CN104164412A - 利用药物分子伴侣改善生物制剂的生产和纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明通过使用用于重组蛋白质的药物分子伴侣，提供了用于改善重组蛋白质的生产的方法。如通过本发明所例证的，一种药物分子伴侣与由细胞表达的一种重组蛋白质的结合可以稳定该蛋白质并且增加了该蛋白质到细胞的内质网外部的输出，并且增加了该蛋白质由细胞的分泌。

Description

利用药物分子伴侣改善生物制剂的生产和纯化
本申请是中国专利申请201080028918.7的分案申请。
1.技术领域
本发明通过使用用于重组蛋白质的药物分子伴侣，提供了改善重组蛋白质生产的方法。将一种药物分子伴侣结合到由细胞表达的一种重组蛋白质上能够稳定该蛋白质并且增加了该蛋白质到该细胞的内质网外部的输出，并且增加了该蛋白质由该细胞的分泌。
2.背景技术
使用哺乳动物细胞培养系统生产了各种重组人类蛋白质，这些哺乳动物细胞培养系统将这些生物制剂过量表达并且分泌到培养基中，然后通过色谱过程进行纯化。这些成功生产的重组蛋白质包含分泌性蛋白(例如：血液凝固因子、免疫球蛋白、促红细胞生成素和其他的激素，弹性蛋白酶抑制剂等等)和溶酶体酶(例如：β-葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶A，酸α-葡萄糖苷酶等等)。在这样一个生产过程中几个关键性因素会影响效率和产量：对于细胞系的表达水平；所分泌的重组蛋白质是否在纯化之前在该细胞培养基中维持了其生物活性；以及用于回收该生物制剂的蛋白质纯化方案。
上述的实例是在内质网(ER)处都共用一种生物合成途径的蛋白质(Blobel et al.,1979)。这些蛋白质(包含全部膜蛋白、分泌性蛋白、过氧化物酶体以及溶酶体蛋白)还共用一种到内质网外部的共同的输出途径，内质网将这些新合成的蛋白质运输到高尔基体用于附加的翻译后修饰以对这些不同种类的蛋白质进行分类，以便它们到达它们预期的细胞或细胞外的目的地(Kornfeld,1987)。为了使这些蛋白质到达它们最终的目的地，它们必须首先折叠成稳定的结构，这些结构在离开此区室之前能充分地经过ER质量控制(QC)系统(Ellgaard&Helenius,2003)。突变体蛋白质通常不会稳定地折叠并且它们被ER QC系统识别并且被保留(Ellgaard&Helenius,2003)。如果在多次尝试后这些突变体蛋白质未能达到一种稳定构象，它们最终会被ER相关的降解(ERAD)系统清除。较不稳定的突变体蛋白质的异常ER截留和过度的ERAD显示为众多疾病的主要原因，这些疾病包括囊性纤维病、2型糖尿病以及各种溶酶体贮存病(Schmitz et al.,2005；Fan et al.,1999；Tropak etal.,2004)。
也观察到一些正常蛋白质过早的降解，这样使得野生型蛋白质的一个可观察部分在规定的时间范围内未能达到稳定构象并且最终被ERAD清除。引用最多的实例是50％-70％的野生型囊性纤维病跨膜传导调节蛋白(CFTR)氯根离子通道的清除。人们相信大的、复杂的蛋白质(例如：CFTR、受体、凝固因子等等)比更小的、简单的对应物更容易进行低效率的折叠并且因此更易于过早的降解。此外，Randall Kaufman及其同事们描述了重组人类因子VIII的积聚和内质网的异常溶胀、某种激酶的急性活化以及在此生物制剂的生产过程中的各种细胞途径。现在这些深奥的细胞效应作为与复杂蛋白质以及其他有问题的蛋白质的表达相关联的ER应激是已知的(例如：因子VIII以及Z-型α-1抗胰蛋白酶)。人们还相信蛋白质积聚、过度的降解以及ER应激对重组蛋白质生产有不利影响并且导致了较低的蛋白质产率。因此对改进重组蛋白质的生产工艺存在着需求。
3.发明内容
本发明通过使用用于重组蛋白质的药物分子伴侣(还被称为活性位点特异性分子伴侣；ASSC)，提供了一种改善重组蛋白质生产的方法。根据本发明，，例如通过将一种药物分子伴侣(例如：1-脱氧野尻霉素(1-deoxynorjirimycin)、1-脱氧半乳糖野尻霉素(1-deoxygalactonorjirimycin)或异桑叶生物碱)结合到一种宿主细胞中表达的一种重组蛋白质上，可以改进重组蛋白质(例如：酸α-葡萄糖苷酶、酸α-半乳糖苷酶A或酸β-葡萄糖苷酶)的生产。
在一个非限制性实施方案中，通过在体外的一种细胞系表达了该重组蛋白质。在另一个非限制性实施方案中，该宿主细胞是一种哺乳动物细胞。在另一个非限制性实施方案中，该宿主细胞可以是一种CHO细胞、HeLa细胞、HEK-293细胞、293T细胞、COS细胞、COS-7细胞、小鼠原代成肌细胞(mouse primary myoblast)或NIH3T3细胞。
在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合增加了该蛋白质到细胞的内质网外部的输出。
在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合增加了该蛋白质由细胞的分泌。
在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合在该蛋白质由细胞的分泌以后稳定了在细胞外部的蛋白质。
在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合降低了与该重组蛋白质的表达相关的内质网应激。
在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合增加了在大于5.0的pH值下该蛋白质的稳定性。
在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合使在由细胞分泌该蛋白质以后从细胞培养基纯化该蛋白质过程中稳定了该重组蛋白质。在另一个非限制性实施方案中，在由细胞分泌以后在该蛋白质从细胞培养基的纯化过程中该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合增加了该纯化蛋白质的产率。
在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合能够在存储期间稳定该蛋白质。在一个进一步非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合降低了在存储期间对该蛋白质的蛋白质分解的酶解和/或化学破坏。
如在上述实施方案的任何一项中所使用的，在没有限制的情况下使用了术语重组蛋白质以及药物分子伴侣。然而在一个非限制性实施方案中，该蛋白质是一种酶，例如：一种溶酶体酶。在另一个非限制性实施方案中，该蛋白质是酸α-葡萄糖苷酶(GAA)，并且该药物分子伴侣是1-脱氧野尻霉素(DNJ)。在另一个非限制性实施方案中，该蛋白质是酸α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)，并且该药物分子伴侣是1-脱氧野尻霉素(DGJ)。在另一个非限制性实施方案中，该蛋白质是酸β-葡萄糖苷酶(葡糖脑苷脂酶；Gba；GCase)，并且该药物分子伴侣是异桑叶生物碱(IFG)。在此处描述的生产方法的任何一个中可以使用这些特定的蛋白质和药物分子伴侣。
在一个非限制性实施方案中，本发明提供一种改善重组酸β-葡萄糖苷酶生产的方法，该方法包括：将宿主细胞与对于该重组酸β-葡萄糖苷酶特异的药物分子伴侣进行体外接触，其中该宿主细胞表达该重组酸β-葡萄糖苷酶；和从该宿主细胞中纯化该重组酸β-葡萄糖苷酶。
