CN113039202A - 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和使用方法 - Google Patents

抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113039202A
CN113039202A CN201980050598.6A CN201980050598A CN113039202A CN 113039202 A CN113039202 A CN 113039202A CN 201980050598 A CN201980050598 A CN 201980050598A CN 113039202 A CN113039202 A CN 113039202A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cha
cpa
pvrig
tigit
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980050598.6A
Other languages
English (en)
Inventor
A·W·德雷克
S·库马尔
S·米特拉
A·萨勒斯
S·维兰
A·卡什亚普
K·阿卡马
N·耶瓦莱卡尔
C·F·圣玛丽亚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Compugen Ltd
Original Assignee
Compugen Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Compugen Ltd filed Critical Compugen Ltd
Publication of CN113039202A publication Critical patent/CN113039202A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供抗PVRIG、抗TIGIT和抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，以及组合物和使用所述抗体治疗癌症的方法。

Description

抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请案要求2018年6月1日申请的美国临时专利申请案第62/679,703号和2018年11月30日申请的第62/773,586号的优先权，其全部内容以全文引用的方式并入。
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式以电子方式提交，且在此以全文引用的方式并入。在2019年5月29日创建的ASCII复本命名为114386-5011-WO_SL.txt并且大小为2,631,244字节。
背景技术
初始T细胞必须从抗原呈递细胞(APC)接收两个独立的信号，以便有效地活化。第一信号1是抗原特异性的，并且出现在T细胞抗原受体遇到APC上的适当抗原-MHC复合物时。免疫反应的命运由第二抗原非依赖性信号(信号2)决定，所述信号通过与其APC表达的配体接合的T细胞共刺激分子递送。所述第二信号可以是刺激性的(正性共刺激)或抑制性的(负性共刺激或共抑制)。在没有共刺激信号或存在共抑制信号的情况下，T细胞活化受损或中止，这可能引起抗原特异性无反应状态(称为T细胞无反应性)，或可能引起T细胞凋亡死亡。
共刺激分子对通常由在APC上表达的配体和在T细胞上表达的它们的同源受体组成。共刺激分子的原型配体/受体对是B7/CD28和CD40/CD40L。B7家族由结构相关的细胞表面蛋白配体组成，其可以为免疫反应提供刺激性或抑制性输入。B7家族的成员在结构上相关，胞外域含有至少一个可变或恒定的免疫球蛋白结构域。
正性和负性共刺激信号在细胞介导的免疫反应的调节中起关键作用，并且介导这些信号的分子已被证明是免疫调节的有效标靶。基于这一知识，已经开发了数种涉及靶向共刺激分子的治疗方法，并且显示所述治疗方法可用于通过在癌症患者中开启免疫反应或阻止免疫反应关闭来预防和治疗癌症，可用于预防和治疗自身免疫疾病和炎性疾病以及同种异体移植排斥，分别通过在具有这些病理状况的受试者中关闭不受控制的免疫反应或利用负性共刺激(或共抑制)诱导“关闭信号”来实现。
对B7配体递送的信号的操纵已显示出治疗自身免疫性、炎性疾病和移植排斥的潜力。治疗策略包括使用针对共刺激对的配体或受体的单克隆抗体，或使用由可结合并阻断其适当配体的共刺激受体构成的可溶性融合蛋白阻断共刺激。另一种方法是使用抑制性配体的可溶性融合蛋白诱导共抑制。这些方法至少部分依赖于最终缺失自身或异体反应性T细胞(它们分别是造成自身免疫疾病或移植中的致病过程的原因)，可能是因为在没有共刺激(其诱导细胞存活基因)的情况下，T细胞变得非常容易诱导细胞凋亡。因此，能够调节共刺激信号而不损害免疫系统抵抗病原体的能力的新型药剂对于治疗和预防这种病理状况是非常有利的。
共刺激途径在肿瘤发展中起重要作用。有趣的是，肿瘤已被证明通过抑制B7-CD28和TNF家族中的共刺激因子以及通过吸引抑制抗肿瘤T细胞反应的调节性T细胞阻止T细胞活化来逃避免疫破坏(参见Wang(2006)，《癌症中肿瘤特异性CD4+调节性T细胞的免疫抑制(Immune Suppression by Tumor Specific CD4+Regulatory T cells in Cancer)》，《癌生物学研究文辑(Semin.Cancer.Biol.)》16：73-79；Greenwald等人.(2005)，《B7家族再论(The B7 Family Revisited)》，《免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)》23：515-48；Watts(2005)，《共刺激T细胞反应的TNF/TNFR家族成员(TNF/TNFR Family Members in Co-stimulation of T Cell Responses)》，《免疫学年鉴》23：23-68；Sadum等人，(2007)《小鼠和人类癌症的免疫特征显示肿瘤逃逸的独特机制和癌症免疫疗法的新靶点(ImmuneSignatures of Murine and Human Cancers Reveal Unique Mechanisms of TumorEscape and New Targets for Cancer Immunotherapy)》，《临床癌症研究(Clin.Canc.Res.)》13(13)：4016-4025)。这种肿瘤表达的共刺激分子已经成为有吸引力的癌症生物标志物，并且可以充当肿瘤相关抗原(TAA)。此外，已经将共刺激途径鉴定为免疫检查点，其在肿瘤转移中的起始和效应功能水平上减弱T细胞依赖性免疫反应。
在过去的十年中，已开发出用于治疗自身免疫疾病、移植物排斥、过敏和癌症的各种共刺激蛋白的激动剂和/或拮抗剂。例如，CTLA4-Ig(阿巴西普(Abatacept)，
Figure BDA0002922546330000031
)被批准用于治疗RA，用于预防急性肾移植排斥的突变CTLA4-Ig(贝拉西普(Belatacept)，
Figure BDA0002922546330000032
)和抗CTLA4抗体(伊匹单抗(Ipilimumab)，
Figure BDA0002922546330000033
)最近被批准用于治疗黑素瘤。其它共刺激调节剂已获批准，例如Merck
Figure BDA0002922546330000034
和BMS
Figure BDA0002922546330000035
的抗PD-1抗体已被批准用于癌症治疗，并且也在测试病毒感染。
然而，尽管具有抗检查点抑制剂抗体的单一疗法已经显示出希望，但许多研究(Ahmadzadeh等人，《血液(Blood)》114：1537(2009)，Matsuzaki等人，《美国科学院院报(PNAS)》107(17)：7875-7880(2010)，Fourcade等人，《癌症研究(Cancer Res.)》72(4)：887-896(2012)和Gros等人，《临床研究杂志(J.Clinical Invest.)》124(5)：2246(2014))审查了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，表明TIL通常表达多个检查点受体。此外，表达多个检查点的TIL可能实际上是最具肿瘤反应性的。相反，外周的非肿瘤反应性T细胞更可能表达单个检查点。使用单特异性全长抗体的检查点阻断对于肿瘤反应性TIL的去抑制与假设引起自身免疫毒性的自身抗原反应性单表达T细胞相比可能是非歧视性的。
一个所关注的标靶是PVRIG。PVRIG，也称为含有脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的蛋白、Q6DKI7或C7orf15，是一种长度为326个氨基酸的跨膜结构域蛋白，具有信号肽(跨越氨基酸1至40)、胞外域(跨越氨基酸41至171)、跨膜结构域(跨越氨基酸172至190)和细胞质结构域(跨越氨基酸191至326)。PVRIG与脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2(PVLR2，也称为连接蛋白-2(nectin-2)、CD112或疱疹病毒侵入介体B(HVEB)、人质膜糖蛋白)，即PVRIG的结合配偶体结合。
另一个所关注的标靶是TIGIT。TIGIT是一种在效应和调节(Treg)CD4+ T细胞、效应CD8+ T细胞和NK细胞上高效表达的共抑制受体。已展示TIGIT通过(1)直接信号传导，(2)诱导配体信号传导，以及(3)竞争和破坏利用共刺激受体CD226(也称为DNAM-1)的信号传导来减弱免疫反应。TIGIT信号传导已经在NK细胞中得到最充分的研究，其中已经证明与其同源配体脊髓灰质炎病毒受体(PVR，也称为CD155)的接合通过其细胞质ITIM域直接抑制NK细胞的细胞毒性。TIGIT基因的敲除或TIGIT/PVR相互作用的抗体阻断已展示在体外增强NK细胞杀伤，以及加剧体内自身免疫疾病。除了对T细胞和NK细胞的直接作用外，TIGIT还可在树突状细胞或肿瘤细胞中诱导PVR介导的信号传导，从而引起抗炎细胞因子(例如IL10)的产生增加。在T细胞中，TIGIT还可以通过破坏共刺激受体CD226的同二聚化，并通过与其竞争结合于PVR来抑制淋巴细胞反应。
TIGIT在淋巴细胞上高度表达，包括浸润不同类型肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和Treg。PVR也在肿瘤中广泛表达，表明TIGIT-PVR信号轴可能是癌症的主要免疫逃逸机制。值得注意的是，TIGIT表达与另一种重要的共抑制受体PD1的表达密切相关。TIGIT和PD1在许多人类和鼠类肿瘤的TIL上共表达。与TIGIT和CTLA4不同，PD1对T细胞反应的抑制不涉及配体与共刺激受体结合的竞争。
因此，能够靶向两种途径的PVRIG/TIGIT双特异性抗体是用于单一抗体疗法的有吸引力的标靶。此类抗体将允许靶向多个检查点受体并且在癌症治疗中提供治疗重要性。如本文所描述，还提供抗PVRIG和抗TIGIT抗体供使用。
发明内容
因此，本发明提供一种单价结合人类PVRIG并且单价结合TIGIT的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，以用于活化T细胞，从而治疗癌症。
在一些实施例中，本发明提供一种单价结合人类PVRIG并且单价结合TIGIT的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，以用于活化T细胞和/或NK细胞，从而治疗癌症。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)第一抗原结合部分，其包含：
i.第一重链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
ii.第一轻链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3；
其中所述抗PVRIG抗体选自由以下组成的组：CHA.7.518.4、CHA.7.518.1、CHA.7.518、CHA.7.524 CHA.7.530、CHA.7.538_1、CHA.7.538_2、CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CHA7.538.1.2、CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049、CPA.7.050和CHA.7.518；和
a)第二抗原结合部分，其包含抗TIGIT抗原结合域。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)第一抗原结合部分，其包含抗PVRIG抗原结合域；和
b)第二抗原结合部分，其包含：
i.第二重链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
ii.第二轻链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3；
其中所述抗TIGIT抗体选自由以下组成的组：CPA.9.086、CHA.9.547.18、CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7和CHA.9.541.8。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)第一抗原结合部分，其包含：
i.第一重链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
ii.第一轻链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3
其中所述抗PVRIG抗体选自由以下组成的组：CHA.7.518.4、CHA.7.518.1、humanized CHA.7.518、humanized CHA.7.524、humanized CHA.7.530、humanizedCHA.7.538_1、humanized CHA.7.538_2、CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CHA7.538.1.2、CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049和CPA.7.050CHA.7.518；和
b)第二抗原结合部分，其包含：
i.第二重链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
ii.第二轻链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3；
其中所述抗TIGIT抗体选自由以下组成的组：CPA.9.086、CHA.9.547.18、CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.086、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7和CHA.9.541.8。
在一些实施例中，第一抗原结合部分包含：
i.第一重链，其包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3；和
ii.第一轻链，其包含VL-CL，其中所述CL为κ或λ抗体的恒定域。
在一些实施例中，第一重链CH3包含氨基酸取代S354C、E356D、M358L和T366W。
在一些实施例中，CL为κ。
在一些实施例中，第二抗原结合部分包含：
i.第二重链，其包含HC-CL-铰链-CH2-CH3，其中所述CL是κ或λ；和
ii.第二轻链，其包含VL-CH1。
在一些实施例中，第二重链CH3包含氨基酸取代Y349C、E356D、M358L、T366S、L368A和Y407V。
在一些实施例中，CL是λ。
在一些实施例中，CL为κ。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)第一抗原结合部分，其包含抗PVRIG抗原结合域；和
b)第二抗TIGIT抗原结合部分，其包含：
i.第二重链可变区，其包含CPA.9.086 VH(EVQLVETGGGLIQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSS；SEQ ID NO：1634)；和
ii.第二轻链可变区，其包含CPA.9.086 VL(QSALTQPRSASGNPGQRVTISCSGSSSNMGRRPVNWYQQIPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLTISGLQSEDEAEYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLAVL；SEQ ID NO：1639)。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
c)第一抗原结合部分，其包含抗PVRIG抗原结合域；和
d)第二抗TIGIT抗原结合部分，其包含：
i.第二重链可变区，其包含CPA.9.547.18 VH(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SSYIMSWVRQAPGKGLEWVATISGGSKGQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWLLSYYA MDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1664)；和
ii.第二轻链可变区，其包含CPA.9.547.18 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQS MAIWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASKSHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCOOGOSYPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1668)。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.1 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1539)；和
ii.第一轻链，其包含CHA.7.518.1 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQID NO：1544)；和
b)第二抗原结合部分，其包含抗TIGIT抗原结合域。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.4 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：3179)；和
ii.第一轻链，其包含CHA.7.518.4 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQID NO：3180)；和
b)第二抗原结合部分，其包含抗TIGIT抗原结合域。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.1 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1539)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CHA.7.518.1(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTITISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1544)；和
b)包含抗TIGIT结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CPA.9.086 VH(EVQLVETGGGLIQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSS；SEQ ID NO：1634)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CPA.9.086 VL(QSALTQPRSASGNPGQRVTISCSGSSSNMGRRPVNWYQQIPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASITISGLQSEDEAEYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLAVL；SEQ ID NO：1639)。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.4 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：3179)；和
ii.第一轻链，其包含CHA.7.518.4 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQID NO：3180)；和
b)包含抗TIGIT结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含：
i.第一重链可变区，其包含CPA.9.086 VH(EVQLVETGGGLIQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSS；SEQ ID NO：1634)；
ii，第一轻链可变区，其包含CPA.9.086 VL(QSALTQPRSASGNPGQRVTISCSGSSSNMGRRPVNWYQQIPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLTISGLQSEDEAEYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLAVL；SEQ ID NO：1639)。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.1(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1539)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CHA.7.518.1 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTITISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1544)；和
b)包含抗TIGIT结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含：
i.第一重链可变区，其包含CHA.9.547.18 HC(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVATISGGSKGQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWLLSYYAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1664)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CHA.9.547.18 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSMAIWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASKSHTGVPSRFSGSGSGTDFTITISSLQPEDFATYYCQQGQSYPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1668)。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含：
a)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.4 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：3179)；和
ii.第一轻链，其包含CHA.7.518.4 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTITISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQID NO：3180)；和
b)包含抗TIGIT结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含：
i.第一重链可变区，其包含CHA.9.547.18 HC(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVATISGGSKGQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWLLSYYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1664)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CHA.9.547.18 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSMAIWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASKSHTGVPSRFSGSGSGTDFTITISSLQPEDFATYYCQQGQSYPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1668)。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体为人源化抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种包含如本文所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的组合物。
一种核酸组合物，其包含：
a)编码如本文所述的第一重链或重链可变域的第一核酸；
b)编码如本文所述的第一轻链或轻链可变域的第二核酸；
c)编码如本文所述的第二重链或重链可变域的第三核酸；和
d)编码如本文所述的第二轻链或轻链可变域的第四核酸。
在一些实施例中，本发明提供一种表达载体组合物，其包含：
a)第一表达载体，其包含如本文所述的第一核酸；
b)第二表达载体，其包含如本文所述的第二核酸；
c)第三表达载体，其包含如本文所述的第三核酸；和
d)第四表达载体，其包含如本文所述的第四核酸。
在一些实施例中，本发明提供一种表达载体组合物，其包含：
a)第一表达载体，其包含如本文所述的第一和第二核酸；和
b)第二表达载体，其包含如本文所述的第三和第四核酸。
在一些实施例中，本发明提供一种包含如本文所述的表达载体组合物的宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供一种制成抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的方法，其包含：
a)在表达所述抗体的条件下培养如本文所述的宿主细胞；和
b)回收所述抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者T细胞的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中患者的T细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者的细胞毒性T细胞(CTL)的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中患者的CTL的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者NK细胞的方法，其包含向所述患者施用如本文所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中患者的NK细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者的γδT细胞的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中患者的γδT细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者Th1细胞的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中患者的Th1细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种减少或消除患者至少一种调节性T细胞(Treg)的细胞数目和/或活性的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种增加患者体内的干扰素γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG/抗TIGIT抗体。
在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌(Merkel Cells cancer)、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)。
在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
在一些实施例中，本发明提供一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
a)包含抗PVRIG抗原结合部分的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含：
i.第一重链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
ii.第一轻链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3：
其中所述抗PVRIG抗原结合部分选自由以下组成的组：CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049、CPA.7.050、CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CHA.7.518.1；CHA7.538.1.2和CHA.7.518.4；和
b)包含抗TIGIT抗原结合域的第二抗原结合部分，其中所述抗TIGIT抗原结合域来自如图24和41，并且特别是图24A-24EE中所提供的抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
a)第一抗原结合部分，其包含抗PVRIG抗原结合域，其中所述抗PVRIG抗原结合域来自如图35中所提供的抗体；和
b)包含抗TIGIT抗原结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含：
i.第二重链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
ii.第二轻链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3；
其中所述抗TIGIT抗原结合域选自由以下组成的组：CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.086、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7、CHA.9.541.8和CHA.9.547.18。
在一些实施例中，本发明提供一种抗PVRIG抗体，其包含：
i)重链或重链可变域，其包含来自以下序列的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3179)，
和
ii)轻链或轻链可变域，其包含来自以下序列的vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO：3180)。
在一些实施例中，本发明提供一种抗TIGIT抗体，其包含：
i)重链或重链可变域，其包含来自以下序列的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVATISGGSKGQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWLLSYYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1664)，
和
ii)轻链或轻链可变域，其包含来自以下序列的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3：DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSMAIWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASKSHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQSYPYTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO；1668)。
在一些实施例中，抗PVRIG抗体包含：
a)重链，其包含CHA.7.518.4 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；SEQ ID NO：3175)；和
b)轻链，其包含CHA.7.518.4 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；SEQ ID NO：3362)。
在一些实施例中，本发明提供一种包含如本文所述的抗PVRIG抗体的组合物。
在一些实施例中，本发明提供一种核酸组合物，其包含：
i)编码如本文所述的重链或重链可变域的第一核酸；和
ii)编码如本文所述的轻链或轻链可变域的第二核酸。
在一些实施例中，本发明提供一种组合物，其包含如本文所述的抗TIGIT抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种核酸组合物，其包含：
i)编码如本文所述的重链或重链可变域的第一核酸；和
ii)编码如本文所述的轻链或轻链可变域的第二核酸。
在一些实施例中，本发明提供一种表达载体组合物，其包含：
i)第一表达载体，其包含如本文所述的第一核酸；和
ii)第二表达载体，其包含如本文所述的第二核酸。
一种表达载体，其包含：
i)如本文所述的第一核酸；和
ii)如本文所述的第二核酸。
在一些实施例中，本发明提供一种表达载体组合物，其包含：
i)第一表达载体，其包含如本文所述的第一核酸；和
ii)第二表达载体，其包含如本文所述的第二核酸。
在一些实施例中，本发明提供一种表达载体，其包含：
i)如本文所述的第一核酸；和
ii)如本文所述的第二核酸。
在一些实施例中，本发明提供一种包含如本文所述的表达载体或载体组合物的宿主细胞。
在一些实施例中，本发明提供一种制成抗PVRIG或抗TIGIT抗体的方法，其包含：
i)在表达所述抗体的条件下培养如本文所述的宿主细胞；和
ii)回收所述抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者T细胞的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的T细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者的细胞毒性T细胞(CTL)的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的CTL的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者NK细胞的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的NK细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者的γδT细胞的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的γδT细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者Th1细胞的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的Th1细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种减少或消除患者至少一种调节性T细胞(Treg)的细胞数目和/或活性的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种增加患者的干扰素γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)。
在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含如本文所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的组合疗法。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含如本文所描述的抗PVRIG抗体和抗PD-1抗体的组合疗法。
在一些实施例中，抗PD-1抗体为选自由帕博利珠单抗和纳武单抗组成的组的抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含如本文所描述的抗TIGIT抗体和抗PD-l抗体的组合疗法。
在一些实施例中，抗PD-1抗体为选自由帕博利珠单抗和纳武单抗组成的组的抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含如本文所述的抗TIGIT抗体和如本文所述的抗PVRIG抗体的组合疗法。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含如本文所描述的抗TIGIT抗体、抗PVRIG抗体和抗PD-1抗体的三联组合疗法。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含如本文所描述的抗TIGIT、抗PVRIG抗体和抗PD-1抗体的三联组合疗法。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含如本文所描述的抗TIGIT抗体、如本文所描述的抗PVRIG抗体和抗PD-1抗体的三联组合疗法。
在一些实施例中，抗PD-1抗体为选自由帕博利珠单抗和纳武单抗组成的组的抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者T细胞的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的T细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者的细胞毒性T细胞(CTL)的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的CTL的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者的γδT细胞的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的γδT细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种活化患者Th1细胞的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中患者的Th1细胞的子集被活化。
在一些实施例中，本发明提供一种减少或消除患者至少一种调节性T细胞(Treg)的细胞数目和/或活性的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
在一些实施例中，本发明提供一种增加患者的干扰素γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，其包含向患者施用如本文所描述的抗PVRIG或抗TIGIT。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者癌症的方法，其包含向患者施用如本文所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)。
在一些实施例中，癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
附图说明
图1描绘人类PVRIG的序列(展示两个不同甲硫氨酸起始点以及全长序列)。信号肽加下划线，ECD加双下划线。PVRIG，也称为含有脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的蛋白质、Q6DKI7或C7orf15，涉及RefSeq登录标识符NP_076975中所示的氨基酸和核酸序列，如图1所示。
图2描绘了PVRIG的结合配偶体人类脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2(PVLR2，也称为连接蛋白-2、CD112或疱疹病毒侵入介体B(HVEB))的序列。PVLR2是人质膜糖蛋白。
图3A-3C展示Fab的CDR序列，其确定成功阻断PVRIG与其对应的PVRL2的相互作用。
图4A-4AA展示结合PVRIG并且阻断PVRIG和PVLR2的结合的本发明所列举的人类CPA抗PVRIG序列的重链和轻链可变域、全长重链和轻链以及重链可变CDR和轻链可变CDR的氨基酸序列。
图5A-5H描绘了结合PVRIG但不阻断PVRIG和PVLR2的结合的本发明的八个人类CPA抗PVRIG序列的重链和轻链可变域、全长重链和轻链以及重链可变CDR和轻链可变CDR的氨基酸序列。
图6A-6G描绘了结合PVRIG产生的所有CPA抗PVRIG抗体序列的CDR，包括不阻断PVRIG和PVLR2的结合的那些抗体序列。
图7A-7AE描绘可变重链和轻链以及所列举的本发明以下CHA抗体中的每一者的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列：CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550和CHA.7.518.4(这些序列包括来自小鼠序列(来自杂交瘤)的可变重链和轻链序列)。
图8A-8D描绘了所列举的本发明CPA抗体CPA.7.001到CPA.7.050中的每一个的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列是人类序列(来自噬菌体显示)。
图9A-9C描绘人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的序列。
图10描绘许多人类PVRIG ECD片段。
图11A-11I描绘五个CHA抗体的人源化序列的排列。
图12A-12E描绘五个CHA抗体的人源化序列的排列。
图13描绘用于组合图11A-11I和图12A-12E的人源化VH和VL CHA抗体的方案。“chimVH”和“chimVL”是连接到人IgG恒定域的小鼠可变重链和轻链序列。
图14A-14BX展示了在本发明中使用的许多PVRIG序列和其它序列。
图15A和15B描绘所列举的本发明CHA抗体CHA.7.518.1.H4(S241P)和CHA.7.538.1.2.H4(S241P)中的每一个的可变重链和轻链以及vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。
图16A-16E描绘四个人源化序列，CHA.7.518、CHA.7.524、CHA.7.530、CHA.7.538_1和CHA.7.538_2中的每一个。所有人源化抗体均包含H4(S241P)取代。请注意，CHA.7.538_2的轻链与CHA.7.538_1的轻链相同。每一个的“H1”是不改变人类框架的“CDR交换”。后续序列改变了以较大的粗体字显示的框架改变。CDR序列以粗体表示。CDR定义是网站www.bioinf.org.uk/abs/的AbM。人类种系和连接序列来自
Figure BDA0002922546330000241
即国际
Figure BDA0002922546330000242
信息系统www.imgt.org(创建者和管理者：法国蒙彼利埃(Montpellier，France)的Marie-Paule Lefranc)。残基编号显示为序列的(seq)或根据Chothia，根据网站www.bioinf.org.uk/abs/(AbM)。“b”表示埋入的侧链；“p”表示部分埋入；“i”表示在VH与VL结构域之间的界面处的侧链。人类与鼠类种系之间的序列差异由星号(*)标注。在序列下方标注框架中潜在的额外突变。如图所示，CDR序列中的潜在变化标注在每个CDR序列下方(#脱酰胺取代：Q/S/A；这些可以防止天冬酰胺(N)脱酰胺。@色氨酸氧化取代：Y/F/H；这些可以防止色氨酸氧化；@甲硫氨酸氧化取代：L/F/A)。
图17A-17C描绘三种CHA抗体的人源化序列的排列：CHA.7.518、CHA.7.538.1和CHA.7.538.2。
图18描绘用于组合人源化VH和VL CHA抗体的方案。“chimVH”和“chimVL”是连接到人IgG恒定域的小鼠可变重链和轻链序列。
图19.PVRIG直系同源物的序列比对。比对人、食蟹猴、狨猴以及恒河猴PVRIG胞外域的序列。人与食蟹猴之间的差异用黄色突出显示。
图20A-20D描绘了AB-407(BOJ-5G4-F4)的可变重链的氨基酸序列和核酸序列(分别是A和B)以及可变轻链的氨基酸序列和核酸序列(分别是C和D)。
图21A和21B描绘了人类IgG1(具有一些有用的氨基酸取代)、IgG2、IgG3、IgG4、具有特别适用于本发明的铰链变体的IgG4的恒定域以及κ和λ轻链的恒定域的氨基酸序列。
图22描绘了人和食蟹猕猴(称为食蟹猴)TIGIT ECD以及人PVR ECD蛋白的序列。
图23A-23D描绘抗TIGIT抗体的序列。除非另外指出，否则CDR利用IMGT编号(包括序列表的抗体)。
图24A-24SSSS描绘用于本发明双特异性抗体的许多抗TIGIT抗体的序列。
图25描绘的示范性双特异性抗体实施例的示意图，其使用CrossMab技术(《单克隆抗体(MAbs)》2016年8月-9月；8(6)：1010-1020)和杵臼技术(knobs in hole technology)(《自然生物科技(Nat Biotechnol)》.1998年7月；16(7)：677-81)。
图26提供CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086双特异性抗体中的每个臂的重链和轻链序列。可变域以斜体字展示。将CDR用红色着色。Fc结构域中的突变以粗体并加下划线展示。
图27提供(A)人类TIGIT在两个独立表面上结合于捕获的TIGIT-PVRIG双特异性抗体和(B)人类PVRIG在两个独立表面上结合于捕获的TIGIT-PVRIG双特异性抗体的SPR传感图(黑线)。(A)和(B)两者中的红线为传感图与简单1∶1动力学结合模型的全局拟合。TIGIT的浓度范围为362pM-88nM，并且PVRIG的浓度范围为460pM-112nM。因为在用TIGIT抗原15分钟之后没有足够的解离信号衰减数据，所以kd在1e-5秒-1下任意地保持恒定，以用于全局拟合。当使kd对于TIGIT双特异性相互作用保持恒定时，估计ka为3.9e6M-1秒-1，其中kd/ka比率计算KD＝2.6pM。对于PVRIG双特异性抗体相互作用的结合常数是ka＝1.3e6M-1秒-1，kd＝2.4e-4秒-1，和KD＝187pM。
图28描绘展现人类TIGIT和人类PVRIG同时结合到抗TIGIT-PVRIG双特异性抗体的SPR“夹心”分析。双特异性抗体首先注射到(A)共价固定到生物传感器芯片的人类TIGIT上。人类PVRIG然后注射到(B)TIGIT结合双特异性抗体上。
图29描绘pp65特异性CD8+ T细胞的表征。A)用pp65(495-503)肽、IL-2和IL-7活化PBMC 11天。进行流式细胞测量术以评定pp65反应性T细胞的百分比和PVRIG、TIGIT和PD-1的表达。展示了来自1名供体的代表性门控分级结构和来自两名供体的代表性四聚体染色。从左到右，淋巴细胞通过前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)(左上方)和活CD3+CD8+阳性细胞来进行门控。在CD3+CD8+阳性群体内，测定结合HLA-A201 pp65四聚体的细胞的百分比并且展示来自2名供体的数据。B.通过流式细胞测量术评估PVRIG、TIGIT和PD-1在pp65反应性T细胞上的表达。右上角的数字表示所关注的标靶相对于同型对照的MFIr。
图30描绘抑制受体阻断对CMV pp65反应性CD8 T细胞与Mel-624 pp65癌细胞系共培养的影响。用于2名供体(供体4(A)和供体72(B))的CMV pp65反应性T细胞在以下存在下与异位表达pp65的经修饰Mel-624肿瘤细胞系共培养18小时：单独或组合的CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086、CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb或人类IgG同型对照。分析条件培养基的细胞因子分泌。条形上方的数字指示相对于同型对照的变化％。条形图展示IFN-γ的平均值±标准差(N＝2)。
