CN114364794A

CN114364794A - 葡糖脑苷脂酶突变体

Info

Publication number: CN114364794A
Application number: CN202080063357.8A
Authority: CN
Inventors: 约尔格·本兹; 马丁·埃贝林; 拉维·姚高希亚; 尼娜·玛丽昂·普法勒; 拉尔夫·托马
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2019-09-09
Filing date: 2020-09-07
Publication date: 2022-04-15
Also published as: JP2022547297A; EP4028048A1; WO2021048034A1; US20220325265A1

Abstract

本发明提供了人β‑葡糖脑苷脂酶蛋白质的变体。

Description

葡糖脑苷脂酶突变体

葡糖脑苷脂酶(EC 3.2.1.45)也称为酸β-葡糖苷酶/β-葡糖神经酰胺酶或简称GCase/GBA1，被归入水解酶一类，指示其将天然存在的葡糖鞘脂类(包括葡糖神经酰胺(GlcCer；也称为葡萄糖脑苷脂)或葡糖鞘氨醇(GlcSph))分别转化为葡萄糖和神经酰胺/鞘氨醇的能力(Brady等人，1965)。葡糖脑苷脂酶是一种溶酶体腔膜相关的水解酶，与糖脂相互作用。相关葡糖神经酰胺酶β(GBA)基因的遗传性常染色体隐性突变导致活动缺陷和戈谢病(GD)的临床表现(Beutler和Grabowski，1994)。自从发现导致GD的GBA突变以来，已经在GD(一般人群中的患病率为1/50000)鉴定出300种不同的突变(Beutler等人，2005；Hruska等人，2008；Charrow等人，2000；Horowitz等人，1998)。

葡糖脑苷脂酶是一种溶酶体酶，负责降解葡糖鞘脂类。当功能紊乱时，底物的积累在组织巨噬细胞(戈谢细胞)和其他相关细胞中诱导炎症应答变化(Kornhaber等人，2008；Schetz和Shankar，2004；Smith等人，2017)。戈谢细胞连同脑中的单核吞噬细胞和神经元细胞是最突出的病理标志，它们参与GD的病理(Beutler和Grabowski，2001)。PhilippeGaucher于1882年首次描述了该疾病的临床特性(Gaucher，1882)，如今它被报道为最常见的溶酶体贮积症(Grabowski，2008)。该疾病的症状尤其表现为贫血、肝脏和脾脏肿大、骨病变以及严重情况下的神经系统表现，被广泛地分为三种临床亚型(Beutler等人，1994；Kornhaber等人，2008)。最常见的形式被归类为I型戈谢病，其几乎没有神经元病影响，目前可以使用酶替代疗法(ERT)进行治疗。II型和III型是更严重的GD类型，其中II型具有急性神经元病表型，在接近出生时表现出症状，并且在婴儿早期发生进展直至造成死亡。III型导致慢性重度神经病症状，包括学习障碍、心脏畸形和肌强直性癫痫(Beutler等人，1994；Sidransky等人，2007；Sidransky和Lopez，2012)。

已鉴定出与GD的进展直接相关的300种突变，这些突变导致该疾病的广泛的病理性特征(Alfonso等人，2007；Grabowski和Horowitz，1997)。GBA基因中遗传性错义和无义突变可导致葡糖脑苷脂酶的错误折叠、错误运输和不稳定。文献中发现的两个最常见的突变是突变N370S和L444P，占所有已知GBA突变的50％。携带突变GCase变体N370S的患者通常被诊断为I型GD，具有各种症状。N370S负责保留并且稳定活性结合袋的适当构象(Lieberman等人，2007)。L444P在携带该GBA基因突变时显示出被归类为II型或III型的更严重的类型，其可能破坏疏水结构，改变结构域II功能(Lieberman等人，2007)。但是，由于存在许多从基因型到表型的变异性，GD上突变的严重程度无法与不同的结构变化直接关联起来。有趣的是，经常在帕金森病(PD)患者中发现杂合突变N370S和更严重的L444P，所研究的L444P GD患者发生PD的风险较高(Sidransky等人，2009)。但是尚不清楚戈谢病患者在何种程度上可能发展为帕金森综合征以及这两种疾病之间的联系(Tayebi等人，2003)。

迄今为止，针对GD的最有效的治疗方法是使用

(伊米苷酶(Imiglucerase)，Genzyme Corp.^TM)的酶替代疗法(ERT)。该分子于1994年获得批准，并且成功治疗了I型GD患者的外周症状(Grabowski，2008；Van Rossum和Holsopple，2016)。Ceredase^TM(Genzyme Corp.^TM)是一种靶向巨噬细胞的糖苷酶，已于1991年获得批准，可大幅降低戈谢细胞内的鞘氨醇水平(Barton等人，1990，1991；Sato和Beutler，1993)。这两种已发布的产品主要通过预防外周中的进行性表现来治疗GD I型患者。除此之外，Shire(Zimran等人，2010)在人类成纤维细胞中生产的

(维拉苷酶(Velaglucerase)，于2010年获得批准)以及Pfier和Protalix(Abrahamov等人，2016)在胡萝卜细胞中生产的

(Taliglucerase Alfa，于2012年获得批准)是针对I型GD患者新开发的两种ERT。

借助酶富集疗法(EET)，患者的GCase缺乏症应通过有助于折叠和稳定蛋白质并且在靶细胞和溶酶体内进行适当运输的小分子伴侣得到恢复。另一种考虑的方法是底物减少疗法(SRT)，其中应通过减慢或破坏糖脂生物合成来降低底物水平(Grabowski，2008；Vunnam和Radin，1980)。在这方面，

(麦格司他(Miglustat)，于2002年获得批准，Oxford GlycoSciences/Actelion)和依利格鲁司他(Eliglustat)(

Sanofi-Genzyme，于2014年获得批准)是两种获得批准的口服葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂，与其用于I型GD疗法的天然底物发生可逆竞争(Butters等人，2000)。

一种有趣的研究途径是寻找具有增强功能性的更稳定的GCase分子，这些分子在体外比在体内可能更有效。已见诸报道的几种稳定的突变体是Amicus Therapeutics(本文中简称为Amicus)的hGCase突变体K321N和K321N/H145L(Hung，2015；专利号：US 8 962564)。这两种突变均被引入R495H_CHO序列的顶部，该序列在位置495处(R->H)携带突变。基于与牛GCase(普通牛(B.taurus))的序列比对，单个突变体K321N在α6-螺旋内的位置321处携带额外的修饰，将赖氨酸(K)替换为天冬酰胺(N)。基于与普通牛(B.taurus)和家猪(S.scrofa)的序列比对，双突变体K321N/H145L在K321N序列的顶部具有额外的取代，位置145处的组氨酸(H)被亮氨酸(L)替换，表明在β-折叠与α2-螺旋之间经过修饰(Hung，2015)。

本发明的目的是提供具有增强功能性的GCase变体，这些变体在体外比在体内可能更有效。

本发明提供了一种重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质，其中该蛋白质包含相对于Seq.Id.No.1的至少一个取代，并且其中所述取代选自由以下项组成的组：I5N、F31Y、L34Q、M53T和P55T以及它们的组合。

在一个特定实施方案中，重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质包含相对于Seq.Id.No.1的至少两个取代，其中所述两个取代为M53T和P55T。

在一个特定实施方案中，重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质包含选自由Seq.Id.No.4至7组成的组的氨基酸序列。

在一个特定实施方案中，重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质包含Seq.Id.No.7所示的氨基酸序列。

在第二方面，本发明提供了一种分离的核酸，该分离的核酸编码本发明的重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质。

在第三方面，本发明提供了一种载体，该载体包含本发明的核酸序列。

在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含本发明的载体。

在另一方面，本发明提供了一种药物制剂，该药物制剂包含本发明的重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质。

在另一方面，本发明涉及本发明的重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质，其用作药物。

在一个特定实施方案中，本发明涉及本发明的重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质，其用于治疗神经退行性疾病，特别是戈谢病和帕金森氏病。

在另一方面，本发明提供了一种缀合物，该缀合物包含本发明的人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质以及血脑屏障穿梭体，并且提供了此类缀合物用于治疗神经退行性疾病(特别是戈谢病和帕金森氏病)的用途。

附图说明

图1：nanoDSF测量的原始数据图(图的上部)和一阶导数峰值(下部)。(A)参考R495H_S2、K321N、K321N/H145L和R495H_CHO的原始数据和一阶导数图。(B)I5N、F31Y、L34Q和M53T/P55T的原始数据图和一阶导数图。样品浓度：0.06-0.5mg/ml，温度梯度：3℃/min，激发功率：20-80％。

