）およびＪ．Ｈａｍｍｅｒほか、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４４５６（１９９４））。最近決定された、別のペプチドが結合したＨＬＡ−ＤＲ１の結晶構造ではＴｒｐが部位を占有している。Ｔｒｐ側鎖の方位はＴｙｒに対して約９０゜回転していて、その周辺を囲むタンパク質のポケットは、本質的に変化を受けない。大きな疎水性側鎖をこのポケット内に置くことは、結合するための必要条件であるように見える（Ｊ．Ｈａｍｍｅｒほか、ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：４４５６（１９９４））。このポケットに結合する基に対して発生させた最適化電荷分布は、結合力を高めたリガンドを合成するためのコンビナトリアル合成スキームを考案するガイドとして使用可能である。

主鎖のトレースおよび接触
コンピューターを援用する本発明の方法は、非ペプチド主鎖を有し、結合を改善するリガンドの設計に使用することができる。ペプチドの電荷分布と比較することにより、主鎖の結合領域の最適化した電荷分布とペプチドの電荷分布とを比較することにより、改善された主鎖構造を合理的に設計することができる。たとえば、本発明の方法は、α炭素（または少なくともβ炭素）の等価体を具備するリガンドの確認に使用することができ、提示された側鎖を新しいプラットフォームのＴ細胞側に結合させる設計を可能にする。

（実施例２）
ＨＩＶプロテアーゼ
はじめに
ＨＩＶ由来プロテアーゼは、ウイルスの正しい構成に必要である。変異によってプロテアーゼが不活性化されると、非感染性粒子が産生される。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の設計には、多くの製薬会社が長年にわたって多大な努力を傾けてきた。本研究は、発現、精製、結晶化の適切な条件を見いだしたあと、研究設備のおかげで高分解能Ｘ線結晶データを得ることができた。タンパク質データバンクには、単独の形か、あるいはリガンドとの複合体の形で、ＨＩＶ−１プロテアーゼの４５を超える構造が登録されている。これらの構造は、異なるリガンドと一つの共通タンパク質との相互作用を調べるうえで豊富なデータを提供する。すでに多くの非常に有望な阻害物質が開発されており、そのうちのいくつかは臨床試験の段階にあり、少数はＦＤＡの承認を得ている。しかしそれにもかかわらず、これらの阻害物質のいくつかについては、プロテアーゼの「すり抜け」変異体が分離されている。

プロテアーゼの構造は、９９個の残基からなるポリペプチド鎖の基本的に対称なホモ二量体であることがわかっている。活性部位は２回軸に形成されていて、対称性に関係する一組のループで囲まれ、それらのループは、非結合状態ではきわめて柔軟性に富むが、リガンドが結合すると活性部の上方を封鎖し、最大７残基まで基質と結合可能な裂け目が隣接するように見える活性部位は、各サブユニットに由来する３個のアミノ酸の配列、Ａｓｐ２５，Ｔｈｒ２６，およびＧｌｙ２７を含み、一対のＡｓｐ２５カルボキシレートは、互いに近接しほぼ同一平面をなしている。リガンドが不在のときの酵素の見かけの厳密な２回対称は、（非対称な）ペプチドリガンドが結合するといくらかこわれる。設計上の特に重要な一つの問題は、非対称なリガンド（たとえば、ペプチド基質に対してモデル化されたリガンド）と（酵素の２回軸と一致するリガンド２回軸と結合する機会を持つ）対称なリガンドのどっちが強く結合するかということであった。ある種の対称リガンドが、活性部位に非対称的に結合することが見いだされたことは驚くべき結果であった。この違いに対するエネルギーの寄与を調べるには、本明細書に開示するコンピューターによる計算方法を使うことができる。

ペプチドに対する結合優先性を決めるには基質特異性の研究が使用されてきた。その研究結果によれば、Ｐ２’位におけるＧｌｎまたはＧｌｕに対する親和性およびＰ１における疎水性の強い側鎖（Ｐｈｅ，Ｌｅｕ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，またはＴｙｒ）の親和性が明らかにされている。これより小さいが、Ｐ３におけるＧｌｕおよびＰ２における疎水性基の優先性が知られている（ＷｌｏｄａｗｅｒおよびＪ．Ｗ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：５４３（１９９３））。

ＨＩＶの感染にとってその関与が不可欠な分子の結合様式を解析するために、本明細書に開示する方法を適用することは、診断薬および治療薬として使用するための強く結合する分子の設計を促進するために使用できる。一般に、コンピューターを援用する本発明の方法は、主として連続体の静電学が対象であり、二次的には自由エネルギーのシミュレーションである。本発明の方法は、標的分子の静電的補体を見つけだすための新しい方法を提供する。予備的な結果によれば、分子を静電的、エネルギー的に解剖して連続体を分析するために本明細書で使用されるコンピューターモデリングは、４３４リプレッサーによるタンパク質−ＤＮＡの認識に関する一対の研究のために、さらに詳細な（それに伴って時間のかかる）自由エネルギーのシミュレーションを使って見いだされたのと一致する結論を与えることが明らかになる（実施例３を参照）。

試験法
本発明の基本部分の試験を、クラスＩＩ ＭＨＣ分子の研究の中で最初に行い、次にＨＩＶ−１プロテアーゼを使って行う。それゆえ、上記の方法は、ＨＩＶ−１プロテアーゼに結合する結合力を高めたリガンドを設計するために使用される。多くのリガンド設計プロトコルで遭遇する一つの難問は、結合した複合体の立体配座を予測する必要があることである。コンピューターを援用する本発明の方法は、タンパク質の立体配置を選択して、最適に相補的なリガンドに対する一組の分子記述子に対して解くことによって、この難問を克服する。さらに、本発明の方法は、利用できるＨＩＶ−１プロテアーゼの構造のサブセットを、プロテアーゼ単独およびさまざまなリガンドとの複合体の形で、研究するためのツールを提供する。

ループの立体配座
対象が関係する二つのループは、酵素が結合していない形では開いた立体配座をとり、結合した形では活性部位に対して閉じている。一組の阻害物質は、ＤｕＰｏｎｔ Ｍｅｒｃｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発された環状尿素化合物で、その特性はよくわかっており比較的剛直であるために魅力に富む物質である（Ｐ．Ｙ．Ｓ．Ｌａｍほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：３８０（１９９４）およびＣ．Ｎ．Ｈｏｄｇｅほか、Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．３：３０１（１９９６））。この化合物群のメンバーは、結合状態の構造の分析に使用できる。たとえば、ＸＫ ２６３との複合体（ナフチル置換基を２個、フェニル置換基を２個、ヒロロキシル置換基を２個有する対象環状尿素）はタンパク質データバンクに登録されており、ＤＭＰ ３２３およびＤＭＰ ４５０は図４に挙げてある（「ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害物質」）。この立体配座の変化が、最適リガンドのコンピューター計算した性質に対して及ぼす影響を上記の方法で調べる。レセプターの立体配座の変化が、相補的リガンドの性質に対して及ぼす影響を、活性部位の個々のサブサイトポケットを占有する部分構造の形と相対的極性で最適値を特徴づけることによって調べる。基質は、まず開いた立体配座をとるループと結合し、ループが閉じると結合を終了しなければならないため、計算の違いはむしろ小さいものと予想される。基質は、開いた形と相補的であることと閉じた形と相補的であることの間で、ある妥協をなすか、両者の間に実質的な違いがないかのいずれかである。

プロトン化の状態
プロテアーゼ阻害物質の設計にとって現在未解決で重要な一つの問題は、触媒アスパルチル残基（Ａｓｐ２５および２５’）のプロトン化状態である。この側鎖対のプロトン状態はコンピューター計算された静電的補体の性質を大きく変えることが予想される。リガンドにとって、無電荷のアスパラギン酸よりもむしろ電荷を有するアスパラギン酸と相互作用するために、脱溶媒和によって受ける不利がより大きいことは、潜在的に価値のあることである。リガンドのコンピューター計算した最適静電的性質と実際の結合リガンドとを比較すれば、プロトン化状態をこれらの複合体のいくつかにあてることが可能になると予想される。ＮＭＲの証拠が、いずれもプロトン化されたアスパルチル基と合致するため、ＤｕＰｏｎｔ Ｍｅｒｃｋグループの環状尿素の事例は、この研究において有用である（Ｄ．Ａ．Ｔｏｒｃｈｉａほか、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１１４９（１９８９））。複数個、１個および非−プロトン化触媒対を使った計算から得られる最適補体の比較から、活性部位における化学的自由度の使用性が、リガンドと活性部位との結合に及ぼす影響が決定される。また、このような研究は、リガンドと結合する傾向が他のものより大きい滴定状態の確認を可能にする。