图31提供对与Mel-624 pp65癌细胞系共培养的CMV pp65反应性CD8 T细胞的抑制性受体阻断的剂量依赖性滴定。用于2名供体(供体4(A)和供体72(B))的CMV pp65反应性T细胞在以下存在下与异位表达pp65的经修饰Mel-624肿瘤细胞系共培养18小时：单独或组合的CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086、CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb或人类IgG同型对照。开始于20μg/ml的10个点4倍稀释系列用于每一抗体。分析条件培养基的细胞因子分泌。报告使用CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086的组合阻断和双特异性抗体治疗的EC50(nM)值。代表性数据(N＝2)。
图32提供对在适用于本发明双特异性抗体的双特异性抗体产生中使用的Fc异源二聚化策略的概述。(参见Godar等人，《治疗性专利的专家意见(Expert Opinion onTherapeutic Patents)》，28(3)：251-276(2018)。)
图33提供对适用于本发明双特异性抗体的不对称双特异性抗体形式的概述。(参见Brinkmann和Kontermann，《双特异性抗体的制成(The making of bispecificantibodies)》，《单克隆抗体》，9(2)：182-212(2017)。)
图34提供对适用于本发明双特异性抗体的对称双特异性抗体形式的概述。(参见Brinkmann和Kontermann，《双特异性抗体的制成》，《单克隆抗体》，9(2)：182-212(2017)。)
图35提供用于本发明双特异性抗体中的额外抗PVRIG抗体。
图36提供人类PVRIg结合到捕获的PVRIg双特异性抗体和单特异性抗体的SPR传感图(黑线)。两者中的红线为传感图与简单1∶1动力学结合模型的全局拟合。PVRIG的浓度范围为460pM至112nM。(A)CHA.7.518.4-H4臼+CHA.9.547.18-H4 CrossMab杵，(B)CHA.7.518.4-H4臼+CPA.9.086-CrossMab H4杵，(C)CHA.7.518.4-H4臼+CPA.9.086 scFv(VL-VH)-H4杵，(D)CHA.7.518.4-H4臼+CPA.9.086 scFv(VH-VL)-H4杵，(E)CPA.9.086 scFv(VH-VL)H4 varl+CHA.7.518.1 Fab H4 var2，(F)CHA.7.518.1 scFv(VL-VH)H4varl+CPA.9.086 Fab H4 var2，(G)CHA.9.547.18 scFv(VH-VL)H4var1+CHA.7.518.4 Fab H4var2，(H)CHA.7.518.4 scFv(VL-VH)H4var1+CHA.9.547.18 Fab H4 var2，(I)CHA.7.518.1H4，(I)(J)Synagis H4。从每个抗体的kd/ka比率(KD)计算来估计结合亲和力并且展现于图38中。
图37提供人类TIGIT结合到捕获的TIGIT双特异性抗体和单特异性抗体的SPR传感图(黑线)。红线为传感器克与简单1∶1动力学结合模型的全局拟合。TIGIT的浓度范围为362pM-88nM。(A)CHA.7.518.4-H4臼+CHA.9.547.18-H4CrossMab杵，(B)CHA.7.518.4-H4臼+CPA.9.086-CrossMab H4杵，(C)CHA.7.518.4-H4臼+CPA.9.086 scFv(VL-VH)-H4杵，(D)CHA.7.518.4-H4臼+CPA.9.086 scFv(VH-VL)-H4杵，(E)CPA.9.086 scFv(VH-VL)H4var1+CHA.7.518.1 Fab H4 var2，(F)CHA.7.518.1 scFv(VL-VH)H4var1+CPA.9.086 Fab H4var2，(G)CHA.9.547.18 scFv(VH-VL)H4var1+CHA.7.518.4 Fab H4 var2，(H)CHA.7.518.4scFv(VL-VH)H4var1+CHA.9.547.18 Fab H4 var2，(I)CPA.9.086 H4，(J)Synagis H4。从每个抗体的kd/ka比率(KD)计算来估计结合亲和力并且展现于图39中。
图38提供通过SPR测定的双特异性抗体与单特异性抗体的PVRIG结合亲和力。
图39提供通过SPR测定的双特异性抗体和单特异性抗体的TIGIT结合亲和力。
图40提供用于本发明双特异性抗体中的额外抗PVRIG抗体。红色字体文字指示氨基酸取代并且()指示相对于参考人类IgG4氨基酸序列的缺失。加下划线的文字指示CDR。灰色突出显示的文字指示Fc结构域。
图41提供用于本发明双特异性抗体的额外抗TIGIT抗体。红色字体文字指示氨基酸取代并且()指示相对于参考人类IgG4氨基酸序列的缺失。加下划线的文字指示CDR。灰色突出显示的文字指示Fc结构域。
图42提供具有一个传统抗体臂和一条重链与轻链恒定域被调换的抗体臂的示范性CrossMab双特异性抗体形式的图式。根据人类IgG1 Eu编号指示“杵臼”形式中的氨基酸取代。
图43提供具有一个传统抗体臂和一个scFv-Fc融合臂的示范性“开瓶器”双特异性抗体形式的图式。根据人类IgG1 Eu编号指示“杵臼”形式中的氨基酸取代。
图44提供具有一个传统抗体臂和一个scFv-Fc融合臂的示范性“开瓶器”双特异性抗体形式的图式。根据人类IgG1 Eu编号指示“等容异源二聚化”形式的氨基酸取代。指示促成减少的FcgR结合的额外取代。
图45提供关于如在MabSelect Sure亲和色谱步骤和尺寸排阻色谱(如果单体％小于亲和色谱法的95％)之后由LC-MS所确定的抗PVRIG-TIGIT双特异性抗体、单体含量和正确装配双特异性抗体％的表达和纯化的数据。
图46提供关于三个不同T细胞供体上的抗PVRIG-TIGIT双特异性抗体筛选的CMV筛选分析以及每次处理在10μg/ml总抗体浓度下进行的数据。
图47提供在用于细胞分析的重组CHO细胞系上的PVRIG、TIGIT和PD-1配体(分别为PVR、PVRL2和PD-L1)表达的流式细胞测量术实例。
图48提供来自三个不同供体的T细胞中的PVRIG、TIGIT和PD-1表达水平的流式细胞测量术实例。
图49提供ELISA结合数据，展现使用PVRIG涂布的培养板对于各种抗PVRIG-TIGIT抗体同时结合PVRIG和TIGIT两者，并且使用生物素标记的TIGIT-His和Steptavidin-HRP检测结合抗体。
图50提供ELISA结合数据，展示使用TIGIT涂布的培养板对于抗PVRIG-TIGIT抗体同时结合PVRIG和TIGIT两者，且使用生物素标记的PVRIG-His和Steptavidin-HRP检测结合抗体。
图51提供在图49和图50中提供的ELISA分析数据的EC-50数据。
图52提供如通过差示扫描荧光测定(DSF)所评定的呈多种形式的双特异性抗体的实例稳定性数据，以及在较低的pH保持和3次冷冻与解冻循环之后的聚集体形成。
图53提供对不同双特异性形式的稳定性评定。通过将抗体在pH 3下保持各种时间，进行测试以模拟病毒灭活，并且通过进行3个连续冷冻/解冻循环来进行压力测试。在还原条件下的重链(含scFv或Fab)(A)、轻链(B)或在非还原条件(CE-SDS)下的完整分子(C)的相对量变化，以及低分子量、高分子量和单体物种含量(SEC-UPLC)(D)变化。数据报告为相对于T＝0的变化。
图54A提供活体外共培养分析，其中来自三个供体(供体4、供体210和供体234)的人类CMV特异性CD8+ T细胞用于评定抗TIGIT抗体(CPA.9.086和CHA.9.547.18)和抗PVRIG抗体(CHA.7.518.1，CHA.7.518.4)单独、以组合方式或作为双特异性抗体对抗原特异性细胞因子分泌的作用。在分析中使用的靶细胞系是表达黑素瘤624(Mel-624)细胞系的HLA-A2+PVRL2+PVR+，其已经过修饰以异位表达pp65。在96孔圆底组织培养物处理过的培养板中以75,000个细胞/孔涂铺细胞。每孔加入15,000个人类CD8+ T细胞。所指示的抗人类PVRIG、TIGIT或同型对照hIgG4抗体以1μg/ml的浓度添加。将共培养物在37℃，5％CO2下培育24小时。使用LEGENDplex IFN珠粒分析(BD生物科学公司(BD Biosciences))通过流式细胞测量术测量共培养物上清液中的人类IFNγ的量。指示每一抗体与hIgG4同型相比IFNr分泌增加的百分比(n＝2个实验，来自所展示1个实验的代表性结果)。(A)CHA.7.518.4-H4臼+CPA.9.086-CrossMab H4杵，(B)CHA.7.518.4-H4臼+CPA.9.086 scFv(VH-VL)-H4杵，(C)CPA.9.086 scFv(VH-VL)H4 var1+CHA.7.518.1 Fab H4 var2，(D)CHA.7.518.1 scFv(VL-VH)H4 var1+CPA.9.086 Fab H4 var2，(E)CHA.7.518.1 H4，(F)CPA.9.086 H4，(G)CHA.7.518.1 H4，(H)CPA.9.086 H4，(I)Synagis H4。
图54B提供在供体细胞的不同扩增下进行的两次CMV分析重复的概述。
具体实施方式
A.概述
本发明提供多种适用的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其尤其适用于治疗癌症。癌症可以认为是患者无法识别和消除癌细胞。在许多情况下，这些转化的(例如癌性)细胞抵消免疫监视。存在限制体内T细胞活化的自然控制机制以防止无限制的T细胞活性，其可被癌细胞利用以逃避或抑制免疫反应。恢复免疫效应细胞(尤其是T细胞)识别和消除癌症的能力是免疫疗法的目标。免疫肿瘤学领域，有时称为“免疫疗法”，正在迅速发展，最近批准了若干T细胞检查点抑制性抗体，如Yervoy、Keytruda和Opdivo。这些抗体通常称为“检查点抑制剂”，因为它们阻断了T细胞免疫的通常负性调节剂。通常理解的是，共刺激和共抑制的各种免疫调节信号可用于协调最佳抗原特异性免疫反应。通常，这些抗体结合检查点抑制蛋白，例如CTLA-4或PD-1，其在正常情况下防止或抑制细胞毒性T细胞(CTL)的活化。通过抑制检查点蛋白质，例如通过使用结合这些蛋白质的抗体，可以实现针对肿瘤的T细胞反应增加。也就是说，这些癌症检查点蛋白质抑制免疫反应；当例如使用针对检查点蛋白质的抗体阻断蛋白质时，免疫系统被活化，产生免疫刺激，从而治疗例如癌症和传染病的病况。
本发明涉及针对其它检查点蛋白质PVRIG和TIGIT的双特异性抗体的用途。PVRIG在NK细胞和T细胞的细胞表面上表达，并且与其它已知的免疫检查点具有若干相似之处。用于展示PVRIG是检查点受体的鉴定和方法在WO2016/134333中进行了论述，所述文献通过引用明确地并入本文。本文提供针对人类PVRIG阻断PVLR2的相互作用和/或结合的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。当PVRIG与其配体(PVRL2)结合时，引发抑制信号，其起到减弱NK细胞和T细胞针对靶细胞的免疫反应(即类似于PD-1/PDL1)的作用。阻断PVRL2与PVRIG的结合会切断PVRIG的这种抑制信号，并因此调节NK细胞和T细胞的免疫反应。利用阻断与PVRL2结合的PVRIG抗体是一种增强NK细胞和T细胞杀伤癌细胞的治疗方法。已经产生了结合PVRIG并阻断其配体PVRL2的结合的阻断抗体。
类似地，TIGIT已经展示为还具有检查点受体的属性，并且本发明提供阻断TIGIT与PVR的相互作用和/或结合的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。当TIGIT与其配体(PVR)结合时，引发抑制信号，其起到减弱NK细胞和T细胞针对靶细胞的免疫反应(即类似于PD-1/PDL1)的作用。阻断PVR与TIGIT的结合会切断TIGIT的这种抑制信号，并因此调节NK细胞和T细胞的免疫反应。利用抗TIGIT的抗体阻断与PVR的结合是一种增强NK细胞和T细胞杀伤癌细胞的治疗方法。已经产生阻断抗体，其结合TIGIT并阻断其配体PVR的结合。
另外，本发明提供用于治疗癌症的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。
B.定义
为了能更全面地了解本申请，下文阐述几种定义。这些定义意味着涵盖语法等效物。
本文所使用的IgG域定义根据IMGT参考序列(www.IMGT.org)。
本文中的“消融”意指减小或去除活性。在一些实施例中，从抗体的恒定域中除去活性是有用的。因此，例如，“消融FcγR结合”意指与不含特定变体的Fc区相比，Fc区氨基酸变体具有小于50％的起始结合，其中小于70-80-90-95-98％的活性损失是优选的，并且通常，活性低于Biacore分析中可检测的结合水平。如图21所示，IgG1恒定区中的一个消融变体是N297A变体，其去除天然糖基化位点并且显著降低FcγRIIIa结合，并且因此降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
“抗原结合域”或“ABD”在本文中是指六个互补决定区(ComplementaryDetermining Region，CDR)的组，当作为多肽序列的一部分存在时，特异性结合如本文所论述的靶抗原。因此，“TIGIT抗原结合域”结合如本文所概述的TIGIT抗原(其序列如图22所示)。类似地，“PVRIG抗体结合域”结合如本文所概述的PVRIG抗原(其序列如图1所示)。如本领域中已知，这些CDR通常作为第一组可变重链CDR(vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻链CDR(vlCDR或VLCDR)存在，其各自包含三个CDR：重链的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3和轻链的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。CDR分别存在于重链可变域和轻链可变域中，并且一起形成Fv区。因此，在一些情况下，抗原结合域的六个CDR由可变重链和可变轻链贡献。在“Fab”形式中，一组6个CDR由两个不同的多肽序列贡献，重链可变域(vh或VH；含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和轻链可变域(vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，其中vh结构域的C端连接到重链CH1域的N端，vl结构域的C端连接到轻链恒定域的N端(从而形成轻链)。短语“抗原结合部分”可以包含ABD或与ABD同义。
本文中的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。举例来说，修饰可以是连接于蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。出于清楚起见，除非另外说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如具有DNA和RNA中的密码子的20种氨基酸。
在本文中，“氨基酸取代”或“取代”意指用不同氨基酸置换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。特定言之，在一些实施例中，取代为不在特定位置天然存在之胺基酸，亦即不在有机体内天然存在或不在任何有机体中天然存在之胺基酸。举例来说，取代N297A是指在位置297处的天冬酰胺被丙氨酸置换的变体多肽，在这种情况下是Fc变体。为清楚起见，已经被工程改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如，将CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍然编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管产生对相同蛋白质进行编码的新基因，但是如果蛋白质在其开始的特定位置处具有相同氨基酸，则所述蛋白质不是氨基酸取代。
如本文所使用的，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后且在位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所使用的，“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸序列。例如，E233-或E233#，E233()或E233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#指代开始于位置233的序列GluAspAla缺失。
如本文所使用的，“变体蛋白”或“蛋白变体”意指借助于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码它的氨基酸序列。优选地，蛋白质变体与亲本蛋白质相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，约一个到约七十个氨基酸修饰，并且优选约一个到约五个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施例中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽，是人类野生型序列，例如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区，尽管具有变体的人类序列也可以充当“亲本多肽”。本文的蛋白质变体序列将优选与亲本蛋白质序列具有至少约80％的一致性，并且最优选至少约90％的一致性，更优选至少约95-98-99％的一致性。变体蛋白可以指代变体蛋白本身、包含蛋白变体的组合物或编码所述蛋白变体的DNA序列。因此，本文所用的“抗体变体”或“变体抗体”是指借助于至少一个氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体，本文所用的“IgG变体”或“变体IgG”是指借助于至少一个氨基酸修饰而与亲本IgG(同样，在许多情况下，来自人IgG序列)不同的抗体，并且本文所用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”是指借助于至少一个氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。本文所用的“Fc变体”或“变体Fc”是指包含Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。本发明的Fc变体根据构成其的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，S241P或S228P是相对于亲本IgG4铰链多肽在位置228处具有取代脯氨酸的铰链变体，其中编号S228P是根据EU索引而S241P是Kabat编号。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人，1969，《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA)》63：78-85，在本文中以引用的方式整体并入本文中)。修饰可以是添加、缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸，以及在一些情况下合成氨基酸。实例包括美国专利第6,586,207号；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO05/74524A2；J.W.Chin等人，(2002)，《美国化学会志(Journal of the American ChemicalSociety)》124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz、(2002)，《生物化学(ChemBioChem)》11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，《PICAS美利坚合众国(PICAS United States ofAmerica)》99：11020-11024；和L.Wang和P.G.Schultz，(2002)、《化学(Chem.)》1-10，其以引用的方式整体并入本文中。
如本文所使用的，本文的“蛋白质”意指至少两个共价连接氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基可以包含天然存在的氨基酸和肽键或合成拟肽结构，例如“类似物”，如类肽(参见Simon等人，《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》89(20)：9367(1992)，其通过引用整体并入)。氨基酸可以是天然存在的或合成的(例如，不是由DNA编码的氨基酸)，如本领域技术人员将理解的。例如，出于本发明的目的，同型苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸被认为是合成氨基酸，并且可以使用D-和L-(R或S)构型的氨基酸。本发明的变体可以包含修饰，其包括使用例如Schultz和同事开发的技术掺入的合成氨基酸，所述技术包括但不限于Cropp和Shultz，2004，《遗传学趋势(Trends Genet.)》20(12)：625-30，Anderson等人，2004，《美国国家科学院院刊》101(2)：7566-71，Zhang等人，2003，303(5656)：371-3和Chin等人，2003，《科学(Science)》301(5635)：964-7所描述的方法，其以引用的方式整体并入本文中。另外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与其它分子的连接子、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。
本文所用的“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份标识。举例来说，天冬酰胺297(也称为Asn297或N297)是人类抗体IgG1中位置297处的残基。
本文所用的“Fab”或“Fab区”是指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以单独指这一区域，或者在全长抗体或抗体片段的情形下指代这一区域。
本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”是指包含单一抗体的VL和VH结构域的多肽。如本领域技术人员所理解，这些通常由两条链组成。
本文中的“单链Fv”或“scFv”意味着通常使用如本文所论述的scFv连接子将重链可变域共价连接到轻链可变域，以形成scFv或scFv结构域。scFv结构域从N端到C端可呈任一定向(vh-连接子-vl或vl-连接子-vh)。通常，连接子是本领域通常已知的scFv连接子，其中连接肽主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。
“连接子”通常是指在如本文所描述的scFv或双特异性抗体的情形下使用的肽连接子。连接肽应该具有足以连接两个分子的长度，以便其相对于彼此呈现正确的构象，从而使其保留所期望的活性。在一个实施例中，连接子具有约1到50个氨基酸的长度，优选约1到30个氨基酸的长度。在一个实施例中，可以使用长度为1个到20个氨基酸的连接子，其中在一些实施例中使用约5个到约10个氨基酸。有用的连接子包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为一(并且通常为3到4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性连接子。替代地，各种非蛋白质聚合物，包括但不限于可用作连接子的聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物可用作连接子。在一些实施例中，连接子选自以下表1和表2中列出的连接子(也参见美国专利第9,650,446号的图7)。
表1：带正电荷的scFv连接子
名称 序列 长度 电荷 SEQ ID NO：
Gly-Ser 15 GGGGSGGGGSGGGGS 15 0 3632
Whitlow连接子 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 18 +1 3633
6paxk_1(+A) IRPRAIGGSKPRVA 14 +4 3634
+B GKGGSGKGGSGKGGS 15 +3 3635
+C GGKGSGGKGSGGKGS 15 +3 3636
+D GGGKSGGGKSGGGKS 15 +3 3637
+E GKGKSGKGKSGKGKS 15 +6 3638
+F GGGKSGGKGSGKGGS 15 +3 3639
+G GKPGSGKPGSGKPGS 15 +3 3640
+H GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS 20 +4 3641
+1 GKGKSGKGKSGKGKSGKGKS 20 +8 3642
表2：带负电荷的scFv连接子
名称 序列 长度 电荷 SEQ ID NO：
Gly-Ser 15 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 20 0 3643
3hsc2(-A) STAGEITHLGGEDFD 14 -4 3644
-B GEGGSGEGGSGEGGS 15 -3 3645
-C GGEGSGGEGSGGEGS 15 -3 3646
-D GGGESGGGESGGGES 15 -3 3647
-E GEGESGEGESGEGFS 1.5 -6 3648
-F GGGESGGEGSGEGGS 15 -3 3649
-G GEGESGEGESGEGESGEGES 20 -8 3650
本文所用的“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”是指将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的比对IgG同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。举例来说，因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。类似地，因为IgG1在位置241处具有脯氨酸并且IgG4在那里具有丝氨酸，所以具有S241P的IgG4分子被认为是IgG亚类修饰。注意，亚类修饰在本文中被认为是氨基酸取代。
本文所用的“非天然存在的修饰”是指不是同种型的氨基酸修饰。例如，因为没有IgG在位置297处包含天冬酰胺，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂合体)中的取代N297A被认为是非天然存在的修饰。
本文所用的“氨基酸”和“氨基酸身份标识”是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
本文所用的“效应功能”是指由抗体Fc区与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
本文所用的“IgG Fc配体”是指与IgG抗体Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子，优选多肽。Fc配体包括但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，其是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人，2002，《免疫评论(Immunological Reviews)》190：123-136，其以引用的方式整体并入)。Fc配体可以包括结合Fc的未发现分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。本文所用的“Fc配体”是指与抗体Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的任何生物体的分子，优选多肽。
本文所用的“亲本多肽”是指随后经过修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或者天然存在的多肽的变体或工程改造版本。亲本多肽可以指代多肽本身、包含所述亲本多肽的组合物或编码所述亲本多肽的氨基酸序列。因此，本文所用的“亲本免疫球蛋白”是指未修饰的免疫球蛋白多肽，其经过修饰以产生变体，并且本文所用的“亲本抗体”是指未修饰的抗体，其经过修饰以产生变体抗体。应注意，“亲本抗体”包括如下概述的已知的商业重组产生的抗体。
本文所用的“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”是指包含抗体恒定区(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域)的多肽，并且在一些情况下是铰链的一部分。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的柔性铰链N端。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及位于Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的下部铰链区。虽然Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成在其羧基端包含残基C226或P230，其中根据如Kabat中的EU索引进行编号。在一些实施例中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一种或多种FcγR受体或FcRn受体的结合。
“重链恒定区”在本文中是指抗体的CH1-铰链-CH2-CH3部分。
本文所用的“位置”是指蛋白质序列中的位置。位置可以顺序编号，或根据确定的格式(例如用于抗体编号的EU索引)编号。
本文所用的“靶抗原”是指由给定抗体的可变区特异性结合的分子。在本发明的情况下，本文中所关注的一种靶抗原是TIGIT，通常是人类TIGIT和任选的食蟹猴TIGIT，如下文所定义。另一种所关注的靶抗原是PVRIG，通常是人类PVRIG和任选的食蟹猴PVRIG，如下文所定义。
本文使用的“靶细胞”是指表达靶抗原的细胞。
本文所用的“可变区”是指免疫球蛋白的区域，其包含一个或多个基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的Vκ(V.κ)、Vλ(V.λ)和/或VH基因编码的Ig域。
“野生型或WT”在本文中是指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白具有未经过有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明的抗体通常是分离的或重组的。在用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离的”意指已经从表达多肽的细胞或细胞培养物中鉴定并且分离和/或回收的多肽。通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。“重组”意味着使用重组核酸技术在外源宿主细胞中产生抗体。
“特异性结合”或“特异性结合于”特定抗原或表位，或“对”特定抗原或表位“具有特异性”意味着与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可以如下测量：例如相比于对照分子的结合来确定一种分子的结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构分子。举例来说，可以通过与类似于标靶的对照分子竞争来确定特异性结合。
针对特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过抗体对抗原或表位的KD为至少约10-9M、至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M、至少约10-13M、至少约10-14M、至少约10- 15M来呈现，其中KD指代特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性结合抗原的抗体的KD对于对照分子相对于抗原或表位大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
另外，可以例如通过抗体对抗原或表位的KA或Ka对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍来呈现对特定抗原或表位的特异性结合，其中KA或Ka指代特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。通常使用表面等离子共振(例如Biacore分析)和使用表达抗原的细胞的流式细胞术测量结合亲和力。
C.序列
序列表提供了许多基于图23格式的序列；参考USSN 62/513,916的图4(在此明确通过引用并入)作为序列标记的指导。重链可变域标记有标识符(例如“CPA.9.086”)，其中下一个序列遵循本说明书的图23的格式(与上文提及的图4的格式相同)，因为下一个序列标识符是vhCDR1，紧接着是vhCDR2与vhCDR3、全长重链、轻链可变域、vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3和全长轻链。因此，单个抗体具有10个相关的序列标识符)。序列表中包括BM26小鼠IgG1(BM26-M1)(WO2016/028656A1，克隆31C6)和BM29小鼠IgG1(BM29-M1)(US2016/0176963A1，克隆22G2)的序列。除非有指出，否则PVRIG和/或TIGIT抗体的全长HC序列呈H4(S241P)形式。
D.PVRIG蛋白
本发明提供抗PVRIG和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其特异性地结合到PVRIG蛋白并防止被其配体蛋白PVRL2(人质膜糖蛋白)活化。PVRIG，也称为含有脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域的蛋白质、Q6DKI7或C7orf15，涉及RefSeq登录标识符NP_076975中所示的氨基酸和核酸序列，如图1所示。人类脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白2(PVLR2，也称为连接蛋白-2、CD112或疱疹病毒侵入介体B(HVEB))，即PVRIG的结合配偶体(如美国公开2016/0244521的实例5中所示)的序列如图2所示。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体对PVRIG胞外域具有特异性，从而阻断PVRIG和PVLR2的结合。
PVRIG是一种长度为326个氨基酸的跨膜结构域蛋白，具有信号肽(跨越氨基酸1至40)、胞外域(跨越氨基酸41至171)、跨膜结构域(跨越氨基酸172至190)和细胞质结构域(跨越氨基酸191至326)。有两个可以是起始密码子的甲硫氨酸，但成熟蛋白质是相同的。
因此，如本文所用，术语“PVRIG”或“PVRIG蛋白”或“PVRIG多肽”可任选地包括任何此类蛋白质，或其变体、缀合物或片段，包括但不限于如本文所述的已知或野生型PVRIG以及任何天然存在的剪接变体、氨基酸变体或同种型，特别是PVRIG的ECD片段。
如本文所指出并在下文中更全面地描述，抗PVRIG和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体既与PVRIG结合又防止被PVRL2活化(例如最常见地通过阻断PVRIG和PVLR2的相互作用)，用于增强T细胞和/或NK细胞活化并用于治疗如癌症和病原体感染的疾病。
E.TIGIT蛋白
本发明提供抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其特异性结合于TIGIT蛋白并且防止其配体蛋白、PVR、脊髓灰质炎病毒受体(也称为CD155)人质膜糖蛋白活化。TIGIT或具有Ig和ITIM域的T细胞免疫受体是共抑制性受体蛋白，也称为WUCAM、Vstm3或Vsig9。TIGIT具有免疫球蛋白可变域、跨膜结构域和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，并含有PVR蛋白家族的特征序列元素。TIGIT和PVR的胞外域(ECD)序列展示于图22中。本发明的抗体对TIGIT ECD具有特异性，从而阻断TIGIT和PVR的结合
因此，如本文所用，术语“TIGIT”或“TIGIT蛋白”或“TIGIT多肽”可任选地包括任何此类蛋白质，或其变体、缀合物或片段，包括但不限于如本文所述的已知或野生型TIGIT，以及任何天然存在的剪接变体、氨基酸变体或同种型，特别是TIGIT的ECD片段。
如本文所指出并在下文中更全面地描述，抗TIGIT抗体(包括抗原结合片段)既结合TIGIT又防止被PVR活化(例如最常见地通过阻断TIGIT和PVR的相互作用)，用于增强T细胞和/或NK细胞活化并用于治疗如癌症和病原体感染的疾病。
V.抗体
如下所述，通常使用术语“抗体”。传统的抗体结构单元通常包含四聚体。每种四聚体通常由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻链”(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重链”(通常具有约50-70kDa的分子量)。人轻链被分类为κ和λ轻链。本发明涉及通常基于IgG类的单克隆抗体，其具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，IgG1、IgG2和IgG4比IgG3更频繁地使用。应注意，IgG1具有不同的同种异型，其在356(D或E)和358(L或M)处具有多态性。本文中所描绘的序列使用356D/358M同种异型，然而本文包括其它同种异型。也就是说，本文包括的包括IgG1 Fc结构域的任何序列可以具有置换356D/358M同种异型的356E/358L。术语“抗体”进一步包括双特异性抗体，例如结合到至少两个不同标靶的那些抗体。在一些实施例中，本发明的抗体为结合PVRIG和TIGIT的双特异性抗体(在本文中称为抗TIGIT/抗PVRIG双特异性抗体)。
每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100到110个或更多个氨基酸的可变区，在本领域和本文中通常称为“Fv结构域”或“Fv区”。在可变区中，重链和轻链的每个V结构域聚集三个环以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文中称为“CDR”)，其中氨基酸序列的变化是最显著的。“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。可变区内的可变性不是均匀分布的。相反，V区由通过称为“高变区”的极端可变性的较短区分隔开的称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的区段组成，所述高变区各自9-15个氨基酸长或更长。
每个VH和VL由三个高变区(“互补决定区”，“CDR”)和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
高变区通常涵盖来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)以及重链可变区中约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)的氨基酸残基；Kabat等人，《免疫学相关蛋白质的序列(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》，第5版.马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部(Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.)(1991)和/或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196：901-917。下面描述本发明的特定CDR。
如本领域的技术人员将了解，CDR的精确编号和布置在不同编号系统中可以不同。然而，应理解，可变重和/或可变轻序列的公开包括相关(固有)CDR的公开。因此，每个重链可变区的公开内容是vhCDR(例如vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个轻链可变区的公开内容是vlCDR(例如vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人，《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27(1)：55-77(2003)：
Kabat+Clothia IMGT Kabat AbM Chothia Contact
vhCDR1 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
vhCDR2 50-65 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
vhCDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
vlCDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
vlCDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
vlCDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
在整个本说明书中，当提及可变域(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)和铰链中的残基以及用于Fc区的EU编号系统时，通常使用Kabat编号系统(例如Kabat等人，见上文(1991))。
本发明提供大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整CDR组”包含三个可变轻链和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以分别是较大轻链可变域或重链可变域的一部分。另外，如本文中更全面概述，当使用重链和轻链时，重链可变域和轻链可变域可以在分开的多肽链上，或者在scFv序列的情况下，可以在单个多肽链上。
CDR有助于形成抗体的抗原结合位点，或更具体来说，表位结合位点。“表位”是指与抗体分子可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)相互作用的决定子。表位是如氨基酸或糖侧链的分子的聚组，且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可以具有超过一个表位。
表位可以包含直接涉及结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和未直接涉及结合的其它氨基酸残基，如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换而言之，氨基酸残基位于特异性抗原结合肽的覆盖区范围内。
表位可以是构象的也可以是线性的。构象表位是由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸空间并置而产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。
表位通常包括呈独特空间构象的至少3个且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，展示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力，例如“装箱”。如下文所概述，本发明不仅包括本文所列举的抗原结合域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结合域结合的表位结合的抗原结合域和抗体。
每条链的羧基端部分限定主要负责效应功能的恒定区。Kabat等人收集重链和轻链可变区的许多一级序列。基于序列的保守度，其将单个一级序列分类为CDR和框架并且列出其列表(参见，SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST、第5版、NIH出版，第91-3242号、E.A.Kabat等人，其以引用的方式整体并入本文中)。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中存在数个免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(Ig)结构域”在本文中意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。本发明相关的是重链结构域，包括重链恒定(CH)域和铰链域。在IgG抗体的情形下，IgG同型各自具有三个CH区。因此，在IgG的情形下，“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU索引的位置118-220。根据如Kabat中的EU索引，“CH2”是指位置237-340，并且根据如Kabat中的EU索引，“CH3”是指位置341-447。
重链的另一种类型的Ig域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中是指包含抗体的第一与第二恒定域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1域在EU位置220处终止，并且IgG CH2域在残基EU位置237处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。
轻链通常包含两个结构域，即轻链可变域(含有轻链CDR并与重链可变域一起形成Fv区)和轻链恒定区(通常称为CL或Cκ)。通常，可以使用恒定λ或恒定κ域，其中λ通常可用于本发明。
下文概述的用于其它取代的另一所关注区是Fc区。
A.嵌合抗体和人源化抗体
在一些实施例中，本文中的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以来源于来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”都是指组合来自超过一种物种的区域的抗体。举例来说，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在一些情况下为大鼠)的可变区和来自人类的恒定区。“人源化抗体”通常是指非人类抗体，其具有与人类抗体中发现的序列交换的可变域框架区。通常，在人源化抗体中，除CDR之外的整个抗体由人类来源的多核苷酸编码或除了在其CDR内之外，与这种抗体相同。CDR(部分或全部由源自非人类生物体的核酸编码)被移植到人类抗体可变区的β-折叠框架中以形成抗体，其特异性由移植的CDR决定。这类抗体的形成描述于例如WO 92/11018，Jones，1986，《自然(Nature)》321：522-525，Verhoeyen等人，1988，《科学》239：1534-1536中，其以引用的方式整体并入本文中。所选择的受体框架残基“回复突变”到相应的供体残基通常需要重新获得在初始移植构建体中丧失的亲和力(US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213，其以引用的方式整体并入本文中)。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分，通常是全部，因此通常包含人Fc区。使用具有基因工程改造的免疫系统的小鼠也可以产生人源化抗体。Roque等人，2004，《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》20：639-654，其以引用的方式整体并入本文中。用于人源化和重塑非人类抗体的多种技术和方法是本领域熟知的(参见Tsurushita和Vasquez，2004，《单克隆抗体的人源化(Humanization ofMonoclonal Antibodies)》，《B细胞分子生物学(Molecular Biology of B Cells)》，533-545，爱思唯尔科学公司(Elsevier Science)(美国)和其中引用的参考文献，其以引用的方式整体并入本文中)。人源化方法包括但不限于以下文献中所述的方法：Jones等人，1986，《自然》321：522-525；Riechmann等人，1988，《自然》332：323-329；Verhoeyen等人，1988，《科学》239：1534-1536；Queen等人，1989，《美国国家科学院院刊》86：10029-33；He等人，1998，《免疫学杂志(J.Immunol.)》160：1029-1035；Carter等人，1992，《美国国家科学院院刊》89：4285-9；Presta等人，1997，《癌症研究》57(20)：4593-9；Gorman等人，1991，《美国国家科学院院刊》88：4181-4185；O′Connor等人，1998，《蛋白质工程(Protein Eng)》11：321-8，其以引用的方式整体并入本文中。降低非人类抗体可变区免疫原性的人源化或其它方法可以包括表面再塑方法，如例如Roguska等人，1994，《美国国家科学院院刊》91：969-973中所述，其以引用的方式整体并入本文中。
因此，来自本文所列举的任何抗体的vhCDR和vlCDR可以是人源化的(或者对于那些已经人源化的抗体来说是“再人源化的”)。
