JP2022523104A - グルコセレブロシダーゼポリペプチド - Google Patents

グルコセレブロシダーゼポリペプチド Download PDF

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Abstract

本発明は、グルコセレブロシダーゼ調製物、その使用、および特にグルコセレブロシダーゼ欠損を伴う状態、たとえば、ゴーシェ病およびグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーの治療においてそれを利用する方法を提供する。本発明は、グルコセレブロシダーゼ調製物、その使用、およびそれを利用する方法を提供する。本発明者らは、本グルコセレブロシダーゼ調製物が、グルコセレブロシダーゼ欠損が関与する状態、たとえば、ゴーシェ病およびグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーにおける治療介入の手段を示すことを実験により確認した。

Description

本発明は、広義には、酵素補充療法（ＥＲＴ）の分野に関し、より正確には、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）の処置における使用のためのポリペプチド産物の分野に関する。詳細には、本発明は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチド、ならびに関連する産物、使用、および方法に関する。
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソームにおける貯蔵産物の分解に関与する分解酵素の活性障害に起因する、その貯蔵産物の蓄積を特徴とする、多様な遺伝性代謝障害群である。貯蔵産物の蓄積は、細胞の機能障害および進行性の臨床的症状発現をもたらす。リソソーム酵素活性、特に、リソソームヒドロラーゼ活性の欠損は、酵素補充療法（ＥＲＴ）によって正すことができるが、ただし、投与される酵素を、罹患細胞のリソソームへと効果的に標的することができることを条件とする。現在では、ＥＲＴは、ＬＳＤ、特に、全身性ＬＳＤを処置するための好ましい介入方針である。
グルコセレブロシダーゼ（β－グルコセレブロシダーゼ、ＧＣアーゼ、ＧＣ、リソソーム酸性グルコシルセラミダーゼ）は、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）およびグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）などの糖脂質の加水分解に必要とされる可溶性リソソーム酵素である。ゴーシェ病は、グルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子における変異によって引き起こされるリソソーム蓄積症であり、ある特定の細胞型、主としてマクロファージのリソソームにおいて酵素の基質の毒性蓄積をもたらすが、他の細胞型にも同様に罹患し得る。この代謝障害は、複数の臨床症状、たとえば、貧血、血小板減少症、肝脾腫大、骨病理、および一部の場合には神経学的症状によって特徴付けられる、多系統疾患を呈する。
ゴーシェ病の３つの異なる形態は、臨床的に十分に説明されている。もっとも多く生じる形態は、いわゆる非神経障害性形態（１型ＧＤ、ＧＤ１）であり、これは、本質的に、原発性ＣＮＳの関与が欠如したマクロファージ障害である。１型ＧＤを有する患者は、ほとんど無症状のものから、小児期発症疾患を呈するものまでの範囲にわたる、多様な身体症状を示し得る（Ｃｈａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｇａｕｃｈｅｒ ｒｅｇｉｓｔｒｙ： ｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ １６９８ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇａｕｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． ２０００， ｖｏｌ． １６０， ２８３５－４３）。少数の患者は、間質性肺疾患および肺性高血圧を含め、肺の関与によって特徴付けられる（Ｍｉｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ． Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｔｙｐｅ １ Ｇａｕｃｈｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ． ２００２， ｖｏｌ． ７７， ９１－８）。２型ＧＤは、２歳よりも前に症状が発症し、疾患症状発現が急速に進行する、急性神経障害性形態である。これは、眼球運動異常に始まり、続いて精神運動発達が制限される、重度の神経障害によって特徴付けられる。通常、障害の発症から最初の２年以内に死亡する。３型ＧＤは、亜急性または慢性神経障害性バリアントであり、様々な程度の全身および神経の両方の関与を特徴とする。後者は、通常、２型と比較して晩年に出現し、異常な眼球運動、けいれん、および認知症が含まれる。患者は、２０歳代または３０歳代まで生存し得る（Ｋｒａｏｕａ ｅｔ ａｌ． Ａ Ｆｒｅｎｃｈ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｙｐｅ ３ Ｇａｕｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ １０ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ． ２０１１， ｖｏｌ． ３３， １３１－９）。神経障害性ゴーシェ病（ｎＧＤ）における病理の症状発現は、部分的に、基質の蓄積、およびそれに続くニューロン細胞の機能不全に起因することが、一般に受け入れられている（Ｋｏｒｋｏｔｉａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ ｌｅｖｅｌｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｔｏｒｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９９， ｖｏｌ． ２７４， ２１６７３－８）（Ｐｅｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｗｉｔｈ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ ｔｏ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｂｙ ｉｍｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ． Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ． ２０００， ｖｏｌ． ２３， １７５－８４）。ｎＧＤ患者は、脳における病理症状によって特徴付けられるが、患者らは、疾患の末梢症状発現も有する。
近年、ＧＣアーゼ欠損とアルファ－シヌクレイン凝集との間の関連性も現れており、とりわけ、パーキンソニズムおよびパーキンソン病を含むグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーが、重要な神経学的障害群として特定され、グルコセレブロシダーゼに基づく治療が、可能性として有望な処置戦略として特定されている（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ２０１４， ｖｏｌ． １０， １３５０－１、Ｏ’Ｒｅｇａｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ Ｄｉｓ． ２０１７， ｖｏｌ． ７， ４１１－４２２、Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１６， ｖｏｌ． ２５， ２６４５－６０、Ｓａｒｄｉ ｅｔ ａｌ． Ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ＣＮＳ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｇａｕｃｈｅｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１３， ｖｏｌ． １１０， ３５３７－４２）。
現在のところ、ゴーシェ病の治癒は存在しない。しかしながら、組換えＧＣアーゼの静脈内（ＩＶ）投与により、欠損した酵素を部分的に補充する酵素補充療法（ＥＲＴ）は、１型ＧＤの症状の緩和のための承認された処置である。特に、マクロファージにおけるマンノース受容体に媒介される取込みを改善するために末端マンノース残基を有するＮ－グリカンを保持するヒトＧＣアーゼの組換え発現に基づいて、３つの異なる酵素調製物、イミグルセラーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））、ベラグルセラーゼアルファ（ＶＰＲＩＶ（登録商標））、およびタリグルセラーゼアルファ（Ｅｌｅｌｙｓｏ（登録商標））が、１型ＧＤを管理するためのＥＲＴとして承認されている。
これらの酵素調製物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できないため、神経障害性形態のゴーシェ病の処置には使用されない。さらに、罹患マウスの脳内へのそのような酵素の直接的な送達に関する前臨床研究は、限られた成果しか示さなかった（Ｃａｂｒｅｒａ－Ｓａｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｉｃ Ｇａｕｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１０， ｖｏｌ． ２２５， ４３６－４４）。したがって、２型および３型の神経障害性ゴーシェ病に現在利用可能な処置選択肢は存在しない。
さらに、米国特許第８，９６２，５６４号は、ヒトＧＣアーゼの安定性を改善し、それによって中性ｐＨおよび体温条件下において、酵素活性の保持時間を増加させることを目的として、アミノ酸Ｆ３１６位、Ｌ３１７位、Ｋ３２１位、またはＨ１４５位における変動を有するバリアントヒトＧＣアーゼタンパク質を開示している。この著者らは、Ｆ３１６位またはＬ３１７位における変動が、活性部位の近傍においてより秩序だった構成を形成し、生理学的条件下において望ましくない不安定化を受ける傾向が低くなるであろうこと、変動Ｋ３２１Ｎが、活性部位の近傍でα－ヘリックスを安定化させ、それによって触媒部位のより開いたかつ活性な構成がもたらされるであろうこと、ならびに触媒部位の近傍ではないランダムコイル領域における変動Ｈ１４５Ｌが、隣接する二次構造のアミノ酸残基間でのより良好な相互作用を促進するであろうことを提唱した。
ＷＯ０３／０５６８９７は、リン酸化ＧＣアーゼを調製するための方法を教示しており、ここでは、ＧＣアーゼを、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃからグリカンの１，２－連結型マンノースの６位へのＧｌｃＮＡｃ－１－リン酸の移動を触媒する、単離されたＮ－アセチルグリコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）ホスホトランスフェラーゼで酵素的に処置し、続いて、Ｎ－アセチルグルコサミンの、ＧｌｃＮＡｃ－リン酸改変グリカンからの除去を触媒するＮ－アセチルグルコサミン－１－ホスホジエステルα－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ホスホジエステルα－ＧｌｃＮＡｃアーゼ）で処置して、グリカンに末端マンノース－６－リン酸を生成する。ＷＯ０３／０５６８９７は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムに連結されたマンノース－６－リン酸受容体に結合するＧＣアーゼが、リン酸化処置によって増加することを実験的に示している。ＷＯ０３／０５６８９７は、いずれの生物系においてもリン酸化ＧＣアーゼについて調べていない。
米国特許第８，９２６，９６７号およびＤｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ＣＮＳ ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ Ａ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００９， ｖｏｌ． ２１５， ３４９－３５７）は、酸性スフィンゴミエリナーゼノックアウト（ＡＳＭＫＯ）マウスにおけるリソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）の脳室内投与について考察している。ＡＳＭ酵素の調製および構造は、開示されていない。
米国特許第８，９６２，５６４号明細書 国際公開第２００３／０５６８９７号 米国特許第８，９２６，９６７号明細書
本発明は、グルコセレブロシダーゼ調製物、その使用、およびそれを利用する方法を提供する。本発明者らは、本グルコセレブロシダーゼ調製物が、グルコセレブロシダーゼ欠損が関与する状態、たとえば、ゴーシェ病およびグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーにおける治療介入の手段を示すことを実験により確認した。
したがって、ある態様では、本発明は、グルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％が、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、調製物または組成物を提供する。
さらなる態様は、治療において使用するための、グルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％が、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、調製物または組成物を提供する。
関連する態様は、それを必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、予防または治療有効量のグルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物を投与するステップを含み、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％が、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、方法を提供する。
別の態様は、グルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、調製物または組成物を提供する。
さらなる態様は、治療において使用するための、グルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、調製物または組成物を提供する。
関連する態様は、それを必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、予防または治療有効量のグルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物を投与するステップを含み、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、方法を提供する。
本発明のこれらのおよびさらなる態様ならびに好ましい実施形態は、以下の節および添付の特許請求の範囲に記載されている。添付の特許請求の範囲の主題は、これにより本明細書に具体的に組み込まれる。
図１は、前臨床研究において使用されるヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）バリアントを概略的に示す。「Ｌ２ｐｒｅ」は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ＹＬ）リパーゼ２（Ｌｉｐ２）タンパク質に由来するシグナルペプチドを指し、「ＧＣアーゼ」は、ポリペプチドのヒトＧＣアーゼ部分を指し、「Ｈｉｓ８」または「Ｈ８」は、ポリヒスチジンタグ８×Ｈｉｓを指し、「Ｈ１４５Ｌ」および「Ｋ３２１Ｎ」は、ヒト野生型（ＷＴ）ＧＣアーゼ配列と比較したアミノ酸置換を指す。
図２は、本発明を具現化する脱キャッピングおよび脱マンノシル化されたＧＣアーゼポリペプチドのうちの１つの単離されたＮ－グリカンの代表的なＤＳＡ－ＦＡＣＥ電気泳動図を、ピーク注釈を含めて示す図である（Ｍ＝マンノース残基、Ｐ＝リン酸残基）。
図３は、図２において注釈されたＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ ３－Ｐ）、ＰＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ ４－Ｐ）、ＰＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ ５－Ｐ）、Ｐ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ５－（Ｐ）２）、およびＰ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍａｎ６－（Ｐ）２）Ｎ－グリカン構造のモジュール図である。円形＝マンノース残基、正方形＝Ｎ－アセチルグリコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基、波線＝タンパク質骨格への結合点。
図４は、本発明を具現化する脱キャッピングおよび脱マンノシル化されたＧＣアーゼポリペプチドのうちの１つ（上部パネル）、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（中央パネル）、およびＶＰＲＩＶ（登録商標）（下部パネル）の単離されたＮ－グリカンの代表的なＤＳＡ－ＦＡＣＥ電気泳動図を、二リン酸化（２Ｐ）、一リン酸化（１Ｐ）、および非リン酸化（中性）Ｎ－グリカンに対応するピークの注釈を含めて示す。
図５は、ヒト神経芽細胞腫細胞による、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）に媒介されるＯｘｙＧＣアーゼ、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、またはＶＰＲＩＶ（登録商標）の正味の取込みの比較を示す。円形＝ＯｘｙＧＣアーゼ、菱形＝Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、三角形＝ＶＰＲＩＶ（登録商標）。
図６は、Ｍ６ＰまたはＭ６Ｐとマンナンとの組合せの添加ありまたはなしのいずれかでの、マウスミクログリアによるＯｘｙＧＣアーゼおよびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の取込みの比較を示す。
図７は、４ＭＵβＧｌｃ活性アッセイによって決定される、（ボーラス注射または緩徐注入のいずれかにより）Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスに脳室内（ＩＣＶ）注入したＯｘｙＧＣアーゼの血漿薬物動態（ＰＫ）曲線を示す。
図８は、４ＭＵβＧｌｃ活性アッセイによって決定される、１回目と４回目のＩＣＶボーラス（左パネル）、または１回目と４回目の緩徐注入（右パネル）を比較した、Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスに脳室内（ＩＣＶ）注入したＯｘｙＧＣアーゼの血漿薬物動態（ＰＫ）曲線を示す。
図９は、シクロフェリトール－エポキシド型の活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）、赤色ＭＤＷ９４１（左パネル）、およびβ－エポキシド開環（Ａ＝求核試薬、Ｂ＝一般的な酸性／塩基性触媒）によるＧＣアーゼの不可逆的阻害の機序（右パネル）を示す。
図１０は、それぞれ、１μＬ／分、０．１μＬ／分の流量で２分間（２ｍ）または２０分間（２０ｍ）のいずれかで注入した、野生型マウスの脳における片側ＩＣＶ注入したＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８の分布を示す。
図１１は、ＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８を、それぞれ、１μＬ／分、０．１μＬ／分の流量で、２分間（２分）または２０分間（２０分）片側ＩＣＶ注入した、野生型マウスの脳の注入部位レベル（切片の乾燥後にＦＬＡ－５０００スキャナーでスキャニング）での冠状脳スライス（約１００μｍ）を示す。
図１２は、ＣＳＦ、脳、および肝臓への２分間のＩＣＶ注入後１または３時間の時点における、ＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８の相対分布を示す。
図１３は、４ＭＵβＧｌｃアッセイによって決定される、１日おきの（ＥＯＤ）ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８での反復的な片側ＩＣＶ処置の最後の回から３時間後のＧＣアーゼ活性を、脳実質と脳室画分との対比で示す。ＷＴ＝野生型マウス、ＫＩ＝Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス、ｎ＝１群当たりの研究した動物の数。
図１４は、４ＭＵβＧｌｃアッセイによって決定される、ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８またはＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）での反復的な片側ＩＣＶ処置の最後の回から４８時間後のＧＣアーゼ活性を、脳線条体と皮質との対比で示す。ＷＴ＝野生型マウス、ＫＩ＝Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス、ｎ＝１群当たりの研究した動物の数、ＥＷ＝週１回、ＢＷ＝週２回（すなわち、１週間につき２回の注入）。