图2：在水浴中于55℃孵育hGCase突变体后测得的残余GCase活性。深灰色条：孵育时间5min；浅灰色条：孵育时间10min。所计算的作为初始GCase活性(100％；加热前)的百分比的残余活性。所用的蛋白质浓度：50nM。水平线表示R495H的残余活性。

图3：针对hGCase参考R495H_CHO(A)、R495H_S2(B)、Amicus单突变体K321N(C)和变体M53T/P55T(D)所评估的pH曲线。测试的缓冲剂：20mM柠檬酸盐缓冲剂(pH 3.5-5)、20mM MES缓冲剂(pH 6-6.5)、20mM HEPES缓冲剂(pH 7-8)。将每个数据集的最高活性归一化至100％。

图4：(A)和(B)使用可逆抑制剂IFG确定的IC50。(C)和(D)使用不可逆抑制剂CBE确定的IC50。(A、C)hGCase突变体M53T/P55T的IC50，(B、D)所有测试的变体的IC50。IFG浓度范围：0.02-100μM；CBE浓度范围：0.04-2500μM。蛋白质浓度：分别为25nM；在活性测量之前，将酶与抑制剂在RT预孵育10min。

图5：代表性突变体M53T/P55T的动力学参数KM和Vmax的确定结果。(A)随孵育时间增加而测得的原始信号数据(进展曲线)，以RFU表示。(B)Michaelis-Menten拟合结果。使用第2.3.5节中所述的活性测定进行测量。Res-β-glc浓度范围：4-500μM。(B)中的曲线拟合以及通过GraphPad Prism7得到的最终计算结果(Michealis-Menten非线性拟合遵循方程4)。¹最初测得的GCase活性(25mM)，以RFU表示。²加入磷脂酰丝氨酸(4μM)后活化。

图6：对测试的hGCase突变体的初始活性(未添加脂质)(浅灰色条)相对于加入磷脂酰丝氨酸后的活化(深灰色条)作图。磷脂酰丝氨酸浓度4μM，蛋白质浓度：25nM。脂质+酶的预孵育：在RT 10min。¹最初测得的GCase活性(25mM)，以RFU表示。²加入磷脂酰丝氨酸(4μM)后活化。

图7：hGCase突变体的磷脂酰丝氨酸活化，以初始活性的倍数增加表示。磷脂酰丝氨酸浓度：4μM，蛋白质浓度：25nM。脂质+酶的预孵育：在RT 10min。水平线表示平均R495H活化水平。

图8：活性水平归一化至使用hGCase分子处理H4胶质母细胞瘤GBA-KO细胞后测得的hGCase蛋白水平。处理浓度(hGCase蛋白)：分别为1、10和100nM(100nM在本文中未显示)。孵育2h后的活性和蛋白质含量测量结果。用人工底物res-β-glc(20μM)测得的活性；通过AlphaLISA得到的蛋白质浓度确定结果(第2.3.6节)。将H4wt细胞(GCase水平归一化至100％)和H4 GBA-KO细胞(缺失GBA基因)用作对照。¹在H4细胞中测得的GCase活性归一化至在H4(wt)细胞中测得的活性(指定为100％)并且归一化至蛋白质含量。²包含敲除的GBA基因的H4胶质母细胞瘤细胞。

图9：用hGCase分子处理H4胶质母细胞瘤GBA-KO细胞后天然底物GlcSph的减少。处理浓度(hGCase蛋白)：分别为1、10和100nM。通过LC/MS分析孵育48h后的底物水平。将H4wt细胞(GCase水平归一化至100％)和H4 GBA-KO细胞(缺失GBA基因)用作对照。¹测量的葡糖鞘氨醇(GlcSph)水平归一化至总蛋白含量。²包含敲除的GBA基因的H4胶质母细胞瘤细胞。

图10：用hGCase分子处理H4胶质母细胞瘤GBA-KO细胞后天然底物GlcSph的减少。图9的重新绘制数据，包含GBA-KO H4细胞经过1nM和10nM蛋白质处理后的结果的直接比较。¹测量的葡糖鞘氨醇(GlcSph)水平归一化至总蛋白含量。²n.s＝不显著；³包含敲除的GBA基因的H4胶质母细胞瘤细胞。

图11：针对每个单独的GCase突变体显示的编译的蜘蛛网图，用于绘制最终性能特征。11A：GCase突变体I5N；11B：GCase突变体F31Y；11C：GCase突变体K321N、K321N/H145L；11A：GCase突变体L34Q；11A：GCase突变体M53T+P55T；

具体实施方式

除非另外指明，否则重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白质特性相对于具有Seq.Id.No.1所示的氨基酸序列的重组人β-葡糖脑苷脂酶蛋白所述。具有Seq.Id.No.1所示的氨基酸序列的β-葡糖脑苷脂酶蛋白质相对于野生型β-葡糖脑苷脂酶蛋白质在位置495处携带R到H的突变，即位置495处的精氨酸被组氨酸替换。在本文中，“GCase”是用于β-葡糖脑苷脂酶的缩写。所有氨基酸编号相对于Seq.Id.No.1而言。因此，位置145将是Seq.Id.No.1中存在的第145个氨基酸。此外，如本文所公开的变体，即重组β-葡糖脑苷脂酶蛋白质，还包括其功能片段或衍生物。

“血脑屏障”或“BBB”是指外周循环与脑和脊髓(即CNS)之间的生理屏障，其由脑毛细血管内皮细胞质膜内的紧密连接形成，构成限制分子(即使是非常小的分子，诸如尿素(60道尔顿))向脑内运输的紧密屏障。脑内的血脑屏障、脊髓内的血-脊髓屏障和视网膜内的血-视网膜屏障是CNS内连续的毛细血管屏障，在本文中统称为“血脑屏障”或“BBB”。BBB还包括血-CSF屏障(脉络丛)，其中屏障由室管膜细胞而不是毛细血管内皮细胞组成。

如本文所用，“血脑屏障穿梭体”是指能够将偶联/连接至血脑屏障穿梭体的货物分子穿过BBB转运的分子。合适的血脑屏障穿梭体为例如与BBB上表达的受体诸如转铁蛋白受体结合的抗体或抗体片段。示例性血脑屏障穿梭体为抗转铁蛋白受体抗体，诸如在WO2014/033074和WO 2012/075037中所公开。在一个特定实施方案中，血脑屏障穿梭体为针对人转铁蛋白受体的Fab抗体片段或scFab抗体片段，优选交叉Fab抗体片段。示例性交叉Fab片段描述于WO 2009/080251、WO 2009/080252和MABS 2016第8卷第6期第1010-1020页中。

“缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于血脑屏障穿梭体)缀合的本发明的GCase蛋白。

可使用多种化学接头进行缀合。例如，本发明的GCase蛋白与血脑屏障穿梭体可使用多种双功能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)进行缀合。接头可以是便于在递送至脑后释放效应子实体的“可裂解接头”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

共价缀合可直接完成，也可通过接头完成。在某些实施方案中，直接缀合是通过构建蛋白质融合(即，通过编码GCase蛋白质的两个基因和血脑屏障穿梭体的基因融合并且作为单一蛋白质表达)的构建。在某些实施方案中，直接缀合是通过在GCase蛋白的两个部分之一的反应基团与血脑屏障穿梭体上的相应基团或受体之间形成共价键。在某些实施方案中，直接缀合是通过修饰(即，遗传修饰)待缀合的两种分子中之一以包括反应性基团(作为非限制性实例，该反应性基团为巯基基团或羧基基团)，该反应性基团在适当条件下与待缀合的另一种分子形成共价连接。作为一个非限制性实例，可将具有所需的反应基团(即半胱氨酸残基)的分子(即氨基酸)引入例如血脑屏障穿梭体以及与GCase蛋白形成的二硫键中。也可以使用多种接头进行缀合。例如，GCase蛋白与血脑屏障穿梭体可使用多种双功能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)进行缀合。也可以使用包含通过肽键连接的1至20个氨基酸的肽接头。在某些此类实施方案中，氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在某些其他此类实施方案中，氨基酸中的一种或多种选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。接头可以是便于在递送至脑后释放效应子实体的“可裂解接头”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等人，CancerRes.52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。

“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述完整抗体的一部分结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)₂；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，请参见Holliger和Hudson，Nature Biotechnology 23：1126-1136(2005)。

术语“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5′至3′。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi：10.1038/nm.4356或EP2 101 823 B1)。

“分离的”核酸是指已从其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

术语“药物组合物”或“药物配制物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用该药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。

“药用载体”是指药物组合物或配制物中除有效成分之外的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在另一方面，提供了包含本文所提供的重组人β-葡糖脑苷脂酶变体中任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个方面，药物组合物包含本文所提供的重组人β-葡糖脑苷脂酶变体中的任一者，以及药用载体。在另一方面，药物组合物包含本文所提供的重组人β-葡糖脑苷脂酶变体中的任一者，以及至少一种另外的治疗剂。