在某些实施例中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包含人类抗体或由人类抗体组成，所述人类抗体包含作为特定种系序列“的产物”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。通过比较人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择序列与人类抗体序列最接近(即，最大％一致性)的人类种系免疫球蛋白，可以鉴定人类抗体是人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”人类种系免疫球蛋白序列。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”特定人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体与种系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人源化抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列通常至少90％相同，并且与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比时，含有将抗体鉴定为衍生自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列与不包括CDR的种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95、96、97、98或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。也就是说，CDR可以是鼠类，但(重链或轻链)可变区的框架区的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白基因编码的框架氨基酸可以至少96％、97％、98％或99％相同。
通常，衍生自特定人类种系序列的人源化抗体将显示与人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10-20个氨基酸差异。在某些情况下，人源化抗体可显示与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何变体之前；即，变体的数量通常较低)。
在一个实施例中，亲本抗体已经亲和力成熟，如本领域已知的。可以利用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如如USSN 11/004,590中所述。基于选择的方法可以用于人源化和/或亲和成熟抗体可变区，包括但不限于以下文献中所述的方法：Wu等人，1999，《分子生物学杂志》294：151-162；Baca等人，1997，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》272(16)：10678-10684；Rosok等人，1996，《生物化学杂志》271(37)：22611-22618；Rader等人，1998，《美国国家科学院院刊》95：8910-8915；Krauss等人，2003，《蛋白质工程(ProteinEngineering)》16(10)：753-759，其以引用的方式整体并入本文中。其它人源化方法可涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人，2002，《免疫学杂志》169：1119-1125；De Pascalis等人，2002，《免疫学杂志》169：3076-3084，其以引用的方式整体并入本文中。
B.任选的抗体工程改造
本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以被修饰或工程改造以通过氨基酸取代改变氨基酸序列。如本文所论述，可以进行氨基酸取代以改变CDR对蛋白质(例如TIGIT或PVRIG，包括增加和降低的结合)的亲和力，以及改变抗体的其它功能特性。举例来说，抗体可以经过工程改造以在Fc区内包括修饰，通常用于改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，根据本发明的至少一些实施例的抗体可以经过化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接到抗体上)或被修饰以改变其糖基化，同样用于改变抗体的一种或多种功能特性。下面进一步描述这类实施例。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编号。
在一个实施例中，对CH1的铰链区进行修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数量发生改变，例如增加或减少。这一方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数量，以便例如有助于轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以被修饰以消除体内Fab臂交换，特别是当使用IgG4恒定域时。具体而言，所述过程涉及在其它IgG4抗体之间交换IgG4半分子(一条重链加一条轻链)，这有效地产生功能上单价的双特异性抗体。铰链区和重链恒定域的突变可以消除这种交换(参见Aalberse，RC，Schuurman J.，2002，《免疫学(Immunology)》105：9-19)。如本文所概述，特别适用本发明的突变是在IgG4恒定域的情形下的S241P。IgG4可用于本发明，因为它没有显著的效应功能，因此用于阻断受体与其配体(例如PVRIG与PVRL2或TIGIT与PVR)的结合而没有细胞衰竭。
在一些实施例中，氨基酸取代可以在Fc区中进行，通常用于改变与FcγR受体的结合。本文所用的“Fcγ受体”、“FcγR”或“FcγR(FcgammaR)”是指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这一家族包括但不限于FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人，2002，《免疫学快报(Immunol Lett)》82：57-65，其以引用的方式整体并入本文中)，以及任何未发现的人类FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII-1(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)，以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
可以进行许多有用的Fc取代以改变与一种或多种FcγR受体的结合。引起结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。举例来说，已知增加与FcγRIIIa的结合通常引起ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞的裂解。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb(抑制受体)的结合减少也是有益的。可用于本发明的氨基酸取代包括美国系列第11/124,620号(尤其是图41)和美国专利第6,737,056号中列出的那些，两个专利都以全文引用的方式明确地并入本文中，并且尤其是关于其中所公开的变体。
在又一实例中，通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区，以增加抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力和/或增加FcRn结合：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。Presta在PCT公开WO 00/42072中进一步描述了这个方法。此外，人类IgG1上关于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经映射并且具有改良结合的变体已有描述(参见Shields，R.L.等人(2001)《生物化学杂志》276：6591-6604)。展示位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变改善了与FcγRIII的结合。另外，展示以下组合突变体改善了FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，例如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S的突变改善了与FcRn的结合并且增加了抗体循环半衰期(参见Chan CA和Carter PJ(2010)《自然综述免疫学(Nature Rev Immunol)》10：301-316)。
此外，修饰本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体以增加其生物半衰期。各种方法都是可能的。举例来说，可以引入以下突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F，如Ward的第6,277,375号美国专利中所述。替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体以含有取自IgG的Fc区的CH2域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利第5,869,046号和第6,121,022号中所述。增加血清半衰期的额外突变公开于美国专利第8,883,973号、第6,737,056号和第7,371,826号中，并且包括428L、434A、434S和428L/434S。
在另一个实施例中，可以修饰抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的糖基化。举例来说，可以制备糖基化抗体(例如抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化，以例如增加抗体对抗原的亲和力或降低效应功能，例如ADCC。这类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点，例如N297来完成。举例来说，可以进行一个或多个氨基酸取代，其引起消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除所述位点的糖基化，在一些实施例中使用丙氨酸置换。
另外地或替代地，可以将抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体制成具有改变的糖基化类型，如岩藻糖基残基量减少的低岩藻糖基化抗体或平分型GlcNac结构增加的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。这类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，其中根据本发明的至少一些实施例表达重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如美国专利公开号20040110704和WO 2003/035835。
本发明涵盖的本文抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的另一修饰是聚乙二醇化或添加其它水溶性部分，通常为聚合物，例如，以便增强半衰期。如本领域已知的，可以使抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。
除了进行取代以改变对FcγR和/或FcRn的结合亲和力和/或增加体内血清半衰期之外，可以进行另外的抗体修饰，如下文进一步详细描述。
在某些情况下，完成亲和力成熟。CDR中的氨基酸修饰有时被称为“亲和力成熟”。“亲和力成熟”抗体是在一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，与不具有那些一个或多个改变的亲本抗体相比，其使得抗体对抗原的亲和力得到改善。在一些情况下，可能期望减少抗体对其抗原的亲和力。
在一些实施例中，在本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的一个或多个CDR中进行一个或多个氨基酸修饰(例如，对于PVRIG CDR或TIGIT CDR)。通常，在任何单个CDR中仅取代1个或2个或3个氨基酸，并且通常不超过1个、2个、3个。在一组6个CDR(例如vhCDR1-3和vlCDR1-3)内作出4、5、6、7、8、9或10个变化。然而，应当理解，在任何CDR中未取代、1个、2个或3个取代的任何组合可以独立地并任选地与任何其它取代组合。
与“亲本”抗体相比，可以进行亲和力成熟以使抗体对抗原的结合亲和力增加至少约10％至50-100-150％或更多，或1至5倍。在一些实施例中，亲和力成熟的抗体对抗原将具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过已知方法产生。亲和力和功效的相关性在下面论述。
替代地，可以在本发明的抗体的一个或多个CDR中进行“沉默的”氨基酸修饰，例如，不显著改变抗体对抗原的亲和力。这样做的原因有很多，包括优化表达(如可以对编码本发明的抗体的核酸所进行的)。
因此，包括在本发明的CDR和抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的定义内的是变体CDR和抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体；也就是说，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包括本发明所列举的抗体的一个或多个CDR中的氨基酸修饰。另外，如下文所概述，氨基酸修饰也可以独立地和任选地在CDR之外的任何区(包括框架区和恒定区)中进行。
VI.本发明的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体
本发明提供双特异性抗PVRIG/抗TIGIT抗体，以及抗PVRIG和/或抗TIGIT抗体。(为方便起见，“抗PVRIG/抗TIGIT抗体”和“双特异性PVRIG/TIGIT抗体”和“抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体”可互换地使用)。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体特异性地结合于人类TIGIT，并且优选是人类TIGIT的ECD，以及PVRIG，并且再优选是人类PVRIG的ECD。本发明进一步提供抗原结合域，包括全长抗体，其含有多种所列举的特定12个CDR组，结合到TIGIT的6个CDR和结合到PVRIG的6个CDR。
本发明还提供可以在单特异性抗体或双特异性抗体情形下的抗PVRIG抗体。此类抗体包括：
PVRIG抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330000531
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330000532
本发明还提供可以在单特异性抗体或双特异性抗体情形下的抗TIGIT抗体。此类抗体包括：
TIGIT抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330000533
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330000534
可以例如通过抗体具有至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M，替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M、至少约10-13M、至少约10-14M、至少约10-15M或更大的KD来呈现对PVRIG和/或TIGIT或PVRIG和/或TIGIT表位的特异性结合，其中KD指代特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。通常，特异性结合抗原的抗体对于对照分子的KD相对于TIGIT抗原或表位大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
然而，为了最佳地结合到NK细胞和T细胞表面上表达的PVRIG和/或TIGIT，抗体优选具有小于50nM且最优选小于1nM的KD，其中小于0.1nM和小于1pM适用于本发明方法中。
此外，可以例如通过抗体对PVRIG和/或TIGIT抗原或表位的ka(指代缔合速率常数)对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍来呈现对特定抗原或表位的特异性结合，其中ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。
在一些实施例中，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体以100nM或更小、50nM或更小、10nM或更小、或1nM或更小(即，更高的结合亲和力)或1pM或更小的KD结合到人类TIGIT和/或人类PVRIG，其中KD通过已知方法测定，例如表面等离子共振(SPR，例如Biacore分析)、ELISA、KINEXA，并且最通常是在25℃或37℃下的SPR。
A.双特异性抗体和/或异源二聚抗体
本发明提供依赖于使用两种不同重链变体Fc序列的双特异性PVRIG和TIGIT检查点抗体，其自装配形成异源二聚体的Fc结构域和作为异源二聚抗体的抗体(例如双特异性抗体)。
在一些实施例中，本发明提供允许结合到PVRIG和TIGIT两者的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。本文所述的抗体构建体基于两条重链的两个Fc结构域(例如两个Fc结构域、包含两个Fc结构域的两个可变区和/或两条重链)的自装配和配对，以装配到二聚体中。在一些实施例中，更改各单体的氨基酸序列以有助于将单体装配到二聚体中。在一些实施例中，这些氨基酸变体和/或更改在恒定区中。在一些实施例中，相比于同源二聚体装配，氨基酸变体在各恒定区中不同以便促进和/或有助于异源二聚体装配。本领域中已知双特异性抗体的许多方法和形式(参见例如Godar等人，《治疗性专利专家意见(Expert Opinion onTherapeutic Patents)》，28(3)：251-276(2018)和Brinkmann和Kontermann，《双特异性抗体的制成》《单克隆抗体》，9(2)：182-212(2017)，两者均以全文引用的方式并入本文中)。
如本文所提供，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性异源二聚抗体包括两种抗原结合域(ABD)，其中的每一种结合到不同检查点蛋白质，特别是PVRIG和TIGIT。这些异源二聚抗体可以是双特异性的并且二价的(例如，每个抗原通过单一ABD结合)，或双特异性的并且三价的(一个抗原通过单一ABD结合并且另一个通过两个ABD结合)。对于本文中所列出的所有重链和轻链可变域，可以制成其它变体。在一些实施例中，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含本文，例如图4、7、8、11、12、15、16、17、23、24、40和41中所列的重链和轻链可变域和/或链中的任一个。在一些实施例中，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含本文，例如图4、7、8、11、12、15、16、17、23、24、40和41中列出的重链和轻链可变域中的任一个的CDR。如本文中所概述，在一些实施例中，一组6个CDR可具有0、1、2、3、4或5个氨基酸修饰(其中氨基酸取代特别适用)，以及重链和轻链可变域的框架区中的变化，只要框架(不包括CDR)与人类种系序列保持至少约80％、85％或90％的一致性即可。因此，举例来说，如本文所描述的相同CDR可与来自人种系序列的不同框架序列组合，只要框架区与人类种系序列保持至少80％、85％或90％的一致性即可。或者，CDR可具有氨基酸修饰(例如来自所述组CDR中的1、2、3、4或5氨基酸修饰(即，CDR可为经修饰的，只要所述组6个CDR中的改变的总数小于6个氨基酸修饰，其中改变CDR的任何组合；例如，vlCDR1中可存在一个变化，vhCDR2中可存在两个变化，vhCDR3中可不存在变化等)，以及具有框架区变化，只要框架区保持与人类种系序列的至少80％、85％或90％的一致性即可。
本发明提供抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。双特异性抗体一般通过在宿主细胞中表达每一重链和轻链的基因来制成。这通常引起期望的异源二聚体(A-B)以及两个同源二聚体(A-A和B-B(不包括轻链异源二聚体问题))形成。
为了解决围绕同源二聚抗体和异源二聚抗体形成的问题(以及在纯化期间两种分离的问题)，已研发出与同源二聚体形式相反的方法将自装配偏置到异源二聚体形式中的方法。使用多种机制和方法，使用本发明的PVRIG和TIGIT抗体序列，可以产生异源二聚抗体，并且尤其产生异源二聚体，包括图4、图7、图8、图11、图12、图15、图16、图17、图23、图24、图40和图41的那些异源二聚体。在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含图26、图40和图41(SEQ IN NO：3213-3612)中提供的序列。在一些实施例中，组合机制和方法以确保高百分比的异源二聚化。
可以促成异源二聚变体的变体(有时称为“异源二聚变体”)可以包括空间变体(例如，如在图25、图42和图43中提供的“杵和臼”，或下文所描述的“偏斜变体”和下文所描述的“电荷对”变体)以及“pi变体”，其允许从异源二聚体纯化同源二聚体。此类方法已在多种专利公开案中描述，包括WO1996/027011以及WO2014/145806，其特此以全文引用的方式并入本文中用于论述“异源二聚变体”，适用于异源二聚化的机制，包括“杵和臼”(“KIH”；如WO2006/106905或WO2014/145806中所描述的，本文有时称“偏斜”变体、“静电转向”或“电荷对”，如WO 2007/114325或WO2014/145806以及WO2017/218707和WO2018045110中所描述的，pi变体；其均以全文引用的方式并入本文中。
1.异源二聚化变体
本发明提供呈多种形式的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其利用异源二聚体变体来实现异源二聚体形成和/或由同源二聚体纯化。
存在许多成对合适的异源二聚化偏斜变体组。这些变体以成“对”“组”方式出现。在一些实施例中，所述对中的一组并入到第一单体中并且所述对中的另一组并入到第二单体中。在一些实施例中，这些组不一定表现为“杵臼”型变体，其中一种单体上的残基与另一种单体上的残基之间存在一对一对应，而组中的这些对形成两种单体之间的界面，促进异源二聚体形成和妨碍同源二聚体形成，使得在生物条件下自发形成的异源二聚体的百分比超过90％，而非预期50％(25％同源二聚体A/A：50％异源二聚体A/B：25％同源二聚体B/B)。在一些实施例中，所形成的异源二聚体的百分比大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％。
在一些实施例中，通过添加空间变体可以有助于异源二聚体的形成。在一些实施例中，通过改变每条重链中的氨基酸，相比于形成具有相同Fc氨基酸序列(例如，防止HC/HC模拟错配)的同源二聚体，不同重链更有可能缔合以形成异源二聚结构。适合的空间变体在本领域中已知并且在下文中进一步详细论述。
在一些实施例中，还可以任选地使用一种被称为“杵和臼”或“杵臼”的机制，其指代产生空间影响以促进异源二聚体形成和不利于同源二聚体形成的氨基酸工程改造；这有时称为“杵和臼”，如以下文献中所述：Ridgway等人，《蛋白质工程》9(7)：617(1996)；Atwell等人，《分子生物学杂志》1997270：26；美国专利第8,216,805号；和WO1996/027011，其全部以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，“杵”是指CH3域a变体T366Y，并且“臼”是指CH3域b变体Y407T。在一些实施例中，“杵”是指CH3域a变体S354C/T366W，并且“臼”是指CH3域b变体Y349C/T366S/L368A/Y407V。另外，如Merchant等人，《自然·生物技术》16：677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以使形成偏向异源二聚化。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含来自所述对的一组取代并且TIGIT结合部分包含来自所述对的另一组取代。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含所述对的“杵”取代，并且TIGIT结合部分包含“臼”取代。在一些实施例中，TIGIT结合部分包含来自所述对的“杵”取代，并且PVRIG结合部分包含“臼”取代。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含取代S354C/T366W，并且TIGIT结合部分包含取代Y349C/T366S/L368A/Y407V。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含取代S354C/E356D/M358L/T366W，且TIGIT结合部分包含取代Y349C/E356D/M358L/T366S/L368A/Y407V。
在一些实施例中，还可任选地使用一种被称为“不对称工程再改造技术免疫球蛋白”(Asymmetric Re-engineering Technology-Immunoglobulin，ART-Ig)的机制，其指代引入突变以产生静电转向效应的氨基酸工程改造；例如，这些解决了LC/HC对(通过框架/互补决定区改组的常见LC)和HC/HC错配问题，所述问题通过引入突变以产生静电导向效应来解决。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含来自所述对的一组取代并且TIGIT结合部分包含来自所述对的另一组取代。此类方法描述于Gunasekaran等人，《生物化学杂志》285(25)：19637(2010)；以及WO2006/106905，其以全文引用的方式并入本文中。此方法有时也被称作“电荷对”。在一些实施例中，静电用以使形成偏向异源二聚化。这些取代还可影响pi，且因此影响纯化，且在一些实施例中，还可视为pi变体。在一些实施例中，这类取代被视为和/或称为“空间变体”。在一些实施例中，这些包括IgG1铰链/CH3电荷对(EEE-RRR)，其包含与D221R/P228R/K409R配对的取代D221E/P228E/L368E。在一些实施例中，这些包括IgG2铰链/CH3电荷对(EEE-RRRR)，其包含与C223R/E225R/P228R/K409R配对的取代C223E/P228E/L368E。在一些实施例中，这些包括与E356K/D399K配对的CH3电荷对(DD-KK)K392D/K409D。在一些实施例中，这些包括EW-RVT对，其中K360E/K409W与Q347R/D399V/F405T配对。在一些实施例中，这些包括EW-RVTS-S对，其中K360E/K409W/Y349C与Q347R/D399V/F405T/S354C配对。在一些实施例中，这些包括在349、368、349或349+355处与351D或E或D配对的366K(+351K)。在一些实施例中，这些实施例包括DuoBody(L-R)对，其中F405L与K409R配对。在一些实施例中，这些包括SEEDbody对，其中IgG/A嵌合体与IgG/A嵌合体配对。在一些实施例中，这些包括BEAT对，其中来自TCRα界面的残基与来自TCRβ界面的残基配对。在一些实施例中，这些包括BEAT对，其中来自CH3域a中的TCRα界面的残基与来自CH3域b中的TCRβ界面的残基配对。在一些实施例中，这些包括7.8.60(DMA-RRVV)对，其中K360D/D399M/Y407A与E345R/Q347R/T366V/K409V配对。在一些实施例中，这些包括20.8.34(SYMV-GDQA)对，其中Y349S/K370Y/T366M/K409V与E356G/E357D/S364Q/Y407A配对。参见例如Brinkmann和Kontermann，《双特异性抗体的制成》《单克隆抗体》，9(2)：182-212(2017)。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含来自所述对的一组取代，并且TIGIT结合部分包含来自所述对的另一组取代。参见例如以全文引用的方式并入本文中的WO2012131555和WO2011131746。
在一些实施例中，可采用称为CrossMAb的机制来解决LC/HC错配问题。在一些实施例中，采用CrossMAbVH-VL交换VH和VL结构域。在一些实施例中，采用CrossMAbCH1-CL交换CH1域和CL域。在一些实施例中，采用CrossMAbFab交换VH-CH1和VL-CL域。在一些实施例中，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性异源二聚抗体采用了CrossMAbCH1-CL并且交换CH1和CL域。在一些实施例中，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性异源二聚抗体采用了CrossMAbVH-VL并且交换VH和VL结构域。在一些实施例中，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性异源二聚抗体采用了CrossMAbFab，并且交换VH-CH1和VL-CL域。参见例如以全文引用的方式并入本文中的WO2009080251。
在一些实施例中，称为BiMAb的机制可以用于解决LC/HC和HC/HC错配问题并且促进所需双特异性抗体的形成。参见例如WO2010129304，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，可通过引入突变以产生静电转向效应(例如，在人类IgG2中)来解决LC/HC和HC/HC错配问题。在一些实施例中，这些包括BiMAb对，其中CH3域a取代K249E/K288E与CH3域b取代E236K/D278K配对。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含来自BiMAb对的一组取代，并且TIGIT结合部分包含来自BiMAb对的另一组取代。
在一些实施例中，可以采用被称为FcΔAdp的机制来解决LC/HC和HC/HC错配问题并且促进所需双特异性抗体的形成。参见例如以全文引用的方式并入本文中的WO2010151792。在一些实施例中，可通过引入突变以产生不同蛋白A亲和力来解决LC/HC和HC/HC错配问题。在一些实施例中，这些包括FcΔAdp对，其中CH3域a取代H435R不与CH3域中取代配对。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含FcΔAdp对的一组取代，并且TIGIT结合部分包含FcΔAdp对的另一组取代。
在一些实施例中，可以采用被称为XmAb的机制来解决LC/HC(Fab-scFv-Fc)和HC/HC错配问题并且促进所需双特异性抗体的形成。参见例如以全文引用的方式并入本文中的WO2011028952。在一些实施例中，可以通过引入HA-TF取代来解决LC/HC(Fab-scFv-Fc)和HC/HC错配问题。在一些实施例中，HA-TF对包括CH3域a取代S364H/F405A与CH3域b取代Y349T/T394F。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含来自XmAb对的一组取代并且TIGIT结合部分包含来自XmAb对的另一组取代。
在一些实施例中，称为DuoBody的机制可以用于解决LC/HC(受控Fab臂交换)和HC/HC错配问题并且促进所需双特异性抗体的形成。参见例如以全文引用的方式并入本文中的WO2011131746。在一些实施例中，可通过引入CH3域取代来解决LC/HC和HC/HC错配问题。在一些实施例中，DuoBody(L-R)对包括与CH3域b取代K409R配对的CH3域a取代F405L。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含DuoBody对的取代中的一个，并且TIGIT结合部分包含DuoBody对的另一取代。
在一些实施例中，可使用被称为Azymetric的机制来解决LC/HC(orthoFab-Ig)和HC/HC错配问题并且促进所需双特异性抗体的形成。参见例如以全文引用的方式并入本文中的WO2012058768。在一些实施例中，可通过引入ZW1取代来解决错配问题。在一些实施例中，ZW1对包括与CH3域b取代T350V/T366L/N390R/K392M/T394W配对的CH3域a取代T350V/L351Y/S400E/F405A/Y407V。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含来自ZW1对的取代中的一个，并且TIGIT结合部分包含来自ZW1对的另一个取代。
在一些实施例中，被称为Biclonics的机制可用于解决LC/HC(通过使用转基因小鼠MeMo和噬菌体展示库产生的常见LC)和HC/HC错配问题并且促进所需双特异性抗体的形成。参见例如以全文引用的方式并入本文中的WO2013157953。在一些实施例中，可通过引入各种取代来解决错配问题。在一些实施例中，取代对包括在Y349、L368或Y349和R355中的任一处与CH3域b取代L351D/E或D配对的CH3域a取代T366K(+L351K)。在一些实施例中，PVRIG结合部分包含来自Biclonics对的取代和TIGIT结合部分包含来自Biclonics对的另一取代。
在一些实施例中，本文中所论述的空间变体可以任选且独立地与任何pi或其它变体(如Fc变体、FcRn变体等)合并到一种或两种单体中，并且可以独立且任选地包括或不包括于本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体中。
2.示范性双特异性抗体形式
如本领域的技术人员将理解且下文更充分地论述的，本发明的抗TIGIT/抗PVRIF双特异性异源二聚抗体可以以多种配置存在，如图33(不对称形式)和34(对称形式)中所提供(也参见Brinkmann和Kontermann，《双特异性抗体的制成》《单克隆抗体》，9(2)：182-212(2017)；其以引用的方式并入本文)。在一些实施例中，本发明的抗TIGIT/抗PVRIF双特异性抗体的异源二聚体形式可以具有不同的价数并且是双特异性的。在一些实施例中，本发明的抗TIGIT/抗PVRIF双特异性异源二聚抗体可以是二价和双特异性的，其中一个检查点标靶(例如，PVRIG或TIGIT)由一个结合部分或抗原结合域(ABD)结合并且其它检查点标靶(例如，TIGIT或PVRIG)由第二结合部分或抗原结合域(ABD)结合。在一些实施例中，本发明的抗TIGIT/抗PVRIF双特异性异源二聚抗体也可以是三价和双特异性的，其中第一检查点标靶(例如，PVRIG或TIGIT)通过第二结合部分或抗原结合域(ABD)和第二检查点标靶(例如，PVRIG或TIGIT)通过第二结合部分或抗原结合域(ABD)结合。
在一些实施例中，形式是例如图33和34，以及以全文引用的方式并入本文中的WO2015/149077A1和WO2017/218707中所提供的形式中的任一种。这些形式还可与以上变体中的任一个组合。
B.抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分
可以例如通过抗体具有至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、或者至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大的KD来展现对PVRIG或PVRIG表位的特异性结合，其中KD是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性结合抗原的抗体对于对照分子的KD相对于PVRIG抗原或表位大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
一般来说，对于最佳结合到在NK和T细胞表面上表达的PVRIG，抗体优选地具有小于50nM并且最优选地小于1nM的KD，其中小于0.1nM并且小于1pM和0.1pM适用于本发明方法中。
此外，可以例如通过抗体对PVRIG抗原或表位的KA或Ka对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍来展现对特定抗原或表位的特异性结合，其中KA或Ka是指特定的抗体-抗原相互作用的缔合速率。
在一些实施例中，本发明的抗PVRIG和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体以100nM或更小、50nM或更小、10nM或更小或1nM或更小(即更高结合亲和力)或1pM或更小的KD结合到人类PVRIG，其中KD在25℃或37℃下通过已知方法测定，例如表面等离子共振(SPR，例如Biacore分析)、ELISA、KINEXA和最通常地SPR。
在一些实施例中，抗PVRIG和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的结合亲和力可与活性相关。呈现T细胞上的最高最大信号的抗体可以与皮摩尔范围内的亲和力相关。在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可适用于基于T细胞的免疫疗法，其部分地基于其亲和力。参考来自WO2016/134333的抗体序列，所述抗体序列在此以引用的方式并入，且确切地说，参考图38中所概述的抗PVRIG抗原结合域(描绘结合PVRIG的序列且阻断PVRIG与PVRL2的相互作用；在此包括与图4的序列)，图39(描绘结合PVRIG的序列且不阻断PVRIG与PVRL2的相互作用；包括在本文中作为图5)，图40(描绘来自这些抗体的CDR和数据；包括在本文中作为图6)和图41(描绘来自杂交瘤的结合和阻断的CDR；包括在本文中作为图7)，以及图35提供用于抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的额外PVRIG结合部分。也就是说，来自WO2016/134333的所有CPA.7和CHA.7抗体(包括CDR、VH和VL和全长序列)的图和图例以及特定序列和SEQ ID NO：明确地并入本文。
本发明的抗PVRIG和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体在皮摩尔范围(例如0.1到9pM)内具有结合亲和力(如使用本文中概述的技术所测量)，其中约0.2到约2为优选的，且约0.2到约0.5为特别适用的。
可以用于提供本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的PVRIG抗体如下标记。本文所述的这些PVRIG抗体标记如下。PVRIG抗体具有参考编号，例如“CPA.7.013”。这表示可变重链和可变轻链的组合，例如，如图4A-4AA和图5A-5H中所描绘。“CPA.7.013.VH”是指CPA.7.013的可变重链部分，而“CPA.7.013.VL”是可变轻链。“CPA.7.013.vhCDR1”、“CPA.7.013.vhCDR2”、“CPA.7.013.vhCDR3”、“CPA.7.013.vlCDR1”、“CPA.7.013.vlCDR2”和“CPA.7.013.vlCDR3”是指所指示的CDR。“CPA.7.013.HC”是指这个分子的整条重链(例如，可变域和恒定域)，并且“CPA.7.013.LC”是指同一个分子的整条轻链(例如，可变域和恒定域)。“CPA.7.013.H1”是指包含可变重链和轻链域的全长抗体，包括人类IgG1的恒定域(因此，图9和图21中展示H1；IgG1、IgG2、IgG3和IgG4序列)。因此，“CPA.7.013.H2”将是与人类IgG2连接的CPA.7.013可变域。“CPA.7.013.H3”将是与人类IgG3连接的CPA.7.013可变域，并且“CPA.7.013.H4”将是与人类IgG4连接的CPA.7.013可变域。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含PVRIG抗体序列和/或PVRIG抗原结合域中的任一种作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。
可以用于提供本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的PVRIG抗体如下标记。抗体具有参考编号，例如“CHA.7.518.1”。这代表可变重链和可变轻链的组合，如图7所示，例如，理解这些抗体包括两条重链和两条轻链。“CPA.7.518.1.VH”是指CPA.7.518.1的可变重链部分，而“CPA.7.518.1.VL”是可变轻链。“CPA.7.518.1.vhCDR1”、“CPA.7.518.1.vhCDR2”、“CPA.7.518.1.vhCDR3”、“CPA.7.518.1.vlCDR1”、“CPA.7.518.1.vlCDR2”和“CPA.7.518.1.vlCDR3”是指所指示的CDR。“CPA.7.518.1.HC”是指这一分子的整条重链(例如可变域和恒定域)，并且“CPA.7.518.1.LC”是指同一分子的整条轻链(例如可变域和恒定域)。通常，人类κ轻链用于本文中每种噬菌体(或人源化杂交瘤)抗体的恒定域，尽管在一些实施例中使用λ轻链恒定域。“CPA.7.518.1.H1”是指包含可变重链和轻链结构域的全长抗体，包括人类IgG1的恒定域(因此H1；IgG1、IgG2、IgG3和IgG4序列显示在图21中)。因此，“CPA.7.518.1.H2”将是与人类IgG2连接的CPA.7.518.1可变域。“CPA.7.518.1.H3”将是与人类IgG3连接的CPA.7.518.1可变域，并且“CPA.7.518.1.H4”将是与人类IgG4连接的CPA.7.518.1可变域。注意，在一些情况下，人类IgG可能具有额外的突变，如下所述，并且这可以注释。举例来说，在许多实施例中，人类IgG4中可能存在S241P突变，并且这可以注释为例如“CPA.7.518.1.H4(S241P)”。具有此S241P铰链变体的人类IgG4序列展示于图21中。其它可能的变体是IgG1(N297A)，(或在这一位点消除糖基化的其它变体，并且因此许多效应功能与FcγRIIIa结合相关)和IgG1(D265A)，其降低与FcγR受体的结合。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含与抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分一样的PVRIG抗体序列中的任一种。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含与抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分一样的PVRIG抗原结合域序列中的任一种。
本发明进一步提供重链和轻链可变域以及全长重链和轻链，其中的任一个可以用作抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的一部分。
在一些实施例中，本发明提供与PVRIG结合的scFv，其包含如上所概述通过scFv连接子连接的重链可变域和轻链可变域。VL和VH结构域可以呈任一定向，例如从N端到C端“VH-接头-VL”或“VL-接头”VH”。这些是由其组成部分命名的；例如“scFv-CHA.7.518.1VH-连接子-VL”或“scFv-CPA.7.518.1.VL-linker-VH”。因此，“scFv-CPA.7.518.1”可以呈任一定向。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含结合到PVRIG的scFv作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。
本发明提供抗原结合域，包括全长抗体，其含有许多特定的所列举的一组6个CDR。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含来自本文中所提供的PVRIG抗体序列的6个CDR组中的任一个，在抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分中。
本发明还提供重链和轻链可变域以及全长重链和轻链。
在许多实施例中，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体为人类(来源于噬菌体)并且阻断PVRIG和PVLR2的结合。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含PVRIG抗体和/或抗原结合域序列，其能够结合和阻断受体-配体相互作用，作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含来自能够结合和阻断受体-配体相互作用的PVRIG抗体序列的CDR，作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。结合和阻断受体-配体相互作用的CPA抗体以及CDR序列如下，并且也概述其组分，其序列如图4中所示：
CPA.7.001、CPA.7.001.VH、CPA.7.001.VL、CPA.7.001.HC、CPA.7.001.LC和CPA.7.001.H1、CPA.7.001.H2、CPA.7.001.H3、CPA.7.001.H4；CPA.7.001.vhCDR1、CPA.7.001.vhCDR2、CPA.7.001.vhCDR3、CPA.7.001.vlCDR1、CPA.7.001.vlCDR2和CPA.7.001.vlCDR3；
CPA.7.003、CPA.7.003.VH、CPA.7.003.VL、CPA.7.003.HC、CPA.7.003.LC、CPA.7.003.H1、CPA.7.003.H2、CPA.7.003.H3、CPA.7.003.H4；CPA.7.003.vhCDR1、CPA.7.003.vhCDR2、CPA.7.003.vhCDR3、CPA.7.003.vlCDR1、CPA.7.003.vlCDR2和CPA.7.003.vlCDR3；
CPA.7.004、CPA.7.004.VH、CPA.7.004.VL、CPA.7.004.HC、CPA.7.004.LC、CPA.7.004.H1、CPA.7.004.H2、CPA.7.004.H3、CPA.7.004.H4；CPA.7.004.vhCDR1、CPA.7.004.vhCDR2、CPA.7.004.vhCDR3、CPA.7.004.vlCDR1、CPA.7.004.vlCDR2和CPA.7.004.vlCDR3；
CPA.7.006、CPA.7.006.VH、CPA.7.006.VL、CPA.7.006.HC、CPA.7.006.LC、CPA.7.006.H1、CPA.7.006.H2、CPA.7.006.H3、CPA.7.006.H4；CPA.7.006.vhCDR1、CPA.7.006.vhCDR2、CPA.7.006.vhCDR3、CPA.7.006.vlCDR1、CPA.7.006.vlCDR2和CPA.7.006.vlCDR3；
CPA.7.008、CPA.7.008.VH、CPA.7.008.VL、CPA.7.008.HC、CPA.7.008.LC、CPA.7.008.H1、CPA.7.008.H2、CPA.7.008.H3、CPA.7.008.H4；CPA.7.008.vhCDR1、CPA.7.008.vhCDR2、CPA.7.008.vhCDR3、CPA.7.008.vlCDR1、CPA.7.008.vlCDR2和CPA.7.008.vlCDR3；
CPA.7.009、CPA.7.009.VH、CPA.7.009.VL、CPA.7.009.HC、CPA.7.009.LC、CPA.7.009.H1、CPA.7.009.H2、CPA.7.009.H3、CPA.7.009.H4；CPA.7.009.vhCDR1、CPA.7.009.vhCDR2、CPA.7.009.vhCDR3、CPA.7.009.vlCDR1、CPA.7.009.vlCDR2和CPA.7.009.vlCDR3；
CPA.7.010、CPA.7.010.VH、CPA.7.010.VL、CPA.7.010.HC、CPA.7.010.LC、CPA.7.010.H1、CPA.7.010.H2、CPA.7.010.H3、CPA.7.010.H4；CPA.7.010.vhCDR1、CPA.7.010.vhCDR2、CPA.7.010.vhCDR3、CPA.7.010.vlCDR1、CPA.7.010.vlCDR2和CPA.7.010.vlCDR3；
CPA.7.011、CPA.7.011.VH、CPA.7.011.VL、CPA.7.011.HC、CPA.7.011.LC、CPA.7.011.H1、CPA.7.011.H2、CPA.7.011.H3、CPA.7.011.H4；CPA.7.011.vhCDR1、CPA.7.011.vhCDR2、CPA.7.011.vhCDR3、CPA.7.011.vlCDR1、CPA.7.011.vlCDR2和CPA.7.011.vlCDR3；
CPA.7.012、CPA.7.012.VH、CPA.7.012.VL、CPA.7.012.HC、CPA.7.012.LC、CPA.7.012.H1、CPA.7.012.H2、CPA.7.012.H3、CPA.7.012.H4；CPA.7.012.vhCDR1、CPA.7.012.vhCDR2、CPA.7.012.vhCDR3、CPA.7.012.vlCDR1、CPA.7.012.vlCDR2和CPA.7.012.vlCDR3；
CPA.7.013、CPA.7.013.VH、CPA.7.013.VL、CPA.7.013.HC、CPA.7.013.LC、CPA.7.013.H1、CPA.7.013.H2、CPA.7.013.H3、CPA.7.013.H4；CPA.7.013.vhCDR1、CPA.7.013.vhCDR2、CPA.7.013.vhCDR3、CPA.7.013.vlCDR1、CPA.7.013.vlCDR2和CPA.7.013.vlCDR3；
CPA.7.014、CPA.7.014.VH、CPA.7.014.VL、CPA.7.014.HC、CPA.7.014.LC、CPA.7.014.H1、CPA.7.014.H2、CPA.7.014.H3、CPA.7.014.H4；CPA.7.014.vhCDR1、CPA.7.014.vhCDR2、CPA.7.014.vhCDR3、CPA.7.014.vlCDR1、CPA.7.014.vlCDR2和CPA.7.014.vlCDR3；
CPA.7.015、CPA.7.015.VH、CPA.7.015.VL、CPA.7.015.HC、CPA.7.015.LC、CPA.7.015.H1、CPA.7.015.H2、CPA.7.015.H3、CPA.7.015.H4；CPA.7.015.vhCDR1、CPA.7.015.vhCDR2、CPA.7.015.vhCDR3、CPA.7.015.vlCDR1、CPA.7.015.vlCDR2和CPA.7.015.vlCDR3；