対称的および非対称的結合
対称的な酵素に対してより相補的であろうという原理に基づいて、いくつかの対称的阻害物質が設計されている（Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１１４９（１９８９））。これらの一部は、結晶構造解析の研究で対称的に結合していることが観察されている（ＸＫ ２６３（Ｐ．Ｙ．Ｓ．Ｌａｍほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：３８０（１９９４））、ＤＭＰ ４５０（Ｃ．Ｎ．Ｈｏｄｇｅほか、Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．３：３０１（１９９６））、およびＡ−７６９２８（Ｍ．Ｖ．Ｈｏｓｕｒほか、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：８４７（１９９４））が、他のものは非対称的に結合している（Ａ−７６８８９（Ｍ．Ｖ．Ｈｏｓｕｒほか、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：８４７（１９９４））。対称的な酵素が非対称に結合する理由には２つの理由がある。結合部位が非対称リガンドに対して真に相補的であるように、結合部位自体が変形する可能性があるか、結合部位自体は本質的に対称性を維持する可能性がある一方で、リガンドの方が非対称的に相互作用するかのいずれかである。これらのケースは、２回対称に対して結合リガンドを対称的にも非対称的にも保護する部位に対して、コンピューター計算した静電的補体を検査すれば精密に区別することができる。もし補体が、非対称的に結合したリガンドに対して対称的なままであるなら、上記の方法を使ってリガンドに対する改善を明確にすることができる。たとえば、図４に挙げた４種類の化合物は、埋没した触媒アスパラギン酸の側鎖を補償するためにヒドロキシル基を使用する場合に異なる選択肢（対称的選択肢および非対称的選択肢）をなし、これらを研究すれば結合力を高めたリガンドを設計することができる。

設計
プロテアーゼ阻害物質を設計する手法は、ＭＨＣリガンドに関する上記の手法と似ている。ＨＩＶプロテアーゼに特有の設計上のポイントを二、三ここに挙げておく。

上記研究のそれぞれは、活性部位に対する立体配座の変化および滴定による変化が、コンピューター計算した相補的リガンドの性質に対して、いかに影響を及ぼすかに関する特定の問題に答える。各研究は、既存リガンドを修飾する（「結合力を高めたリガンド」を得るために）機会または親和性を高めた全く新しいリガンドを設計する機会について分析することができる。アルコールおよびジオールは、いくつかのＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害物質に広く認められる。結合力を高めたリガンドを設計するため、アスパルチル基の静電的性質を満たす、より有効な部分構造を確認することができる。

ＨＩＶを標的とするすべての薬物にとって特に重要な問題の一つは、時として「すり抜け」変異体が進化することである。本発明は、活性部位の残基を補完するために必要最小限の電荷の配置を明らかにするために有用である。このようなコア分子はその大きさが限定されていて、すり抜け変異体によって破壊される可能性のある接触の回数が減少するはずであり、それゆえ、このような分子は有用と考えられる。加えて、接触はすべて触媒部位に存在するであろうから、分裂変異体は不活性である可能性があろう。

ＨＩＶのその他の標的に対する設計の研究
ＨＩＶのその他の標的に対する設計の研究は、上記の方法を使って行われる。ＨＩＶのその他の標的は、たとえばＴＡＲおよびＲＲＥのＲＮＡ複合体、およびＨＩＶエンベロープタンパク質などである。

（実施例３）
４３４リプレッサーＤＮＡを結合するドメイン
はじめに
当発明者は、連続体静電気計算を行って、Ｏ_Ｒ ^１オペレーターに結合する４３４リプレッサーＤＮＡを結合するドメイン、Ｒ１−６９の高分解能Ｘ線結晶構造を分析した。得られた結果の要点は次のとおりである。相互作用を、各タンパク質の主鎖カルボニル、Ｃ_αＮＨ、および側鎖ならびに核酸のリボース、塩基およびリン酸からの寄与に分解した。各基に対して、結合に対する脱溶媒和の寄与、界面を横切って行われる（「分子間」と名づける）新しい相互作用からの寄与およびタンパク質またはＤＮＡ内部（「分子内」と名づける）の遮蔽の変化からの寄与を計算した。

今のところ、あらかじめ立体配座が固定されたタンパク質二量体とあらかじ立体配座が固定されたＤＮＡとの剛直な結合のみが研究し終わっている。これらの方法を拡張して、上で述べた立体配座の柔軟性に取り組むことができる。結合に対する全体を通しての静電的寄与は（結合形成に対して）好ましくない（４５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）。これは、脱溶媒和による不利が大きく（１３２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）、好ましい分子間の項（−９６．４ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）ではごく一部しか相殺されないことに原因がある。分子内の項の総和は小さく、そして好ましくない（８．８ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）。複合体に形成された４つの塩橋（対称に関係する２つの対）は、複合体の形成をそれぞれが平均−１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定化する。これは、主として、これらの基が受ける脱溶媒和による不利の方が、タンパク質側鎖が非折り畳み状態から折り畳み状態になるときに受けるそれよりも小さいという事実によっている。これに関して、結合は、折り畳みとやや違っているように思われるが、当発明者のさらに別の結果によると、両者の区別はもっと複雑である。

脱溶媒和による不利に最も大きく貢献する要素は、系に含まれる電荷を有する基である。具体的には、タンパク質の側鎖（６３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）とＤＮＡの主鎖（５０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）である。タンパク質の主鎖（６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）とＤＮＡの塩基（１１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）が引き起こすコストははるかに小さい。脱溶媒和による不利は、タンパク質−ＤＮＡの界面に埋没される多くの基にとってかなり大きい。近くには存在するが、界面には存在しない一部の側鎖も、結合時にかなりの脱溶媒和を受ける。

複合体中に形成される強く、かつ有利な相互作用が、ほとんど全部ＤＮＡ主鎖との間で行われることは興味深い。電荷を有する末端を除いて、単に極性を有するタンパク質主鎖との相互作用から（−４１．８ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）と同じ量が、電荷を持つ基を多数含むタンパク質側鎖との相互作用から（−４２．２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）も来ていることは驚きである。分析結果は、αヘリックスのＮ末端と個々のリン酸基との間およびタンパク質ループの主鎖基と一組のリン酸基との間で強い相互作用が行われることを示している。加えて、電荷を有する側鎖とＤＮＡ主鎖の間の相互作用の中にはかなり遠距離のものがあり、そうした相互作用は、溶媒による遮蔽が少ないために比較的遠距離での静電相互作用が予想される低誘電タンパク質を通して影響を及ぼす。

塩基との分子間相互作用は小さい：すなわち、タンパク質主鎖で２．２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ（不利）、タンパク質側鎖で−１４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ。ただし、一般に塩基−側鎖相互作用はタンパク質−ＤＮＡ複合体にかなり大きな特異性を与えるものと考えられている。好ましい分子間相互作用のおよそ半分は、水素結合を作るに十分近い相互作用が占めている。そして水素結合を形成するには遠すぎる相互作用がこれと同じ寄与をしている。特に、これら比較的遠距離の相互作用は、その多くがオペレーターの中心領域の「非接触」塩基によるもので、左半分の部位と右半分の部位のＡｒｇ４３の寄与は−３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌｅである。

静電ドックングエネルギーに対する、全体を通しての分子間相互作用の寄与はわずか８．８ｋｃａｌ／ｍｏｌｅに過ぎないが、この効果の起源は非常に興味深い。これらの相互作用はタンパク質かまたはＤＮＡの中にあるため、結合状態における相互作用も遊離状態における相互作用も同じ幾何形状で存在する。しかし複合体中の誘電性の高い溶媒が排除されると、相互作用の遮蔽は減少する。結合状態において溶媒による遮蔽が減少すると有効誘電率が低下するため、タンパク質が結合すると、ＤＮＡ主鎖内の反発（主としてリン酸基−リン酸基相互作用による）は、１９．２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ増大する。その一部は、複合体中の遮蔽が低下したことで強まるタンパク質内の塩橋の引力に主として帰せられるタンパク質側鎖間の好ましい寄与、−１１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌｅによって相殺される。

寄与のすべて（脱溶媒和、分子間、および分子間）を基ごとに表に表した場合、ほとんどの基はそれらが他の相互作用で取り戻すより多くを、それぞれ個別に脱溶媒和で費やしている。このことは、特にリン酸基および一つを除く全塩基、ならびに結合界面における側鎖に対して当てはまる。脱溶媒和で費やすより多くを取り戻す基は、ドッキングしていない状態で大部分が埋没される傾向がある。