在一个非限制性实施方案中，本发明提供一种改善重组酸β-葡萄糖苷酶生产的方法，该方法包括：将表达该重组酸β-葡萄糖苷酶的CHO宿主细胞与异桑叶生物碱或它的盐进行体外接触；和从该宿主细胞中纯化该重组酸β-葡萄糖苷酶，其中该异桑叶生物碱或它的盐以增加该重组酸β-葡萄糖苷酶在纯化期间的稳定性的有效量与该宿主细胞接触。
4.附图简要说明
图1描述了如在热稳定性测定中确定的在100μM1-脱氧野尻霉素盐酸盐(1-DNJ-HCl)的存在或不存在下，在中性pH(7.4)或酸性pH(5.2)下重组人类GAA(Genzyme公司)的稳定性。该热稳定性测定利用热量来诱导蛋白质变性，使用一种SYPRO橙色染料对此进行监测，该染料在与疏水性氨基酸结合时会发荧光(这在一种折叠的蛋白质中不会暴露)。需要更多热量来变性的一种蛋白质结构按照定义是更加稳定的。Myozyme通常在溶酶体pH(5.2)下比在中性pH(7.4)下是更加稳定的。然而，如单独与Myozyme比较，通过添加100μM脱氧野尻霉素极大地增加了该酶在pH7.4下的稳定性。
图2A描述了在37℃下在中性pH(7.4)和溶酶体pH(5.2)下1-DNJ-HCl对重组人类GAA(rhGAA；Genzyme公司)活性的影响。对GAA活性进行了评价以评估随着时间的推移一种ASSC延长该rhGAA的活性的能力。在37℃下在pH7.4或pH5.2的缓冲剂中有或没有50μM1-DNJ的情况下对Myozyme(45nM)进行培养经过24小时。在0、3、6以及24小时处使用4-MU-α-葡萄糖对样品进行了GAA酶活性的测定并且剩余的GAA活性表达为初始活性的％。这些结果表明1-DNJ改善了在中性pH(7.4)下GAA酶活性的损失。
图2B描述了一个平行SYPRO橙色热稳定性实验以确定图2A中所示的酶活性的损失、尤其是在中性pH(7.4)下Myozyme活性的损失，是否与蛋白质解折叠以及变性是相关联的。在37℃下，在pH7.4或pH5.2的缓冲剂中有或没有10μM1-DNJ-HCl的情况下，对Myozyme(0.9μM)进行培养并且每小时对该蛋白质折叠进行监测经过24小时。图2A和2B显示GAA变性与酶活性的损失是相关联的。更重要的是，这些结果表明1-DNJ能够防止在中性pH下GAA变性与酶活性的损失。
图3描述了利用热量来诱导蛋白质变性的一种热稳定性测定的结果，使用一种SYPRO橙色染料对此进行监测，该染料在与疏水性氨基酸结合时会发荧光(这在一种折叠的蛋白质中不会暴露)。如通过GAA的熔融温度的增加而明显的，1-DNJ-HCl以一种剂量依赖的方式增加了GAA热稳定性。在pH7.4下进行该实验。
图4描述了利用热量来诱导蛋白质变性的热稳定性分析的结果，使用一种当结合到疏水性氨基酸(这些氨基酸在折叠蛋白质中没有暴露)上时会发荧光的SYPRO橙色染料对该热稳定性分析进行检测。如通过熔融温度的增加而明显的，异桑叶生物碱以一种剂量依赖的方式增加了酸β-葡萄糖苷酶的热稳定性。在pH7.4下进行该实验。
图5描述了用来监测酸β-葡萄糖苷酶(葡萄糖苷酶；)的解折叠的一个SYPRO橙色热稳定性实验。在37℃，存在或不存在10μM IFG的情况下，在pH7.4或pH5.2的缓冲液中对GCase(2μM)进行培养，并且每小时都对蛋白质的解折叠进行监测，经过24小时。这些结果表明IFG能够阻止GCase在中性pH值下变性。
图6描述了利用热量来诱导蛋白质变性的热稳定性分析的结果，使用一种当结合到疏水性氨基酸(这些氨基酸在折叠蛋白质中没有暴露)上时会发荧光的SYPRO橙色染料对该热稳定性分析进行检测。如通过α-Gal A熔融温度的增加而明显的，1-脱氧半乳糖野尻霉素以一种剂量依赖的方式增加了α-Gal A的稳定性。在pH7.4下进行该实验。
图7分别地描述了在瞬时表达和用100μM IFG或DGJ培养的过程中，来自COS-7细胞的条件培养基的酸β-葡萄糖苷酶或α-Gal A活性的增加。这些结果证明用一种结合并且稳定目标蛋白质的熟知的药物分子伴侣进行的培养引起了酶活性的增加。这些酶活性水平的增加是这些目标蛋白质的增加的蛋白质分泌和/或阻止来自该条件培养基的这些分泌的蛋白质的降解和失活的结果。因为当与用空载体(EV)的对照瞬时转染比较时，一种结构上相似的药物分子伴侣(DNJ)没有引起酸β-葡萄糖苷酶活性的变化，所以酸β-葡萄糖苷酶活性的增加对其药物分子伴侣(IFG)而言是特异的。
5.详细说明
本发明通过使用用于重组蛋白质的药物分子伴侣，提供了改善重组蛋白质生产的方法。本发明在某种程度上基于发现药物分子伴侣能够将一种溶酶体酶稳定在一种构象，这种构象的溶酶体酶在表达该溶酶体酶的细胞的内质网中不会被降解。本发明在某种程度上还基于发现一种药物分子伴侣与一种溶酶体酶的结合增加了该酶对温度和pH应激的稳定性。
为清楚起见并且不通过限制的方法，此详细说明被分成以下的子部分：
(i)定义；
(ii)蛋白质缺乏失调；
(iii)重组蛋白质生产；以及
(iv)体外稳定性。
5.1定义
在本发明的背景之内以及每个术语所使用的特定的背景中，本说明书中使用的这些术语在本领域中总体上具有它们平常的含义。某些术语在如下或在本说明书的别处进行了详述，以在本发明的组合物以及方法的描述上来对实践者提供额外的指导以及如何制造并且使用它们。
术语“酶替代疗法”或“ERT”指的是将一种非天然的纯化的酶引入到缺乏这种酶的个体中。该施用的酶可以从天然资源或通过重组表达获得。该术语另外还指的是在个体中引入一种纯化酶，该个体需要或受益于纯化酶的施用，例如该个体遭受蛋白质不充足的痛苦。所引入的酶可以是一种在体外产生的纯化的重组酶，或从分离的组织或体液中纯化的酶，例如从胎盘或动物乳或从植物中分离。
术语“稳定一种适合的构象”指的是一种化合物或肽或其他分子与一种野生型蛋白质联合的能力，或指的是一种能够在体外以及在体内发挥其野生型功能的突变蛋白质，通过这样一种方式即该野生型或突变蛋白质的结构可以作为其天然的或合适的形式被保持。实际上此效应可以通过以下一项或多项来表明它本身：(i)该蛋白质增加的保质期；(ii)更高的每单位/量的蛋白质的活性；或(iii)更大的体内疗效。这可以在表达期间通过以下在实验上观察到：来自ER的增加的产率；较大的对于由于温度增加的解折叠的抵抗力(例如，如在热稳定性测定中所确定的)，或解序剂的存在，以及通过相似的方法。
如在此使用的，术语“活性位点”指的是具有一些特定生物活性的一种蛋白质的区域。例如，它可以是结合了一种底物或其他的结合部分并且贡献了直接参与一些化学键的形成和破坏的氨基酸残基的一个位点。本发明中的活性位点可以包括酶的催化位点、抗体的抗原结合位点、受体的配体结合域、调控因子的结合域或分泌性蛋白质的受体结合域。这些活性位点还可以包括反式激活、蛋白质相互作用或转录因子和调控因子的DNA结合域。
如在此使用的，这些术语“药物分子伴侣”或“活性位点特异性分子伴侣”指的是包括一种蛋白质、肽、核酸、碳水化合物等的任何分子，这些分子特定地与蛋白质的一个活性位点可逆地相互作用并且增强了一种稳定的分子构象的形成。如在此使用的，“活性位点特异性分子伴侣”不包括细胞的ER中存在的内源一般分子伴侣，例如：结合蛋白(Bip)、钙联接蛋白或钙网蛋白或一般的非特定的化学分子伴侣例如氘化水、DMSO或TMAO。