CPA.7.017、CPA.7.017.VH、CPA.7.017.VL、CPA.7.017.HC、CPA.7.017.LC、CPA.7.017H1、CPA.7.017.H2、CPA.7.017.H3、CPA.7.017.H4；CPA.7.017.vhCDR1、CPA.7.000171.vhCDR2、CPA.7.017.vhCDR3、CPA.7.017.vlCDR1、CPA.7.017.vlCDR2和CPA.7.017.vlCDR3；
CPA.7.018、CPA.7.018.VH、CPA.7.018.VL、CPA.7.018.HC、CPA.7.018.LC、CPA.7.018.Hl、CPA.7.018.H2、CPA.7.018.H3、CPA.7.018.H4；CPA.7.017.vhCDR1、CPA.7.017.vhCDR2、CPA.7.017.vhCDR3、CPA.7.017.vlCDR1、CPA.7.017.vlCDR2和CPA.7.017.vlCDR3；
CPA.7.019、CPA.7.019.VH、CPA.7.019.VL、CPA.7.019.HC、CPA.7.019.LC、CPA.7.019.H1、CPA.7.019.H2、CPA.7.019.H3、CPA.7.019.H4；CPA.7.019.vhCDR1、CPA.7.019.vhCDR2、CPA.7.019.vhCDR3、CPA.7.019.vlCDR1、CPA.7.019.vlCDR2和CPA.7.019.vlCDR3；
CPA.7.021、CPA.7.021.VH、CPA.7.021.VL、CPA.7.021.HC、CPA.7.021.LC、CPA.7.021.H1、CPA.7.021.H2、CPA.7.021.H3、CPA.7.021.H4；CPA.7.021.vhCDR1、CPA.7.021.vhCDR2、CPA.7.021.vhCDR3、CPA.7.021.vlCDR1、CPA.7.021.vlCDR2和CPA.7.021.vlCDR3；
CPA.7.022、CPA.7.022.VH、CPA.7.022.VL、CPA.7.022.HC、CPA.7.022.LC、CPA.7.022.H1、CPA.7.022.H2、CPA.7.022.H3、CPA.7.022.H4；CPA.7.022.vhCDR1、CPA.7.022.vhCDR2、CPA.7.002201.vhCDR3、CPA.7.022.vlCDR1、CPA.7.022.vlCDR2和CPA.7.022.vlCDR3；
CPA.7.023、CPA.7.023.VH、CPA.7.023.VL、CPA.7.023.HC、CPA.7.023.LC、CPA.7.023.H1、CPA.7.023.H2、CPA.7.023.H3、CPA.7.023.H4；CPA.7.023.vhCDR1、CPA.7.023.vhCDR2、CPA.7.023.vhCDR3、CPA.7.023.vlCDR1、CPA.7.023.vlCDR2和CPA.7.023.vlCDR3；
CPA.7.024、CPA.7.024.VH、CPA.7.024.VL、CPA.7.024.HC、CPA.7.024.LC、CPA.7.024.H1、CPA.7.024.H2、CPA.7.024.H3、CPA.7.024.H4；CPA.7.024.vhCDR1、CPA.7.024.vhCDR2、CPA.7.024.vhCDR3、CPA.7.024.vlCDR1、CPA.7.024.vlCDR2和CPA.7.024.vlCDR3；
CPA.7.033、CPA.7.033.VH、CPA.7.033.VL、CPA.7.033.HC、CPA.7.033.LC、CPA.7.033.H1、CPA.7.033.H2、CPA.7.033.H3、CPA.7.033.H4；CPA.7.033.vhCDR1、CPA.7.033.vhCDR2、CPA.7.033.vhCDR3、CPA.7.033.vlCDR1、CPA.7.033.vlCDR2和CPA.7.033.vlCDR3；
CPA.7.034、CPA.7.034.VH、CPA.7.034.VL、CPA.7.034.HC、CPA.7.034.LC、CPA.7.034.H1、CPA.7.034.H2、CPA.7.034.H3、CPA.7.034.H4；CPA.7.034.vhCDR1、CPA.7.034.vhCDR2、CPA.7.034.vhCDR3、CPA.7.034.vlCDR1、CPA.7.034.vlCDR2和CPA.7.034.vlCDR3；
CPA.7.036、CPA.7.036.VH、CPA.7.036.VL、CPA.7.036.HC、CPA.7.036.LC、CPA.7.036.H1、CPA.7.036.H2、CPA.7.036.H3、CPA.7.036.H4；CPA.7.036.vhCDR1、CPA.7.036.vhCDR2、CPA.7.036.vhCDR3、CPA.7.036.vlCDR1、CPA.7.036.vlCDR2和CPA.7.036.vlCDR3；
CPA.7.040、CPA.7.040.VH、CPA.7.040.VL、CPA.7.040.HC、CPA.7.040.LC、CPA.7.040.H1、CPA.7.040.H2、CPA.7.040.H3和CPA.7.040.H4；CPA.7.040.vhCDR1、CPA.7.040.vhCDR2、CPA.7.040.vhCDR3、CPA.7.040.vlCDR1、CPA.7.040.vlCDR2和CPA.7.040.vlCDR3；
CPA.7.046、CPA.7.046.VH、CPA.7.046.VL、CPA.7.046.HC、CPA.7.046.LC、CPA.7.046.H1、CPA.7.046.H2、CPA.7.046.H3、CPA.7.046.H4；CPA.7.046.vhCDR1、CPA.7.046.vhCDR2、CPA.7.046.vhCDR3、CPA.7.046.vlCDR1、CPA.7.046.vlCDR2和CPA.7.046.vlCDR3；
CPA.7.047、CPA.7.047.VH、CPA.7.047.VL、CPA.7.047.HC、CPA.7.047.LC、CPA.7.047.H1、CPA.7.047.H2、CPA.7.047.H3、CPA.7.047.H4；CPA.7.047.vhCDR1、CPA.7.047.vhCDR2、CPA.7.047.vhCDR3、CPA.7.047.vlCDR1、CPA.7.004701.vlCDR2和CPA.7.047.vlCDR3；
CPA.7.049、CPA.7.049.VH、CPA.7.049.VL、CPA.7.049.HC、CPA.7.049.LC、CPA.7.049.H1、CPA.7.049.H2、CPA.7.049.H3、CPA.7.049.H4；CPA.7.049.vhCDR1、CPA.7.049.vhCDR2、CPA.7.049.vhCDR3、CPA.7.049.vlCDR1、CPA.7.049.vlCDR2和CPA.7.049.vlCDR3；和
CPA.7.050、CPA.7.050.VH、CPA.7.050.VL、CPA.7.050.HC、CPA.7.050.LC、CPA.7.050.H1、CPA.7.050.H2、CPA.7.050.H3、CPA.7.050.H4、CPA.7.050.vhCDR1、CPA.7.050.vhCDR2、CPA.7.050.vhCDR3、CPA.7.050.vlCDR1、CPA.7.050.vlCDR2和CPA.7.050.vlCDR3。
另外，存在与PVRIG结合但不阻断PVRIG和PVLR2的相互作用的本文产生的许多CPA抗体。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含PVRIG抗体和/或抗原结合域序列，其能够结合但不阻断作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的受体-配体相互作用。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含来自能够结合但不阻断受体-配体相互作用的序列的PVRIG抗体序列的CDR，作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。以下是结合但不阻断受体-配体相互作用的CPA抗体以及CDR序列，并且也概述其组分，其序列如图4中所示：
CPA.7.028、CPA.7.028.VH、CPA.7.028.VL、CPA.7.028.HC、CPA.7.028.LC、CPA.7.028.H1、CPA.7.028.H2、CPA.7.028.H3和CPA.7.028.H4；CPA.7.028.vhCDR1、CPA.7.028.vhCDR2、CPA.7.028.vhCDR3、CPA.7.028.vlCDR1、CPA.7.028.vlCDR2和CPA.7.028.vlCDR3。
CPA.7.030、CPA.7.030.VH、CPA.7.030.VL、CPA.7.030.HC、CPA.7.030.LC、CPA.7.030.H1、CPA.7.030.H2、CPA.7.030.H3和CPA.7.030.H4；CPA.7.030.vhCDR1、CPA.7.030.vhCDR2、CPA.7.030.vhCDR3、CPA.7.030.vlCDR1、CPA.7.030.vlCDR2和CPA.7.030.vlCDR3。
CPA.7.041、CPA.7.041.VH、CPA.7.041.VL、CPA.7.041.HC、CPA.7.041.LC、CPA.7.041.H1、CPA.7.041.H2、CPA.7.041.H3和CPA.7.041.H4；CPA.7.041.vhCDR1、CPA.7.041.vhCDR2、CPA.7.041.vhCDR3、CPA.7.041.vlCDR1、CPA.7.041.vlCDR2和CPA.7.041.vlCDR3。
CPA.7.016、CPA.7.016.VH、CPA.7.016.VL、CPA.7.016.HC、CPA.7.016.LC、CPA.7.016.H1、CPA.7.016.H2、CPA.7.016.H3和CPA.7.016.H4；CPA.7.016.vhCDR1、CPA.7.016.vhCDR2、CPA.7.016.vhCDR3、CPA.7.016.vlCDR1、CPA.7.016.vlCDR2和CPA.7.016.vlCDR3。
CPA.7.020、CPA.7.020.VH、CPA.7.020.VL、CPA.7.020.HC、CPA.7.020.LC、CPA.7.020.H1、CPA.7.020.H2、CPA.7.020.H3和CPA.7.020.H4；CPA.7.020.vhCDR1、CPA.7.020.vhCDR2、CPA.7.020.vhCDR3、CPA.7.020.vlCDR1、CPA.7.020.vlCDR2和CPA.7.020.vlCDR3。
CPA.7.038、CPA.7.038.VH、CPA.7.038.VL、CPA.7.038.HC、CPA.7.038.LC、CPA.7.038.H1、CPA.7.038.H2、CPA.7.038.H3和CPA.7.038.H4；CPA.7.038.vhCDR1、CPA.7.038.vhCDR2、CPA.7.038.vhCDR3、CPA.7.038.vlCDR1、CPA.7.038.vlCDR2和CPA.7.038.vlCDR3。
CPA.7.044、CPA.7.044.VH、CPA.7.044.VL、CPA.7.044.HC、CPA.7.044.LC、CPA.7.044.H1、CPA.7.044.H2、CPA.7.044.H3和CPA.7.044.H4；CPA.7.044.vhCDR1、CPA.7.044.vhCDR2、CPA.7.044.vhCDR3、CPA.7.044.vlCDR1、CPA.7.044.vlCDR2和CPA.7.044.vlCDR3。
CPA.7.045、CPA.7.045.VH、CPA.7.045.VL、CPA.7.045.HC、CPA.7.045.LC、CPA.7.045.H1、CPA.7.045.H2、CPA.7.045.H3和CPA.7.045.H4；CPA.7.045.vhCDR1、CPA.7.045.vhCDR2、CPA.7.045.vhCDR3、CPA.7.045.vlCDR1、CPA.7.045.vlCDR2和CPA.7.045.vlCDR3。
如本文所论述，本发明还提供上述组分的变体，包括如上所述的CDR中的变体。另外，可变重链可以与本文的“VH”序列80％、90％、95％、98％或99％一致，和/或当使用Fc变体时，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸变化或更多。提供可变轻链，其可与本文的“VL”序列80％、90％、95％、98％或99％一致，和/或当使用Fc变体时，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸变化或更多。类似地，提供重链和轻链，其与本文的全长“HC”和“LC”序列80％、90％、95％、98％或99％一致，和/或当使用Fc变体时，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸变化或更多。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含这些PVRIG抗体和/或抗原结合域序列中的任一种作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。
此外，本发明提供许多CHA抗体，其是由杂交瘤产生的鼠类抗体。如本领域众所周知的，当置于人类框架重链可变区和轻链可变区中或当重链和轻链可变域人源化时，六个CDR是有用的。
本发明的抗PVRIG和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含以下来自PVRIG抗体序列的CHA组中的任一个，作为本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的一部分。因此，本发明提供抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下CDR的CHA组作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的一部分，其序列展示于图7中：
CHA.7.502.vhCDR1、CHA.7.502.vhCDR2、CHA.7.502.vhCDR3、CHA.7.502.vlCDR1、CHA.7.502.vlCDR2和CHA.7.502.vlCDR3。
CHA.7.503.vhCDR1、CHA.7.503.vhCDR2、CHA.7.503.vhCDR3、CHA.7.503.vlCDR1、CHA.7.503.vlCDR2和CHA.7.503.vlCDR3。
CHA.7.506.vhCDR1、CHA.7.506.vhCDR2、CHA.7.506.vhCDR3、CHA.7.506.vlCDR1、CHA.7.506.vlCDR2和CHA.7.506.vlCDR3。
CHA.7.508.vhCDR1、CHA.7.508.vhCDR2、CHA.7.508.vhCDR3、CHA.7.508.vlCDR1、CHA.7.508.vlCDR2和CHA.7.508.vlCDR3。
CHA.7.510.vhCDR1、CHA.7.510.vhCDR2、CHA.7.510.vhCDR3、CHA.7.510.vlCDR1、CHA.7.510.vlCDR2和CHA.7.510.vlCDR3。
CHA.7.512.vhCDR1、CHA.7.512.vhCDR2、CHA.7.512.vhCDR3、CHA.7.512.vlCDR1、CHA.7.512.vlCDR2和CHA.7.512.vlCDR3。
CHA.7.514.vhCDR1、CHA.7.514.vhCDR2、CHA.7.514.vhCDR3、CHA.7.514.vlCDR1、CHA.7.514.vlCDR2和CHA.7.514.vlCDR3。
CHA.7.516.vhCDR1、CHA.7.516.vhCDR2、CHA.7.516.vhCDR3、CHA.7.516.vlCDR1、CHA.7.516.vlCDR2和CHA.7.516.vlCDR3。
CHA.7.518.vhCDR1、CHA.7.518.vhCDR2、CHA.7.518.vhCDR3、CHA.7.518.vlCDR1、CHA.7.518.vlCDR2和CHA.7.518.vlCDR3。
CHA.7.520_1.vhCDR1、CHA.7.520_1.vhCDR2、CHA.7.520_1.vhCDR3、CHA.7.520_1.vlCDR1、CHA.7.520_1.vlCDR2和CHA.7.520_1.vlCDR3。
CHA.7.520_2.vhCDR1、CHA.7.520_2.vhCDR2、CHA.7.520_2.vhCDR3、CHA.7.520_2.vlCDR1、CHA.7.520_2.vlCDR2和CHA.7.520_2.vlCDR3。
CHA.7.522.vhCDR1、CHA.7.522.vhCDR2、CHA.7.522.vhCDR3、CHA.7.522.vlCDR1、CHA.7.522.vlCDR2和CHA.7.522.vlCDR3。
CHA.7.524.vhCDR1、CHA.7.524.vhCDR2、CHA.7.524.vhCDR3、CHA.7.524.vlCDR1、CHA.7.524.vlCDR2和CHA.7.524.vlCDR3。
CHA.7.526.vhCDR1、CHA.7.526.vhCDR2、CHA.7.526.vhCDR3、CHA.7.526.vlCDR1、CHA.7.526.vlCDR2和CHA.7.526.vlCDR3。
CHA.7.527.vhCDR1、CHA.7.527.vhCDR2、CHA.7.527.vhCDR3、CHA.7.527.vlCDR1、CHA.7.527.vlCDR2和CHA.7.527.vlCDR3。
CHA.7.528.vhCDR1、CHA.7.528.vhCDR2、CHA.7.528.vhCDR3、CHA.7.528.vlCDR1、CHA.7.528.vlCDR2和CHA.7.528.vlCDR3。
CHA.7.530.vhCDR1、CHA.7.530.vhCDR2、CHA.7.530.vhCDR3、CHA.7.530.vlCDR1、CHA.7.530.vlCDR2和CHA.7.530.vlCDR3。
CHA.7.534.vhCDR1、CHA.7.534.vhCDR2、CHA.7.534.vhCDR3、CHA.7.534.vlCDRl、CHA.7.534.vlCDR2和CHA.7.534.vlCDR3。
CHA.7.535.vhCDR1、CHA.7.535.vhCDR2、CHA.7.535.vhCDR3、CHA.7.535.vlCDR1、CHA.7.535.vlCDR2和CHA.7.535.vlCDR3。
CHA.7.537.vhCDR1、CHA.7.537.vhCDR2、CHA.7.537.vhCDR3、CHA.7.537.vlCDR1、CHA.7.537.vlCDR2和CHA.7.537.vlCDR3。
CHA.7.538_1.vhCDR1、CHA.7.538_1.vhCDR2、CHA.7.538_1.vhCDR3、CHA.7.538_1.vlCDR1、CHA.7.538_1.vlCDR2和CHA.7.538_1.vlCDR3。
CHA.7.538_2.vhCDR1、CHA.7.538_2.vhCDR2、CHA.7.538_2.vhCDR3、CHA.7.538_2.vlCDR1、CHA.7.538_2.vlCDR2和CHA.7.538_2.vlCDR3。
CHA.7.543.vhCDR1、CHA.7.543.vhCDR2、CHA.7.543.vhCDR3、CHA.7.543.vlCDR1、CHA.7.543.vlCDR2和CHA.7.543.vlCDR3。
CHA.7.544.vhCDR1、CHA.7.544.vhCDR2、CHA.7.544.vhCDR3、CHA.7.544.vlCDR1、CHA.7.544.vlCDR2和CHA.7.544.vlCDR3。
CHA.7.545.vhCDR1、CHA.7.545.vhCDR2、CHA.7.545.vhCDR3、CHA.7.545.vlCDR1、CHA.7.545.vlCDR2和CHA.7.545.vlCDR3。
CHA.7.546.vhCDR1、CHA.7.546.vhCDR2、CHA.7.546.vhCDR3、CHA.7.546.vlCDR1、CHA.7.546.vlCDR2和CHA.7.546.vlCDR3。
CHA.7.547.vhCDR1、CHA.7.547.vhCDR2、CHA.7.547.vhCDR3、CHA.7.547.vlCDR1、CHA.7.547.vlCDR2和CHA.7.547.vlCDR3。
CHA.7.548.vhCDR1、CHA.7.548.vhCDR2、CHA.7.548.vhCDR3、CHA.7.548.vlCDR1、CHA.7.548.vlCDR2和CHA.7.548.vlCDR3。
CHA.7.549.vhCDR1、CHA.7.549.vhCDR2、CHA.7.549.vhCDR3、CHA.7.549.vlCDR1、CHA.7.549.vlCDR2和CHA.7.549.vlCDR3。
CHA.7.550.vhCDR1、CHA.7.550.vhCDR2、CHA.7.550.vhCDR3、CHA.7.550.vlCDR1、CHA.7.550.vlCDR2和CHA.7.550.vlCDR3。
CHA.7.518.4.vhCDR1，CHA.7.518.4.vhCDR2，CHA.7.518.4.vhCDR3，CHA.7.518.4.vlCDR1，CHA.7.518.4.vlCDR2和CHA.7.518.4.vlCDR3。
如上所述，这些CDR组也可以是如上所述的氨基酸变体。
此外，可变重链和可变轻链的框架区可以如本领域中已知的人源化(视需要在CDR中产生偶发性变体)，并且因此可以产生图7A-7DD的VH和VL链的人源化变体。此外，人源化重链和轻链可变域然后可以与人类恒定区，例如来自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区融合。
特别地，如本领域中已知，鼠类VH和VL链可以如本领域中已知般进行人源化，例如使用NCBI网站的IgBLAST程序，如Ye等人《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》41：W34-W40(2013)中所概述，所述文献关于人源化方法以全文引用的方式并入本文中。IgBLAST采用鼠类VH和/或VL序列并且将其与已知人类种系序列的文库进行比较。如本文所示，对于本文所产生的人源化序列，使用的数据库是IMGT人类VH基因(F+ORF，273个种系序列)和IMGT人类VLK基因(F+ORF，74个种系序列)。选择示范性五个CHA序列：CHA.7.518、CHA.7.530、CHA.7.538_1、CHA.7.538_2和CHA.7.524(关于VH和VL序列，参见图7A-7DD)。对于人源化的这个实施例，5个全都选择人类种系IGHV1-46(等位基因1)作为受体序列并且选择人类重链IGHJ4(等位基因1)连接区(J基因)。对于四个(CHA.7.518、CHA.7.530、CHA.7.538_1和CHA.7.538_2)中的三个，选择人类种系IGKV1-39(等位基因1)作为受体序列并且选择人类轻链IGKJ2(等位基因1)(J基因)。J基因选自在
Figure BDA0002922546330000761
国际ImMunoGeneTics信息系统(如www.imgt.org)下汇编的人类连接区序列。CDR根据AbM定义(参见www.bioinfo.org.uk/ abs/)来定义。图11A-11I描绘人源化序列以及一些潜在变化以优化与PVRIG的结合。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含这些经人源化的PVRIG抗体或抗原结合域序列中的任一个作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含CHA.7.518PVRIG抗体序列作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含CHA.7.530PVRIG抗体序列作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含CHA.7.538_1PVRIG抗体序列作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含CHA.7.538_2PVRIG抗体序列作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含CHA.7.518.4 PVRIG抗体序列作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分
CHA抗体的特异性人源化抗体包括图11A-11I、图12A-12E和图13中所示的那些抗体。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含如在图11A-11I、图12A-12E和图13中展示的CHA PVRIG抗体序列作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。如本领域的普通技术人员将了解，每个人源化可变重链(人源化重链；HH)和可变轻链(人源化轻链；HL)序列可以与人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区组合。也就是说，CHA.7.518.HH1是第一人源化可变重链，并且CHA.7.518.HH1.1是全长重链，包含具有IgG1恒定区的“HH1”人源化序列(CHA.7.518.HH1.2是具有IgG2的CHA.7.518.HH1等)。在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含图4、5、7、11、12、13、14、15、16、17、26和/或40中所提供的PVRIG序列作为PVRIG结合部分。
在一些实施例中，本发明的抗PVRIG抗体包括抗PVRIG抗体，其中不同抗PVRIG抗体的VH和VL序列可以“混合和匹配”以产生其它抗PVRIG抗体。可以使用上文所述的结合分析(例如，ELISA)测试这类“混合和匹配”抗体的PVRIG结合。在一些实施例中，当VH和VL链混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被结构上类似的VH序列置换。同样地，在一些实施例中，来自特定VH/VL配对的VL序列被结构上类似的VL序列置换。举例来说，同源抗体的VH和VL序列特别适合于混合和匹配。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含来自已经“混合和匹配”的不同抗PVRIG抗体的PVRIG VH和VL序列作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分。
因此，本发明的抗体包含选自由以下组成的组的CDR氨基酸序列：(a)如本文所列的序列；(b)由于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代而与(a)中指定的那些CDR氨基酸序列不同的序列；(c)与(a)或(b)中指定的序列具有90％或更高、95％或更高、98％或更高、或99％或更高序列一致性的氨基酸序列；(d)具有由多核苷酸编码的氨基酸序列的多肽，所述多核苷酸具有编码本文所列氨基酸的核酸序列。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的一部分的PVRIG变体CDR序列。
在PVRIG抗体的定义中另外包括与本文中所列举的PVRIG抗体共享一致性的抗体。也就是说，在某些实施例中，根据本发明的抗PVRIG抗体包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区分别包含与优选的抗PVRIG免疫分子的分离后的抗PVRIG氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中抗体保留亲本抗PVRIG抗体的所期望的功能特性。两个序列之间的一致性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数(例如，同源性％＝相同位置的数量/位置总数×100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，这些需要引入以使两个序列最佳对齐。序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的测定可以使用数学算法完成，如下面的非限制性实例中所述。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与如本文所述的经分离的抗PVRIG氨基酸序列同源的氨基酸序列。
两个氨基酸序列之间的一致性百分比可以使用已并入到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(Comput.Appl.Biosci.)》，4：11-17(1988))算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、空位长度罚分(gaplength penalty)12和空位罚分(gap penalty)4来测定。另外，两个氨基酸序列之间的一致性百分比可以使用已经并入到GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》48：444-453(1970))算法、使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6来测定。
另外地或替代地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，对公共数据库进行检索，以例如鉴别相关序列。此类检索可以使用Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215：403-10的XBLAST程序(2.0版)进行。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与根据本发明的至少一些实施例的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带空位比对，可以如Altschul等人(1997)《核酸研究》25(17)：3389-3402中所述采用带空位的BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
通常，PVRIG抗体之间比较的一致性百分比为至少75％、至少80％、至少90％，优选一致性百分比至少约95％、96％、97％、98％或99％。一致性百分比可以沿着整个氨基酸序列，例如整条重链或轻链或沿着链的一部分。举例来说，在本发明的抗PVRIG抗体的定义内包括的是沿着整个可变区(例如，其中一致性是沿着可变区95％或98％一致)，或沿着整个恒定区，或仅沿着Fc结构域共享一致性的抗体。确切地说，本发明提供具有PVRIG结合部分或抗原结合域的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述PVRIG结合部分或抗原结合域与CHA.7.518.4抗体具有至少75％、至少80％、至少90％，优选一致性百分比至少约95％、96％、97％、98％或99％。
另外，还包括可具有相同CDR，但可变域(或整条重链或轻链)有改变的序列。举例来说，PVRIG抗体包括具有与图8A-8D中所示相同的CDR的那些，但其沿着可变区的一致性可以更低，例如95％或98％相同。确切地说，本发明提供抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其具有PVRIG结合部分或抗原结合域，所述PVRIG结合域具有与CHA.7.518.4相同的CDR，但具有与CHA.7.518.495％或98％相同的框架区。
本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含与图8A-8D中所示的那些CDR相同的CDR，作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的一部分。
另外，还包括可具有相同CDR，但可变域(或整条重链或轻链)有改变的序列。举例来说，PVRIG抗体包括具有与图35A-35D中所示相同的CDR的那些，但其沿着可变区的一致性可以更低，例如95％或98％相同。
本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含与图35A-35D中所示的那些CDR相同的CDR，作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的一部分。
在一些实施例中，PVRIG结合部分来自如WO 2017/041004(以全文引用的方式并入本文中)中所提供的抗PVRIG抗体。在一些实施例中，PVRIG结合部分来自如WO 2018/017864(以全文引用的方式并入本文中)中所提供的抗PVRIG抗体。
1.与所列举的抗体竞争结合的PVRIG抗体
本发明不仅提供所列举的抗体，而且还提供了与所列举的抗体竞争以特异性结合到PVRIG分子的额外抗体(在本文中所列举的特异性结合到PVRIG的大量CPA和CHA)。本发明的PVRIG抗体“分箱”到不同表位箱中。本文概述了四个单独的分箱；1)表位箱到CPA.7.002、CPA.7.003、CPA.7.005、CPA.7.007、CPA.7.010、CPA.7.012、CPA.7.015、CPA.7.016、CPA.7.017、CPA.7.019、CPA.7.020、CPA.7.021、CPA.7.024、CPA.7.028、CPA.7.032、CPA.7.033、CPA.7.036、CPA.7.037、CPA.7.038、CPA.7.043、CPA.7.046和CPA.7.041所属的分箱；2)表位箱到CPA.7.004、CPA.7.009、CPA.7.011、CPA.7.014、CPA.7.018、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.034、CPA.7.040、CPA.7.045和CPA.7.047所属的分箱；3)CPA.7.039，其定义了分箱1和分箱2之间的区别，其在于分箱1阻断CPA.7.039的结合，且分箱2将配体夹在CPA.7.039中，以后分箱4)将其夹在CPA.7.050中。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含能够与所列举的抗体(本文中所列举的特异性结合到PVRIG的CPA和CHA数)竞争的PVRIG抗体和/或抗原结合域序列作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分的一部分。
因此，本发明提供抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的PVRIG结合部分能够与分箱1中的抗体竞争结合，与分箱2中的抗体竞争结合，与分箱3中的抗体和/或与分箱4中的抗体竞争结合。
产生与所列举的抗体竞争的额外的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，如本领域中已知且一般概述于下文中。竞争性结合研究可以如本领域已知的那样进行，通常使用SPR/
Figure BDA0002922546330000801
结合分析，以及ELISA和基于细胞的分析。
C.抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的TIGIT结合部分
本文所述的抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含TIGIT抗体和/或抗原结合域序列作为TIGIT结合部分的一部分，其中TIGIT抗体如下标记。这类TIGIT抗体具有参考编号，例如“CPA.9.086”。这表示可变重链和可变轻链的组合，如图23中所描绘，例如，理解这些抗体包括两条重链和两条轻链。“CPA.9.086.VH”是指CPA.9.086的可变重链部分，而“CPA.9.086.VL”是可变轻链。“CPA.9.086.vhCDR1”、“CPA.9.086.vhCDR2”、“CPA.9.086.vhCDR3”、“CPA.9.086.vlCDR1”、“CPA.9.086.vlCDR2”和“CPA.9.086.vlCDR3”是指所指示的CDR。“CPA.9.086.HC”是指这种分子的整条重链(例如可变域和恒定域)，并且“CPA.9.086.LC”是指相同分子的整条轻链(例如可变域和恒定域)。通常，人类κ轻链用于本文中每种噬菌体(或人源化杂交瘤)抗体的恒定域，尽管在一些实施例中使用λ轻链恒定域。“CPA.9.086.H1”是指包含可变重链和轻链域的全长抗体，包括人类IgG1的恒定域(因此，图9和图21中展示H1；IgG1、IgG2、IgG3和IgG4序列)。因此，“CPA.9.086.H2”将为连接到人类IgG2的CPA.9.086可变域。“CPA.9.086.H3”将为连接到人类IgG3的CPA.9.086可变域，且“CPA.9.086.H4”将为连接到人类IgG4的CPA.9.086可变域。注意，在一些情况下，人类IgG可能具有额外的突变，如下所述，并且这可以注释。举例来说，在许多实施例中，人类IgG4中可能存在S241P突变，并且这可以例如注释为“CPA.9.086.H4(S241P)”。具有此S241P铰链变体的人类IgG4序列展示于图21中。其它可能的变体是IgG1(N297A)，(或在这一位点消除糖基化的其它变体，并且因此许多效应功能与FcγRIIIa结合相关)和IgG1(D265A)，其降低与FcγR受体的结合。本发明的抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含TIGIT抗体域序列中的任一个作为抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的TIGIT结合部分。本发明的抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含TIGIT抗原结合域中的任一个作为抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的TIGIT结合部分。
本发明还提供重链和轻链可变域以及全长重链和轻链。
在一些实施例中，本发明提供结合于TIGIT的scFv，其包含如上所概述通过scFv连接子连接的重链可变域和轻链可变域。VL和VH结构域可以呈任一定向，例如从N端到C端“VH-连接子-VL”或“VL-连接子”VH”。这些是由其组成部分命名的；例如“scFv-CPA.9.086.VH-连接子-VL”或“scFv-CPA.9.086.VL-连接子-VH”。因此，“scFv-CPA.9.086”可以呈任一定向。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含结合到TIGIT作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的TIGIT结合部分的任何scFv。本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含结合到TIGIT作为抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的TIGIT抗原结合域的一部分的任何scFv。在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含图26中所提供的PVRIG序列作为PVRIG结合部分。在许多实施例中，本发明的抗体是人(衍生自噬菌体)并阻断TIGIT和PVR的结合。如图3和图4中所示，以下是结合和阻断受体-配体相互作用的CPA抗体，并且也概述其组分，(如在“序列”部分中所论述，所有但scFv构建体的序列在序列表中以及在图24中提供)：
CPA.9.018、CPA.9.018.VH、CPA.9.018.VL、CPA.9.018.HC、CPA.9.018.LC、CPA.9.018.H1、CPA.9.018.H2、CPA.9.018.H3、CPA.9.018.H4；CPA.9.018.H4(S241P)；CPA.9.018.vhCDR1、CPA.9.018.vhCDR2、CPA.9.018.vhCDR3、CPA.9.018.vlCDR1、CPA.9.018.vlCDR2、CPA.9.018.vlCDR3和scFv-CPA.9.018；
CPA.9.027、CPA.9.027.VH、CPA.9.027.VL、CPA.9.027.HC、CPA.9.027.LC、CPA.9.027.H1、CPA.9.027.H2、CPA.9.027.H3、CPA.9.027.H4；CPA.9.018.H4(S241P)；CPA.9.027.vhCDRl、CPA.9.027.vhCDR2、CPA.9.027.vhCDR3、CPA.9.027.vlCDR1、CPA.9.027.vlCDR2、CPA.9.027.vlCDR3和scFv-CPA.9.027；
CPA.9.049、CPA.9.049.VH、CPA.9.049.VL、CPA.9.049.HC、CPA.9.049.LC、CPA.9.049.H1、CPA.9.049.H2、CPA.9.049.H3；CPA.9.049.H4；CPA.9.049.H4(S241P)；CPA.9.049.vhCDR1、CPA.9.049.VhCDR2、CPA.9.049.vhCDR3、CPA.9.049.vlCDR1、CPA.9.049.vlCDR2、CPA.9.049.vlCDR3和scFv-CPA.9.049；
CPA.9.057、CPA.9.057.VH、CPA.9.057.VL、CPA.9.057.HC、CPA.9.057.LC、CPA.9.057.H1、CPA.9.057.H2、CPA.9.057.H3；CPA.9.057.H4；CPA.9.057.H4(S241P)；CPA.9.057.vhCDR1、CPA.9.057.vhCDR2、CPA.9.057.vhCDR3、CPA.9.057.vlCDR1、CPA.9.057.vlCDR2、CPA.9.057.vlCDR3和scFv-CPA.9.057；
CPA.9.059、CPA.9.059.VH、CPA.9.059.VL、CPA.9.059.HC、CPA.9.059.LC、CPA.9.059.H1、CPA.9.059.H2、CPA.9.059.H3；CPA.9.059.H4；CPA.9.059.H4(S241P)；CPA.9.059.vhCDR1、CPA.9.059.vhCDR2、CPA.9.059.vhCDR3、CPA.9.059.vlCDR1、CPA.9.059.vlCDR2、CPA.9.059.vlCDR3和scFv-CPA.9.059；
CPA.9.083、CPA.9.083.VH、CPA.9.083.VL、CPA.9.083.HC、CPA.9.083.LC、CPA.9.083.H1、CPA.9.083.H2、CPA.9.083.H3；CPA.9.083.H4；CPA.9.083.H4(S241P)；CPA.9.083.vhCDR1、CPA.9.083.vhCDR2、CPA.9.083.vhCDR3、CPA.9.083.vlCDR1、CPA.9.083.vlCDR2、CPA.9.083.vlCDR3和scFv-CPA.9.083；
CPA.9.086、CPA.9.086.VH、CPA.9.086.VL、CPA.9.086.HC、CPA.9.086.LC、CPA.9.086.H1、CPA.9.086.H2、CPA.9.086.H3；CPA.9.086.H4；CPA.9.086.H4(S241P)；CPA.9.086.vhCDR1、CPA.9.086.vhCDR2、CPA.9.086.vhCDR3、CPA.9.086.vlCDR1、CPA.9.086.vlCDR2、CPA.9.086.vlCDR3和scFv-CPA.9.086；
CPA.9.089、CPA.9.089.VH、CPA.9.089.VL、CPA.9.089.HC、CPA.9.089.LC、CPA.9.089.H1、CPA.9.089.H2、CPA.9.089.H3；CPA.9.089.H4；CPA.9.089.H4(S241P)；CPA.9.089.vhCDR1、CPA.9.089.vhCDR2、CPA.9.089.vhCDR3、CPA.9.089.vlCDR1、CPA.9.089.vlCDR2、CPA.9.089.vlCDR3和scFv-CPA.9.089；
CPA.9.093、CPA.9.093.VH、CPA.9.093.VL、CPA.9.093.HC、CPA.9.093.LC、CPA.9.093.H1、CPA.9.093.H2、CPA.9.093.H3；CPA.9.093.H4；CPA.9.093.H4(S241P)；CPA.9.093.vhCDR1、CPA.9.093.vhCDR2、CPA.9.093.vhCDR3、CPA.9.093.vlCDR1、CPA.9.093.vlCDR2、CPA.9.093.vlCDR3和scFv-CPA.9.093；
CPA.9.101、CPA.9.101.VH、CPA.9.101.VL、CPA.9.101.HC、CPA.9.101.LC、CPA.9.101.H1、CPA.9.101.H2、CPA.9.101.H3；CPA.9.101.H4；CPA.9.101.H4(S241P)；CPA.9.101.vhCDR1、CPA.9.101.vhCDR2、CPA.9.101.vhCDR3、CPA.9.101.vlCDR1、CPA.9.101.vlCDR2、CPA.9.101.vlCDR3和scFv-CPA.9.101；以及
CPA.9.103、CPA.9.103.VH、CPA.9.103.VL、CPA.9.103.HC、CPA.9.103.LC、CPA.9.103.H1、CPA.9.103.H2、CPA.9.103.H3；CPA.9.103.H4；CPA.9.103.H4(S241P)；CPA.9.103.vhCDR1、CPA.9.103.vhCDR2、CPA.9.103.vhCDR3、CPA.9.103.vlCDR1、CPA.9.103.vlCDR2、CPA.9.103.vlCDR3和scFv-CPA.9.103。
此外，本发明提供许多CHA抗体，其是由杂交瘤产生的鼠类抗体。如本领域众所周知的，当置于人类框架重链可变区和轻链可变区中或当重链可变域和轻链可变域人源化时，六个CDR是有用的。因此，本发明提供了抗体，通常是全长或scFv结构域，其包含以下CDR组，其序列展示在图23和/或序列表中：
CHA.9.536.1、CHA.9.536.1.VH、CHA.9.536.1.VL、CHA.9.536.1.HC、CHA.9.536.1.LC、CHA.9.536.1.H1、CHA.9.536.1.H2、CHA.9.536.1.H3；CHA.9.536.1.H4、CHA.9.536.1.H4(S241P)、CHA.9.536.1.vhCDR1、CHA.9.536.1.vhCDR2、CHA.9.536.1.vhCDR3、CHA.9.536.1.vlCDR1、CHA.9.536.1.vlCDR2和CHA.9.536.1.vhCDR3；
CHA.9.536.3、CHA.9.536.3.VH、CHA.9.536.3.VL、CHA.9.536.3.HC、CHA.9.536.3.LC、CHA.9.536.3.H1、CHA.9.536.3.H2、CHA.9.536.3.H3；CHA.9.536.3.H4、CHA.9.536.3.H4(S24lP)；CHA.9.536.3.vhCDRl、CHA.9.536.3.vhCDR2、CHA.9.536.3.vhCDR3、CHA.9.536.3.vlCDRl、CHA.9.536.3.vlCDR2和CHA.9.536.3.vhCDR3；
CHA.9.536.4、CHA.9.536.4.VH、CHA.9.536.4.VL、CHA.9.536.4.HC、CHA.9.536.4.LC、CHA.9.536.4.H1、CHA.9.536.4.H2、CHA.9.536.4.H3；CHA.9.536.4.H4、CHA.9.536.4.H4(S241P)、CHA.9.536.4.vhCDR1、CHA.9.536.4.vhCDR2、CHA.9.536.4.vhCDR3、CHA.9.536.4.vlCDR1、CHA.9.536.4.vlCDR2和CHA.9.536.4.vhCDR3；
CHA.9.536.5、CHA.9.536.5.VH、CHA.9.536.5.VL、CHA.9.536.5.HC、CHA.9.536.5.LC、CHA.9.536.5.H1、CHA.9.536.5.H2、CHA.9.536.5.H3；CHA.9.536.5.H4、CHA.9.536.5.H4(S241P)、CHA.9.536.5.vhCDR1、CHA.9.536.5.vhCDR2、CHA.9.536.5.vhCDR3、CHA.9.536.5.vlCDR1、CHA.9.536.5.vlCDR2和CHA.9.536.5.vhCDR3；
CHA.9.536.6、CHA.9.536.6.VH、CHA.9.536.6.VL、CHA.9.536.6.HC、CHA.9.536.6.LC、CHA.9.536.6.H1、CHA.9.536.6.H2、CHA.9.536.6.H3；CHA.9.536.6.H4、CHA.9.536.6.vhCDR1、CHA.9.536.6.vhCDR2、CHA.9.536.6.vhCDR3、CHA.9.536.6.vlCDR1、CHA.9.536.6.vlCDR2和CHA.9.536.6.vhCDR3；
CHA.9.536.7、CHA.9.536.7.VH、CHA.9.536.7.VL、CHA.9.536.7.HC、CHA.9.536.7.LC、CHA.9.536.7.H1、CHA.9.536.7.H2、CHA.9.536.7.H3；CHA.9.536.7.H4、CHA.9.536.5.H4(S241P)；CHA.9.536.7.vhCDR1、CHA.9.536.7.vhCDR2、CHA.9.536.7.vhCDR3、CHA.9.536.7.vlCDR1、CHA.9.536.7.vlCDR2和CHA.9.536.7.vhCDR3；
CHA.9.536.8、CHA.9.536.8.VH、CHA.9.536.8.VL、CHA.9.536.8.HC、CHA.9.536.8.LC、CHA.9.536.8.H1、CHA.9.536.8.H2、CHA.9.536.8.H3；CHA.9.536.8.H4、CHA.9.536.8.H4(S241P)、CHA.9.536.8.vhCDR1、CHA.9.536.8.vhCDR2、CHA.9.536.8.vhCDR3、CHA.9.536.8.vlCDR1、CHA.9.536.8.vlCDR2和CHA.9.536.8.vhCDR3；