図１５は、示されるＯｘｙＧＣアーゼバリアントおよびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）での反復的な片側ＩＣＶ処置の最後の回から４８時間後の、脳半球（Ａ）または肝臓（Ｂ）におけるＧＣアーゼ活性を示す。結果は、異なるｉｎ ｖｉｖｏ実験によって得られた。すべての処置は、１０～２０分間のボーラス注射によって行われたが、ＯｘｙＧＣアーゼは、３時間の期間にわたって緩徐に注入した「ｉｎ」で示される群は除く。ＷＴ＝野生型マウス、ＫＩ＝Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス、ＥＷ＝週１回、ＢＷ＝週２回（すなわち、１週間につき２回の注入）。 同上。
図１６は、ａｌｐｈａＬＩＳＡによって決定される、一日おきの（ＥＯＤ）ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８での反復的な片側ＩＣＶ処置の最後の回から３時間後のヒトＧＣアーゼタンパク質レベルを、脳実質と脳室画分との対比で示す。ＷＴ＝野生型マウス、ＫＩ＝Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス。
図１７は、脳におけるＨｅｘＳｐｈレベルによって決定される、ＯｘｙＧＣアーゼバリアントおよびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の片側ＩＣＶ注射時のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性の概要を示す。結果は、Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩ対照レベルに対するＨｅｘＳｐｈパーセントとして表す。ＷＴおよびＫＩ対照に対するｐ値は、それぞれ、底部および上部の線に示される：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ ｐ＞０．０５（一方向ＡＮＯＶＡおよび多重比較補正を伴う事後ボンフェローニ）。ｎ＝研究群当たりの分析した試料の総数であり、異なるｉｎ ｖｉｖｏ実験からプールされていた。ＷＴ＝野生型マウス、ＫＩ＝Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス、ＥＷ＝週１回、ＢＷ＝週２回（すなわち、１週間につき２回の注入）、ＥＯＤ＝１日おき、ＡＢＸ＝アンブロキソール。
図１８は、個々のマウスの脳におけるＨｅｘＳｐｈとＧＣアーゼ活性レベルとの間の相関を示す。
図１９は、異なる脳領域における反復的なＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８およびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）処置時の、組織１ｍｇ当たりのｐｇでのＧｌｃＳｐｈレベルを示すグラフである（ビヒクル処理したＷＴ ＨｅｘＳｐｈレベルをＫＩレベルから差し引くことによって計算した）。対照ＫＩレベルに対する％としてのＧｌｃＳｐｈを、それぞれのデータ点の上に記す。ＫＩ＝Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス、ＥＷ＝週１回、ＢＷ＝週２回（すなわち、１週間につき２回の注入）。
図２０は、脳半球の細胞選別後の試料においてＲＰ－ＬＣ－Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ分析によって決定される、ＨｅｘＳｐｈレベルを示すグラフである（細胞１ｍｇ当たりのｐｇ、１０６個の細胞当たり１ｍｇの重さであると仮定（Ｓｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｏｄｙ． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． ２０１６， ｖｏｌ． １４， ｅ１００２５３３））。ＷＴ＝野生型マウス、ＫＩ＝Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス、ＥＷ＝週１回。
図２１は、肝臓におけるＨｅｘＳｐｈレベルによって決定される、ＯｘｙＧＣアーゼバリアントおよびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の片側ＩＣＶ注射時のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性の概要を示す。結果は、Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩ対照レベルに対するＨｅｘＳｐｈパーセントとして表す。ＷＴおよびＫＩ対照に対するｐ値は、それぞれ、下段および上段に示される：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ ｐ＞０．０５（一方向ＡＮＯＶＡおよび多重比較補正を伴う事後ボンフェローニ）。ｎ＝研究群当たりの分析した試料の総数であり、異なるｉｎ ｖｉｖｏ実験からプールされていた。ＷＴ＝野生型マウス、ＫＩ＝Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス、ＥＷ＝週１回、ＥＯＤ＝１日おき、ＡＢＸ＝アンブロキソール。
図２２は、ＩＣＶによりＯｘｙＧＣアーゼで処置したＧｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスに由来する血漿における抗ＧＣアーゼ抗体力価を示す。力価は、プレートの分断点（ｃｕｔ ｐｏｉｎｔ）の内挿であった（使用したもっとも低い希釈において異なるマウスから得られたナイーブ血漿の平均の３倍）。血漿試料は、２回の独立した実験から得られたものであり、これは、異なる時点で収集された：すべての群について投薬前および２４時間、さらに、６時間（８回目のボーラス）後または４８時間（１２回目のボーラス）後。ｎ＝１群当たりのマウスの数。
図２３は、Ｙａｒｒｏｗｉａ特異的発現構築物の概略図である。ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム、ＯＲＩ：複製起点、Ｙｌ：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、ゼータ１／２：Ｙａｒｒｏｗｉａゲノムへのランダムな組込みの割合を増加させるＹａｒｒｏｗｉａ特異的配列。Ｙａｒｒｏｗｉａへの形質転換の前に、プラスミドを、ＮｏｔＩで消化させて、細菌配列を除去する。
図２４は、週１回で４回のＯｘｙＧＣアーゼバリアントおよびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）でのＩＶ処置の最後の回から２４時間後の、マウスの肝臓におけるＧＣアーゼ活性を示す。示される結果は、異なるｉｎ ｖｉｖｏ実験の組合せである。
図２５は、ＷＴまたはＧｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスにおける週１回で４回のビヒクル、または３０Ｕ／ｋｇのｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）、ｈｕＧＣアーゼ、またはＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）のＩＶ注射の最後の回から２４時間後の、肝臓（左上部）、脾臓（右上部）、心臓（左下部）、および肺（右下部）におけるＨｅｘＳｐｈレベル（ｐｇ／ｍｇ組織）を示す。ＷＴおよびＫＩ対照に対するｐ値は、それぞれ、上段および下段に示される：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ｎｓ ｐ＞０．０５（一方向ＡＮＯＶＡおよび多重比較補正を伴う事後ボンフェローニ）。データは、２回の独立したｉｎ ｖｉｖｏ実験から得られる。
図２６は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における１０ｍｇまたは５０ｍｇのＯｘｙ５５９５（実施例に記載されるｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ））での１回、４回、８回、１２回、および１９回のＩＣＶ注入後７２時間にわたるＣＳＦ（左パネル）および血漿（右パネル）における、雄性と雌性を組み合わせた活性ＧＣアーゼの濃度－時間曲線を示す。点線は、アッセイ（合成基質４ＭＵβＧｌｃでのＧＣアーゼ活性測定）の定量限界を示す。
図２７は、脳パンチの概要を提供する図である。１＝前頭皮質、２＝線条体－尾状核、３＝頭頂皮質、４＝視床、５＝海馬、６＝脳橋、７＝延髄、８＝後頭皮質、９および１０＝小脳。
図２８は、４ＭＵβＧｌｃアッセイによって決定される、ビヒクル、１０ｍｇ、または５０ｍｇのＯｘｙ５５９５での２３回目のＩＣＶ処置から４８時間後の、ＮＨＰの異なる脳領域における活性ＧＣアーゼレベル（脳組織１ｇ当たりのｎｇ）を示す。
図２９は、４ＭＵβＧｌｃアッセイによって決定される、ビヒクル、１０ｍｇ、または５０ｍｇのＯｘｙ５５９５での２３回目のＩＣＶ処置から４８時間後の、ＮＨＰの異なる脳領域における活性ＧＣアーゼの濃度を示す。
図３０は、１０ｍｇまたは５０ｍｇのＯｘｙ５５９５での２３回目のＩＣＶ処置から４８時間後の、ＮＨＰの異なる脳領域における活性ＧＣアーゼのビヒクルに対する増加パーセントを示す。
図３１は、５０ｍｇのＯｘｙ５５９５での２３回のＩＣＶ処置時のカニクイザルの脳におけるＯｘｙ５５９５分布の概略図である。矢状正中線切片（左パネル）および冠状切片（右パネル）。
図３２は、マウスにおける異なる脳領域に達する活性Ｏｘｙ５５９５の量を、ＮＨＰと比較して示す。
本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明確に示されない限り、単数形および複数形の両方の参照物を含む。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の言及されていないメンバー、要素、または方法ステップを除外するものではない。この用語はまた、特許用語において十分に確立した意味をなす「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」も包含する。
端点による数値範囲の記述は、それぞれの範囲内のすべての数字および分数、ならびに記載された端点を含む。これは、「．．．から．．．」という表現で表されるか、「．．．と．．．との間」という表現で表されるか、別の表現で表されるかに関係なく、数値範囲に適用される。
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、測定可能な値、たとえば、パラメーター、量、時間範囲、およびその他に言及して本明細書で使用される場合、指定される値の、およびそれからの変動、たとえば、その指定される値の±１０％またはそれを下回る、好ましくは±５％またはそれを下回る、より好ましくは±１％またはそれを下回る、なおもさらに好ましくは±０．１％またはそれを下回る変動を包含することを、そのような変動が本開示の発明を実行するのに適している範囲で意味する。修飾語「約」または「およそ」が指す値は、それ自体も、具体的かつ好ましく開示されることを理解されたい。
「１つまたは複数の」または「少なくとも１つの」という用語、たとえば、メンバーの群のうちの１つもしくは複数のメンバーまたは少なくとも１つのメンバーは、さらなる例示によってそれ自体明確であり、この用語は、とりわけ、前記メンバーのうちのいずれか１つ、または前記メンバーのうちのいずれか２つもしくはそれよりも多く、たとえば、前記メンバーのうちのいずれか３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上など、および最大で前記メンバーすべてへの言及を包含する。別の例では、「１つまたは複数の」または「少なくとも１つの」は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれよりも多くを指し得る。
本明細書における本発明の背景技術の考察は、本発明の文脈を説明するために含まれている。これは、参照された材料のいずれかが、特許請求の範囲のうちのいずれかの優先日の時点において、いずれかの国において公開されていたか、公知であったか、一般的な知識の一部であったという認識として解釈されるものではない。
本開示全体を通じて、様々な刊行物、特許、および公開特許明細書が、特定する引用によって参照される。本明細書において引用されているすべての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。具体的には、本明細書において具体的に参照されるそのような文書の教示または節が、参照により本明細書に組み込まれる。
別途定義されない限り、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、技術用語および科学用語を含め、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらなる案内を用いて、本発明の教示をより良好に理解するために、用語の定義が含まれる。具体的な用語が、本発明の特定の態様または本発明の特定の実施形態と関連して定義される場合、そのような含意または意味は、別途定義されない限り、本明細書全体を通じて、すなわち、本発明の他の態様または実施形態の文脈においても適用されることが意図される。
以下の節において、本発明の異なる態様または実施形態が、より詳細に定義されている。そのようにして定義されるそれぞれの態様または実施形態は、そうでないことが明確に示されない限り、任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。具体的には、好ましいかまたは有利であると示された任意の特性を、好ましいかまたは有利であると示された任意の他の１つまたは複数の特性と組み合わせることができる。
本明細書全体を通じて、「一実施形態」、「ある実施形態」への参照は、実施形態と関連して記載される特定の特性、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて様々な箇所における「一実施形態では」または「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に言及しているとは限らないが、言及している場合もある。さらに、特定の特性、構造、または特徴は、本開示から当業者には明らかなように、１つまたは複数の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載される一部の実施形態は、他の実施形態に含まれる一部の特性を含むが他の特性は含まず、異なる実施形態の特性の組合せは、当業者には理解されるように、本発明の範囲内であり、異なる実施形態を形成することが意図される。たとえば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれも、任意の組合せで使用することができる。
本明細書に含まれる実験データは、本発明の原理を具現化したいくつかの例示的なグルコセレブロシダーゼ調製物が、神経障害性グルコセレブロシダーゼ欠損、より具体的には、３型ゴーシェ病およびパーキンソン病の関連動物（マウス）モデルの片側脳室内（ＩＣＶ）処置の際に、より深層の脳構造を含め、脳の両半球へのＧＣアーゼ酵素の迅速かつ均等な分布をもたらし、そこで、ＧＣアーゼ酵素が、ニューロンを含むすべての細胞型においてＧＣアーゼ基質を効率的に低減させたことを示す。このことは、ニューロン集団によって取り込まれず、したがって、ゴーシェ病の現在市販利用可能なすべての他の酵素補充療法と同様に、神経障害性グルコセレブロシダーゼ欠損のＣＮＳ関連症状を処置するための治療的に実行可能な手段を表すものではない、イミグルセラーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））とは極めて対照的であった。
本発明者らは、後者が、罹患したニューロン細胞によるＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の不十分な取込みに起因すると仮定する。Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）および他のゴーシェ病に現在利用可能なＥＲＴ療法は、比較的低いレベルの一リン酸化グリカンを有し、実質的に、検出可能な二リン酸化グリカンを有さず、主として中性グリカンを有する。これは、マンノース受容体（ＭＲ）を介したマクロファージ（１型ゴーシェ病）による細胞取込みには適切であり得るが、本明細書に示されるように、形質膜上に少ししかＭＲを発現し得ないニューロン細胞については明らかに不十分であるかまたは有効ではない。本発明者らは、本明細書に開示されるＧＣアーゼにおける比較的高い程度のグリカンリン酸化により、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）受容体を介してニューロンを含むＣＮＳ細胞による効率的な取込みが可能になると仮定する。
さらに、例示的なＧＣアーゼ酵素はまた、基質を低減するのに十分な量で、末梢器官にも到達し、本明細書において教示されるＧＣアーゼ組成物を使用したＩＣＶ処置が、疾患の末梢症状も同様に改善し得、有益なことにＩＣＶと全身（介入）処置を組み合わせたアプローチの必要性を回避することを実証した。
したがって、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）調製物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％が、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、グルコセレブロシダーゼ調製物が、本明細書において提供される。また、グルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％が、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、組成物も、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、前記グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む。ある特定の実施形態では、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのうちの少なくともいくつかは、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む。したがって、ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％は、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含み、優先度の低いものから順に、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、前記グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含み、優先度の低いものから順に、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む。ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％は、グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、グリコシル化されている。したがって、ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％は、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含み、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％は、グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％は、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含み、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、前記グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含み、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％は、グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、前記グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含み、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、グリコシル化されている。
グルコセレブロシダーゼ調製物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、グルコセレブロシダーゼ調製物が、本明細書においてさらに提供される。また、グルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、組成物も、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの１０％を上回るものが、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含み、それぞれ、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの１５％を上回るか、または２０％を上回るか、または２５％を上回るか、または３０％を上回るか、または３５％を上回るか、または４０％を上回るか、または４５％を上回るものは、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む。したがって、ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含み、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む。ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％は、グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、グリコシル化されている。したがって、ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含み、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％は、グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含み、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含み、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％は、グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％は、２つのマンノース－６－リン酸部分を含み、優先度の低いものから順に、グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべては、グリコシル化されている。
