ES2331573T3 - Vector de expresion para la secrecion de un fragmento de anticuerpo usando una secuencia señal de e. coli y procedimiento para la produccion en serie del fragmento de anticuerpo. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para producir un fragmento de anticuerpo, que comprende los pasos de: a) preparar un vector de expresión que comprende un gen que codifica una cadena ligera del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E. coli y un gen que codifica una cadena pesada del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de E. coli, en el que la expresión de los genes que codifican la cadena ligera y la cadena pesada está regulada por un único promotor; b) transformar un microorganismo con el vector de expresión; c) cultivar el microorganismo transformado en un medio; y d) recoger el fragmento de anticuerpo segregado del microorganismo transformado dentro del medio o del espacio periplasmático del microorganismo.
Description
Vector de expresión para la secreción de un
fragmento de anticuerpo usando una secuencia señal de E. coli
y procedimiento para la producción en serie del fragmento de
anticuerpo.
La presente invención versa acerca de un vector
de expresión recombinante que expresa de forma secretora un
fragmento de anticuerpo fusionado con una secuencia señal de E.
coli en forma de heterocigoto soluble; acerca de un mecanismo
transformado con el vector de expresión; y acerca de un
procedimiento para producir en serie el fragmento del anticuerpo
usando el microorganismo transformado.
Un "fragmento de anticuerpo", tal como se
usa en el presente documento, significará la porción de un
anticuerpo que comprende una región de enlace a antígenos, o una
región variable de la misma. Fragmentos ejemplares de anticuerpo
son los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y scFv. La
digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos
idénticos de enlace a antígenos, denominados fragmentos Fab, cada
uno con un único sitio de enlace a antígenos, y un fragmento
residual Fc. Cuando un anticuerpo es tratado con pepsina, se produce
el fragmento F(ab')_{2}, que tiene dos sitios de enlace a
antígenos que sigue siendo capaz de formar reticulación. El
fragmento Fab también contiene un dominio constante de la cadena
ligera un primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los
fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de
algunos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de la cadena
pesada que incluye una o más cisteínas de una región bisagra del
anticuerpo.
Para modificar las propiedades inherentes de un
anticuerpo aumentando la afinidad de enlace del anticuerpo,
cambiando la antigenicidad o preparando un doble anticuerpo
específico, se han estudiado diversos procedimientos para la
producción de anticuerpos y fragmentos de los mismos usando una
técnica recombinante de genes. Como resultado, se ha desarrollado
un procedimiento para producir y anticuerpo y fragmentos del mismo
usando un sistema de expresión de E. coli. El procedimiento
de producción que usa un sistema de expresión de E. coli
tiene varias ventajas con respecto a otros procedimientos
convencionales basados en el sistema de expresión de las células
animales: 1) dado que construir un vector de expresión resulta más
fácil, la expresión del mismo puede comprobarse con facilidad; 2)
es posible producir en serie un anticuerpo a costo reducido debido
a la rápida tasa de desarrollo de E. coli, lo que facilita
contar con muestras de anticuerpos para estudios experimentales; y
3) la aplicación del procedimiento de fermentación relativamente
simple puede dar pie a una comercialización más fácil que la de los
procedimientos que emplean otras células huésped.
Ha habido varios informes de un gen codificante
de anticuerpos introducido en E. coli y expresado en su
interior (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
3273-3277, 1984; y Boss et al., Nucleic Acids
Res. 12: 3791-3806, 1984). Estos informes han dado
a conocer que las moléculas de anticuerpo están expresadas a
diversos rendimientos en un espacio citoplasmático, y también que
puede usarse E. coli como célula huésped para expresar de
forma secretora una cadena ligera de inmunoglobulina
(Zemel-Dreasen et al., Gene
315-322, 1984) o para segregar un fragmento de
anticuerpo fusionado con la secuencia señal de fosfatasa alcalina o
de \beta-lactamasa en un espacio periplasmático
(Pluckthun et al., Cold Spring Harbor Symposia on
Quantitative Biology Volume LII, 105-112, 1987). La
Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/01059 enseña que el
gen codificante de Fab' que reconoce un sitio específico de una
célula cancerosa es expresado en forma de una proteína de fusión
con la secuencia señal de la proteína A (OmpA) de la membrana
exterior de E. coli; y la Patente U.S. Nº 5.648.237 da a
conocer que el gen codificante de Fab' fusionado con la secuencia
señal de enterotoxina de E. coli es expresado bajo el
control de un promotor PhoA.
Un fragmento de anticuerpo expresado muestra una
afinidad de enlace a antígenos similar a la de un anticuerpo de
tipo salvaje; sin embargo, dado que es menor que el tipo salvaje, su
invasividad local es más elevada (Blumenthal et al., Adv.
Drug Del. Rev. 4: 279, 1990) y, dado que no contiene región Fc
alguna, no se induce ningún efecto colateral cuando se administra a
un cuerpo humano. En consecuencia, puede usarse un fragmento de
anticuerpo para preparar un reactivo de diagnóstico o para
desarrollar un anticuerpo terapéutico, y la producción en serio del
mismo en E. coli se vuelve económicamente atractiva. En el
caso de la preparación de un fragmento de anticuerpo a partir de un
anticuerpo de tipo salvaje, el anticuerpo de tipo salvaje debe ser
digerido con una proteinasa y purificado, lo cual es engorroso y
económicamente desfavorable.
Sin embargo, hay varios problemas asociados con
la producción de un fragmento de anticuerpo en E. coli. En
primer lugar, no todos los fragmentos de anticuerpos pueden ser
expresados en cantidad suficiente para los fines terapéuticos o
diagnósticos perseguidos, y a veces es preciso repetir varias veces
el procedimiento de cultivo. Además, para dotar al fragmento del
anticuerpo de actividad funcional, tanto la cadena pesada como la
cadena ligera tienen que estar expresadas en una única célula y
mantener una forma heterocigota por medio de un enlace de bisulfuro
formado entre ellas, lo que requiere que el fragmento del anticuerpo
se exprese en una forma sumamente soluble, y no en forma de un
cuerpo de inclusión, que se encuentra con frecuencia cuando una
proteína se expresa en demasía en E. coli. Para resolver
tales problemas, se ha estudiado de forma activa un procedimiento
para segregar un fragmento de anticuerpo expresado en un espacio
periplasmático usando una secuencia señal. Sin embargo, se ha
informado de que no todos los fragmentos de anticuerpo fusionados
con la secuencia señal son expresados de forma secretora en demasía
en el espacio periplasmático de E. coli, y la cantidad del
anticuerpo expresado varía muchísimo con la secuencia de nucleótidos
de los mismos (Kelly et al., Biochemistry 31:
5434-5441, 1992; and Humphreys et al.,
Protein Expression and Purification 26: 309-320,
2002). También se ha descubierto que el patrón de expresión de un
fragmento fluctúa dependiendo de la diferencia en el gen
estructural del vector de expresión o de la distancia entre los
genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera
(Publicación de la Patente Internacional Nº WO 01/94585). Estos
hechos sugieren que para la expresión de un fragmento de anticuerpo
diana, es preciso que se mantenga un debido equilibrio en términos
de la interacción entre el gen del anticuerpo diana y el gen
estructural del huésped para la expresión y la interacción entre la
diana y las secuencias señal en el caso de que se usen secuencias
señal.
El documento WO 00/15661 y RIPPMANN J.F. ET
AL.: "Procaryotic expression of single-chain
variable-fragment (scFv) antibodies: secretion in
L-form cells of Proteus mirablis leads to
active product and overcomes the limitations of periplasmic
expression in Escherichia coli" APPL. ENVIRON. MICROBIOL.
vol. 64, no. 12, diciembre de 1998, páginas
4862-4869 dan a conocer un péptido señal de la
enterotoxina II de E. coli modificada y una secuencia señal
de la proteína A de la membrana exterior para la secreción de
proteína heteróloga, respectivamente.
El documento WO 03/018771 da a conocer un
procedimiento para producir fragmentos de anticuerpo en células
huésped, incluida E. coli, usando vectores con dos unidades
traslacionales separadas que codifican las cadenas ligera y pesada.
Se usa una secuencia señal para el transporte al periplasma, que
puede proceder de genes, incluidos el OmpA y la enterotoxina II
termoestable.
ANTHONY J ET AL: "PRODUCTION OF STABLE
ANTI-DIGOXIN FV IN
ESCHERICHIA-COLI" MOLECULAR IMMUNOLOGY,
vol. 29, nº 10. 1992, páginas 1237-1247, da a
conocer un sistema bacteriano de
expresión-exportación para expresar el fragmento
(Fv) de región variable de un anticuerpo antidigoxina en E.
coli. El plásmido contiene un promotor T7 y las secuencias
señal de E. coli ompA y phoA (fosfatasa alcalina de E.
coli) fusionadas a secuencias de la región variable de la
cadena pesada (VH) y de la cadena ligera (VL) para generar un
cistrón artificial. Las proteínas VH y VL fueron escindidas en sus
N-terminales maduros y exportadas a periplasma
bacteriano para su purificación.