本文所述的重组人β-葡糖脑苷脂酶变体的药物组合物通过将此类具有所需纯度的Gcase变体与一种或多种任选的药用载体混合(Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编(1980))，制成冻干组合物或水溶液的形式。药用载体在所用的剂量和浓度下对受治疗者一般无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用载体进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(

Halozyme，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公布号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种附加的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)混合。

本文的药物组合物还可以含有多于一种对于所治疗的特定适应症必需的活性成分，优选地是具有不会对彼此造成不利影响的互补活性的那些活性成分。

活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；包埋在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或包埋在粗乳液中。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980)中。

可以制备用于缓释的药物组合物。缓释制备物的合适实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半透性基质，这些基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。

用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。

本文提供的任何Gcase变体可用于治疗方法。

在另一方面，本发明提供了一种治疗神经退行性疾病(特别是戈谢病和帕金森氏病)的方法。在一个方面，该方法包含向患有此类神经退行性疾病的个体施用有效量的如本文所述的重组人β-葡糖脑苷脂酶变体。根据上述方面中的任一方面的“个体”可以是人。

材料与方法

表达系统和表达质粒

将表达载体pExpreS2_1-A用于所有hGCase变体，以在S2细胞系统(Schneider S2果蝇细胞系)中表达基因。该表达系统基于黑腹果蝇的昆虫细胞系。该表达为组成型表达，因此无需诱导剂。利用Zeocin作为形成稳定细胞系的选择剂(1.5mg/ml)。相应质粒的基本基因型为pExpreS2_1-A-BIP-hGCase(1-497，X，R495H)-GS-Sor-8xHis，其中X被下表(表1)中列出的各建议突变取代。因此，His8标签通过甘氨酸-丝氨酸接头(GS)与序列偶联，包括分选酶识别位点(Sor)。下表概述了已确定的hGCase及其在本申请中使用的缩写以及它们的生化特性。

表1：具有相关生化特性的hGCase突变体。

¹R495H_S2基于

序列(R495H)，但在S2细胞而非CHO细胞中产生。列出的所有其他构建体均基于

序列，仅在S2细胞中产生

²计算包括BIP(S2细胞蛋白分泌)信号序列的分子量和消光系数

微生物学方法

以下章节介绍了表达在本文中产生和表征的hGCase变体的微生物学方法。S2细胞系统中蛋白质的培养和表达主要由Daniela H ü gin(SMR，Lead Discovery；见第2.7节)实施。

瞬时转染

制备所有提出的突变体以用于Schneider S2细胞中的瞬时转染(Schetz和Shankar，2004)。将基因型为pExpreS2_1-A-BIP-hGCase(1-497，X，R495H)-GS-Sor-8xHis(X＝提出的不同hGCase变体的修饰；表2.4)的质粒瞬时转移至S2细胞中并且首先表达，而不整合到S2基因组中。缩写“1-A”表示串联体，指示一个DNA序列的多个拷贝。“BIP”为昆虫S2细胞的蛋白质分泌信号肽。通过甘氨酸-丝氨酸接头(GS)，将分选酶识别序列连接至多组氨酸标签，其包括融合至蛋白质的C端的8个组氨酸残基(His8标签)。细胞在ExCell420培养基(Sigma-Aldrich)中制备并且生长过夜，细胞数为66.9×10⁶个细胞/ml，并且测量的细胞活力为99％。使用Climo-Shaker ISF1-X培养箱(Kuhner)，在暗处培养所有培养物。初始培养体积为20ml。在27℃、120rpm、50mm振摇半径并且排除CO₂和湿度的条件下孵育过夜后，将细胞在培养基(ExCell420)中稀释至6.0×10⁶个细胞/ml(细胞活力为99％)。将转染试剂ExpreS2 TR5x(Invitrogen)在培养基中预稀释(将15μl转染试剂用1ml培养基预稀释)并且涡旋1-2s。将质粒DNA(5μg)加入混合物中。将溶液再次涡旋并且储存于RT。平行地，将制得的S2细胞培养物进一步稀释至细胞密度为4.0×10⁶个细胞/ml。将1ml制得的S2培养物移液到每个制备的DNA-TR5x混合物中。将溶液轻轻混合，并且在27℃、120rpm、50mm振摇半径、排除CO₂和湿度的条件下孵育72h。

多克隆细胞系

瞬时转染后，将DNA细胞溶液在27℃孵育72h后，将1.2ml原始培养物替换为包含1.5mg/ml Zeocin(最终浓度)的培养基。Zeocin是一种广谱糖肽抗生素，对大多数细菌、真菌、植物、酵母和动物细胞有效。通过选择具有Zeocin抗性的细胞，可以选择靶基因完全整合到宿主细胞基因组中的细胞。当整合时，基因被复制，因此将由于细胞分裂而得到表达和传代。总共完成22天的选择，每3-4天进行一次培养基更换(将1.2ml培养基替换为包含1.5mg/ml Zeocin的ExCell420培养基)。选择后，培养工作体积为30ml的稳定细胞系。

用于hGCase突变体筛选的小规模培养(工作体积30ml)

针对各构建体制备小规模培养物(30ml)。作为参考，R495H_S2和Amicus突变体K321N也经过新鲜培养，以保持相同的条件，以在进一步的实验中进行更好的比较。对于30ml培养物，将具有相关构建体的培养细胞作为接种培养物。确定细胞数，并且将其稀释至接种浓度5×10⁶个细胞/ml。将细胞在27℃、120rpm、振摇半径为50mm、不添加CO₂并且排除湿度的条件下培养。细胞大致每周分开两次，导致总培养时间为72-96h。对于首次突变筛选(见第3.1.1节)，分别取1-2ml各变体培养物并且储存于-20℃以供进一步使用(最终细胞密度：50-60×10⁶个细胞/ml，细胞活力：约98％)。

选定hGCase突变体的中试规模培养(工作体积5L)

在选定突变体的中试规模培养中，制备了5×1L培养物。将各种hGCase变体的30ml预培养物稀释至细胞数为5×10⁶个细胞/ml，并且传代至培养体积为100-300ml。达到足够高的细胞密度后，将5×10⁶个细胞/ml进一步转移至1L的最终工作体积。针对各构建体，接种5×1L后，将培养物在27℃、90rpm和50mm半径下培养96h，然后收获。在排除CO₂和湿度的条件下，在暗处进行培养。96h后，通过在4℃以4000×g离心(Avanti JXN-26离心机，配备转子JS-5.3，Beckman Coulter)20min来收获细胞。弃去细胞沉淀；将上清液转移至1L细胞培养瓶中，并且在-80℃冷冻直至用于纯化。

培养后检查蛋白质表达

进行了蛋白质印迹分析，以测试瞬时转染后以及建立稳定细胞系后的蛋白质表达(由Daniela H ü gin(SMR)完成，数据未显示)。利用抗-His 6/9 HRPO抗体(内部生产)作为识别与蛋白质序列的C端融合的His8标签的检测抗体(数据未显示)。为检查最终中试规模培养物中的hGCase表达，如第2.3.4节所述进行SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。在分析中，将0.6μg总蛋白(按照Bradford法确定，第2.3.2节)加载至每个孔中用于SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。此外，测量培养样品的活性以确认表达(第2.3.5节)。

蛋白质生物化学方法

以下章节涵盖所有已被用于鉴定、纯化和最终表征hGCase变体的蛋白质生物化学方法。

一般生化特性的确定

使用Web界面SAWI(Sequence Analysis Web Interface，Bioinformatics，Hoffmann-La Roche)，通过插入蛋白质的相关基因序列来确定某些一般生化特性，例如分子量(MW)、等电点(IP)和消光系数(E 1％)。

按照Bradford法确定可溶性蛋白质含量

为不仅测量细胞培养样品中而且测量纯化样品中的总体蛋白质含量，使用标准Bradford测定法(Bradford，1976)。借助Bradford测定法，由于最大吸收偏移至λ＝660nm，因此可以检测可溶性蛋白质。这是由于添加的基于考马斯的染料(考马斯亮蓝G-250；Pierce^TM 660nm蛋白检测试剂)在酸性环境中与蛋白质的阳离子共价侧链发生络合。在λ＝660nm处增加的信号与蛋白质含量直接相关，可通过分光光度法检测。该测定按照供应商(PierceTM 660nm蛋白质测定，Thermo Scientific，美国)提供的说明进行。向10μl样品中加入150μl Pierce^TM 660nm蛋白检测试剂，并且在RT和温和振摇条件下，于暗处孵育5min。使用SpectraMax i3酶标仪(Molecular Devices)在λ＝660nm的波长下进行检测。利用软件SoftMax Pro 6.4进行可视化和评估。利用白蛋白标准品(Thermo Scientific，美国)作为参考蛋白质(标准曲线见附录I，图I.1)。所有测量至少一式三份进行。