以上をまとめると、本研究は、結合現象をエネルギー的に解剖することから生まれる詳細な洞察を明らかにする。これらの手法はＨＩＶ標的に結合するリガンドの探索に役立ち、結合力を高めたリガンドの合理的な設計を可能にする。

点変異効果の自由エネルギー分析：４３４リプレッサー−ＤＮＡ複合体における塩基対変化のシミュレーション
当発明者は、認識の具体的な問題に取り組み、そして連続体静電気に関する本研究結果の有効性を確認するため、明示的な溶媒で自由エネルギーシミュレーションの研究を行った。結合状態の出発構造にはＯ_Ｒ ^２に結合したＲ１−６９高分解能複合体（Ｌ．Ｊ．Ｗ．ＳｈｉｍｏｎおよびＳ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３２：８２６〜８３８（１９９３））を選んだ。変異は７Ｌ位のＴＡ→ＧＣであった。複数個のＤＮＡ非結合立体配座を３００−ｐｓ分子動的トラジェクトリから発生させた。このトラジェクトリの５個のフレームを選び、非結合自由エネルギー計算するための出発構造として使用した。４３４リプレッサーとＤＮＡとの間の相互作用のほとんどは、主溝にあるが、このオペレーターの変異は、リプレッサーがＤＮＡの小溝側に面する疑似二回対称軸の近くで行われる。全部で１０回のシミュレーションは非結合状態で行い、６回は結合状態で行って良好な統計データを得た。得られた結果の概要を簡単に記す（Ｅ．Ｊ．Ｓｉｍｏｎ，“Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｂａｑｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ４３４ Ｏｐｅｒａｔｏｒ／Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ”，ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９６））。

結果：
全体を通しての安定性変化は＋１．４±０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌで、変異オペレーターへの結合に不利である。これは実験値の０．８〜１．２と良く一致する（Ｇ．Ｂ．Ｋｏｕｄｅｌｋａほか、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２６：８８６（１９８７））。全体を通してのこの安定性変化の原因を分析した結果（Ｂ．Ｔｉｄｏｒ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｃｈａｎｇｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９０）；Ｂ．ＴｉｄｏｒおよびＭ．Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３２１７（１９９１）；およびＢ．Ｔｉｄｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｋ．，Ｇｅｎｅｔ．，１９：３１０（１９９４））、Ａｒｇ４３Ｌの側鎖と変異グアニンのＮ２アミノ基との間に強い反発があることがわかる。これは、このアルギニンが、この位置のグアニンに「干渉する」ことで負の特異性決定基として働くことを示唆していることから、非常に興味深い相互作用である。変異部位のＡＴに富む領域の小溝内の一連の水素結合アクセプターとその側方に位置するリン酸基は、周囲の水を分極させてこの負の電位と有利に相互作用する。Ｇｕａ Ｎ２ドナーを小溝に導入すると、分極したこの溶媒を効果的にしりぞける。タンパク質が結合すると、溶媒は小溝のこの領域から排除されるため、結合状態より非結合状態の方が斥力は強い。

これらの自由エネルギーシミュレーション結果と連続体静電気の研究を比較すると、溶媒分極効果を含め、Ａｒｇ４３の相互作用に対して同じ分解研究結果（ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）が示される。この比較は、明示的シミュレーションに関する連続体法の正確さを証明する。コンピューターを援用する本発明の方法は、連続体による手法に基づく、経済的な方法であり、一回に一つの基を分析するのではなくて、結合部位全体を分析するのに使用することができる。自由エネルギーシミュレーションは主として連続体の理論と実験との間の不一致点を調べるために使われる。

付属資料（ＡＰＰＥＮＤＩＸ）
図５は問題の形状を示す。図５ａは、レセプター（Ｒ）と球形リガンド（Ｌ）が剛直にドッキングして結合状態の球形複合体を形成する反応を模式化したものである。レセプター、リガンドおよび複合体はいずれも低誘電率媒体（∈_１）であり、周囲を高誘電率溶媒（∈_２）で囲まれている。図５ｂは、ここで解かれる境界値問題が、誘電率が∈_２の溶媒に囲まれた、半径がＲ、誘電率が∈_１の球形領域内に電荷分布を含むことを示す。座標の原点は、大きい球形領域の中心であり、電荷分布は、ｚ軸に沿って距離ｄの点ａの周りに多極子として広がっている。幾何的必要条件は、リガンドの球がレセプターの球を超えて広がらないことであり、Ｒ≧ｄ＋ａが成立することである。等号が成立する場合が図示されている。

結合の静電自由エネルギーは、結合状態における静電自由エネルギーと非結合状態における静電自由エネルギーとの差、ΔＧ_{ｂｉｎｄｉｎｇ}＝Ｇ^{ｂｏｕｎｄ}−Ｇ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}である（図５ａを参照）。誘電モデルは、エントロピーおよびエンタルピーに影響を及ぼす応答を含むので、静電エネルギーは自由エネルギーと考えられる。各状態の自由エネルギーは、リガンド（Ｌ）、レセプター（Ｒ）およびそれらの相互作用（Ｌ−Ｒ）を含むクーロン項と反応場項の和の形で表される：

上式から、結合の自由エネルギーに対して次式が得られる。

式中、レセプターおよびリガンドの点電荷の幾何形状は変わらないという事実によって、リガンドおよびレセプターのクーロン自己寄与は消去され、リガンドとレセプターは、非結合状態では相互作用しないと考えられるため、２つのＬ−Ｒ項は結合状態に対してのみ考慮される。しかしレセプターに関する電荷分布は、結合状態と非結合状態とで同じである必要はないことに注意しなければならない。両者が異なる場合は、ΔＧ_{ｂｉｎｄｉｎｇ}に定数が加わるが、この定数は、式（３）でΔＧ_ｖａｒを定義するときには省略することできる。かくして、式（２）は、リガンドおよびレセプターの脱溶媒和への寄与（不利な寄与）と、結合状態における溶媒で遮蔽された静電相互作用（普通は有利）との和の形で静電結合自由エネルギーを記述する。目的はリガンドの電荷分布を変えて静電結合自由エネルギーを最適化することであり、最後の項は単に定数を加えるだけなので、関係する変動結合エネルギーは次式によって定義される。

ここで、式（２）の右辺（ＲＨＳ）の最初の２項は、遮蔽相互作用項として一つの項にまとめられ、定数項は省略されている。

であることに注意しなければならない。式中、Ｖ_Ｌ ^{ｓｔａｔｅ}は、表示された状態における、リガンドの電荷分布のみによる総静電電位であり、Ｖ_{ｔｅｒｍ，Ｌ} ^{ｓｔａｔｅ}は、表示のようにクーロン項または反応場（水和）項である。総和は、リガンド（ｉ∈Ｌ）またはレセプター（ｊ∈Ｒ）の原子点電荷について行われる。式（５）に現れる係数、１／２は、リガンドの電荷分布が自己の誘起する反応場と相互作用することによっている。

式（４）および（５）の３つの静電電位、Ｖ_{ｃｏｕｌ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}、Ｖ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}、およびＶ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}は、図５ｂに示す境界値問題を解くことによって、その与えられた幾何形状と電荷分布の点から表される。（リガンドに対応する）電荷分布は、半径がＲの球に埋め込まれる。座標の原点は球の中心にとられるが（’記号を付けない）、多極子の形の電荷分布は、ｚ軸に沿って距離ｄだけ平行移動した第二の原点（’記号を付ける）について展開され、次式が得られる。

電位はすべての位置でポアソン方程式を満たす。球内部の電位は次式で表すことができる。

ＲＨＳの第一項はクーロン項、そして第二項は反応場（水和）の電位である。ｉに関する総和はリガンドの点電荷に対応する。球の外側では、クーロン項と反応場電位は、一緒に合わせて次式で表すことができる。

式中、Ａ_ｌ，ｍおよびＢ_ｌ，ｍは、適切な境界条件によって決定され、Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）は球面調和関数である。式（７）のクーロン項は、球面調和関数に展開され、電荷分布の多極子は、球の中心について展開される。ここで、多極子の展開の原点は

に移される。

ここで、Ｑ’_ｌ，ｍは、プライム付き原点、

について展開された球形多極子である。

Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）の定義は、Ｊａｃｋｓｏｎ^１が使用したものを採用する。
式（１０）の表現は、ｒ’＞ｒ’_ｉ（すなわち、リガンドの外、もっと正確に言えば、中心が

にあり、半径が

と点電荷の間の距離の中で最も長い距離に合致する球の外）に対して成立する。

式（７）に置き換え、球面調和関数を含む項を合わせるため、まず、式（１０）のＹ_ｌ，ｍ（θ’，φ’）／ｒ’^ｌ＋１をＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）／ｒ^ｌ＋１について展開する。これは、ｒ＞ｄに対してそのことを述べているＧｒｅｅｎｇａｒｄ^２の結果を使って行われる。