CHA.9.560.1、CHA.9.560.1VH、CHA.9.560.1.VL、CHA.9.560.1.HC、CHA.9.560.1.LC、CHA.9.560.1.H1、CHA.9.560.1.H2、CHA.9.560.1.H3；CHA.9.560.1.H4、CHA.9.560.1.H4(S241P)、CHA.9.560.1.vhCDR1、CHA.9.560.1.vhCDR2、CHA.9.560.1.vhCDR3、CHA.9.560.1.vlCDR1、CHA.9.560.1.vlCDR2和CHA.9.560.1.vhCDR3；
CHA.9.560.3、CHA.9.560.3VH、CHA.9.560.3.VL、CHA.9.560.3.HC、CHA.9.560.3.LC、CHA.9.560.3.H1、CHA.9.560.3.H2、CHA.9.560.3.H3；CHA.9.560.3.H4、CHA.9.560.3.H4(S241P)；CHA.9.560.3.vhCDR1、CHA.9.560.3.vhCDR2、CHA.9.560.3.vhCDR3、CHA.9.560.3.vlCDR1、CHA.9.560.3.vlCDR2和CHA.9.560.3.vhCDR3；
CHA.9.560.4、CHA.9.560.4VH、CHA.9.560.4.VL、CHA.9.560.4.HC、CHA.9.560.4.LC、CHA.9.560.4.H1、CHA.9.560.4.H2、CHA.9.560.4.H3；CHA.9.560.4.H4、CHA.9.560.4.H4(S241P)、CHA.9.560.4.vhCDR1、CHA.9.560.4.vhCDR2、CHA.9.560.4.vhCDR3、CHA.9.560.4.vlCDR1、CHA.9.560.4.vlCDR2和CHA.9.560.4.vhCDR3；
CHA.9.560.5、CHA.9.560.5VH、CHA.9.560.5.VL、CHA.9.560.5.HC、CHA.9.560.5.LC、CHA.9.560.5.H1、CHA.9.560.5.H2、CHA.9.560.5.H3；CHA.9.560.5.H4、CHA.9.560.5.vhCDR1、CHA.9.560.5.vhCDR2、CHA.9.560.5.vhCDR3、CHA.9.560.5.vlCDR1、CHA.9.560.5.vlCDR2和CHA.9.560.5.vhCDR3；
CHA.9.560.6、CHA.9.560.6VH、CHA.9.560.6.VL、CHA.9.560.6.HC、CHA.9.560.6.LC、CHA.9.560.6.H1、CHA.9560.6.H2、CHA.9.560.6.H3；CHA.9.560.6.H4、CHA.9.560.6.H4(S241P)、CHA.9.560.6.vhCDR1、CHA.9.560.6.vhCDR2、CHA.9.560.6.vhCDR3、CHA.9.560.6.vlCDR1、CHA.9.560.6.vlCDR2和CHA.9.560.6.vhCDR3；
CHA.9.560.7、CHA.9.560.7VH、CHA.9.560.7.VL、CHA.9.560.7.HC、CHA.9.560.7.LC、CHA.9.560.7.H1、CHA.9.560.7.H2、CHA.9.560.7.H3；CHA.9.560.7.H4；CHA.9.560.7.H4(S241P)；CHA.9.560.7.vhCDR1、CHA.9.560.7.vhCDR2、CHA.9.560.7.vhCDR3、CHA.9.560.7.vlCDR1、CHA.9.560.7.vlCDR2和CHA.9.560.7.vhCDR3；
CHA.9.560.8、CHA.9.560.8VH、CHA.9.560.8.VL、CHA.9.560.8.HC、CHA.9.560.8.LC、CHA.9.560.8.H1、CHA.9.560.8.H2、CHA.9.560.8.H3；CHA.9.560.8.H4、CHA.9.560.8.H4(S241P)；CHA.9.560.8.vhCDR1、CHA.9.560.8.vhCDR2、CHA.9.560.8.vhCDR3、CHA.9.560.8.vlCDR1、CHA.9.560.8.vlCDR2和CHA.9.560.8.vhCDR3；
CHA.9.546.1、CHA.9.546.1VH、CHA.9.546.1.VL、CHA.9.546.1.HC、CHA.9.546.1.LC、CHA.9.546.1.H1、CHA.9.546.1.H2、CHA.9.546.1.H3；CHA.9.546.1.H4、CHA.9.546.1.H4(S241P)、CHA.9.546.1.vhCDR1、CHA.9.546.1.vhCDR2、CHA.9.546.1.vhCDR3、CHA.9.546.1.vlCDR1、CHA.9.546.1.vlCDR2和CHA.9.546.1.vhCDR3；
CHA.9.547.1、CHA.9.547.1VH、CHA.9.547.1.VL、CHA.9.547.1.HC、CHA.9.547.1.LC、CHA.9.547.1.H1、CHA.9.547.1.H2、CHA.9.547.1.H3；CHA.9.547.1.H4、CHA.9.547.1.H4(S241P)、CHA.9.547.1.vhCDR1、CHA.9.547.1.vhCDR2、CHA.9.547.1.vhCDR3、CHA.9.547.1.vlCDR1、CHA.9.547.1.vlCDR2和CHA.9.547.1.vhCDR3；
CHA.9.547.2、CHA.9.547.2VH、CHA.9.547.2.VL、CHA.9.547.2.HC、CHA.9.547.2.LC、CHA.9.547.2.H1、CHA.9.547.2.H2、CHA.9.547.2.H3；CHA.9.547.2.H4、CHA.9.547.2.H4(S241P)、CHA.9.547.2.vhCDR1、CHA.9.547.2.vhCDR2、CHA.9.547.2.vhCDR3、CHA.9.547.2.vlCDR1、CHA.9.547.2.vlCDR2和CHA.9.547.2.vhCDR3；
CHA.9.547.3、CHA.9.547.3VH、CHA.9.547.3.VL、CHA.9.547.3.HC、CHA.9.547.3.LC、CHA.9.547.3.H1、CHA.9.547.3.H2、CHA.9.547.3.H3；CHA.9.547.3.H4、CHA.9.547.3.H4(S241P)、CHA.9.547.3.vhCDR1、CHA.9.547.3.vhCDR2、CHA.9.547.3.vhCDR3、CHA.9.547.3.vlCDR1、CHA.9.547.3.vlCDR2和CHA.9.547.3.vhCDR3；
CHA.9.547.4、CHA.9.547.4VH、CHA.9.547.4.VL、CHA.9.547.4.HC、CHA.9.547.4.LC、CHA.9.547.4.H1、CHA.9.547.4.H2、CHA.9.547.4.H3；CHA.9.547.4.H4、CHA.9.547.4.H4(S241P)、CHA.9.547.4.vhCDR1、CHA.9.547.4.vhCDR2、CHA.9.547.4.vhCDR3、CHA.9.547.4.vlCDR1、CHA.9.547.4.vlCDR2和CHA.9.547.4.vhCDR3；
CHA.9.547.6、CHA.9.547.6 VH、CHA.9.547.6.VL、CHA.9.547.6.HC、CHA.9.547.6.LC、CHA.9.547.6.H1、CHA.9.547.6.H2、CHA.9.547.6.H3；CHA.9.547.6.H4、CHA.9.547.6.H4(S241P)、CHA.9.547.6.vhCDR1、CHA.9.547.6.vhCDR2、CHA.9.547.6.vhCDR3、CHA.9.547.6.vlCDR1、CHA.9.547.6.vlCDR2和CHA.9.547.6.vhCDR3；
CHA.9.547.7、CHA.9.547.7VH、CHA.9.547.7.VL、CHA.9.547.7.HC、CHA.9.547.7.LC、CHA.9.547.7.H1、CHA.9.547.7.H2、CHA.9.547.7.H3；CHA.9.547.7.H4、CHA.9.547.7.H4(S241P)、CHA.9.547.7.vhCDR1、CHA.9.547.7.vhCDR2、CHA.9.547.7.vhCDR3、CHA.9.547.7.vlCDR1、CHA.9.547.7.vlCDR2和CHA.9.547.7.vhCDR3；
CHA.9.547.8、CHA.9.547.8VH、CHA.9.547.8.VL、CHA.9.547.8.HC、CHA.9.547.8.LC、CHA.9.547.8.H1、CHA.9.547.8.H2、CHA.9.547.8.H3；CHA.9.547.8.H4、CHA.9.547.8.H4(S241P)、CHA.9.547.8.vhCDR1、CHA.9.547.8.vhCDR2、CHA.9.547.8.vhCDR3、CHA.9.547.8.vlCDR1、CHA.9.547.8.vlCDR2和CHA.9.547.8.vhCDR3；
CHA.9.547.9、CHA.9.547.9、CHA.9.547.9VH、CHA.9.547.9.VL、CHA.9.547.9.HC、CHA.9.547.9.LC、CHA.9.547.9.H1、CHA.9.547.9.H2、CHA.9.547.9.H3；CHA.9.547.9.H4、CHA.9.547.9.H4、CHA.9.547.9.H4(S241P)、CHA.9.547.9.H4(S241P)、CHA.9.547.9.vhCDR1、CHA.9.547.9.vhCDR2、CHA.9.547.9.vhCDR3、CHA.9.547.9.vlCDR1、CHA.9.547.9.vlCDR2和CHA.9.547.9.vhCDR3；
CHA.9.547.13、CHA.9.547.13、CHA.9.547.13VH、CHA.9.547.13.VL、CHA.9.547.13.HC、CHA.9.547.13.LC、CHA.9.547.13.H1、CHA.9.547.13.H2、CHA.9.547.13.H3：CHA.9.547.13.H4、CHA.9.547.13.H4、CHA.9.547.13.H4(S241P)、CHA.9.547.13.H4(S241P)、CHA.9.547.13.vhCDR1、CHA.9.547.13.vhCDR2、CHA.9.547.13.vhCDR3、CHA.9.547.13.vlCDR1、CHA.9.547.13.vlCDR2和CHA.9.547.13.vhCDR3；
CHA.9.541.1、CHA.9.541.1.VH、CHA.9.541.1，VL、CHA.9.541.1.HC、CHA.9.541.1.LC、CHA.9.541.1.H1、CHA.9.541.1.H2、CHA.9.541.1.H3；CHA.9.541.1.H4、CHA.9.541.1.H4(S241P)、CHA.9.541.1.vhCDR1、CHA.9.541.1.vhCDR2、CHA.9.541.1.vhCDR3、CHA.9.541.1.vlCDR1、CHA.9.541.1.vlCDR2和CHA.9.541.1.vhCDR3；
CHA.9.541.3、CHA.9.541.3.VH、CHA.9.541.3.VL、CHA.9.541.3.HC、CHA.9.541.3.LC、CHA.9.541.3.H1、CHA.9.541.3.H2、CHA.9.541.3.H3；CHA.9.541.3.H4、CHA.9.541.3.H4(S241P)、CHA.9.541.3.vhCDR1、CHA.9.541.3.vhCDR2、CHA.9.541.3.vhCDR3、CHA.9.541.3.vlCDR1、CHA.9.541.3.vlCDR2和CHA.9.541.3.vhCDR3；
CHA.9.541.4、CHA.9.541.4.VH、CHA.9.541.4.VL、CHA.9.541.4.HC、CHA.9.541.4.LC、CHA.9.541.4.H1、CHA.9.541.4.H2、CHA.9.541.4.H3；CHA.9.541.4.H4、CHA.9.541.4.H4(S241P)、CHA.9.541.4.vhCDR1、CHA.9.541.4.vhCDR2、CHA.9.541.4.vhCDR3、CHA.9.541.4.vlCDR1、CHA.9.541.4.vlCDR2和CHA.9.541.4.vhCDR3；
CHA.9.541.5、CHA.9.541.5.VH、CHA.9.541.5.VL、CHA.9.541.5.HC、CHA.9.541.5.LC、CHA.9.541.5.H1、CHA.9.541.5.H2、CHA.9.541.5.H3；CHA.9.541.5.H4、CHA.9.541.5.H4(S241P)、CHA.9.541.5.vhCDR1、CHA.9.541.5.vhCDR2、CHA.9.541.5.vhCDR3、CHA.9.541.5.vlCDR1、CHA.9.541.5.vlCDR2和CHA.9.541.5.vhCDR3；
CHA.9.541.6、CHA.9.541.6.VH、CHA.9.541.6.VL、CHA.9.541.6.HC、CHA.9.541.6.LC、CHA.9.541.6.H1、CHA.9.541.6.H2、CHA.9.541.6.H3；CHA.9.541.6.H4、CHA.9.541.6.H4(S241P)、CHA.9.541.6.vhCDR1、CHA.9.541.6.vhCDR2、CHA.9.541.6.vhCDR3、CHA.9.541.6.vlCDR1、CHA.9.541.6.vlCDR2和CHA.9.541.6.vhCDR3；
CHA.9.541.7、CHA.9.541.7.VH、CHA.9.541.7.VL、CHA.9.541.7.HC、CHA.9.541.7.LC、CHA.9.541.7.H1、CHA.9.541.7.H2、CHA.9.541.7.H3；CHA.9.541.7.H4、CHA.9.541.7.H4(S241P)、CHA.9.541.7.vhCDR1、CHA.9.541.7.vhCDR2、CHA.9.541.7.vhCDR3、CHA.9.541.7.vlCDR1、CHA.9.541.7.vlCDR2和CHA.9.541.7.vhCDR3；和
CHA.9.541.8、CHA.9.541.8.VH、CHA.9.541.8.VL、CHA.9.541.8.HC、CHA.9.541.8.LC、CHA.9.541.8.H1、CHA.9.541.8.H2、CHA.9.541.8.H3；CHA.9.541.8.H4、CHA.9.541.8.H4(S241P)；CHA.9.541.8vhCDR1、CHA.9.541.8.vhCDR2、CHA.9.541.8.vhCDR3、CHA.9.541.8.vlCDR1、CHA.9.541.8.vlCDR2和CHA.9.541.8.vhCDR3。
CHA.9.547.18vhCDR1、CHA.9.547.18.vhCDR2、CHA.9.547.18.vhCDR3、CHA.9.547.18.vlCDR1、CHA.9.547.18vlCDR2和CHA.9.547.18.vlCDR3。
在包含上述抗体的CDR的scFv的情况下，将这些标记为scFv，其包括包含具有vhCDR的重链可变域、接头和具有vlCDR的轻链可变域的scFv，同样如上所述呈任一定向。因此，本发明包括scFv-CHA.9.536.3.1、scFv-CHA.9.536.3、scFv-CHA.9.536.4、scFv-CHA.9.536.5、scFv-CHA.9.536.7、scFv-CHA.9.536.8、scFv-CHA.9.560.1、scFv-CHA.9.560.3、scFv-CHA.9.560.4、scFv-CHA.9.560.5、scFv-CHA.9.560.6、scFv-CHA.9.560.7、scFv-CHA.9.560.8、scFv-CHA.9.546.1、scFv-CHA.9.547.1、scFv-CHA.9.547.2、scFv-CHA.9.547.3、scFv-CHA.9.547.4、scFv-CHA.9.547.6、scFv-CHA.9.547.7、scFv-CHA.9.547.8、scFv-CHA.9.547.9、scFv-CHA.9.547.13、scFv-CHA.9.541.1、scFv-CHA.9.541.3、scFv-CHA.9.541.4、scFv-CHA.9.541.5、scFv-CHA.9.541.6、scFv-CHA.9.541.7和scFv-CHA.9.541.8。
此外，CHA.9.543与TIGIT结合但不阻断TIGIT-PVR相互作用。
如本文所论述的，本发明还提供了上述组分(CPA和CHA)的变体，包括CDR中的变体，如上所述。因此，本发明提供包含如本文所概述的一组6个CDR的抗体，其可以在CDR组中含有一个、两个或三个氨基酸差异，只要所述抗体仍然与TIGIT结合即可。用于测试抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体与本文所概述的CDR序列相比是否含有突变的合适分析是本领域已知的，例如Biacore分析。
此外，本发明还提供了上述可变重链和轻链的变体。在这种情况下，可变重链可以与本文的“VH”序列80％、90％、95％、98％或99％相同，和/或当使用Fc变体时，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸变化或更多。提供可变轻链，其可与本文的“VL”序列(特别是CPA.9.086)80％、90％、95％、98％或99％相同，和/或当使用Fc变体时，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸变化或更多。在这些实施例中，只要抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体仍与TIGIT结合，本发明就包括这些变体。用于测试抗TIGIT抗体与本文所概述的CDR序列相比是否含有突变的合适分析是本领域已知的，例如Biacore分析。
类似地，提供重链和轻链，其与本文的全长“HC”和“LC”序列(并且特别是CPA.9.086)80％、90％、95％、98％或99％一致，和/或当使用Fc变体时，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸变化或更多。在这些实施例中，只要抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体仍与TIGIT结合，本发明就包括这些变体。用于测试抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体与本文所概述的CDR序列相比是否含有突变的合适分析是本领域已知的，例如Biacore分析。
此外，本文中CPA或CHA抗体的可变重链和可变轻链的框架区可以如本领域已知(根据需要偶尔在CDR中产生变体)进行人源化(或者，在CHA抗体的情况下，“再人源化”，达到可以进行替代人源化方法的程度)，因此可以产生图23的VH和VL链的人源化变体(并且特别是CPA.9.086)。此外，人源化重链和轻链可变域然后可以与人类恒定区，例如来自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区(包括IgG4(S241P))融合。
特别地，如本领域中已知，鼠类VH和VL链可以如本领域中已知般进行人源化，例如使用NCBI网站的IgBLAST程序，如Ye等人《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》41：W34-W40(2013)中所概述，所述文献关于人源化方法以全文引用的方式并入本文中。IgBLAST采用鼠类VH和/或VL序列并且将其与已知人类种系序列的文库进行比较。如本文所示，对于本文所产生的人源化序列，使用的数据库是IMGT人类VH基因(F+ORF，273个种系序列)和IMGT人类VLκ基因(F+ORF，74个种系序列)。选择示范性的五种CHA序列：CHA.9.536，CHA9.560，CHA.9.546，CHA.9.547和CHA.9.541(参见图23)。对于人源化的这个实施例，5个全都选择人类种系IGHV1-46(等位基因1)作为受体序列并且选择人类重链IGHJ4(等位基因1)连接区(J基因)。对于四个(CHA.7.518、CHA.7.530、CHA.7.538_1和CHA.7.538_2)中的三个，选择人类种系IGKV1-39(等位基因1)作为受体序列并且选择人类轻链IGKJ2(等位基因1)(J基因)。J基因选自在
Figure BDA0002922546330000931
国际ImMunoGeneTics信息系统(如www.imgt.org)下汇编的人类连接区序列。CDR根据AbM定义(参见www.bioinfo.org.uk/abs/)来定义。在一些实施例中，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包括TIGIT结合部分或抗原结合域，其中不同TIGIT结合部分或抗原结合域的VH和VL序列可以“混合和匹配”以产生其它TIGIT结合部分或抗原结合域。可以使用上文所述的结合分析(例如，ELISA或Biacore分析)测试这类“混合和匹配”抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的TIGIT结合。在一些实施例中，当VH和VL链混合和匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被结构上类似的VH序列置换。同样地，在一些实施例中，来自特定VH/VL配对的VL序列被结构上类似的VL序列置换。举例来说，同源抗体的VH和VL序列特别适合于混合和匹配。
因此，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含选自由以下组成的组的CDR氨基酸序列：(a)如本文中所列举的序列；(b)与(a)中所指定被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸取代的那些CDR氨基酸序列不同的序列；(c)与(a)或(b)中指定的序列具有90％或更高、95％或更高、98％或更高或99％或更高序列一致性的氨基酸序列；(d)具有由多核苷酸编码的氨基酸序列的多肽，所述多核苷酸具有编码如本文中所列举的氨基酸的核酸序列。确切地说，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以包含来自CPA.9.086抗体的抗原结合域，其可具有选自(a)、(b)、(c)或(d)的序列。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列(图26；杵臼异源二聚化方法的氨基酸取代为粗体并加下划线的)：
CHA.7.518.1.H4(S241P)VH IgG1 CH1 IgG4 CH2-CH3 S354C、E356D、M358L、T366W
Figure BDA0002922546330000941
CHA.7.518.1.H4(S241P)VL Cκ
Figure BDA0002922546330000942
和
CPA.9.086 HC CλCrossmab IgG4 Y349C、E356D、M358L、T366S、L368A、Y407V
Figure BDA0002922546330000943
CPA.9.086 LC CH1
Figure BDA0002922546330000944
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330000945
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330000946
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330000951
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330000952
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330000953
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330000954
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330000955
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330000956
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330000957
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330000958
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330000959
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA00029225463300009510
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330000961
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330000962
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330000963
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330000964
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列中的一个。以下序列中()指示相对于参考人类IgG4氨基酸序列的缺失。粗体文字指示相对于参考IgG4序列的氨基酸取代。
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下序列中的一个：
CHA.7.518.1 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330000965
CHA.7.518.1 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330000966
CHA.7.518.1 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330000967
Figure BDA0002922546330000971
CHA.7.518.1 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330000972
CHA.7.518.1 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330000973
CHA.7.518.1 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330000974
CHA.7.518.1 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330000975
CHA.7.518.1 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330000976
Figure BDA0002922546330000981
CHA.7.518.1 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330000982
CHA.7.518.1 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330000983
CHA.7.518.4 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330000984
CHA.7.518.4 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330000985
CHA.7.518.4 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330000986
Figure BDA0002922546330000991
CHA.7.518.4 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330000992
CHA.7.518.4 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330000993
CHA.7.518.4 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330000994
CHA.7.518.4 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330000995
CHA.7.518.4 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330000996
Figure BDA0002922546330001001
CHA.7.518.4 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001002
或
CHA.7.518.4 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001003
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含以下抗PVRIG序列中的一个：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001004
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001005
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001011
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001012
CPA.9.086 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001013
CPA.9.086 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001014
CPA.9.086 VH CA-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001015
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001021
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001022
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001023
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001024
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001025
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001031
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001032
CHA.9.547.18 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001033
CHA.9.547.18 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001034
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001035
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001036
Figure BDA0002922546330001041
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001042
或
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001043
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001044
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001045
Figure BDA0002922546330001051
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001052
CPA.9.086 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001053
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001054
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001055
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001056
Figure BDA0002922546330001061
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001062
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001063
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001064
CPA.9.086 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001065
Figure BDA0002922546330001071
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001072
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001073
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001074
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001075
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001081
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001082
CPA.9.086 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001083
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001084
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001085
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001091
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001092
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001093
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001094
CPA.9.086 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001095
Figure BDA0002922546330001101
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001102
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001103
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001104
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001105
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001111
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001112
CPA.9.086 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001113
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001114
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001115
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001121
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001122
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001123
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001124
CPA.9.086 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001125
Figure BDA0002922546330001131
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001132
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001133
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001134
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001135
Figure BDA0002922546330001141
并且抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自以下的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001142
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001143
CPA.9.086 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001144
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001145
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001146
Figure BDA0002922546330001151
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001152
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001153
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001154
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001155
Figure BDA0002922546330001161
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001162
和
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001163
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001164
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001165
Figure BDA0002922546330001171
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001172
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001173
和
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001174
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001175
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001181
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001182
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001183
和
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001184
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.1 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001191
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001192
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001193
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001194
和
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001195
Figure BDA0002922546330001201
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001202
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001203
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001204
CPA.9.086 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001205
Figure BDA0002922546330001211
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001212
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001213
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001214
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001215
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001221
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001222
CPA.9.086 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001223
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001224
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001225
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001231
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001232
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001233
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001234
CPA.9.086 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001235
Figure BDA0002922546330001241
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001242
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001243
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001244
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001245
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001251
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001252
CPA.9.086 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001253
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001254
CFA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001255
Figure BDA0002922546330001261
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001262
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001263
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001264
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001265
CPA.9.086 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001271
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001272
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001273
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001274
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 hIgG4变体2
Figure BDA0002922546330001275
Figure BDA0002922546330001281
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001282
CPA.9.086 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001283
CPA.9.086 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001284
CHA.9.547.18 scFv(VL-连接子-VH)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001285
CHA.9.547.18 scFv(VH-连接子-VL)hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001286
Figure BDA0002922546330001291
和
CHA.9.547.18 hIgG4变体1
Figure BDA0002922546330001292
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 VH Cλ-VL-CHl Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001293
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CHl Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001294
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001295
Figure BDA0002922546330001301
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001302
和