El documento WO 94/28025 da a conocer
procedimientos para la producción de fragmentos de anticuerpos,
incluyendo Fab, Fab' o (Fab')_{2}, mediante expresión
recombinante en células huésped, incluyendo E. coli y el use
de varias secuencias señal para dirigir las cadenas de anticuerpos a
través de la membrana interior de la célula bacteriana, incluyendo
las de OmpA y la enterotoxina II termoestable de E. coli.
CARTER P ET AL: "HIGH LEVEL
ESCHERICHIA COLI EXPRESSION AND PRODUCTION OF A BIVALENT
HUMANIZED ANTIBODY FRAGMENT" BIO/TECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING
CO. NUEVA YORK, EE. UU., vol. 10, nº 2, febrero de 1992
(1992-02), páginas 163-167, da a
conocer un operón cistrónico para fragmentos de cadena ligera y
pesada bajo el control de un único promotor phoA de E. coli,
que es inducible mediante enrarecimiento de fosfatos. Cada cadena de
anticuerpo es precedida por la secuencia señal de la enterotoxina
II termoestable de E. coli para dirigir la secreción al
espacio periplasmático.
Por lo tanto, los presentes inventores se han
esforzado por desarrollar un procedimiento para expresar en E.
coli un fragmento de anticuerpo en forma heterocigota soluble
dotada de una afinidad deseada en enlace con antígenos preparando
un vector de expresión recombinante que expresa de forma secretora
el anticuerpo humano Fab' del factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-\alpha) como fragmento de anticuerpo diana
usando la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E.
coli o la secuencia señal de la proteína A (OmpA) de la
membrana exterior de E. coli.
En consecuencia, un objeto de la presente
invención es proporcionar un vector de expresión recombinante que
es capaz de expresar en demasía un fragmento de anticuerpo dotado de
una afinidad de enlace a antígenos en forma heterocigota soluble
usando una secuencia señal de E. coli y un microorganismo
transformado con el vector de expresión.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para producir el fragmento de
anticuerpo usando el microorganismo transformado.
Conforme a un aspecto de la presente invención,
se proporciona un vector de expresión recombinante que comprende un
gen que codifica una cadena ligera de un fragmento de anticuerpo
fusionado con una secuencia señal de enterotoxina termoestable de
E. coli y un gen que codifica una cadena pesada del fragmento
de anticuerpo fusionado con una secuencia señal de la proteína A de
la membrana exterior de E. coli, en el que la expresión de
los genes que codifican la cadena ligera y la cadena pesada es
regulada por un único promotor, y el fragmento de anticuerpo
expresado a partir del vector de expresión es segregado a un medio
de cultivo.
Conforme a otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para producir el
fragmento del anticuerpo que comprende los pasos de: a) preparar el
anterior vector de expresión; b) transformar un microorganismo con
el vector de expresión; c) cultivar el microorganismo en un medio; y
d) recoger el fragmento del anticuerpo segregado por el organismo
al medio.
Los objetos y las características anteriores de
la presente invención, y otros, se harán evidentes a partir de la
siguiente descripción de la invención cuando se toma conjuntamente
con los dibujos adjuntos, que, respectivamente, muestran:
Fig. 1: los procedimientos de construcción de
plásmidos pBH y pBL insertando regiones constantes de la cadena
pesada y de la cadena ligera en plásmido pBluescript SK(-),
respectivamente;
Fig. 2: los procedimientos de construcción de
plásmidos pBHC y pBLC insertando regiones variables de la cadena
pesada y de la cadena ligera en los plásmidos pBH y pBL,
respectivamente;
Fig. 3: los procedimientos de construcción del
vector de expresión pmsLC, que comprende promotor T7 y un gen que
codifica la cadena ligera del anticuerpo fusionado con la secuencia
señal de enterotoxina termoestable de E. coli, y del vector
de expresión pmsHC, que comprende promotor T7 y un gen que codifica
la cadena pesada del anticuerpo fusionado con la secuencia señal de
enterotoxina termoestable de E. coli, respectivamente;
Fig. 4: los procedimientos de construcción de
los vectores de expresión dicistrónicos PsDLHF_B y psDLHF_Bp que,
expresan y segregan la cadena larga y la cadena corta,
respectivamente, bajo el control de un único promotor T7;
Fig. 5: el procedimiento de construcción del
vector de expresión poDLHF, que comprende el promotor Tac y genes
que codifican la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo
fusionados con la secuencia señal de la proteína A (OmpA) de la
membrana exterior de E. coli.
Fig. 6: el procedimiento de construcción del
vector de expresión poDLHF_B/S, que expresa y segrega la cadena
pesada y la cadena ligera bajo el control de promotores Tac
diferenciados;
Fig. 7: el procedimiento de construcción del
vector de expresión pmsoDLHF_N/S, en el que un gen que codifica la
cadena ligera del anticuerpo está fusionado con la secuencia señal
de la enterotoxina termoestable de E. coli, y en el que un
gen que codifica la cadena pesada del anticuerpo está fusionado con
la secuencia señal de la proteína A (OmpA) de la membrana exterior
de E. coli, siendo reguladas la expresión y la secreción de
las mismas por un único promotor Tac;
Fig. 8: el procedimiento de construcción del
vector de expresión pmsoDLHF_S/K, en el que un gen que codifica la
cadena ligera del anticuerpo está fusionado con la secuencia señal
de proteínas A (OmpA) de la membrana exterior de E. coli, y
en el que un gen que codifica la cadena pesada del anticuerpo está
fusionado con la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de
E. coli, siendo reguladas la expresión y la secreción de las
mismas por un único promotor Tac;
Fig. 9: el resultado de comparar los patrones de
expresión del antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab'
expresado a partir de E. coli transformante con análisis
SDS-PAGE realizados bajo condiciones reductoras y
no reductoras; y
Fig. 10: el resultado de ELISA para examinar si
el antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab' expresado a partir
de E. coli transformante se enlaza o no al factor de necrosis
tumoral \alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un vector de
expresión recombinante que comprende un gen que codifica una cadena
ligera de un fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia
señal de la enterotoxina termoestable de E. coli, y un gen
que codifica una cadena pesada del fragmento de anticuerpo fusionado
con la secuencia señal de la proteína A (OmpA) de la membrana
exterior de E. coli, en el que la expresión de los genes que
codifican la cadena ligera y la cadena pesada es regulada por un
único promotor, y en el que el fragmento de anticuerpo expresado a
partir del vector de expresión es segregado a un medio de cultivo; y
un microorganismo transformado con el vector de expresión.
El fragmento de anticuerpo de la presente
invención puede ser un fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2} o
scFv, preferiblemente Fab'. El fragmento Fab contiene un dominio
constante de la cadena ligera y un primer dominio constante (CH1)
de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos
Fab por la adición de algunos residuos en el terminal carboxi del
dominio CH1 de la cadena pesada, incluidas una o más cisteínas de
una región bisagra del anticuerpo. Además, el fragmento
F(ab')_{2} se obtiene enlazando dos moléculas Fab' con un
enlace de bisulfuro, y el fragmento scFv existe como una única
cadena polipeptídica formada acoplando únicamente regiones
variables de la cadena ligera y de la cadena pesada con un ligador
de péptidos.
El fragmento de anticuerpo empleable en la
presente invención incluye todos los anticuerpos capaces de
enlazarse selectivamente a un antígeno, en el que el antígeno puede
ser un antígeno enlazado a la superficie de una célula, como una
célula T, una célula endotelial, o a un marcador de célula
cancerosa, o un antígeno soluble libre que no se enlace con una
célula. Los antígenos enlazados a una superficie celular pueden
incluir, pero sin limitación, integrinas \beta1,
P-selectina, E-selectina, CD2, CD3,
CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25,
CD33, CD38, CD40, CD45, CD69, MHC clase II, VEGF y otros receptores.
Además, los antígenos solubles pueden incluir, pero sin limitación,
interleucinas como IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 e
IL-12; antígenos víricos como el antígeno de
citomegalovirus; las inmunoglobulinas, como la IgE; los
interferones, como los IFN-\alpha, \beta y
\gamma; los factores relativos al crecimiento y la proliferación
celulares, como los factores \alpha y \beta de necrosis
tumoral, y los factores \alpha y \beta de crecimiento derivados
de plaquetas. En una realización preferida, la presente invención
emplea genes que codifican la cadena ligera y la cadena pesada del
fragmento de anticuerpo del antifactor de necrosis tumoral \alpha
(TNF-\alpha). Se sabe que el
TNF-\alpha induce las síntesis de
IL-1, IL-6 e IL-8,
que son conocidas como citoquinas generadas por las células
relacionadas con el sistema inmunológico, como los monocitos o los
macrófagos, y que causa inflamación cuando se expresa en demasía, y
estimula la secreción de la proteinasa que destruye el tejido
cartilaginoso, actuando así como mediador clave causante de la
artritis. El Fab' del antifactor de necrosis tumoral \alpha como
elemento terapéutico de la artritis tiene que derivarse de un
anticuerpo monoclonal, preferiblemente de un anticuerpo humanizado,
más preferiblemente de un anticuerpo humano completo.