θ_ｄ＝０での幾何形状（図１ｂ）が使用されているので、式（１２）のｍ’＝０の項のみが０の値をとならない（ｎｏｎ−ｖａｒｎｉｓｈｉｎｇ）。その場合、式（１０）は次のようになる。

ここで、多極子の分布は点

について取られるが、電位は大きな球の中心に関する球面調和関数で表される。上記の方程式は次のように書くこともできる。

式（１４）では、同じＱ’^＊ _ｌ，ｍを含む項が一つにまとめられるのに対して、ここでは、同じＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）を含む項は一つにまとめられる。

式（１５）を式（７）に代入し、ｒ＝Ｒで境界条件をマッチさせると、

球内部の水和（反応場）電位として、

が得られる。式中、

各Ｖは、明示的にされたＱ’^＊ _ｌ，ｍに依存する形で書き換えることができる。Ｖ’_{ｃｏｕｌ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}は式（１０）で与えられ、Ｖ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}は式（１９）で与えられるが、同じＱ’^＊ _ｌ，ｍを含む項は集めるように書き換えられ、Ｖ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}は、Ｒ＝ａ、ｄ＝０として式（１９）で与えられる。

式（４）に代入すると、Δ_{Ｇｉｎｔ，Ｌ−Ｒ}のＱ’^＊ _ｌ，ｍに対する依存性が明示的となる。

ここで、Ｑ’^＊ _ｌ，ｍに依存しない要素α_ｌ，ｍは、最後の行で式（２５）のＱ’^＊ _ｌ，ｍに乗じる係数として定義される。各α_ｌ，ｍは多極子のΔＧ_{ｉｎｔ，Ｌ−Ｒ}に対する寄与を表し、ΔＧ_ｖａｒを得るために必要なレセプターの電荷分布に関するすべての情報を含む。

ΔＧ_{ｈｙｄ，Ｌ}については、Ｑ’^＊ _ｌ，ｍの点から式（５）を書き換えるのに有用であり、多極子は、個々の電荷ｑ_ｉではなくて、リガンドの電荷分布を記述する。Ｖ（ｒ）は、多極子の展開の中心ｄについて展開される。

球面座標でこの展開は次のようになることがＲｏｓｅによって明らかにされている^３。

そしてｙ_ｌ，ｍ

は

を

で置き換えて得られる演算子である。
正のｍに対して、ラプラス方程式の解（すなわち、ｒ^ｌＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）またはＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）／ｒ^ｌ＋１）にｙ_ｌ，ｍ

を作用させると、次式が成立することが明らかにされている３。
ｍ≧０に対して

二重階乗は次のように定義され、

球面偏導関数は次のとおりである。

負のｍに対してｙ_ｌ，ｍを計算するには、ｙ_ｌ，ｍ

＝（−１）^ｍＹ^＊ _ｌ，ｍ（θ，φ）であるという事実および式（３４）における球面偏導関数の定義が使用され、次式が得られる。

次に、結合したリガンドの水和エネルギーは、

となる。
式（３７）のｙ_ｌ，ｍ

を評価するには、式（３１）およびグラジエント式が使用される^４。

Ｃ（ｌ’，ｌ；ｍ−ｍ’，ｍ’）は、表Ｉに示す角運動量の研究にしばしば現れるベクトル加法（またはＣｌｅｂｓｃｈ−Ｇｏｒｄｏｎ）係数であり^４、ξ_ｍは球面単位ベクトルである。

が成立する。
式（３８）〜式（４１）から、

表Ｉ、式（３１）および式（３７）〜（４２）を使って、以下の中間結果

および結合状態におけるリガンドの水和エネルギーを表す最終式

が得られる。式中、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}は上の２つの式で定義され、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}はｍ’ｍに対して０であることに注意しなければならない。

式（４６）において、ｄ＝０、Ｒ＝αと置くことにより、非結合リガンドの水和エネルギーが得られる。

式中、γ_ｌ，ｍは、式（４８）および（４９）によって定義される。次に、γ_ｌ，ｍは、形式的にはｍに依存しないが、表記を簡単にするためｌおよびｍの両方の関数として記述される。

かくして、ΔＧ_ｖａｒは、リガンドの電荷分布の多極子、Ｑ’_ｌ，ｍおよびＱ’_ｌ，ｍに依存しないエレメント、α_ｌ，ｍ、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}およびγ_ｌ，ｍの関数として表されてきた。式（２６）、（４７）および（４９）を組み合わせると次式が得られる。

レセプターの電荷に依存するのは、α_ｌ，ｍだけであるのに対して、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}およびγ_ｌ，ｍは、実数量であり、結合状態および非結合状態の幾何形状のみに依存することに注意しなければならない。それに対してα_ｌ，ｍおよびＱ’_ｌ，ｍは、複素数であり、積α_ｌ，ｍＱ’_ｌ，ｍおよびＱ’^＊ _ｌ，ｍＱ’_ｌ’，ｍは、Ｙ^＊ _ｌ’，ｍ（θ’，φ’）Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）の形の項に関する総和を含む。β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}およびγ_ｌ，ｍは実数であることに注意しなければならない。そこで、ΔＧ_ｖａｒ ^ｏｐｔは、α_ｌ，ｍおよびＱ’_ｌ，ｍの実数部分および虚数部分の項で書き換えられるが

（ここで、ｍに関する総和は、ｌ＝０に対して除外される）、ここで再び、Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）＝（−１）^ｍＹ^＊ _ｌ，ｍ（θ，φ）および

であることに注意しなければならない。
新しい変数、ＲｅＱ’_ｌ，ｍおよびＩｍＱ’_ｌ，ｍに再指数づけして、Ｑ_ｉで書き変えれば次式が得られる。

同様の変換によってα_ｉ、β_ｉｊおよびγ_ｉを作り出す。
そこで式（５１）は次の形

または行列形で書くことができる。

ここで、

はＱ_ｉによって形成されるベクトル、

はα_ｉによって形成されるベクトル、

は（β_ｉｊ−δ_ｉｊγ_ｉ）によって形成される対称行列、式（５８）に達するために二乗の完全化が使用された。式（５７）の

は、リガンドの脱溶媒和による不利（ペナルティ）に相当する。この不利は化学的に合理的な幾何形状に対してゼロより大きくなければならない。行列

は、正の定数であり、ΔＧ_ｖａｒの極値は最小値である５。式（５８）から多極子

の最適値および最小変動結合エネルギーΔＧ_ｖａｒ ^ｏｐｔが得られる。

も正の定数であるため、

は常に負である。

単極子（総電荷）を固定して（Ｑ_１＝

）最適多極子分布について解くため、残る最適多極子（ｉ≠１）に対する方程式は次のとおりであり、この式は、式（５９）と類似である。

次元がｉ_ｍａｘ＝（ｌ_ｍａｘ＋１）^２で打ち切られた上記行列方程式は、比較的穏当な計算資源で数値的解くことができる。実施上は、無限数の項についての総和を含むため、式（２５）および式（４６）における最も内部の総和を途中で打ち切るためにｌ_ｍａｘの第二切り捨て値を使う必要がある。ｌ_ｍａｘおよびｌ_ｃｕｔが十分大きければ、ΔＧ_ｖａｒ ^ｏｐｔは収束し、多極子の数が多く含まれるほど利点が増すといことは、基本的にはなくなる。

かくして、当発明者は、レセプターおよび幾何形状が与えられれば、それに対して最も緊密に結合するリガンドの電荷分布を決める方法を一組の多極子として記述した。試験リガンドに最適な結合自由エネルギーからの偏差は、式（５８）から式（６０）を差し引き、式（５９）を使って

を消去して計算することができる。

参考文献

以上、コンピューターを援用する本発明の方法について二、三の実施例を挙げて説明してきたが、これらは単なる例示したものであって、これによって本発明の範囲が限定されるものでないことは、当業者であれば明らかであろう。多数の変形や他の実施形態が通常の当技術分野の中の一つに入り、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の方法およびその等価物の範囲内に入るものと考えられる。