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001303
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001304
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001305
Figure BDA0002922546330001311
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001312
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CHl Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001313
和
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001314
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001315
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001321
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001322
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001323
和
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001324
在一些实施例中，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的抗PVRIG部分包含以下抗PVRIG序列
CHA.7.518.4 VH hIgG4 Fc Y354C E356D M348L T366W杵
Figure BDA0002922546330001331
并且抗TIGIT/抗TIGIT双特异性抗体的抗TIGIT部分包含选自由以下序列组成的组的抗TIGIT序列：
CPA.9.086 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001332
CPA.9.086 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001333
CHA.9.547.18 VH Cλ-VL-CH1 Crossmab hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366SL368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001334
和
CHA.9.547.18 VH hIgG4 Fc Y349C E356D L358L T366S L368A Y407V臼
Figure BDA0002922546330001335
Figure BDA0002922546330001341
另外，抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的定义包括包含与来自本文中所列举的TIGIT抗体的结合域共享一致性的TIGIT结合域的抗体。也就是说，在某些实施例中，根据本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含重链和轻链可变区，其包含与来自优选的抗TIGIT抗体的抗TIGIT氨基酸序列的全部或部分结合域一致的氨基酸序列，其中抗体保留亲本抗TIGIT抗体的所期望功能特性。两个序列之间的一致性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数(即，同源性％＝相同位置的数量/位置总数×100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，这些需要引入以使两个序列最佳对齐。序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的测定可以使用数学算法完成，如下面的非限制性实例中所述。
两个氨基酸序列之间的一致性百分比可以使用已并入到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(《计算机在生物科学中的应用(Comput.Appl.Biosci.)》，4：11-17(1988))算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、空位长度罚分(gaplength penalty)12和空位罚分(gap penalty)4来测定。另外，两个氨基酸序列之间的一致性百分比可以使用已经并入到GCG软件包中的GAP程序中的Needleman和Wunsch(《分子生物学杂志》48：444-453(1970))算法、使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6来测定。
另外地或替代地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，对公共数据库进行检索，以例如鉴别相关序列。此类检索可以使用Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215：403-10的XBLAST程序(2.0版)进行。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与根据本发明的至少一些实施例的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带空位比对，可以如Altschul等人(1997)《核酸研究》25(17)：3389-3402中所述采用带空位的BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
通常，TIGIT结合域或抗原结合域之间比较的一致性百分比为至少75％、至少80％、至少90％，优选一致性百分比为至少约95％、96％、97％、98％或99％。一致性百分比可以沿着整个氨基酸序列，例如整条重链或轻链或沿着链的一部分。举例来说，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的定义内包括TIGIT结合部分或抗原结合域沿整个可变区(例如，其中一致性沿可变区为95％或98％一致)或沿整个恒定区或仅沿Fc结构域共享一致性的那些抗体。确切地说，本发明提供具有TIGIT结合部分或抗原结合域的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述TIGIT结合部分或抗原结合域与CPA.9.086抗体具有至少75％、至少80％、至少90％，优选一致性百分比至少约95％、96％、97％、98％或99％。确切地说，本发明提供具有TIGIT结合部分或抗原结合域的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述TIGIT结合部分或抗原结合域与CHA.9.547.18抗体具有至少75％、至少80％、至少90％，优选一致性百分比至少约95％、96％、97％、98％或99％。
另外，还包括可以具有一致CDR但在可变域(或整条重链或轻链)的框架部分中发生变化的序列。例如，TIGIT抗体包括具有与图23中所示相同的CDR的那些，但其沿着可变区的一致性可以更低，例如95％或98％相同。确切地说，本发明提供抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其具有TIGIT结合部分或抗原结合域，所述TIGIT结合域具有与CPA.9.086相同的CDR，但具有与CPA.9.08695％或98％相同的框架区。确切地说，本发明提供抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其具有TIGIT结合部分或抗原结合域，所述结合部分或抗原结合域具有与CHA.9.547.18相同的CDR，但具有与CHA.9.547.1895％或98％相同的框架区。
另外，还包括可以具有一致CDR但在可变域(或整条重链或轻链)的框架部分中发生变化的序列。例如，TIGIT抗体包括具有与图24A-24SSSS中所示相同的CDR的那些，但其沿着可变区的一致性可以更低，例如95％或98％相同。
在一些实施例中，TIGIT结合部分来自如US2016/0176963A1(以全文引用的方式并入本文中)中所提供的抗TIGIT抗体。在一些实施例中，TIGIT结合部分来自如US20170281764(以全文引用的方式并入本文中)中所提供的抗TIGIT抗体。在一些实施例中，TIGIT结合部分来自如WO2015009856(以全文引用的方式并入本文中)中所提供的抗TIGIT抗体。在一些实施例中，TIGIT结合部分来自如US 9713641(以全文引用的方式并入本文中)中所提供的抗TIGIT抗体。在一些实施例中，TIGIT结合部分来自如WO2016028656(以全文引用的方式并入本文中)中所提供的抗TIGIT抗体。
1.竞争结合的TIGIT抗体
本发明不仅提供所列举的抗体，而且提供与所列举的抗体(本文列举的特异性结合TIGIT的CPA编号)竞争特异性结合TIGIT分子的其它抗体。本发明的TIGIT抗体“分箱”到不同抗原表位箱中。在表位箱研究中的44种TIGIT抗体中，存在各自具有相关成对阻断模式的四个群落，其分入到本文概述的12个总离散分箱中。这里概述了十二个离散箱；1)BM9-H4、CHA.9.525、CPA.9.081-H4、CHA.9.538、CHA.9.553、CPA.9.069-H4、CHA.9.543、CHA.9.556、CPA.9.077-H4和CHA.9.561；2)CHA.9.560和CHA.9.528；3)CHA.9.552、CHA.9.521、CHA.9.541、CHA.9.529、CHA.9.519、CHA.9.527和CHA.9.549；4)CPA.9.057-H4和CHA.9.554；5)CHA.9.546、CPA.9.012-H4、CHA.9.547、CPA.9.013-H4、CPA.9.018-H4、MBSA43-M1、Sino PVR-Fc(配体)、CHA.9.555、PVR-Fc M2A(配体)、BM29-H4、CPA.9.027-H4、CPA.9.049-H4和CPA.9.053-H4；6)CPA.9.064-H4；7)BM26-H4；8)CPA.9.059-H4；9)CHA.9.535和CPA.9.009-H4；10)CHA.9.536、CHA.9.522和CPA.9.015-H4；11)CPA.9.011-H4和BM8-H4和12)CPA.9.071-H4。如WO2018/033798中所论述，其以全文引用的方式并入本文中。
因此，本发明提供了抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其与离散的表位箱1至12中的抗体竞争结合。在一个特定实施例中，本发明提供抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其与CPA.9.086竞争结合，并且与CPA.9.086至少95％、96％、97％、98％或99％一致。
产生与所列举的抗体竞争的额外的抗体抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，如本领域中已知且一般概述于下文中。竞争性结合研究可以如本领域已知的那样进行，通常使用SPR/
Figure BDA0002922546330001371
结合分析，以及ELISA和基于细胞的分析。
VII.编码抗体的核酸
还提供编码本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的核酸组合物，以及含有用核酸和/或表达载体组合物转型的核酸和宿主细胞的表达载体。如本领域技术人员所理解，由于遗传密码的简并性，本文所描绘的蛋白质序列可由任何数量的可能核酸序列编码。
编码抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的核酸组合物将取决于抗体的形式。传统上，含有两条重链和两条轻链的四聚抗体由两个不同核酸编码，一个编码重链并且一个编码轻链。这些可以放入单个表达载体或两个表达载体中，如本领域中已知，转化到宿主细胞中，在宿主细胞中表达其以形成本发明的抗体。在一些实施例中，例如当使用scFv构建体时，通常使用编码可变重链-连接子-可变轻链的单个核酸，其可以插入表达载体中以转化到宿主细胞中。可将核酸置于含有适当转录和翻译控制序列的表达载体中，转录和翻译控制序列包括但不限于信号和分泌序列、调节序列、启动子、复制起点、选择基因等。
根据本发明的至少一些实施例的用于表达重组抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)、PER.C6、HEK293等，如本领域中已知的。
核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中、或部分纯化或基本上纯的形式中。核酸在通过标准技术纯化去掉其它细胞组分或其它污染物(例如其它细胞核酸或蛋白质)时得以“分离”或“变成基本上纯的”，标准技术包括碱/SDS处理、CsCl分带(CsCl banding)、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳以及本领域中众所周知的其它技术。
为了产生scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可操作地连接到编码柔性接头，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段和本文论述的其它片段，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白质，其中VL和VH区通过柔性接头连接。
VIII.配制品
用于实践前述方法的治疗性组合物(并且确切地说，包含至少来自CHA.7.518.1、CHA.7.518.4、CPA.9.086和/或CHA.9.547.18的CDR的双特异性抗体)可以配制到包含适合于所要传递方法的载剂的药物组合物中。合适的载体包括当与治疗组合物组合时保留治疗组合物的抗肿瘤功能，并且通常不与患者的免疫系统反应的任何材料。实例包括但不限于许多标准药物载体中的任一种，例如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水等(总体上参见《雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》第16版，A.Osal.编辑，1980)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且可以包括缓冲剂。
在一些实施例中，配制到药物组合物中的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.1.H4(S241P)VH IgG1 CH1 IgG4 CH2-CH3 S354C、E356D、M358L、T366W
Figure BDA0002922546330001381
CHA.7.518.1.H4(S241P)VL Cκ
Figure BDA0002922546330001391
和
CPA.9.086 HC Cλ Crossmab IgG4 Y349C、E356D、M358L、T366S、L368A、Y407V
Figure BDA0002922546330001392
CPA.9.086 LC CH1
Figure BDA0002922546330001393
在一些实施例中，配制到药物组合物中的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
PVRIG抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001394
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001395
和
TIGIT抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001396
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001397
在一些实施例中，配制到药物组合物中的抗PVRIG抗体包含以下序列：PVRIG抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001401
和
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001402
在一些实施例中，配制到药物组合物中的抗TIGIT抗体包含以下序列：
TIGIT抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001403
和
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001404
在一个优选实施例中，包含本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的药物组合物可以以水溶性形式，如以药学上可接受的盐形式存在，其意图包括酸和碱加成盐两者。“药学上可接受的酸加成盐”是指那些保留游离碱的生物有效性并且不在生物学上或其它方面不合意的用无机酸等形成的盐。“药学上可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱等的盐。
可以以多种方式(包括但不限于皮下和静脉内)施用包含本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的药物组合物(优选呈无菌水溶液形式)。
在优选的实施例中，给药量和施用频率选择为治疗或预防有效的。如本领域中已知，可能需要针对蛋白质降解、全身性对比局部递送和新蛋白酶合成速率以及年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病况的严重程度做出调整，并且这些调整将由本领域技术人员通过常规实验来确定。
为了治疗患者，可以施用治疗有效剂量的本发明的Fc变体。本文的“治疗有效剂量”是指产生其施用效果的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且本领域技术人员可以使用已知技术确定。
IX.使用抗体的方法
本发明的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于多种诊断和治疗应用。在一些情况下，向患者施用抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的决定，通过使用样品肿瘤活检体的表达水平(基因表达水平或蛋白质表达水平，其中优选后者)的评估来确定样品是否过度表达TIGIT和/或PVRIG，以确定向患者施用何种治疗性抗体。
A.诊断用途
因此，本发明的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体还发现分别过度表达PVRIG和/或TIGIT的肿瘤的活体外或体内诊断(包括成像)中的用途。然而，应注意，如本文所论述，TIGIT和PVRIG两者(作为免疫肿瘤学靶蛋白)不一定在癌细胞上过度表达，而是在癌症中(例如，在肿瘤微环境中，也称为TME)的免疫浸润性内。因此，它是作用机制，例如免疫细胞如T细胞和NK细胞的活化，其引起癌症诊断。因此，这些抗体可用于诊断癌症。使用PVRIG抗体的诊断也在WO 2016/134333[0434至0459]中概述，其通过引用并入本文。
通常，诊断可以通过几种方式完成。在一个实施例中，来自患者的组织(如活检样品)与通常标记的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体接触，使得抗体结合于内源性TIGIT。将信号水平与来自相同患者或参考样品的正常非癌组织的信号水平进行比较，以确定癌症的存在或不存在。活组织检查样品可来自实体瘤、血液样品(对于淋巴瘤和白血病，如ALL、T细胞淋巴瘤等)。
一般来说，在此实施例中，标记抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，例如用荧光团或其它光标签，其使用荧光计或此项技术中众所周知的其它光学检测系统检测。在另一个实施例中，使二级标记的抗体与样品接触，例如使用来自不同哺乳动物(小鼠、大鼠、兔、山羊等)的抗人IgG抗体，以形成如本领域已知的夹心分析。替代地，可以直接标记(例如，用生物素)抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，并且可以通过针对本领域中的标记剂的二级Ab进行检测。
一旦发现TIGIT过度表达，可以施用如本文中所概述的根据本发明的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体进行治疗。
在其它实施例中，进行体内诊断。通常，在所述实施例中，将抗TIGIT抗体(包括抗体片段)注射到患者体内并进行成像。在此实施例中，例如，抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体通常标记有光标签或MRI标记，如钆螯合剂、mAb(包括片段)的放射性标记。
在一些实施例中，本文所述的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体用于诊断和治疗两者，或用于单独诊断。当抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体用于诊断和治疗时，一些实施例依赖两种不同的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体到两种不同的表位(例如TIGIT或PVRIG内的两种不同表位，或基于其结合到PVRIG或TIGIT的双特异性性质)，使得诊断性抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体不与治疗性抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体竞争结合，但在一些情况下，相同抗体可用于这两者。举例来说，这可以使用在不同分箱中的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体来进行，例如，结合到TIGIT上的不同表位或PVRIG上的不同表位，如本文中所概述的。因此，包括于本发明中的是包含诊断性抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体和抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的组合物，并且在一些实施例中，诊断性抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体如本文所描述标记。另外，如本文中所概述，治疗性和诊断性抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的组合物也可以与如本文中所概述的其它药物共同施用。
特别适用于诊断的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包括但不限于所列举的这些抗体，或利用具有变体序列的CDR的抗体，或与图5、图7和/或图23中的抗体中的任一种竞争结合的抗体。
在许多实施例中，标记诊断性抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。本文中“标记”意指本文所公开的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体具有一个或多个所连接的元素、同位素或化合物，以实现屏幕或诊断程序中的检测。通常，标记分成几类：a)免疫标记，其可以是作为由抗体识别的融合配偶体并入的表位；b)同位素标记，其可以是放射性同位素或重同位素；c)小分子标记，其可以包括荧光染料和比色染料，或能够实现其它标记方法的如生物素等分子；以及d)如颗粒(包括用于超声标记的气泡)或允许身体成像的顺磁标记等标记。如本领域中已知的，可以在任何位置并入标记到抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体中，并且可以在蛋白质表达期间活体外或活体内并入。
可以在体内，通过施用允许如下所述的全身成像的诊断抗体，或在体外，对从患者取出的样品进行诊断。在此上下文中的“样品”包括任何数量的物质，包括但不限于体液(包括但不限于血液、尿液、血清、淋巴液、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液和精液)，以及组织样本，例如由相关组织的活组织检查产生的样品。
此外，如下文和在实例和图式中所概述，关于PVRIG和/或TIGIT的蛋白质表达水平的信息可以用于确定应该向患者施用哪些抗体。
B.癌症治疗
本发明的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体尤其适用于治疗作为单一疗法的癌症。由于免疫肿瘤学作用机制的性质，PVRIG和/或TIGIT不一定需要过度表达于特定癌症类型上或与特定癌症类型相关；也就是说，目标是使抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体去抑制T细胞和NK细胞活化，使得免疫系统将在癌症之后发生。
在一些实施例中，包含图4、5、7、11、12、13、14、15、16、17、26和/或40的抗PVRIG抗体序列的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体用于治疗癌症(包括如以下概述的T细胞和/或NK细胞的活化)，特别是那些包含S241P和取代的抗体。虽然包含图4、5、7、11、12、13、14、15、16、17、26和/或40的抗PVRIG抗体序列的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体用于治疗癌症(包括如以下概述的T细胞和/或NK细胞的活化)，发现包含CHA.7.518.1、CHA.7.518.4和/或CHA.7.538.2的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体特别适用于一些实施例。
虽然包含图23、24和/或41的抗TIGIT抗体序列的任何抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体用于治疗癌症(包括如下文所概述的T细胞/和或NK细胞的活化)，发现包含CPA.9.086.H4(S241P)、CPA.9.083.H4(S241P)、CHA.9.547.7.H4(S241P)和CHA.9.547.13.H4(S241P)、CHA.9.547.18的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体特别适用于一些实施例。
在一些实施例中，本发明还提供包含图4、5、7、11、12、13、14、15、16、17、26和/或40的抗PVRIG抗体序列的抗PVRIG抗体，其发现适用于治疗癌症(包括如下文所概述的T细胞/和或NK细胞的活化)。在一些实施例中，抗PVRIG抗体包含：
PVRIG抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001441
和
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001442
本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体尤其适用于治疗癌症。一般来说，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体是免疫调节的，因为本发明的抗体通常通过抑制检查点受体(例如，PVRIG或TIGIT)的作用而非直接攻击癌细胞而刺激免疫系统。因此，与旨在抑制对肿瘤生长和发育至关重要的分子途径和/或消耗肿瘤细胞的肿瘤靶向疗法不同，癌症免疫疗法旨在刺激患者自身的免疫系统以消除癌细胞，破坏长期的肿瘤。在癌症免疫疗法中可以使用各种途径，其中有用于诱导肿瘤特异性T细胞反应的治疗性癌症疫苗和用于去除免疫抑制通路的免疫刺激性抗体((例如抑制性受体的拮抗剂＝免疫检查点)。
靶向疗法或常规抗癌疗法的临床反应往往是短暂的，因为癌细胞产生抗性，并且发生肿瘤复发。然而，过去几年中癌症免疫疗法的临床使用表明，这种类型的疗法可以具有持久的临床反应，显示出对长期存活的显著影响。然而，尽管反应是长期的，但只有少数患者有反应(与常规或靶向疗法相反，在常规或靶向疗法中，大量患者有反应，但反应是暂时的)。
当临床上检测到肿瘤时，其已经通过获得免疫耐受和免疫抑制特性以及通过各种机制和多种免疫细胞形成免疫抑制性肿瘤微环境来逃避免疫防御系统。
因此，本发明的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体抗体适用于治疗癌症。由于免疫肿瘤学作用机制的性质，检查点受体(TIGIT或PVRIG)不一定需要在特定癌症类型上过表达或与特定癌症类型相关；也就是说，目标是使抗体去除对T细胞和NK细胞活化的抑制，以使得免疫系统将对癌症起作用。
如本文所用的“癌症”泛指以引起恶性生长或肿瘤(例如，不受调节的细胞生长)的异常和不受控制的细胞分裂为特征的任何肿瘤性疾病(无论是侵袭性的还是转移性的)。如本文所用的术语“癌症”或“癌性”应理解为涵盖以引起恶性生长或肿瘤的异常和不受控制的细胞分裂为特征的任何肿瘤性疾病(无论是侵袭性的、非侵袭性的还是转移性的)，其非限制性实例在本文中有描述。这包括哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的任何生理病况。癌症实例举例说明于实施例中并且在说明书内也有描述。
可使用本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体治疗的癌症的非限制性实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、食道癌、黑素瘤、间皮瘤、默克细胞癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌、喉癌、口腔癌、尿路上皮癌、KRAS突变肿瘤、骨髓增生异常综合症(MDS)以及B细胞恶性肿瘤、B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小型非裂解细胞NHL；肿块性病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
Figure BDA0002922546330001461
Macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性骨髓母细胞白血病；成人T细胞白血病/淋巴瘤；多发性骨髓瘤和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、淋巴恶性肿瘤、与母斑病相关的异常血管增生、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯综合症(Meigs′syndrome)、直肠癌、肾细胞癌、软组织肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、类癌样癌、早期或晚期(包括转移性)卵巢癌。
如WO2016/134333的实例中所示，PVRIG在许多不同来源的不同肿瘤中过表达和/或与肿瘤淋巴细胞浸润相关(如通过与CD3、CD4、CD8和PD-1表达的相关性所证明)，并且因此可用于治疗任何癌症，包括但不限于前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤(NHL)和霍奇金淋巴瘤(HD))、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤和食道癌。
确切地说，包含CHA.7.518.1作为PVRIG结合部分的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)、食道癌。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含CHA.7.538.1.2作为PVRIG结合部分的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)、食道癌。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含CHA.7.518.4作为PVRIG结合部分的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)、食道癌。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含CPA.9.086作为TIGIT结合部分的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)、食道癌。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含CPA.9.083作为TIGIT结合部分的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)、食道癌。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含CHA.9.547.7作为TIGIT结合部分的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)、食道癌。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含CHA.9.547.13作为TIGIT结合部分的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)、食道癌。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含CPA.9.547.18作为TIGIT结合部分的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)、食道癌。在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含以下序列的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)，其中抗PVRIG/抗TIGIT双特异性包含以下序列：
CHA.7.518.1.H4(S241P)VH IgG1 CH1 IgG4 CH2-CH3 S354C、E356D、M358L、T366W
Figure BDA0002922546330001511
CHA.7.518.1.H4(S241P)VL Cκ
Figure BDA0002922546330001512
和
CPA.9.086 HC Cλ Crossmab IgG4 Y349C、E356D、M358L、T366S、L368A、Y407V
Figure BDA0002922546330001513
CPA.9.086 LC CH1
Figure BDA0002922546330001514
在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含以下序列的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)，其中抗PVRIG/抗TIGIT双特异性包括以下抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体中的任一种：
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330001521
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330001522
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330001523
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330001524
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001531
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001532
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330001533
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330001534
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330001535
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330001536
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001537
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001538
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001539
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA00029225463300015310
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001541
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001542
在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含以下序列的抗PVRIG抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)，其中抗PVRIG/抗TIGIT双特异性包括以下抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体中的任一种：
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330001543
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330001544
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330001551
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330001552
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001553
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001554
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330001555
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330001556
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330001557
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330001558
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001559
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA00029225463300015510
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001561
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001562
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001563
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001564
在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含以下序列的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)，其中抗PVRIG/抗TIGIT双特异性包括以下抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体中的任一种：
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330001571
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330001572
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330001573
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330001574
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001575
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001576
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330001577
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330001578
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330001579
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA00029225463300015710
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001581
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001582
或
一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001583
CHA.7.518.4 LC
Figure BDA0002922546330001584
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001585
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001586
在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
确切地说，包含以下序列的抗PVRIG抗体可以用于治疗前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、膀胱癌、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)：
包含以下序列的抗PVRIG抗体：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001591
和
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001592
在一些实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
C.组合疗法
如本领域中已知的，包含靶向免疫疗法标靶的治疗性抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体和对疾病病况具有特异性的额外治疗剂的组合疗法展示出极大前景。举例来说，在免疫疗法的领域中，存在使用化学治疗剂(小分子药物或抗肿瘤抗体)或使用免疫肿瘤学抗体(例如本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体)的许多有前景的组合疗法。
术语“与……组合”和“共同施用”不限于在完全相同的时间施用所述预防剂或治疗剂。相反，这意味着抗体和其它一种或多种药剂以一定的顺序和时间间隔施用，使得它们可以共同起作用以提供与仅用本发明的抗体或仅用其它一种或多种药剂治疗相比增加的益处。优选抗体和其它一种或多种药剂相加起作用，特别优选它们协同起作用。这些分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。有经验的开业医生能够凭经验或通过考虑药剂的药物动力学和作用模式来确定每种治疗剂的合适剂量以及合适的施用时序和方法。
因此，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以与一种或多种其它治疗方案或药剂同时施用。额外治疗方案或药剂可以用于改进抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的功效或安全性。此外，额外治疗方案或药剂可用于治疗相同疾病或共存性，而非改变抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的作用。举例来说，本发明的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以与化学疗法、辐射疗法或化学疗法和辐射疗法两者一起向患者施用。
1.具有化学治疗性小分子的PVRIG、TIGIT和/或PVRIG/TIGIT双特异性抗体
本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以与一种或多种其它的预防剂或治疗剂组合施用，包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、促进血液细胞增殖的药剂、血管生成抑制剂、蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制剂或其它治疗剂。
在此情形下，“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；乙酰精宁(acetogenins)(尤其布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL′)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙碱(colchicine)；桦木酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓朴替康(topotecan)
Figure BDA0002922546330001601
CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
Figure BDA0002922546330001611
)、乙酰喜树碱、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻环肽(cryptophycin)(特别是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；盘克斯塔叮(pancratistatin)；沙考的汀(sarcodictyin)；海绵毒素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γII和卡奇霉素ωII(参见例如《德国应用化学(Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.)》，33：183-186(1994))；达米辛(dynemicin)，包括达米辛A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非罗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如迪诺特宁(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，如二甲睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙碱；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；罗尼达宁(lonidainine)；美登素类(maytansinoid)，如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；硝拉维林(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK.RTM.多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺环锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙基胺；单端孢霉烯(trichothecene)(尤其T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)
Figure BDA0002922546330001631
达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；噻替派(thiotepa)；紫杉烷类(taxoids)，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)(
Figure BDA0002922546330001632
Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton.N.J.)、
Figure BDA0002922546330001633