Ya se han presentado informes sobre genes que
codifican regiones determinantes complementarias (CDR) de varios
anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados del, y se ha
determinado la secuencia de nucleótidos de un gen de anticuerpo
humano completo (Patente Internacional Nº WO 97/29131). En
consecuencia, es posible sintetizar artificialmente un gen que
codifique el fragmento de anticuerpo basado en tal información
usando un sintetizador de nucleótidos y clonar los genes
sintetizados que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de
Fab mediante una serie de procedimientos de emparejamiento y de
ligadura, o de reacción de ligadura en cadena (RLC) y de reacción
de polimerasa en cadena (RPC).
En una realización preferida, la presente
invención prepara las regiones variables de la cadena ligera y de
la cadena pesada sintetizando los fragmentos de los genes que
codifican la región variable de la cadena ligera del antifactor de
necrosis tumoral \alpha Fab' humano que contienen las secuencias
de nucleótidos con ID SEC N^{os} 1 a 6, y los fragmentos de los
genes que codifican la región variable de la cadena pesada que
contienen las secuencias de nucleótidos con ID SEC N^{os} 7 a 12
usando un sintetizador de nucleótidos y ligando entre sí estos
fragmentos sintetizados mediante RPC. Además, el fragmento de gen
que comprende la región constante de la cadena ligera y la región
constante de la cadena pesada, incluidos CH1 y la región bisagra de
IgGI, se prepara mediante RPC-TI usando como
plantilla un ARN total extraído de la sangre humana y un par de
cebadores específicos para las regiones constantes de la cadena
ligera y de la cadena pesada del antifactor de necrosis tumoral
\alpha Fab' humano. Cada uno de los fragmentos preparados de gen
que codifican las regiones constantes de la cadena ligera y de la
cadena pesada es clonado en el debido vector de expresión para
preparar el plásmido PBL, que comprende el gen que codifica la
región constante de la cadena ligera, al igual que el plásmido
pBHC, que comprende el gen que codifica la región constante de la
cadena pesada (véanse las Figuras 1 y 2). Como consecuencia del
análisis de secuenciación de nucleótidos, se ha encontrado que el
gen que codifica la región constante de la cadena ligera insertado
en el plásmido pBLC tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº
32, y que el gen que codifica la región constante de la cadena
pesada insertado en el plásmido pBHC tiene la secuencia de
nucleótidos de ID SEC Nº 33.
El fragmento de anticuerpo que debe expresarse
puede existir como heterocigoto dotado de dos proteínas diferentes
consistentes en la cadena pesada y la cadena ligera. En
consecuencia, para preparar el fragmento de anticuerpo como
heterocigoto activo dotado de afinidad de enlace a antígenos, la
cadena pesada y la cadena ligera deben ser expresadas
simultáneamente con un nivel similar, y tiene que formarse un enlace
de bisulfuro en un sitio preciso entre la cadena pesada y la cadena
ligera expresadas a partir del vector de expresión. Además, cuando
el fragmento de anticuerpo es expresado en E. coli, la
proteína expresada en un citoplasma puede existir en forma de
cuerpo de inclusión. En este caso, sucede que el enlace de bisulfuro
entre la cadena pesada y la cadena ligera puede no formarse en un
sitio preciso, y aunque se exprese en forma soluble, puede resultar
difícil destruir completamente las células durante el paso de
purificación. Para resolver estos problemas, la presente invención
proporciona un vector de expresión recombinante que segrega el
fragmento de anticuerpo expresado a partir del vector a un espacio
periplasmático de E. coli en un medio de cultivo usando
secuencia señal de E. coli.
Cuando la proteína expresada existe en el medio
de cultivo, no hay necesidad de llevar a cabo el engorroso proceso
de destruir las células, como se requiere cuando la proteína expresa
existe dentro de las células bacterianas. Además, dado que la
proteína expresada existe en el espacio periplasmático, puede ser
recogida sin pasar por un procedimiento como el tratamiento por
choque osmótico tras la recogida de las células. Además, dado que
un entorno oxidativo facilita la formación de un enlace de bisulfuro
para dar un heterocigoto, resulta ventajoso que la proteína
expresada exista en el espacio periplasmático o en el medio de
cultivo más que en el entorno no oxidativo del citoplasma
celular.
En una realización preferida de la presente
invención, la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de
E. coli usada para segregar los fragmentos Fab' de anticuerpo
activos expresados a partir del vector de expresión en un medio de
cultivo ha sido desarrollada por los presentes inventores para
expresar varias proteínas foráneas en E. coli. Se ha hallado
que la secuencia señal derivada de la enterotoxina termoestable de
E. coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 17 y
que es capaz de expresar y segregar diversas proteínas foráneas en
E. coli con una eficiencia óptima (Patente coreana Nº
316347). En la presente invención, un vector de expresión
recombinante que puede segregar una forma activa de Fab' expresada a
partir de un vector de expresión en un medio de cultivo se prepara
fusionando los genes la cadena ligera y la cadena pesada de un
fragmento de anticuerpo con la secuencia señal de la enterotoxina
termoestable de E. coli y con la secuencia señal de la
proteína A de la membrana exterior, respectivamente.
Para expresar los genes que codifican la cadena
pesada y la cadena ligera de un fragmento de anticuerpo en un
vector de expresión, la presente solicitud proporciona dos tipos de
vector de expresión: el vector de expresión que usa un sistema
dicistrónico que puede expresar simultáneamente dos proteínas
disponiendo los genes en los debidos intervalos bajo un único
promotor, y usando el otro vector de expresión un sistema de
promotor dual que puede expresar independientemente dos proteínas
emparejando los genes con los promotores respectivos.
En primer lugar, un fragmento de gen que
codifica la hormona humana del crecimiento (hGH) es eliminado del
vector de expresión pT14SISH-4T20V22Q (Patente
coreana Nº 316347), que comprende la secuencia señal de la
enterotoxina termoestable de E. coli y el gen hGH. El
fragmento de gen que codifica la cadena ligera obtenida del
plásmido pBLC y el fragmento de gen que codifica la cadena pesada
obtenida del plásmido pBHC son insertados en el vector de expresión
pT14SISH-4T20V22Q para obtener el vector de
expresión pmsHC, que comprende el fragmento de gen que codifica la
cadena pesada fusionado con la secuencia señal derivada de la
enterotoxina termoestable, y el vector de expresión pmsLC, que
comprende el fragmento de gen que codifica la cadena ligera
fusionado con la secuencia señal derivada de la enterotoxina
termoestable. Para construir un vector de expresión dicistrónico
para que cada uno de los genes que codifican la cadena pesada y la
cadena ligera se fusione con la secuencia derivada de la secreción
de la enterotoxina termoestable de E. coli, y para que un
único promotor regule la expresión de los genes que codifican la
cadena ligera y la cadena pesada, el fragmento de gen que codifica
la cadena pesada obtenida a partir del plásmido pmsHC mediante RPC
es insertado en el plásmido pmsLC para obtener los vectores de
expresión psDLHF_B y psDLHF_Bp (véanse las Figuras 3 y 4).
Además, la presente solicitud ha construido el
vector de expresión poDLHF de modo que cada uno de los genes que
codifican la cadena ligera y la cadena pesada está fusionado con la
secuencia señal OmpA de E. coli (ID SEC Nº 24) y un único
promotor Tac regula la expresión de los genes que codifican la
cadena ligera y la cadena pesada (véase la Fig. 5) mediante el
mismo procedimiento descrito más arriba.
Los vectores de expresión psDLHF_B, psDIHF_Bp y
poDLHF así preparados son vectores de expresión bicistrónicos; cada
una de las cadenas pesada y ligera del antifactor de necrosis
tumoral \alpha Fab' fusionadas con la secuencia señal es
expresada y segregada bajo el control de un único promotor. Los
transformantes BL21 (DE3)/psDLHF_B (HM10920),
BL21(DE3)/psDLHF_BP(HM10921) y
BL21/poDLHF(HM10922) de E. coli, preparados
transformando cada uno de los vectores de expresión anteriores en
E. coli BL21 (DE3), se depositaron en el Centro Coreano de
Cultivos de Microorganismos el 2 de octubre de 2003 con los números
de acceso KCCM-10509, KCCM-10510 y
KCCM-10511, respectivamente, en conformidad con los
términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del
Procedimiento de Patentes.
En el caso de la expresión de forma secretora de
dos proteínas diferentes bajo el control de un único promotor, como
se ha mencionado más arriba, la eficiencia de la expresión del gen
más próximo al promotor puede diferir de la del gen más alejado
(Humphreys et al., Protein Expression and Purification 26:
309-320, 2002).