（特許請求の範囲）
（請求項１） 溶媒中で標的分子に結合するリガンドの性質を確認するための、コンピューターを援用する方法であって、
三次元で定義される標的分子の選択された一部分の形を補完する、三次元で定義されるリガンドの選択された形の指示を受け入れる工程と、
リガンドと標的分子の間の、溶媒中における結合自由エネルギーに対する静電的寄与を最小にする電荷分布の表現を決める工程と
からなる方法。
（請求項２） 電荷分布の表現が多極子の集合であることを特徴とする請求項１に記載のコンピューターを援用する方法。
（請求項３） 電荷分布の表現に一致する点電荷を有するリガンドを確認するための工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のコンピューターを援用する方法。
（請求項４） 電荷分布の表現に一致する点電荷を有するリガンドを確認するための工程をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載のコンピューターを援用する方法。
（請求項５） 電荷分布の表現に一致する点電荷を有するリガンドを含むコンビナトリアル・ライブラリーを設計する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のコンピューターを援用する方法。
（請求項６） 電荷分布の表現に一致する点電荷を有するリガンドを含むコンビナトリアル・ライブラリーを設計する工程を含むことを特徴とする請求項２に記載のコンピューターを援用する方法。

（付録Ｂ）
静電結合自由エネルギーの最適化
Ｌｅｅ−Ｐｅｎｇ Ｌｅｅ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９−４３０７
Ｂｒｕｃｅ Ｔｉｄｏｒ^ａ）
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９−４３０７
（１９９６年１２月９日受理；１９９７年０２月２４日掲載決定）
Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０６（２１）８６８１〜８６９０（１９９７）掲載
レセプターの電荷分布および球形の幾何形状を仮定して、最も緊密に結合するリガンドの電荷分布を定義する解析結果を誘導する。最適分布は、連続体静電学の枠組みを使って、静電結合自由エネルギーを最小化することによって決定される多極子の集合として表される。この理論の応用を明らかにするため、２種類の単純なレセプター系に対する結果を提示する。 １９９７ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ．
［Ｓ００２１−９６０６（９７）５０２２１−２］
Ｉ．はじめに
多くの疾患で働いているメカニズムの一つは、タンパク質（以下「レセプター」と呼ぶ）による望ましくない作用であり、少なくとも原理的には分子リガンドの緊密な結合によって阻止することが可能である（たとえば、活性部位を立体的に封鎖するか、必要な立体配座への変化を防止する）。^１ そのような分子が、薬物として有効であるためには、重要な薬理学的活性のいくつか、たとえばバイオアベイラビリティおよび無毒性などの特性を持つ必要がある。薬物分子を見つけだす一つの段階は、緊密に結合するリガンドの設計を確認することである。リガンドを設計することは、これに反対する結合自由エネルギーに対する寄与を適切に調整しなければならないため、特に困難な課題である。たとえば、リガンドの点電荷の大きさを大きくするとレセプターとの相互作用を強めることができるが（結合に有利に働く）、非結合状態における溶媒との相互作用も強める（結合に不利に働く）。これらの効果のバランスをとり、最も好ましい結合自由エネルギーを作り出すには、電荷の大きさをどうすればよいだろうか？ この問題は、リガンドの電荷分布の全多極子項に一般化することができる。これらの効果のバランスを最適にした電荷分布は、レセプターに最も緊密に結合するだろう。

本研究では、連続体静電理論を使って、あるレセプターと最も緊密に結合するリガンドの電荷分布を決定する問題に取り組む。第ＩＩ章では、遊離のリガンドと結合した複合体が、高誘電率の水性媒質に囲まれた低誘電率の球形領域をなし、系の挙動がポアソン方程式によって支配される場合について解法を提示する。解析による問題の解決を簡易にするため、次のようの仮定を置いた：非結合状態ではリガンドおよびレセプターは相互作用しない；リガンドの電荷分布は結合状態と非結合状態で同じである；リガンドはある特別な方向でレセプターと緊密に結合する。最適電荷分布は、リガンドの電荷分布を多極子の任意の集合で表現し、その多極子に関して結合自由エネルギーを最小にすることによって得られる。第ＩＩＩ章では、この理論を、検査目的として工夫した対称性の高い電荷分布に応用し、さらにもう一つの電荷分布として、いくつかのタンパク質部位に存在するαヘリックスの末端にも応用する。第ＩＶ章では、考察と結論を提示する。

ＩＩ．理論
静電結合自由エネルギーは、結合状態と非結合状態の静電自由ネルギーの差、ΔＧ_{ｂｉｎｄｉｎｇ}＝Ｇ^{ｂｏｕｎｄ}−Ｇ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}で与えられる（図１ａ参照）。誘電モデルはエントロピーとエンタルピーの両方に影響を及ぼす応答を含む。ここでは各状態の自由エネルギーを、リガンド（Ｌ）、レセプター（Ｒ）およびそれらの相互作用（Ｌ−Ｒ）を含むクーロン項と反応場（水和）の項の和として表す。

そこで、結合自由エネルギーとして次式を得る：

ここで、レセプター２およびリガンドの点電荷の幾何形状は固定されたままで、リガンドおよびレセプターのクーロン自己寄与が消去されるという事実を使用した。またここで、リガンドおよびレセプターは非結合状態では相互作用しないものと仮定されているので、^２つのＬ−Ｒ項は結合状態でしか関係しない。かくして、静電結合自由エネルギーは、式（２）においてリガンドおよびレセプターの脱溶媒和の寄与（不利に働く）と、溶媒で遮蔽された結合状態における静電相互作用（通常は遊離に働く）との総計で記述される。われわれの目的は、リガンドの電荷分布を変えて静電結合自由エネルギーを最適化することであり、最後の項は、単に定数が加わるだけなので、われわれは次式によって関係する変動結合エネルギーを定義し、

図１ 問題幾何形状の説明図
（ａ）レセプター（Ｒ）と球形リガンド（Ｌ）が剛直にドッキングして結合状態の球形複合体を形成する結合反応を示す。レセプター、リガンドおよび複合体はいずれも低誘電率媒体（∈_１）であり、周囲を高誘電率溶媒（∈_２）で囲まれている。（ｂ）ここで解かれる境界値問題は、誘電率が∈_２の溶媒に囲まれた、半径がＲ、誘電率が∈_１の球形領域内に電荷分布を含む。座標の原点は大きい球形領域の中心であり、電荷分布はｚ軸に沿って距離ｄの点ａの周りに多極子として広がっている。幾何的必要条件は、リガンドの球がレセプターの球を超えて広がらないことであり、Ｒ≧ｄ＋ａが成立することである。等号が成立する場合が図示されている。
ここで、式（２）のＲＨＳ（右辺）の最初の２項は、遮蔽された相互作用として一つの項にまとめられ、定数項は省略されている。ここで次式が成立することに注意しなければならない。

式中、Ｖ_Ｌ ^{ｓｔａｔｅ}は、表示した状態における、リガンドの電荷分布のみによる総静電電位であり、Ｖ_{ｔｅｒｍ，Ｌ} ^{ｓｔａｔｅ}は、表示したように、クーロン項か反応場（水和）項である。総和はリガンド（ｉ∈Ｌ）またはレセプター（ｊ∈Ｒ）の原子点電荷について行われる。式（５）に現れる係数、１／２は、リガンドの電荷分布が、自己の誘起する反応場と相互作用することによっている。

われわれは、図１ｂに示す境界値問題を解くことにより、その与えられた幾何形状および電荷分布の点から式（４）および式（５）の３種類の静電電位、Ｖ_{ｃｏｕｌ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}、Ｖ_{ｈｙｄ、Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}、およびＶ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}を表し、先へ進む。半径Ｒの球に（リガンドに対応する）電荷を埋め込む。われわれは、座標の原点を球の中心にとるが（’記号を付けない）、多極子の形の電荷分布は、ｚ軸にそって距離ｄだけ平行移動した第二の原点（’記号を付ける）について展開し、次式を得る。

電位はすべての位置でポアソン方程式を満たす。球内部の電位は次式で表すことができる。

ＲＨＳの第一項はクーロン項、そして第二項は反応場（水和）の電位である。ｉに関する総和はリガンドの点電荷に対応する。球の外側では、クーロン項と反応場電位は、一緒に合わせて次式で表すことができる。

式中、Ａ_ｌ，ｍおよびＢ_ｌ，ｍは、適切な境界条件によって決定され、Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）は球面調和関数である。次に行うべき標準的な手続きは、式（７）のクーロン項を球面調和関数に展開し、電荷分布の多極子を球の中心について展開することである。ここで、われわれは、多極子展開の原点を

に移す。

ここで、Ｑ’_ｌ，ｍは、プライム付き原点、

について展開された球形多極子である。

われわれは、本研究全体を通して、Ｊａｃｋｓｏｎ^３が使用したＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）の定義を採用していることに留意していただきたい。式（１０）の表現は、ｒ’＞ｒ’ｉ（すなわち、リガンドの外、もっと正確に言えば、中心が