太平洋紫杉醇的无克列莫佛(cremophor-free)的白蛋白工程改造的纳米颗粒配制品(AmericanPharmaceutical Partners，Schaumberg，Ill.)和多西他赛(docetaxel)(
Figure BDA0002922546330001634
Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0002922546330001635
6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)
Figure BDA0002922546330001636
铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)
Figure BDA0002922546330001637
奥沙利铂(oxaliplatin)；甲酰四氢叶酸(leucovovin)；长春瑞宾(vinorelbine)
Figure BDA0002922546330001638
米托蒽醌(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维生素A(retinoids)，如维甲酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA0002922546330001639
上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，如CHOP，即环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合疗法的缩写；CVP，即环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙组合疗法的缩写；以及FOLFOX，即奥沙利铂
Figure BDA0002922546330001641
与5-FU和甲酰四氢叶酸组合的治疗方案的缩写。
根据至少一些实施例，本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体可以与本领域已知的任何护理癌症治疗标准(例如，可以在http：//www.cancer.gov/cancertopics中找到)组合使用。
因此，在一些情况下，本文中概述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体(确切地说，包括CHA.7.538.1.2和/或CHA.7.518.1作为PVRIG结合部分的那些抗体)可与化学治疗剂组合。类似地，本文中概述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体(确切地说，包括CPA.9.086、CPA.9.083和/或CHA.9.547.13作为TIGIT结合部分的那些抗体)可以与化学治疗剂组合。
在一些实施例中，可以与化学治疗剂组合的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.1.H4(S241P)VH IgG1 CH1 IgG4 CH2-CH3 S354C、E356D、M358L、T366W
Figure BDA0002922546330001642
CHA.7.518.1.H4(S241P)VL Cκ
Figure BDA0002922546330001643
CPA.9.086 HC Cλ Crossmab IgG4 Y349C、E356D、M358L、T366S、L368A、Y407V
Figure BDA0002922546330001644
CPA.9.086 LC CH1
Figure BDA0002922546330001651
在一些实施例中，可以与化学治疗剂组合的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
PVRIG抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001652
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001653
和
TIGIT抗体序列(IMGT CDR粗体并加下划线)
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001654
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001655
在一些实施例中，可以与化学治疗剂组合的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330001656
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330001657
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330001658
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330001659
在一些实施例中，可以与化学治疗剂组合的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001661
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA0002922546330001662
和
CPA.9.086 VH
Figure BDA0002922546330001663
CPA.9.086 VL
Figure BDA0002922546330001664
在一些实施例中，可以与化学治疗剂组合的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.1 VH
Figure BDA0002922546330001665
CHA.7.518.1 VL
Figure BDA0002922546330001666
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA0002922546330001667
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001668
在一些实施例中，可以与化学治疗剂组合的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体包含以下序列：
CHA.7.518.4 VH
Figure BDA0002922546330001669
CHA.7.518.4 VL
Figure BDA00029225463300016610
和
CHA.9.547.18 VH
Figure BDA00029225463300016611
Figure BDA0002922546330001671
CHA.9.547.18 VL
Figure BDA0002922546330001672
D.治疗评定
一般来说，本发明的抗PVRIG、抗TIGIT和/或抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体以如本文所述的多种方式向患有癌症的患者施用，并且评定功效。因此，虽然可以进行标准的功效分析，例如癌症负荷、肿瘤尺寸、转移的存在或程度的评估等，但是也可以基于免疫状况评估来评定免疫肿瘤学治疗。这可以通过多种方式完成，包括体外和体内分析。举例来说，可以与“旧式(old fashioned)”测量一起评估免疫状态变化(例如，在ipi治疗后ICOS+CD4+T细胞的存在)，“旧式”测量如肿瘤负荷、大小、浸润性、LN参与、转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部：PVRIG或TIGIT对CD4+ T细胞活化或增殖、CD8+ T(CTL)细胞活化或增殖、CD8+ T细胞介导的细胞毒性活性和/或CTL介导的细胞耗竭、NK细胞活性和NK介导的细胞耗竭的抑制作用；PVRIG或TIGIT对Treg细胞分化和增殖和Treg或骨髓来源的抑制细胞(MDSC)介导的免疫抑制或免疫耐受的增强作用；和/或PVRIG或TIGIT对通过免疫细胞产生的促炎性细胞因子的影响，例如通过T细胞或其它免疫细胞产生的IL-2、IFN-γ或TNF-α。
在一些实施例中，通过使用例如CFSE稀释法、免疫效应细胞的Ki67细胞内染色以及3H-胸苷掺入法评估免疫细胞增殖来评定治疗。
在一些实施例中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白质含量的增加来评定治疗，所述标志物包括以下中的一个或多个：CD25、CD69、CD137、ICOS、PD1、GITR、OX40以及通过CD107A的表面表达测量的细胞脱粒。
在一些实施例中，通过在不存在治疗的情况下，例如在施用本发明的抗体之前评定T细胞增殖的量来进行治疗评定。如果在施用后患者的T细胞增殖增加，例如患者T细胞的亚组增殖，那么表明T细胞被活化。
类似地，用本发明的抗体治疗的评定可以通过在施用前和施用后测量患者的IFNγ水平来进行，以评定治疗效果。这可以在几小时或几天内完成。
通常，如本领域已知的那样进行基因表达分析。参见例如Goodkind等人，《计算机与化学工程(Computers and Chem.Eng.)》29(3)：589(2005)；Han等人，《生物信息学与生物学见解(Bioinform.Biol.Insights)》11/15/159(增刊1)：29-46；Campo等人，《现代病理学(Nod.Pathol.)》2013年1月；26增刊1：S97-S110，其基因表达测量技术以引用的方式明确并入本文中。
通常，蛋白质表达测量也类似地如本领域中已知般进行，参见例如Wang等人，《用于生物标志物发现的基于毛细管电泳的蛋白质组技术的最新进展(Recent Advances inCapillary Electrophoresis-Based Proteomic Techniques for BiomarkerDiscovery)》，《分子生物学方法(Methods.Mol.Biol.)》2013：984：1-12；Taylor等人，《生物医学研究(BioMed Res.)》第2014卷，文章编号361590，8页；Becerk等人，《突变研究(Mutat.Res)》2011年6月17日：722(2)：171-182，其测量技术以引用的方式明确地并入本文中。
在一些实施例中，通过估计许多细胞参数，例如酶活性(包括蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、ATP产生、辅酶产生和核苷酸摄取活性来评定由靶细胞活力检测测量的细胞毒性活性，从而评定治疗。这些分析的具体实例包括但不限于台盼蓝(Trypan Blue)或PI染色、51Cr或35S释放法、LDH活性、MTT和/或WST分析、钙黄绿素-AM分析、基于发光的分析以及其它分析。
在一些实施例中，通过评定由细胞因子产生测量的T细胞活性，使用细胞因子，使用众所周知的技术，细胞内测量培养物上清液来评定治疗，所述细胞因子包括但不限于：IFNγ、TNFα、GM-CSF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13。
因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδT细胞活化的增加；(iii)细胞毒性T细胞活性的增加；(iv)NK和/或NKT细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδT细胞抑制的缓解；(Vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)IL-2分泌的增加；(viii)干扰素γ产生的增加；(ix)Th1反应的增加；(x)Th2反应的减少；(xi)减少或消除调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性。
E.测量功效的分析
在一些实施例中，使用如实例中所述的混合淋巴细胞反应(MLR)分析来评定T细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量免疫反应的增加或减少，如例如通过不同因子的磷酸化或去磷酸化或通过测量其它翻译后修饰所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量αβ和/或γδT细胞活化的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量细胞毒性T细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量NK和/或NKT细胞活性的增加或减少，如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过如例如CD107a等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量促炎性细胞因子分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量IL-2分泌的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量干扰素γ产生的增加或减少，如例如通过ELISA或通过Luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和FACS分析或通过Alispot等所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量Th1反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量Th2反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量调节性T细胞(Treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量M2巨噬细胞细胞数量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量M2巨噬细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量N2嗜中性粒细胞增量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过IHC所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量N2嗜中性粒细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量T细胞活化抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量CTL活化抑制的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞耗竭的增加或减少，如例如通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδT细胞反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD137、CD107a、PD1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如CD45RA、CCR7等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径测试测量癌细胞的细胞凋亡或裂解的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的刺激的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量癌细胞的直接杀伤的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导通路分析测量Th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，信号传导途径分析测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如MTT、Cr释放、Calcine AM)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如CFSE稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺活化性。适当的活性增加概述如下。
在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或活化标志物(例如CD137、CD107a、PD1等)的表达变化来测量T细胞活化。对于T细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如CD25、CD69、CD137、PD1)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施例中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过活化标志物(例如CD107a等)的表达变化来测量NK细胞活化。对于NK细胞，增殖、细胞毒性(杀伤靶细胞并且增加CD107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如IFNγ和TNF)和细胞表面受体表达(例如CD25)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化来测量γδT细胞活化。
在一个实施例中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化来测量Th1细胞活化。
相比参考样品或对照样本，例如不含本发明的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的测试样品中的信号，活性或反应的适当增加(或如上所述适当减少)是至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％至99％的增加。
类似地，与参考或对照样品相比，增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍显示出有功效。
X.实例
实例1：抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的产生和表征
1.简介
PVRIG和TIGIT为表达于T细胞和天然杀伤细胞上的抑制性免疫检查点受体。这些受体与其相应配体的相互作用的抗体介导的阻断产生增强的T细胞活性。所述组合的抗PVRIG和抗TIGIT抗体疗法在活体外功能分析中产生协同效应或累加效应。此处，我们使抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体产生并对其表征，且展示抗体保留各臂对于相应靶抗原的结合亲和力。此外，PVRIG/TIGIT BsAb等效于基于活体外官能分析的T细胞中的抗PVRIG和抗TIGIT抗体组合。
2.方案
抗PVRIG/抗TIGIT双特异性构建体设计：多个双特异性PVRIG/TIGIT双抑制剂抗体使用以下的组合以三种不同形式产生：“杵臼”(KIH)Fc工程改造和CrossMab、KIH scFv-Fab(“开瓶器”)以及在IMGT下沉积的基于“开瓶器”等容异源二聚化(“IH”)形式的序列(http：//www.imgt.org，基于Eu编号的位置；还参见图42-44)。为了以KIH CrossMab形式产生全人类双特异性抗体，使CPA.9.086可变重链以及丙氨酸和丝氨酸的含两个氨基酸的连接子融合到人类恒定λ域和含有突变S241P、S354C、E356D、M358L和T366W的人类IgG4的CH2和CH3域。CPA.9.086轻链可变域以及两个丝氨酸的连接子融合到人类IgG4的CH1。CHA.7.518.1.H4(S241P)重链可变域融合到人类IgG4的CH1域，并且人类IgG4的CH2和CH3域含有突变Y349C、E356D、M358L、T366S、L368A和Y407V。CHA.7.518.1.H4(S241P)轻链可变域融合到人类恒定κ域。对于KIH“开瓶器”形式，使用来自上文的相同CHA.7.518.1重链和轻链构建体，且使其与融合到人类IgG4铰链区并且还含有具有上文所列“杵”突变的CH2和CH3的CPA.9.086的单链可变片段(scFv)配对。重链和轻链的顺序以单链形式(VH-VL或VL-VH)变化以评定对表达和稳定性的影响。对于等容异源二聚化开瓶器形式，评估数种可变域组合(CPA.9.086 scFv与CHA.7.518.1配对，CHA.7.518.1 scFv与CPA.9.086配对，CHA.9.547.18scFv与CHA.7.518.4配对，并且CHA.7.518.4 scFv与CHA.547.18配对)，含有scFv的构建体具有以下在CH2域和CH3域中的取代：F234V L235A G236del S267K S357Q S364K。Fab构建体含有以下取代：N208D E233P F234V L235A G236del S267K Q295E L368D K370S N384DQ418E N421D。并入取代E233P F234V L235A G236del S267K和E233P F234V L235AG236del S267K K370S N384D Q418E N421D以减少Fc受体结合。
CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086双特异性抗体的表达：将这些构建体中的每一者的DNA克隆到pcDNA3.4表达载体(赛默飞世尔(ThermoFisher))中以产生四种独立载体。为了表达双特异性抗体，在1μg/ml的最终总浓度下，将每个构建体的DNA转染到3ml以对数方式生长的Expi293细胞(赛默飞世尔)中。在减小和非减小条件两者中，通过LabChip(珀金埃尔默(Perkin Elmer))毛细管电泳分析不同比率的重链和轻链的表达水平。这允许针对多个条件定性地确定未复合的重链和轻链的相对量。一旦确定最优比率，就进行较大规模生产，并且纯化所表达的双特异性抗体。
CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086双特异性抗体：使用亲和纯化和尺寸排阻色谱纯化抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。
用蛋白A进行亲和力纯化：对上清液进行蛋白A亲和色谱法(ProA)以从细胞培养物上清液纯化双特异性抗体(BsAb)。通过每1000mL上清液添加20mL的1M磷酸钠pH 7.4(天惠华(Teknova))和100mL的5M NaCl(天惠华)，接着添加0.22μm过滤来制备上清液用于色谱。在具有用20mM磷酸钠(pH 7.4)、0.6M NaCl(天惠华)平衡的5mL HiTrap柱MabSelect SuRe(通用电气医疗集团(GE Healthcare))的AKTA Pure(通用电气医疗集团)上进行分离。以1.25mL/min装载上清液。上样后，柱在5mL/min下用平衡缓冲液洗涤10CV。洗脱分两个步骤进行。步骤一具有20mM柠檬酸钠(pH 3.6)、150mM NaCl(天惠华)并且步骤2具有100mM甘氨酸(pH 2.7)、150mM NaCl(天惠华)。用5mL/min的4.3CV进行两次洗脱，将12mL洗脱份收集到预填充有2.25mL 1M Tris pH 7.5(天惠华)的试管中。使用NanoDrop(赛默)通过吸光度分析洗脱份在280nm下的蛋白质浓度和通过分析型HPLC-SEC分析其单体含量。
单体和高分子量(HMW)组分的分离：对Pro A纯化双特异性抗体进行制备尺寸排阻色谱(SEC)以将单体与HMW分离。通过0.22μm过滤制备BsAb用于SEC色谱。对运行PBS的等度梯度(pH 7.3)的AKTA Pure(通用电气医疗集团)进行分离。BsAb装载到以2.6mL/min的Superdex 200pg 26/600柱(通用电气医疗集团)上。洗脱在1柱体积(CV)的PBS下以2.6mL/min进行。在空隙体积之后收集洗脱份。正如预期的，HMW在单体之前洗脱。在HPLC-SEC上运行峰洗脱份以测定单体对HMW百分比，并且通过在280nm下的吸光度测定浓度。单独地合并含有单体和HMW的洗脱份。
SEC-HPLC分析：使用Acquity UPLC(沃特斯(Waters))系统进行分析，并且将蛋白BEH SEC、200A、1.7μm、4.6mm×150mm、10K-450K(沃特斯)用作SEC柱。使用由PBS(pH 7.4(天惠华))组成的流动相，在环境温度下均匀地进行SEC分离。流速为0.25mL min-1。通过计算在280nm下由紫外线(UV)检测器检测到的峰面积来定量BiSpAb单体、聚集物和片段的相对量。
人类TIGIT和人类PVRIG结合到双特异性抗体的SPR分析：所有实验使用在22℃下的ProteOn XPR 36仪器进行，而在分析期间样品保持在4℃下。首先，使用标准胺偶联，用固定在GLC芯片(伯乐公司(Bio Rad))上的所有垂直捕获通道和水平中间点上的山羊抗人类Fc多克隆抗体(赛默飞世尔)制备高密度捕获表面。每个通道的多克隆抗体的典型固定水平为约4600RU。从北京义翘神州生物科技有限公司(Sino Biological)获得人类TIGIT-HIS单体，而在室内制备人类PVRIG-HIS。双特异性抗体在运行缓冲液中稀释到约1μg/ml，将其1×PBST与经过滤BSA一起添加直到100μg/ml的最终浓度。对于ProteOn仪器上的每一“单次动力学”循环，在两个独特垂直捕获通道上捕获不同抗体两分钟。在将ProteOn的缓冲液流切换成水平方向后，捕获表面稳定约15-20分钟。在单独捕获循环期间，将六种浓度的3倍稀释系列的人类TIGIT(362pM-88nM)或人类PVRIG(460pM-112nM)注射2分钟，接着以100μl/min的流速进行15分钟解离。在捕获的双特异性抗体的两个独立表面上注射每一浓度系列抗原的三个复本，以及用于双重参考的若干缓冲注射循环。在具有146mM磷酸的两个30秒脉冲的各循环之间再生抗人类抗体表面。使用Scrubber的ProteOn版本处理在所捕获的双特异性抗体上注射的TIGIT和PVRIG的传感器图，并且拟合到1∶1动力学结合模型，包括用于质量传递的项。
对人类TIGIT和人类PVRIG同时结合到双特异性抗体的SPR夹心分析：在22℃下，使用Biacore 3000(通用电气医疗集团)进行实验。使用标准胺偶联，人类TIGIT(义翘神州生物科技有限公司)在介于800RU到1000RU范围内的RU水平下共价固定到CM5 Biacore芯片的所有四个流道。将双特异性抗体以25nM的分子浓度、25μl/min流速在一个流动细胞上方注射持续3分钟。然后，在与双特异性抗体复合的TIGIT流动细胞上和在不具有结合双特异性抗体的对照TIGIT表面上，同时以116nM的浓度、25μl/min的流速注射人类PVRIG持续三分钟。使用Scrubber 2.0软件减去对照TIGIT表面以处理所得传感器图。
双接合ELISA：为了制备用于分析双特异性抗体结合的ELISA板，将板在4℃下用100μl含1μL/mL PVRIG-hFc的PBS涂布过夜。第二天，丢弃涂布溶液，并且用250μL 2％BSA、0.1％Tween 20阻断板2小时。用300μL 1×PBS pH 7.4、0.05％Tween20(洗涤缓冲液)洗涤孔3X。在300RPM下振荡，在1×PBS pH7.4、0.1％Tween20、0.2％BSA(结合缓冲液)中，将样品以3倍增量从1μg/mL连续稀释到1.4pg/mL并且在室温下培育1小时。作为对照，类似地制备和评估CHA.7.518.1.H4(S241P)(PVRIG特异性抗体)和CPA.9.086(TIGIT特异性抗体)作为双特异性样品。如上所述洗涤各孔并且通过添加100μL 1μg/mL TIGIT-His评定结合TIGIT的能力(北京义翘神州生物科技有限公司，目录号10917-H08H)。为了评定对照抗体结合，将100μL的1μg/mL的PVRIG-His(Compugen，批次20170623)添加到CHA.7.518.1.H4(S241P)孔中，且将100μl的1μg/mL TIGIT-His添加到CPA.9.086孔。与可溶性配体一起在室温下以300RPM摇动培育1小时。如上洗涤孔，且接着可溶配体结合通过在结合缓冲液中添加100μl1μg/ml抗His-Tag抗体HRP结合物(安迪生物公司，目录号#MAB050H，克隆#AD1.1.10来检测，且在室温下培育，以300RPM震荡1小时。用上述洗涤缓冲液将孔洗涤3次，并加入100μL室温的Ultra-TMB底物(莫斯公司(Moss Inc.))。显影7分钟，并通过添加100μL 2N H2SO4终止反应。在Molecular Devices SpectraMax 340PC-384板读取器上以450nM的波长读取所述板。
为了评定双特异性抗体的TIGIT捕获和可溶性PVRIG结合，进行与上文所使用的类似的分析。在此情况下，在4℃下，将100μL/孔的含1μg/ml TIGIT-Fc融合蛋白之1×PBSpH7.4涂布过夜。丢弃涂布溶液，并且孔在室温下用1×PBS pH 7.4、2％BSA和0.1％Tween20阻断2小时。上文所使用的双特异性和单特异性对照在与对于PVRIG捕获实验的范围相同的范围内连续稀释。实验的其余部分与以上相同，不同之处在于使用PVRIG-His来检测除使用TIGIT-His的CPA.9.086以外的所有样品。
人类CMV特异性CD8+ T细胞扩增：解冻人类CMV反应性周边血液单核细胞(CTL)，在2×106个细胞/毫升下再悬浮，并且在补充有2ng/ml重组人类IL2(安迪生物公司)和10ng/ml重组人类IL-7(安迪生物公司)以及在37℃下5％CO2的完整RPMI培养基中用1μg/ml CMVpp65肽(阿娜斯派公司(Anaspec))刺激。6天后，将细胞1∶2分离并且用低剂量人类IL-2(100IU/ml)静置。在第八天，收集细胞，并且在完全RPMI培养基中以2百万/毫升再接种于低剂量IL-2(100U/ml)中两天。在第十一天，细胞表型化成CD8+ T细胞纯度和CMV pp65(495-503)反应性。
细胞用以下染色：抗CD3(克隆：OKT3)-别藻蓝蛋白七(APC-Cy7；百进生技(Biolegend))、抗CD8(克隆：H1T8a)-Alexa荧光剂(AF)488(百进生技)、抗CD14(克隆：HCD14)-多甲藻素叶绿素蛋白质(PerCP-Cy5.5)的组合混合液、抗CD19(克隆：HIBCD14)PerCP-Cy5.5、抗CD56(克隆：HCD56)-PerCP-Cy5.5(百进生技)、抗TIGIT(克隆：MBSA43)-别藻蓝蛋白(APC；e-生命科学)或IgG4(Compugen)-同型对照(APC：百进生技)、CHA.7.518.1.H4(S241P)-AF-647(Compugen)或IgG4-AF647同种型对照(Compugen)和抗PD-1(克隆：EH12.2H7)-亮紫421(BV421：百进生技)或IgG1(克隆：MOPC21)BV421(百进生技)。为了评定四聚体反应性CD8+ T细胞的频率，将PBMC用iTAg四聚体-HLA-A*02：01CMVpp65(495-503)(NLVPMVATV)-藻红蛋白(MBL-BION)在室温下染色30分钟。用PBS/1％BSA/0.01％叠氮化钠缓冲液洗涤细胞，使用Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)获取数据并且使用FlowJo(Treestar)分析。
用pp65-表达黑素瘤细胞系进行的人类CMV特异性CD8+ T细胞共培养分析：利用用人类CMV特异性CD8+ T细胞的活体外共培养分析来评定单克隆抗体(mAb)对PVRIG或TIGIT的作用以及双特异性抗体(BsAb)对PVRIG和TIGIT对抗原特异性细胞因子分泌的作用。共培养测定中使用的靶细胞是修饰的Mel-624细胞系(ATCC)，Mel-624 pp65。这个细胞系通过异位表达CMV蛋白pp65而产生。这产生来源于pp65的肽的HLA-A2呈现，而不需要添加外源性pp65肽。进行与Mel-624 pp65癌细胞系共培养的CMV pp65反应性CD8 T细胞上的抑制性受体阻断的剂量依赖性滴定。以靶细胞(75,000)与T细胞(15,000)5∶1比率，使开始于132nM且结束于0.001nM的10点、4倍稀释系列的抗体与Mel624 pp65细胞和CMV+CD8+ T细胞共同培养。将T细胞、肿瘤细胞系和抗体一起添加于96孔U形培养盘(科斯塔(Costar))中，且在37℃下培育18小时。测试了以下抗体：靶向PVRIG和TIGIT两者以及人类IgG4同型对照的抗PVRIG(CHA.7.518.1.H4(S241P))、抗TIGIT(CPA.9.086)、CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086的组合、双特异性抗体(CHA.7.518.1.H4(S241P)或CHA.7.518.4/CPA.9.086或CHA.9.547.18BsAb)。在18小时培育时段之后，通过流式细胞测量术使用细胞测量术(BD)测量共培养物上清液中的人类干扰素γ(IFN-γ)的量。通过非线性回归分析数据，并且使用格拉夫帕德棱镜(GraphPad Prism)拟合到“一个位点特异性结合”或“一个位点-总的和非特异性结合”模型。
差示扫描荧光测定：熔融温度提供抗体稳定性的测量。分析双特异性和对照单特异性抗体的熔融温度变性和疏水性染料SYPRO橙(赛默)的结合。抗体在具有SYPRO橙的所需缓冲液中稀释到适当浓度。StepOne Plus RT-PCR仪器(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))用于进行受控熔体(25C-95C，1度/分钟匀变)并且以1分钟间隔检测SYPRO橙的荧光。在pH6.0和pH7.4下分析抗体以确保所提供的效果不归因于配制品。
LC-MS分析：由美国加利福尼亚州贝尔蒙特(Belmont)的LakePharma公司进行质谱分析。在酶促去糖基化之后，在偶联到毛细管UHPLC系统的Agilent Q Exactive Orbitrap(赛默飞世尔科技)上分析样品。在未减少和减少条件下进行蛋白质表征的完整分析并且沃特斯MassLynx软件用于分析结果。
冷冻/解冻稳定性分析：通过在1×PBS中调节浓度到1.0mg/mL pH 7.4，通过稀释或使用旋转集中器来制备样品。将100μl放到0.2ml snapstrip PCR管中，并且在80℃下冷冻至少24小时，然后在室温下解冻。此循环重复两次冷冻和解冻的3遍循环。通过SEC-UPLC分析20μl各样品的单体、高分子量(HMW)和低分子量(LMW)物种。样品还在CE-SDS(还原和非还原，Lab芯片GXII，珀金埃尔默)中运行并且在离心之后评定浓度以去除任何沉淀的蛋白质。
低pH保持：通过稀释或使用旋转集中器在1×PBS pH 7.4中将浓度调节到1.0mg/mL来制备样品。通过添加0.1M甘氨酸pH3.2将每个样品的pH调节到pH3.0，并且在室温下培育0、1、2、4和24小时。样品用1M Tris pH7.5中和，并且通过CE-SDS(还原和非还原，Lab芯片GXII，珀金埃尔默)、SEC-UPLC分析和在离心之后通过NanoDrop在280nm下对吸光度的分析，以去除任何沉淀的蛋白质。
结果
双特异性抗体序列：使用两种不同Fc异源二聚形式和两种可变域显示形式产生抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。每个片段的序列展示于图26、图40和图41中。
SPR动力分析：图27展示(A)TIGIT和(B)PVRIG结合到所捕获的双特异性抗体的传感图数据在两个独立表面上，且数据全局拟合到简单1∶1动力学模型。因为对于动力学模型没有足够的解离信号衰变来充分估计TIGIT双特异性抗体相互作用的解离速率，因此kd值在1.0e-5秒-1下任意地保持恒定，以便拟合数据。因此，来自图27中的TIGIT双特异性抗体相互作用的亲和力和速率常数应仅被视为粗略估计。如使用SPR所测量的TIGIT双特异性抗体相互作用的结合常数在1.0e-5秒-1下保持恒定，为ka＝3.9e6 M-1秒-1并且KD＝2.6pM。估计用于PVRIG双特异性抗体相互作用的结合常数为ka＝1.3e6 M-1秒-1，kd＝2.4e-4秒-1，并且KD＝187pM。
SPR夹心分析：图28展示在具有固定的人类TIGIT的Biacore芯片上在注射人类PVRIG(B)之前注射的双特异性抗体(A)的连续注射传感图，因此展示双特异性抗体同时结合人类TIGIT和人类PVRIG两者的能力。与TIGIT表面结合的双特异性抗体的反应水平为约1100RU。与预复合到TIGIT表面的双特异性抗体结合的人类PVRIG的反应水平为约230RU。
CMVpp65反应性T细胞表达PVRIG、TIGIT和PD-1：对CMV蛋白，pp65具有特异性的CD8+ T细胞已经充分表征，并且这些CMV特异性T细胞可以用于研究调节受体对T细胞的作用。如通过四聚体染色确定，使用CMV pp65肽、IL-2和IL-7刺激HLA-A2+供体PBMC引起CMV pp65特异性T细胞强烈扩增到纯度为90-95％。图29A展示扩增后来自两个供体的CMV pp65特异性T细胞的百分比。从这些供体评定PVRIG、TIGIT和PD-1对T细胞的表面表达。在活化的第十一天，CMV pp65特异性T细胞表达PVRIG gMFI比率(MFIr，定义为靶抗体的MFI除以对照抗体的MFI)：3-5倍、TIGIT MFIr：4倍)和PD-1MFIr：1-2倍(图29B)。
抗人类PVRIG和TIGIT抗体单独或与人类CMV特异性T细胞组合增加IFN-γ分泌：根据诱导与T细胞功能障碍相关的CD8+ T细胞上的TIGIT和PVRIG表达的基本原理，我们旨在评估PVRIG和TIGIT阻断对促炎性细胞因子产生的能力的作用。用Mel-624(PVR+PVRL2+)pp65细胞共培养来自2名供体的CMV反应性T细胞(供体4和供体72)。评定CMV+CD8+ T细胞上的CHA.7.518.1.H4(S241P)、CPA.9.086、CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086以及CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb的活性。我们观察到，相比于IgG对照抗体，CHA.7.518.1.H4(S241P)IFN-γ产量增加(32-46％)。添加CPA.9.086抗体引起IFN-y(55-86％)的进一步增加。当组合时，CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086协同治疗，或在一些情况下，与CHA.7.518.1.H4(S241P)或CPA.9.086单一阻断(99-189％)相比，额外地增加CD8+ T细胞的细胞因子产生。CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb呈现与组合CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.0862 mAbs(100-191％)相同的功能作用。各抗体中的IFN-γ分泌比相应同型对照抗体的增加百分比展示于图30中。
还观察到，CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb显示由CMV pp65特定T细胞产生的IFN-γ的剂量依赖性增加，其与CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086 mAbs(图31)的组合相当。在供体4和72两者中，CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb以及CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086的组合的平均+SEM IFN-γ产生EC50值类似且计算为个位数较低nM范围内。在供体4中，对于CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086的组合，ECs0计算为0.38nM，而CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb EC50计算为0.36nM。在供体72中，对于CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086的组合，EC50计算为0.58nM，而CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086BsAb EC50计算为0.53nM(图31)。
双接合ELISA：评定双特异性和单特异性抗体同时结合涂布抗原且接着结合第二可溶配体的能力。图49展示在通过生物素标记的TIGIT-His蛋白和抗生蛋白链菌素-HRP结合进行的检测下，双特异性抗体和单特异性抗体的3倍连续稀释液与PVRIG涂布的板的结合。类似地，图50展示双特异性和单特异性抗体的3倍连续稀释液与重组TIGIT-His涂布的板的结合，并且通过生物素标记的PVRIG和抗生蛋白链菌素HRP结合的检测。所有双特异性形式能够同时与两个配体接合。亲和力的明显变化归因于溶液中正确装配的抗体的相对量。图51展示使用SoftMax Pro软件(分子仪器公司(Molecular Devices))计算EC50，并且针对如通过LC-MS测定和在图45中所示的正确装配的双特异性抗体对所述数值进行校正。
差示扫描荧光测定：分析双特异性和单特异性抗体的熔融温度变性和疏水性染料SYPRO橙(赛默)的结合。在pH6.0和pH7.4下分析抗体以确保所提供的效果不归因于配制品。反映CH2域溶解的Tml对于所有双特异性抗体在pH7.4下在51.7C到60.4C的范围内并且在pH6.0下在50.9C到60.5C的范围内(图52)。单特异性抗体都展现较高的Tml，在pH7.4下63.3C到66.2C，在pH6.0下62.4C到64.1C。所有抗体的Tm2(CH3和Fab熔融)＞70C(范围＝在pH7.4下为70.2C-77.1C，在pH6.0下为70.9C到77.1C)。
LC-MS分析：对所有三种形式的双特异性抗体进行去糖基化完整质谱分析。利用杵臼Fc的异源二聚化策略和CrossMab策略产生32％和73％正确装配的双特异性抗体，而通过不同Fc异源二聚方法(分别杵臼和等容异源二聚化)，两种含有scFv的“开瓶器”形式产生≥95％正确装配的双特异性抗体，所述scFv含有臂和完整抗体臂(图45)。
低pH保持：双特异性和单特异性对照抗体在pH3下培育0、1、2、4和24小时，且使用LabChip GXII(珀金埃尔默)和SEC-UPLC通过CE-SDS评定聚集物或较低分子量产物的形成，如通过相对于T＝0的单体含量％改变所观察到的。所有双特异性和单特异性抗体对此应力稳定，展示在24小时时间过程中单体含量的至多6％变化。
冷冻/解冻稳定性分析：利用各种轻链限制和异源二聚化方法评定双特异性和对照单特异性抗体耐受连续解冻循环的能力。在三个冷冻和解冻循环之后，通过SEC-UPLC分析抗体的存在于溶液中的低分子量(LMW)、单体和高分子量物质的变化。正值表示在冷冻/解冻循环之后所报告的物质的相对比例的增加。双特异性抗体BsAb-14为唯一展示单体含量相对于T＝0降低>5％的样品(图53)。在此应力之后所有其它形式都是稳定的。CMV分析剂量反应
在针对图30所描述的CMV分析中测试双特异性、单特异性和单特异性抗体的组合的给药反应。进行每一抗体或混合物的连续三倍稀释以提供一系列从66nM到0.003nM的抗体浓度。单特异性抗体在连续稀释之前与非特异性对照抗体混合1∶1。所测试的双特异性抗体为BsAb 2(KIH+CrossMab)、BsAb 4(KIH开瓶器)、BsAb 14和BsAb 18(均为IH开瓶器)。还评定CHA.7.518.1和CHA.7.518.4与CPA.9.086的组合。双特异性抗体都至少同等于所测试的所有形式的抗体的组合进行，并且优于在两种独立分析中测试的所有三种供体T细胞中的单特异性抗体(图54)。
概述和结论
单独或以组合形式添加CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086，以及CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb到Mel-624 pp65分析引起相比于IgG对照抗体，IFN-y分泌的剂量依赖性增加。当组合时，CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086协同，或在供体72的情况下，与单独单一阻断相比，额外增加CD8+ T细胞的细胞因子产生。CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086 BsAb呈现与CHA.7.518.1.H4(S241P)/CPA.9.086mAbs的组合相同的功能作用，其中两种供体EC50值计算为在个位数较低nM范围内的值。综合来看，这些数据表明单独或以组合形式或以双特异性抗体形式的CHA.7.518.1.H4(S241P)和CPA.9.086抗体可增强T细胞效应功能。
实例2：ELISA测定
PVRIG涂布板
为了制备用于分析双特异性抗体结合的ELISA板，将板在4℃下用100μl含1μL/mLPVRIG-hFc的PBS涂布过夜。第二天，丢弃涂布溶液，并且用250μL2％BSA、0.1％Tween 20阻断板2小时。用300μL 1×PBS pH 7.4、0.05％Tween20(洗涤缓冲液)洗涤孔3X。在300RPM下振荡，在1×PBS pH7.4、0.1％Tween20、0.2％BSA(结合缓冲液)中，将样品以3倍增量从1μg/mL连续稀释到1.4pg/mL并且在室温下培育1小时。作为对照，类似地制备CHA.7.518.1 H4(PVRIG特异性抗体)和CPA.9.086 H4(TIGIT特异性抗体)并作为双特异性样品评估。如上所述洗涤各孔并且通过添加100μL 1μg/mL TIGIT-His评定结合TIGIT的能力(北京义翘神州生物科技有限公司，目录号10917-H08H)。为了评定对照抗体结合，将100μL 1μg/mL PVRIG-His(Compugen，批次20170623)添加到CHA.7.518.1 H4孔中，且将100μL 1μg/mL TIGIT-His添加到CPA.9.086 H4孔中。与可溶性配体一起在室温下以300RPM摇动培育1小时。如上洗涤孔，且接着可溶配体结合通过在结合缓冲液中添加100μl 1μg/ml抗His-Tag抗体HRP结合物(安迪生物公司，目录号#MAB050H，克隆#AD1.1.10)来检测，且在室温下培育，以300RPM震荡1小时。用上述洗涤缓冲液将孔洗涤3次，并加入100μL室温的Ultra-TMB底物(莫斯公司)。显影7分钟，并通过添加100μL 2N H2SO4终止反应。在Molecular Devices SpectraMax 340PC-384板读取器上以450nM的波长读取所述板。
为了评定双特异性抗体的TIGIT捕获和可溶性PVRIG结合，进行与上文所使用的类似的分析。在此情况下，在4℃下，将100μL/孔的含1μg/ml TIGIT-Fc融合蛋白之1×PBSpH7.4涂布过夜。丢弃涂布溶液，并且孔在室温下用1×PBS pH 7.4、2％BSA和0.1％Tween20阻断2小时。上文所使用的双特异性和单特异性对照在与对于PVRIG捕获实验的范围相同的范围内连续稀释。实验的其余部分与以上相同，不同之处在于使用PVRIG-His来检测除使用TIGIT-His的CPA.9.086 H4以外的所有样品。
提供上述实例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的组合物、系统和方法的实施例的完整公开和描述，而不是旨在限制发明人认为是其发明的范围。对于本领域技术人员而言显而易见，用于执行本公开的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中所提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。
使用所有标题和章节命名仅仅是出于清楚和参考的目的，并且不应当被视为以任何方式进行限制。例如，本领域的技术人员将认识到根据本文所描述的本发明的精神和范围，适当地组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。
本文中所引用的所有参考文献在此通过引用以其整体并入本文中，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地或单独地被指示出于所有目的以其整体通过引用并入。
在不脱离本技术的精神和范围的情况下，可以对本申请进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文描述的具体实施例和实例仅通过举例的方式提供，并且本申请仅受所附权利要求的条款以及权利要求有权获得的等效物的全部范围的限制。

Claims (80)

1.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其单价结合人类PVRIG并且单价结合TIGIT以用于活化T细胞和/或NK细胞，从而治疗癌症。
2.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
b)第一抗原结合部分，其包含：
iii.第一重链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
iv.第一轻链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3；
其中所述抗PVRIG抗体选自由以下组成的组：CHA.7.518.4、CHA.7.518.1、CHA.7.518、CHA.7.524CHA.7.530、CHA.7.538_1、CHA.7.538_2、CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CHA7.538.1.2、CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049、CPA.7.050和CHA.7.518；和
b)第二抗原结合部分，其包含抗TIGIT抗原结合域。
3.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)第一抗原结合部分，其包含抗PVRIG抗原结合域；和
d)第二抗原结合部分，其包含：
iii.第二重链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
iv.第二轻链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3；