通过NanoDrop确定蛋白质浓度

使用NanoDrop确定纯化样品的蛋白质浓度。其局限性在于仅适用于纯蛋白质。如第2.3.1节所述确定消光系数(E 1％)。在这项工作中，使用NanoDrop2000分光光度计(Thermo Scientific)，包括软件NanoDrop2000/2000c。在测量时，施加2μl蛋白质样品。利用相关溶液缓冲剂作为空白。计算出的260/280nm比率应在约0.5的范围内，以确保高蛋白质纯度。

SDS-PAGE和蛋白质印迹

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳通常用于分离蛋白质并且通过分离以进一步确定其分子量。在样品制备时，将LDS样品缓冲剂(4x)(Invitrogen)、还原剂(10x)(Invitrogen)和蛋白质样品(按照Bradford法确定的5μg总蛋白)混合并且在95℃变性5min。将10μl样品以及标记物加载至各孔中(约0.6μg总蛋白)。在这项工作中，将NuPAGETM4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)与5％(v/v)MOPS/DPBS运行缓冲剂配合使用(表2.3)。向凝胶室(Novex Mini-cell；BioRad Criterion^TM 电泳槽)施加200V恒定电压进行电泳。利用

Plus2预染色标准品(Invitrogen)作为标记物。利用InstantBlue^TM(考马斯类染色溶液，Expedeon，Ltd.)作为显色溶液，并且利用H2Obidest作为脱色溶液。在凝胶成像时，使用Amersham^TM Imager 600(Amersham Biotech)，包括相关软件。

蛋白质印迹

在通过蛋白质印迹进行评估时，如第2.3.4节所述制备SDS-PAGE凝胶。利用

转印膜组(硝酸纤维素，常规/小型，Invitrogen)作为印迹工具，包括用于印迹的堆叠层。利用iBlot^TM(Invitrogen)作为印迹设备。运行后，将SDS-PAGE凝胶从槽室中轻轻取出并且转移到硝酸纤维素膜上。将Whatman纸用H2Obidest润湿，并且置于凝胶的顶部。除去叠层之间的气泡后，启动印迹设备的程序(P3)并且运行7分钟。将印迹硝酸纤维素膜转移至封闭液I(见表2.7)中并且孵育1h。除去多余封闭液后，将膜在包括抗His 6/9 HRPO抗体(1∶10000；内部生产；表2.7)的封闭液II中再孵育1小时。用DPBS-Tween(0.05％(v/v))缓冲剂洗涤印迹数次后，将检测溶液A(Luminol Enhancer溶液，Amersham)和B(过氧化物溶液，Amersham)以1∶1的比例合并，并且立即分配到膜上。将印迹显色5min，并且利用Amersham^TM Imager600(Amersham Biotech)通过不同的曝光时间进行检测。

使用人工底物确定GCase活性

使用人工底物试卤灵-β-吡喃葡萄糖苷(res-β-glc；Sigma-Aldrich)测量GCase的酶活性(EA)。葡糖脑苷脂酶是一种水解酶(EC3.2.1.45(BRENDA酶数据库))，催化天然存在的葡糖鞘脂类(包括葡萄糖神经酰胺(GlcCer)或葡糖鞘氨醇(GlcSph))分别转化为葡萄糖和神经酰胺/鞘氨醇。

就人工底物res-β-glc(Sigma-Aldrich)而言，GCase识别葡萄糖部分并且将分子代谢为葡萄糖和试卤灵。在分光光度法测定中，试卤灵可在λ＝535nm的波长下被激发，并且发射λ＝595nm的光。

利用res-β-glc标准曲线评估酶活性。将储备液浓度为10mM的底物用DMSO稀释。为绘制底物标准曲线，制备浓度范围为0.1-500μM的res-β-glc并且与高蛋白浓度的参考蛋白(R495H_CHO，100μg/ml)一起孵育60min，以确保底物完全转化。对于每个底物浓度，取孵育8min后λ＝595nm处的发射信号(以RFU＝相对荧光单位表示)绘制最终标准曲线，这是由于在长时间孵育后发生不确定RFU信号下降效应。使用以下二阶多项式(二次)方程拟合标准曲线(GraphPad Prism7)：

y＝b0+b1x+b2x² (1)

使用该标准曲线，可将以RFU表示的给定信号转化为酶活性(EA)。在这项工作中，EA被定义为在1分钟内转化1μmol res-β-glc的确定的酶浓度，并且可按照下式计算：

EAtotal：总酶活性[U]

cres.：已转化的res-β-glc的浓度[μM]

t：孵育时间[min]

F：稀释倍数[-]

V：所测量的样品的总体积[L]

对于包括活性测定在内的所有进一步的GCase表征实验，将底物浓度20μM、孵育时间30-40min和25-100nM范围内的蛋白质浓度设定为最终测定设置，以确保在线性范围内进行测量。测定中的总体DMSO浓度保持为0.5％(v/v)或甚至更低，因为DMSO影响较高浓度下的荧光信号(经过实验测试，数据未显示；由Urban等人，2008确认)。因此，还使用GCase活性缓冲剂+1％(v/v)DMSO进行稀释(表2.9)。在这项工作中，利用酶标仪SpectraMax i3(Molecular Devices)(包括分析软件SoftMax Pro 6.4)进行所有活性测量。所有活性测量运行的程序设置保持相同：动力学运行，测量温度：37℃，PMT增益：高；每次读数灯闪次数：6；读数高度：距板0.73305mm。

使用AlphaLISA定量测定hGCase

AlphaLISA方法是一种确定相关样品中蛋白质含量的简单有效的方法。该方法的优点在于对粗提物测量具有额外的适用性。该原理基于放大化学发光接近测定法，其中供体珠(包被链霉亲和素)和受体珠通过捕获相同分析物的两种缀合抗体(夹心检测)而紧邻。通过在λ＝680nm的波长处激发供体珠，释放的单线态氧在受体珠附近触发级联反应，导致化学发光，其可在λ＝615nm的波长处检测到。将分析物(f.c.：10nM，归一化至R495H_CHO浓度)、生物素化抗体(Ms mAb抗hGCase1/23，内部生产，f.c.：1nM)和抗hGCase受体珠(用MsmAb抗hGCase1/17标记，内部生产，f.c.：20μg/ml)合并，混合，并且在RT和150rpm的条件下于暗处孵育4h。孵育后，加入供体珠(链霉亲和素珠，f.c.：40μg/ml)，并且在RT和150rpm的条件下于暗处再孵育1小时，然后进行检测。所有测量一式三份进行。在所有测量中，利用R495H_CHO(Genzyme Corp.^TM)作为参考蛋白质，从而能够使用AlphaLISA计算蛋白质浓度。使用Paradigm SpectraMax酶标仪(Molecular Devices)进行检测。

hGCase变体的纯化和质量筛选

本章节介绍了在S2细胞中产生的hGCase变体的纯化策略以及随后用于评估和验证纯化后蛋白质质量和数量的方法和方式。在所有纯化步骤中，使用FPLC

Pure(GE Healthcare Bio-Science)，其包括灵活的馏分收集器F9-C(如果没有另外提及)。在所有纯化步骤中，在λ＝280/260nm的检测波长下检测UV信号。选定的突变体经历相同的纯化策略，并且在整个纯化过程中经过同等处理，以确保可比性。在初步工作中完成了Amicus突变体K321N和K321N/H145L和参考R495H_S2的纯化(数据未显示)。利用软件UnicornTM 7.3进行纯化分析和评估。

hGCase变体的纯化策略

捕获步骤：使用伴刀豆球蛋白A(Con A)柱的亲和层析法

将I5N、F31Y、L34Q和M53T/P55T变体的3L培养上清液首先分别通过0.22μm PES膜无菌过滤器(

真空过滤系统，Millipore，Merck)过滤，以去除残留细胞和大颗粒，然后上样至HiTrap Con A 4B柱(1.6cm×2.5cm，GE Healthcare Bio-Sciences；柱体积(CV)：3×5ml＝15ml)。该柱的树脂由与

4B偶联的蛋白质伴刀豆球蛋白A(ConA)组成。伴刀豆球蛋白A代表一种四聚体金属蛋白，其广泛用于糖蛋白、糖脂和多糖纯化，因为金属蛋白为凝集素(碳水化合物结合蛋白)，允许在不同的糖基化模式后进行纯化(GEHealthcare Life Sciences，2019)。用Con A缓冲剂A(20mM TRIS/HCl、0.5M NaCl、1mMMnCl₂、1mM CaCl₂、0.02％(v/v)NaN₃，pH 7.4；表2.6)以5个CV对柱进行平衡，流速为5ml/min。过滤后的上清液以1.8ml/min的流速上样。上样后，用缓冲剂A洗涤柱10个CV(流速：5ml/min)。首先应用15个CV的线性梯度(0-100％缓冲剂B(20mM TRIS/HCl、0.5M NaCl、1mMMnCl₂、1mM CaCl₂、0.02％(v/v)NaN₃+0.5M甲基α-D-吡喃甘露糖苷，pH 7.4；表2.6))，然后以10个CV继续洗脱(100％缓冲剂B)，洗脱并且收集蛋白质(总体积约360-370ml)。将具有最高活性的洗脱级分合并(第2.3.5节)。将Con A纯化过程中每一步的1ml在干冰上速冻并且保留在-80℃以供进一步分析。