在一个非限制性实施方案中，该活性位点特异性分子伴侣可以是一种蛋白质或酶的一种“竞争性抑制剂”，其中一种竞争性抑制剂可以指的是一种化合物，该化合物在结构上与该酶底物的化学结构和分子的几何形状相似以在与底物大致相同的位置结合该酶。因此，该抑制剂与底物分子竞争相同的活性位点，从而增大了Km。如果可获得足够的底物分子用来置换该抑制剂，竞争性抑制通常是可逆的，即一些竞争性抑制剂能够可逆地结合。因此，酶抑制剂的量取决于抑制剂浓度、底物浓度、以及抑制剂和底物对于活性位点的相对亲和力。
术语“宿主细胞”是指以任何方式选择的、修饰的、转化的、生长的或使用的或操纵的任何生物体的任何细胞，用于通过该细胞生产一种底物，例如通过细胞表达一种基因、一种DNA或RNA序列、一种蛋白质或一种酶。在一个实施方案中，用一个编码蛋白质的载体进行转染的宿主细胞可以被用于蛋白质替代疗法，例如酶替代疗法。
在另一个非限制性实施方案中，该宿主细胞可以是CHO细胞、HeLa细胞、HEK-293细胞、293T细胞、COS细胞、COS-7细胞、小鼠原代成肌细胞或NIH3T3细胞。
如在此使用的术语“纯化的”指的是在减少或去除一些不相关的材料的存在的条件下已经被分离的材料，这些不相关的材料即污染物，包括从其中获得该材料的天然材料。例如，一种纯化的蛋白质优选地基本上不含其他的在细胞中与其相关联的蛋白质或核酸；一种纯化的核酸分子优选地基本上不含可以在细胞中与其一起找到的蛋白质或其他不相关的核酸分子。如在此使用的，术语“基本上不含”在操作上被使用在该材料的分析测试的环境中。优选地，基本上不含污染物的纯化的材料至少是95％纯的；更优选地，至少是97％纯的，并且还更优选地至少是99％纯的。可以通过色谱法、凝胶电泳法、免疫测定、成分分析、生物测定以及在本领域中已知的其他的方法对纯度进行评价。在一个具体的实施方案中，纯化的是指污染物的水平是低于监管当局所接受的对于人类或非人类的动物进行安全给药的一个水平。
如在此使用的，这些术语“突变的”和“突变”是指在遗传材料例如DNA中的任何可检出的变化，或这样一种变化的任何过程、机制或结果。这包括基因突变，在这些突变中基因的结构(例如：DNA序列)被改变，由任何突变过程产生的任何基因或DNA，以及通过一种修饰的基因或DNA序列表达的任何表达产物(例如：RNA、蛋白质或酶)。
如在此使用的，术语“突变的蛋白质”指的是从包含遗传突变的基因中翻译的蛋白质，这些遗传突变导致了改变的蛋白质序列。在一个具体的实施方案中，这种突变导致该蛋白质没有能力在ER中正常存在的条件下实现它的天然构象。不能实现此构象导致了这些蛋白质被降解，而不是在蛋白质运输系统中通过它们正常的途径被运输到细胞内的它们的合适的位置。其他的突变能够导致减小的活性或更快的翻转。
如在此使用的，术语“野生型基因”指的是一种核酸序列，该核酸序列编码一种能够在体内具有正常的生物功能活性的蛋白质。该野生型核酸序列可以包括与已知的公布的序列不同的核苷酸变化，只要这些变化导致对生物活性具有很小或没有影响的氨基酸替换。该术语野生型还可以包括一些核酸序列，这些核酸序列被设计用来对相对于内源的或天然的蛋白质有增加或增强活性的能力的一种蛋白质进行编码。
如在此使用的，术语“野生型基因”指的是由一种野生型基因编码的任何蛋白质，该野生型基因当在体内被表达或被引入时有能力具有功能性生物活性。术语“正常的野生型活性”指的是在细胞中一种蛋白质的正常生理功能。可以通过所熟知的确定一种蛋白质功能性的任何方法对这种功能性进行测试。
术语“在遗传上被修饰”指的是在一种核酸的引入之后表达一种特定基因产物的一些细胞，该核酸包括编码该基因产物的一种编码序列，连同控制该编码序列的表达的一些调节元件一起。该核酸的引入可以通过本领域中已知的任何方法(包括基因打靶以及同源重组)实现。如在此使用的，该术语还包括已经被设计用来表达或过量表达通常并不是通过这种细胞表达的一种内源基因或基因产物的一些细胞，例如：通过基因活化技术。
术语“药学上可接受的”，不论是否与本发明的药用组合物结合使用，指的是当对人类给药时在生理上是可容许的并且不会典型地产生一些不良反应的一些分子实体以及组合物。优选地，如在此使用的，该术语“药学上可接受的”是指被联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其他的普遍公认的在动物中并且更具体地说在人类中使用的药典中列出的。该术语“载体”指的是一种稀释剂、辅助剂、赋形剂或运载体，用这些载体该化合物被给药。此类药物载体可以是无菌的液体，例如水以及油类。水或水性溶液、盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液优选地被用作载体，特别地用于可注射的溶液。在由E.W.Martin所著的“Remington's Pharmaceutical Sciences”第18版中描述了一些适合的药物载体。
这些术语“治疗的有效剂量”和“有效量”指的是一种足以导致一种治疗反应的化合物的量。在其中一种ASSC和一种酶以一种复合体的形式被给药的实施方案中，这些术语“在治疗上有效的剂量”和“有效量”可以指的是足以导致一种治疗反应的该复合体的量。一种治疗反应可以是一个使用者(例如：一位临床医生)将识别为对该疗法的一种有效反应的任何反应。因此，一种治疗反应通常会是一种疾病或失调的一个或多个症状或迹象的一种缓解。
这些术语“大约”和“近似地”通常应该是指对于测量的数量的一个可接受程度的误差，考虑到这些测量的性质或精度。典型的，示例性的误差程度是在一个给定值或值的范围的20％之内，优选地在10％之内，并且更优选地在5％之内。可替代地，并且特别地在生物系统中，这些术语“大约”和“近似地”可以是指在一个给定数值的一个数量级内的一些值，优选地在10或5倍之内，并且更优选地在2倍之内。除非另行说明，在此给出的数量是近似的，这意味着当不是被清楚地规定时术语“大约”和“近似地”可以被推断出。
应该指出的是，由于体内给药后ASSC的稀释(以及由于平衡的变化随之发生的结合移位)、生物利用率以及新陈代谢，在该纯化治疗蛋白质的体外生产、运输或存储期间抑制的ASSC的一种浓度还可以构成用于本发明的目的的一个“有效量”。
5.2蛋白质缺乏失调
在理论上表征为蛋白质或酶缺乏或在特定组织中的功能损失的失调是可以通过蛋白质替代疗法进行治疗的。在这样的失调中，一个个体的某些细胞或所有细胞缺乏一种充分功能的蛋白质，包含该蛋白质的一种非活化的形式或包含对于生物功能的不充分水平。
例如，通过编码蛋白质或酶的基因中的一种突变，蛋白质或酶缺乏失调可以被引起，该突变导致一种没有功能的或具有降低的或改变的功能的蛋白质或酶的表达。该缺乏病还可以通过蛋白质或酶的基因中的一种突变而引起，该突变导致了很少至没有蛋白质或酶的表达(例如：一种无效突变)。