其中所述抗TIGIT抗体选自由以下组成的组：CPA.9.086、CHA.9.547.18、CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7和CHA.9.541.8。
4.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)第一抗原结合部分，其包含：
iii.第一重链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
iv.第一轻链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的v1CDR1、vlCDR2和vlCDR3
其中所述抗PVRIG抗体选自由以下组成的组：CHA.7.518.4、CHA.7.518.1、CHA.7.518、CHA.7.524、CHA.7.530、CHA.7.538_1、CHA.7.538_2、CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CHA7.538.1.2、CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049和CPA.7.050CHA.7.518；和
d)第二抗原结合部分，其包含：
iii.第二重链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
iv.第二轻链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vlCDR1、vlCDR2和v1CDR3；
其中所述抗TIGIT抗体选自由以下组成的组：CPA.9.086、CHA.9.547.18、CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.086、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7和CHA.9.541.8。
5.根据权利要求4所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中第一抗原结合部分包含：
iii.第一重链，其包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3；和
iv.第一轻链，其包含VL-CL，其中所述CL为κ或λ抗体的恒定域。
6.根据权利要求5所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述第一重链CH3包含氨基酸取代S354C、E356D、M358L和T366W。
7.根据权利要求5所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述CL为κ。
8.根据权利要求4所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述第二抗原结合部分包含：
iii.第二重链，其包含HC-CL-铰链-CH2-CH3，其中所述CL是κ或λ；和
iv.第二轻链，其包含VL-CH1。
9.根据权利要求8所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述第二重链CH3包含氨基酸取代Y349C、E356D、M358L、T366S、L368A和Y407V。
10.根据权利要求8所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述CL为λ。
11.根据权利要求8所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述CL为κ。
12.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
e)第一抗原结合部分，其包含抗PVRIG抗原结合域；和
f)第二抗TIGIT抗原结合部分，其包含：
iii.第二重链可变区，其包含CPA.9.086 VH(EVQLVETGGGLIQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSS；SEQ ID NO：1634)；和
iv.第二轻链可变区，其包含CPA.9.086 VL(QSALTQPRSASGNPGQRVTISCSGSSSNMGRRPVNWYQQIPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLTISGLQSEDEAEYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLAVL；SEQ ID NO：1639)。
13.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
g)第一抗原结合部分，其包含抗PVRIG抗原结合域；和
h)第二抗TIGIT抗原结合部分，其包含：
iii.第二重链可变区，其包含CPA.9.547.18 VH(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS YIMSWVRQAPGKGLEWVATISGGSKGQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWLLSYYAMD YWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1664)；和
iv.第二轻链可变区，其包含CPA.9.547.18 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSMAIWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASKSHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQSYPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1668)。
14.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.1 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1539)；和
ii.第一轻链，其包含CHA.7.518.1 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQ IDNO：1544)；和
d)第二抗原结合部分，其包含抗TIGIT抗原结合域。
15.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.4 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：3179)；和
ii.第一轻链，其包含CHA.7.518.4 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQ IDNO：3180)；和
d)第二抗原结合部分，其包含抗TIGIT抗原结合域。
16.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.1 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1539)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CHA.7.518.1(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQID NO：1544)；和
d)包含抗TIGIT结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CPA.9.086 VH(EVQLVETGGGLIQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSS；SEQ ID NO：1634)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CPA.9.086 VL(QSAL.TQPRSASGNPGQRVTISCSGSSSNMGRRPVNWYQQIPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLTISGLQSEDEAEYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLAVL；SEQ ID NO：1639)。
17.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.4 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：3179)；和
ii.第一轻链，其包含CHA.7.518.4 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQ IDNO：3180)；和
d)包含抗TIGIT结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含：
i.第一重链可变区，其包含CPA.9.086 VH(EVQLVETGGGLIQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGEVKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPLPLHYYGMDVWGQGTTVTVSS；SEQ ID NO：1634)；
ii.第一轻链可变区，其包含CPA.9.086 VL(QSALTQPRSASGNPGQRVTISCSGSSSNMGR肿VNWYQQIPGTAPKLLIYSQNQRPSGVPDRFSGSQSGTSASLTISGLQSEDEAEYFCAVWDDIGRVLQLGGGTQLAVL；SEQ ID NO：1639)。
18.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.1(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1539)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CHA.7.518.1 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1544)；和
d)包含抗TIGIT结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含：
i.第一重链可变区，其包含CHA.9.547.18 HC(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVATISGGSKGQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWLLSYYAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：1664)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CHA.9.547.18 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSMAIWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASKSHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQSYPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1668)。
19.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)包含抗PVRIG结合域的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含
i.第一重链可变区，其包含CHA.7.518.4 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSS；SEQ ID NO：3179)；和
ii.第一轻链，其包含CHA.7.518.4 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIK；SEQ IDNO：3180)；和
d)包含抗TIGIT结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含：
i.第一重链可变区，其包含CHA.9.547.18 HC(EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVATISGGSKGQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWLLSYYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1664)；和
ii.第一轻链可变区，其包含CHA.9.547.18 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSMAIWLSWYQQKPGKAPKLLIYKASKSHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQSYPYTFGQGTKLEIK；SEQ ID NO：1668)。
20.根据权利要求1到19和37到38中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体为人源化抗体。
21.一种组合物，其包含根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。
22.一种核酸组合物，其包含：
e)第一核酸，其编码根据权利要求1到20中任一项所述的第一重链或重链可变域；
f)第二核酸，其编码根据权利要求1到20中任一项所述的第一轻链或轻链可变域；
g)第三核酸，其编码根据权利要求1到20中任一项所述的第二重链或重链可变域；和
h)第四核酸，其编码根据权利要求1到20中任一项所述的第二轻链或轻链可变域。
23.一种表达载体组合物，其包含：
e)第一表达载体，其包含根据权利要求22所述的第一核酸；
f)第二表达载体，其包含根据权利要求22所述的第二核酸；
g)第三表达载体，其包含根据权利要求22所述的第三核酸；和
h)第四表达载体，其包含根据权利要求22所述的第四核酸。
24.一种表达载体组合物，其包含：
c)第一表达载体，其包含根据权利要求22所述的第一和第二核酸；以及
d)第二表达载体，其包含根据权利要求22所述的第三和第四核酸。
25.一种宿主细胞，其包含根据权利要求23或权利要求24所述的表达载体组合物。
26.一种制成抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的方法，其包含：
c)在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求25所述的宿主细胞；和
d)回收所述抗体。
27.一种活化患者T细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述患者的所述T细胞的子集被活化。
28.一种活化患者的细胞毒性T细胞(CTL)的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述患者的所述CTL的子集被活化。
29.一种活化患者NK细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述患者的所述NK细胞的子集被活化。
30.一种活化患者γδT细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述患者的所述γδT细胞的子集被活化。
31.一种活化患者Th1细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其中所述患者的所述Th1细胞的子集被活化。
32.一种减少或消除患者至少一种调节性T细胞(Treg)的细胞数目和/或活性的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。
33.一种增加患者的干扰素γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体。
34.一种治疗患者癌症的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT抗体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌(Merkel Cells cancer)、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
37.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)包含抗PVRIG抗原结合部分的第一抗原结合部分，所述第一抗原结合部分包含：
i.第一重链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
ii.第一轻链可变域，其包含来自抗PVRIG抗体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3；
其中所述抗PVRIG抗原结合部分选自由以下组成的组：CPA.7.021、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049、CPA.7.050、CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CHA.7.518.1；CHA7.538.1.2和CHA.7.518.4；和
d)包含抗TIGIT抗原结合域的第二抗原结合部分，其中所述抗TIGIT抗原结合域来自如图24和41，并且特别是图24A-24EE中所提供的抗体。
38.一种抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体，其包含：
c)第一抗原结合部分，其包含抗PVRIG抗原结合域，其中所述抗PVRIG抗原结合域来自如图35中所提供的抗体；和
d)包含抗TIGIT抗原结合域的第二抗原结合部分，所述第二抗原结合部分包含：
iii.第二重链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3；和
iv.第二轻链可变域，其包含来自抗TIGIT抗体的v1CDR1、vlCDR2和v1CDR3；
其中所述抗TIGIT抗原结合域选自由以下组成的组：CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.086、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7、CHA.9.541.8和CHA.9.547.18。
39.一种抗PVRIG抗体，包含：
i)重链或重链可变域，其包含来自以下序列的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3：
Figure FDA0002922546320000131
和
ii)轻链或轻链可变域，其包含来自以下序列的vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3：
Figure FDA0002922546320000132
40.一种抗TIGIT抗体，其包含：
i)重链或重链可变域，其包含来自以下序列的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3：
Figure FDA0002922546320000141
和
ii)轻链或轻链可变域，其包含来自以下序列的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3：
Figure FDA0002922546320000142
41.根据权利要求38所述的抗PVRIG抗体，其包含：
c)重链，其包含CHA.7.518.4 VH(QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNINWVRQAPGQGLEWMGYIYPYIGGSGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDKTARNAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；SEQ ID NO：3175)；和
d)轻链，其包含CHA.7.518.4 VL(DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSENIYDVLAWYQQKPGKAPKLLIYEATNLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；SEQ ID NO：3362)。
42.一种组合物，其包含根据权利要求38或权利要求40所述的抗PVRIG抗体。
43.一种核酸组合物，其包含：
i)第一核酸，其编码根据权利要求38或权利要求40所述的重链或重链可变域；和
ii)第二核酸，其编码根据权利要求38或权利要求40所述的轻链或轻链可变域。
44.一种组合物，其包含根据权利要求39所述的抗TIGIT抗体。
45.一种核酸组合物，其包含：
i)第一核酸，其编码根据权利要求38所述的重链或重链可变域；和
ii)第二核酸，其编码根据权利要求38所述的轻链或轻链可变域。
46.一种表达载体组合物，其包含：
i)第一表达载体，其包含根据权利要求41所述的第一核酸；和
ii)第二表达载体，其包含根据权利要求41所述的第二核酸。
47.一种表达载体，其包含：
i)根据权利要求41所述的第一核酸；和
ii)根据权利要求41所述的第二核酸。
48.一种表达载体组合物，其包含：
i)第一表达载体，其包含根据权利要求43所述的第一核酸；和
ii)第二表达载体，其包含根据权利要求43所述的第二核酸。
49.一种表达载体，其包含：
i)根据权利要求43所述的第一核酸；和
ii)根据权利要求43所述的第二核酸。
50.一种宿主细胞，其包含根据权利要求44到47中任一项所述的表达载体或载体组合物。
51.一种制成抗PVRIG或抗TIGIT抗体的方法，其包含：
i)在表达所述抗体的条件下培养根据权利要求48所述的宿主细胞；和
ii)回收所述抗体。
52.一种活化患者T细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述T细胞的子集被活化。
53.一种活化患者的细胞毒性T细胞(CTL)的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述CTL的子集被活化。
54.一种活化患者NK细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述NK细胞的子集被活化。
55.一种活化患者γδT细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述γδT细胞的子集被活化。
56.一种活化患者Th1细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述Th1细胞的子集被活化。
57.一种减少或消除患者至少一种调节性T细胞(Treg)的细胞数目和/或活性的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
58.一种增加患者的干扰素γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
59.一种治疗患者癌症的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
62.一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含根据权利要求1到20中任一项所述的抗PVRIG/抗TIGIT双特异性抗体的组合疗法。
63.一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含根据权利要求38所述的抗PVRIG抗体和抗PD-1抗体的组合疗法。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述抗PD-1抗体为选自由帕博利珠单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)组成的组的抗体。
65.一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含根据权利要求39所述的抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体的组合疗法。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述抗PD-1抗体为选自由帕博利珠单抗和纳武单抗组成的组的抗体。
67.一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含根据权利要求39所述的抗TIGIT抗体和根据权利要求38所述的抗PVRIG抗体的组合疗法。
68.一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含根据权利要求39所述的抗TIGIT抗体、抗PVRIG抗体和抗PD-1抗体的三联组合疗法。
69.一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含抗TIGIT、根据权利要求38所述的抗PVRIG抗体和抗PD-1抗体的三联组合疗法。
70.一种治疗患者癌症的方法，其包含施用包含根据权利要求39所述的抗TIGIT抗体、根据权利要求38所述的抗PVRIG抗体和抗PD-1抗体的三联组合疗法。
71.根据权利要求64到69中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体为选自由帕博利珠单抗和纳武单抗组成的组的抗体。
72.一种活化患者T细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述T细胞的子集被活化。
73.一种活化患者的细胞毒性T细胞(CTL)的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述CTL的子集被活化。
74.一种活化患者γδT细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述γδT细胞的子集被活化。
75.一种活化患者Th1细胞的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体，其中所述患者的所述Th1细胞的子集被活化。
76.一种减少或消除患者至少一种调节性T细胞(Treg)的细胞数目和/或活性的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
77.一种增加患者的干扰素γ产生和/或促炎性细胞因子分泌的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
78.一种治疗患者癌症的方法，其包含向所述患者施用根据权利要求38到40中任一项所述的抗PVRIG或抗TIGIT抗体。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、肝癌(HCC)、结肠直肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胰脏癌、胃(stomach/gastric)癌、子宫颈癌、头颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、泌尿道上皮癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌(鳞状和基底细胞癌)、神经胶质瘤、肾癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、间皮瘤、食道癌、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合征(MDS)。
80.根据权利要求77所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：三阴性乳腺癌、胃(stomach/gastric)癌、肺癌(小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、默克尔细胞癌、高MSI癌、KRAS突变型肿瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓发育不良综合症(MDS)。
CN201980050598.6A 2018-06-01 2019-05-31 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和使用方法 Pending CN113039202A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862679703P 2018-06-01 2018-06-01
US62/679,703 2018-06-01
US201862773586P 2018-11-30 2018-11-30
US62/773,586 2018-11-30
PCT/US2019/035062 WO2019232484A1 (en) 2018-06-01 2019-05-31 Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113039202A true CN113039202A (zh) 2021-06-25

Family

ID=67003669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980050598.6A Pending CN113039202A (zh) 2018-06-01 2019-05-31 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和使用方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20190382477A1 (zh)
EP (1) EP3802605A1 (zh)
JP (1) JP2021525087A (zh)
KR (1) KR20210016448A (zh)
CN (1) CN113039202A (zh)
AU (1) AU2019276578A1 (zh)
BR (1) BR112020024249A2 (zh)
CA (1) CA3101019A1 (zh)
CL (1) CL2020003127A1 (zh)
CO (1) CO2020016619A2 (zh)
IL (1) IL279053A (zh)
MX (1) MX2020012797A (zh)
SG (1) SG11202011461TA (zh)
WO (1) WO2019232484A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114057867A (zh) * 2021-12-14 2022-02-18 河南联科物联网科技有限公司 一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用
WO2023006040A1 (zh) * 2021-07-30 2023-02-02 江苏先声药业有限公司 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和应用
WO2023040935A1 (zh) * 2021-09-15 2023-03-23 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种含抗pvrig/tigit双特异性抗体的药物组合物
WO2023040945A1 (zh) * 2021-09-15 2023-03-23 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合pd-1的蛋白及其医药用途
WO2023186081A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗tigit-抗pvrig双特异性抗体、其药物组合物及用途
WO2023186063A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗pvrig抗体、其药物组合物及用途
WO2023236980A1 (zh) * 2022-06-08 2023-12-14 山东先声生物制药有限公司 一种pvrig/tigit双特异性抗体药物组合物及其用途

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022514702A (ja) 2018-12-21 2022-02-14 オーエスイー・イミュノセラピューティクス 二機能性抗ｐｄ－１／ｉｌ－７分子
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
AU2020406083A1 (en) 2019-12-17 2022-06-16 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant
EP4119162A4 (en) * 2020-03-13 2023-08-23 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. PVRIG-BINDING PROTEIN AND ITS MEDICAL USES
CA3176497A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Fatima MECHTA-GRIGORIOU Antxr1 as a biomarker of immunosuppressive fibroblast populations and its use for predicting response to immunotherapy
WO2021257124A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Genentech, Inc. Treatment with anti-tigit antibodies and pd-1 axis binding antagonists
TW202216778A (zh) 2020-07-15 2022-05-01 美商安進公司 Ｔｉｇｉｔ及ｃｄ１１２ｒ阻斷
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
US20240076373A1 (en) * 2021-01-28 2024-03-07 Compugen Ltd. Combination therapy with anti-pvrig antibodies formulations and anti-pd-1 antibodies
EP4284516A1 (en) * 2021-01-28 2023-12-06 Compugen Ltd. Anti-pvrig antibodies formulations and uses thereof
KR20230144596A (ko) * 2021-02-09 2023-10-16 상하이 준스 바이오사이언스 컴퍼니 리미티드 항 cd112r 항체 및 그의 용도
CA3206413A1 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Pinchas TSUKERMAN Antibodies against cd112r and uses thereof
IL307419A (en) 2021-04-09 2023-12-01 Ose Immunotherapeutics A new scaffold for bifunctional molecules with improved properties
EP4320156A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
WO2022258049A1 (en) * 2021-06-10 2022-12-15 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric pvrig
WO2023010094A2 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140056890A1 (en) * 2012-06-06 2014-02-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Binding Agents That Modulate the Hippo Pathway and Uses Thereof
US20160244521A1 (en) * 2015-02-19 2016-08-25 Compugen, Ltd. Anti-pvrig antibodies and methods of use
WO2018017864A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig-binding agents and uses thereof
WO2018033798A1 (en) * 2016-08-17 2018-02-22 Compugen Ltd. Anti-tigit antibodies, anti-pvrig antibodies and combinations thereof

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0915987A2 (en) 1997-04-21 1999-05-19 Donlar Corporation POLY-($g(a)-L-ASPARTIC ACID), POLY-($g(a)-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
WO2003073238A2 (en) 2002-02-27 2003-09-04 California Institute Of Technology Computational method for designing enzymes for incorporation of amino acid analogs into proteins
JPWO2003085107A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
WO2005035727A2 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Ambrx, Inc. Polymer derivatives
AU2005211385B2 (en) 2004-02-02 2008-12-11 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone polypeptides and their uses
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
PL2975051T3 (pl) 2009-06-26 2021-09-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Wyizolowane z łatwością dwuswoiste przeciwciała o formacie natywnej immunoglobuliny
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SG184427A1 (en) 2010-04-20 2012-11-29 Genmab As Heterodimeric antibody fc-containing proteins and methods for production thereof
JP6167040B2 (ja) 2010-11-05 2017-07-19 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
EA201791693A1 (ru) 2011-03-25 2018-05-31 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гетеродимерные иммуноглобулины
NZ630551A (en) 2012-04-20 2017-11-24 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
CN110981964B (zh) 2013-01-14 2023-09-15 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
EP3936521A1 (en) 2013-03-15 2022-01-12 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
PL3021869T3 (pl) 2013-07-16 2020-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Sposoby leczenia nowotworu z użyciem antagonistów wiązania osi PD-1 i inhibitorów TIGIT
KR102497443B1 (ko) 2014-03-28 2023-02-08 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
JO3664B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme أجسام مضادة لـ tigit
MA40662B1 (fr) 2014-12-23 2020-12-31 Bristol Myers Squibb Co Anticorps contre tigit
CA2997179A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 The Regents Of The Unversity Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for modulating t-cell mediated immune response
AU2016331052B2 (en) 2015-10-01 2023-08-03 Potenza Therapeutics, Inc. Anti-TIGIT antigen-binding proteins and methods of use thereof
MX2018010485A (es) 2016-03-04 2019-01-10 Jn Biosciences Llc Anticuerpos para inmunoreceptor de celulas t con dominios de ig e itim (tigit).
RU2022104399A (ru) 2016-06-14 2022-05-05 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
WO2018045110A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2018220446A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Compugen Ltd. Triple combination antibody therapies

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140056890A1 (en) * 2012-06-06 2014-02-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Binding Agents That Modulate the Hippo Pathway and Uses Thereof
US20160244521A1 (en) * 2015-02-19 2016-08-25 Compugen, Ltd. Anti-pvrig antibodies and methods of use
CN107580500A (zh) * 2015-02-19 2018-01-12 康姆普根有限公司 抗pvrig抗体和使用方法
WO2018017864A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig-binding agents and uses thereof
WO2018033798A1 (en) * 2016-08-17 2018-02-22 Compugen Ltd. Anti-tigit antibodies, anti-pvrig antibodies and combinations thereof

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023006040A1 (zh) * 2021-07-30 2023-02-02 江苏先声药业有限公司 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和应用
WO2023040935A1 (zh) * 2021-09-15 2023-03-23 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种含抗pvrig/tigit双特异性抗体的药物组合物
WO2023040945A1 (zh) * 2021-09-15 2023-03-23 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合pd-1的蛋白及其医药用途
CN114057867A (zh) * 2021-12-14 2022-02-18 河南联科物联网科技有限公司 一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用
CN114057867B (zh) * 2021-12-14 2023-05-12 河南联科物联网科技有限公司 一种抗减蛋综合征的单克隆抗体及其应用
WO2023186081A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗tigit-抗pvrig双特异性抗体、其药物组合物及用途
WO2023186063A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗pvrig抗体、其药物组合物及用途
WO2023236980A1 (zh) * 2022-06-08 2023-12-14 山东先声生物制药有限公司 一种pvrig/tigit双特异性抗体药物组合物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
SG11202011461TA (en) 2020-12-30
IL279053A (en) 2021-01-31
CO2020016619A2 (es) 2021-01-18
AU2019276578A1 (en) 2021-01-14
JP2021525087A (ja) 2021-09-24
WO2019232484A1 (en) 2019-12-05
EP3802605A1 (en) 2021-04-14
KR20210016448A (ko) 2021-02-15
BR112020024249A2 (pt) 2021-03-02
CL2020003127A1 (es) 2021-10-29
CA3101019A1 (en) 2019-12-05
WO2019232484A9 (en) 2021-05-06
US20190382477A1 (en) 2019-12-19
MX2020012797A (es) 2021-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190382477A1 (en) Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and methods of use
US11701424B2 (en) Anti-TIGIT antibodies, anti-PVRIG antibodies and combinations thereof
JP6982643B2 (ja) Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
US11603405B2 (en) Anti-CD3 antibodies and uses thereof
JP2023051968A (ja) 多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質
CN112512581A (zh) 针对cldn18.2和cd3的抗体构建体
KR20180021786A (ko) Lag-3-결합 분자 및 그 사용 방법
CN111787949A (zh) 变体cd3-结合结构域及其在用于治疗疾病的组合疗法中的用途
JP2022111148A (ja) 共刺激受容体およびチェックポイント受容体に連結する二重特異性免疫調節抗体
CN116368154A (zh) 三特异性结合剂
CN115515980A (zh) C19 c38双特异性抗体
EA040773B1 (ru) Анти-tigit антитела, анти-pvrig антитела и их комбинации

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination