CN101896504B - 二价双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型结构域交换、二价、双特异性抗体，及其制备和应用。

Description

二价双特异性抗体
本发明涉及新型二价双特异性抗体，其制备和应用。
发明背景
改造的蛋白，诸如能够结合两种以上抗原的双特异性或多特异性抗体是本领域中已知的。这样的多特异性结合蛋白可以利用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术产生。
最近已经开发了广泛多样的重组双特异性抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，M.J.，等，Nature Biotech.(自然生物技术)15(1997)159-163；WO 2001077342；和Morrison，S.，L.，Nature Biotech.(自然生物技术)25(2007)1233-1234)。
此外，开发了能够结合两种以上抗原的若干其他新型形式，其中抗体中心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)不再保持诸如双抗体、三链抗体或四链抗体，微型抗体(minibodies)，若干单链形式(scFv，双-scFv)(Holliger，P.，等，Nature Biotech(自然生物技术)23(2005)1126-1136；Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobiology(病理学)74(2007)3-14；Shen，J.，等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)318(2007)65-74；Wu，C.，等.，Nature Biotech(自然生物技术)25(2007)1290-1297)。
所有这样的形式使用连接体将抗体中心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobiology(病理学)74(2007)3-14)。虽然连接体具有改造双特异性抗体的优势是明显的，但是其也可能引起治疗设置中的问题。实际上，这些外源肽可能引起针对连接体本身或蛋白质和连接体之间连接的免疫反应。此外，这些肽的灵活的本质使得其更加倾向于蛋白水解分裂，这潜在地导致弱抗体稳定性、聚集和增高的免疫原性。另外，人们可能希望保留效应子功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其通过保持与天然存在抗体的高度相似性经由Fc部分来介导。
因此，理想地，人们的目标应该是开发通用结构与天然存在抗体(如IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)非常类似的双特异性抗体，其与人序列具有最小的偏离。
在一种方法中，利用细胞杂交瘤(quadroma)技术(见Milstein，C.和A.C.Cuello，Nature(自然)，305(1983)537-40)生成了与天然抗体非常类似的双特异性抗体，所述细胞杂交瘤技术基于表达具有所需的双特异性抗体特异性的鼠单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合。因为在产生的杂交-杂交瘤(或细胞杂交瘤)细胞系中的两个不同抗体重链和轻链的随机配对，生成至多10种不同的抗体类型，其中只有一种是所需的功能双特异性抗体。由于存在错配副产物和显著降低的产率，其意味着需要技术先进的纯化程序(参见例如Morrison，S.L.，Nature Biotech(自然生物技术)25(2007)1233-1234)。一般地，如果使用重组表达技术，则相同的错配副产物问题仍存在。
用于避开错配副产物问题的方法，称为“杵-进入-臼(knobs-into-holes)”，其目的在于通过将突变引入CH3结构域来迫使两个不同抗体重链配对，以改变接触界面。在一条链上，大氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换，以形成“臼(holes)”。相反地，将具有大侧链的氨基酸引入到另一个CH3结构域中，以形成“杵(knobs)”。通过共表达这两条重链(和两条相同的轻链，其必须适合于这两条重链)，观察到与同型二聚体形式(‘臼-臼’或‘杵-杵’)相比，异型二聚体形式(‘杵-臼’)的高产率(Ridgway，J.B.，Protein Eng.(蛋白质工程)9(1996)617-621；和WO 96/027011)。异型二聚体的百分比可以通过利用噬菌体展示法重建两个CH3结构域的相互作用表面和引入二硫键来稳定该异型二聚体而得到进一步增加(Merchant A.M，等.，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；Atwell，S.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35)。关于杵-进入-臼技术的新方法记述在例如EP 1870459A1中。尽管这种形式似乎非常吸引人，但是目前不存在描述针对临床的进展的数据。这种策略的一个重要的制约是两个母体抗体的轻链必须相同，以防止错配和形成无活性的分子。因此，该技术不适合于容易地开发起始自针对第一和第二抗原的两种抗体的、针对两种抗原的重组、二价双特异性抗体，因为这些抗体的重链和/或相同的轻链必须是最优化的。
WO 2006/093794涉及异型二聚体蛋白结合组合物。WO 99/37791描述了多用途抗体衍生物。Morrison等J.Immunolog(免疫学杂志)，160(1998)2802-2808指出可变区结构域交换对IgG的功能特性的影响。
发明概述
本发明涉及二价双特异性抗体，其包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
本发明的另一个实施方案是用于制备按照本发明的二价双特异性抗体的方法，其包括下列步骤：
a)用以下各项转化宿主细胞，
-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，和
-载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换；
b)在容许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从所述培养物中回收所述抗体分子。
本发明的另一个实施方案是宿主细胞，其包括
-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，和
-载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
本发明的另一个实施方案是按照本发明的抗体的组合物，优选药物或诊断组合物。
本发明的另一个实施方案是药物组合物，其包括按照本发明的抗体和至少一种药用赋形剂。
本发明的另一个实施方案是用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的按照本发明的抗体。
发明详述
本发明涉及二价双特异性抗体，其包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
因此，所述二价双特异性抗体，包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，
其中所述第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中所述第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换。
因此，对于所述特异性结合第二抗原的抗体，以下各项适用：
在轻链中
可变轻链结构域VL被所述抗体的可变重链结构域VH替换，且恒定轻链结构域CL被所述抗体的恒定重链结构域CH1替换；
且在重链中
可变重链结构域VH被所述抗体的可变轻链结构域VL替换，且恒定重链结构域CH1被所述抗体的恒定轻链结构域CL替换。
术语“抗体”用于本文中时，指完整的单克隆抗体。所述完整抗体由两对“轻链”(LC)和“重链”(HC)(所述轻链(LC)/重链对缩写为LC/HC)组成。所述抗体的轻链和重链是由若干结构域组成的多肽。在完整抗体中，每条重链包括重链可变区(缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括重链恒定结构域CH1、CH2和CH3(抗体类型IgA，IgD，和IgG)和任选地，重链恒定结构域CH4(抗体类型IgE和IgM)。每条轻链包括轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL。一种天然存在的完整抗体，即IgG抗体的结构显示在例如图1中。可变结构域VH和VL可以进一步再分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，它们之间分布有更加保守的区域，称为构架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以以下顺序从氨基端向羧基端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4((Janeway，C.A.，Jr.等.，Immunobiology(免疫学)，第5版，加兰出版社(Garland Publishing)(2001)；和Woof J，Burton D Nat Rev Immunol(自然免疫学综述)4(2004)89-99)。两对重链和轻链(HC/LC)能够特异性结合相同抗原。因此所述完整抗体是二价、单特异性抗体。所述“抗体”包括例如小鼠抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和遗传改造的抗体(变异或突变抗体)，条件是保持它们的特有特性。特别优选人或人源化抗体，尤其作为重组的人或人源化抗体。
存在5种由希腊字母表示的哺乳动物抗体重链类型：α，δ，ε，γ，和μ(Janeway，C.A.，Jr.，等.，Immunobiology(免疫学)，第5版，加兰出版社(Garland Publishing)(2001))。存在的重链的类型定义抗体的类型；这些链分别存在于IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM抗体中(Rhoades RA，Pflanzer RG(2002).Human Physiology(人体生理学)，第4版，汤姆森知识(ThomsonLearning))。不同的重链在尺寸和组成上不同；α和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε具有约550个氨基酸。
每条重链具有两种区域，即恒定区和可变区。恒定区在相同同种型的所有抗体中相同，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ，α和δ具有由3个恒定结构域CH1、CH2和CH3(处于一条线上)组成的恒定区和用于增加灵活性的铰链区(Woof，J.，Burton D Nat Rev Immunol(自然免疫学综述)4(2004)89-99)；重链μ和ε具有由4个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4组成的恒定区(Janeway，C.A.，Jr.，等.，Immunobiology(免疫学)，第5版，加兰出版社(Garland Publishing)(2001))。重链的可变区在由不同B细胞产生的抗体中不同，但对由单种B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体都是相同的。每条重链的可变区长约110个氨基酸且由单抗体结构域组成。
在哺乳动物中，仅存在两类轻链，其称为λ和κ。轻链具有两个连续的结构域：一个恒定结构域CL和一个可变结构域VL。轻链的近似长度是211-217个氨基酸。优选地，轻链是κ轻链，且恒定结构域CL优选是Cκ。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单氨基酸组成的抗体分子制剂。
按照本发明的“抗体”可以是任意类型(例如IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，优选IgG或IgE)，或亚型(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2，优选IgG1)，其中按照本发明的二价双特异性抗体所源自的两种抗体具有相同亚型(例如IgG1，IgG4等，优选IgG1)的Fc部分，优选相同同种异型的Fc部分(例如高加索人)。
“抗体的Fc部分”是熟练的技术人员公知的术语，并基于抗体的木瓜蛋白酶裂解而定义。按照本发明的抗体包含如Fc部分，优选源自人来源的Fc部分和优选人恒定区的全部其他部分。抗体的Fc部分直接参与补体活化，C1q结合，C3活化和Fc受体结合。尽管抗体对补体系统的影响取决于特定的条件，但是与C1q的结合由Fc部分中确定的结合位点所导致。所述结合位点是现有技术中已知的且记述在例如Lukas，T.J.，等.，J.Immunol.(免疫学杂志)127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.(分子免疫学)16(1979)907-917；Burton，D.R.，等.，Nature(自然)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等.，Mol.Immunol.(分子免疫学)37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等.，J.Immunol.(免疫学杂志)164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等.，J.Virol.(病毒学杂志)75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等.，Immunology(免疫学)86(1995)319-324；和EP 0 307 434中。所述结合位点是例如L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(按照Kabat的EU目录编号，见下)。亚型IgG1，IgG2和IgG3的抗体通常表现出补体活化，C1q结合和C3活化，而IgG4不活化补体系统，不结合C1q且不活化C3。优选地，Fc部分是人Fc部分。
术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，所述免疫球蛋白基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，Proc.Natl.Acad Sci.USA(美国国家科学院学报)81(1984)6851-6855；US5,202,238和5,204,244。
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与亲本免疫球蛋白的特异性相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见，例如，Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上关于嵌合抗体指出的抗原的那些代表性序列。发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。
用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，当前化学生物学观点(Curr.Opin.in ChemicalBiology)5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生全部或所选的人抗体成员。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见，例如Jakobovits，A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等.，Nature(自然)362(1993)255-258；Brüggemann，M.，等.，Year Immunol.(免疫学年度)7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388；Marks，J.D.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole，S.P.C.，等和Boerner等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，S.P.C.，等.，Monoclonal antibodies and CancerTherapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，Inc.，纽约(1986)，第77-96页；和Boerner，P.，等.，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对按照本发明的嵌合抗体和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列，所述序列尽管源自人种系VH和VL序列并与之相关，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中。
“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变区)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的通用结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区保持其三维结构并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和性方面起特别重要的作用，并因此提供本发明的另一个目的。
用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDR通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat E.A.等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(PublicHealth Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))的标准定义确定CDR和FR区域。
重链和轻链的“恒定结构域”不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应子功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白被分为以下类型：
术语“二价双特异性抗体”用于本文中时，指如上所述的抗体，其中两对重链和轻链(HC/LC)中的每对特异性结合不同的抗原，即第一重链和第一轻链(源自针对第一抗原的抗体)特异性共同结合第一抗原，且第二重链和第二轻链(源自针对第二抗原的抗体)特异性共同结合第二抗原(如图2中所示)；所述二价双特异性抗体能够同时特异性结合两种不同的抗原，且不超过两种抗原，与其相对照的是，一方面仅能够结合一种抗原的单特异性抗体和另一方面例如能够同时结合四种抗原分子的四价、四特异性抗体。
按照本发明，所需二价双特异性抗体与不需要的副产物的比例可以通过替换仅一对重链和轻链(HC/LC)中的某些结构域来提高。尽管两对HC/LC对的第一对源自特异性结合第一抗原的抗体且保持基本不变，而两对HC/LC对的第二对源自特异性结合第二抗原的抗体并通过以下替换来改变：
-轻链：将可变轻链结构域VL替换为所述特异性结合第二抗原的抗体的可变重链结构域VH，且将恒定轻链结构域CL替换为所述特异性结合第二抗原的抗体的恒定重链结构域CH1，和
-重链：将可变重链结构域VH替换为所述特异性结合第二抗原的抗体的可变轻链结构域VL，且将恒定重链结构域CH1替换为所述特异性结合第二抗原的抗体的恒定轻链结构域CL。
因此，由此生成的二价双特异性抗体是人造抗体，其包括
a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，
其中(特异性结合第二抗原的抗体的)所述轻链包括可变结构域VH而非VL和恒定结构域CH1而非CL，
其中(特异性结合第二抗原的抗体的)所述重链包括可变结构域VL而非VH和恒定结构域CL而非CH1。
在本发明的另一方面，这样提高的所需二价双特异性抗体与不需要的副产物的比例可以通过以下两种备选方案之一进一步提高：
A)第一备选方案(见图3)：
所述按照本发明的二价双特异性抗体的CH3结构域可以通过“杵-进入臼”技术改变，该技术以若干实例详细记述在例如WO 96/027011，RidgwayJ.B.，等.，Protein Eng(蛋白质工程)9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等.，Nat Biotechnol(自然生物技术)16(1998)677-681中。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面，以增加包含这两个CH3结构域的两条重链的异型二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域之一可以是“杵”，而另一个是“臼”。引入二硫键稳定该异型二聚体(Merchant，A.M，等.，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；Atwell，S.，等.J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35)并增加产率。
因此在优选的实施方案中，二价双特异性抗体的CH3结构域通过“杵-进入-臼”技术改变，在所述二价双特异性抗体中，第一CH3结构域和第二CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接触，所述“杵-进入-臼”技术包括通过将二硫键引入CH3结构域而进一步稳定化(记述在WO 96/02701l，Ridgway，J.B.，等.，Protein Eng(蛋白质工程)9(1996)617-621；Merchant，A.M.，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；和Atwell，S.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35中)以促进所述二价双特异性抗体的形成。
因此，在本发明的一个方面，所述二价双特异性抗体的特征在于：
一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接触；
其中改变所述界面以促进二价双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于：
a)改变一条重链的CH3结构域，
由此，在与二价双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接触的一条重链的CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成凸起，该凸起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中
且
b)改变另一条重链的CH3结构域，
由此，在与二价双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接触的第二CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内生成凹洞，第一CH3结构域的界面内的凸起可以定位在该凹洞中。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。
在本发明的一个方面中，进一步改变这两个CH3结构域，引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域相应位置处的氨基酸，从而使得可以形成两个CH3结构域之间的二硫键。
在本发明的另一个优选实施方案中，通过使用关于杵残基的残基R409D；K370E(K409D)和关于臼残基的D399K；E357K来改变两个CH3结构域，其记述在例如EP 1870459A1中。
或
B)第二备选方案(见图4)：
通过将一个恒定重链结构域CH3替换为恒定重链结构域CH1；和将另一个恒定重链结构域CH3替换为恒定轻链结构域CL。
替换重链结构域CH3的恒定重链结构域CH1可以是任何Ig类型(例如IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM)，或亚型(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)的。
替换重链结构域CH3的恒定轻链结构域CL可以是λ或κ型，优选κ型的。
因此，本发明的一个优选实施方案是二价双特异性抗体，其包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
且其中任选地，
c)一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接触；
其中改变所述界面以促进二价双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于：
ca)改变一条重链的CH3结构域，
由此，在与二价双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接触的一条重链的CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成凸起，该凸起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中
且
cb)改变另一条重链的CH3结构域，
由此，在与二价双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接触的第二CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内生成凹洞，第一CH3结构域的界面内的凸起可以定位在该凹洞中；
或d)
一个恒定重链结构域CH3被恒定重链结构域CH1替换；且另一个恒定重链结构域CH3被恒定轻链结构域CL替换。
术语“抗原”或“抗原分子”用于本文中时，可交替使用并指能够被抗体特异性结合的所有分子。二价双特异性抗体特异性结合第一抗原和第二不同抗原。术语“抗原”用于本文中时，包括例如蛋白、蛋白上的不同表位(在本发明含义内作为不同抗原)和多糖。这主要包括细菌、病毒和其他微生物的部分(外壳、被膜、细胞壁、鞭毛、菌毛(fimbrae)和毒素)。脂质和核酸仅在与蛋白和多糖组合时具有抗原性。非微生物外源(非自身)抗原可以包括花粉、蛋清和来自被移植组织和器官的蛋白或在被输血的血细胞表面上的蛋白。优选地，抗原选自由细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体组成的组。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞表面上的MHC I或MHC II分子呈递的那些抗原。这些抗原有时可以由肿瘤细胞来呈递，且从来不由正常细胞来呈递。由此，它们称为肿瘤特异性抗原(TSAs)且典型地由肿瘤特异性突变产生。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞呈递的抗原，且它们称为肿瘤相关抗原(TAAs)。识别这些抗原的细胞毒性T淋巴细胞可能能够在肿瘤细胞增殖或转移前破坏它们。肿瘤抗原还可以采用例如突变受体的形式存在于肿瘤表面上，在这种情形中它们应该被B细胞识别。
在一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)中的至少一种是肿瘤抗原。
在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)均是肿瘤抗原；在该情形中，所述第一和第二抗原还可以是相同肿瘤特异性蛋白上的两种不同表位。
在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)之一是肿瘤抗原且另一种是效应子细胞抗原，如例如T细胞受体、CD3、CD16等。
在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)之一是肿瘤抗原且另一种是抗癌物质诸如毒素或激酶抑制剂。
用于本文中时，“特异性结合”或“与……特异性结合”指特异性结合抗原的抗体。优选地，特异性结合该抗原的抗体的结合亲和性的KD-值是10-9mol/l以下(例如10-10mol/l)，优选KD-值是10-10mol/l以下(例如10-12mol/l)。结合亲和性使用标准结合测定法，诸如表面等离振子共振技术来确定。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定子。在某些实施方案中，表位决定子包括分子化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，且或特定的带电特性。表位是抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或高分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，认为该抗体与抗原特异性结合。
本发明的另一个实施方案是用于制备按照本发明的二价双特异性抗体的方法，其包括
a)用以下各项转化宿主细胞，
-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，和
-载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换；
b)在容许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从所述培养物中回收所述抗体分子。
一般地，存在两种编码所述特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的载体，和另外两种编码所述特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的载体。两种载体之一编码各种轻链，且两种载体中的另一种编码各种重链。然而，在用于制备按照本发明的二价双特异性抗体的另一种方法中，可以使用仅一种编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的第一载体和仅一种编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的第二载体来转化宿主细胞。
本发明包括用于制备所述抗体的方法，其包括在容许合成所述抗体分子的条件下培养相应的宿主细胞和从所述培养物中回收所述抗体，其例如通过表达以下各项来实现
-第一核酸序列，其编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链；
-第二核酸序列，其编码所述特异性结合第一抗原的抗体的重链；
-第三核酸序列，其编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链，其中可变轻链结构域VL被替换为可变重链结构域VH，且其中恒定轻链结构域CL被替换为恒定重链结构域CH1；和
-第四核酸序列，其编码所述特异性结合第二抗原的抗体的重链，其中可变重链结构域VH被替换为可变轻链结构域VL，且其中恒定重链结构域CH1被替换为恒定轻链结构域CL。
本发明的另一个实施方案是宿主细胞，其包括：
-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，和
-载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
本发明的另一个实施方案是宿主细胞，其包括
a)包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链的核酸分子的载体和包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链的核酸分子的载体，和
b)包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链的核酸分子的载体和包括编码特异性结合第二抗原的抗体的重链的核酸分子的载体，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
本发明的另一个实施方案是按照本发明的二价双特异性抗体的组合物，优选药物或诊断组合物。
本发明的另一个实施方案是药物组合物，其包括按照本发明的抗体和至少一种药用赋形剂。
本发明的另一个实施方案是用于治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向所述患者施用治疗有效量的按照本发明的二价双特异性抗体。
术语“核酸或核酸分子”，用于本文中时，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。在意指不同名称时，其将通过上下文而清楚。
术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham，F.L.，和van der Eb，A.J.，Virology(病毒学)52(1973)456-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞中的方法，诸如通过电穿孔、核染(nucleofection)、核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen，S.N，等，PNAS.69(1972)2110-2114所述。
利用转化重组生成抗体是现有技术中公知的且记述在，例如，综述文章Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.(蛋白表达纯化)17(1999)183-202；Geisse，S.，等.，Protein Expr.Purif.(蛋白表达纯化)8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.(分子生物技术)16(2000)151-160；Werner，R.G.，等.，Arzneimittelforschung 48(1998)870-880中，以及US 6,331,415和US 4,816,567中。
用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和所编码的多肽共称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。
“载体”是核酸分子，特别是自我复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。
“表达载体”是多核苷酸，其在引入合适的宿主细胞时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。
按照本发明的二价双特异性抗体优选通过重组手段生成。所述方法是本领域中普遍已知的，且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达及随后分离抗体多肽和通常纯化到药用纯度。对于蛋白质表达，通过标准方法将编码轻链和重链或其片段的核酸插入表达载体中。表达在合适的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER.C6细胞，酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞中进行，且从所述细胞(溶胞后的上清或细胞)中回收抗体。二价双特异性抗体可以存在于完整细胞中、细胞溶解产物中或以部分纯化或基本纯的形式存在。通过标准技术，包括碱/SDS处理，柱层析法和其他本领域公知技术进行纯化，从而消除其他细胞成分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白。参见Ausubel，F.，等.，编，Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学方案)，Greene Publishing and Wiley Interscience，纽约(1987)。
在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.，等.，Cytotechnology(细胞技术学)32(2000)109-123；和Barnes，L.M.，等.，Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等.，Nucl.Acids.Res.(核酸研究)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等.，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在Cytotechnology(细胞技术学)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，在J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)194(1996)191-199中。
适合于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和加A信号。
当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在阅读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果不存在所述位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接合体或连接体。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如例如，蛋白A-琼脂糖，羟磷灰石层析法，凝胶电泳，透析，或亲合层析法，从培养基中适当分离二价双特异性抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA容易利用常规程序分离和测序。杂交瘤细胞可以作为所述DNA和RNA的来源。一旦分离后，可以将DNA插入到表达载体中，所述表达载体随后转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞中，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
二价双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适当的核苷酸改变引入到抗体DNA中，或通过核苷酸合成来制备。然而，这样的修饰仅能在非常有限的范围内，例如如上所述的范围内进行。例如，所述修饰不改变上述抗体特征诸如IgG同种型和抗原结合，但可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或促进纯化。
提供以下实施例、序列表和附图来帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中描述。应该理解在不偏离本发明精神的条件下可以对所述程序进行改变。
序列表
SEQ ID NO：1野生型<IGF-1R>抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO：2野生型<IGF-1R>抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO：3<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链*(HC*)的氨基酸序列，其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL，且重链结构域CH1被替换为轻链结构域CL。
SEQ ID NO：4<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的轻链*(LC*)的氨基酸序列，其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH，且轻链结构域CL被替换为重链结构域CH1。
SEQ ID NO：5IGF-1R胞外域His-链霉亲和素结合肽-标记物(IGF-1R-His-SBP ECD)的氨基酸序列