第2步：固定化金属螯合亲和层析(IMAC)

在第二个纯化步骤中，使用CV＝5ml的HisTrapTM HP柱(GE Healtcare，1.6×2.5cm)。该柱包含镍-琼脂糖凝胶高性能(HP)亲和树脂，其与蛋白质的His8标签相互作用，从而能够进行特异性和高分离度纯化。该相互作用通过与琼脂糖树脂偶联的螯合基团发生。这些基团进一步预充镍离子，与蛋白质的组氨酸标签相互作用。将使用过的HisTrap HP柱首先用2个CV的IMAC缓冲剂A(50mM HEPES/NaOH、0.5M NaCl、10mM咪唑和0.02％(v/v)NaN₃，pH 7.6；表2.6))进行平衡。平衡后，将蛋白质样品(Con A合并物)以0.2ml/min的流速上样至柱(过夜上样)。随后，使用10个CV的缓冲剂A洗涤柱(流速：5ml/min)。使用5个CV的4％、8％和10％IMAC缓冲剂B(50mM HEPES/HCl 0.5M NaCl、0.5M咪唑和0.02％(v/v)NaN₃，pH 7.6；表2.6)进行分步洗脱，以根据咪唑浓度的增加而洗脱弱结合蛋白质。包括15个CV的最终梯度洗脱和随后的100％缓冲剂B(0.5M咪唑用于5个CV)的连续洗脱步骤，以洗脱靶蛋白和结合性更强的蛋白质。测试峰级分的活性，将具有最高活性的洗脱级分合并(第2.3.5节)。将IMAC纯化过程中每一步的1ml在干冰上速冻并且保留在-80℃以供进一步分析。

第3步：疏水作用层析(HIC)

在疏水作用层析(HIC)的样品制备中，将0.5M KCl加入第二步的IMAC合并物中。在不断搅拌下缓慢加入盐以确保均匀分布，避免在合并物内出现浓度峰值。在这项工作中，自主装填Toyopearl Butyl-M 650 1.1ml HIC柱(Tosoh Bioscience，1.0×1.4cm)，其CV为1.1ml。该树脂包含羟基化甲基丙烯酸聚合物珠，这些珠经丁基配体基团官能化(TosohBioscience LLC，2019)。最初，使用1个CV的HIC缓冲剂A(20mM MES/HCl、0.5M KCl和0.02％(v/v)NaN₃；表2.6)对柱进行平衡。样品以1ml/min的流速上样。上样后，洗涤柱以去除未结合的蛋白质(流速：1ml/min，7个CV)。由于靶蛋白与HIC柱树脂的强相互作用，使用包含80％(v/v)乙二醇的HIC缓冲剂B(表2.6)进行洗脱。在洗脱时，采用线性梯度(15个CV)，然后用10个CV的100％缓冲剂B继续洗脱。测试峰级分的活性，将表现出最高活性和蛋白质含量的洗脱级分合并(第2.3.5节)。用最终缓冲剂(20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6；表2.6)对合并物进行透析。将HIC纯化过程中每一步的1ml在干冰上速冻并且保留在-80℃以供进一步分析。

纯化蛋白质的透析和储存

在最后一步纯化后，用最终缓冲剂对样品进行透析(表2.6)。在透析时，使用

透析盒10000MWCO(Thermo Scientific)。在持续搅拌下于4℃进行过夜透析。为完全更换缓冲剂，建议使用至少200x初始样品体积的透析缓冲剂体积。随后，样品通过由

注射器驱动的过滤装置(Millipore，Merck)过滤，确保无菌条件。出于浓缩的目的，使用

Ultra-15离心过滤器10000NMWL(Millipore，Merck)浓缩器。将样品以3600×g(MegaStar 3.OR，VWR)离心，直至达到所需的体积/浓度。将最终样品等分，在干冰上速冻，并且储存在-80℃直至使用。

利用购得的

(R495H_CHO)作为基准参考

购买市售

(R495H_CHO；伊米苷酶；Genzyme Corp.^TM)，并且用最终缓冲剂(20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0；表2.6)进行初始透析。在这项工作中，缓冲剂更换应确保在CHO中产生的R495H_CHO与在S2中产生的hGCase突变体之间具有更紧密的可比性。然而，分子的生产系统不同，因此仍然无法直接比较。在临床使用中，已采用R495H_CHO作为参考分子。

hGCase变体的表征

在这项工作的背景下，利用几种方法来仔细表征hGCase变体的生化特性。为此，对变体的纯度、产量和酶比活性进行测试(在本文中为spec.EA)。此外，计算作为动力学参数KM、Vmax、kcat和kcat/KM的性能指标，并且使用两种不同的抑制剂(可逆和不可逆)确定IC50值。研究了添加磷脂(在本文中为磷脂酰丝氨酸)对分子的活化能力以及热稳定性。通过进行pH筛选来评估pH最佳值的可能的偏移。利用分析型SEC和沉降速度分析型超速离心(SV-AUC)收集有关分子寡聚状态的信息。最后，测试人H4胶质母细胞瘤细胞的摄取、活性和底物减少，以采用基于细胞的测定设置评估性能。

hGCase突变体的热稳定性

如下文所述，使用两种不同的热应力方法确定热稳定性。

通过nanoDSF测量进行热位移测定

使用Prometheus NT.Plex nanoDSF(NanoTemper Technologies)，通过nanoDSF(差示扫描荧光法)测量进行热位移测定。使用软件PR.ThermoControl启动测量。Prometheus可通过在单次运行中测量热去折叠、化学变性和聚集来精确表征样品(NanoTemper Technologies，2019)。通过逐渐加热样品直至其达到95℃，使蛋白质去折叠。因此，色氨酸残基的化学环境发生变化(由于含水量较高的环境导致蛋白质的固有色氨酸荧光发生变化)，导致荧光发生红移(色氨酸荧光发射偏移)。通过将350/330nm处的荧光比相对于温度作图，可确定熔解温度Tm。计算原始数据的一阶导数，得到峰值曲线，其最大值指示去折叠温度Tm。

在样品制备时，将hGCase突变体的浓度调整为0.5mg/ml。对于变体I5N和R495H_S2，由于蛋白质产量低，因此应用的蛋白质浓度为0.075mg/ml(I5N)和0.06mg/ml(R495H_S2)。在毛细管架(Prometheus NT.Plex毛细管芯片，NanoTemper)的每个毛细管中吸收总体积为15μl的样品，并且将其放入设备中。将激发功率调整为20-80％，具体取决于施加的蛋白质浓度。将逐渐加热的速率设置为3℃/min，直到达到95℃(将20℃设定为起始温度)。一阶导数的评估和计算使用NanoTemper PR.ThermoControl软件进行，最终评估和绘图使用PR.StabilityAnalysis软件进行。

在55℃热灭活

另一种测试突变体热稳定性的方法是在55℃进行不可逆的热灭活(Futami等人，2017；Zale和Klibanov，1986)。作为选择最有希望的候选物的初步筛选，选择该热稳定性测试方法(第3.1.1节)。为此，分别从30ml S2细胞培养物中采集各构建体的上清液样品(第2.2节)。不调整蛋白质浓度。使用PCR板(

96孔带裙边PCR板，4titude Ltd.)，将样品在55℃(PCR循环仪Mastercycler梯度，Eppendorf)下总共孵育40min。在5、7、10、15、20、30和40min后采集样品以用于残余活性测量。如第2.3.5节所述进行活性测定。将加热前每种突变体的初始活性设定为100％。残余活性关于初始活性进行计算。利用GraphPadPrism7的单相衰减拟合法，按照以下方程3拟合数据点：

y＝(y₀-平台)·e^(-k·x)+平台 (3)