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un vector de expresión que usa un sistema de promotores duales para
que la expresión y la secreción de la cadena pesada y de la cadena
ligera del antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab' puedan
regularse de manera independiente por promotores diferenciados. En
una realización preferida, la presente invención ha preparado el
vector de expresión poDLHF_B/S de modo que cada uno de los genes
que codifican la cadena pesada y la ligera del antifactor de
necrosis tumoral \alpha Fab' esté fusionado con la secuencia
señal OmpA, y de modo que los respectivos promotores Tac regulen la
expresión de los genes que codifican la cadena ligera y la cadena
pesada (véase la Fig. 6). El E. coli
BL21/poDLHF_B/S(HIVI10923) transformante, preparado
transformando el vector expresión poDLHF_B/S en E. coli BL21,
fue depositado en el Centro Coreano de Cultivos de Microorganismos
el 2 de octubre de 2003 con el número de acceso
KCCM-10512, en conformidad con los términos del
Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del
Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de
Patentes.
La formación de un heterocigoto como un
fragmento de anticuerpo se ve inhibida cuando uno de los dos
fragmentos del heterocigoto se expresa en demasía; en consecuencia,
los dos fragmentos de proteína deben ser expresados a niveles
similares. Así, la presente invención proporciona una vector de
expresión recombinante que puede expresar de forma secretora un
fragmento de anticuerpo fusionando cada uno de los genes que
codifican la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente, con
diferentes secuencias señal. En una realización preferida de la
presente invención, el vector de expresión pmsoDLHF_N/S está
construido de tal modo que el gen que codifica la cadena ligera del
antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab' esté fusionado con la
secuencia señal derivada de la enterotoxina termoestable, que el
gen que codifica la cadena pesada del mismo esté fusionado con la
secuencia señal OmpA y que un único promotor T7 regule la expresión
de los genes que codifican la cadena ligera y la pesada (véase la
Fig. 7). Además, en la presente invención, el vector de expresión
pmsoDLHF_S/K está construido de tal modo que el gen que codifica la
cadena pesada está fusionado con la secuencia señal derivada de la
enterotoxina termoestable, que el gen que codifica la cadena ligera
esté fusionado con la secuencia señal OmpA y que un único promotor
Tac regule la expresión de los genes que codifican la cadena ligera
y la pesada (véase la Fig. 8). Los transformantes
BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924) y
BL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925) de E. coli, preparados
introduciendo cada uno de los vectores de expresión pmsoDLHF_N/S y
pmsoDLHF_S/K en E. coli BL21, se depositaron en el Centro
Coreano de Cultivos de Microorganismos el 2 de octubre de 2003 con
los números de acceso KCCM-10513 y
KCCM-10516, respectivamente, en conformidad con los
términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del
Procedimiento de Patentes.
La presente invención proporciona un
microorganismo recombinante preparado introduciendo el vector
inventivo de expresión recombinante así construido en una célula
huésped apropiada. Las células huésped empleables en la presente
invención pueden incluir, sin limitaciones, E. coli W3110,
RV308, BL21, BL21(DE3), etcétera, preferiblemente E.
coli BL21. En el caso del cultivo del microorganismo
recombinante transformado con el vector de expresión a
concentración elevada usando un fermentador (OD600=120 a 150), se ha
hallado que el fragmento de anticuerpo del antifactor de necrosis
tumoral \alpha es producido de manera secretora en el medio de
cultivo con una producción elevada de más de 100 a 500 mg por 1 l de
medio de cultivo (véase la Tabla 1). El fragmento de anticuerpo del
antifactor de necrosis tumoral \alpha así producido en serie puede
ser parcialmente purificado con una columna de afinidad con
proteína G. Los análisis SDS-PAGE reductores y no
reductores del fragmento de anticuerpo purificado del antifactor de
necrosis tumoral \alpha han demostrado que el fragmento de
anticuerpo es producido en forma de heterocigoto soluble (véase la
Fig. 9). Además, el análisis ELISA que usa el antifactor de
necrosis tumoral \alpha como antígeno de enlace ha revelado que
el fragmento de anticuerpo del factor de necrosis tumoral \alpha
tiene buena afinidad de enlace con el antígeno del antifactor de
necrosis tumoral \alpha (véase la Fig. 10).
La presente invención proporciona además un
procedimiento para producir un fragmento de anticuerpo que comprende
los pasos de: preparar un vector de expresión que comprende un gen
que codifica una cadena ligera del fragmento de anticuerpo
fusionado con la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de
E. coli, y un gen que codifica una cadena pesada del
fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal OmpA de
E. coli, en el que la expresión de los genes que codifican
la cadena ligera y la cadena pesada es regulada por un único
promotor; transformar un microorganismo con el vector de expresión;
cultivar el microorganismo en un medio; y recoger el fragmento de
anticuerpo segregado por el microorganismo en el medio.
Las secuencias señal de E. coli
empleables en el vector inventivo de expresión recombinante pueden
incluir, preferiblemente, la secuencia señal de la enterotoxina
termoestable de E. coli, que tiene la secuencia de
nucleótidos de ID SEC Nº 17, o la secuencia señal OmpA, que tiene la
secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 24.
Una vez que el microorganismo transformado con
el vector de expresión recombinante sea sometido a precultivo en un
medio apropiado, la solución del precultivo es inoculada en un
fermentador y sometida al cultivo propiamente dicho en condiciones
aerobias a una temperatura que oscila entre 30 y 35ºC. Cuando el
valor OD a 600 nm alcanza 80, se añade un inductor al fermentador
para inducir una expresión del fragmento de anticuerpo diana.
Preferiblemente, el inductor empleable en la presente invención es,
sin limitación, IPTG. El cultivo se lleva a cabo además durante
entre 40 y 45 horas hasta que el valor OD a 600 nm alcance el
intervalo de 120 a 140. Una vez que la solución del cultivo haya
sido sometida a centrifugación para separar un sobrenadante, el
sobrenadante es sometido a cromatografía de columna de afinidad
para purificar el fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, los
microorganismos transformantes pueden incluir, sin limitación, E.
coli BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920)
(KCCM-10509), BL21(DE3)/
psDLHF_BP(HM10921) (KCCM-10510), BL21/poDLHF
(HM10922) (KCCM-10511), BL21/poDLHF_B/S (HM10923)
(KCCM-10512), BL21/pmsoDLHF_N/S (HM10924)
(KCCM-10513) o BL21/pmsoDLHF_S/
K(HM10925) (KCCM-10516).
K(HM10925) (KCCM-10516).
Al ser segregado el fragmento de anticuerpo
expresado conforme al procedimiento inventivo en el espacio
periplasmático de la célula huésped o en el medio de cultivo, el
fragmento de anticuerpo puede ser recogido sin atravesar pasos como
el tratamiento por choque osmótico.
El fragmento de anticuerpo diana que puede ser
expresado por el procedimiento inventivo, preferiblemente Fab,
Fab', F(ab')_{2} o scFv, no está limitado al fragmento de
anticuerpo del antifactor de necrosis tumoral \alpha y, en
consecuencia, el procedimiento inventivo puede ser aplicado a la
producción de cualquier fragmento de anticuerpo usado para el
diagnóstico o el tratamiento, por ejemplo, teniendo el fragmento de
anticuerpo efecto anticancerígeno, o siendo el fragmento de
anticuerpo contra varias citoquinas dañino para el cuerpo humano
cuando se expresa en demasía.
Como se ha afirmado más arriba, el vector de
expresión recombinante de la presente invención, que comprende la
secuencia señal derivada de la enterotoxina termoestable de E.
coli y la secuencia señal de la proteína A de la membrana
exterior de E. coli, puede expresar el fragmento de
anticuerpo en forma de heterocigoto soluble dotado de afinidad de
enlace con los antígenos, y el microorganismo transformado con el
vector de expresión puede segregar el fragmento de anticuerpo en el
espacio periplasmático de la célula huésped o en el medio de
cultivo, y, por lo tanto, el fragmento de anticuerpo expresado puede
ser recolectado fácilmente de una manera adecuada para la
producción en serie. En consecuencia, puede ser usado de manera
efectiva para la preparación de un reactivo de diagnóstico o de un
anticuerpo terapéutico.