、半径が

から最も遠くにある点電荷までの距離である球の外）に対して成立する。

式（７）に置き換え、球面調和関数を含む項を合わせるため、まずわれわれは、式（１０）のＹ_ｌ，ｍ（θ’，φ’）／ｒ’^ｌ＋１を、Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）／ｒ^ｌ＋１について展開する。これは、ｒ＞ｄに対してそのことを述べるＧｒｅｅｎｇａｒｄ^４の結果を使って行われる。

われわれは、θ_ｄ＝０での幾何形状（図１ｂ）を選んでいるので、式（１２）のｍ’＝０の項のみが０の値をとならない（ｎｏｎ−ｖａｒｎｉｓｈｉｎｇ）。その場合、式（１０）は次のようになる。

ここで、多極子の分布は点

について取られるが、電位は大きな球の中心に関する球面調和関数で表される。上記の方程式は次のように書くこともできる。

式（１４）では、同じＱ’^＊ _ｌ，ｍを含む項が一つにまとめられるのに対して、ここでは、同じＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）を含む項は一つにまとめられる。

式（１５）を式（７）に代入し、ｒ＝Ｒで境界条件をマッチさせると、

われわれは、球内部の水和（反応場）電位として、

今やわれわれは、さまざまなＶを、明示的にされたＱ’^＊ _ｌ，ｍに依存する形で書き換えることができる。Ｖ’_{ｃｏｕｌ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}は式（１０）で与えられ、Ｖ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｂｏｕｎｄ}は式（１９）で与えられるが、同じＱ’^＊ _ｌ，ｍを含む項は一まとめにして書き換えられ、Ｖ_{ｈｙｄ，Ｌ} ^{ｕｎｂｏｕｎｄ}は、Ｒ＝ａ、ｄ＝０として式（１９）で与えられる。

式（４）に代入して、われわれは、ΔＧ_{ｉｎｔ，Ｌ−Ｒ}のＱ’^＊ _ｌ，ｍに対する依存性を明示的にする。

ここで、Ｑ’^＊ _ｌ，ｍに依存しない要素_αｌ，ｍは、最後の行で式（２５）のＱ’^＊ _ｌ，ｍに乗じる係数として定義される。各α_ｌ，ｍは多極子のΔＧ_{ｉｎｔ，Ｌ−Ｒ}に対する寄与を表し、ΔＧ_ｖａｒを得るために必要なレセプターの電荷分布に関するすべての情報を含む。

ΔＧ_{ｈｙｄ，Ｌ}については、Ｑ’^＊ _ｌ，ｍの点から式（５）を書き換えるのに有用であり、多極子は、個々の電荷ｑｉではなくて、リガンドの電荷分布を記述する。われわれは、

を、多極子の展開の中心

について展開する。

球面座標でこの展開は次のようになることがＲｏｓｅによって明らかにされている^５。

そしてｙ_ｌ，ｍ

は

を

で置き換えて得られる演算子である。
正のｍに対して、ラプラス方程式の解（すなわち、ｒ^ｌＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）またはＹ_ｌ，ｍ（θ，φ）／ｒ^ｌ＋１）にｙ_ｌ，ｍ

を作用させると、次式が成立することが明らかにされている^５。
ｍ≧０に対して

二重階乗は次のように定義され、

球面偏導関数は次のとおりである。

負のｍに対してｙｌ，ｍを計算するため、われわれは、ｙ_ｌ，ｍ

＝（−１）^ｍＹ^＊ _ｌ，ｍ（θ，φ）であるという事実および式（３４）における球面偏導関数の定義を使用し、次式を得る。

次に、結合したリガンドの水和エネルギーは、

となる。
式（３７）のｙ_ｌ，ｍ

を評価するため、われわれは、式（３１）およびグラジエント式を使用する^６。

Ｃ（ｌ’，ｌ；ｍ−ｍ’，ｍ’）は、表Ｉ６に示す角運動量の研究にしばしば現れるベクトル加法（またはＣｌｅｂｓｃｈ−Ｇｏｒｄｏｎ）係数であり^４、ξ_ｍは球面単位ベクトルである。

そこでただちに、

が成立することがわかる。
式（３８）〜式（４１）から、われわれは、

を得る。
表Ｉ、式（３１）および式（３７）〜（４２）を使って、われわれは、以下の中間結果

および結合状態におけるリガンドの水和エネルギーを表す最終式

を得る。式中、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}は上の２つの式で定義され、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}はｍ’≠ｍに対して０であることに注意しなければならない。われわれは、式（４６）において、ｄ＝０、Ｒ＝αと置くことにより、非結合リガンドの水和エネルギーを得る。

式中、γ_ｌ，ｍは、式（４８）および（４９）によって定義される。次に、γ_ｌ，ｍは、形式的にはｍに依存しないが、表記を簡単にするためｌおよびｍの両方の関数として記述される。

かくして、ΔＧ_ｖａｒは、リガンドの電荷分布の多極子、Ｑ’_ｌ，ｍおよびＱ’_ｌ，ｍに依存しないエレメント、α_ｌ，ｍ、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}およびγ_ｌ，ｍの関数として表されてきた。式（２６）、（４７）および（４９）を組み合わせると次式が得られる。

レセプターの電荷に依存するのは、α_ｌ，ｍだけであるのに対して、β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}およびγ_ｌ，ｍは、実数量であり、結合状態および非結合状態の幾何形状のみに依存することに注意しなければならない。

は実質数量であるが、α_ｌ，ｍおよびＱ’_ｌ，ｍは、複素数であり、積α_ｌ，ｍＱ’_ｌ，ｍおよびＱ’^＊ _ｌ，ｍＱ’_ｌ’，ｍは、Ｙ^＊ _ｌ’，ｍ（θ’，φ’）Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）の形の項に関する総和を含む。β_{ｌ，ｍ，ｌ’，ｍ’}およびγ_ｌ，ｍは実数であることに注意しなければならない。われわれは、

を、α_ｌ，ｍおよびＱ’_ｌ，ｍの実数部分および虚数部分の項で書き換るが

（ここで、ｍに関する総和は、ｌ＝０に対して除外される）、ここで再び、Ｙ_ｌ，ｍ（θ，φ）＝（−１）^ｍＹ^＊ _ｌ，ｍ（θ，φ）および

であることに注意しなければならない。
新しい変数、ＲｅＱ’_ｌ，ｍおよびＩｍＱ’_ｌ，ｍに再指数づけして、Ｑ_ｉで書き変えれば次式が得られる。

同様の変換によってα_ｉ、β_ｉｊおよびγ_ｉを作り出す。
そこで式（５１）は次の形

または行列形で書くことができる。

ここで、

はＱ_ｉによって形成されるベクトル、

はα_ｉによって形成されるベクトル、Ｂは（β_ｉｊ−δ_ｉｊγ_ｉ）によって形成される対称行列、式（５８）に達するために二乗の完全化が使用された。式（５７）の

は、リガンドの脱溶媒和による不利（ペナルティ）に相当する。この不利は化学的に合理的な幾何形状に対してゼロより大きくなければならない。行列

は、正の定数であり、ΔＧ_ｖａｒの極値は最小値である^７。式（５８）から多極子

の最適値および最小変動結合エネルギー

が得られる。

も正の定数であるため、

は常に負である。

単極子（総電荷）を固定して

最適多極子分布について解くため、残る最適多極子（ｉ≠１）に対する方程式は次のとおりであり、この式は、式（５９）と類似である。

次元がｉ_ｍａｘ＝（ｌ_ｍａｘ＋１）^２で打ち切られた上記行列方程式は、比較的穏当な計算資源で数値的解くことができる。実施上は、無限数の項についての総和を含むため、式（２５）および式（４６）における最も内部の総和を途中で打ち切るためにｌ_ｍａｘの第二切り捨て値を使う必要がある。ｌ_ｍａｘおよびｌ_ｃｕｔが十分大きければ、

は収束し、多極子の数が多く含まれるほど利点が増すといことは、基本的にはなくなる。

かくして、われわれは、レセプターおよび幾何形状が与えられれば、それに対して最も緊密に結合するリガンドの電荷分布を決める方法を一組の多極子として記述した。試験リガンドに最適な結合自由エネルギーからの偏差は、式（５８）から式（６０）を差し引き、式（５９）を使って

を消去して計算することができる。

（ＩＩＩ．結果）
（Ａ．実施）
上で述べたアルゴリズムを、ｌ_ｍａｘ［式（５９）および（６１）で行列の大きさを決定した］、ｌ_ｃｕｔ［式（２５）および（４６）で最も内部の総和を途中で打ち切るために使用した］、問題の幾何形状、および最適単極子は自由とすべきかある値で固定すべきであるかを入力として、コンピュータープログラムで実行した。問題の幾何形状には、系における結合状態およびリガンドの球の両方の半径および中心の座標（ｚ軸上）、ならびに各部分原子電荷の座標および大きさが含まれる。誘電率∈_１および∈_２は、それぞれ４および８０とした。α_ｉ、β_ｉｊおよびγ_ｉを評価し、それからＬＵの分解を使用して行列方程式［式（５９）または（６１）］を解いた。定常点が最小であることを確認するため