ＧＣアーゼによって含まれるある特定の一般的または特異的なグリカン構造のパーセンテージ、たとえば、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのパーセンテージまたは２つのマンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのパーセンテージに言及されている場合、数字（またはモル量）によるパーセンテージが、具体的に意味され得る。例として、複数のグリカン１００個中、５０個またはそれよりも多くのグリカンが、マンノース－６－リン酸部分を含む場合、この複数物は、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含むグリカンを少なくとも５０％含むと称することができる。したがって、パーセンテージは、調製物または組成物によって含まれる複数のグルコセレブロシダーゼ分子によって含まれるグリカンの群またはプールに基づく。そのようなパーセンテージは、Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）処置によってＧＣアーゼからグリカンを放出させ、グリカンをＡＰＴＳ（８－アミノ－１，３，６－ピレントリスルホン酸三ナトリウム塩）で標識し、ＤＳＡ－ＦＡＣＥ（ＤＮＡシーケンサー補助フルオロフォア補助炭水化物電気泳動）を使用してグリカン構造を決定することなどによって、実施例に例示されている方法を使用して、グルコセレブロシダーゼ調製物または組成物の代表的な試料から容易に決定することができる。ＤＳＡ－ＦＡＣＥは、電荷および質量によってグリカンを分離させ、ピークプロファイル読み取りを提供し、ここで、それぞれのピークは、所与のグリカン構造を表す。ピーク面積により、それぞれのＮ－グリカン構造の量の相対表示が得られる。典型的には、数またはモル量による所与のグリカン構造のパーセンテージは、その重量パーセンテージに近似し得、いずれの場合にも、当業者であれば、それぞれのグリカン構造の分子量に基づいて、両方の種類のパーセンテージを計算し、それらの間で変換を行うことができる。
グリコシル化ＧＣアーゼ分子のパーセンテージについて言及されている場合、数（またはモル量）によるパーセンテージが、具体的に意味される。例として、複数のＧＣアーゼ分子１００個中、５０個またはそれよりも多くのＧＣアーゼ分子がグリコシル化されている場合、この複数物は、少なくとも５０％のグリコシル化ＧＣアーゼ分子を含むと称することができる。グリコシル化ＧＣアーゼ分子と非グリコシル化ＧＣアーゼ分子とは、好適には、たとえば、それらの異なる電気泳動移動度に基づいて、分離し、定量することができる。典型的には、グリコシル化ＧＣアーゼのパーセンテージは、その重量パーセンテージに近似し得、いずれの場合にも、当業者であれば、それぞれのＧＣアーゼ分子の分子量に基づいて、両方の種類のパーセンテージを計算し、それらの間で変換を行うことができる。
本発明は、したがって、本明細書に開示されるグルコセレブロシダーゼタンパク質またはポリペプチドによって具現化される。「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」という用語は、互換可能に使用することができ、隣接するアミノ酸残基間でのペプチド結合によって一緒に結合されたアミノ酸を含む、任意の天然、合成、または組換え分子を指す。「ペプチド結合」、「ペプチド連結」、または「アミド結合」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基が、他のアミノ酸のアミノ基と反応したときに２つのアミノ酸の間で形成される共有結合であり、それによって、水分子が放出される。ポリペプチドは、任意の供給源に由来し得、たとえば、天然に存在するポリペプチド、化学的に合成されたポリペプチド、組換え分子遺伝学技術によって産生されたポリペプチド、または細胞もしくは翻訳系に由来するポリペプチドであり得る。好ましくは、ポリペプチドは、組換え分子遺伝学技術によって産生されたポリペプチドである。ポリペプチドは、直鎖であってもよく、または球形状にフォールディングされていてもよい。「アミノ酸」および「アミノ酸残基」という用語は、本明細書において互換可能に使用され得る。さらに、文脈から明らかでない限り、本明細書における任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質への言及にはまた、前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の変更された形態、たとえば、発現後改変、たとえば、リン酸化、グリコシル化、脂質付加、メチル化、システイン化、スルホン化（ｓｕｌｐｈｏｎａｔｉｏｎ）、グルタチオン化、アセチル化、メチオニンからメチオニンスルホキシドまたはメチオニンスルホンへの酸化、およびその他のものも一般に包含され得る。
「グリカン」という用語は、広義には、遊離形態にあるか、または複合糖質、たとえば、糖タンパク質、プロテオグリカン、もしくは糖脂質の炭水化物部分を形成する、任意の単糖、オリゴ糖、または多糖を包含する。典型的にグリカン、たとえば、糖タンパク質グリカンに含まれる、単糖単位としては、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、シアル酸（ＳＡ）、キシロース（Ｘｙｌ）、および／またはフコースを挙げることができる。酵母細胞グリカンを含む真菌において典型的に見出される単糖単位としては、ＭａｎおよびＧｌｃＮＡｃを挙げることができる。グリカン内の単糖間での連結は、α－および／またはβ－形態であり得、鎖は、直鎖であっても分岐鎖であってもよく、必要に応じたグリカン改変としては、典型的に、アセチル化、リン酸化、および／またはスルホン化（ｓｕｌｐｈａｔｉｏｎ）を挙げることができる。糖タンパク質は、ＮまたはＯ結合を介してポリペプチドに共有結合で結合した１つまたは複数のグリカンを有する。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書において意図されるグリカンは、Ｎ－グリカンであり得る。少なくとも１つのグリカンを含むタンパク質またはポリペプチド、より具体的には、少なくとも１つのグリカンがそこに共有結合で連結されているもの、さらにより具体的には、少なくとも１つのＮ結合型またはＯ結合型グリカンを含むものは、一般に、「グリコシル化されている」と称される。例として、少なくとも１つのＯ結合型またはＮ結合型グリカンを含む、好ましくは少なくとも１つのＮ結合型グリカンを含み、たとえば、ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＮ結合型グリカンを含みＯ結合型グリカンを含まない、ＧＣアーゼ分子は、「グリコシル化」ＧＣアーゼ分子と称され得る。Ｏ－グリカンは、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基に連結されている。Ｎ－グリカンは、側鎖窒素を介して、アスパラギン残基に連結されている。天然に存在するＮ－グリカンは、２つのマンノース残基の共通の五糖領域を共有しており、α－１，３およびα－１，６連結によって中心のマンノースに別個に連結されており、これが、β－１，４連結によって、２つのβ－１，４連結したＧｌｃＮＡｃ残基からなるキトビオースコアに連結されている。五糖のさらなるプロセシングに基づいて、Ｎ－グリカンは、３つの主要なクラス：（ｉ）高マンノース型、（ｉｉ）複合型、および（ｉｉｉ）ハイブリッド型に分類される。
ある特定の実施形態では、グリコシル化ＧＣアーゼ分子は、少なくとも１つ、たとえば、厳密に１つのグリカン、より具体的にはＮ－グリカンを有してもよく、または好ましくは、少なくとも２つ、たとえば、厳密に２つのグリカン、より具体的にはＮ－グリカンを有してもよく、またはより好ましくは、少なくとも３つ、たとえば、厳密に３つのグリカン、より具体的にはＮ－グリカンを有してもよく、またはさらにより好ましくは、少なくとも４つ、たとえば、厳密に４つのグリカン、より具体的にはＮ－グリカンを有してもよい。たとえば、野生型ヒトＧＣアーゼは、４つのＮ－グリコシル化部位を含有するが、たとえば、ＷＯ０１／４９８３０において教示されるように、追加のＮ－グリコシル化部位を含むように操作されてもよい。ある特定の実施形態では、グリコシル化ＧＣアーゼ分子は、４つを上回る、たとえば、厳密に５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個のグリカン、より具体的にはＮ－グリカンを有してもよい。複数のグリコシル化ＧＣアーゼ分子は、それぞれ独立して１つまたは複数のグリカン、より具体的にはＮ－グリカンを有する、ＧＣアーゼ分子を含み得る。たとえば、複数のグリコシル化ＧＣアーゼ分子は、１つのＧＣアーゼ分子当たり、平均で、１．０～１．９個、または２．０～２．９個、または３．０～３．９個、または約４．０個のグリカン、より具体的にはＮ－グリカンを有し得る。
「少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む」という語句は、グリカン、より具体的にはＮ－グリカンが、１つまたは１つを上回るマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）部分、たとえば、厳密に１つまたは厳密に２つのＭ６Ｐ部分を含むことを指す。「２つのマンノース－６－リン酸部分を含む」という語句は、グリカン、より具体的にはＮ－グリカンが、２つ、たとえば、厳密に２つのＭ６Ｐ部分を含むことを指す。そのようなＭ６Ｐ部分は、共有結合、たとえば、グリコシド結合、より典型的にはα－１，２またはα－１，６グリコシド結合によって、グリカンの基礎単糖単位、たとえば、グリカンの基礎マンノース単位に連結されている。Ｍ６Ｐ部分では、リン酸基は、マンノース基のＣ６に連結されている。リン酸基は、露出している（たとえば、別の単糖単位、たとえば、別のマンノース単位によって、「キャッピング」されていない）。例示のために、マンノース－６－リン酸の代表的な構造を、以下に示す。
Figure 2022523104000001
リン酸基は、遊離酸形態（－ＯＰＯ（ＯＨ）２、または－ＯＰＯ２（ＯＨ）－およびＨ＋、もしくは－ＯＰＯ３ ２－および２Ｈ＋に解離されている）であってもよく、または塩の形態、特に、薬学的に許容される塩の形態であってもよく、たとえば、適切な有機または無機塩基での処置によって金属またはアミン付加塩の形態に変換されてもよい。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つ、たとえば、厳密に１つのマンノース－６－リン酸部分を含むグリカン、より具体的にはＮ－グリカンは、少なくとも、以下から選択されるコア構造を含むかまたはそれからなり：
Ｐ－６Ｍａｎα１－６Ｍａｎα１－６Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ （式Ｉ）、または
Ｐ－６Ｍａｎα１－２Ｍａｎα１－３Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃ （式ＩＩ）
式中、α１－２、α１－３、α１－６、およびβ１－４は、隣接する単糖単位間のグリコシド結合を指す。これらの構造はまた、図３、パネル「Ｍａｎ ３－Ｐ」においてモジュール方式で例示されており、ここで、式Ｉは、右手側の構造に対応し、ＩＩは、左手側の構造に対応する。
ある特定の実施形態では、２つ、たとえば、厳密に２つのマンノース－６－リン酸部分を含むグリカン、より具体的にはＮ－グリカンは、少なくとも、以下のコア構造を含むかまたはそれからなり：
Figure 2022523104000002
 式中、α１－２、α１－３、α１－６、およびβ１－４は、隣接する単糖単位間のグリコシド結合を指す。この構造はまた、図３、パネル「Ｍａｎ ５－（Ｐ）２」においてモジュール方式で例示されている。
ある特定の好ましい実施形態では、マンノース－６－リン酸部分のマンノースは、末端マンノースである。マンノースは、したがって、グリカンにおける基礎単糖単位とグリコシド結合を形成するが、基礎単糖単位と結果として生じる別の単糖単位との間には挟まれない。典型的には、グリコシド結合は、α－グリコシド結合、より具体的には、マンノースのＣ１原子を介したα－グリコシド結合であり得る。典型的には、基礎単糖単位は、マンノースであり得る。典型的には、グリコシド結合は、基礎マンノースへのα－１，２またはα－１，６グリコシド結合であり得る。
ある特定の好ましい実施形態では、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンは、それぞれ独立して、ＰＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれらからなる群より選択される。たとえば、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または実質的にすべてが、それぞれ独立して、これらの構造から選択され得る。そのようなＮ－グリカンの構造は、以下に示される構造ＰＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＰ２Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２から、Ｍａｎ－６－Ｐ残基以外の１つまたは（該当する場合は、逐次的に）複数の末端マンノース残基を、概念的に加水分解することによって、得ることができる。
式ＩＶ－ＰＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２
Figure 2022523104000003
 式Ｖ－ＰＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２：
Figure 2022523104000004
 式ＶＩ－Ｐ２Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２：
Figure 2022523104000005
ある特定の好ましい実施形態では、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンは、それぞれ独立して、ＰＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれらからなる群より選択され、これは、図３にもモジュール式で示されている。たとえば、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または実質的にすべてが、それぞれ独立して、これらの構造から選択され得る。
ある特定の好ましい実施形態では、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンは、それぞれ独立して、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれらからなる群より選択され、これは、図３にモジュール式で示されており、それぞれ、式ＩおよびＩＩ、ならびにＩＩＩにも示されている。たとえば、マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または実質的にすべてが、それぞれ独立して、これらの構造から選択され得る。
「グルコセレブロシダーゼ」、「β－グルコセレブロシダーゼ」、「ＧＣアーゼ」、「ＧＣ」、または「グルコシルセラミダーゼ」という用語は、広義には、グルコース含有糖脂質、たとえば、グルコシルセラミドおよびグルコシルスフィンゴシンにおけるグルコシド連結の加水分解を触媒する酵素（ＥＣ３．２．１．４５）を包含する。
ある特定の好ましい実施形態では、グルコセレブロシダーゼは、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼである。「ヒト」という限定詞は、ＧＣアーゼポリペプチドと関連して本明細書で使用される場合、その起源または供給源ではなく、ＧＣアーゼポリペプチドの一次アミノ酸配列を指す。たとえば、ヒトＧＣアーゼポリペプチドは、技術手段によって、たとえば、組換え発現、無細胞翻訳、または非生物学的ペプチド合成によって、得ることができる。本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドに適用される「野生型」という用語は、自然界に存在する生物において生じるかまたはその生物によって産生される、核酸またはポリペプチドを指す。「野生型」という用語は、「天然の」と同義であり得、後者は、天然の配列、すなわち、一次配列が、自然界において見出されるかまたはそれに由来する核酸またはポリペプチドのものと同じであるものを有する、核酸またはポリペプチドを包含する。当業者であれば、天然の配列が、所与の種内での通常の遺伝的多様性（変動）に起因して、同じ種の異なる個体間または個体内で異なり得ることを理解する。また、天然の配列は、転写後改変または翻訳後改変に起因して、同じ種の異なる個体間または個体内で異なり得る。核酸またはポリペプチドの任意のそのようなバリアントまたはアイソフォームは、本明細書において、「天然」であるとして包含される。したがって、自然界において見出されるかまたはそれに由来する核酸またはポリペプチドのすべての配列は、「天然」と考えられる。「天然」という用語は、生きている生物、器官、組織、または細胞の一部を形成する場合、生物学的試料の一部を形成する場合、およびそのような供給源から少なくとも部分的に単離されている場合の、核酸またはポリペプチドを包含する。この用語はまた、組換えまたは合成手段によって産生された場合の核酸またはポリペプチドも包含する。しかしながら、ほとんどの天然のヒトＧＣアーゼ核酸またはポリペプチドは「野生型」と考えることができるとはいえ、疾患表現型、たとえば、ゴーシェ病またはα－シヌクレイノパチー、たとえば、パーキンソン病と関連するかまたはそれを引き起こす天然に存在する変異を有するもの（そのような変異は、ＧＣアーゼの発現および／または活性を減弱または排除させる場合がある）は、一般に、「野生型」という用語の範囲から除外される。したがって、ある特定の実施形態では、ヒトＧＣアーゼは、疾患表現型と関連するものでも、それを引き起こすものでもない。
ヒトグルコセレブロシダーゼは、文献、たとえば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓ． ２０１１， ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９７３２３１）において記載されている、可溶性リソソーム酵素である。ヒトＧＣアーゼの遺伝子名称としては、「ＧＢＡ」、「ＧＣ」、および「ＧＬＵＣ」が含まれる。例示的なヒトＧＣアーゼタンパク質配列は、米国政府のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｇｅｎｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）受託番号ＮＰ＿０００１４８．２（配列バージョン２）、またはＳｗｉｓｓｐｒｏｔ／Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）受託番号Ｐ０４０６２－１において注釈されている通りであり得る。例示的なヒトＧＣアーゼｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１５７．４（配列バージョン４）で注釈されている通りであり得る。
ＮＰ＿０００１４８．２で注釈されているヒトＧＣアーゼアミノ酸配列を、以下に再生する。
Figure 2022523104000006
上記の代表的なヒトＧＣアーゼポリペプチド配列は、Ｎ末端シグナルペプチドを含むＧＣアーゼ前駆体のものである。ヒトＧＣアーゼのプロセシングの際、配列番号１のアミノ酸１～３９に対応するシグナルペプチドは、プロセシングで除去されて配列番号１のアミノ酸４０～５３６に対応する成熟ヒトＧＣアーゼタンパク質が形成され、これは、したがって、４９７アミノ酸長である。したがって、例示的な成熟ヒトＧＣアーゼのアミノ酸配列を、以下に再生する。
Figure 2022523104000007
本明細書で使用されるヒトＧＣアーゼポリペプチドへの参照は、文脈から明らかなように、ヒトＧＣアーゼ前駆体ポリペプチドおよび成熟ヒトＧＣアーゼポリペプチドの両方を包含する。さらに、天然のシグナルペプチドが好適な宿主細胞において活性なシグナルペプチド（たとえば、真菌細胞において活性なシグナルペプチド）によって置き換えられたヒトＧＣアーゼポリペプチドもまた、文脈から明らかなように、包含される。ある特定の実施形態では、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼは、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼは、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントまたは断片である。ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの「生物学的に活性なバリアントもしくは断片」または「機能的に活性なバリアントもしくは断片」という表現は、ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの機能的に活性なバリアント、ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの機能的に活性な断片、およびヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの断片の機能的に活性なバリアントを含む。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの「断片」という用語は、一般に、前記タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのＮ末端および／またはＣ末端が欠失または短縮された形態を指す。この用語は、任意の機序、たとえば、限定することなく、選択的翻訳、前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の、たとえば、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでのｅｘｏおよび／もしくはｅｎｄｏタンパク質分解ならびに／または分解、たとえば、物理的、化学的、および／もしくは酵素的タンパク質分解などによって生じる断片を包含する。限定することなく、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの断片は、前記タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、たとえば、対応するヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、対応する成熟ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも約５％（アミノ酸数で）、または少なくとも約１０％、たとえば、２０％もしくはそれよりも多く、３０％もしくはそれよりも多く、または４０％もしくはそれよりも多く、たとえば、好ましくは５０％もしくはそれよりも多く、たとえば、６０％もしくはそれよりも多く、７０％もしくはそれよりも多く、８０％もしくはそれよりも多く、９０％もしくはそれよりも多く、または９５％もしくはそれよりも多くを表し得る。
たとえば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの断片は、対応する全長タンパク質またはポリペプチド、たとえば、対応するヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、対応する成熟ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの５個もしくはそれよりも多くの連続したアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多くの連続したアミノ酸、２０個もしくはそれよりも多くの連続したアミノ酸、３０個もしくはそれよりも多くの連続したアミノ酸、たとえば、４０個もしくはそれよりも多くの連続したアミノ酸、たとえば、例として、５０個もしくはそれよりも多くの連続したアミノ酸、６０個もしくはそれよりも多く、７０個もしくはそれよりも多く、８０個もしくはそれよりも多く、９０個もしくはそれよりも多く、１００個もしくはそれよりも多く、２００個もしくはそれよりも多く、３００個もしくはそれよりも多く、３１０個もしくはそれよりも多く、３２０個もしくはそれよりも多く、３３０個もしくはそれよりも多く、３４０個もしくはそれよりも多く、３５０個もしくはそれよりも多く、３６０個もしくはそれよりも多く、３７０個もしくはそれよりも多く、３８０個もしくはそれよりも多く、３９０個もしくはそれよりも多く、４００個もしくはそれよりも多く、４１０個もしくはそれよりも多く、４２０個もしくはそれよりも多く、４３０個もしくはそれよりも多く、４４０個もしくはそれよりも多く、４５０個もしくはそれよりも多く、４６０個もしくはそれよりも多く、４７０個もしくはそれよりも多く、４８０個もしくはそれよりも多く、または４９０個もしくはそれよりも多くの連続したアミノ酸の配列を含み得る。
ある実施形態では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの断片は、対応する全長タンパク質またはポリペプチド、たとえば、対応するヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、対応する成熟ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドと比較して、１～約２０個のアミノ酸、たとえば、１～約１５個のアミノ酸、または１～約１０個のアミノ酸、または１～約５個のアミノ酸がＮ末端および／またはＣ末端で短縮されていてもよい。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの「バリアント」という用語は、一般に、それらのアミノ酸配列がそのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの配列と実質的に同一である（すなわち、大部分が同一であるが全体として同一ではない）、たとえば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの配列に対して、たとえば、対応するヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、対応する成熟ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの配列に対して、少なくとも約８０％同一であるかまたは少なくとも約８５％同一である、たとえば、好ましくは少なくとも約９０％同一である、たとえば、少なくとも９１％同一である、９２％同一である、より好ましくは、少なくとも約９３％同一である、たとえば、少なくとも９４％同一である、さらにより好ましくは少なくとも約９５％同一である、たとえば、少なくとも９６％同一である、なおもさらに好ましくは、少なくとも約９７％同一である、たとえば、少なくとも９８％同一であり、もっとも好ましくは、少なくとも９９％同一である、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを指す。好ましくは、バリアントは、引用されたタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの配列全体が、配列アライメントにおいて問い合わせた場合に、引用されたタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに対してそのような程度の同一性（すなわち、全体的な配列同一性）を示し得る。配列同一性は、それ自体公知のように、配列アライメントおよび配列同一性の決定を行うのに好適なアルゴリズムを使用して決定することができる。例示的であるが非限定的なアルゴリズムとしては、もともとはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． １９９０ （Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３－１０）によって説明されているＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）に基づくもの、たとえば、Ｔａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ １９９９ （ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １７４： ２４７－２５０）によって説明されている「Ｂｌａｓｔ ２配列」アルゴリズム、たとえば、公開されているデフォルト設定または他の好適な設定（たとえば、例として、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムについては、ギャップ開始コスト＝５、ギャップ伸長コスト＝２、ミスマッチペナルティ＝－２、マッチ報酬＝１、ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、期待値＝１０．０、文字列サイズ＝２８、またはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムについては、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８９：１０９１５－１０９１９）、ギャップ開始コスト＝１１、ギャップ伸長コスト＝１、期待値＝１０．０、文字列サイズ＝３）を使用するものが挙げられる。
特定のアミノ酸配列と問合せポリペプチドのアミノ酸配列（たとえば、ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、成熟ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド）との間の同一性パーセントを決定するための手段の例は、ＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）においてウェブアプリケーションとしてまたはスタンドアロン型実行可能プログラム（ＢＬＡＳＴバージョン２．２．３１＋）として入手可能なＢｌａｓｔ２配列（Ｂｌ２ｓｅｑ）アルゴリズムを使用し、好適なアルゴリズムパラメーターを使用して２つのアミノ酸配列をアライメントすることを伴う。好適なアルゴリズムパラメーターの例としては、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ開始コスト＝１１、ギャップ伸長コスト＝１、期待値＝１０．０、文字列サイズ＝３）が挙げられる。２つの比較している配列が相同性を共有している場合、出力は、それらの相同性の領域を、アライメントされた配列として提示する。２つの比較している配列が相同性を共有していない場合、出力は、アライメントされた配列を提示しない。アライメントされた後、同一のアミノ酸残基が両方の配列において提示されている位置の数を計数することによって、マッチ数が決定される。同一性パーセントは、マッチ数を、問合せポリペプチドの長さで除した後、得られた値に１００を乗じることによって、決定される。同一性パーセント値は、小数点１位に丸めてもよいが、必ずしもそうしなくてもよい。たとえば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は、７８．１に切り下げてもよく、一方で７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８、および７８．１９は、７８．２に切り上げてもよい。Ｂｌ２ｓｅｑによって出力されるアライメントのそれぞれのセグメントの詳細表示には、同一性のパーセンテージがすでに便宜的に含まれていることに、さらに留意されたい。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのバリアントは、前記タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのホモログ（たとえば、オルソログまたはパラログ）であってもよい。本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、一般に、同じかまたは異なる分類群に由来する２つの巨大分子間、特に、２つのタンパク質またはポリペプチド間での構造的類似性を指し、ここで、前記類似性は、共有の祖先に起因する。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのバリアントは、対応するタンパク質またはポリペプチド、たとえば、対応するヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、対応する成熟ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドと比べて（すなわち、それと比較して）、１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、または置換を含み得る。
たとえば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのバリアント（置換バリアント）は、対応するタンパク質またはポリペプチド、たとえば、対応するヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、対応する成熟ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドと比べて（すなわち、それと比較して）、最大で７０個（たとえば、１つを上回らない、２つを上回らない、３つを上回らない、４つを上回らない、５つを上回らない、６つを上回らない、７つを上回らない、８つを上回らない、９つを上回らない、１０個を上回らない、１２個を上回らない、１５個を上回らない、２０個を上回らない、２５個を上回らない、３０個を上回らない、３５個を上回らない、４０個を上回らない、５０個を上回らない、６０個を上回らない、または７０個を上回らない）保存的アミノ酸置換を含み得る。
保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の、類似の特徴を有する別のものとの置換である。保存的アミノ酸置換は、以下の群内の置換を含む：バリン、アラニン、およびグリシン；ロイシン、バリン、およびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システイン、およびスレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（すなわち、塩基性の）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（すなわち、酸性の）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上述の極性、塩基性、または酸性の群の１つのメンバーの、同じ群の別のメンバーでの任意の置換は、保存的置換とみなすことができる。対照的に、非保存的置換は、１つのアミノ酸の、類似しない特徴を有する別のものとの置換である。
代替的にまたは追加として、たとえば、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのバリアント（欠失バリアント）は、対応するタンパク質またはポリペプチド、たとえば、対応するヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、対応する成熟ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチド、たとえば、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドと比べて（すなわち、それと比較して）、最大で２０個のアミノ酸セグメント（たとえば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のセグメント）が欠如していてもよい。欠失セグメントは、それぞれ独立して、１つのアミノ酸、２つの連続するアミノ酸、または３つの連続するアミノ酸からなり得る。欠失セグメントは、非連続であってもよく、または欠失セグメントのうちの２つもしくはそれよりも多くもしくはすべてが、連続していてもよい。
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのバリアントは、融合タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドであってもよく、ここで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、１つまたは複数の他のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに化学的にコンジュゲートされているか、非共有結合で結合しているか、または翻訳により融合されている。他のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとしては、シグナル生成化合物（たとえば、酵素またはフルオロフォア）、診断もしくは検出マーカー（たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、組換えタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの精製に使用されるアミノ酸配列（たとえば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン（たとえば、ヘキサヒスチジン）、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｌｕｔｔａｎｉｎ）（ＨＡ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ））、標的細胞へのタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの輸送を指示もしくは増強するために使用されるシグナル配列およびアミノ酸配列（たとえば、血液脳関門シャトルペプチド）を挙げることができるが、これらに限定されない。アミノ酸配列は、必要に応じてスペーサー（たとえば、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）またはポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ））の使用によって、本明細書において意図されるように、アゴニストのＮ末端および／またはＣ末端に融合することができる。
本明細書がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのバリアントおよび／または断片について言及するかまたはそれを包含する場合、これは、機能的に活性であるか、または機能性である、すなわち、それぞれのまたは対応するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの生物学的活性または意図される機能性を少なくとも部分的に保持する、バリアントまたは断片を指す。例としてであり限定するものではなく、本明細書に開示されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの機能的に活性なバリアントまたは断片は、ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの生物学的活性を少なくとも部分的に保持するものとする。たとえば、それは、ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの生物学的活性、たとえば、ヒドロラーゼ活性の１つまたは複数の態様を保持し得る。好ましくは、機能的に活性なバリアントまたは断片は、対応するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと比較して、意図される生物学的活性または機能性の少なくとも約２０％、たとえば、少なくとも約２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、たとえば、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、たとえば、少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、なおもさらに好ましくは少なくとも約９０％、およびもっとも好ましくは少なくとも約９５％、またはさらには約１００％またはそれよりも多くを保持し得る。タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、たとえば、ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの「活性」への言及は、一般に、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの生物学的活性の任意の１つまたは複数の態様、たとえば、限定することなく、たとえば、細胞、組織、器官、または生物内のその生化学的活性、酵素活性、シグナル伝達活性、相互作用活性、リガンド活性、および／または構造活性の任意の１つまたは複数の態様を包含し得る。例としてであり限定するものではなく、ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片についての言及は、ヒドロラーゼとしてのその活性を指す。所与のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、たとえば、ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの活性を、確立されたアッセイ、たとえば、酵素アッセイにおいて（たとえば、例として、蛍光アッセイによって）容易に測定することができる場合、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの機能的に活性なバリアントまたは断片は、そのようなアッセイにおいて、それぞれのまたは対応するタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの活性の少なくとも約２０％、たとえば、少なくとも約２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、たとえば、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、たとえば、少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、なおもさらに好ましくは少なくとも約９０％、およびもっとも好ましくは少なくとも約９５％、またはさらには約１００％、またはそれよりも多くを示し得る。
たとえば、ヒト野生型ＧＣアーゼまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のヒドロラーゼ活性は、酵素アッセイ、たとえば、特に、合成基質４ＭＵβＧｌｃ（４－メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）－β－Ｄ－グルコピラノシド（Ｕｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ， ｖｏｌ． １１（１０）， ８１７－８２４））を使用してＧＣアーゼの酵素活性を測定する蛍光アッセイである４ＭＵβＧｌｃアッセイにおいて、測定することができる。一単位を、１１１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４４ｍＭクエン酸、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１０ｍＭタウロコール酸ナトリウム、０．２５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ５．５中５ｍＭの最終基質濃度で、３７℃において、１分当たり１μｍｏｌの４ＭＵβＧｌｃの加水分解を触媒する酵素の量として定義する。