SEQ ID NO：6野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO：7野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO：8<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链*(HC*)的氨基酸序列，其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL，且重链结构域CH1被替换为轻链结构域CL。
SEQ ID NO：9<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的轻链*(LC*)的氨基酸序列，其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH，且轻链结构域CL被替换为重链结构域CH1。
SEQ ID NO：10用于杵-进入-臼技术的具有T366W交换的CH3结构域(杵)的氨基酸序列
SEQ ID NO：11用于杵-进入-臼技术的具有T366S，L368A，Y407V交换的CH3结构域(臼)的氨基酸序列
SEQ ID NO：12野生型<VEGF>抗体重链的氨基酸序列
SEQ ID NO：13和14具有和不具有前导序列的野生型<VEGF>抗体轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO：15<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链*(HC*)的氨基酸序列，其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL，且重链结构域CH1被替换为轻链结构域CL，且CH3结构域携带具有T366S，L368A，Y407V交换(臼)的氨基酸序列以用于杵-进入-臼技术
SEQ ID NO：16野生型<VEGF>抗体重链的氨基酸序列，其中CH3结构域携带具有T366W(杵)交换的氨基酸序列以用于杵-进入-臼技术
SEQ ID NO：17<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链(G)*(HC*)的氨基酸序列，其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL，且重链结构域CH1被替换为具有另外的甘氨酸插入的轻链结构域CL。
SEQ ID NO：18<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的轻链(G)*(LC*)的氨基酸序列，其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH，且轻链结构域CL被替换为具有另外的甘氨酸插入的重链结构域CH1。
附图说明
图1IgG的示意图，IgG即为天然存在的特异于一种抗原的完整抗体，其具有两对重链和轻链，所述重链和轻链具有处于典型顺序的可变结构域和恒定结构域。
图2二价双特异性抗体的示意图，所述二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中可变结构域VL和VH相互替换，且其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
图3二价双特异性抗体的示意图，所述二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中可变结构域VL和VH相互替换，且其中恒定结构域CL和CH1相互替换，且其中通过杵-进入-臼技术改变两条重链的CH3结构域。
图4二价双特异性抗体的示意图，所述二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和b)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中可变结构域VL和VH相互替换，且其中恒定结构域CL和CH1相互替换，且其中两条重链的恒定重链结构域CH3之一被替换为恒定重链结构域CH1，且另一个获恒定重链结构域CH3被替换为恒定轻链结构域CL。
图5<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链*<IGF-1R>HC*的蛋白序列图
图6<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的轻链*<IGF-1R>LC*的蛋白序列图
图7重链*<IGF-1R>HC*表达载体pUC-HC*-IGF-1R的质粒图谱
图8轻链*<IGF-1R>LC*表达载体pUC-LC*-IGF-1R的质粒图谱
图94700-Hyg-OriP表达载体的质粒图谱
图10具有HC*和LC*的单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体(IgG1*)的SDS-PAGE，所述单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体(IgG1*)是从瞬时转染HEK293E细胞后的细胞培养物上清中，通过使用蛋白质A琼脂糖的免疫沉淀法分离的。
图11在基于ELISA的结合测定中，单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和野生型<IGF-1R>抗体与IGF-1R ECD的结合。
图12重链*<ANGPT2>HC*表达载体pUC-HC*-ANGPT2>的质粒图谱
图13轻链*<ANGPT2>LC*表达载体pUC-LC*-ANGPT2>的质粒图谱
图14通过蛋白质A亲合层析法及随后的大小排阻层析法和浓缩，从细胞培养物上清中纯化的以下各项的混合物的还原SDS-PAGE的和非还原SDS-PAGE：A)单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体(“双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物”)
图15对于I24 IGF-1R表达细胞进行的用于检测功能双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的存在的细胞FACSIGF-1R-ANGPT2桥连测定的测定原理。
图16对于I24IGF-1R表达细胞进行的用于检测细胞培养物上清中存在功能双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的细胞FACS IGF-1R-ANGPT2桥连测定的样品A-G的结果。
  样品   细胞IGF-1R   抗体   hANGPT2   检测抗体   检测
  A   I24   未处理   -   <Ang-2>mlgG1-生物素   SA-PE
  B   I24   未处理   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  C   I24   双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体混合物   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  D   I24   野生型混合物   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  E   I24   <ANGPT2>野生型抗体   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  F   I24   <IGF-1R>野生型抗体   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  G   I24   单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
图17对于I24 IGF-1R表达细胞进行的用于检测功能双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的存在的细胞FACSIGF-1R-ANGPT2桥连测定的样品A-G的结果。
  样品   细胞IGF-1R   抗体   hANGPT2   检测抗体   检测
  A   I24   未处理   -   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  B   I24   未处理   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  C   I24   双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物   2μg/mLhANGPT2   mIgG1-生物素-同种型对照   SA-PE
  D   I24   双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  E   I24   野生型混合物   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  F   I24   <ANGPT2>野生型抗体   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
  G   I24   <IGF-1R>野生型抗体   2μg/mLhANGPT2   <Ang-2>mIgG1-生物素   SA-PE
图18IGF-1R ECD结合ELISA的示意图
图19ANGPT2结合ELISA的示意图
图20VEGF-ANGPT2桥连ELISA的示意图
图21ANGPT2-VEGF桥连Biacore测定的示意图
图22<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体纯化物的SDS-PAGE，纯化的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体对应于浓缩的SEC库；B)纯化的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的大小排阻层析
图23<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体纯化物的SDS-PAGE，纯化的<ANPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体对应于浓缩的SEC库；B)纯化的<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的大小排阻层析
图24在基于ELISA  的结合测定中，单特异性<ANGPt2>VL-VH/CL-CH1交换抗体和野生型<ANGPt2>抗体与ANGPT2的结合。
图25单特异性<ANGPt2>VL-VH/CL-CH1交换抗体和野生型<ANGPt2>抗体与ANGPT2的结合的Biacore分析
图26来自双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的大小排阻层析的洗脱级分的还原SDS-PAGE和非还原SDS-PAGE
图27通过天然级分质谱法获得的SDS-PAGE中的条带分配。显示通过质谱法鉴定的蛋白在各种未还原SDS-PAGE中的位置
图28在VEGF-ANGPT2桥连ELISA中，来自双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的大小排阻层析的洗脱级分5和9的分析。包括同时识别ANGPT2和VEGF的双特异性四价抗体TvG6-Ang23作为阳性对照。
图29在VEGF-ANGPT2桥连Biacore测定中，来自双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的大小排阻层析的洗脱级分5和9的表面等离振子共振分析。包括同时识别ANGPT2和VEGF的双特异性四价抗体TvG6-Ang23作为阳性对照。
图30具有用于异型二聚化的杵-入-臼的双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的图
图31单特异性<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CH1(G)交换抗体和野生型<ANGPT2>抗体与ANGPT2的结合的Biacore分析。
实施例
材料和一般方法
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.，等.，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))中提供。按照EU编号对抗体链的氨基酸进行编号和提及(Edelman，G.M.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等.，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service，National Institutes ofHealth)，Bethesda，MD.(1991))。
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook，J.等.，Molecular cloning：Alaboratory manual(分子克隆：实验室手册)；Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约，1989中所述。分子生物学试剂按照供应商说明使用。
基因合成
所需基因区段由通过化学合成制备的寡核苷酸制备。侧连单限制性内切酶裂解位点的600-1800bp长的基因区段通过包括PCR扩增的寡核苷酸的退火和连接来装配，并随后通过所指出的限制位点例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆到基于pGA4的克隆载体的pPCRScript(Stratagene)中。亚克隆的基因片段的DNA序列通过DNA测序验证。基因合成片段按照Geneart(Regensburg，德国)的提供的说明书来订购。
DNA序列确定
DNA序列通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，德国)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten，德国)进行的双链测序来确定。
DNA和蛋白序列分析和序列数据管理
GCG(Genetics Computer Group(遗传学计算小组)，Madison，威斯康星)的软件包版本10.2和Infomax载体NT1进展组版本8.0(Infomax’s VectorNT1 Advance suite version 8.0)用于序列构建、作图、分析、注解和说明。
表达载体
为了表达所述抗体，应用用于基于具有CMV-内含子A启动子的cDNA构造或基于具有CMV启动子的基因组构造的细胞中(例如在HEK293EBNA或HEK293-F中)瞬时表达的表达质粒的变体。
除抗体表达盒以外，所述载体包括：
-复制起点，其容许该质粒在大肠杆菌中复制和
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。
抗体基因的转录单元由以下元件组成：
-5’末端处的特有限制性位点
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子，
-在cDNA构造的情形中，随后是内含子A序列，
-人抗体基因的5’-非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-人抗体链(野生型或具有结构域交换)，其作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子构造的基因组构造
-具有加A信号序列的3’非翻译区，和
-3’末端处的特有限制性位点。
如下所述的包括所述抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成产生，并使用已知的重组方法和技术来装配，所述重组方法和技术通过在各种载体中例如利用特有的限制性位点来连接相应的核酸区段来实现。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。
细胞培养技术
使用如Current Protocols in Cell Biology(当前细胞生物学方案)(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编)，John Wiley & Sons，Inc中所述的标准细胞培养技术。
通过在贴壁生长的HEK293-EBNA中或在悬浮生长的HEK29-F细胞中瞬时共转染各种表达质粒来表达双特异性抗体，如下所述。
HEK293-EBNA系统中的瞬时转染
双特异性抗体通过在贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物中心，保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959 218)中瞬时共转染各种表达质粒(例如编码重链和修饰的重链，以及相应的轻链和修饰的轻链)来表达，所述HEK293-EBNA细胞是在增补了10％超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，和250μg/ml遗传霉素(geneticin)(Gibco)的DMEM(Dulbecco’smodified Eagle’s medium(Dulbecco改良的Eagle培养基)，Gibco)中培养的。为了转染，FuGENETM 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals(罗氏分子生物化学))按照FuGENETM试剂(μl)与DNA(μg)的比例为4∶1(在3∶1～6∶1的范围内)来使用。利用编码(修饰的和野生型)轻链和重链的质粒的摩尔比为1∶1(等摩尔)，其范围是1∶2～2∶1，分别由各种质粒来表达蛋白。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格玛(Sigma)]和NAA[Gibco]饲养细胞。在在转染后第5-11天通过离心收获包含双特异性抗体的细胞培养物上清并保存在-20℃。关于人免疫球蛋白在例如HEK293细胞中的重组表达的一般信息提供在Meissner，P.等.，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)75(2001)197-203中。
HEK293-F系统中的瞬时转染
双特异性抗体通过利用HEK293-F系统(Invitrogen)按照供应商的说明瞬时转染各种质粒(例如编码重链和修饰的重链，以及相应的轻链和修饰的轻链)来生成。简言之，用四种表达质粒和293fectin或fectin(Invitrogen)的混合物来转染在摇瓶中或在搅拌发酵器中在无血清FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Coming)，HEK293-F细胞以1.0E*6细胞/mL的密度接种在600mL中并以120rpm，8％CO2温育。第二天，用ca.42mL的A)具有600μg等摩尔比的分别编码重链或修饰的重链，和相应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293 fectin或fectin(2μl/mL)的混合物，以ca.1.5E*6细胞/mL的细胞密度来转染细胞。在发酵过程中根据葡萄糖的消耗，添加葡萄糖溶液。在5-10天时收获包含分泌的抗体的上清，并且直接由上清纯化抗体，或冷冻并保存上清。
蛋白确定
纯化的抗体和衍生物的蛋白浓度通过利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数确定280nm处的光密度(OD)来确定，其依照Pace，C.N.，等，Protein Science(蛋白质科学)，1995，4，2411-1423进行。
上清中抗体浓度的确定