行列の固有値を求めた。すべての実数浮動点値を６４ビットで表わした。Ｐｒｅｓｓら^８が発表した該当サブルーチンの精度を高めたものを使って行列代数学を実行した。最適電荷分布の多極子、

、定常点の性格およびα_ｉ、β_ｉｊおよびγ_ｉを記録したファイルをプログラムの出力とした。ｌ_ｍａｘ＝ｌ_ｃｕｔ＝４０とした場合、レセプターに対する典型的なＣＰＵの使用は、ＰＡ−７２００（９９ＭＨｚ）チップを搭載したヒューレットパッカード９０００／７３５、使用最大メモリが約２２ＭＢで２０分であった。行列の大きさが（ｌ_ｍａｘ＋１）^２×（ｌ_ｍａｘ＋１）^２の行列方程式を解くために直接法（すなわち、ＬＵの分解）を使用したので、時間のスケールは（ｌ_ｍａｘ）^６およびメモリのスケールは（ｌ_ｍａｘ）^４とした。この時点ではコードを最適化することはしなかった。たとえば、行列方程式には、必要なコンピューターの負担を軽減するために使用することができる、とりわけまばらな行列（問題に対して選択される方角幾何形状）が含まれる。最適化問題は、反復法、たとえば共役グラジエント法または各種緩和法を使って解くこともできる。

（Ｂ．検査問題）
第一の検査問題は、それぞれがｚ＝１５．５０面に−５．５ｅの負電荷とｚ＝１４．２５面に＋０．５５ｅの正電荷を持つ４個の平行な双極性基を有するレセプターの問題であった。すべての長さと距離はオングストローム単位（１Å＝０．１ｎｍ）で表す。各電荷の（ｘ，ｙ）座標は（＋１．５，＋１．５）、（−１．５，＋１．５）、（−１．５，−１．５）、および（＋１．５，−１．５）とした。結合状態の低誘電領域は、原点を中心とする半径２４．０の球と境を接した。結合状態におけるリガンド球の半径は４．０で、中心の座標は（ｘ，ｙ，ｚ）＝（０．０，０．０，２０．０）とした。

第二の検査問題はレセプターの理想化されたαヘリックスの問題であった。ヘリックスは、１８個のアラニン残基を有し、Ｎ末端およびＣ末端にそれぞれアセチル基およびＮ−メチルアミド封鎖基を持つ。座標は、ＣＨＡＲＭＭ ＰＡＲＡＭ１９（文献９）結合長および結合角、およびφ＝−５７゜およびψ＝−４７゜を使用し、水素極表示で発生させた。ＰＡＲＳＥパラメータセットからの部分原子電荷を使用した^１０。ヘリックスの軸を座標系のｚ軸と一致させ、Ａｌａ１０の窒素原子が原点に最も近くなるようにした。結合状態における低誘電領域は、原点を中心とする半径２４．０の球と境を接し、リガンド球の半径は４．０とし、結合状態におけるリガンド多極子の中心の座標は、（ｘ，ｙ，ｚ）＝（０．０，０．０，２０．０）（ポリアラニンらせんのＣ末端近く）とした。

（Ｃ．結果の分析）

各検査問題は、ｌ_ｍａｘの値を変えながら（ｌ_ｃｕｔを８０まで大きくしても、結果に本質的な違いは見られなかったが、ここに示す結果に対してはｌ_ｃｕｔを４０に固定した）、変動分布の単極子を非固定にするか、０または＋１に固定して、計算をくり返して解いた。図２は、使用したｌ_ｍａｘ値に対する計算

の収束を示す（ａは４個の双極性基に対する計算結果、ｂはαヘリックスに対する計算結果である）。いずれの場合も計算

は、ｌ_ｍａｘが増すにつれて単調に低下し、ｌ_ｍａｘのいかなる値に対しても、

の値は、変動最適化に対する予想どおり、単極子の値を固定した場合より非固定にした方が低く（すなわち有利に）なった。両検査問題に対して、

の値は、ｌ_ｍａｘが２０を超えると、単極子が浮動の場合も、あるいは固定の場合もほとんど変化しないように見えた。図３は最適化分布の低多極子モーメントの大きさをｌ_ｍａｘの変化に対してプロットしたものである（非固定単極子の値で）。２^ｌ極子の大きさはＱ＝

（式中、ａはリガンドの半径）で定義される。最初の６個の多極子の大きさは１０のｌ_ｍａｘ付近で収束した。図４は、やはりｌ_ｍａｘに対して、計算最適リガンドによるクーロン電位の変化をプロットしたものである。電位は２０のｌ_ｍａｘでほぼ収束しているように見えた。図５ａは、４個の双極性基問題について、リガンドのすぐ外（ｚ＝１６．０）で、そして４０のｌ_ｍａｘで計算した、最適リガンドの収束クーロン電位をｘｙ平面にプロットしたものである。同様に、図５ｃは、αヘリックスに対する収束クーロン電位を示す。好適なリガンドの電位は適切な４回対称を含み、４個の双極性基レセプターのそれとマッチする。このことはこの種のリガンドが４個の総極子すべてと等しく相互作用するであろうことを示唆する。しかし、双極性基がコイル状を呈し、ｚ方向に後退するαヘリックスに対しては、このような方法で計算した最適リガンドは、最も近くの双極性基とのみ強く相互作用するのではないかと思われる。このようにして計算される最適化多極子の分布によるクーロン電位は孤立したレセプターのクーロン電位を単純に反映したものではない。たとえば、両者ともｚ＝１６．０で計算した、最適リガンドによるクーロン電位（図５ａ）とレセプターによるクーロン電位（図５ｂ）とを比較して見るとよい。リガンド電位のピークはレセプターの電位より「内側」にある。これは、一方の分布は固定され、他方は最適化されるため基本的には非対称な、静電的に最適化された、結合相互作用の一般的な特徴ではないかと思われる。

１ 図３ （ａ）４個の双極性基および（ｂ）αヘリックスの計算に使用したｌ_ｍａｘの値を変えたときの最適リガンドの最も低い７個の２^ｌ極の大きさの収束を示す。最適化は総リガンド電荷を固定しないで行った。（ａ）の場合、ｌ＝４およびｌ＝５の線は互いのほとんど上にあることに注意すべきである。

２ 図４ （ａ）４個の双極性基および（ｂ）αヘリックスに対して、それぞれ、ｌ_ｍａｘ値の範囲で、線（ｙ＝−１．１，ｚ＝１６．０）に沿ってプロットした最適リガンドによるクーロン電位の収束。最適化は、総電荷の変化を拘束しないで行った。ｌ_ｍａｘ＝２０に対する曲線とｌ_ｍａｘ＝４０に対する曲線がほとんど同じであることに注意。

（ＩＶ．考察および結論）
球形リガンドが不変レセプターに結合して複合体を形成する自由エネルギーの最小値を生むリガンド多極子の分布を定義するにはポアッソン方程式の解析的解が使用されてきた。解析理論の評価に数値計算法を使うアルゴリズムが開発されて実行されてきた。今日まで調べられたすべての解の中で、二次導関数が、定常点が最小値であることを証明している。この意味で多極子分布は最適値と言われる。ここに提示した理論の重要な特徴は、最適値を多極子の分布の形で表現することで、確率論的な最適化の探求やその他の決定論的最適化法によらないで、直接に解くことができることである。ある球形リガンドの形および結合の幾何形状に対する最適電荷分布の多極子としての性質を明らかにすることは、分子の結合および認識における相補的相互作用を理解するのに有用であろう。このような性質は、緊密に結合する個々のリガンドの構築を助けるか、化合物ライブラリーを探索し、またはコンビナトリアル・ライブラリーの設計を助けるのに使用できる記述子を提供するかの、いずれかの形で、特にリガンド設計の分野に応用可能であることは明らかであろう。