La presente invención es definida adicionalmente
en los siguientes Ejemplos. Debiera entenderse que, aunque indican
realizaciones preferidas de la invención, estos Ejemplos se dan
únicamente a título de ilustración.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron regiones variables de una cadena
pesada y de una cadena ligera del antifactor de necrosis tumoral
\alpha Fab' usando un sintetizador de nucleótidos, con referencia
a las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en la Patente
Internacional Nº WO97/29131. Los fragmentos de gen para clonar la
región variable de la cadena ligera tenían las secuencias de
nucleótidos de ID SEC N^{os} 1 a 6, y los fragmentos de gen para
clonar la región variable de la cadena pesada tenían las secuencias
de nucleótidos de ID SEC N^{os} 7 a 12. Para facilitar el
procedimiento de clonado subsiguiente, se insertaron sitios de
reconocimiento en las enzimas de restricción HindIII y Pvul en el
primer fragmento de gen de cada uno de los genes que codifican la
cadena ligera y la cadena pesada (es decir, los de ID SEC N^{os} 1
y 7), respectivamente. Cada uno de los fragmentos de gen
sintetizados de la cadena ligera y de la cadena pesada se mezcló en
un único tubo y se cometió a una RPC convencional para enlazarlos
en una secuencia de genes, respectivamente, para obtener los genes
que codifican las regiones variables de la cadena ligera y de la
cadena pesada. En esta reacción RPC, cada uno de los fragmentos de
gen podía actuar como cebador, al igual que como plantilla, y, en
consecuencia, se emparejaban entre sí para formar un fragmento de
gen que tenía el tamaño de aproximadamente 320 mer. La mezcla de la
reacción RPC se preparó mezclando 100 pmoles de cada uno de los
fragmentos de gen, 5 \mul de una mezcla de dNTP de 2 mM, 2,5
unidades de pfu ADN polimerasa (Stratagen) y 5 \mul de un tampón
de reacción (100 mM de Tris-HCl) [pH 8,3], 15 mM de
MgCl_{2}, 500 mM de KC1) y ajustando su volumen final a 50 \mul
con agua destilada. La RPC fue llevada a cabo bajo la condición de
30 ciclos de 60 segundos a 94ºC, 60 segundos a 60ºC, y 60 segundos
a 72ºC tras la desnaturalización inicial de 5 min a 94ºC usando un
termociclador de ADN
(Perking-Elmer).
(Perking-Elmer).
Para clonar un gen que codifica una región
constante de cadena ligera y un gen que codifica una región
constante de cadena pesada que comprende IgGI CH1 y una región
bisagra del antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab' humano, se
extrajo ARN de células corpusculares sanguíneas humanas y se sometió
a RPC-TI. Se extrajo ARN total de aproximadamente 6
ml de sangre usando un kit sanguíneo de ARN Qiamp (Qiagen) y
se usó como plantilla en la RPC-TI. Cada uno de los
genes que codifica las regiones constantes de la cadena pesada y de
la cadena ligera fue amplificado con el kit
RPC-TI (RT-PCR en inglés) de un paso
(Qiagen) usando el primer par de ID SEC N^{os} 13 y 14 para la
amplificación de la cadena pesada, y el primer par de ID SEC
N^{os} 15 y 16 para la amplificación de la cadena ligera. En ese
momento, para facilitar el subsiguiente procedimiento de clonación,
se insertaron sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción
HindIII y StuI en el cebador 5' de cadena pesada de ID SEC Nº 26,
un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BamHI,
incluyendo un codón de terminación, en el cebador 3' de cadena
pesada de ID SEC Nº 27; sitios de reconocimiento de las enzimas de
restricción HindIII y Nrul en el cebador 5' de cadena ligera de ID
SEC Nº 28, y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción
BamHI, incluyendo un codón de terminación, en el cebador 3' de
cadena ligera de ID SEC Nº 29. Los productos de RPC que codifican
las regiones constantes de la cadena pesada y de la cadena ligera
fueron digeridos con HindIII y BamHI, respectivamente, e insertados
en plásmido pBluescript SK(-) (Stratagen) pretratado con las mismas
enzimas, para preparar los plásmidos pBH y pBL (Fig. 1). Se halló
mediante análisis de secuenciación de ADN que las regiones
constantes de la cadena pesada y la cadena ligera se insertaban de
manera precisa en los plásmidos pBH y pBL, respectivamente.
Para enlazar las regiones variables de la cadena
pesada y la cadena ligera con las regiones constantes
correspondientes, cada región variable de la cadena pesada y de la
cadena ligera así sintetizadas mediante RPC fue digerida con
HindIII. La región variable de la cadena pesada tratada con enzimas
fue insertada en plásmido pBH pretratado con HindIII/StuI, y la
región variable de la cadena ligera tratada con enzimas fue
insertada en plásmido pBL pretratado con HindIII/NruI, para
construir los plásmidos pBHC y pBLC, respectivamente, en los que
cada una de las regiones variables de de la cadena pesada y de la
cadena ligera fue enlazado a las regiones constantes
correspondientes (Fig. 2). La cadena pesada y la cadena ligera
insertadas en los plásmidos pBHC y pBLC tenían las secuencias de
nucleótidos de ID SEC N^{os} 32 y 33, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para construir un vector de expresión usando la
secuencia señal derivada de la enterotoxina termoestable de E.
coli, se empleó el vector de expresión
pT14S1SH-4T20V22Q (Patente coreana Nº 316347) que
expresa la hormona humana del crecimiento (hGH). El vector de
expresión contenía una secuencia señal deriva de enterotoxina
termoestable que tenía la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 17.
Para eliminar el gen hGH del vector de expresión e insertar en el
mismo sitio el fragmento de gen que codifica la cadena pesada y la
cadena ligera preparado en el Ejemplo 1, se insertó un sitio de
reconocimiento de la enzima de restricción de StuI en el sitio de
fusión entre la secuencia señal derivada de la enterotoxina
termoestable y el gen hGH del plásmido
pT14S1SH-4T20V22Q por la mutagénesis dirigida al
sitio usando una pareja de cebadores de ID SEC N^{os} 18 y 19. Se
encontró a partir del resultado del análisis de secuenciación que se
generó con éxito el sitio de reconocimiento StuI en el sitio diana.
El plásmido que tenía el sitio de reconocimiento StuI dentro del
plásmido pT14S1SH-4T20V22Q fue designado como
pmSTII.
Una vez que el plásmido pmSTII fue tratado con
StuI/BamHI y sometido a electroforesis en gel de agarosa, se
escindió del gel un fragmento grande (4,7 kb) que contenía la
secuencia señal derivada de la enterotoxina termoestable de E.
coli con la eliminación del hGH. Después de que el plásmido pBLC
que tenía el fragmento de gen que tenía la cadena ligera preparada
en el Ejemplo 1 fue tratado con PuvI, sus dos extremos fueron
tratados con T4 ADN polimerasa para obtener extremos romos. El
plásmido resultante fue tratado con BamHI y se recuperó el
fragmento de gen que codificaba la cadena ligera, que tenía un
tamaño de aproximadamente 720 bp. Además, se llevó a cabo RPC
usando el plásmido pBHC, que contenía el fragmento de gen que
codificaba la cadena pesada como plantilla y una pareja de
cebadores de ID SEC N^{os} 1 y 20. El producto de la RPC así
amplificado fue tratado con las mismas enzimas usadas en la
preparación del fragmento de gen que codificaba la cadena ligera
para recuperar el fragmento de gen que codificaba la cadena pesada y
que tenía un tamaño de aproximadamente 700 bp. Dado que se designó
al cebador de ID SEC Nº 20 para su inserción en la secuencia
aminoácida del codón de terminación EPKSCDKTHTCAA, la secuencia
bisagra modificada que comprende parte de la región bisagra de la
cadena pesada, en el fragmento de gen que codificaba la cadena
pesada, y contenía un sitio de reconocimiento de la enzima de
restricción BamHI, podía usarse de forma efectiva para la
construcción del vector de expresión Fab' en el procedimiento
siguiente. Cada uno de los fragmentos de genes que codificaban la
cadena pesada y la cadena ligera así preparados fue insertado en el
fragmento del plásmido pmSTII para construir el plásmido pmsHC, que
comprendía el fragmento de gen que codificaba la cadena pesada
fusionado con la secuencia señal derivada de la enterotoxina
termoestable, al igual que el plásmido pmsLC, que comprendía el
fragmento de gen que codificaba la cadena ligera fusionado con la
secuencia señal derivada de la enterotoxina termoestable (Fig.
3).
Para construir un vector de expresión
dicistrónico de modo que la cadena pesada y la cadena ligera puedan
ser expresadas y segregadas bajo el control de un único promotor, se
llevó a cabo RPC usando plásmido pmsHC que comprendía el fragmento
de gen que codificaba la cadena pesada fusionada con la secuencia
señal derivada de la enterotoxina termoestable como plantilla y dos
parejas de cebadores de ID SEC N^{os} 21 y 20 e ID SEC N^{os}
22 y 23. El cebador 5' de ID SEC Nº 21 fue designado para iniciar la
RPC a partir de la secuencia Shine-Dalgarno (SD)
necesaria para la expresión del fragmento de gen que codificaba la
cadena pesada, y también contenía un sitio de reconocimiento BamHI
para clonar con facilidad el producto amplificado. Además, la pareja
de cebadores de ID SEC N^{os} 22 y 23, tenía las mismas
secuencias de nucleótidos de la pareja de ID SEC N^{os} 21 y 20,
salvo en que contenía un sitio de reconocimiento de la enzima de
restricción BpuI, no el sitio de reconocimiento BamHI, para cambiar
el sitio de clonación. Los fragmentos de gen que codifican la
cadena pesada amplificados con cada una de las parejas de cebadores
(una comprendiendo el sitio de reconocimiento BamHI, y
comprendiendo la otra el sitio de reconocimiento BpuI) fueron
tratados con BamHI y BpuI, respectivamente.