其中y0代表衰减的起点(加热前初始活性为100％)，将平台设定为0％(终点；残余活性0％)，k代表等于x轴单位的倒数的速率常数。

在纯化蛋白质的热灭活实验(见第3.3.3节)中，制备最终浓度为50nM的hGCase蛋白样品，用hGCase活性缓冲剂(pH 6.0)将其稀释(表2.9)，并且在水浴(Julabo 5A，Julabo)中于55℃孵育5分钟和10分钟。

hGCase变体的pH筛选

由于酶的结构修饰，进行了pH最佳值筛选以观察新变体的pH谱所可能发生的偏移。因此，使用三种不同的缓冲剂，其涵盖pH 3.5至8的pH范围。筛选时，在使用纯化缓冲剂之后选择缓冲剂物质。因此，制备以下缓冲剂：柠檬酸缓冲剂(20mM，pH 3.5-5)、MES缓冲剂(20mM，pH 6-6.5)和HEPES缓冲剂(20mM，pH 7-8)。用于该测定的最终蛋白质浓度为75nM。如第2.3.5节(表2.11)所述进行活性测定，不同之处在于仅改变缓冲剂。

动力学参数的确定

使用人工底物试卤灵-β-吡喃葡萄糖苷(Sigma-Aldrich)检查动力学参数。确定时，对最终浓度范围为4-500μM的底物进行测试。该测定按照第2.3.5节中的活性测定说明进行。针对每种构建体使用的最终蛋白质浓度为25nM。将孵育时间设定为30min，以确保在线性信号范围内进行测量。根据Michaelis-Menten(Cornish-Bowden，2013；Johnson，2015)评估动力学并且作图。利用GraphPad Prism7，通过该程序所提供的Michaelis-Menten拟合方程计算KM、Vmax。该方程模型如下：

其中：

KM：Michaelis-Menten常数[μM]

Vmax：最大反应速度[μM/min]

KM被定义为反应达到最大速度一半时的底物浓度。因此，用于计算KM的方程如下：

其中：KM：Michaelis-Menten常数[μM]

Vmax：最大反应速度[μM/min]

当所有可用的酶分子在酶-底物复合物(ES)中复合时，达到最大反应速度，简化如下：

酶(E)和底物(S)形成酶-底物复合物(ES)，其中发生酶的催化反应，将底物转化为产物(P)或ES复合物崩解，导致未经修饰的底物和酶释放。速率常数k描述E与S(双分子)的缔合，或描述酶(E)与底物(S)(单分子)的解离/逆反应。由于酶-产物(EP)复合物的形成以及随后崩解为(E)和(P)的过程以高反应速率发生，因此(EP)步骤可以忽略。另外，由于在此类实验中底物浓度通常超过酶浓度，因此与逆反应得到(E)和(S)相比，更有可能形成(ES)并且进一步形成(P)和(E)。因此，基本Michaelis-Menten方程可表示为：

其中：V＝初始反应速度[μM/min]

Vmax：最大反应速度[μM/min]

[S]：底物浓度[μM]

KM：Michaelis-Menten常数[μM]

动力学参数kcat被定义为催化常数，其表示单位时间内(在本文中是每秒)底物到产物的转换数(Eisenthal等人，2007)。kcat可按照下式计算：

其中：

kcat：转换数[min-1]

Vmax：最大反应速度[μM/min]

[E]tot.：总酶浓度[nM]

描述酶催化效率的另一个动力学关键参数是参数kcat/KM，在这项工作中以[μM-1·s-1]衡量(Eisenthal等人，2007)。

hGCase突变体的IC50的确定

使用可逆的竞争性抑制剂异荞麦碱(IFG，内部生产)和不可逆的抑制剂环己烯四醇(Conduritol)-β-环氧化物(CBE，Sigma-Aldrich)测试对hGCase的抑制。

使用异荞麦碱(IFG)抑制hGCase

IFG是一种竞争性、可逆的hGCase抑制剂，与酶的活性袋相互作用(Powe等，2006)。

为计算IC50，对浓度范围为0.002-100μM的IFG进行测试。在DMSO中，用浓度为1mM的储备液制备IFG。最终酶浓度为25nM。将抑制剂加入酶中后，将溶液在RT预孵育10min，然后加入底物(20μM)以进行活性测量。活性测定设置如表2所示。

表2：用于通过IFG进行IC50确定的hGCase活性测定方案。

¹此处的蛋白质是指包含纯化GCase的样品

²此处为异荞麦碱(IFG)

³GCase活性缓冲剂，X：体积可调

⁴人工底物试卤灵-β-吡喃葡萄糖苷

使用GraphPad Prism7进行评估和IC50确定。将未添加抑制剂的hGCase活性设定为相对酶活性100％。在通过GraphPadPrism7评估原始数据的情况下，首先将施加的抑制剂浓度转换为log10 x值，绘制在x轴上。此外，将通过活性测定所测定的原始数据(以RFU表示)归一化至一个数据集内的最高活性(等于100％)。100％信号被定义为10-12μM IFG(＝未添加抑制剂)。使用log(抑制剂)与响应变量斜率(四个参数)(GraphPadPrism7)，按照方程9拟合数据点并且确定IC50值：

其中顶部和底部代表曲线平台，以y轴的单位表示。Hill斜率描述曲线的陡峭程度。-1.0的Hill斜率指示正常范围，-2.0指示更陡峭的曲线走向。

使用环己烯四醇-β-环氧化物(CBE)抑制hGCase

CBE是一种不可逆的葡糖脑苷脂酶抑制剂，其与酶的活性位点共价结合(Liou等人，2006)。

用超纯H₂O制备100mM CBE储备液。确定IC50时，对浓度范围为0.04-2500μM的CBE进行测试。同样，最终酶浓度为25nM。加入抑制剂后，将酶预孵育10min，然后加入底物(20μM)以启动活性测量。最终活性测定如下表3所示：

表3：用于通过CBE进行IC50确定的hGCase活性测定方案。

¹此处的蛋白质是指包含纯化hGCase的样品

²此处为环己烯四醇-β-环氧化物(CBE)

³GCase活性缓冲剂(表2.9)，X：体积可调

⁴人工底物试卤灵-β-吡喃葡萄糖苷

按照针对IFG所述的相同的方式(见上文部分)进行IC50评估。使用GraphPadPrism7，按照方程9进行IC50计算。

磷脂酰丝氨酸对hGCase突变体的活化能力

已知带负电荷的脂质诸如磷脂酰丝氨酸通常与鞘脂激活蛋白(Saposin)C(SAP-2)结合以使酶稳定和活化，因为GCase在体内与溶酶体膜自然发生相互作用。测定时，对25nM蛋白质和4μM磷脂酰丝氨酸(Avanti；溶于氯仿中的10mM储备液)进行测试。活性测定如表4所示：

表4：用于磷脂酰丝氨酸活化测量的活性测定方案。

¹此处的蛋白质是指包含纯化hGCase的样品

²此处为磷脂酰丝氨酸

³GCase活性缓冲剂(表2.9)，X：体积可调

⁴人工底物试卤灵-β-吡喃葡萄糖苷

将脂质加入酶中后，将溶液在RT预孵育10min，然后加入底物并且启动酶促反应。将未添加磷脂酰丝氨酸时的hGCase活性设定为相对酶活性100％。将活性的增加表示为未添加活化剂时的初始活性的X倍。

人H4胶质母细胞瘤细胞上的hGCase突变体在摄取、活性和葡糖鞘氨醇(GlcSph)减少方面的性能

人H4胶质母细胞瘤细胞(H4细胞)上的hGCase变体的实验和评估由NadiaAnastasi(NRD)和Iris Ruf(SMR，苗头化合物定量测定)单独完成，因此在本章中仅简要提及。

将人H4胶质母细胞瘤细胞(H4细胞)用作人类神经元模型，以采用基于细胞的设置测试纯化的hGCase变体。利用H4野生型细胞和未经处理的H4 GBA-KO细胞(敲除相关GCaseGBA基因)作为参考。接种(40000个细胞/孔)并且将其孵育约24h后，用1、10和100nM的靶蛋白样品处理GBA-KO细胞并且在37℃、5％CO₂和恒定湿度下孵育2h(用于摄取和GCase活性测量)或48h(用于底物减少测量)。细胞裂解后(GCase活性缓冲剂(表2.6)+0.1％(w/v)TritonX-100+磷酸酶(Phospho stop，Roche内部)+蛋白酶抑制剂(完全不含EDTA))，通过AlphaLISA(第2.3.6节)测量hGCase浓度以及摄取后的活性(第2.3.5节)来评估酶摄取到细胞中的过程。将用于底物减少确定的样品移交给Iris Ruf(SMR，见第2.7节)。由于H4 GBA-KO细胞中缺失GCase相关GBA基因，因此天然底物葡糖鞘氨醇(GlcSph)发生积累。Iris Ruf(SMR)通过LC/MS评估了由于hGCase处理所导致的GlcSph水平下降。

数据评估

数据的计算和评估主要使用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism7完成，其中使用相关部分中更详细地提及的相应的拟合方程。所有测量至少一式三份进行，最终结果以平均值+/-标准偏差给出。