抗体和衍生物在细胞培养物上清中的浓度通过使用蛋白质A琼脂糖-珠(Roche(罗氏))的免疫沉淀法来估算。60μL蛋白质A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1％Nonidet-P40)洗涤三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清应用于在TBS-NP40中预平衡的蛋白质A琼脂糖珠。室温下温育1小时后，将该珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤1次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲液(2xPBS，Roche(罗氏))洗涤2次并用0.5mL 100mM柠檬酸钠pH 5,0简单洗涤4次。通过添加35μlLDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。样品的一半分别与样品还原剂混合或保持未还原，并在70℃加热10分钟。随后，将5-30μl应用于4-12％Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有MOPS缓冲液，以用于非还原的SDS-PAGE，且具有抗氧化运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液，以用于还原的SDS-PAGE)，并用考马斯蓝染色。
抗体和衍生物在细胞培养物上清中的浓度通过亲合HPLC层析法来定量测量。简言之，将包含结合蛋白质A的抗体和衍生物的细胞培养物上清应用于处于200mM KH2PO4，100mM柠檬酸钠，pH 7.4中的应用生物系统(Applied Biosystems)Poros A/20柱，并在安捷伦(Agilent)HPLC 1100系统上用200mM NaCl，100mM柠檬酸，pH 2,5由基质洗脱。洗脱的蛋白通过UV吸光度和峰面积整合来量化。纯化的标准IgG1抗体作为标准物。
备选地，抗体和衍生物在细胞培养物上清中的浓度通过夹心式-IgG-ELISA来测量。简言之，将StreptaWell高结合链霉亲和素A-96孔微量滴定板(Roche(罗氏))用100μL/孔生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)，以0.1μg/mL在室温下包被1小时或备选地在4℃包被过夜，并随后用200μL/孔PBS，0.05％吐温(PBST，Sigma(西格玛))洗涤3次。将100μL/孔包含各种抗体的细胞培养物上清在PBS(Sigma(西格玛))中的稀释物系列加入到孔中，并在微量滴定板摇动器上，以室温温育1-2小时。孔用200μL/孔PBST洗涤三次，并且用100μl浓度为0.1μg/mL的F(ab‘)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体，在微量滴定板摇动器上，在室温下检测结合的抗体1-2小时。未结合的检测抗体用200μL/孔PBST洗涤三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μLABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参照波长492nm)来进行吸光度的确定。
蛋白质纯化
参考标准流程，从过滤的细胞培养物上清中纯化蛋白。简言之，将抗体应用于蛋白质A琼脂糖柱(GE healthcare(GE健康护理))并用PBS洗涤。在pH 2.8实现抗体洗脱，并随后立即中和样品。在PBS中或在20mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0中，通过大小排阻层析法(Superdex 200，GEhealthcare(GE健康护理))将聚集的蛋白质与单体抗体分开。汇集单体抗体级分，如果需要，利用MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩，冷冻和在-20℃或-80℃保存其。提供部分样品进行随后的蛋白质分析和分析表征，例如通过SDS-PAGE、大小排阻层析法或质谱法进行。
SDS-PAGE
预制凝胶系统(Invitrogen)按照供应商的说明来使用。具体地，使用10％或4-12％ Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和MES(还原的凝胶，具有抗氧化运行缓冲液添加剂)或MOPS(未还原的凝胶)运行缓冲液。
分析大小排阻层析法
用于确定抗体聚集和低聚状态的大小排阻层析法通过HPLC层析法来进行。简言之，将蛋白质A纯化的抗体应用于安捷伦(Agilent)HPLC 1100系统上处于300mM NaCl，50mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的TosohTSKgel G3000SW柱或Dionex HPLC-系统上处于2x PBS中的Superdex200柱(GE healthcare(GE健康护理))。洗脱的蛋白通过UV吸光度和峰面积的整合来量化。BioRad凝胶过滤标准151-1901作为标准物。
质谱法
交叉抗体的总去糖基化质量通过电喷射离子化质谱法(ESI-MS)来确定和验证。简言之，用处于100mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7中的50mU N-糖苷酶F(PNGaseF，ProZyme)在37℃，以至多2mg/ml的蛋白质浓度，将100μg纯化的抗体去糖基化12-24小时，并随后在Sephadex G25柱(GEhealthcare(GE健康护理))上通过HPLC来脱盐。各种重链和轻链的质量在去糖基化和还原后通过ESI-MS来确定。简言之，处于115μl中的50μg抗体用60μl 1M TCEP和50μl 8M盐酸胍来温育，并随后脱盐。总质量和还原的重链和轻链的质量通过在装配了NanoMate源的Q-Star Elite MS系统上进行ESI-MS来确定。
IGF-1R ECD结合ELISA
产生的抗体的结合特性在使用IGF-1R胞外结构域(ECD)的ELISA测定中评估。为了该目的，将IGF-1R的胞外结构域(残基1-462)，其包括与N-端His-链霉亲和素结合肽-标记物(His-SBP)融合的α链(根据McKern等.，1997；Ward等.，2001)的人IGF-IR胞外域的天然前导序列和LI-富含半胱氨酸-12结构域(LI-cysteine rich-12 domain)，克隆到pcDNA3载体衍生物中，并在HEK293F细胞中瞬时表达。IGF-1R-His-SBP ECD的蛋白质序列在SEQ ID NO：5中给出。将StreptaWell高结合链霉亲和素A-96孔微量滴定板(Roche(罗氏))用100μL/孔含有可溶性IGF-1R-ECD-SBP融合蛋白的细胞培养物上清在4℃包被过夜，并用200μL/孔PBS，0.05％吐温(PBST，Sigma(西格玛))洗涤三次。随后，100μL/孔处于包含1％BSA(级分V，Roche(罗氏))的PBS(Sigma(西格玛))中的各种抗体的稀释物系列和作为参照的野生型<IGF-1R>抗体加入到孔中，并在微量滴定板摇动器上在室温下温育1-2小时。对于稀释物系列，将等量的纯化抗体作为参照或来自通过夹心式-IgG-ELISA针对相同抗体浓度标准化的HEK293E(HEK293F)中的瞬时转染的上清应用于所述孔。该孔用200μL/孔PBST洗涤三次，并且结合的抗体用浓度为0.1μg/mL的100μL/孔F(ab‘)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体在微量滴定板摇动器上，在室温下检测1-2小时。未结合的检测抗体使用200μL/孔PBST洗涤三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μL ABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参照波长492nm)来进行吸光度的确定。
IGF-1R ECD Biacore
产生的抗体与人IGF-1R ECD的结合也通过利用BIACORE T100仪器(GE healthcare Biosciences AB(GE健康护理生物科学AB)，Uppsala，瑞典)的表面等离振子共振来研究。简言之，为了亲合测量，通过用于呈递针对Fc标记的人IGF-1R ECD(human IGF-1R ECD-Fc tagged)的抗体的胺偶联在CM5芯片上固定山羊-抗-人IgG，JIR 109-005-098抗体。结合在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，ph 7.4)中，25℃测量。将IGF-1R ECD(R&D系统或内部纯化的)以不同浓度加入到溶液中。缔合通过IGF-1R ECD注射80秒-3分钟来测量；解离通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3-10分钟来测量，且KD值利用1∶1朗缪尔结合模式(Langmuir binding model)来评估。由于<IGF-1R>抗体的低负载密度和捕获水平，获得单价IGF-1R ECD结合。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以用于校正系统固有的基线漂移和用于噪音信号的降低。使用Biacore T100评估软件版本1.1.1来分析S曲线(sensorgrams)和用于计算亲合数据(图18)。
ANGPT2结合ELISA
产生的抗体的结合特性在使用全长ANGPT2-His蛋白(R&D Systems(R&D系统))的ELISA测定中进行。为了该目的，将Falcon聚苯乙烯透明强化微量滴定板用处于PBS中的100μl1μg/mL重组人ANGPT2(R&DSystems(R&D系统)，无载体)在室温下包被2小时或在4℃包被过夜。孔用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3次，并用200μl 2％BSA 0，1％吐温20在室温下封闭30分钟，并随后用300μl PBST洗涤3次。将100μL/孔处于PBS(Sigma(西格玛))中的纯化的<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的稀释物系列和作为参照的野生型<ANGPT2>抗体加入到孔中，并在微量滴定板摇动器上在室温下温育1小时。该孔用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3次，并且结合的抗体用处于2％BSA 0，1％吐温20中的100μL/孔0.1μg/ml F(ab‘)<hk>POD(Biozol Cat.No.206005)或100μL/孔0.1μg/mlF(ab‘)<hFcγ>POD(Immuno research(免疫研究))作为检测抗体在微量滴定板摇动器上在室温下进行检测1小时。未结合的检测抗体使用300μL/孔PBST洗涤三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μL ABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参照波长492nm)来进行吸光度的确定。
ANGPT2结合BIACORE
产生的抗体与人ANGPT2的结合也通过利用BIACORE T100仪器(GEhealthcare Biosciences AB(GE健康护理生物科学AB)，Uppsala，瑞典)的表面等离振子共振来研究。简言之，为了亲合测量，通过用于呈递针对人ANGPT2的抗体的胺偶联在CM5或CM4芯片上固定山羊<hIgG-Fcg>多克隆抗体。结合在具有或不具有5mM Ca2+的HBS缓冲液(HBS-P(10mMHEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，ph 7.4)中，在25℃测量。将纯化的ANGPT2-Hi(R&D系统或内部纯化的)以不同浓度加入到溶液中。缔合通过ANGPT2注射3分钟来测量；解离通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3-5分钟来测量，且KD值利用1∶1朗缪尔结合模式来评估。由于ANGPT2制剂的异质性，不能观察到1∶1的结合；KD值因此仅是相对的评估。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以用于校正系统固有的基线漂移和用于噪音信号的降低。使用Biacore T100评估软件版本1.1.1来分析S曲线和用于计算亲合数据(图19)。
抑制hANGPT2与Tie-2-ECD的结合(ELISA)
为了测试ANGPT2抗体干扰Tie2结合的能力，设置以下ELISA。测试在384孔微量滴定板(MicroCoat，DE，Cat.No.464718)上，在RT下进行。每次温育步骤后，用PBST洗涤板3次。开始时，用0.5μg/ml Tie-2蛋白(R&D Systems(R&D系统)，英国，Cat.No.313-TI)包被板至少2小时(h)。其后，用增补了0.2％吐温-20和2％BSA(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE)的PBS封闭孔1小时。纯化的抗体在PBS中的稀释物与0.2μg/ml huANGPT2(R&D Systems(R&D系统)，UK，Cat.No.623-AN)一起在RT下温育1小时。洗涤后，添加0.5μg/ml生物素化的抗-ANGPT2克隆BAM0981(R&D Systems(R&D系统)，UK)和1∶3000稀释的链霉亲和素HRP(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE，Cat.No.11089153001)的混合物1小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE，缓冲液#204530 001，片剂#11 112 422 001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。
ANGPT2-VEGF桥连ELISA
产生的双特异性抗体的结合特性在使用固定的全长VEGF165-His蛋白(R&D Systems(R&D系统))和人ANGPT2-His蛋白(R&D Systems(R&D系统))的ELISA测定中进行，以同时检测结合的双特异性抗体。只有双特异性抗体能够同时结合VEGF和ANGPT2并由此桥连这两种抗原，而单特异性“标准”IgG1抗体应该不能够同时结合VEGF和ANGPT2。为了该目的，将Falcon聚苯乙烯透明强化微量滴定板用处于PBS中的100μl 2μg/mL重组人VEGF165(R&D Systems(R&D系统))在室温下包被2小时或在4℃包被过夜。孔用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3次，并用200μl 2％BSA 0，1％吐温20在室温下封闭30分钟，并随后用300μl PBST洗涤3次。将100μL/孔处于PBS(Sigma(西格玛))中的纯化的双特异性抗体和对照抗体的稀释物系列加入到孔中并在微量滴定板摇动器上在室温下温育1小时。该孔用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3次，并且结合的抗体通过添加处于PBS中的100μl 0.5μg/ml人ANGPT2-His(R&D Systems(R&D系统))来检测。该孔用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3次，并且结合的ANGPT2用100μl 0.5μg/mL<ANGPT2>mIgG1-生物素抗体(BAM0981，R&D Systems(R&D系统))在室温下检测1小时。未结合的检测抗体使用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤三次洗掉，并且结合的抗体通过添加以1∶4稀释在封闭缓冲液中的100μl 1∶2000链霉亲和素-POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，Cat.No.11089153)，在室温下检测1小时。未结合的链霉亲和素-POD缀合物用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3-6次洗掉，并且结合的链霉亲和素-POD缀合物通过添加100μLABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参照波长492nm)来进行吸光度的确定(图20)。
用于检测双特异性抗体同时结合VEGF和ANGPT2的Biacore测定
为了进一步确证来自桥连ELISA的数据，按照以下流程，在BiacoreT100仪器上，利用表面等离振子共振技术构建了另外的测定，以验证与VEGF和ANGPT2的同时结合。数据利用T100软件包来分析：ANGPT2通过经由胺偶联(amincoupling)(无BSA)固定在CM5芯片上的5-His抗体(5-His-Ab无BSA，Qiagen No.34660)，以捕获水平2000-1700RU来捕获。HBS-N缓冲液作为运行缓冲液，活化通过EDC/NHS混合物来进行。5-His-Ab无BSA捕获抗体在偶联缓冲液NaAc，pH 4.5，c＝30μg/mL中稀释，最后通过注射1M Ethanolamin来封闭仍然活化的羧基，检测5000和17000RU的配体密度。浓度为500nM的ANGPT2通过用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释的5-His-Ab以5μL/分钟的流速来捕获。随后，结合ANGPT2和VEGF的双特异性抗体通过用rhVEGF温育来证明。为了该目的，双特异性抗体与以50μL/分钟的流速、浓度为100-500nM且用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释的ANGPT2结合，并且同时的结合通过用处于PBS+0.005％(v/v)吐温20运行缓冲液+1mg/ml BSA中、流速为50μL/分钟且VEGF浓度为100-150nM的VEGF(rhVEGF，R&D-Systems(R&D系统)Cat.-No，293-VE)温育来检测。缔合时间为120秒，解离时间为1200秒。再生以50μL/分钟的流速，用2x10mM甘氨酸pH 2.0和60秒的接触时间来进行。S曲线利用常规双参照(对照参照：双特异性抗体和rhVEGF与捕获分子5-His-Ab的结合)来校正。关于每种Ab的空白使用rhVEGF浓度“0”来测量。Biacore测定图显示在图21中。S曲线利用常规双参照(对照参照：双特异性抗体和rhVEGF与捕获分子5-His-Ab的结合)来校正。关于每种Ab的空白使用rhVEGF浓度“0”来测量。
实施例1：
制备、表达、纯化和表征单特异性二价<IGF-1R>抗体，其中可变结构域VL和VH相互替换，且其中恒定结构域CL和CH1相互替换(本文中缩写为<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体)。
实施例1A
制备关于单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的表达质粒
包括本实施例中所述的各种前导序列的单特异性二价胰岛素样生长因子1受体<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链和轻链可变结构域的序列源自WO 2005/005635中所述的野生型<IGF-1R>抗体重链(SEQ IDNO：1，质粒4843-pUC-HC-IGF-1R)和轻链(SEQ ID NO：2，质粒4842-pUC-LC-IGF-1R)，且重链和轻链恒定结构域源自人抗体(C-κ和IgG1)。
编码<IGF-1R>抗体前导序列、轻链可变结构域(VL)和人κ-轻链恒定结构域(CL)的基因区段连接并与人γ1-重链恒定结构域(铰链-CH2-CH3)的Fc结构域的5’末端融合。编码通过用VL和CL结构域交换VH和CH1结构域获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<IGF-1R>HC*(重链*)(SEQ ID NO：3)。
<IGF-1R>抗体前导序列，重链可变结构域(VH)和人γ1-重链恒定结构域(CH1)的基因区段作为独立的链连接。编码通过用VH和CH1结构域交换VL和CL结构域获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<IGF-1R>LC*(轻链)*(SEQ ID NO：4)。
图5和图6显示修饰的<IGF-1R>HC*重链*和修饰的<IGF-1R>LC*轻链*的蛋白质序列的示意图。
以下，简要描述各种表达载体：
载体DW047-pUC-HC*-IGF-1R
载体DW047-pUC-HC*-IGF-1R是例如用于在HEK293(EBNA)细胞中瞬时表达<IGF-1R>重链*HC*(cDNA组织的表达盒；具有CMV-内含子A)或用于在CHO细胞中稳定表达的表达质粒.