ある特定の例では、ヒト野生型ＧＣアーゼの機能的に活性なバリアントまたは断片は、配列番号２に記載されるヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドのＧＣアーゼ酵素活性の少なくとも２５％（たとえば、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、またはさらには１００％よりも多く）を有し得る。機能的バリアントまたは断片は、一般に、連続的なタンパク質の領域から構成され得るが、必ずしもそうでない場合があり、ここで、この領域は、機能的活性を有する。
ヒトＧＣアーゼポリペプチドの活性部位のアミノ酸配列は、文献に記載されている（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ２０１１）。活性部位を形成する残基、より具体的には、基質の認識および結合に関与する残基（グルコース結合に関わる残基）は、ドメイン２に位置しており、これには、Ａｒｇ１２０、Ａｓｐ１２７、Ｐｈｅ１２８、Ｔｒｐ１７９、Ａｓｎ２３４、Ｔｙｒ２４４、Ｐｈｅ２４６、Ｔｙｒ３１３、Ｃｙｓ３４２、Ｓｅｒ３４５、Ｔｒｐ３８１、Ａｓｎ３９６、Ｐｈｅ３９７、およびＶａｌ３９８が挙げられる（成熟タンパク質におけるアミノ酸番号付けによる）。ヒト野生型ＧＣアーゼポリペプチドの機能的バリアントまたは断片の候補は、したがって、当業者により、十分に確立された方法、たとえば、相同性モデリングおよびコンピュータ操作を使用して得ることができ、所望される酵素活性について試験することができる。
したがって、ある特定の実施形態では、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントは、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性、たとえば、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼ、たとえば、配列番号２のものに対して、少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性、特に、全体的な配列同一性を示す。
ある特定の実施形態では、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントは、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼと比べて増加した安定性および／または特異性を有する。ある特定の実施形態では、ＧＣアーゼバリアントの安定性は、ヒト野生型ＧＣアーゼの安定性と比較して、少なくとも１％増加していてもよい。たとえば、安定性は、ヒト野生型ＧＣアーゼの安定性と比較して、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、またはそれを上回って（たとえば、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも３００％）増加していてもよい。
ＧＣアーゼバリアントの安定性は、ある特定の期間（たとえば、１時間、２時間、４時間、８時間、または１６時間）、ある特定の温度（たとえば、３７℃）で、ある特定の条件下（たとえば、およそ中性のｐＨ、たとえば、ｐＨ７．５で、または血清もしくは血漿中で）、ＧＣアーゼバリアントをインキュベートすること、ならびにＧＣアーゼ活性を測定することを含む方法によって、決定することができる。対照として、ヒト野生型ＧＣアーゼを使用することができる。ゼロ時点における酵素活性を、それぞれの条件下において１００％に設定することができる。それぞれの酵素の安定性は、特定のインキュベーション時間点における酵素活性の、ゼロ時点における値に対する比（たとえば、パーセント）として計算し、表すことができる。
代替的に、または追加として、ＧＣアーゼバリアントの安定性は、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）とも称されるサーマルシフトアッセイによって、予測することができる。
代替的に、または追加として、ＧＣアーゼバリアントの安定性は、タンパク質またはポリペプチドのその融解温度（Ｔｍ）を測定することによって、予測することができる。タンパク質またはポリペプチドの「融解温度（Ｔｍ）」は、タンパク質またはポリペプチドの５０％が、可逆的熱変性中に不活性化される温度を指す。例として、タンパク質またはポリペプチドの融解温度は、蛍光に基づくサーマルシフトアッセイ（ＴＳＡ）を使用して決定することができる。そのようなアッセイは、疎水性表面に非特異的に結合する色素であり、その蛍光が水性環境においてクエンチされる、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅの使用に基づき得る。熱に誘導されるアンフォールディングの際、フルオロフォアは、アンフォールディングするタンパク質の露出した疎水性内部に優先的に結合し、クエンチの急激な減少をもたらす。熱に誘導されるアンフォールディングは、フォールディング状態と非フォールディング状態との間の急激な遷移を有する二状態モデルによる不可逆的プロセスであり、ここで、Ｔｍは、タンパク質のアンフォールディング遷移の温度の中点として定義される。別の例として、タンパク質またはポリペプチドの融解温度は、円偏光二色性（ＣＤ）分光法を使用して決定することができる。「円偏光二色性分光法」という用語は、一般に、タンパク質の二次構造またはタンパク質のフォールディングを研究するためのツールを指す。円偏光二色性分光法は、円形偏光の吸光を測定する。タンパク質の場合、二次構造、たとえば、アルファヘリックスおよびベータシートは、キラルであり、したがって、そのような光を吸収する。この光の吸収が、タンパク質のフォールディングの程度のマーカーとしての機能を果たす。ＣＤは、コンフォメーションの変化を示すための有用なツールである。この技法を使用して、吸光の変化を温度の関数として測定することによって、タンパク質の二次構造がどのように変化するかを研究することができる。このようにして、ＣＤにより、それ以外の方法では容易に得ることができないタンパク質に関する重要な熱力学的情報（たとえば、エンタルピーおよび変性のギブズ自由エネルギー）が判明し得る。
ある特定の実施形態では、ＧＣアーゼバリアントの融解温度は、ヒト野生型ＧＣアーゼの融解温度と比較して、少なくとも２．０℃増加していてもよい。たとえば、融解温度は、ヒト野生型ＧＣアーゼの融解温度と比較して、少なくとも２．０℃、少なくとも３．０℃、少なくとも４．０℃、少なくとも５．０℃、少なくとも１０．０℃、少なくとも１５．０℃、少なくとも２０．０℃、少なくとも２５．０℃、または少なくとも３０．０℃増加していてもよい。
ある特定の実施形態では、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントは、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１、Ｈ１４５、Ｆ３１６、およびＬ３１７からなる群より選択される１つまたは複数の位置における単一アミノ酸置換によって異なる。タンパク質またはポリペプチドの所与の位置における単一アミノ酸置換は、その位置における単一のアミノ酸の、厳密に１つの他のアミノ酸との置換えを指す。バリアントは、１つの単一アミノ酸置換を含有してもよく、またはそれぞれ２つもしくはそれよりも多くの位置における２つもしくはそれよりも多くの単一アミノ酸置換を含有してもよい。Ｋ３２１、Ｈ１４５、Ｆ３１６、および／またはＬ３１７における単一アミノ酸置換は、ＧＣアーゼの安定性に有利であることがこれまでに説明されている（米国特許第８，９６２，５６４号を参照されたい）。
ある特定の好ましい実施形態では、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントは、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１、またはＨ１４５、またはＫ３２１およびＨ１４５における単一アミノ酸置換によって異なる。
ある特定のより好ましい実施形態では、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントは、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１Ｎ置換、またはＨ１４５Ｌ置換、またはＫ３２１ＮおよびＨ１４５Ｌ置換によって異なる。
ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼＨ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎバリアントは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
Figure 2022523104000008
ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼＨ１４５Ｌバリアントは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
Figure 2022523104000009
ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼＫ３２１Ｎバリアントは、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
Figure 2022523104000010
本明細書において意図されるグルコセレブロシダーゼは、好ましくは、組換えにより産生され得る。「組換え」という用語は、一般に、材料（たとえば、核酸、遺伝子構築物、またはタンパク質）が、ヒトの介入を通じた技術手段により（すなわち、非天然に）変更されていることを示すために使用される。「組換え核酸」という用語は、一般に、組換えＤＮＡ技術を使用して、一緒に結合されたセグメントから構成される核酸を指す。「組換えタンパク質またはポリペプチド」という用語は、一般に、組換え核酸、たとえば、組換えＤＮＡの発現により生じるタンパク質またはポリペプチドを指す。
ＧＣアーゼの組換え発現のために、ＧＣアーゼをコードする核酸分子および核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットまたは発現ベクターを構築することができる。好ましくは、発現カセットまたは発現ベクターは、好適な宿主細胞においてＧＣアーゼの発現がもたらされるように構成され得る。
「発現ベクター」または「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、核酸分子、典型的には、ＤＮＡを指し、そこに、核酸断片、好ましくは、本明細書に定義される組換え核酸分子が、挿入されクローニングされ得る、すなわち、増殖され得る。したがって、ベクターは、典型的に、１つまたは複数の固有の制限部位を含有し、クローニングされた配列が再生されるように、既定の宿主細胞またはビヒクル生物において自律複製が可能であり得る。ベクターはまた、好ましくは、ベクターを含有するレシピエント細胞の選択を可能にするために、選択マーカー、たとえば、抗生物質耐性遺伝子などを含有し得る。ベクターとしては、限定することなく、適宜、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バクテリオファージ由来ベクター、ＰＡＣ、ＢＡＣ、線形核酸、たとえば、線形ＤＮＡ、ウイルスベクターなどを挙げることができる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ １９９２を参照されたい）。発現ベクターは、一般に、所望される発現系において、たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、宿主細胞、宿主器官、および／または宿主生物において、そこに導入された核酸またはＯＲＦの発現を可能にする、かつ／またはそれがもたらされるように構成される。たとえば、発現ベクターは、有益なことに、好適な調節配列を含み得る。
特定のベクターを選択する際に重要となる因子としては、とりわけ、レシピエント宿主細胞の選択、ベクターを含有するレシピエント細胞を、ベクターを含有しないレシピエント細胞から認識および選択することの容易さ、特定のレシピエント細胞において所望されるベクターのコピー数、ベクターがレシピエント細胞において染色体に組み込まれることが所望されるか、または染色体外に留まることが所望されるか、ならびにベクターを異なる種のレシピエント細胞間で「往復輸送」することができることが望ましいかどうかが挙げられる。
発現ベクターは、自律的であっても組込みであってもよい。組換え核酸は、発現ベクター、たとえば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはウイルス粒子の形態で、宿主細胞に導入され得る。組換え核酸は、染色体外で維持されてもよく、または細胞染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。発現ベクターは、所望される核酸が形質転換された細胞の検出および／または選択を可能にするために、選択された条件下において細胞生存に必要とされるタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子を含有し得る（たとえば、ウラシル生合成に必要な酵素をコードするＵＲＡ３、またはトリプトファン生合成に必要とされる酵素をコードするＴＲＰ１）。発現ベクターはまた、自律複製配列（ＡＲＳ）も含み得る。
組込みベクターは、一般に、少なくとも第１の挿入可能なＤＮＡ断片、選択可能なマーカー遺伝子、および第２の挿入可能なＤＮＡ断片の順に配置された配列を含む。第１および第２の挿入可能なＤＮＡ断片は、それぞれ、長さが約２００個（たとえば、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、または約１０００個、またはそれよりも多くの）ヌクレオチドであり、形質転換しようとする宿主細胞種のゲノムＤＮＡの部分に相同であるヌクレオチド配列を有する。発現のための目的の遺伝子を含有するヌクレオチド配列は、マーカー遺伝子の前または後に関係なく、第１および第２の挿入可能なＤＮＡ断片間でこのベクターに挿入される。組込みベクターは、目的のヌクレオチド配列の宿主細胞ゲノムへの組込みを促進するために、形質転換の前に線形化され得る。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子を転写するのを可能にするＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、次いで、転写が開始される。したがって、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって直接的に結合されるかまたはその動員に関与するかのいずれかである、ＤＮＡ配列を含有する。プロモーター配列はまた、「エンハンサー領域」も含み得、これは、遺伝子クラスターにおいて遺伝子の転写レベルを増強させるためにタンパク質に結合することができる、ＤＮＡの１つまたは複数の領域である（すなわち、トランス作用因子）。エンハンサーは、典型的には、コード領域の５’末端にあるが、プロモーター配列とは別個であってもよく、たとえば、遺伝子のイントロン領域内または遺伝子のコード領域に対して３’であってもよい。
「作動可能な連結」とは、調節配列および発現させようとする配列が、前記発現を可能にするような様式で接続されている連結である。たとえば、配列、たとえば、プロモーターおよびＯＲＦなどは、前記配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）ＯＲＦの転写を誘導するプロモーターの能力を妨害せず、（３）プロモーター配列から転写されるＯＲＦの能力を妨害しない場合に、作動可能に連結すると称され得る。したがって、「作動可能に連結した」とは、発現制御配列、たとえば、プロモーターが、目的のコード配列、たとえば、本明細書に定義される核酸分子の発現を効果的に制御するように、遺伝子構築物に組み込まれることを意味し得る。
プロモーターは、構成的または誘導性（条件的）プロモーターであり得る。構成的プロモーターは、発現が、標準的な培養条件下において一定であるプロモーターであると理解される。誘導性プロモーターは、１つまたは複数の誘導キューに応答するプロモーターである。たとえば、誘導性プロモーターは、化学的に調節することができるか（たとえば、転写活性が、化学的誘導剤、たとえば、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属、または他の小分子の存在または不在によって調節されるプロモーター）、または物理的に調節することができる（たとえば、転写活性が、物理的誘導剤、たとえば、光または高温もしくは低温の存在または不在によって調製されるプロモーター）。誘導性プロモーターはまた、化学的または物理的キューによってそれ自体が直接調節される１つまたは複数の転写因子によって、間接的に調節されてもよい。
たとえば、プロモーターは、真菌細胞、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞における発現のためのプロモーター、たとえば、好適な真菌種、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ、または他の好適な真菌種に由来するプロモーターであり得る。好適な真菌または酵母プロモーターとしては、たとえば、ＡＤＣ１、ＴＰＩ１、ＡＤＨ２、ｈｐ４ｄ、ＴＥＦ１、ＰＯＸ２、またはＧａｌ１０プロモーターが挙げられる。好ましくは、プロモーターは、ｈｐ４ｄまたはＰＯＸ２である。より好ましくは、プロモーターは、ｈｐ４ｄである。たとえば、Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９（２３）：７４１０、Ｚｈｕ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ， １９９９， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５（７－８）：６０８－６１１、または米国特許第６，２６５，１８５号を参照されたい。
グルコセレブロシダーゼは、任意の宿主細胞系において産生され得る。一般的な宿主細胞系としては、真菌細胞、たとえば、酵母細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、たとえば、ヒト細胞、および非ヒト哺乳動物細胞を挙げることができる。そのような宿主細胞系は、本明細書において必要とされる程度のグリカンリン酸化を有する糖タンパク質の産生を可能にすることができるか、またはそれを可能にするように操作もしくは構成されていてもよい。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞を含め、真菌細胞であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞であり得る。真菌および酵母宿主細胞としては、とりわけ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐが挙げられる。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓであり得る。好ましくは、宿主細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された真菌細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも３０％が少なくとも１つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、真菌細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも１０％が２つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、真菌細胞である。そのようなグリカンとしては、特に、ＭａｎＰ－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を挙げることができる。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも３０％が少なくとも１つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも１０％が２つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞である。そのようなグリカンとしては、特に、ＭａｎＰ－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２を挙げることができる。
好ましくは、宿主細胞、たとえば、真菌細胞、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞は、Ｎ－グリカンの外側鎖伸長活性の欠損、たとえば、ＯＣＨ１活性の欠損を含み得る。これにより、分泌される糖タンパク質への高グリコシル構造の合成の可能性が抑止される。全細胞外タンパク質上の主要なＮ－グリカンは、中性Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２である。好ましくは、宿主細胞、たとえば、真菌細胞、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞は、Ｎ－グリカンのマンノシルリン酸化を達成することができるポリペプチド、たとえば、ＭＮＮ４またはＰＮＯ１の過剰発現を含み得る。これにより、Ｎ－グリカンにマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含めることが促進される。特に好ましくは、宿主細胞、たとえば、真菌細胞、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞は、Ｎ－グリカンの外側鎖伸長活性の欠損を含み、Ｎ－グリカンのマンノシルリン酸化を達成することができるポリペプチドの過剰発現を含む。特に好ましくは、宿主細胞、たとえば、真菌細胞、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞は、ＯＣＨ１欠損およびＭＮＮ４またはＰＮＯ１の過剰発現を含む。これは、ほぼすべての中性Ｎ－グリカンの、１つまたは２つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含有する構造への変換をもたらす。全細胞外タンパク質上の主要なＮ－グリカンは、ＭａｎＰ－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２である。たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、もしくはＣ． ａｌｂｉｃａｎｓに由来するＭＮＮ４ポリペプチド、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに由来するＰＮＯ１は、真菌細胞、好ましくは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞において、過剰発現され得る。好ましくは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに由来するＭＮＮ４ポリペプチドは、真菌細胞、好ましくは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞において過剰発現され得る。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに由来する例示的なＭＮＮ４ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＸＭ＿５０３２１７．１を有する。高度にリン酸化されたＮ－グリカンを有する糖タンパク質、特に、ＭａｎＰ－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ－グリカンの比率が高いものを産生させるためのＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの前述の遺伝子改変は、ＷＯ２００８／１２０１０７およびＴｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１２， ｖｏｌ． ３０， １２２５－３１）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