结果

通过HP-RPC对最终hGCase批次进行质量分析

为更精确地研究最终蛋白质批次的质量，使用高效反相层析(HP-RPC)来分离、鉴定和定量分析最终hGCase合并物中的组分。使用Poroshell 300SB-C8(1.0×75mm，1CV＝0.06ml，Agilent Technologies)柱。由于适用的压力不同(50-350bar)以及柱尺寸和粒径(2-50μm)较小，因此HP-RPC具有更高的分离能力，有利于分离和鉴定样品混合物内甚至极低浓度的物质。图3.8显示了突变体M53T/P55T的代表性HP-RPC层析图。

M53T/P55T的HP-RPC层析图在保留时间为1.966分钟处表现出UV信号峰

其信号强度为约50mAU。使用约70％流动相B洗脱蛋白质(表2.6)。由于进样分析了纯参考蛋白R495H_CHO，因此可以确定GCase分子的保留时间，确认其为约1.9min。与参考R495H_CHO(2.011min)相比，保留时间的细微变化可被解释为hGCase变体的融合His8标签、缺失R495H_CHO以及生产系统的不同(S2细胞与CHO细胞)。通过对信号峰积分，可计算曲线下面积，并且在蛋白质含量方面与进样分析的参考蛋白质进行比较。但是，在本文中使用HP-RPC时，重点在于最终蛋白质批次的纯度确定，而非蛋白质含量。由于未观察到其他峰(图3.8)，因此突变体M53T/P55T表现出100％的纯度，无可检测到的杂质或降解蛋白质。针对每个纯化蛋白质批次运行HP-RPC，并且在表5中进行评估。

表5：针对所有纯化突变体以及选定参考物质所确定的HP-RPC参数的总结。

所有分子大致表现出相同的保留时间，表明hGCase分子经过类似的纯化。R495H_S2、K321N和突变体M53T/P55T未表现出杂质，而K321N/H145L在HP-RPC层析图中显示出另外两个峰，其保留时间分别为1.6min和1.8min，表明蛋白质批次更不纯。对于变体I5N、F31Y和L34Q，可以观察到相同的模式，结果表明其纯度下降。

hGCase突变体的热稳定性

如上所述，据报道，用作参考的两种hGCase变体与

分子伊米苷酶相比具有更高的热稳定性(Hung，2015)。为鉴定可能稳定的变体，应用两种不同的方法从不同的角度测试热稳定性。

在一个方面，使用Prometheus NT.Plex(NanoTemper Technologies，2019)通过nanoDSF(差示扫描荧光法)测量应用连续增加的温度梯度来测量蛋白质分子的解链温度。逐渐加热样品，使其温度升高至达到95℃。因此，蛋白质去折叠并且色氨酸残基经历化学环境的变化(暴露于含水量较高的环境)，其改变了蛋白质的固有色氨酸荧光，导致荧光光谱中的红移(350/330nm＝色氨酸荧光发射偏移)(Schubert，2015)。图1显示了此类去折叠实验的典型熔解曲线。

在图的上半部分(图1(A)和(B))，绘制了使用nanoDSF所测得的原始数据(进展曲线)，表明测量过程中荧光比350/330nm随温度升高而发生偏移。根据软件PR.StabilityAnalysis的默认设置(表2)进行一阶导数的计算，得到峰值曲线(图(A)和(B)的下半部分)。峰最大值(热去折叠转变中点)表示去折叠温度Tm，其中一半蛋白质是去折叠的(Schubert，2015)。表6汇总了各构建体的去折叠温度。

表6：使用Prometheus NT.Plex通过nanoDSF测量得到的所测试的hGCase突变体的去折叠温度Tm总结。

与R495H_S2(54.6℃)相比，所有突变体均表现出更高或相等的热稳定性，其中大多数为约55℃。突变体I5N具有最大的偏差，这可以被解释为最初产量低而导致施加的浓度低，导致测量变异。仅参考分子K321N和K321N/H145L(Amicus突变体)表现出热稳定性显著提高，Tm增加1.5-3℃。

第二种方法旨在测试在固定温度热灭活后残余的GCase活性。借助该额外的方法，重点在于随孵育时间增加而发生的基于活性的变化(Futami等人，2017；Zale和Klibanov，1986)。此处将样品置于水浴中在55℃孵育5分钟和10分钟。在将初始活性设定为100％(加热前)的情况下测量残余GCase活性。图2显示了所测试的突变体在孵育后，计算的残余活性。

基于活性的方法提供了有关酶即使在热应力下也能保持其活性的能力的更多信息。基于两个不同的孵育时间点，可以推断出不同hGCase变体失去其活性的速度和程度。除变体I5N和R495H_CHO外，所有其他突变体在孵育5分钟和10分钟后测得的残余活性均高于R495H_S2。Amicus突变体K321N和K321N/L145H在两个孵育时间下均表现出明显更高的残余活性，其对应于nanoDSF测量值(表3.6)。关于新测试的候选物，变体M53T/P55T在孵育5min后表现出最高的残余活性(65％)，然后在孵育10min后降至残余活性仅为27％，与F31Y和L34Q类似。I5N表现出较差的性能，5min后的残余活性为31％，10min后仅为16％。R495H_CHO似乎迅速失去其初始活性，但在进一步孵育后保持残余活性。但是，应通过使用相同的实验设置重复测量来确认R495H_CHO的结果。

一般来讲，两种方法揭示出相似的趋势，Amicus变体表明分子针对热稳定性进行了优化，如已经报道的那样，而新突变体的性能好于R495H_S2或与其相似。

确定因突变引起的pH最佳值偏移

应检查由于结构修饰所可能导致的pH最佳值偏移。由于GCase酶最初发生于溶酶体内，据报道其天然pH最佳值在pH 4.7-6.0之间(Lieberman等人，2007；Liou等人，2006；Tan等人，2014)。当分子结构中包括细微修饰时，该pH最佳值发生变化。因此，在3.5至8的pH范围内测试了突变体的酶活性。图3显示了四种选定hGCase突变体的pH谱。

所提及的突变体的pH特征始终表现出pH最佳值为pH 6(100％相对活性)。通常，在大多数变体中可以观察到，所测试的hGCase变体倾向于在较高pH值下(7-8，相对活性为约80-90％)而非在3.5与4之间的较低pH下(相对活性为60-80％)保持其活性。此处的例外是突变体M53T/P55T和K321N/H145L，它们具有更接近钟形的pH谱(图3)。R495H_CHO在pH 3.5(20mM柠檬酸缓冲剂)下孵育时失去其活性的40％，相比之下，(例如)R495H_S2和M53T/P55T在相同pH下则保留80％的相对活性。反之，变体I5N在pH 3.5下表现出75％的活性，但是在pH＝8时变得完全失活。变体F31Y和L34Q显示出相似的pH谱，在低pH(3.5)下表现出约80％的相对活性，其活性随pH增加而增加，直至pH达到6(100％)，并且在更高pH下进一步保持几乎85-95％的活性。总体而言，在整个测试的pH范围内，无变体(pH 8时的I5N除外)的残余活性低于50％。为整合数据，需要使用在缀合的碱上具有几乎相同的电荷并且在pH研究期间以及叠加pH范围内保持恒定的离子强度的缓冲剂，重复缓冲剂筛选。

使用天然抑制剂异荞麦碱和不可逆的抑制剂环己烯四醇-β-环氧化物确定IC50

为确定酶的活性结合位点是否受损或改变，计算活性位点抑制剂的IC50值并且进行比较。在这项工作中，使用天然存在的GCase抑制剂异荞麦碱(IFG)和环己烯四醇-β-环氧化物(CBE)。已知IFG是一种可逆抑制剂，与GCase酶的活性位点发生相互作用，而CBE是GCase的不可逆的抑制剂(Powe等人，2006)。酶的IC50被定义为其中反应(在这种情况下为酶活性)降低一半的抑制剂的浓度(Kalliokoski等人，2013)。两种测定均如第2.5.6节所述进行。使用IFG和CBE所得到的M53T/P55T抑制剂特征以及所有剩余突变体的IC50特征合并显示于图4中。

通过将施加的IFG/CBE浓度转换为对数刻度(x轴，图4)并且归一化活性信号(将各数据集的最高信号设定为100％，其定义为表观抑制剂浓度为10-12μM，等于无抑制剂)，对原始数据作图。使用GraphPad Prism7，按照方程9计算IC50值。使用IFG时，计算得出突变体M53T/P55T的IC50为约40nM；使用CBE时，IC50为约76μM(图4(A)和(C))。所有确定的IC50值如表7所示。