除<IGF-1R>HC*表达盒以外，该载体包含：
-来自载体pUC18的复制起点，其容许在大肠杆菌中复制该质粒，和
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。
<IGF-1R>HC*基因的转录单元由以下元件组成：
-5’末端处的特有的AscI限制性位点
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子，
-随后的内含子A序列，
-人抗体基因的5’-非翻译区，
-免疫球蛋白轻链信号序列，
-人<IGF-1R>成熟HC*链，其编码与人γ1-重链恒定结构域(铰链-CH2-CH3)的Fc结构域的5’末端融合的人轻链可变结构域(VL)和人κ-轻链恒定结构域(CL)的融合体
-具有加A信号序列的3’非翻译区，和
-3’末端处的特有限制性位点SgrAI。
<IGF-1R>HC*表达载体DW047-pUC-HC*-IGF-1R的质粒图谱显示在图7中。<IGF-1R>HC*(包括信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO：3中提供。
载体DW048-pUC-LC*-IGF-1R
载体DW048-pUC-LC*-IGF-1R是例如用于在HEK293(EBNA)细胞中瞬时表达VL-VH/CL-CH1交换<IGF-1R>轻链*LC*(cDNA组织的表达盒；具有CMV-内含子A)或用于在CHO细胞中稳定表达的表达质粒.
除<IGF-1R>LC*表达盒以外，该载体包含：
-来自载体pUC 18的复制起点，其容许在大肠杆菌中复制该质粒，和
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。
<IGF-1R>LC*基因的转录单元由以下元件组成：
-5’末端处的特有限制性位点Sse8387I
-来自人巨细胞病毒的即时早期增强子和启动子，
-随后的内含子A序列，
-人抗体基因的5’-非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-人<IGF-1R>成熟LC*链，其编码人重链可变结构域(VH)和人
γ1-重链恒定结构域(CH1)的融合体
-具有加A信号序列的3’非翻译区，和
-3’末端处的特有限制性位点SalI和FseI。
轻链<IGF-1R>LC*表达载体DW048-pUC-LC*-IGF-1R的质粒图谱显示在图8中。<IGF-lR>LC*(包括信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO：4中提供。
质粒DW047-pUC-HC*-IGF-1R和DW048-pUC-LC*-IGF-1R可以用于瞬时或稳定共转染到例如HEK293，HEK293EBNA或CHO细胞(2-载体系统)中。为了比较的原因，野生型<IGF-1R>抗体由与该实施例中所述的那些类似的质粒4842-pUC-LC-IGF-1R(SEQ ID NO：2)和4843-pUC-HC-IGF-1R(SEQ ID NO：1)瞬时表达。
为了在HEK293EBNA细胞中获得瞬时表达的较高表达水平，可以将<IGF-lR>HC*表达盒经由AscI、SgrAI位点和将<IGF-lR>LC*表达盒经由Sse8387I和FseI位点亚克隆到包含以下各项的4700pUC-Hyg_OriP表达载体中：
-OriP元件，和
-潮霉素抗性基因，作为选择标记。
可以将重链和轻链转录单元亚克隆到2个独立的4700-pUC-Hyg-OriP载体中，从而进行共转染(2-载体系统)，或可以将它们克隆到一个共同的4700-pUC-Hyg-OriP载体(1-载体系统)中，从而随后用由此产生的载体进行瞬时或稳定转染。图9显示基础载体4700-pUC-OriP的质粒图谱。
实施例lB
制备单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体表达质粒
包括野生型<IGF-1R>抗体的交换的Fab序列的<IGF-1R>融合基因(HC*和LC*融合基因)使用已知的重组方法和技术，通过连接相应的核酸区段来装配。
编码IGF-1R HC*和LC*的核酸序列分别通过化学合成来合成，并随后在Geneart(Regensburg，德国)，克隆到基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆载体中。将编码IGF-1R HC*的表达盒经由PvuII和BmgBI限制性位点连接到各种大肠杆菌质粒中，以生成最终载体DW047-pUC-HC*-IGF-1R；将编码各种IGF-1R LC*的表达盒经由PvuII和SalI限制性位点连接到各种大肠杆菌质粒中，以生成最终载体DW048-pUC-LC*-IGF-1R。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时和稳定转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。
实施例1C
在HEK293 EBNA细胞中瞬时表达单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体
重组<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体通过在贴壁生长的HEK293EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物中心，保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959 218)中瞬时共转染质粒DW047-pUC-HC*-IGF-1R和DW048-pUC-LC*-IGF-1R来表达，所述HEK293EBNA细胞是在增补了10％超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，和250μg/ml遗传霉素(Gibco)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，Gibco)中培养的。为了转染，FuGENETM 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals(罗氏分子生物化学))以FuGENETM试剂(μl)与DNA(μg)的比例为4∶1(在3∶1～6∶1的范围内)来使用。编码<IGF-1R>HC*和LC*的轻链和重链质粒(质粒DW047-pUC-HC*-IGF-1R和DW048-pUC-LC*-IGF-1R)利用摩尔比例为1∶1(等摩尔)的编码轻链和重链的质粒，其范围是1∶2～2∶1，分别由两种不同质粒来表达。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格玛(Sigma)]和NAA[Gibco]饲养细胞。在转染后第5-11天通过离心收获包含<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的细胞培养物上清并保存在-20℃。关于人免疫球蛋白在例如HEK293细胞中的重组表达的一般信息在Meissner，P.等.，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)75(2001)197-203中给出。
实施例1D
单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的免疫沉淀
单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体通过使用蛋白质A琼脂糖-珠(Roche(罗氏))的免疫沉淀法从胞培养物上清(实施例1C)中分离。60μL蛋白质A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1％ Nonidet-P40)中洗涤三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清应用于在TBS-NP40中预平衡的蛋白质A琼脂糖珠。室温下温育1小时后，将该珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤1次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲液(2xPBS，Roche(罗氏))洗涤2次并用0.5mL 100mM柠檬酸钠pH 5，0简单洗涤4次。通过添加35μlLDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。样品的一半分别与样品还原剂混合或保持未还原，并在70℃加热10分钟。随后，将20μl应用于4-12％Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有MOPS缓冲液，以用于非还原的SDS-PAGE，和具有抗氧化运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液，以用于还原的SDS-PAGE)，并用考马斯蓝染色。图10显示来自典型免疫测定实验的SDS-PAGE。单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的行为如同典型的IgG1抗体，具有对应于LC*轻链的ca.25kDa条带和对应于各自HC*重链的50kDa条带。在未还原的状态中，对完整抗体可以观察到ca.150kDa的条带。
实施例1E
纯化单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和通过质谱法确认性质
按照已知的标准方法，通过蛋白质A亲合层析法，由过滤的细胞培养物上清中纯化表达和分泌的单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体。简言之，来自瞬时转染的包含<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的细胞培养物上清通过离心(10,000g，10分钟)和经由0.45μm滤器过滤来净化，并应用于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mMNaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的蛋白质A HiTrap MabSelect Xtra柱(GEhealthcare(GE健康护理))。用PBS平衡缓冲液及随后的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 5.5洗出未结合的蛋白，并用PBS清洗。用100mM柠檬酸钠，pH2,8实现<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的洗脱，随后立即用300μl 2MTris pH 9.0/2ml级分来中和样品。在20mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0中，通过在HiLoad 26/60Superdex 200制备级柱(GE healthcare(GE健康护理))上进行的大小排阻层析法将聚集的蛋白质与单体抗体分开，且随后利用MILLIPORE Amicon Ultra-15离心浓缩器浓缩单体抗体级分。在-20℃或-80℃下冷冻和保存<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体。<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换的完整性通过存在和缺乏还原剂的SDS-PAGE和随后用考马斯亮蓝染色来分析，如实施例1D中所述。纯化的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的行为如同典型的IgG1抗体，具有对应于LC*轻链的ca.25kDa条带和对应于各自HC*重链的50kDa条带。在未还原的状态中，对完整抗体可以观察到ca.150kDa的条带。<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的聚集和低聚状态通过分析大小排阻层析法来分析，并显示纯化的Fab交叉抗体处于单体状态。提供表征的样品，以进行随后的蛋白质分析和功能表征。ESI质谱法验证作为主要种类的完全去糖基化的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的理论分子量(在不具有重链C端赖氨酸残基和具有轻链C端焦谷氨酸残基的条件下计算的)(图22)。
实施例1F
在IGF-1R ECD结合ELISA中和通过Biacore分析单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的IGF-1R结合特性
单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的结合特性在使用如上所述的IGF-1R胞外结构域(ECD)的ELISA测定中评估。图11显示来自HEK293E中瞬时转染上清的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和野生型<IGF-1R>抗体通过夹心式-IgG-ELISA滴定的标准化结果。可以清楚地看到<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体是功能性的且表现出与野生型<IGF-1R>抗体相当的结合特性，并因此似乎是完全功能性的。观察到的微小差别在该方法的误差范围内，并且可能是例如由蛋白质浓度的微小变化导致的。
这些发现由关于各种纯化的抗体的Biacore数据来确证，其显示单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体在该方法的误差范围内，具有与初始野生型抗体相当的对IGF-1R ECD的亲和性和结合动力学。动力学数据在下表中给出：
                        ka[1/Ms]       kd[1/s]        K(D)[M]
  野生型<IGF-1R>抗体    3.18E+06       5.521E-3       1.74E-09
  <IGF-1R>VL-VH/CL-CH1  2.65E+06       6.258E-3       2.36E-09交换抗体
实施例1G
通过使用IGF-1R过表达I24细胞的FACS分析单特异性二价<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的IGF-1R结合特性
为了验证<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的结合活性，通过FACS研究与在I24细胞(表达重组人IGF-1R的NIH3T3细胞，Roche(罗氏))表面上过表达的IGF-1R的结合。简言之，5x10E5 I24细胞/FACS管用纯化的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和作为参照的野生型<IGF-1R>抗体的稀释物来温育，并在冰上温育1小时。未结合的抗体用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去。随后，离心细胞(5分钟，400g)并且在避光条件下，用F(ab‘)2<hFcγ>PE缀合物(Dianova)在冰上检测结合的抗体1小时。未结合的检测抗体用4m1冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去。随后，对细胞进行离心(5分钟，400g)，重新悬浮在300-500μL PBS中，并且在FACSCalibur或FACS Canto(BD(FL2通道，10.000细胞/获得物)上量化结合的检测抗体。在实验过程中，包括各自的同种型对照，以排除任何非特异性结合事件。<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和野生型<IGF-1R>参照抗体与I24上的IGF-1R的结合通过平均荧光强度的浓度依赖性移位来比较。
另外的实验显示<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体也保持其在MCF7细胞上诱导IGF-1R内在化的活性，并在DU145细胞上仅具有低ADCC活性，条件是用与野生型<IGF-1R>抗体相当的人PBMC来温育。
总之，实施例1中的实验显示利用结构域交换，可以产生具有与野生型抗体相当的特性的完全功能性抗体。在生物化学和细胞测定中保持所有功能性特性。这些具有结构域交换的抗体形成用于生成如下所述双特异性抗体的基础。
实施例2：
生成、表达、纯化和表征单特异性二价<ANGPT2>抗体，其中可变结构域VL和VH相互替换，且其中恒定结构域CL和CH1相互替换(本文中缩写为<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体)。
实施例2A
制备关于单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体变体的表达质粒
包括本实施例中所述的各种前导序列的单特异性二价血管生成素-2<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链和轻链可变结构域的序列源自WO 2006/045049中所述的人<ANGPT2>抗体重链(SEQ ID NO：6)和轻链(SEQ ID NO：7)，且重链和轻链恒定结构域源自人抗体(C-κ和IgG1)。
编码<ANGPT2>抗体前导序列、轻链可变结构域(VL)和人κ-轻链恒定结构域(CL)的基因区段连接并与人γ1-重链恒定结构域(铰链-CH2-CH3)的Fc结构域的5’末端融合。编码通过用VL和CL结构域交换VH和CH1结构域获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<ANGPT2>HC*(重链*)(SEQ ID NO：8)。
<ANGPT2>抗体前导序列，重链可变结构域(VH)和人γ1-重链恒定结构域(CH1)的基因区段作为独立的链连接。编码通过用VH和CH1结构域交换VL和CL结构域获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<ANGPT2>LC*(轻链*)(SEQ ID NO：9)。
各种表达载体与实施例1A中所述的那些类似。重链*<ANGPT2>HC*表达载体pUC-HC*-ANGPT2>的质粒图谱显示在图12中。<ANGPT2>HC*(包括信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO：8中提供。
轻链<ANGPT2>LC*表达载体pUC-LC*-ANGPT2>的质粒图谱显示在图13中。<ANGPT2>LC*(包括信号序列)的氨基酸序列在SEQ ID NO：9中提供。质粒pUC-HC*-ANGPT2>和pUC-LC*-ANGPT2>可以用于瞬时或稳定共转染到例如HEK293-F，HEK293EBNA或CHO细胞(2-载体系统)中。
为了在HEK293EBNA细胞中获得瞬时表达的较高表达水平，可以将<ANGPT2>HC*表达盒经由AscI、SgrAI位点亚克隆和将<ANGPT2>LC*表达盒经由Sse8387I和FseI位点亚克隆到如上实施例1A中所述的4700pUC-Hyg_OriP表达载体中。可以将重链和轻链转录单元亚克隆到2个独立的4700-pUC-Hyg-OriP载体中，从而进行共转染(2-载体系统)，或可以将它们经由FseI，SgrAI，Sse8387I和AscI位点克隆到一个共同的4700-pUC-Hyg-OriP载体(1-载体系统)中，从而随后用由此产生的载体进行瞬时或稳定转染。
将野生型<ANGPT2>抗体克隆到与本实施例以及以上实施例1A中所述的载体类似的质粒SB04-pUC-HC-ANGPT2(SEQ ID NO：6)和SB06-pUC-LC-ANGPT2(SEQ ID NO：7)中。野生型<ANGPT2>抗体重链和轻链的转录单元由质粒SB04-pUC-HC-ANGPT2和SB06-pUC-LC-ANGPT2基础载体，经由FseI，SgrAI，Sse8387I和AscI位点，亚克隆到质粒SB07-pUC-Hyg-OriP-HC-ANGPT2和SB09-pUC-Hyg-OriP-LC-ANGPT2中，从而在HEK293E细胞中获得较高的瞬时表达水平。为了比较的原因和为了共表达实验(见实施例3)，野生型<ANGPT2>抗体由质粒SB07-pUC-Hyg-OriP-HC-ANGPT2和SB 09-pUC-Hyg-OriP-LC-ANGPT2或由质粒SB 04-pUC-HC-ANGPT2和SB06-pUC-LC-ANGPT2瞬时(共-)表达。
实施例2B
制备单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体表达质粒
包括野生型<ANGPT2>抗体的交换的Fab序列的<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体融合基因(HC*和LC*融合基因)使用已知的重组方法和技术，通过连接相应的核酸区段来装配。
编码<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体HC*和LC*的核酸序列分别通过化学合成来合成，并随后在Geneart(Regensburg，德国)，克隆到基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆载体中。将编码<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体HC*的表达盒经由PstI和EcoNI限制性位点连接到各种大肠杆菌质粒中，以生成最终载体pUC-HC*-<ANGPT2>；将编码各种<ANGPT2>LC*的表达盒经由PvuII和FseI限制性位点连接到各种大肠杆菌质粒中，以生成最终载体pUC-LC*-<ANGPT2>。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时和稳定转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。
实施例2C
在HEK293EBNA细胞中瞬时表达单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体
重组<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体通过在贴壁生长的HEK293EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物中心，保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959 218)中瞬时共转染质粒pUC-HC*-ANGPT2>和pUC-LC*-ANGPT2>来表达，所述HEK293 EBNA细胞是在增补了10％超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，和250μg/ml遗传霉素(Gibco)的DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium，Gibco)中培养的。为了转染，FuGENETM 6转染试剂(RocheMolecular Biochemicals(罗氏分子生物化学))以FuGENETM试剂(μl)与DNA(μg)的比例为4∶1(在3∶1～6∶1的范围内)来使用。编码<ANGPT2>HC*和LC*的轻链和重链质粒(质粒pUC-HC*-ANGPT2>和pUC-LC*-ANGPT2>)利用摩尔比例为1∶1(等摩尔)的编码轻链和重链的质粒，其范围是1∶2～2∶1，分别由两种不同质粒来表达。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格玛(Sigma)]和NAA[Gibco]饲养细胞。在转染后第5-11天通过离心收获包含<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的细胞培养物上清并保存在-20℃。关于人免疫球蛋白在例如HEK293细胞中的重组表达的一般信息在Meissner，P.等.，Biotechnol.Bioeng.(生物技术和生物工程)75(2001)197-203中给出。
实施例2D
纯化单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体和通过质谱法确认性质
按照已知的标准方法，通过蛋白质A亲合层析法，由过滤的细胞培养物上清中纯化表达和分泌的单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体。简言之，来自瞬时转染的包含<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的细胞培养物上清通过离心(10,000g，10分钟)和经由0.45μm滤器过滤来净化，并应用于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的蛋白质A HiTrap MabSelect Xtra柱(GE healthcare(GE健康护理))。用PBS平衡缓冲液及随后的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 5.5洗出未结合的蛋白，并用PBS洗涤。用100mM柠檬酸钠，pH 2,8实现VL-VH/CL-CH1交换抗体的洗脱，随后立即用300μl 2MTris pH 9.0/2ml级分来中和样品。在20mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0中，通过在HiLoad 26/60 Superdex 200制各级柱(GE healthcare(GE健康护理))上进行的大小排阻层析法将聚集的蛋白质与单体抗体分开，且随后利用MILLIPORE Amicon Ultra-15离心浓缩器浓缩单体抗体级分。在-20℃或-80℃下冷冻和保存<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体。<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的完整性通过存在和缺乏还原剂的SDS-PAGE和随后用考马斯亮蓝染色来分析(图23-A)。<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的聚集和低聚状态通过分析大小排阻层析法来分析(图23-B)。提供表征的样品，以进行随后的蛋白质分析和功能表征。ESI质谱法验证作为主要种类的完全去糖基化的<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的理论分子量。不能观察到由抗体样蛋白引起的污染。
实施例在2F
在<ANGPT2>结合ELISA中和通过Biacore分析单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的<ANGPT2>结合特性
单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的结合特性在使用如上所述全长<ANGPT2>-His蛋白(R&D Systems(R&D系统))的ELISA测定中评估。图24显示来自在夹心式结合ELISA中滴定纯化的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和野生型<IGF-1R>抗体的结果。可以清楚地看到<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体是功能性的，且表现出与野生型<ANGPT2>抗体相当的结合特性，并因此似乎是完全功能性的。观察到的微小差别在该方法的误差范围内，并且可能是例如由蛋白质浓度的微小变化导致的。