Los sitios de reconocimiento de BamHI y BpuI en
el plásmido pmsLC, que comprende la fragmento de gen que codifica
la cadena ligera fusionado con la secuencia señal derivada de la
enterotoxina termoestable, se localizaban corriente abajo del codón
de terminación de la cadena ligera, están situado el sitio de
reconocimiento BpuI 60 nucleótidos más corriente abajo que el sitio
de reconocimiento BamHI. Una vez que el plásmido pmsLC fue tratado
con BamHI y BpuI, fue insertado en el mismo el fragmento de gen que
codificaba la cadena pesada tratado con BamHI o BpuI. El vector de
expresión Fab' que comprendía el fragmento de gen de cadena pesada
insertado en el sitio de reconocimiento BamHI del plásmido pmsLC
fue designado psDLHF_B, y el vector de expresión Fab' que
comprendía el fragmento de gen de cadena pesada insertado en el
sitio de reconocimiento BpuI del plásmido pmsLC fue designado
psDLHF_Bp (Fig. 4). En estos vectores de expresión, cada uno de los
genes codifica la cadena pesada y la cadena ligera con la secuencia
señal de la enterotoxina termoestable de E. coli, y un único
promotor T7 regula la expresión de los genes que codifican la cadena
ligera y la cadena pesada. Se transformó E. coli
BL21(DE3) con cada uno de los vectores de expresión para
preparar los transformantes
BL21(DE3)/psDLHF_B(HM10920) y BL21(DE3)/psDLHF_
BP(HIVI10921) de E. coli, respectivamente, y los
transformantes E. coli se depositaron en el Centro Coreano
de Cultivos de Microorganismos el 2 de octubre de 2003 con los
números de acceso KCCM-10509 y
KCCM-10510.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó como sigue un vector de expresión
que expresaba de forma secretora los genes que codifican la cadena
pesada y la cadena ligera del antifactor de necrosis tumoral
\alpha usando la secuencia señal OmpA de E. coli.
Se trató con HindIII el plásmido pFlag.CTS
(Eastman Chemical Company), que contenía promotor Tac y secuencia
señal OmpA, y el sitio de reconocimiento HindIII del plásmido se
trató con Klenow ADN polimerasa (NEB, New England Biolab, EE. UU.)
para obtener un extremo romo, que fue tratado con BglII para
construir un fragmento de vector dotado de un extremo 5' romo y de
un extremo 3' cohesivo. Además, para enlazar cada uno de los genes
que codifican la cadena pesada y la cadena ligera con la secuencia
señal OmpA, se llevó a cabo RPC usando plásmido pBHC que comprendía
el fragmento de gen que codificaba la cadena pesada como plantilla y
una pareja de cebadores de ID SEC N^{os} 25 y 26 para amplificar
el producto de la RPC que comprendía la región variable y la región
constante de la cadena pesada, una región bisagra modificada y un
codón de terminación. En ese momento, el cebador de ID SEC Nº 26,
correspondiente al extremo 3', fue designado para incluir un sitio
insertado de reconocimiento de la enzima de restricción BglII. El
fragmento de gen amplificado que codificaba la cadena pesada fue
tratado con BglII, y el fragmento resultante fue insertado en el
plásmido pFlag.CTS pretratado con BglII para construir el plásmido
poHC, que comprendía el fragmento de gen que codificaba la cadena
pesada fusionada con la secuencia señal OmpA. Conforme al mismo
procedimiento descrito más arriba, se llevó a cabo RPC usando
plásmido pBLC que comprendía el fragmento de gen que codificaba la
cadena ligera como plantilla y una pareja de cebadores de ID SEC
N^{os} 27 y 28; el producto de la RPC así amplificado fue sometido
al mismo tratamiento de enzimas e insertado en el plásmido
pFlag.CTS para construir el plásmido poLC, que comprendía el
fragmento de gen que codificaba la cadena ligera fusionada con la
secuencia señal OmpA
Para construir un vector de expresión
dicistrónico de modo que cada uno de los genes que codifican la
cadena pesada y la cadena ligera fusionados con las respectivas
secuencias señal OmpA pueda ser expresado y segregado bajo el
control de un único promotor Tac, se llevó a cabo RPC usando el
plásmido poHC como plantilla y una pareja de cebadores de ID SEC
N^{os} 29 y 30. El producto de la RPC así amplificado tenía el
sitio de reconocimiento SalI a ambos extremos, la secuencia
Shine-Dalgano necesaria para la expresión de la
cadena pesada, salvo una región promotora y la secuencia señal
OmpA. Después de que el producto de la RPC fue tratado con SalI, el
fragmento de gen recuperado fue insertado en el plásmido poLC
pretratado con la misma enzima para construir el vector de
expresión poDLHF que expresa el gen Fab' (Fig. 5). Se transformó
E. coli BL21 con el vector de expresión poDLHF para preparar
E. coli BL21/poDLHF(HM10922) transformante, y
el E. coli transformante fue depositado en el Centro Coreano
de Cultivos de Microorganismos el 2 de octubre de 2003 con el número
de acceso KCCM-10511.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó como sigue un vector de expresión
dotado de un sistema promotor dual que puede expresar y segregar la
cadena pesada y la cadena ligera del antifactor de necrosis tumoral
\alpha Fab' bajo el control de promotores independientes,
respectivamente. Se trató con BamHI y SalI el plásmido poHC del
Ejemplo <2-2>, que comprendía el fragmento de
gen que codificaba la cadena pesada del antifactor de necrosis
tumoral \alpha Fab' fusionado con la secuencia señal OmpA. El
plásmido tratado con enzimas fue sometido a electroforesis en gel de
agarosa, y se escindió del gel un fragmento menor (1,2 kb) que
comprendía el fragmento de gen que codificaba la cadena pesada del
antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab', el promotor Tac y la
secuencia señal OmpA. Ambos extremos del fragmento fueron tratados
con Klenow ADN polimerasa para obtener extremos romos. Además, el
plásmido poLC del Ejemplo <2-2>, que
comprendía el fragmento de gen que codificaba la cadena ligera del
antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab', fue tratado con SalI
y, después, ambos extremos fueron hechos romos también mediante el
mismo procedimiento. El fragmento de gen que codificaba la cadena
pesada fue insertado entonces en el mismo para construir el vector
de expresión poDLHF_B/S, que expresaba y segregaba cada uno de los
genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera fusionados
de manera independiente con la secuencia señal OmpA bajo el control
del promotor Tac (Fig. 6). Se transformó E. coli BL21 con el
vector de expresión poDLHF_B/S para preparar E. coli
BL21/poDLHF_B/S(HM10923) transformante, y el E. coli
transformante fue depositado en el Centro Coreano de Cultivos de
Microorganismos el 2 de octubre de 2003 con el número de acceso
KCCM-10512.
\vskip1.000000\baselineskip
<2-4-1>
Se construyó como sigue un vector de expresión
dotado del gen que codifica la cadena ligera del antifactor de
necrosis tumoral \alpha Fab' fusionado con la secuencia señal
derivada de la enterotoxina termoestable y del gen que codifica la
cadena pesada fusionado con la secuencia señal OmpA, estando
reguladas la expresión y la secreción del mismo mediante un único
promotor.
Una vez que el vector de expresión poDLHF del
Ejemplo <2-2>, que expresaba cada uno de los
genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera fusionados
con la secuencia señal OmpA bajo el control de un único promotor
Tac, fue tratado con NdeI y SacI, el vector resultante fue sometido
a electroforesis en gel de agarosa, y se escindió del gel un
fragmento mayor (6,6 kb). El sitio de reconocimiento NdeI se
encontraba en el primer aminoácido, la metionina, de la secuencia
señal OmpA, y el sitio de reconocimiento SacI se encontraba en la
región constante de la cadena ligera. En consecuencia, cuando el
vector de expresión fue tratado con NdeI y SacI, se obtuvo un
fragmento de gen que no tenía ninguna secuencia señal OmpA, sino
toda la región variable de la cadena ligera y una parte de la
región constante de la cadena ligera.