前述のように、真菌細胞、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａによって産生されるリン酸化Ｎ－グリカンにおいて、リン酸基は、マンノース基でキャッピングされており、したがって、Ｎ－グリカンは、マンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含む。哺乳動物細胞、たとえば、ヒト細胞上のマンノース－６－リン酸受容体への結合、ならびにそれに続く細胞内部および最終的にはリソソームへの輸送を促進するために、リン酸化Ｎ－グリカンを含有する、真菌細胞により産生される糖タンパク質を、脱キャッピングする必要があり得る。これに関連して、「脱キャッピングされる」とは、具体的には、ホスホ－６－マンノース部分におけるリン酸基が、別の部分、たとえば、マンノース－１－イル部分に共有結合で連結されていないことを意味し、「脱キャッピング」は、具体的には、マンノース－１－イル残基を除去し、それによって、リン酸部分を露出させることを指す。Ｎ－グリカンが１つを上回るリン酸基を含有する場合、Ｎ－グリカンは、前記リン酸基のうちの少なくとも１つが脱キャッピングされていると、「脱キャッピングされている」と称され得る。好ましくは、前記リン酸基の両方が、脱キャッピングされ得る。
さらに、真菌細胞、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａによって産生されるリン酸化Ｎ－グリカンは、高マンノース型のものであり、典型的には、リン酸基が結合するマンノースの基礎となる（すなわち、マンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分の基礎となる）マンノースに結合した１つまたは複数のマンノース残基を含有する。例として、ＯＣＨ１が欠損しておりＭＮＮ４またはＰＮＯ１を過剰発現する前述のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の事例では、そのようなＮ－グリカンは、ＭａｎＰ－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ－グリカンであり得る。そのような構造は、脱マンノシル化する必要があり得る。これに関連して、「脱マンノシル化された」とは、少なくとも、基礎となるマンノースがリン酸化されている場合に、末端アルファ－１，２－マンノースを含む、リン酸含有Ｎ－グリカンの末端アルファ－１，２マンノース部分の加水分解を指し得る。したがって、これにより、６位にリン酸を含有し、末端マンノースとなるマンノースが生じる。ある特定の実施形態では、「脱マンノシル化された」とは、リン酸含有Ｎ－グリカンの末端アルファ－１，２マンノース、アルファ－１，３マンノース、および／または（好ましくは「および」）アルファ－１，６マンノース連結または部分の加水分解を指し得る。より具体的には、リン酸化（一リン酸化または二リン酸化）Ｎ－グリカンの場合、脱マンノシル化には、Ｎ－グリカンの非リン酸化アームの加水分解、および基礎となるマンノースがリン酸化されている場合には、末端アルファ－１，２－マンノースの加水分解が含まれ得る。そのような事例において、脱マンノシル化の最終加水分解産物は、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（脱キャッピングも行われた場合）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる群より選択され得る。脱キャッピングされたリン酸基を含有する脱マンノシル化Ｎ－グリカンは、哺乳動物細胞上のマンノース－６－リン酸受容体に、脱キャッピングされたリン酸基を含有する脱マンノシル化されていないＮ－グリカンよりも実質的に良好に結合し、それによって、ＧＣアーゼが哺乳動物細胞の内部および最終的にはリソソームに輸送される効率が増加する。
したがって、ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼは、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、特に、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも３０％が少なくとも１つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、真菌細胞によって組換え発現される、グルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるか、または得られる。
さらなる実施形態では、グルコセレブロシダーゼは、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、特に、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも３０％が少なくとも１つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞によって組換え発現される、グルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるか、または得られる。
さらなる実施形態では、グルコセレブロシダーゼは、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、特に、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも１０％が２つのマンノース－６－リン酸部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、真菌細胞によって組換え発現される、グルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるか、または得られる。
さらなる実施形態では、グルコセレブロシダーゼは、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、特に、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも１０％が２つのマンノース－６－リン酸部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａによって組換え発現される、グルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるか、または得られる。
リン酸化Ｎ－グリカンを含有する糖タンパク質は、脱マンノシル化することができ、マンノース－１－ホスホ－６－マンノース連結または部分を含有するリン酸化Ｎ－グリカンを含有する糖タンパク質は、糖タンパク質を、（ｉ）マンノース－１－ホスホ－６－マンノース連結または部分を加水分解して、マンノース－６－リン酸にすることができる、ならびに（ｉｉ）末端アルファ－１，２マンノース、アルファ－１，３マンノース、および／またはアルファ－１，６マンノース連結もしくは部分を加水分解することができる、マンノシダーゼと接触させることによって、脱キャッピングおよび脱マンノシル化することができる。そのようなマンノシダーゼの非限定的な例としては、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ（たとえば、ＡＭＳ１）が挙げられる。タチナタマメおよびＡＭＳ１マンノシダーゼのいずれも、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼである。
タチナタマメマンノシダーゼは、たとえば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から硫酸アンモニウム懸濁物（カタログ番号Ｍ７２５７）およびプロテオミクスグレードの調製物（カタログ番号Ｍ５５７３）として商業的に入手可能である。そのような市販調製物は、たとえば、混入物質、たとえば、ホスファターゼを除去するために、ゲルろ過クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＭＳ１マンノシダーゼは、組換え産生させることができる。ＡＭＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９に配列番号５として記載されている。
一部の実施形態では、脱キャッピングおよび脱マンノシル化のステップは、２つの異なる酵素によって触媒される。たとえば、マンノース－１－ホスホ－６マンノース連結または部分の脱キャッピングは、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓに由来するマンノシダーゼ（たとえば、ＣｃＭａｎ５）を使用して実行され得る。ＣｃＭａｎ５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９に配列番号２として記載されている。シグナル配列を含有するＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９に配列番号３として記載されている。シグナル配列を有さないＣｃＭａｎ５ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９に配列番号４として記載されている。一部の実施形態では、ＣｃＭａｎ５ポリペプチドの生物学的に活性な断片が、使用される。たとえば、生物学的に活性な断片は、ＷＯ２０１３／１３６１８９に配列番号４として記載されているアミノ酸配列の残基１～７７４を含み得る。ＷＯ２０１１／０３９６３４も参照されたい。ＣｃＭａｎ５マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼである。
脱キャッピングされた糖タンパク質の脱マンノシル化は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉ（Ａｓ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓとしても公知）に由来するマンノシダーゼまたはＣｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌａｎｓに由来するマンノシダーゼ（たとえば、ＣｃＭａｎ４）を使用して触媒することができる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉマンノシダーゼは、ファミリー４７のグリコシドヒドロラーゼであり、ＣｃＭａｎ４マンノシダーゼは、ファミリー９２のグリコシドヒドロラーゼである。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｔｏｉマンノシダーゼのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９に配列番号６として記載されており、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ０８６３４．１である。ＣｃＭａｎ４ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ２０１３／１３６１８９の図８に記載されている。
脱キャッピングされた糖タンパク質の脱マンノシル化は、ファミリー３８のグリコシドヒドロラーゼに由来するマンノシダーゼ、たとえば、Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ（タチナタマメ）マンノシダーゼまたはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａマンノシダーゼ（たとえば、ＡＭＳ１）を使用して触媒することができる。たとえば、ＣｃＭａｎ５は、糖タンパク質（または糖タンパク質の分子複合体）のマンノース－１－ホスホ－６マンノース部分を脱キャッピングするために使用され得、タチナタマメマンノシダーゼは、脱キャッピングされた糖タンパク質（または糖タンパク質の分子複合体）を脱マンノシル化するために使用され得る。
脱マンノシル化された糖タンパク質、または脱キャッピングおよび脱マンノシル化された糖タンパク質を産生するために、マンノース－１－ホスホ－６マンノース連結または部分を含有する糖タンパク質を、好適な条件下において、好適なマンノシダーゼおよび／または好適な天然もしくは組換え産生されたマンノシダーゼを含有する細胞ライセートと接触させる。好適なマンノシダーゼは、上記に説明されている。細胞ライセートは、真菌細胞、植物細胞、または動物細胞を含む、任意の遺伝子操作された細胞であり得る。動物細胞の非限定的な例としては、線虫、昆虫、植物、鳥類、爬虫類、および哺乳動物、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、イヌ、ネコ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、クジラ、サル、またはヒトが挙げられる。
糖タンパク質を精製したマンノシダーゼおよび／または細胞ライセートと接触させると、マンノース－１－ホスホ－６－マンノース連結または部分は、加水分解されて、ホスホ－６－マンノースとなり得、そのようなリン酸含有グリカンの末端アルファ－１，２マンノース、アルファ－１，３マンノース、および／または（好ましくは「および」）アルファ－１，６マンノース連結または部分は、加水分解されて、脱キャッピングおよび脱マンノシル化された糖タンパク質が産生され得る。一部の実施形態では、脱キャッピングステップおよび脱マンノシル化ステップの両方を触媒する１つのマンノシダーゼが使用される。一部の実施形態では、脱キャッピングステップを触媒するために１つのマンノシダーゼが使用され、脱マンノシル化ステップを触媒するために異なるマンノシダーゼが使用される。マンノシダーゼによる処理を行った後、糖タンパク質を単離することができる。
本明細書において意図されるグルコセレブロシダーゼは、任意の好適な形態もしくは形式または作動可能な形態もしくは形式で提供され得る。グルコセレブロシダーゼは、単離することができ、したがって、その天然の環境の１つまたは複数の他の成分から分離して存在または提供され得る。グルコセレブロシダーゼは、組換え産生され得る。例として、グルコセレブロシダーゼ調製物は、精製されたグルコセレブロシダーゼを含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。この文脈における「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とするものではない。そうではなく、精製されているものが、他の成分に対するその存在量がもともとの材料よりも多い別個の環境にあることを指す。別個の環境とは、単一媒体、たとえば、例として、単一の溶液、ゲル、沈殿物、凍結乾燥物などを指す。精製した後、グルコセレブロシダーゼは、好ましくは、別個の環境のタンパク質含量のうちの１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、たとえば、６０重量％以上、さらにより好ましくは７０重量％以上、たとえば、８０重量％以上、およびなおもさらに好ましくは９０重量％以上、たとえば、９５重量％以上、９６重量％以上、９７重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、またはさらには１００重量％を構成し得る。タンパク質含量は、たとえば、ローリー法（Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ． １９５１ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９３：２６５）によって決定することができ、必要に応じてＨａｒｔｒｅｅ １９７２ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４８：４２２－４２７によって説明されている。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の純度は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー、または好ましくは銀染色を使用して、還元または非還元条件下において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定することができる。ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼは、凍結乾燥形態で提供されてもよい。ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼは、水溶液で提供されてもよい。
「組成物」という用語は、一般に、２つまたはそれよりも多くの成分から構成されるものを指し、より具体的には、特に、２つまたはそれよりも多くの材料、たとえば、元素、分子、物質、生物学的分子、または微生物学材料の混合物またはブレンド、ならびに組成物の材料から形成される反応産物および分解産物を指す。例として、グルコセレブロシダーゼ組成物は、１つまたは複数の物質と組み合わせて、グルコセレブロシダーゼを含み得る。たとえば、グルコセレブロシダーゼ組成物は、グルコセレブロシダーゼを、前記１つまたは複数の他の物質と組み合わせること、たとえば、混合することによって、得ることができる。ある特定の実施形態では、本組成物は、医薬組成物として構成され得る。医薬組成物は、典型的に、１つまたは複数の薬理学的に活性な成分（１つもしくは複数の薬理学的作用を有する化学的および／もしくは生物学的に活性な材料）ならびに１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む。本明細書において典型的に使用される組成物は、液体、半固体、または固体であり得、溶液または分散物が含まれ得る。
さらなる態様は、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物または組成物を含む医薬組成物を提供する。
「医薬組成物」および「薬学的製剤」という用語は、互換可能に使用することができる。本明細書において教示される医薬組成物は、本明細書において具体的に示される成分に加えて、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。好適な薬学的賦形剤は、活性成分の剤形および正体に依存し、当業者によって選択され得る（たとえば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１２， ｅｄｓ． Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．を参照して）。本明細書で使用される場合、「担体」または「賦形剤」は、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、緩衝液（たとえば、中性緩衝食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水）、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、充填剤、キレート剤（たとえば、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン）、アミノ酸（たとえば、グリシン）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、矯味矯臭味剤、芳香剤、増粘剤、デポー効果を達成するための薬剤、コーティング剤、抗真菌剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、張度制御剤、吸収遅延剤、およびその他のものを含む。許容可能な希釈剤、担体、および賦形剤は、典型的に、レシピエントの恒常性（たとえば、電解質バランス）に悪影響を及ぼさない。薬学的に活性な物質にそのような媒体および薬剤を使用することは、当該技術分野において周知である。そのような材料は、非毒性であり、ＧＣアーゼの活性を妨害しないものとする。許容可能な担体としては、生体適合性の不活性または生体吸収性塩、緩衝化剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘性改善剤、保存剤、およびその他を挙げることができる。１つの例示的な担体は、生理食塩水である（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０～７．４）。別の例示的な担体は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムである。
担体または他の材料の正確な性質は、投与の経路に依存するであろう。たとえば、医薬組成物は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性、および安定性を有する、非経口で許容可能な水溶液の形態であってもよい。