此外，蛋白质或酶缺乏病可以是由于一种构象失调，由改变蛋白质折叠以及该突变蛋白质在ER中的阻滞的突变所引起，从而导致了蛋白质缺乏。这些疾病包括，例如，但不限于，囊性纤维病、α1-抗胰蛋白酶缺乏病、家族性血胆固醇过多、法布里氏病、阿尔茨海默病(Selkoe,Annu.Rev.Neurosci.1994；17:489-517)、成骨不全症(Chessler et al.,J.Biol.Chem.1993；268:18226-18233)、碳水化合物缺乏糖蛋白综合征(Marquardt et al.,Eur.J.Cell.Biol.1995；66:268-273)、马拉二氏综合征(Bradford et al.,Biochem.J.1999；341:193-201)、遗传性失明(Kaushal et al.,Biochemistry1994；33:6121-8)、血小板无力症(Kato et al.,Blood1992；79:3212-8)、遗传因子VII缺乏症(Arbini et al.,Blood1996；87:5085-94)、眼皮肤白化病(Halaban et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97:5889-94)以及蛋白质C缺乏病(Katsumi,et al.,Blood1996；87:4164-75)。最近，在X连锁疾病脑白质肾上腺萎缩症(ALD)中的一种突变，导致了有缺陷的过氧化物酶体转运蛋白的错折叠，通过受到影响的细胞的低温培养可以将该转运蛋白营救(Walter et al.,Am JHum Genet2001；69:35-48)。通常所公认的是突变均匀地遍及一个基因的整个序列而发生。因此，可预测的是由该有缺陷的蛋白质的错折叠产生的表型存在于许多其他的遗传性失调中。
许多遗传性的蛋白质缺乏失调是酶缺乏病。一大类遗传性酶失调包括在溶酶体酶中的一些突变并且称为溶酶体贮积失调(LSD)。溶酶体贮积失调是一组由糖鞘脂类、糖原以及粘多糖类的累积引起的疾病。溶酶体失调的一些实例包括，但不限于，戈谢病(Beutler et al.,The Metabolic and MolecularBases of Inherited Disease,8th ed.2001Scriver et al.,ed.pp.3635-3668,McGraw-Hill,New York)、GM1-神经节苷脂贮积症(同上，在pp3775-3810)、岩藻糖苷贮积病(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease1995.Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.and Valle,D.,ed.pp.2529-2561,McGraw-Hill,New York)、粘多糖贮积症(同上，在pp3421-3452)、蓬珀氏病(同上，在pp.3389-3420)、胡-射二氏病(Weismann et al.,Science1970；169,72-74)，尼-皮A和B病(The Metabolic and Molecular Bases of InheritedDisease8th ed.2001.Scriver et al.ed.,pp3589-3610,McGraw-Hill,New York)以及法布里氏病(同上，在pp.3733-3774)。
法布里氏病
术语“法布里氏病”指的是糖鞘脂分解代谢的一种X-连锁先天性缺陷，由于缺乏的溶酶体α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)活性。此缺陷引起了球形三酰神经酰胺(三己糖苷神经酰胺)以及在心脏、肾、皮肤、以及其他组织的血管内皮溶酶体中相关的糖鞘脂类的累积。
在一个非限制性实施方案中，α-半乳糖苷酶A指的是一种人类Gla基因，该基因包括在GenBank登录号NM_000169中描述的一种核酸序列。可替代地，α-半乳糖苷酶A可以由展示出对于α-半乳糖苷酶A基因至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％以及高达100％的同源性(如通过标准软件所确定的，例如BLAST或FASTA)的任何核酸分子、以及在标准条件下与这些序列杂交的任何序列来编码。
在另一个非限制性实施方案中，人类α-半乳糖苷酶A(α-GAL A)指的是由人类Gla基因编码的一种酶或与其至少90％同源的任何其他氨基酸序列。人类α-GAL酶由429个氨基酸组成并且是在GenBank登录号U78027和NP_000160中。
术语“非典型法布里氏病”指的是有α-GAL缺陷病的原发性心脏临床表现的患者，也就是渐进性的球形三酰神经酰胺(GL-3)在心肌细胞中的积累，该积累导致了心脏的显著扩大，尤其是左心室。
“携带者”是具有带有一个有缺陷的α-GAL基因的一个X染色体和带有正常基因的一个X染色体的一个女性并且在该女性体内该正常等位基因的X染色体的失活存在于一个或多个细胞类型中。携带者通常用法布里氏病来诊断。
在一个非限制性实施方案中，用于α-半乳糖苷酶A的一种药物分子伴侣可以是1-脱氧半乳糖野尻霉素(DGJ)，其中DGJ是具有以下结构的一种化合物：
此术语包括该游离碱和任何盐的形式两者以及它们的任何药物前体。
在Fan等人的美国专利号6,274,597、6,774,135以及6,599,919中还对于α-GAL A的其他药物分子伴侣进行了描述，并且包括α-别高野尻霉素、β-1-C-丁基-脱氧半乳糖野尻霉素、以及α-半乳糖-高野尻霉素、打碗花素A3、打碗花素B2、打碗花素B3、N-甲基-打碗花素A3、N-甲基-打碗花素B2以及N-甲基-打碗花素B3。
蓬珀氏病
蓬珀氏病是一种表征为缺乏的酸α-葡萄糖苷酶(GAA；α-葡萄糖苷酶)活性的一种常染色体隐性LSD，缺乏的活性削弱了溶酶体糖原新陈代谢。酶缺乏病导致了溶酶体糖原积累并且造成渐进性的骨骼肌无力，降低的心脏功能，呼吸功能不全、和/或在疾病的晚期的CNS损伤。在GAA基因中的遗传突变造成了或者更低的表达或者产生带有改变了的稳定性和/或生物活性的酶的突变形式，最终导致疾病。(通常参见Hirschhorn R,1995,GlycogenStorage Disease Type II:Acidα-Glucosidase(Acid Maltase)Deficiency,TheMetabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,Scriver et al.,eds.,McGraw-Hill,New York,7th ed.,pages2443-2464)。蓬珀氏病的这三种公认的临床形式(婴儿的、少年的以及成年的)与剩余的α-葡萄糖苷酶活性的水平是相关的(Reuser A J et al.,1995,Glycogenosis Type II(Acid Maltase Deficiency),Muscle&Nerve Supplement3,S61-S69)。ASSC(在别处还称为“药物分子伴侣”)代表了一种用于一些遗传疾病例如一些溶酶体贮积失调(例如蓬珀氏病)的治疗的有希望的新治疗方法。
在一个非限制性实施方案中，酸α-葡萄糖苷酶(GAA)指的是一种人类糖苷酶，α-酸(GAA)基因，该基因包括在GenBank登录号NM_000152、NM_001079803或NM_001079804中描述的核酸序列。可替代地，酸α-葡萄糖苷酶可以由展示出对于酸α-葡萄糖苷酶基因至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％以及高达100％的同源性(如通过标准软件所确定的，例如BLAST或FASTA)的任何核酸分子、以及在标准条件下与这些序列杂交的任何序列来编码。
在另一个非限制性实施方案中，人类酸α-葡萄糖苷酶指的是在糖原、麦芽糖以及异麦芽糖存在下对α-1,4-和α-1,6-连接的-D-葡萄糖聚合物进行水解的一种酶。可替代的命名如以下所示：葡糖淀粉酶；1,4-α-D-葡聚糖水解酶；淀粉葡萄糖苷酶；γ-淀粉酶；以及外-1,4-α-葡萄糖苷酶。人类GAA基因已经被绘制到染色体17q25.2-25.3并且具有如在GenBank登录号Y00839、NP_000143、NP_001073271或NP_001073272中描述的一个氨基酸序列，或与其至少90％同源性的任何其他的氨基酸序列。