这些发现用关于各种纯化的抗体的Biacore数据来确证，其显示单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体，其KD值为13pM，在该方法的误差范围内，具有与初始野生型<ANGPT2>抗体，其KD值为12pM相当的对ANGPT2的亲和性和结合动力学。
实施例2G
分析单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的功能特性
为了显示单特异性二价<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体具有与初始野生型<ANGPT2>抗体相当的功能特性，在ELISA结合测定中比较两种抗体干扰ANGPT2与其Tie2受体胞外结构域结合的能力，如上所述。在各个结合ELISA中，关于干扰人ANGPT2的结合，<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体具有135ng/ml的EC50值，这与野生型<ANGPT2>抗体的145nM的EC50值相当。这些数据在使用在其表面上过表达Tie2的HEK293细胞的细胞配体结合竞争测定中得到验证，其中关于干扰人ANGPT2的结合，<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体具有225ng/ml的EC50值，这与野生型<ANGPT2>抗体的205nM的EC50值相当(数据未显示)。
总之，实施例2中的实验显示利用结构域交换，可以产生具有与野生型抗体相当的特性的完全功能性抗体。在生物化学和细胞测定中保持所有功能性特性。这些具有结构域交换的抗体形成用于生成如下在实施例3和4中所述双特异性抗体的基础。
实施例2H
具有结构域交换的抗体的分子建模分析揭示交换的结构域之间的位阻空间可以限制折叠。因此，将构建体设计为这样，其中分别在例如VL-CL和铰链连接区之间的Fab的交换结构域的C端或自由VH-CH1结构域的末端引入另外的甘氨酸残基。各个单特异性二价抗体在下文中表示为<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CH1(G)交换抗体。
包括本实施例中所述的各种前导序列的单特异性二价血管生成素-2<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链和轻链可变结构域的序列源自WO 2006/045049中所述的人<ANGPT2>抗体重链(SEQ ID NO：6)和轻链(SEQ ID NO：7)，且重链和轻链恒定结构域源自人抗体(C-κ和IgG1)。
编码<ANGPT2>抗体前导序列、轻链可变结构域(VL)和人κ-轻链恒定结构域(CL)的基因区段连接并与人γ1-重链恒定结构域(铰链-CH2-CH3)的Fc结构域的5’末端融合并包括另外的甘氨酸残基。编码通过用VL和CL结构域交换VH和CH1结构域获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<ANGPT2>HC(G)*(重链*)(SEQ ID NO：17)。
<ANGPT2>抗体前导序列，重链可变结构域(VH)和人γ1-重链恒定结构域(CH1)的基因区段作为包括另外的甘氨酸残基的独立的链连接。编码通过用VH和CH1结构域交换VL和CL结构域获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<ANGPT2>LC(G)*(轻链*)(SEQID NO：18)。
各种表达载体与以上实施例2中所述的那些类似。随后，使用这些表达载体在HEK293-F细胞中瞬时共表达各种具有结构域交换的<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CH1(G)抗体。各种<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CH1(G)交换抗体由如上所述的瞬时表达来纯化，并用各种抗体的SDS-PAGE、大小排阻层析法和质谱法来分析。蛋白表达产率是良好的，并与对上述常规VL-VH/CL-CH1交换抗体获得的表达产率类似。研究的所有特性显示没有意外的发现，且与各种<ANGPT2野生型抗体基本相当。图31在ANGPT2Biacore结合测定中证明<ANGPT2>野生型抗体和<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CH1(G)抗体实质上相当的特性。在该方法的误差范围内，这两种抗体对人ANGPT2表现出相当的结合亲和性，其评估的KD值(来自两次确定的平均值)关于<ANGPT2>野生型抗体为ca.38pM和关于<ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CH1(G)抗体为ca.45pM。
                               ka[1/Ms]     kd[1/s]      K(D)[M]
  野生型<ANGPT2>抗体           5.26E+05     2.0E-4       3.79E-10
  <ANGPT2>VL-VH(G)/CL-CH1(G)   5.29E+06     2.358E-3     4.45E-09交换抗体
实施例3
表达双特异性二价<ANGPT2-IGF-1R>抗体，其中在特异性结合IGF-1R的重链和轻链中，可变结构域VL和VH相互替换，且恒定结构域CL和CH1相互替换(本文中缩写为<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体)。
实施例3A
在HEK293EBNA细胞中瞬间共表达<ANGPT2>野生型抗体和<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体以生成双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体
为了生成通过位于一侧的<ANGPT2>野生型Fab区识别<ANGPT2>并通过位于另一侧的<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体Fab区识别IGF-1R的功能性双特异性抗体，将2个编码<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体(实施例1A)的表达质粒与2个编码<ANGPT2>野生型抗体的表达质粒(实施例2A)共表达。假设野生型重链HC和Fab交叉重链HC*统计学关联，这导致双特异性二价<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的生成。在两种抗体同等充分表达并不考虑副产物的假设下，这应该导致比例为1∶2∶1的三种主要产物：单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体、双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和<ANGPT2>野生型抗体。另外，可以预期若干副产物诸如LC-LC*(Fab2片段)，HC-HC*(单价抗体)和HC*-LC二聚体。
相反，当共表达两个编码<IGF-1R>野生型抗体(实施例1A)的表达质粒和2个编码作为参照的<ANGPT2>野生型抗体的表达质粒时，应该仅生成少量的功能性双特异性<IGF-1R-ANGPT2>抗体，这归因于重链与来自<IGF-1R>和<ANGPT2>野生型抗体的两条重链统计学关联，而轻链与来自<IGF-1R>和<ANGPT2>野生型抗体的两条重链不受控关联。
为了生成主要产物A)单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体的混合物，在贴壁生长的HEK293-EBNA细胞(表达EB病毒核抗原的人胚肾细胞系293；美国典型培养物中心，保藏号ATCC#CRL-10852，Lot.959 218)中共转染四种质粒DW047-pUC-HC*-IGF-1R和DW048-pUC-LC*-IGF-1R，以及质粒SB07-pUC-Hyg-OriP-HC-ANGPT2和SB09-pUC-Hyg-OriP-LC-ANGPT2(或质粒SB04-pUC-HC-ANGPT2和SB06-pUC-LC-ANGPT2)，所述HEK293-EBNA细胞是在增补了10％超低IgG FCS(胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，和250μg/ml遗传霉素(Gibco)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，Gibco)中培养的。为了转染，FuGENETM 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals(罗氏分子生物化学))以FuGENETM试剂(μl)与DNA(μg)的比例为4∶1(在3∶1～6∶1的范围内)来使用。编码<IGF-1R>HC*和LC*的轻链和重链质粒(质粒DW047-pUC-HC*-IGF-1R和DW048-pUC-LC*-IGF-1R)和编码<ANGPT2>HC和LC的轻链和重链质粒(分别地，质粒SB07-pUC-Hyg-OriP-HC-ANGPT2和SB09-pUC-Hyg-OriP-LC-ANGPT2或质粒SB04-pUC-HC-ANGPT2和SB06-pUC-LC-ANGPT2)利用摩尔比为1∶1(等摩尔)的编码轻链和重链的质粒由四种不同质粒来表达。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格玛(Sigma)]和NAA[Gibco]饲养细胞。收获的上清包含主要产物A)单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体、B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体，并表示为“双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物”。在转染后第5-11天通过离心收获包含双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物的细胞培养物上清并保存在-20℃。
为了比较的原因，野生型<IGF-1R>抗体由HC和LC质粒(4842-pUC-LC-IGF-1R和4843-pUC-HC-IGF-1R，实施例1A)和野生型<ANGPT2>HC和LC质粒(分别地，SB07-pUC-Hyg-OriP-HC-ANGPT2和SB09-pUC-Hyg-OriP-LC-ANGPT2或SB04-pUC-HC-ANGPT2和SB06-pUC-LC-ANGPT2)一起瞬时共表达。在第3天，用L-谷氨酰胺加至4mM，葡萄糖[西格玛(Sigma)]和NAA[Gibco]饲养细胞。收集的上清包含单特异性，双特异性或无结合能力的不同<IGF-1R>和<ANGPT2>野生型抗体变体的混合物并表示为“野生型混合物”，所述单特异性，双特异性或无结合能力归因于轻链与来自<IGF-1R>和<ANGPT2>野生型抗体的两条重链的不受控关联，其导致错误的轻链关联。包含野生型混合物的细胞培养物上清在转染后第5-11天通过离心收获并保存在-20℃。
由于<ANGPT2>野生型抗体显示出比<IGF-1R>野生型和<IGF-1R>Fab交叉抗体显著更高的表达瞬时表达产率，所以<ANGPT2>野生型抗体质粒与<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体质粒的比例向着有利于<ANGPT2>野生型抗体表达的方向偏移。在将来的实验中必须调整质粒比例，以容许同等表达两种特异性，从而导致不同抗体更加均等的分布。
实施例3B
双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的免疫沉淀
主要产物A)单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体的混合物(“双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物”)通过使用蛋白质A琼脂糖-珠(Roche(罗氏))的免疫沉淀法从胞培养物上清(实施例3A)中分离。60μL蛋白质A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris，pH 7.5，150mMNaCl，1％Nonidet-P40)中洗涤三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清应用于在TBS-NP40中预平衡的蛋白质A琼脂糖珠。室温下温育1小时后，将该珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤1次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲液(2xPBS，Roche(罗氏))洗涤2次，并用0.5mL100mM柠檬酸钠pH 5,0简单洗涤4次。通过添加35μlLDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。样品的一半分别与样品还原剂混合或保持未还原，并在70℃加热10分钟。随后，将20μl应用于4-12％Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有MOPS缓冲液，以用于非还原的SDS-PAGE，和具有抗氧化运行缓冲液添加剂(Invitrogen)的MES缓冲液，以用于还原的SDS-PAGE)并用考马斯蓝染色。在SDS-PAGE上不能观察到三种抗体种类之间的差异。所有抗体的行为如同典型的IgG1抗体，具有对应于轻链的ca.25kDa条带和对应于各自重链的50kDa条带。在未还原的状态中，对完整抗体可以观察到ca.150kDa的条带。因此，为了证明功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的存在，纯化三种抗体种类的交叉混合物(实施例3C)并设计细胞FACS桥连测定法(实施例3D)。
实施例3C
纯化双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体
按照已知的标准方法，通过蛋白质A亲合层析法及随后的大小排阻层析法，由过滤的细胞培养物上清中纯化来自实施例3A的主要产物A)单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH 1交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体的混合物(“双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物”)。简言之，来自质粒DW047-pUC-HC*-IGF-1R和DW048-pUC-LC*-IGF-1R和SB07-pUC-Hyg-OriP-HC-ANGPT2和SB09-pUC-Hyg-OriP-LC-ANGPT2的瞬时转染的包含抗体混合物的细胞培养物上清通过离心(10,000g，10分钟)和经由0.45μm滤器过滤来净化，并应用于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的蛋白质AHiTrap MabSelect Xtra柱(GE healthcare(GE健康护理))。用PBS平衡缓冲液及随后的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 5.5洗出未结合的蛋白，并用PBS洗涤。用100mM柠檬酸钠，pH 2,8实现双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的洗脱，随后立即用300μl 2M Tris pH 9.0/2ml级分来中和样品。在20mM组氨酸，150mM NaCl pH 6.0中，通过在HiLoad 26/60Superdex 200制备级柱(GE healthcare(GE健康护理))上进行的大小排阻层析法将聚集的蛋白质与单体抗体分开，且随后利用MILLIPORE Amicon Ultra-15离心浓缩器浓缩单体抗体级分。在-20℃或-80℃下冷冻和保存该VL-VH/CL-CH1交换抗体。该抗体种类的完整性通过在存在和缺乏还原剂的SDS-PAGE和随后用考马斯亮蓝染色来分析(见图14)，如实施例1D所述。该抗体混合物行为如同典型的IgG1抗体，具有对应于轻链的ca.25kDa条带和对应于各自重链的50kDa条带。在未还原的状态中，对完整抗体可以观察到ca.150kDa的条带。蛋白质A纯化后，由SDS-PAGE没有观察到明显的副产物诸如单价抗体等。双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的聚集和低聚状态通过分析大小排阻层析法来分析，并显示纯化的抗体种类处于单体状态。提供表征的样品，以进行随后的蛋白质分析和功能表征。为了证明功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的存在，在细胞FACS桥连测定中分析三种抗体种类的混合物(实施例3D)。
为了比较的原因，由共表达野生型<IGF-1R>抗体HC和LC质粒(4842-pUC-LC-IGF-1R和4843-pUC-HC-IGF-1R，实施例1A)以及野生型<ANGPT2>HC和LC质粒(SB07-pUC-Hyg-OriP-HC-ANGPT2和SB09-pUC-Hyg-OriP-LC-ANGPT2)产生的野生型混合物通过蛋白质A亲合层析法及随后的大小排阻层析法，按照所述程序，从过滤的细胞培养物上清中纯化，作为参照。
实施例3D
在针对I24IGF-1R表达细胞的细胞FACS桥连测定中检测功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体
为了证实来自实施例3A中所述的瞬时共表达的主要产物A)单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体，B)双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体和C)<ANGPT2>野生型抗体的“双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物”中存在功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体，对I24细胞(表达重组人IGF-1R的NIH3T3细胞，Roche(罗氏))进行细胞FACS IGF-1R-ANGPT2桥连测定。该测定的原理在图15中描述。分别存在于上清中(实施例3A)或纯化的抗体混合物中(实施例3C)的双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体能够同时结合I24细胞中的IGF-1R和结合ANGPT2；且因此应该用两个对置的Fab区桥连它的两个靶抗原。
简言之，5x10E5I24细胞/FACS管用50μL未稀释的细胞培养物上清或160μg/mL总纯化抗体混合物的稀释物来温育，并在冰上温育1小时。在第一种情形中，用来自共表达交叉<IGF-1R>质粒(DW047-pUC-HC*-IGF-1R和DW048-pUC-LC*-IGF-1R)和野生型<ANGPT2>质粒(SB04-pUC-HC-ANGPT2>和SB06-pUC-LC-ANGPT2)的细胞培养物上清，表示为“双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物”或B)来自共表达野生型<IGF-1R>质粒(4842-pUC-LC-IGF-1R和4843-pUC-HC-IGF-1R)和野生型<ANGPT2>质粒(SB04-pUC-HC-ANGPT2>和SB06-pUC-LC-ANGPT2)的细胞培养物上清，表示为“野生型混合物”来温育细胞(图16)。在第二种情形中，将来自双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物或来自野生型混合物的各种纯化抗体应用于I24细胞(实施例3C，图17)。未结合的抗体用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去，离心细胞(5分钟，400g)并且用50μl 2μg/mL人血管生成素-2(ANGPT2)(R&D Systems(R&D系统))在冰上检测结合的双特异性抗体1小时。随后，用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗涤一次(图16)或两次(图17)洗去未结合的血管生成素-2(ANGPT2)，离心细胞(5分钟，400g)并且用50μl 5μg/mL<Ang-2>mIgG1-生物素抗体(BAM0981，R&D Systems(R&D系统))在冰上检测结合的血管生成素-2 45分钟；备选地，用50μl 5μg/mL mIgG 1-生物素-同种型对照(R&DSystems(R&D系统))温育细胞。未结合的检测抗体用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去，离心细胞(5分钟，400g)并且在避光条件下，用50μl 1∶400链霉亲和素-PE缀合物(Invitrogen/Zymed)在冰上检测结合的检测抗体45分钟。未结合的链霉亲和素-PE缀合物用4ml冰冷PBS(Gibco)+2％FCS(Gibco)洗去。随后，对细胞进行离心(5分钟，400g)，重新悬浮在300-500μL PBS中，并且在FACSCalibur或FACS Canto(BD(FL2通道，10.000细胞/获得物)上量化结合的链霉亲和素-PE缀合物。在实验过程中，包括各自的同种型对照，以排除任何非特异性结合事件。另外，包括纯化的单特异性二价IgG1抗体<IGF-1R>和<ANGPT2>作为对照。
图16显示来自使用细胞培养物上清的针对I24细胞的细胞FACS桥连测定的结果；图17显示使用纯化的抗体混合物的结果。在这两种其中应用VL-VH/CL-CH1交换技术的情形中，使用来自VL-VH/CL-CH1交换抗体和野生型抗体的共表达的上清或纯化的抗体“双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物”导致荧光性的显著偏移，这说明能够同时结合I24细胞中的IGF-1R和结合ANGPT2的功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的存在；并由此使用对置的Fab区桥连它的两种靶抗原。与此相反且如对共表达两种野生型抗体所预测地，当应用来自野生型<IGF-1R>质粒和野生型<ANGPT2>质粒的共表达的细胞培养物上清或纯化的抗体“野生型混合物”时，仅形成非常少量的功能性双特异性抗体，这仅导致FACS桥连测定中荧光性的微小偏移，这说明仅存在少量部分的功能性双特异性<IGF-1R-ANGPT2>野生型抗体。
这些结果显示，通过编码<IGF-1R>抗体的VL-VH/CL-CH1交换质粒和编码<ANGPT2>抗体的野生型质粒的共表达可以容易地生成同时识别两种不同靶标的功能性双特异性<ANGPT2-IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体。相反，编码<IGF-1R>和<ANGPT2>抗体的两种野生型质粒的共表达导致形成的抗体的高度复杂性和仅小比例的功能性双特异性<IGF-1R-ANGPT2>野生型抗体。
实施例4
生成具有修饰的CH3结构域(杵-进入-臼)的二价双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体(图30)
如上实施例所示，编码野生型抗体的质粒和编码VL-VH/CL-CH1交换抗体的质粒的共表达导致生成主要产物A)单特异性<IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体，B)双特异性VL-VH/CL-CH1交换抗体和C)野生型抗体的双特异性VL-VH/CL-CH1交换混合物。为了进一步提高双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的产率，将杵-进入-臼技术应用于<ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体和野生型<VEGF>抗体的共表达，从而促进各种未修饰的和修饰的重链(经由HC和HC*)的异型二聚化，并获得更加同质的功能性双特异性抗体制备物。在该实施例中，生成如上所述的基于<VEGF>野生型抗体G6-31和VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体Mab536的同时识别VEGF和ANGPT2的双特异性抗体。
如上所述，编码<ANGPT2>抗体前导序列、轻链可变结构域(VL)和人κ-轻链恒定结构域(CL)的基因区段连接并与人γ1-重链恒定结构域(铰链-CH2-CH3)的Fc结构域的5’末端融合。编码通过用VL和CL结构域交换VH和CH1结构域获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并表示为<ANGPT2>HC*(重链*)(SEQ ID NO：8)。
<ANGPT2>抗体前导序列，重链可变结构域(VH)和人g1-重链恒定结构域(CH1)的基因区段作为独立的链连接。编码通过用VH和CH1结构域交换VL和CL结构域获得的各种融合蛋白的DNA通过基因合成产生，并在以下表示为<ANGPT2>LC*(轻链*)(SEQ ID NO：9)。
包括该实施例中所述的各自前导序列的单特异性二价<VEGF>野生型抗体G6-31的野生型重链和轻链可变结构域的序列源自人<VEGF>抗体G6-31的重链可变结构域SEQ ID NO：12和轻链可变结构域SEQ ID NO：13，这二者均源自人噬菌体展示来源的抗VEGF抗体G6-31，其详细记述在Liang等.，J Biol Chem.(生物化学杂志)2006年1月13日；281(2)：951-61中和US 2007/0141065中，且重链和轻链恒定结构域源自人抗体(C-κ和IgGl)。
为了该目的，编码<VEGF>野生型抗体G6-31的重链的质粒通过将由基因合成生成的并编码SEQ ID NO：10的杵残基T366W的CH3基因区段引入到各自的<VEGF>野生型抗体G6-31重链的CH3结构域中来进行修饰，从而形成SEQ ID NO：16；相反，编码VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体Mab536的重链*HC*的质粒通过将由基因合成生成的并编码SEQ IDNO：11的臼残基T366S，L368A，Y407V的CH3基因区段引入到各自的VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体Mab536重链*HC*的CH3结构域中来进行修饰，从而形成SEQ ID NO：15。在该情形中，编码野生型<VEGF>杵抗体G6-31的质粒组成基因组载体，而用于VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体Mab536的质粒组成内含子A-cDNA载体。