薬学的製剤は、生理学的条件に近似するために必要に応じて薬学的に許容される補助物質、たとえば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、保存剤、錯化剤、張度調節剤、湿潤剤など、たとえば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化水素、ベンジルアルコール、パラベン、ＥＤＴＡ、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含み得る。好ましくは、医薬製剤のｐＨ値は、生理学的ｐＨ範囲内であり、たとえば、具体的には、製剤のｐＨは、約５～約９．５、より好ましくは、約６～約８．５、さらにより好ましくは、約７～約７．５である。好ましくは、ＧＣアーゼの安定性および保管時間を増加させるために、ｐＨは、わずかに酸性であり得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約５．０～約６．９、たとえば、約５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約６．４～６．９、好ましくは、約６．６のｐＨを有する。そのような医薬製剤の調製は、当業者の技能の範囲内である。
医薬組成物の投与は、全身的または局所的（局部的）であり得る。医薬組成物は、それらが、非経口および／または腸内投与に好適となるように製剤化され得る。具体的な投与モダリティとしては、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内、経口、直腸、頬内、局部、鼻、眼、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ、膣、および子宮内投与が挙げられる。
ある特定の好ましい実施形態では、投与は、静脈内（ＩＶ）、たとえば、ＩＶ注入または注射であり得る。ＩＶ投与のためには、組成物は、比較的低いｐＨ、たとえば、約５．０～６．０、たとえば、約５．５のｐＨ（たとえば、クエン酸緩衝液を使用する）を有し得る。ある特定の好ましい実施形態では、投与は、脳室内（ＩＣＶ）、たとえば、ＩＣＶ注入または注射であり得る。ＩＣＶ投与のためには、組成物は、生理学的なｐＨに比較的近いｐＨ、たとえば、６．１～７．４、好ましくは、６．４～６．９、たとえば、約６．６のｐＨを有し得る。
ある特定の実施形態では、特に、ＩＣＶまたは髄腔内投与については、グルコセレブロシダーゼは、人工脳脊髄液（ａＣＦＳ）を用いて製剤化され得る。
人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）と示される組成物には、生理学的脳脊髄液を模倣するように設計された任意の多価生理学的イオン溶液が包含される。ａＣＳＦは、例示的に、１２７ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、２．４ｍＭ ＣａＣｌ２、および１．３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有し得る。ａＣＳＦは、例示的に、１１９ｍＭ ＮａＣｌ、２６．２ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭグルコース、および２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有し得る。ａＣＳＦ中の電解質濃度は、例示的には、１５０ｍＭ Ｎａ＋、３．０ｍＭ Ｋ＋、１．４ｍＭ Ｃａ２＋、０．８ｍＭ Ｍｇ２＋、１．０ｍＭ ホスフェート、および１５５ｍＭ Ｃｌ－であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、ａＣＳＦは、１４８ｍＭ ＮａＣｌ、３ ｍＭ ＫＣｌ、１．４ｍＭ ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．４６５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ、および０．５３５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏを含有し得る。ａＣＳＦのｐＨは、必要に応じて、３～１０またはその範囲内である。ある特定の実施形態では、ｐＨは、６．１～７．４、好ましくは、６．４～６．９、たとえば、約６．６であり得る。
いくつかの研究により、ヒトＧＣアーゼは、薬理学的シャペロン、たとえば、イソファゴミンまたはアンブロキソール（Ｋｏｒｎｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ９， ２６４３－２６４９、Ｍａｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２８４， ２３５０２－２３５１６）が結合すると、中性ｐＨで安定化され得ることが報告されており、そのような薬理学的シャペロンは、本組成物に含まれ得る。
さらなる態様は、治療において使用するための、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物を提供する。関連する態様は、それを必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態は、グルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる疾患を処置する方法において使用するための、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物を提供する。関連する態様は、グルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる疾患の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
グルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる疾患は、広義には、健常または生理学的状態と比較して、細胞におけるグルコセレブロシダーゼ活性の低減もしくは減少または消失が、疾患、障害、または病態を引き起こすか、それに寄与するか、またはそれと関連する、任意の疾患、障害、または病態を包含する。例として、そのようなグルコセレブロシダーゼ活性の低減もしくは減少または消失は、天然のグルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子（たとえば、ヒトにおけるＧＢＡ１）における１つまたは複数の変異、特に、１つまたは複数の機能喪失変異の結果であり得る。限定することなく、そのような変異は、ＧＢＡ１遺伝子の転写の低減を引き起こし得るか、ＧＢＡ１転写物のプロセシング、安定性、輸送、もしくは翻訳を妨害し得るか、または天然のグルコセレブロシダーゼタンパク質の発現、プロセシング、輸送、構造、および／もしくは活性を変更し得る。限定することなく、グルコセレブロシダーゼタンパク質における変異としては、挿入、欠失、または置換を挙げることができ、これには、タンパク質の短縮形態をもたらすフレームシフト変異、およびタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸の置換をもたらす点変異が含まれる。あるいは、そのようなグルコセレブロシダーゼ活性の低減もしくは減少または消失は、天然のグルコセレブロシダーゼをコードする遺伝子における変異に起因しない場合があるが、グルコセレブロシダーゼに影響を及ぼす他の原因を有し得る。
ある特定の実施形態では、疾患は、ゴーシェ病である。この用語は、医療上の実施において十分に確立されており、とりわけ、ゴーシェ病のありとあらゆる臨床的に認識されているサブタイプ、たとえば、具体的には、Ｉ型（非神経障害性）、ＩＩ型（急性幼児期神経障害性）、およびＩＩＩ型（慢性神経障害性）が含まれる。
ある特定の実施形態では、疾患は、非神経障害性ゴーシェ病である。ある特定の実施形態では、全身的、たとえば、ＩＶ投与が、非神経障害性ゴーシェ病形態に好ましくあり得る。
ある特定の実施形態では、疾患は、神経障害性ゴーシェ病である。ある特定の実施形態では、ＩＣＶ投与が、神経障害性ゴーシェ病形態には好ましくあり得る。ある特定の実施形態では、疾患は、２型（ＧＤ２）、３型（ＧＤ３）、または周生期致死型（ＧＤＰＬ）の神経障害性ゴーシェ病である。
ある特定の実施形態では、疾患は、グルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーである。この文脈において、グルコセレブロシダーゼ関連とは、上記で説明されているように、グルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる（たとえば、それによって引き起こされるか、それに寄与するか、またはそれと関連する）疾患を指す。シヌクレイノパチーまたはα－シヌクレイノパチーは、広義には、神経系に罹患する疾患群、より具体的には、ニューロン、神経線維、またはグリア細胞におけるα－シヌクレインタンパク質の凝集物の異常な蓄積によって特徴付けられる、神経変性疾患を包含する。ある特定の実施形態では、ＩＣＶ投与が、グルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーには好ましくあり得る。
ある特定の実施形態では、グルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーは、パーキンソニズム、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（Ｌｅｗｉｓ Ｂｏｄｙ Ｄｅｍｅｎｔｉａ）（ＬＢＤ）である。
「治療法」または「処置」への参照は、広義には、治癒的または防止的の両方の処置を包含し、これらの用語は、特に、病態、たとえば、疾患または障害の１つまたは複数の症状または測定可能なマーカーの軽減または測定可能な減少を指し得る。これらの用語は、一次処置、ならびにネオアジュバント処置、アジュバント処置、および補助療法を包含する。測定可能な減少には、測定可能なマーカーまたは症状の任意の統計学的に有意な低下が含まれる。一般に、これらの用語は、治癒的処置、ならびに疾患の症状を低減するおよび／または進行を緩徐にすることを対象とした処置の両方を包含する。これらの用語は、すでに発症している病態の治療的処置、ならびに病態の発生の可能性を防止または減少させることを目的とした予防または防止措置の両方が包含される。ある特定の実施形態では、これらの用語は、治療処置に関し得る。ある特定の他の実施形態では、これらの用語は、防止処置に関し得る。寛解期間中の慢性病態の処置もまた、治療処置を構成すると考えることができる。この用語は、本発明の文脈において、適宜、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの処置を包含し得る。
「被験体」、「個体」、または「患者」という用語は、本明細書全体を通じて互換可能に使用され、典型的にかつ好ましくは、ヒトを指すが、非ヒト動物、好ましくは、温血動物、さらにより好ましくは、哺乳動物、たとえば、例として、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどへの参照も包含され得る。「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物、たとえば、哺乳動物、たとえば、非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（たとえば、マウスもしくはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、バッファロー、シカ、ウマ、ラバ、およびロバ、ならびに非哺乳動物、たとえば、鳥類、たとえば、ヒヨコを含むニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ヤマウズラ、キジ、アヒル、ガチョウ、またはハクチョウ、両生類、爬虫類などが含まれる。「哺乳動物」という用語には、ヒト、家畜および畜産動物、動物園の動物、競技用動物、愛玩用動物、コンパニオン動物、および実験動物、たとえば、例として、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、アレチネズミ、畜牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、および霊長類、たとえば、サルおよび類人猿（たとえば、チンパンジー、ヒヒ、またはサル）を含むがこれらに限定されない、そのような分類の任意の動物が含まれる。ある特定の実施形態では、被験体は、非ヒト哺乳動物である。両方の性別およびそれらのすべての年齢カテゴリーを含むヒト被験体が、特に好ましい。好ましくは、ヒト被験体に投与するためのＧＣアーゼは、ヒト野生型ＧＣアーゼまたは本明細書に記載されるそのバリアントもしくは断片であり得る。他の実施形態では、被験体は、実験動物または疾患モデルとしての動物代替物である。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、成体および新生の被験体、ならびに胎児が、雄性または雌性に関係なく、網羅されることが意図される。被験体という用語は、トランスジェニック非ヒト種を含むことがさらに意図される。
「処置を必要とする被験体」という用語または類似物は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される疾患と診断されたかもしくはそれを有する被験体、および／または前記疾患が防止しようとされる被験体を指す。
「治療有効量」という用語は、一般に、単回用量または複数回用量のいずれかで、医療従事者、たとえば、医師、臨床医、外科医、獣医、または研究者が求めている、とりわけ、処置している疾患の症状の緩和を含み得る、薬理学的作用または医学応答を被験体において誘起するのに十分な量を指す。「予防有効量」という用語は、一般に、単回用量または複数回用量のいずれかで、医療従事者が求めている防止的作用、たとえば、疾患の発症の阻害または遅延を被験体において誘起するのに十分な量を指す。キットオブパーツ（ｋｉｔｓ－ｏｆ－ｐａｒｔｓ）中の本組成物または成分の適切な予防または治療有効量は、疾患の性質および重症度、ならびに患者の年齢および状態を考慮して、責任者である有資格医師によって決定され得る。投与しようとする本明細書に記載されるキットオブパーツの組成物または成分の有効量は、多数の異なる因子に依存し得、日常的な実験を通じて当業者により決定することができる。考慮され得るいくつかの非限定的な因子としては、活性成分の生物学的活性、活性成分の性質、処置しようとする被験体の特徴などが挙げられる。「投与する」という用語は、一般に、分注または適用することを意味し、典型的には、組織へのｉｎ ｖｉｖｏ投与およびｅｘ ｖｉｖｏ投与の両方、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ投与が含まれる。一般に、組成物は、全身的または局所的に投与され得る。
必要に応じて、投与しようとする１つまたは複数の他の活性化合物と組み合わせた、本明細書において教示されるＧＣアーゼポリペプチドの投薬量または量は、個々の事例に依存し、慣例として、最適な作用を達成するために個別の状況に適合される。したがって、単位用量およびレジメンは、処置しようとする障害の性質および重症度に依存し、また、被験体の種、性別、年齢、体重、全般的な健康状態、食事、投与の様式および時間、免疫の状態、ならびに処置しようとするヒトまたは動物の個々の応答性、使用される化合物の有効性、代謝安定性および作用持続期間などの因子、治療が急性であるか慢性であるかもしくは予防的であるか、または本発明の薬剤に加えて他の活性化合物が投与されるかどうかにも依存する。治療有効性を最適化するために、本明細書に記載されるＧＣアーゼを、異なる投薬レジメンで最初に投与してもよい。典型的には、組織におけるＧＣアーゼのレベルは、たとえば、所与の処置レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として、適切なスクリーニングアッセイを使用してモニタリングすることができる。投薬の頻度は、医療従事者（たとえば、医師または看護師）の技能および臨床判断の範囲内である。典型的には、投与レジメンは、臨床試験によって確立され、それによって最適な投与パラメーターが確立され得る。しかしながら、従事者は、前述の因子、たとえば、被験体の年齢、健康状態、体重、性別、および医療ステータスのうちの１つまたは複数に応じて、そのような投与レジメンを変動させることができる。投薬の頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて変動し得る。
本明細書に記載されるＧＣアーゼポリペプチドの毒性および治療有効性は、たとえば、細胞培養物または実験動物において、公知の薬学的手順によって決定することができる。これらの手順は、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性作用と治療作用との用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が、好ましい。毒性副作用を呈する医薬組成物を使用することはできるが、正常な細胞（たとえば、非標的細胞）への損傷の可能性を最小限に抑え、それによって副作用を低減させるために、そのような化合物の標的を、罹患した組織の部位に定める送達系を設計するように注意を払う必要がある。
細胞培養アッセイおよび動物研究により得られたデータを、適切な被験体（たとえば、ヒト患者）において使用するための様々な投薬量を処方するのに使用することができる。そのような医薬組成物の投薬量は、一般に、毒性がほとんどないかまたはまったくないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内となる。投薬量は、この範囲内で、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変動し得る。本明細書に記載されるように使用される医薬組成物については、治療有効用量は、まず、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する医薬組成物の濃度）を含む、循環血漿濃度を達成するように処方され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
限定することなく、疾患の種類および重症度に応じて、本明細書において教示されるＧＣアーゼポリペプチドの典型的な投薬量（たとえば、典型的な１日投薬量または典型的な間欠的投薬量、たとえば、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、１週間ごと、１．５週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、１ヶ月ごと、またはその他の典型的な投薬量）は、上述の因子に応じて、１用量当たり、被験体の体重１ｋｇにつき約１０μｇ～約１００ｍｇの範囲に及び得、たとえば、１用量当たり、被験体の体重１ｋｇにつき約１００μｇ～約１０ｍｇ、または１用量当たり、被験体の体重１ｋｇにつき約２００μｇ～約２ｍｇの範囲に及び得、たとえば、毎日または間欠的に、好ましくは間欠的に、より好ましくは１週間ごとに、さらにより好ましくは１週間おきに、なおもさらに好ましくは１ヶ月ごとに、またはさらに低い頻度で、１用量当たり、被験体の体重１ｋｇにつき、約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、約１．０ｍｇ、約１．１ｍｇ、約１．２ｍｇ、約１．３ｍｇ、約１．４ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．６ｍｇ、約１．７ｍｇ、約１．８ｍｇ、約１．９ｍｇ、または約２．０ｍｇであり得る。例としてであり限定するものではなく、ＧＣアーゼは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約０．６ｍｇ／ｋｇ、または約０．７ｍｇ／ｋｇ、または約０．８ｍｇ／ｋｇ、または約０．９ｍｇ／ｋｇ、または約１．０ｍｇ／ｋｇ、または約１．５ｍｇ／ｋｇ、または約２．０ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約３．０ｍｇ／ｋｇ、または約３．５ｍｇ／ｋｇ、または約４．０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．６～０．８ｍｇ／ｋｇ、または約３～４ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、１週間に２回で投与され得る。
ＩＣＶ投与される場合、本明細書において教示されるＧＣアーゼは、脳重量１００ｇ当たり５～３０ｍｇ、たとえば、脳重量１００ｇ当たり１０～２０ｍｇ、たとえば、脳重量１００ｇ当たり約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍｇで投与され得る。例として、２～３歳の小児の脳のおよその重量は、１．２ｋｇであり、本明細書において教示されるＧＣアーゼは、そのような被験体に、１用量当たり６０ｍｇ～３６０ｍｇ、たとえば、１用量当たり１２０ｍｇ～２８０ｍｇ、たとえば、１用量当たり、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、または約２８０ｍｇ、たとえば、好ましくは、１用量当たり１８０ｍｇ～２４０ｍｇ、またはより好ましくは、１用量当たり２００ｍｇ～２２０ｍｇ、たとえば、特に好ましくは、１用量当たり約２１０ｍｇで投与され得る。そのような投与は、１週間に１回、１週間に２回、または１ヶ月に１回、好ましくは１週間に１回であり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物は、全身投与される。ある特定の実施形態では、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物は、静脈内（ＩＶ）、たとえば、ＩＶ注射または注入で投与される。そのような全身、特に、ＩＶ投与は、非神経障害性形態のゴーシェ病に特に好適であり得るが、これに限定されない。
ある特定の実施形態では、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与される。ＣＮＳ投与は、神経障害性ゴーシェ病形態およびＧＣアーゼ関連α－シヌクレイノパチーに特に好ましくあり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内、または実質内（ＣＮＳに）、好ましくは、ＩＣＶまたは髄腔内に、より好ましくはＩＣＶに、たとえば、ＩＣＶ注射または注入で投与される。ＩＣＶ投与、たとえば、ＩＣＶ注入または注射は、好ましくは、片側であり得、好ましくは、右または左のいずれかの側脳室に方向付けられ得る。反復的または慢性的なＩＣＶ、髄腔内、または実質内投与は、たとえば、カニューレまたはカテーテルを標的脳室に埋め込むことによって促進され得る。そのような系は、たとえば、ＵＳ２００５／０２０８０９０から、当該技術分野において公知である。