婴儿的蓬珀氏病(I或A型)是最常见并且最严重的，其特征为在生命的第二年之内发育不良、全身的张力减退、心脏肥大以及心和肺的衰退。少年的蓬珀氏病(II或B型)在严重性上是介于中间的并且其特征为没有心脏扩大症的情况下肌肉症状的占主导。一些少年的蓬珀氏个体通常在到达20岁的年龄之前由于呼吸衰退而死亡。成年的蓬珀氏病(III或C型)通常在十几岁或晚到五六十岁时呈现一种慢性渐进的肌病(Felice K J et al.,1995,ClinicalVariability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency:Report of Affected Sibs andReview of the Literature,Medicine74,131-135)。
在蓬珀氏病中，已经显示了通过糖基化作用、磷酸化以及蛋白酶解加工对α-葡萄糖苷酶进行了广泛地翻译后修饰。在溶酶体中通过蛋白水解作用110千道尔顿(kDa)的前体到76和70kDa成熟形式的转化对于最佳的糖原催化是所要求的。
如此处使用的，术语“蓬珀氏病”指的是所有类型的蓬珀氏病。本申请中披露的这些配制品以及给药方案可以被用于治疗例如I型、II型或III型蓬珀氏病。
在一个具体的非限制性实施方案中，用于酸α-葡萄糖苷酶的一种药物分子伴侣可以是1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)，它通过以下的化学式来表示：
或它的一种药学上可接受的盐、酯或药物前体。在一个实施方案中，该盐是盐酸盐(即，1-脱氧野尻霉素-HCl)。
在Fan等人的美国专利号6,599,919以及Mugrage等人的美国专利申请公开号2006/0264467中描述了用于酸α-葡萄糖苷酶的其他药物分子伴侣，并且包括α-高野尻霉素以及澳粟精胺。
戈谢病
如此处使用的，术语“戈谢病”指的是分解脂肪葡糖脑苷脂的溶酶体酶葡糖脑苷脂酶的一种缺乏症。那么脂肪大部分积累在在肝、脾脏以及骨髓中。戈谢病可以引起疼痛、疲劳、黄疸、骨骼损坏、贫血以及甚至死亡。戈谢病存在三种临床的表型。患有I型的患者或者在生命的早期或者在成年早期容易显示挫伤并且由于贫血、低血小板、肝和脾脏的扩大、骨骼虚弱而经历疲劳，并且在某些情况下有肺和肾的损伤。还没有迹象表明涉及大脑。在II型中，早期发病的肝和脾脏扩大发生在年龄的三个月并且广泛地涉及大脑。在两岁之前存在一种较高的死亡率。III型的特征为肝和脾脏扩大以及大脑癫痫发作。β-葡糖脑苷脂酶基因位于人类1q21染色体上。它的蛋白质前体包括536个氨基酸并且它的成熟蛋白质长度是497个氨基酸。
在一个非限制性实施方案中，葡糖脑苷脂酶指的是一种人类糖苷酶，β(Gba)基因，该基因包括在GenBank登录号NM_001005741、NM_001005741、NM_001005749、NM_001005750或NM_000157中描述的一种核酸序列。可替代地，葡糖脑苷脂酶可以由展示出对于葡糖脑苷脂酶基因至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％以及高达100％的同源性的任何核酸分子(如通过标准软件所确定的，例如BLAST或FASTA)、以及在标准条件下与这些序列杂交的任何序列来编码。
在另一个非限制性实施方案中，葡糖脑苷脂酶指的是由人类糖苷酶，β(Gba)基因(GenBank登录号NP_001005741、NP_001005742、NP_001005749、NP_001005750或NP_000148)编码的一种酶，或任何其他的与其至少90％同源性的氨基酸序列。
在一个非限制性实施方案中，用于葡糖脑苷脂酶的一种药物分子伴侣可以是异桑叶生物碱(IFG；(3R,4R,5R)-5-(羟甲基)-3,4-哌啶二醇)，具有以下的结构：
异桑叶生物碱酒石酸盐最近已经被描述在Mugrage等人共同所有的美国专利号7,501,439中，并且已经被指定CAS号919364-56-0。异桑叶生物碱还可以用各种有机和无机酸制成的其他酸加成盐的形式来制备。这些盐类包括用氯化氢、溴化氢、甲磺酸、硫酸、醋酸、三氟乙酸、草酸、马来酸、苯磺酸、甲基苯磺酸以及各种其他的酸形成的那些盐类(例如：硝酸盐、磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐以及类似物)。如本领域的普通技术人员已知的这些盐类可以被形成。
在Fan等人的美国专利号6,599,919、Kristiansen等人的6,046,214、Sierks等人的5,844,102以及Wustman的美国专利申请公开号2008/0009516中还对于葡糖脑苷脂酶的其他药物分子伴侣进行了描述，并且包括C-苯甲基异桑叶生物碱以及衍生物、N-烷基(C9-12)-DNJ、葡糖并咪唑(以及衍生物)、C-烷基-IFG(以及衍生物)、N-烷基-β-井冈霉烯胺(valeinamine)、氟奋乃静、N-十二烷基-DNJ以及打碗花素A3、B1、B2以及C1。
除遗传性失调之外，其他的酶缺乏病产生于由初级或次级失调引起的组织或器官的损伤。例如，损伤的胰腺组织或胰腺炎是由酒精中毒引起的，导致了对消化所必需的胰酶的一种缺乏病。目前正在使用酶替代疗法对胰腺炎进行治疗。
可以通过给予替换蛋白质来增强或刺激生物过程来对蛋白质缺乏的失调进行治疗。例如，对患有贫血的一些个体给予重组促红细胞生成素以刺激红细胞的生产并且增加了到组织的氧运输。此外，给予一些重组干扰素例如干扰素α2b( 或)以及干扰素β1a( )来分别治疗乙型肝炎以及多发性硬化症。其他的所给予的蛋白质是重组人类脱氧核糖核酸酶I选择性地切割用于改善患有囊性纤维病的患者中的肺功能的DNA的一种酶；开发用于已经接近全部或全部甲状腺切除并且因此必须摄取甲状腺激素的甲状腺癌患者的重组促甲状腺激素用于治疗来自化疗的嗜中性白细胞减少症的重组G-CSF以及患有胰腺炎个体中的消化酶。蛋白质治疗的另一个重要的方面是用具有高度特异的、明确限定的活性位点的抗体治疗传染病以及癌症。一些抗体治疗产品包括用于呼吸道合胞病毒的用于乳癌的用于关节炎和炎性疾病的和以及其他的产品。用于抗体的ASSC是众所周知的，并且靶抗原亦或一种结构上相关的类似物(例如该活性靶的一种修饰的形式或一种模拟物)可以被使用。
“患者”指的是已经被诊断为患有或被怀疑患有一种特定疾病的受试者。患者可以是人类或动物。例如，“法布里氏病患者”指的是已经被诊断为患有或被怀疑患有法布里氏病并且具有一种突变的α-GAL的个体。法布里氏病的一些特征标志物能以相同的患病率发生在一些男性半合子以及一些女性携带者中，尽管女性典型地较不严重地受到影响。
5.3重组蛋白质生产