随后，在Quad发酵桶中以2.6L的规模，如上所述通过在HEK293-F系统中瞬时转染，以等摩尔比例来共表达各自四种质粒，即编码具有杵的<VEGF>G6-31重链HC SEQ ID NO：16和野生型轻链LC SEQ ID NO：14，和修饰的具有臼的VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT>重链*HC*SEQ IDNO：15和修饰的轻链*LC*(SEQ ID NO：8)的质粒。抗体经由HiTrapMabSelect柱(GE)及随后在如上所述的HiLoad Superdex 200 26/60柱(GE)上进行的大小排阻层析法来纯化。SEC后的产率在来自2L瞬时表达的ca.38mg纯化抗体级分的范围内。图26显示在纯化过程中获得的尺寸排阻级分的还原和非还原SDS-PAGE。在还原的SDS-PAGE上，可以观察到均匀地合成和纯化了各自的野生型和修饰的重链和轻链。然而，在非还原的SDS-PAGE上，显然仍存在若干抗体种类。
以下，获得的尺寸排阻级分通过质谱法来分析(去糖基化但不还原或去糖基化且还原)。通过质谱法可以鉴别级分中的若干抗体种类并还可以为其分配在各自SDS-PAGE上观察到的条带(图27)。下表显示可以鉴别的抗体种类：
  种类   1.运行馏分5去糖基化   1.运行馏分9去糖基化
  LC G6-31/23255Da/(SS)：23251Da   -   -
  HC G6-31/49149Da/(SS)：49136Da   -   -
  LC*VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体/23919Da/(SS)：23914Da   -   -
  HC*VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体Mab536/49245Da/(SS)：49231Da -
  LC G6-31+LC VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体Mab536＝>(SS)：47165Da   X   X
  完整Ab G6-31(SS)144774Da   X
  完整Ab双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体(SS)145532Da(LC+HC G6-31)+(LC*+HC*)   X
  1/2Ab G6-31(SS)72387Da   X   X
  (HC G6-31)+(HC VL-VH/CL-CH1交换   X   X
  <ANGPT2>抗体Mab536)＝>(SS)98367Da
  (SH)2x(HC VL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体Mab536)+LC G6-31＝>121745Da   X
  2x(HC G6-31)+LC G6-31+HCVL-VH/CL-CH1交换<ANGPT2>抗体Mab536＝>(SS)：170754Da   X+20Da
所需的用一个臂识别VEGF且用另一个臂识别ANGPT2的双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体可以因此通过质谱法明确鉴别，且还可以在各自的SDS-PAGE观察到。所需的双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的示意图显示在图30中。可以在级分5和6中发现最高浓度的这种所需的抗体，而其浓度在后来的级分中减少。
另外，能够同时结合ANGPT2和VEGF的双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的存在通过上述ELISA桥连测定(图28)和Biacore桥连测定(图29)来证实，其显示所述双特异性抗体能够同时结合ANGPT2和VEGF。在这些测定中，四价双特异性抗体TvG6-Ang23起对照的作用。
应该注意到，由于野生型<VEGF>抗体G6-31的相对过表达，例如由于编码G6-31衍生物的基因组载体的较好的表达产率，促进无活性副产物的形成，这导致过量的无活性G6-31二聚体和半抗体。为了获得所需双特异性<VEGF-ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的最大产率，正在进行实现全部四种抗体链均匀表达并减少副产物形成的另外的研究。这些研究包括i)最优化用于共表达的4种质粒的等摩尔化学计量，其例如通过组合一种或两种质粒上的转录单元，引入各自的对照元件来实现；以及ii)最优化异型二聚化，其例如通过使用不同的杵-进入-臼技术诸如将另外的二硫键引入CH3结构域例如将Y349C引入“杵链”和将D356C引入“臼链”和/或结合由EP 1870459A1所述地对杵残基使用残基R409D；K370E(K409D)和对臼残基使用D399K；E357K来实现。
序列表
<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司
<120>二价双特异性抗体
<130>24677
<150>EP 07024867
<151>2007-12-21
<160>18
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>467
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>野生型<IGF-1R>抗体重链的氨基酸序列
<400>1
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
        115                 120                 125
Arg Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
    130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
                165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
    210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225                 230                 235                 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
            340                 345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Pro Gly Lys
465
<210>2
<211>235
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>野生型<IGF-1R>抗体轻链的氨基酸序列
<400>2
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
    50                  55                  60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                85                  90                  95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
            100                 105                 110
Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys
        115                 120                 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
    130                 135                 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
            180                 185                 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
        195                 200                 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
    210                 215                 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>3
<211>462
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223><IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链*(HC*)的氨基酸序列，
     其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL，且重链结构域CH1被
     替换为轻链结构域CL
<400>3
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1               5                   10                  15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
    50                  55                  60
Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
                85                  90                  95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser
            100                 105                 110
Lys Trp Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys
        115                 120                 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
    130                 135                 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
            180                 185                 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
        195                 200                 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
    210                 215                 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
225                 230                 235                 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
                245                 250                 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
            260                 265                 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
        275                 280                 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
    290                 295                 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
                325                 330                 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
            340                 345                 350
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
        355                 360                 365
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
    370                 375                 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
385                 390                 395                 400
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
                405                 410                 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
            420                 425                 430
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
        435                 440                 445
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    450                 455                 460
<210>4
<211>240
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223><IGF-1R>VL-VH/CL-CH1交换抗体的轻链*(LC*)的氨基酸序列，
     其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH，且轻链结构域CL被
     替换为重链结构域CH1
<400>4
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly
        115                 120                 125
Arg Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
    130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
                165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
            180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
        195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
    210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225                 230                 235                 240
<210>5
<211>557
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>IGF-1R胞外域His-链霉亲和素结合肽-标记物(IGF-1R-His-SBP ECD)
     的氨基酸序列
<400>5
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
            20                  25                  30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
        35                  40                  45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
    50                  55                  60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
                85                  90                  95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
            100                 105                 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
        115                 120                 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
    130                 135                 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
                165                 170                 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
            180                 185                 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
        195                 200                 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
    210                 215                 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225                 230                 235                 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
                245                 250                 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
            260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
        275                 280                 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
    290                 295                 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
                325                 330                 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
            340                 345                 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
        355                 360                 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
    370                 375                 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
                405                 410                 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
            420                 425                 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
        435                 440                 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
    450                 455                 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465                 470                 475                 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Ala Ala Ala Leu
                485                 490                 495
Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Thr His His His His His His Ser
            500                 505                 510
Gly Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
        515                 520                 525
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
    530                 535                 540
Gln Gly Gln Arg Glu Pro Ser Gly Gly Cys Lys Leu Gly
545                 550                 555
<210>6
<211>471
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗体重链的氨基酸序列
<400>6
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr
        115                 120                 125
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
    130                 135                 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
                165                 170                 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
            180                 185                 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
    210                 215                 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
                245                 250                 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
            260                 265                 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
        275                 280                 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
    290                 295                 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305                 310                 315                 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                325                 330                 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
            340                 345                 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
        355                 360                 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