表7：使用IFG和CBE确定的hGCase变体的IC50值的总结。

¹n.d.＝未确定

对于使用IFG计算的IC50，除R495H_S2外，所有值大致都在约20nm与40nM之间的类似范围内。R495H_S2表现出略低的IC50，其IC50为17nM。第二种抑制剂应进一步验证新hGCase突变体的活性结合位点的恰当功能性。考虑到标准偏差，使用CBE进行测量时，R495H_CHO、R495H_S2以及F31Y和M53T/P55T表现出相似的IC50值，其IC50值为约60-70μM。K321N和双突变体K321N/H145L表现出更有效的CBE IC50值，分别为28μM和35μM，但与R495H_CHO和R495H_S2相比，IC50降低了两倍。相反，使用CBE进行的变体L34Q的测量IC50为106μM，与报道的R495H_CHO的IC50相比几乎翻了一番。由于纯化样品不足，无法使用CBE确定I5N的IC50。通常，当使用CBE进行测试时，在各种分子中观察到IC50值具有较高的偏差，其随后应进行额外的酶动力学测量和结构检测。

hGCase突变体的动力学参数比较

确定酶动力学关键参数，提供了有关酶效率和功效以及某些突变如何影响其功能的可靠的信息。为确定并且比较酶促性能，分别计算了不同hGCase变体的KM、Vmax和kcat以及kcat/KM(Eisenthal等人，2007)。如第2.5.5节所述进行相应的测定，其中均使用人工底物res-β-glc进行测量。如下所示，应用Michaelis-Menten曲线拟合(GraphPad Prism7；见方程4)来确定代表性突变体M53T/P55T的KM和Vmax。

动力学原始数据显示于图5(A)中，其中进展曲线在线性测量范围内遵循伪一阶，具有良好的重现性和低方差。可重新绘制进展曲线的斜率，将速度V[μM/min]作为所施加的底物浓度[S]的函数作图，得到Michaelis-Menten曲线的典型走向(Cornish-Bowden，2013；Johnson，2015)。计算出的动力学关键参数汇总于表8中。

表8：所测试的hGCase变体的关键动力学参数总结。

¹所用的蛋白质浓度：对于所有构建体，均为25nM

关于计算得到的KM的偏差，所有变体都大致处于相似的范围内，KM为约100-180μM。R495H_S2性能较差，其表观KM为188.6±45.5μM，并且Vmax＝0.08±0.01μM/min。计算Vmax时，所有突变体均表现出高于R495H_S2的Vmax，而L34Q则表现出最高的最大速度(0.17±0.01μM/min)。酶的转换效率可用kcat表示。其代表底物转化为产物的催化常数，考虑到给定酶浓度的单个代表性活性位点(见方程8(Eisenthal等人，2007))。因此，kcat值应在一定程度上与Vmax趋势相关(方程8)。一个更确定的参数揭示了kcat/KM，其通常被称为特异性常数，并且广泛用于比较酶的效率。此处，K321N、I5N、F31Y和L34Q以及R495H_CHO表现出相似的性能，kcat/KM为约0.7μM-1·s-1·10-3，因为KM或Vmax值的偏差必然影响该比率。I5N表现出出乎意料好的动力学性能，而在纯化后评估spec.EA时仅可得到较差的结果。R495H_S2在酶动力学方面表现出最差的性能，与其他hGCase变体相比，kcat和kcat/KM的计算值几乎低两倍(表8)。有趣的是，双突变体K321N/H145L表现相当差，具有明显较高的KM(158.3μM)和下降的kcat/KM(0.58μM-1·s-1·10-3)，但是在纯化后表现出合适的spec.EA。总体而言，与R495H_S2相比，所有变体均表现出增加的kcat/KM值，即使考虑到KM偏差时也是如此，这是因为使用各种突变体实现了更出色的Vmax性能。特别地，变体M53T/P55T在所有计算参数方面均表现出良好的性能，得到最高的表观kcat/KM值(0.9μM-1·s-1·10-3)以及相对较低的KM(100.3±15.8μM)和适度的Vmax(0.13±0.01μM/min)。

溶酶体膜脂质磷脂酰丝氨酸对hGCase的影响

据报道，几种生理物质可刺激葡糖脑苷脂酶的活性。GCase在体内自然与溶酶体膜相互作用，因此已知带负电荷的脂质诸如磷脂酰丝氨酸可单独或与鞘脂激活蛋白C(SAP-2)结合以使酶稳定和活化(Qi和Grabowski，1998；Sun等人，2002；Vaccaro等人，1995)。因此，在修饰GCase酶结构时保留这些特性至关重要。为此，作为第一种方法，评估单独磷脂酰丝氨酸的作用。将添加和未添加磷脂酰丝氨酸时的活性水平绘制在图6中。

通过将数据转换为初始活性的倍数增加，可得出更具决定性的陈述(图7)。

所有测试的hGCase变体均可被磷脂活化。Amicus双突变体K321N/H145L表现出最低程度的活化(约2.8倍)。除K321N/H145L外，所有变体均表现出与R495H_S2相同或更高的活化水平(4.9倍)。M53T/P55T增加6.5倍，I5N增加7.5倍，这两种变体在新突变体中表现出最出色的磷脂刺激作用，但是I5N具有最低的基础活性水平(图6)。有趣的是，R495H_CHO优于所有测试的变体，在添加磷脂后活化水平增加了11.5倍。

hGCase突变体在作为神经元细胞模型的人胶质母细胞瘤H4细胞上的性能

最后，确定人神经元细胞中的细胞摄取、活性和底物减少，以测试突变体在更多细胞环境中的功效。在这项工作中，利用人H4胶质母细胞瘤野生型细胞(wt)和H4 GBA-KO细胞(敲除GCase相关GBA基因)作为戈谢细胞模型。H4 GBA-KO细胞由于缺失GBA基因而积累天然底物葡糖鞘氨醇(GlcSph)，分别用1、10和100nM的hGCase分子进行处理。在几个培养基洗涤步骤后孵育2小时后测量活性和蛋白质浓度(通过AlphaLISA)。在细胞处理48h后，通过LC/MS分析天然底物GlcSph的减少。在摄取到细胞后测得的活性(归一化至测量的hGCase蛋白水平)显示于图8中。所评估的活性以在wt H4细胞中测得的hGCase活性(设定为100％)的百分比给出。

一般来讲，与在H4 wt细胞中测得的GCase活性水平相比，测得的所有hGCase构建体的活性水平均较低(黑色条)。在10nM蛋白质处理浓度下，R495H_CHO表现出最高的活性水平，归一化至H4 wt GCase活性水平的结果为44％。与R495H_S2相比，所有分子都表现出相等或更高的活性水平(用10nM处理)。双突变体M53T/P55T表现出最佳结果，与H4 wt相比，活性为26％(10nM处理)，但仍未达到H4 Wt细胞中天然存在的GCase酶水平(黑色条)。在1nM蛋白质处理浓度下，尽管突变体M53T/P55T现在显示出与R495H_CHO相似的活性水平(4％)，但是观察到大致相同的趋势。重要的是，所测试的R495H_CHO样品未在本实验中S2产生的分子的通常使用的最终缓冲剂中进行透析。因此，将其施加到其原始制剂缓冲剂中。这可能对活性产生影响，因为制剂缓冲剂中的添加剂可稳定酶并且改善分子的整体性能。

为确定酶的功效，研究了H4 GBA-KO细胞中积累的葡糖鞘氨醇(GlcSph)的减少。图9显示了根据处理后的酶浓度以及在GBA-KO细胞中测得的初始底物水平所测得的GlcSph水平(通过LC/MS测量，归一化至摄取后测得的蛋白质水平)(黑色条)。

与具有所有三种已测试浓度的未经处理的H4 GBA-KO细胞(黑色条)相比，所有测试的分子分别表现出GlcSph底物水平下降。为更好进行评估，在图10中重新绘制这些数据。

在1nM的酶浓度下，所有测试的构建体的GlcSph水平仅降低1.4至1.7(约30-40％)(图10)。用10nM蛋白质处理时，可绘制更具决定性的图片，仍然表明与1nM处理具有相似的趋势。与最初在H4 GBA-KO细胞中测得的水平相比，突变体I5N和R495H_S2在10nM时效率最低，GlcSph水平降低了4(约75％)。尤其是对于突变体I5N，可观察到其酶动力学性能(表8)与本文所评估的H4细胞的性能之间的差异，并且需要对该差异进行讨论。所有突变体(I5N除外)均表现出比R495H_S2更好地减少天然底物。变体M53T/P55T是所测试的性能最出色的分子(R495H_CHO除外)，具有最高的GlcSph底物减少程度(用10nM处理时，减少8.3倍＝减少88％)。R495H_CHO最有效(用1nM处理时减少82％；用10nM处理时减少97％)的事实可以再次归因于其原始制剂缓冲剂的稳定添加剂或缓冲条件。在未来的实验中，应计划使用与S2材料相同的缓冲剂条件透析R495H_CHO，从而更好地理解功能差异。

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