对治疗患有一种蛋白质缺乏病的患者有用的这些替换蛋白质，例如，通过酶替代疗法，可以在本领域的技术范围内使用普通的分子生物学、微生物学以及重组DNA技术被分离并且纯化。例如，可以使用如在本文献中描述的重组DNA表达对编码了该替换蛋白质的一些核酸进行分离。参见，例如Sambrook、Fritsch&Maniatis，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社第二版(1989)，冷泉港，纽约州(在此"Sambrook et al.,1989")；DNA克隆：一种实用的方法，卷I和II(1985年D.N.Glover编辑)；寡核苷酸合成(1984年M.J.Gait编辑)；核酸杂交(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985年))；转录和翻译(B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984年))；动物细胞培养(R.I.Freshney编辑(1986年))；固定化细胞以及酶(IRL出版社(1986年))；B.E Perbal，分子克隆的实用指导书(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)，分子生物学实验室操作指南，JohnWiley&Sons,Inc.(1994)。编码了该蛋白质的核酸可以是全长的或截短的，只要该基因编码了一种生物活性的蛋白质。例如，α-Gal A的一种生物活性的、截短的形式，与法布里氏病有关的有缺陷的酶，已经在Miyamura等人的美国专利号6,210,666中进行了描述。
然后编码了目标蛋白质的被鉴定并且分离的基因可以被插入到一种适当的克隆载体中。可以使用在本领域中已知的大量载体-宿主系统。一些可能的载体包括，但不限于，一些质粒或修饰的病毒，但是该载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。载体的实例包括，但不限于，大肠杆菌噬菌体例如λ-衍生物、或质粒例如pBR322衍生物或pUC质粒衍生物，例如pGEX载体、pmal-c、pFLAG等等。对一种克隆载体的插入可以，例如，通过将该DNA片段连接到一种具有互补粘着末端的克隆载体中来实现。然而，如果用于使DNA成片段的这些互补的限制酶切位点没有在该克隆载体中出现，这些DNA分子的末端可以用酶法进行修饰。可替代地，可以通过将核苷酸序列(连接物)连接到DNA末端上来产生任何所希望的位点；这些连接的连接物可以包括一些特定的用化学方法合成的寡核苷酸，这些寡核苷酸编码了限制性内切核酸酶的识别序列。该重组蛋白质的生产可以通过遗传操作被放大，例如包括在N末端促进分泌的一种信号肽或包含一个聚腺苷酸化位点的一种3'非翻译序列。
在一个非限制性实施方案中，用于转导宿主细胞的这些构建体是病毒衍生的载体，包括但不限于腺病毒、腺关联的病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、辛德毕斯病毒以及牛痘病毒。
通过转化、转染、感染、电穿孔等等可以将一些重组分子引入到宿主细胞中，以便生成基因序列的许多拷贝。优选地，所克隆的基因包含在一种穿梭载体质粒上，这在一个克隆的细胞中提供了扩张，例如大肠杆菌，以及用于随后插入到一种适当的表达细胞系中的易做到的纯化，如果这是所希望的。
一些潜在的宿主-载体系统包括但不限于被病毒感染的哺乳动物细胞系统(例如：牛痘病毒、腺病毒等等)；被病毒感染的昆虫细胞系统(例如：杆状病毒)；微生物例如包含酵母载体的酵母；或用噬菌体、DNA、质粒DNA或黏端质粒DNA转化的细菌。载体的这些表达元件在它们的强度和特异性方面变化。根据所利用的该宿主-载体系统，可以使用大量适合的转录和翻译元件的任何一个。不同的宿主细胞对于蛋白质的翻译的和翻译后的加工和修饰(例如：糖基化作用、切割[例如：信号序列的])具有一些典型的并且特殊的机制。一些适当的细胞系或宿主系统可以被选择以确保所表达的外来蛋白质的所希望的修饰和处理，例如：糖基化作用、唾液酸化作用以及磷酸化。例如，在一个细菌系统中的表达可以被用来生产一种非糖基化的核心蛋白质产品。然而，在细菌中表达的蛋白质可能不被适当地折叠。在酵母中的表达可以产生一种糖基化的产品。在真核细胞中的表达可以增加“天然的”糖基化作用以及一种异源蛋白的折叠的可能性。此外，在哺乳动物细胞中的表达可以提供用于重建或构建蛋白质的一种工具。
使用本领域中已知的一些方法可以实现重组地表达的蛋白质的纯化，例如通过硫酸铵沉淀、含有疏水性相互作用树脂、阳离子交换树脂、阴离子交换树脂以及色谱聚焦树脂的柱色谱法。可替代地，使用一种适当的多克隆或单克隆抗体免疫亲和性层析法可以用来纯化重组蛋白质，该抗体特定地结合到该蛋白质或融合到该重组蛋白质的一个标签上。在一个优选实施方案中，用于本发明的方法的重组蛋白质的纯度将是至少95％，优选地至少97％并且最优选地大于98％。
在其他非限制性实施方案中，对治疗患有一种蛋白质缺乏病的患者有用的这些替换蛋白质，例如，通过酶替代疗法，可以从一种重组细胞表达系统中被纯化(例如：哺乳动物细胞或昆虫细胞，通常参见Desnick等人的美国专利号5,580,757；Selden等人的美国专利号6,395,884以及6,458,574；Calhoun等人的美国专利号6,461,609；Miyamura等人的美国专利号6,210,666；Selden等人的美国专利号6,083,725；Rasmussen等人的美国专利号6,451,600；Rasmussen等人的美国专利号5,236,838；以及Ginns等人的美国专利号5,879,680)、人类胎盘或动物乳(参见Reuser等人的美国专利号6,188,045)。
用于获得适合于药物用途的该替换蛋白质的其他的合成技术可以发现于，例如，美国专利号7,423,135、6,534,300以及6,537,785中；国际公布申请号2005/077093以及美国公布申请号2007/0280925和2004/0029779中。出于所有目的将这些参考文献以其整体通过引用由此结合。
此外，不同的载体/宿主表达系统可以在一个不同程度上影响加工反应，例如蛋白酶剪切。通过使用一种特异的分子伴侣可以增加表达效率，如在美国专利号6,274,597中所描述的，以及相关的家庭成员。
如以上所指出，本发明的一个方面提供了一种用于改善一种重组蛋白质生产的方法，该方法包括将表达一种重组蛋白质的一种宿主细胞与对于该重组蛋白质特异的一种药物分子伴侣进行接触。
在一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣可以在表达该蛋白质的细胞的ER中稳定一种目标重组蛋白质，并且防止了该蛋白质的ERAD以及过早降解。在这样做时，该药物分子伴侣可以降低与该重组蛋白质的表达相关联的ER应激，这进而可以允许该生产细胞系维持该蛋白质的高生存能力以及表达。
在其他非限制性实施方案中，该药物分子伴侣可以稳定由细胞表达的一种重组蛋白质，并且增加了该蛋白质到该细胞的ER外部的输出，并且增加了该蛋白质到细胞外部的分泌。
在其他非限制性实施方案中，该药物分子伴侣可以在表达该蛋白质的细胞之外稳定一种目标重组蛋白质(也就是，在该蛋白质已经被分泌到该细胞培养基中之后)。通过稳定该重组蛋白质，该药物分子伴侣可以对这些蛋白质是有益的，这些蛋白质通常必须被储存在一个较低的pH下以维持稳定性，并且在典型地是在中性pH值中配制的大多数细胞培养基中通常是不稳定的。在收获和纯化之前当这些蛋白质依然留在该细胞培养基中的时候可能会造成酶活性的巨大损失。药物分子伴侣可以稳定这些蛋白质并且防止在pH大于5.0(例如：在中性pH下)的培养基中蛋白质活性的不可逆的变性以及失活。