    370                 375                 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385                 390                 395                 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
                405                 410                 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
            420                 425                 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
        435                 440                 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>7
<211>219
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>野生型血管生成素-2<ANGPT2>抗体轻链的氨基酸序列
<400>7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210>8
<211>468
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223><ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链*(HC*)的氨基酸序列，
     其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL，且重链结构域CH1
     被替换为轻链结构域CL
<400>8
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser
            20                  25                  30
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser
        35                  40                  45
Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu
    50                  55                  60
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn
65                  70                  75                  80
Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
                85                  90                  95
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
    130                 135                 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
145                 150                 155                 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
                165                 170                 175
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
            180                 185                 190
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
        195                 200                 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
    210                 215                 220
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
                245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
            260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
        275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
    290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
                325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
            340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
        355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
    370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
                405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
            420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
        435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210>9
<211>244
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223><ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的轻链*(LC*)的氨基酸序列，
     其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH，且轻链结构域CL被
     替换为重链结构域CH1
<400>9
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
        35                  40                  45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr
        115                 120                 125
Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
    130                 135                 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
                165                 170                 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
            180                 185                 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
    210                 215                 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
Pro Lys Ser Cys
<210>10
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>用在杵-进入-臼技术中的具有T366W交换的CH3结构域(杵)的氨基酸序列
<400>10
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1               5                   10                  15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
        35                  40                  45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
    50                  55                  60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65                  70                  75                  80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
                85                  90                  95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            100                 105
<210>11
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>用在杵-进入-臼技术中的具有T366S，L368A，Y407V交换的CH3结构域(臼)
     的氨基酸序列
<400>11
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1               5                   10                  15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
        35                  40                  45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
    50                  55                  60
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65                  70                  75                  80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
                85                  90                  95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            100                 105
<210>12
<211>469
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>野生型<VEGF>抗体重链的氨基酸序列
<400>12
Mer Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
            20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile
        35                  40                  45
Ser Asp Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
                165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
            180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
        195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
    210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
                245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
    370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210>13
<211>233
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>具有前导序列的野生型<VEGF>抗体轻链的氨基酸序列
<400>13
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
            20                  25                  30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
        35                  40                  45
Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
    50                  55                  60
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
                85                  90                  95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly
            100                 105                 110
Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
        115                 120                 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
    130                 135                 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
                165                 170                 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
            180                 185                 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
        195                 200                 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
    210                 215                 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>14
<211>214
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>不具有前导序列的野生型<VEGF>抗体轻链的氨基酸序列
<400>14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Asn Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>15
<211>446
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223><ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链*(HC*)的氨基酸序列，
     其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL，且重链结构域CH1
     被替换为轻链结构域CL和CH3
<400>15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
            260                 265                 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            340                 345                 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                405                 410                 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>16
<211>450
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>野生型<VEGF>抗体重链的氨基酸序列，其中CH3结构域携带具有T366W(杵)
     交换的氨基酸序列以用于杵-进入-臼技术
<400>16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Phe Val Phe Phe Leu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys
    450
<210>17
<211>447
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223><ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的重链*(HC*)的氨基酸序列，
     其中重链结构域VH被替换为轻链结构域VL，且重链结构域CH1被替换为具有Gly
     的轻链结构域CL
<400>17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
                85                  90                  95
Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Gly Cys Asp Lys Thr His
    210                 215                 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
                245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
            260                 265                 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
        275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
    290                 295                 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
                325                 330                 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
            340                 345                 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
        355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
    370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
                405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
            420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210>18
<211>226
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223><ANGPT2>VL-VH/CL-CH1交换抗体的轻链*(LC*)的氨基酸序列，
     其中轻链结构域VL被替换为重链结构域VH，且轻链结构域CL被替换
     为具有Gly的重链结构域CH1
<400>18
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
        115                 120                 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
    130                 135                 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
            180                 185                 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
        195                 200                 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
    210                 215                 220
Gly Cys
225

Claims (11)

1.二价双特异性抗体，其包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的第一轻链和第一重链；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的第二轻链和第二重链，
其中第二轻链和第二重链的可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中第二轻链和第二重链的恒定结构域CL和CH1相互替换。
2.按照权利要求1的抗体，其特征在于
一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接触；
其中所述包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面被改变，以促进形成所述二价双特异性抗体，其中所述改变的特征在于：
a)改变一条重链的CH3结构域，
由此，在与所述二价双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接触的一条重链的CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成凸起，所述凸起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中
且
b)改变另一条重链的CH3结构域，
由此，在与所述二价双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接触的第二CH3结构域的初始界面内，
氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内生成凹洞，在所述凹洞中可以定位第一CH3结构域的界面内的凸起。
3.按照权利要求2的抗体，其特征在于
所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。
4.按照权利要求2或3中任一项的抗体，其特征在于
所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。
5.按照权利要求2-4中任一项的抗体，其特征在于
通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域的相应位置处的氨基酸来进一步改变两个CH3结构域。
6.按照权利要求1的抗体，其特征在于
两条重链的恒定重链结构域CH3之一被替换为恒定重链结构域CH1；且另一个恒定重链结构域CH3被替换为恒定轻链结构域CL。
7.用于制备按照权利要求1的二价双特异性抗体的方法，其包括下列步骤：
a)用以下各项转化宿主细胞，
-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，和
-载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换；
b)在容许合成所述抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；和
c)从所述培养物中回收所述抗体分子。
8.宿主细胞，其包括
-载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，和
-载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链的核酸分子，
其中可变结构域VL和VH相互替换，
且
其中恒定结构域CL和CH1相互替换。
9.按照权利要求1-6的二价双特异性抗体的组合物。
10.按照权利要求1-6的二价双特异性抗体的诊断组合物。
11.药物组合物，其包括按照权利要求1-6的二价双特异性抗体和至少一种药用赋形剂。
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