Se llevó a cabo RPC usando el plásmido pmsLC que
comprendía el fragmento de gen que codificaba la cadena pesada
fusionado con la secuencia señal derivada de la enterotoxina
termoestable como plantilla y una pareja de cebadores de ID SEC
N^{os} 31 y 20. El cebador 5' de ID SEC Nº 31 tenía un sitio de
reconocimiento Ndel enlazado al primer aminoácido de la secuencia
señal de la enterotoxina termoestable, y el cebador 3' de ID SEC Nº
20 tenía un sitio de reconocimiento Sacl. El producto de la RPC así
amplificado fue tratado con NdeI y SacI, y fue insertado en el
plásmido poDLHF, que tenía la región eliminada de la cadena ligera,
para construir el vector de expresión pmsoDLHF_N/S (Fig. 7). Se
transformó E. coli BL21 con el vector de expresión
pmsoDLHF_N/S para preparar E. coli
BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924) transformante, y el E. coli
transformante fue depositado en el Centro Coreano de Cultivos de
Microorganismos el 2 de octubre de 2003 con el número de acceso
KCCM-10513.
<2-4-2>
A diferencia del vector de expresión preparado
en el Ejemplo <2-4-1>, se
construyó como sigue un vector de expresión dotado del gen que
codifica la cadena pesada del antifactor de necrosis tumoral
\alpha Fab' fusionado con la secuencia señal derivada de la
enterotoxina termoestable y del fragmento de gen que codifica la
cadena ligera fusionado con la secuencia señal OmpA, estando
reguladas la expresión y la secreción del mismo mediante un único
promotor.
Una vez que el vector de expresión psDLHF_Bp del
Ejemplo <2-1> fue tratado con SacI y KpnI, y
sometido a electroforesis en gel de agarosa, se escindió del gel un
fragmento menor (0,6 kb). El sitio de reconocimiento SacI se
encontraba en la región constante de la cadena ligera, y el sitio de
reconocimiento KpnI se encontraba en la región constante de la
cadena pesada y, en consecuencia, el fragmento recuperado comprendía
el fragmento de gen que codificaba la cadena ligera fusionado con
la secuencia señal derivada de la enterotoxina termoestable. El
vector de expresión poDLHF, que expresa cada uno de los genes que
codifican la cadena pesada y la cadena ligera fusionados con la
secuencia señal OmpA regulados por un único promotor Tac, fue
tratado con las mismas enzimas, SacI y KpnI, y sometido a
electroforesis en gel de agarosa. Después, se escindió del gel un
fragmento grande (7,4 kb) y se enlazó al gen que codificaba la
cadena ligera recuperada antes para construir el vector de
expresión pmsoDLHF_S/K (Fig. 8). Se transformó E. coli BL21
con el vector de expresión pmsoDLHF_S/K para preparar E.
coli BL21/pmsoDLHF_S/K(HM10925) transformante, y el E.
coli transformante fue depositado en el Centro Coreano de
Cultivos de Microorganismos el 2 de octubre de 2003 con el número de
acceso KCCM-10516.
\vskip1.000000\baselineskip
Los transformantes HM10920 a HM10925 de E.
coli preparados en el Ejemplo 2 se inocularon en un fermentador
(Marubishi) en volumen de 5, sometidos a fermentación y, luego, se
examinó como sigue la expresión del antifactor de necrosis tumoral
\alpha Fab' por parte de cada uno de los transformantes de E.
coli.
Cada uno de los transformantes de E. coli
fue cultivado en 100 ml de medio LB con agitación durante la noche,
inoculado en el fermentador y sometido al cultivo propiamente dicho.
La temperatura del fermentador se mantuvo a 35ºC o 30ºC, se inyectó
aire en el fermentador a una cadencia de 20 wm para evitar el
desarrollo de una condición anaerobia, y el medio de cultivo se
removió a 500 rpm. Se suministraron una fuente de energía de
glucosa y un extracto de levadura con el desarrollo del
microorganismo, considerando el estado de fermentación de
microorganismo. Cuando el valor OD a 600 nm alcanzó 80, se añadió al
fermentador IPTG, un inductor. La fermentación se llevó a cabo
otras 40 a 45 horas hasta que el valor OD a 600 nm llegó a entre 120
y 140.
La solución de cultivo fermentada fue sometida a
centrifugación (20.000 g, 30 min) para obtener un sobrenadante, y
el sobrenadante fue sometido a ELISA para medir la cantidad de
antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab' expresado a partir de
cada transformante. Una vez que un anticuerpo monoclonal (MAB1304,
Chemicon international) contra al anticuerpo humano CH1 fue
disuelto en 10 mM de tampón de carbonato (pH 9,6) a una
concentración de 1 \mug/ml, se recubrió una placa de 96 pocillos
con la solución del anticuerpo a una concentración de 200 ng por
pocillo a 4ºC durante la noche, y se lavó tres veces con solución
PBS-T (137 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 10 mm de
Na_{2}HPO_{4}, 2 mM de KH_{2}PO_{4}, Tween 20 al 0,05%). Se
preparó un tampón bloqueante disolviendo albúmina de suero bovino
en la solución PBS-T a una concentración del 1%. Una
vez que se echaron 250 \mul de solución bloqueante en cada
pocillo, la placa de los pocillos se mantuvo a temperatura ambiente
durante 1 hora y se lavó tres veces con la misma solución
PBS-T. Se diluyeron soluciones estándar y de muestra
con la solución de PBS-T a una debida concentración
y se añadieron al pocillo recubierto con el anticuerpo. La placa de
los pocillos se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora para
lograr una reacción antígeno-anticuerpo y se lavó
tres veces con la solución de PBS-T. La solución
estándar se preparó digiriendo la inmunoglobulina-G
humana (IB-globulin A, Green cross PBM) con una
proteasa, la papaína, purificando el Fab usando una serie de
columnas, disolviendo el Fab en la solución de PBS-T
a una concentra de 1 ng/ml y sometiendo la solución estándar a una
disolución uno a dos. Se usó una muestra conjugada (A7164, Sigma),
un anticuerpo multiclonal contra la región constante de la cadena
ligera humana enlazado covalentemente a una peroxidasa, tras diluir
con el tampón bloqueante en 1000 : 1. Se echaron 200 \mul de la
muestra diluida en cada pocillo, y la placa de los pocillos se
mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora. Una vez que se
completó la reacción, cada pocillo fue lavado tres veces con la
solución de PBS-T. Se mezclaron a volúmenes iguales
soluciones colorantes A y B (Color A - Solución de peroxidasa
estabilizada, y color B - solución de cromógeno estabilizado, DY
999, R&D Systems), se añadieron a cada pocillo 200 \mul de la
mezcla de la solución colorante, y luego la placa de los pocillos
se guardó durante 30 minutos. Después, se añadieron 50 \mul de
ácido sulfúrico 2M a cada pocillo para parar la reacción. La placa
de los pocillos fue analizada con un lector de microplacas
(Molecular Device) para medir la absorbancia a 450 nm de las
soluciones estándar y de muestra. Los resultados se describen en la
Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para detectar el antifactor de necrosis tumoral
\alpha Fab' expresado a partir de cada uno de los E. coli
transformantes preparados en el Ejemplo 3, la proteína expresada fue
purificada parcialmente usando una columna de proteína G dotada de
afinidad elevada con Fab y se sometió a análisis
SDS-PAGE como sigue.
Se equilibró suficientemente una columna HP
Hitrap de proteína G (Amersharm Bioscience) 10 volúmenes de columna
de un tampón de equilibrado (20 mM de fosfato sódico, pH 7,0) a una
velocidad de flujo de 1 ml por minuto, y se cargó en la columna el
sobrenadante del cultivo fermentado obtenido en el Ejemplo 3. Una
vez que la carga de la muestra se hubo completado, la columna fue
lavada con 10 volúmenes de columna del tampón de equilibrado, y se
eluyó el antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab' absorbido en
la columna desde la columna con 5 volúmenes de columna de una
solución eluyente (0,1 M glicina-HCl, pH 2,7).
Dado que el antifactor de necrosis tumoral
\alpha Fab' así eluido era un heterocigoto formado enlazando dos
proteínas diferentes, concretamente, la cadena pesada y la ligera,
unidas por un enlace de bisulfuro, sus patrones de migración entre
los análisis SDS-PAGE reductores y no reductores se
hacen diferentes. La Fig. 9 muestra el resultado de comparar los
patrones de migración del antifactor de necrosis tumoral \alpha
Fab' purificado en análisis SDS-PAGE reductores y
no reductores usando gel criterio al 15% (Bio-Rad).
En la Fig. 9, las calles 4 y 5 eran resultado del
SDS-PAGE no reductor. La calle 1 era un marcador
estándar pretincionado de intervalo bajo (Bio-Rad);
las calles 2 y 4 eran la proteína estándar Fab usada en el Ejemplo
3; y las calles 3 y 5 eran la muestra purificada producida
fermentando el E. coli transformante HM10922
(KCCM-10511).
Como se muestra en la Fig. 9, el enlace entre la
cadena pesada y la cadena ligera en SDS-PAGE
reductor se escindió de forma reductora y, en consecuencia, la
cadena pesada y la cadena ligera migraron como monómeros separados
de aproximadamente el mismo tamaño (dado que el peso molecular de la
cadena pesada (aproximadamente 24 kDa) es similar al de la cadena
ligera (aproximadamente 23 kDa), parecían una molécula en el gel).