在其他非限制性实施方案中，在一种蛋白质从细胞培养基中纯化的过程中该药物分子伴侣可以保护这种目标重组蛋白质。如果一种重组蛋白质在培养基中是不稳定的，通过在这些纯化混合物中污染一些蛋白酶它可能变性并且对蛋白水解作用是敏感的。通过稳定该蛋白质以及防止一些蛋白水解位点被露出，药物分子伴侣可以防止此蛋白水解作用。因此在纯化的过程中该药物分子伴侣可以改善蛋白质的完整性和/或酶活性。
在其他非限制性实施方案中，在一种药物制剂的存储和/或制备过程中该药物分子伴侣可以保护一种重组蛋白质。例如，一种药物分子伴侣可以约束并且抑制凝血因子(例如蛋白酶)的酶活性来确保这些蛋白质在存储和配制过程中以蛋白质水解的方式被酶解。在配制过程中药物分子伴侣还可以防止其他类型的不可逆的化学破坏(例如氧化作用、水解作用或脱酰胺作用)或物理不稳定性，例如聚集、沉淀以及对表面的吸附作用。此外，该药物分子伴侣可以稳定并且保护蛋白质免受应激，例如pH、温度、剪切应激、冻结/解冻应激以及这些应激的组合，另外这可能有助于该蛋白质的降解。
在一个非限制性实施方案中，该替换蛋白质是一种重组酸α-葡萄糖苷酶(GAA)，由此基因的最主要的九个可观测的单倍型来编码并且在一种中国仓鼠卵巢细胞系中通过重组DNA技术来生产。该重组的GAA可以是例如，如在Kakkis等人，2008，“An improved alpha-glucosidase enzyme forPompe disease”，摘要，美国人类遗传学学会第58届年会；Kishnani et al.,2007,Neurology.68(2):99-109；Reuser等人的美国专利号6,118,045、Chen的7,056,712以及van Bree的7,351,410中描述的一种重组GAA，出于所有目的将它们中的每一个以其整体通过引用结合。
在其他优选的非限制性实施方案中，该ASSC是1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)并且该GAA是一种重组GAA。在一个可替代的实施方案中，该ASSC是α-高野尻霉素并且该GAA是一种重组GAA。在另一个可替代的实施方案中，该ASSC是澳粟精胺并且该GAA是一种重组GAA。该ASSC(例如：1-脱氧野尻霉素、α-高野尻霉素以及澳粟精胺)可以从一些合成文库获得(参见，例如Needels et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993；90:10700-4；Ohlmeyeret al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993；90:10922-10926；Lam等人的PCT公布号WO92/00252；Kocis等人的PCT公布号WO94/28028)，根据本发明这些合成文库提供了ASSC的一种可能的来源。合成化合物文库在商业上从Maybridge化学公司(Trevillet，康沃尔，英国)、Comgenex(普林斯顿，新泽西)、Brandon联合公司(梅里马克，新罕布什尔州)以及Microsource(新米尔福德，康涅狄格州)是可商购的。一种罕见的化学文库从Aldrich(密尔沃基，威斯康星州)是可得到的。可替代地，以细菌的、真菌的、植物的以及动物的提取物形式存在的一些天然化合物的文库从例如PanLaboratories(博塞尔，华盛顿州)或MycoSearch(北卡罗来纳州)是可得到的，或是容易生产的。此外，一些天然的和合成地生产的文库以及化合物通过Res.1986；155:119-29是容易被修饰的。
5.4体外稳定性
主要的挑战是确保一种替换蛋白质配制品在其保存期内的稳定性。例如，小瓶的重组酶通常仅仅用于单次使用并且未用过的产品应该被丢弃。此外，通常必须通过健康护理专业人员对重组酶进行重建、稀释并且给药，并且这种给药应该是没有耽搁的。重组酶通常必须被存储在低温下，例如2℃至8℃，并且该产品仅仅在一个有限的时间内是稳定的，例如一直到24小时。
当该ASSC和该替换蛋白质存在于相同的组合物中时，本发明的这些配制的组合物提供了更稳定的组合物。除在体内稳定该给药的蛋白质之外，该ASSC在体外可逆地结合到并且稳定该替换蛋白质的构象，由此防止了聚集和降解，并且延长了该配制品的保存期。使用本领域中所熟知的一些技术可以对该ASSC/替换蛋白质相互作用的分析进行评价，例如差示扫描热量法或圆二色性法。
例如当在一个加塞的小瓶中提供了组合物的一种水性可注射的配制品时(适合使用一支针和注射器取出内含物)，一种ASSC的存在抑制了该替换蛋白质的聚集。该小瓶可以用于单次使用亦或多次使用。该配制品还可以作为一种预填充的注射器而提供。在另一个实施方案中，该配制品处于一种干燥或冷冻干燥的状态，该状态要求用一种标准的或一种供应的生理稀释液重建到一种液体状态。在此实例中，在重建期间或重建之后，一种ASSC的存在将稳定该替换蛋白质以防止聚集。在其中该配制品是用于静脉给药的一种液体的实施方案中，例如在用于连接到一个静脉给药的线路或导液管的一种无菌袋中，一种ASSC的存在对该配制品是有益的。
除稳定有待给药的替代蛋白质之外，ASSC的存在可以使该替换蛋白质配制品能够被存储在大约7.0-7.5的中性pH值下。这将会对通常必须被存储在低pH值下才能保持稳定性的一些蛋白质是有益的。例如，一些溶酶体酶(如GAA)典型地在低pH值下保持一种稳定的构象(例如5.0或更低)。然而，在低pH值下该替换蛋白质延长的存储可以促进该酶和/或配制品的降解。
6.实例
借助以下提出的实例对本发明进一步描述。这些实例的使用仅仅是说明性的并且绝不会限制本发明或任何示例术语的范围以及意义。同样地，本发明不限于在此描述的任何具体的优选实施方案。实际上，根据阅读此说明书本发明的许多修改以及变化对于本领域的普通技术人员将会是清楚的。因此本发明仅仅将是受到所附权利要求的术语连同被这些权利要求赋予权利的等效物的全部范围的限制。
实例1：酸α-葡萄糖苷酶经热攻击的稳定性
通过一种热稳定性测定确定了重组人类GAA(Genzyme公司)在100μM的ASSC1-脱氧野尻霉素盐酸盐(DNJ)的存在或不存在下的稳定性，该稳定性测定利用热量来诱导蛋白质变性。使用一种SYPRO橙色染料对变性进行监测，该SYPRO橙色染料在结合到疏水性氨基酸(它们不会暴露在一种折叠的蛋白质中)上时会发荧光。
在pH7.4下对两种配制品进行了热稳定性测试，该pH值对应着ER的pH值。如图1所示，在7.4pH下包含100μM DNJ的配制品在很大程度上需要更大的热量来变性，并且因此该配制品与在pH7.4下没有ASSC的配制品相比是更稳定的。
实例2：1-脱氧野尻霉素防止酸α-葡萄糖苷酶在37℃下经延长的培养的活性损失
对四种配制品进行残余的GAA活性测定：
(1)在pH7.4下只有Myzozyme；
(2)在pH7.4下Myzozyme加50μM DNJ；
(3)在pH5.2下只有Myzozyme；
(4)在pH5.2下Myzozyme加50μM DNJ。
基于经24小时的初始活性(t＝0)的％，对活性进行了测定。基于在0、3、6以及24小时下荧光底物4-MU-α-葡萄糖的水解对样品进行了GAA酶活性测定。该GAA活性表达为初始活性的％，例如：残余活性。
如图2A所示，上面的配制品(1)(没有该ASSC)随着时间的推移会失去活性，从而在给药24小时后仅具有其初始活性的大约20％。相比而言，配制品(2)保持的最多，如果不是其所有初始活性保持经24小时。在pH5.2下的两种配制品(以上的配制品(3)和(4))经24小时都维持了它们大部分的初始活性。