好ましくない脱溶媒和エネルギーを超えて、リガンドとレセプターとの間に最大限に好ましい相互作用作り出すための最適値が、ここに提示した連続体モデルの中で定義できるという観察は、緊密に結合するリガンドの設計が成功するには、レセプター結合部位における極性基または電荷を持つ基に対して補償的相互作用をもたらす相補的形状を持つ分子を構築する以上のものが含まれている可能性があることを示唆している。たとえば、レセプターに含まれる中性、かつ極性のカルボニル基を中性、かつ極性のヒドロキシル基で補償する静電学は、それを正の電荷を有するアンモニウム基を補完するのとはかなり違っているであろう。また、遠距離静電効果が存在し、各基は、リガンド全体の多極子モーメントに影響を及ぼすため、単に、個々に補償し合う基の組み合わせの観点から問題を論じることは適当ではない。われわれは、少しでもこれらの問題に答えられるよう、現在、アルゴリズムによって定義される最適に密接に相当する多極子モーメントを持つ点電荷の組みおよび分子を設計するためのアルゴリズムを研究中である。

最適多極子分布および結合エネルギーの性質はさらに研究する価値がある。ここで、われわれは、

が常に負であるのに対して、全体を通しての結合自由エネルギーΔＧ_{ｂｉｎｄｉｎｇ}は、レセプターの脱溶媒和エネルギーのため、正の場合もあれば正でない（好ましくない）こともあることを特記しておきたい。^１１ そのうえ、遮蔽されたリガンド−レセプター相互作用自由エネルギーの大きさは、最適におけるリガンドの脱溶媒和の大きさの２倍であること

、そして各多極子成分の寄与

に対しても同じ関係が成立することを証明することは簡単である。^１２ 最後に、最適化電荷分布のクーロン電位とレセプターのクーロン電位との関係は、リガンドの脱溶媒和に関して、いかにすれば結合状態において好ましい相互作用を実現しうるかという微妙さを反映する重要な特徴を明らかにする。４個の双極性基の例として、これは各双極子を補償する化学基は、対応するレセプター双極子よりも方位軸に近い位置をとらなければならないことを示唆している。

ここに紹介した理論は今後の研究に有益な出発点となる。現在、われわれは、水性媒質のイオン効果も包含するのではないかと考えて、線形化および非線形ポアソン−ボルツマン方程式を解くための拡張の研究を進めている。また、非結合リガンドおよび結合複合体の両方が球形の幾何形状を有するということ、および結合状態と非結合状態とでリガンドの電荷の寄与が同じであること、そして滴定可能な基は、固定されたプロトン化状態で処理されること、という制限は、解消できるかもしれない。非結合レセプターの形または電荷分布の寄与はΔＧｖａｒを定義する中で消去される定数であるため、本理論には、この非結合レセプターの形または電荷分布に対する制約は、全くないことを強調しておきたい。

（謝辞）
本研究を進める中で有益な議論に加わっていただいたＭｏｕｎｇｉ Ｇ．Ｂａｗｅｎｄｉ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｃ．Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｒｉｃｋ Ｌ．Ｄａｎｈｅｉｓｅｒ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｗ．Ｆｉｅｌｄ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ Ｊａｒｑｕｅ，Ｅｒｉｋ Ｋａｎｇａｓ，Ｗｈａｙ Ｃ．Ｌｅｅ，Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｊ．Ｌｉｐｐａｒｄ，Ｉｒｗｉｎ ｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｃａｒｌ Ｏ．Ｐａｂｏ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｊ．Ｓｔｉｌｂｅｙ，および特にＳａｒａ Ｄｅｍｐｓｔｅｒの各氏に感謝申し上げます。本研究は、米国公衆衛生研究所（ＧＭ４７６７８）およびＭＩＴ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ Ｆｕｎｄからの支援を受けました。ここに記して謝意を表します。

図１は、溶媒中で結合した場合の、抗体またはそのフラグメントと抗原との結合相互作用をモデル化するための幾何形状を示す（一番上の囲み）。具体的には、誘電定数が∈_２の溶媒に囲まれた半径がＲ、誘電定数が∈_１の球形領域の電荷分布、および抗原抗体界面のその他の幾何形状を決めることを含む境界値問題（一番下の囲み、下記本文も参照）。 図２は、５ｃ８重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのヌクレオチド（配列番号：１、３）およびポリペプチド（配列番号：：２、４）配列である。

Claims (15)

1. 抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合親和性を増大させる方法であって、該方法の少なくとも工程ｉ）またはｖ）がコンピュータで実行され、該方法は、置換させる際に該抗体の該抗原結合親和性が、親抗体の親和性よりも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、５倍、８倍、１０倍、５０倍、１０^２ 倍、１０^３ 倍、１０^４ 倍、１０^５ 倍、１０^６ 倍、１０^７ 倍、または１０^８ 倍大きく増大するように、
   ｉ）溶媒中で抗原に結合する場合に、アミノ酸側鎖の特性を表すための制約を課して、該抗体のアミノ酸の最適電荷分布、およびそれに関連する該抗体の結合自由エネルギーの変化の空間表示を決定する工程、
   ｉｉ）工程ｉ）において決定された抗原に結合する場合の該抗体の結合自由エネルギーを変えるために修飾されるべき該抗体の少なくとも一つの候補アミノ酸残基の位置を同定する工程、
   ｉｉｉ）該アミノ酸位置で置換するために選択されるアミノ酸残基を選択する工程、
   ｉｖ）ここで、該選択されるアミノ酸残基が、（ａ）結合すると一部が埋没する残基；（ｂ）結合すると埋没する極性残基；および（ｃ）非相補的ポテンシャル領域にある該抗体上の表面残基からなる群より選択され、
   ｖ）非修飾抗体が該抗原に結合する場合と比較した、該抗原に結合する際の修飾アミノ酸または変更を含む抗体の結合自由エネルギーの変化を、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでモデル化することにより計算する工程であって、該非修飾抗体と比較した、該修飾アミノ酸または変更を含む該抗体の結合自由エネルギーの減少が、抗原結合親和性を示し、ここで、該工程が、静電的結合エネルギーの決定において応答連続体モデル化を利用する、工程、ならびに
   ｖｉ）該候補アミノ酸残基位置において該選択されるアミノ酸残基を、工程ｉ）において課した制約をきっちり満たす代替のアミノ酸で置換させる工程であって、該置換が該結合自由エネルギーの減少をもたらす、工程、を包含する、方法。
2. 前記候補アミノ酸残基位置で、前記選択されるアミノ酸残基を置換する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. 前記計算する工程が、ファンデルワールス結合エネルギーの決定および溶媒が接近可能な表面積に基づく方法を使用する結合エネルギーの決定からなる群から選択される少なくとも一つの決定をさらに使用する、請求項１に記載の方法。
4. 前記修飾された抗体または変更した抗体を発現させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
5. 前記選択されるアミノ酸が、特徴的な側鎖の化学的性質を有するアミノ酸のサブセット由来であり、該アミノ酸サブセットは、無電荷の極性アミノ酸残基、非極性アミノ酸残基、正の電荷を有するアミノ酸残基、および負の電荷を有するアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 溶媒中で結合した場合に、前記選択されるアミノ酸残基が、抗体と抗原との間の結合自由エネルギーを増大させ、それによって抗体−抗原結合親和性を減少させる、請求項１に記載の方法。
7. 溶媒中で結合した場合に、前記選択されるアミノ酸残基が、抗体と抗原との間の結合自由エネルギーを減少させ、それによって抗体−抗原結合親和性を増大させる、請求項１に記載の方法。
8. 前記方法が、少なくとも一回くり返される、請求項１に記載の方法。
9. 少なくとも一つの工程が、三次元構造データによって情報が与えられる、請求項１に記載の方法。
10. 少なくとも一つの工程が、溶媒中で抗原に結合する発現された抗体から誘導される結合データ、抗体の結晶構造データ、抗原に結合する抗体の結晶構造データ、抗体の三次元構造データ、抗体のＮＭＲ構造データおよび抗体のコンピューターモデル化された構造データからなる群から選択されるデータによって情報が与えられる、請求項１に記載の方法。
11. 前記修飾された抗体の発現が、無細胞性抽出物発現系、ファージディスプレイ発現系、原核細胞表現系および真核発現系からなる群から選択される発現系における発現である、請求項４に記載の方法。
12. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｖ_ＨＣＤＲ１、Ｖ_ＨＣＤＲ２、Ｖ_ＨＣＤＲ３、Ｖ_ＬＣＤＲ１、Ｖ_ＬＣＤＲ２およびＶ_ＬＣＤＲ３からなる群から選択される、ＣＤＲ領域内の一つ以上の位置で修飾される、請求項１に記載の方法。
13. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗体、抗体の軽鎖（ＶＬ）、抗体の重鎖（ＶＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、および単ドメインフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
14. 前記抗原結合親和性が、塩を含有する水性溶媒の存在下で決定される、請求項１に記載の方法。
15. 前記溶媒が、生理学的濃度の塩を含む、請求項１４に記載の方法。

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