Por otra parte, la cadena pesada y la cadena ligera existían como
heterocigoto, una forma unida por medio de un enlace de bisulfuro,
en el SDS-PAGE no reductor y, en consecuencia,
mostraron una distancia de migración de aproximadamente 47 kDa.
Para analizar la secuencia de aminoácidos del
heterocigoto que tiene el peso molecular de aproximadamente 47 kDa
que fue determinada por SDS-PAGE en el Ejemplo
<4-1> en el Instituto Coreano de Ciencia
Básica (KBSI, sucursal de Seúl), se preparó una muestra como
sigue.
Se activó una membrana PVDF (Bio Rad)
empapándola en metanol durante entre aproximadamente 2 y 3 segundos,
y la membrana activada fue suficientemente humectada con una
solución bloqueante (170 mM de glicina, 25 mM de
Tris-HCl [pH 8], 20% metanol). El gel
SDS-PAGE no reductor del Ejemplo
<4-1> fue sometido a transferencia a la
membrana PVDF activada usando un kit de transferencia (unidad
de transferencia semiseca Hoefer, Amersham) durante 1 hora. La
proteína transferida a la membrana PVDF fue tincionada con Azul
Comassie R-250 (Amnesco) de 3 a 4 seg, y lavada con
una solución destincionadora (agua : ácido acético : metanol = 5 : 1
: 4). La región que contenía la proteína fue escindida de la
membrana lavada con un par de tijeras y usada para el análisis de
secuenciación N-terminal.
La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera
del antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab' fue
Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser
(ID SEC Nº 34) y el de la cadena pesada fue
Glu-Val-Gln-Leu-Glu-Val-Asp-Ser
(ID SEC Nº 35). Como consecuencia del análisis de secuenciación de
aminoácidos, se halló que la secuencia N-terminal
del heterocigoto que tenía el peso molecular de aproximadamente 47
kDa expresada de forma secretora a partir del E. coli
transformante inventivo era
Asp/Glu-Ile/Val-Gln-Met/Leu-hr/Val-Gln/Asp-Ser
(ID SEC Nº 36). Estos resultados confirmaron que la cadena pesada y
la cadena ligera del antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab'
producidas conforme a la presente invención existen en forma de
heterocigoto normal.
Para examinar si el antifactor de necrosis
tumoral \alpha Fab' expresado a partir del E. coli
transformante del Ejemplo 3 se enlaza con un antígeno del factor de
necrosis tumoral \alpha, se llevó a cabo como sigue el ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
La concentración del antifactor de necrosis
tumoral \alpha Fab' obtenido en el Ejemplo
<4-1> se midió determinando el coeficiente de
absorción a 280 nm (coeficiente de extinción = 1,43, Humphreys et
al. Protein Expression and Purification 26:
309-320, 2002), y, después, se disolvió en tampón de
PBS-T a una concentración de 10 ng/ml. Además, se
disolvió en el mismo tampón humira (Abbott), que ya se ha demostrado
que es un agente terapéutico comercialmente efectivo contra la
artritis que se enlaza con el factor de necrosis tumoral \alpha,
a la misma concentración para ser usado como anticuerpo estándar
capaz de enlazarse al factor de necrosis tumoral \alpha. Una
placa de pocillos se recubrió con el factor de necrosis tumoral
\alpha según el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 3, y
se examinó si el anticuerpo estándar producido a partir de células
animales y el Fab' producido a partir del E. coli
transformante inventivo muestran la misma afinidad de enlace a la
misma concentración. En ese momento, el anticuerpo estándar
(control) era el Fab preparado digiriendo inmunoglobulina G humana
con una proteasa, la papaína, y purificando usando una serie de
columnas.
Como se muestra en la Fig. 10, aunque la
proteína Fab estándar usada como control no mostraba ninguna
afinidad de enlace con el factor de necrosis tumoral \alpha, el
antifactor de necrosis tumoral \alpha Fab' producido por el E.
coli transformante inventivo se enlazaba con el factor de
necrosis tumoral \alpha en proporción a la tasa de disolución y
mostraba la misma absorbancia, o superior, que el anticuerpo
estándar.
<110> Hanmi Pharm. Co., Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> VECTOR DE EXPRESIÓN PARA LA
SECRECIÓN DE UN FRAGMENTO DE ANTICUERPO USANDO UNA SECUENCIA SEÑAL
DE E. COLI Y PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN EN SERIE DEL
FRAGMENTO DE ANTICUERPO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCA40739/HMY
\vskip0.400000\baselineskip
<150> KR1020030072216
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-10-16
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.71
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de gen de región variable
de cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo específico de
RPC-TI para cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso específico de
RPC-TI para cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo específico de
RPC-TI para cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso específico de
RPC-TI para cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia señal de la enterotoxina
II termoestable de E. coli modificada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo que contiene un
sitio de enzima de restricción StuI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso que contiene un
sitio de enzima de restricción StuI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso específico para
cadena ligera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo que contiene una
secuencia SD y un sitio de enzima de restricción BamHI
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo que contiene un
sitio de enzima de restricción BpuI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso que contiene un
sitio de enzima de restricción BpuI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia señal OmpA de E.
coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo específico para
cadena pesada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo que contiene sitios
de enzimas de restricción HindIII y StuI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo que contiene un
codón de parada y un sitio de enzima de restricción BamHi
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo que contiene sitios
de enzimas de restricción HindIII y NruI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso que contiene un
codón de parada y un sitio de enzima de restricción BamHI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso que contiene un
sitio de enzima de restricción SalI
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo específico para
péptido señal de la enterotoxina de E. coli modificada y que
contiene un sitio de enzima de restricción NdeI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 705
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena pesada
TNF-alfa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 645
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cadena ligera
TNF-alfa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cadena ligera
TNF-alfa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cadena pesada
TNF-alfa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia N-terminal
de TNF-alfa recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm39
Claims (19)
1. Un procedimiento para producir un fragmento
de anticuerpo, que comprende los pasos de:
- a)
- preparar un vector de expresión que comprende un gen que codifica una cadena ligera del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E. coli y un gen que codifica una cadena pesada del fragmento de anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de E. coli, en el que la expresión de los genes que codifican la cadena ligera y la cadena pesada está regulada por un único promotor;
- b)
- transformar un microorganismo con el vector de expresión;
- c)
- cultivar el microorganismo transformado en un medio; y
- d)
- recoger el fragmento de anticuerpo segregado del microorganismo transformado dentro del medio o del espacio periplasmático del microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el fragmento de anticuerpo se deriva de un anticuerpo
quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el fragmento de anticuerpo está seleccionado de entre el
grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')_{2} y scFv.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E.
coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 17 y la
secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de E.
coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 24.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el promotor es un promotor T7 o un promotor Tac.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo
antifactor de necrosis tumoral alfa.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el vector de expresión es pmsoDLHF_N/S.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el microorganismo es E. coli.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que el microorganismo transformado con el vector de expresión es
E. coli BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924) depositada bajo el
número de acceso KCCM-10513.
10. Un vector de expresión que comprende un gen
que codifica una cadena ligera del fragmento de anticuerpo fusionado
con la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de E.
coli y un gen que codifica una cadena pesada del fragmento de
anticuerpo fusionado con la secuencia señal de la proteína A de la
membrana exterior de E. coli, en el que la expresión de los
genes que codifican la cadena ligera y la cadena pesada está
regulada por un único promotor, y el fragmento de anticuerpo
expresado a partir del vector de expresión es segregado a un medio
de cultivo o un espacio periplasmático de un microorganismo.
11. El vector de expresión de la reivindicación
10, en el que el fragmento de anticuerpo se deriva de un anticuerpo
quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
12. El vector de expresión de la reivindicación
10, en el que el fragmento de anticuerpo está seleccionado de entre
el grupo que consiste en Fab, Fab', F(ab')_{2} y scFv.
13. El vector de expresión de la reivindicación
10, en el que la secuencia señal de la enterotoxina termoestable de
E. coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº 17 y
la secuencia señal de la proteína A de la membrana exterior de
E. coli tiene la secuencia de nucleótidos de ID SEC Nº
24.
14. El vector de expresión de la reivindicación
10, en el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento de un
anticuerpo antifactor de necrosis tumoral alfa.
15. El vector de expresión de la reivindicación
10, en el que el promotor es un promotor T7 o un promotor Tac.
16. El vector de expresión de la reivindicación
15 que es pmsoDLHF_N/S.
17. Un microorganismo transformado con el vector
de expresión de la reivindicación 10.
18. El microorganismo de la reivindicación 17
que es E. coli.
19. El microorganismo de la reivindicación 18
que es E. coli BL21/pmsoDLHF_N/S(HM10924) depositada
bajo el número de acceso KCCM-10513.
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