为了确定初始酶活性的损失是否与未能维持一种合适的构象相关，在以上的这些样品上如在实例1中通常描述的进行了一种SYPRO橙色热稳定实验。在这个热稳定实验中，在配制品(2)和(4)中将DNJ的浓度下降到10μM。基于此实验，在图2B中对折叠的GAA的％进行了估计并且作图。在图2B中对于配制品(1)折叠的GAA量经24小时的降低与图2A中所示的对于此相同的一般配制品的活性损失是相关的。
实例3：DNJ增加了GAA经热攻击的稳定性
在四种组合物上进行了如通常在实例1中所描述的一种热稳定性实验：
(1)只有Myzozyme的组合物；
(2)Myzozyme加1μM1-DNJ-HCl；
(3)Myzozyme加10μM1-DNJ-HCl；
(4)Myzozyme加100μM1-DNJ-HCl；
如图3中所示，如通过GAA的熔化温度的增加而明显的，DNJ-HCl以一种剂量依赖的方式增加了GAA热稳定性。
实例4：异桑叶生物碱(IFG)增加了酸β-葡萄糖苷酶经热攻击的稳定性
在GCase的三种组合物上进行了如通常在实例1中描述的一种热稳定性实验：
(1)只有GCase的组合物；pH7.4
(2)GCase加10μM的IFG；pH7.4
(3)GCase加100μM的IFG；pH7.4
如图4中所示，如通过该蛋白质的熔化温度的增加而明显的，IFG以一种剂量依赖的方式增加了GCase的热稳定性。
实例5：在IFG的存在下GCase的热稳定性
对三个配制品确定了解折叠的GCase的百分比：
(1)在pH5.2下，只有GCase
(2)在pH7.4下，只有GCase
(3)GCase与10μM IFG；pH7.4
为了确定在37℃以及中性pH值下IFG是否防止GCase解折叠，如通常在实例1中描述的在上面的这些样品上进行了一种SYPRO橙色热稳定性实验。在此热稳定性实验中，在配制品(3)中IFG的浓度是10μM。基于图5中的这些结果，在这些特定的条件下IFG防止了GCase解折叠。
实例6：1-脱氧野尻霉素(DGJ)增加了α-Gal A经热攻击的热稳定性
在α-Gal A的三种组合物上进行了如通常在实例1中描述的一种热稳定性实验：
(1)只有α-Gal A的组合物；pH7.4
(2)α-Gal A加10μM DGJ；pH7.4
(3)α-Gal A加100μM DGJ；pH7.4
如图6中所示，如通过该蛋白质的熔化温度的增加而明显的，DGJ以一种剂量依赖的方式增加了α-Gal A的热稳定性。
实例7：药物分子伴侣增加了来自瞬时转染的COS-7细胞的重组蛋白质的活性水平
用一个空载体、为GBA基因编码的一个质粒、或为GLA基因编码的一个质粒对COS-7细胞进行了瞬时转染。用100μM的指示的药物分子伴侣(IFG、DGJ或DNJ)对这些各种瞬时转染进行培养。在48小时的蛋白质表达后，收获了来自每个转染的条件培养基，并且在用伴刀豆球蛋白A-琼脂糖微球捕获分泌的蛋白质之后对酸β-葡萄糖苷酶或α-Gal A活性的水平进行了评估。在使用这些适当的荧光基质(用于葡萄糖苷酶的4-MU-β-葡萄糖；用于α-Gal A的4-MU-β-葡萄糖)进行活性确定的过程中，此伴刀豆球蛋白A捕获步骤对通过这些药物分子伴侣消除酶活性的潜在抑制是必需的。
如图7中所示，用IFG或DGJ的培养分别地增加了酸β-葡萄糖苷酶或α-Gal A的活性。当在酸β-葡萄糖苷酶的瞬时表达中对DNJ进行培养时，没有看到酶活性的增加。此观察表明酶活性的增加是由于与一种蛋白质的已知的药物分子伴侣和/或抑制剂的一些特定的相互作用。
* * *
本发明在范围上将不会受到在此描述的这些具体实施方案的限制。实际上，从前面的描述以及这些附图来看，除在此描述的那些之外，本发明的各种修改对本领域的普通技术人员将变的清楚。这些修改旨在落入所附权利要求的范围之内。
对专利、专利申请书、公布、产品说明书、GenBank登录号以及实验方案的引用遍及此申请，出于所有目的本申请的这些披露通过引用以其整体结合在此。

Claims (16)

1.一种改善重组酸β-葡萄糖苷酶生产的方法，该方法包括：
将宿主细胞与对于该重组酸β-葡萄糖苷酶特异的药物分子伴侣进行体外接触，其中该宿主细胞表达该重组酸β-葡萄糖苷酶；和
从该宿主细胞中纯化该重组酸β-葡萄糖苷酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中该宿主细胞是哺乳动物细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中该药物分子伴侣是选自下组，该组由以下各项组成：异桑叶生物碱、C-苯甲基异桑叶生物碱、N-烷基(C9-12)-DNJ、葡糖并咪唑、C-烷基-IFG、N-烷基-β-井冈霉烯胺、氟奋乃静、N-十二烷基-DNJ、打碗花素A3、打碗花素B1、打碗花素B2以及打碗花素C1。
4.如权利要求3所述的方法，其中该药物分子伴侣是异桑叶生物碱。
5.如权利要求1所述的方法，其中该宿主细胞是选自下组，该组由以下各项组成：CHO细胞、HeLa细胞、HEK-293细胞、293T细胞、COS细胞、COS-7细胞、小鼠原代成肌细胞以及NIH3T3细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中将宿主细胞与对于该重组酸β-葡萄糖苷酶特异的药物分子伴侣接触使得该重组酸β-葡萄糖苷酶稳定为合适的野生型构象，该构象在该细胞的内质网中不被降解。
7.如权利要求1所述的方法，其中将宿主细胞与对于该重组酸β-葡萄糖苷酶特异的药物分子伴侣接触降低了与该重组酸β-葡萄糖苷酶的过量表达相关的内质网应激。
8.如权利要求1所述的方法，其中将宿主细胞与对于该重组酸β-葡萄糖苷酶特异的药物分子伴侣接触增加了该重组酸β-葡萄糖苷酶到该细胞的内质网外部的输出。
9.如权利要求1所述的方法，其中将宿主细胞与对于该重组酸β-葡萄糖苷酶特异的药物分子伴侣接触增加了该重组酸β-葡萄糖苷酶到细胞外部的分泌，并且分泌的重组酸β-葡萄糖苷酶是被纯化的。
10.如权利要求1所述的方法，其中将宿主细胞与对于该重组酸β-葡萄糖苷酶特异的药物分子伴侣接触增加了该重组酸β-葡萄糖苷酶在大于5.0的pH值下的稳定性。
11.如权利要求1所述的方法，还包括将纯化的重组酸β-葡萄糖苷酶在大于5.0的pH值下存储。
12.如权利要求1所述的方法，其中该重组酸β-葡萄糖苷酶被纯化为纯度是至少95％。
13.如权利要求1所述的方法，其中纯化该重组酸β-葡萄糖苷酶包括硫酸铵沉淀、含有疏水性相互作用树脂的柱色谱、将该重组酸β-葡萄糖苷酶与阳离子交换树脂接触、将该重组酸β-葡萄糖苷酶与阴离子交换树脂或将该重组酸β-葡萄糖苷酶与色谱聚焦树脂接触。
14.一种改善重组酸β-葡萄糖苷酶生产的方法，该方法包括：
将表达该重组酸β-葡萄糖苷酶的CHO宿主细胞与异桑叶生物碱或它的盐进行体外接触；和
从该宿主细胞中纯化该重组酸β-葡萄糖苷酶，其中该异桑叶生物碱或它的盐以增加该重组酸β-葡萄糖苷酶在纯化期间的稳定性的有效量与该宿主细胞接触。
15.如权利要求14所述的方法，还包括存储经纯化的重组酸β-葡萄糖苷酶，其中该异桑叶生物碱增加该重组酸β-葡萄糖苷酶在纯化期间的稳定性，并且其中该重组酸β-葡萄糖苷酶的稳定性大于未与该异桑叶生物碱接触的重组酸β-葡萄糖苷酶的稳定性。
16.如权利要求14所述的方法，还包括将纯化的重组酸β-葡萄糖苷酶在大于5.0的pH值下存储。
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