ある特定の実施形態では、疾患は、神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーであり、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内に投与される。
ある特定の実施形態では、疾患は、神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連α－シヌクレイノパチーであり、本明細書において教示されるグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）に投与される。
本出願はまた、以下の番号付けしたステートメントに記載されている態様および実施形態を提供する。
ステートメント１．グルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、前記グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％が、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、調製物または組成物。
ステートメント２．前記グルコセレブロシダーゼによって含まれる前記グリカンのうちの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべてが、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、ステートメント１に記載の調製物または組成物。
ステートメント３．前記マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのうちの少なくともいくつかが、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、ステートメント１または２に記載の調製物または組成物。
ステートメント４．前記マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、ステートメント１から３のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント５．前記グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％が、グリコシル化されている、ステートメント１から４のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント６．前記グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべてが、グリコシル化されている、ステートメント１から５のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント７．グルコセレブロシダーゼが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼ、またはヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントもしくは断片である、ステートメント１から６のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント８．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性、たとえば、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼに対して少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示す、ステートメント７に記載の調製物または組成物。
ステートメント９．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼと比べて増加した安定性および／または特異性を有する、ステートメント７または８に記載の調製物または組成物。
ステートメント１０．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１、Ｈ１４５、Ｆ３１６、およびＬ３１７からなる群より選択される１つまたは複数の位置における単一アミノ酸置換によって異なる、ステートメント７から９のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１１．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１における、またはＨ１４５における、またはＫ３２１およびＨ１４５における単一アミノ酸置換によって異なる、ステートメント７から１０のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１２．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１Ｎ置換によって、またはＨ１４５Ｌ置換によって、またはＫ３２１ＮおよびＨ１４５Ｌ置換によって異なる、ステートメント７から１１のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１３．マンノース－６－リン酸部分のマンノースが、末端マンノースである、ステートメント１から１２のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１４．マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンが、それぞれ独立して、ＰＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれからなる群より選択される、ステートメント１から１３のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
ステートメント１５．マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンが、それぞれ独立して、ＰＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれからなる群より選択される、ステートメント１から１４のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
ステートメント１６．マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンが、それぞれ独立して、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれからなる群より選択される、ステートメント１から１５のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
ステートメント１７．グルコセレブロシダーゼが、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、特に、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも３０％が少なくとも１つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、真菌細胞によって組換え発現される、グルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるか、または得られる、ステートメント１から１６のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１８．グルコセレブロシダーゼが、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、特に、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも３０％が少なくとも１つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞によって組換え発現される、グルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるか、または得られる、ステートメント１から１７のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１９．ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物または組成物を含む、医薬組成物。
ステートメント２０．グルコセレブロシダーゼが、人工脳脊髄液（ａＣＦＳ）を用いて製剤化される、ステートメント１９に記載の医薬組成物。
ステートメント２１．医薬組成物が、約６．４～６．９、好ましくは約６．６のｐＨを有する、ステートメント１９または２０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
ステートメント２２．治療において使用するための、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいはそれを必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２３．グルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる疾患を処置する方法において使用するための、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいはグルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる疾患の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２４．ゴーシェ病を処置する方法において使用するための、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいはゴーシェ病の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２５．非神経障害性ゴーシェ病を処置する方法において使用するための、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいは非神経障害性ゴーシェ病の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２６．神経障害性ゴーシェ病を処置する方法において使用するための、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいは神経障害性ゴーシェ病の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２７．神経障害性ゴーシェ病が、２型（ＧＤ２）、３型（ＧＤ３）、または周生期致死型（ＧＤＰＬ）である、ステートメント２６に記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２６に記載の方法。
ステートメント２８．グルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーを処置する方法において使用するための、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーの処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２９．グルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーが、パーキンソニズム、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）である、ステートメント２８に記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２８に記載の方法。
ステートメント３０．調製物もしくは組成物または医薬組成物が、全身投与される、ステートメント２２から２９のいずれか１つに記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２２から２９のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント３１．調製物もしくは組成物または医薬組成物が、静脈内（ＩＶ）投与される、ステートメント２２から３０のいずれか１つに記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２２から３０のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント３２．調製物もしくは組成物または医薬組成物が、中枢神経系に投与される、ステートメント２２から３０のいずれか１つに記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２２から３０のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント３３．調製物もしくは組成物または医薬組成物が、脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内に投与される、ステートメント２２から３０のいずれか１つに記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２２から３０のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント３４．神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーを脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内投与によって処置する方法において使用するための、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいは神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーの処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物を脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内投与するステップを含む、方法。
ステートメント３５．神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーを脳室内（ＩＣＶ）投与によって処置する方法において使用するための、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいは神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーの処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１から１８のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント１９から２１のいずれか１つに記載の医薬組成物を脳室内（ＩＣＶ）投与するステップを含む、方法。
ステートメント１＊．グルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、調製物または組成物。
ステートメント２＊．グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、ステートメント１＊に記載の調製物または組成物。
ステートメント３＊．グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの１０％を上回るものが、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、ステートメント１＊に記載の調製物または組成物。
ステートメント４＊．グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含み、それぞれ、グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの１５％を上回るか、または２０％を上回るか、または２５％を上回るか、または３０％を上回るか、または３５％を上回るか、または４０％を上回るか、または４５％を上回るものが、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、ステートメント３＊に記載の調製物または組成物。
ステートメント５＊．前記グルコセレブロシダーゼによって含まれる前記グリカンのうちの少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべてが、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、ステートメント３＊に記載の調製物または組成物。
ステートメント６＊．前記グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％が、グリコシル化されている、ステートメント１＊から５＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント７＊．前記グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべてが、グリコシル化されている、ステートメント１＊から６＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント８＊．グルコセレブロシダーゼが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼ、またはヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントもしくは断片である、ステートメント１＊から７＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント９＊．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼに対して少なくとも９０％の配列同一性、たとえば、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼに対して少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を示す、ステートメント８＊に記載の調製物または組成物。
ステートメント１０＊．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼと比べて増加した安定性および／または特異性を有する、ステートメント８＊または９＊に記載の調製物または組成物。
ステートメント１１＊．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１、Ｈ１４５、Ｆ３１６、およびＬ３１７からなる群より選択される１つまたは複数の位置における単一アミノ酸置換によって異なる、ステートメント８＊から１０＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１２＊．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１における、またはＨ１４５における、またはＫ３２１およびＨ１４５における単一アミノ酸置換によって異なる、ステートメント８＊から１１＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１３＊．ヒト野生型グルコセレブロシダーゼの生物学的に活性なバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１Ｎ置換によって、またはＨ１４５Ｌ置換によって、またはＫ３２１ＮおよびＨ１４５Ｌ置換によって異なる、ステートメント８＊から１２＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１４＊．マンノース－６－リン酸部分のマンノースが、末端マンノースである、ステートメント１＊から１３＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１５＊．２つのマンノース－６－リン酸部分を含むグリカンが、それぞれ独立して、Ｐ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群より選択される、ステートメント１＊から１４＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント１６＊．マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンが、それぞれ独立して、ＰＭａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれからなる群より選択される、ステートメント１＊から１４＊のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
ステートメント１７＊．マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンが、それぞれ独立して、ＰＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれからなる群より選択される、ステートメント１＊から１４＊のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
ステートメント１８＊．マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンが、それぞれ独立して、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれからなる群より選択される、ステートメント１＊から１４＊のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
ステートメント１９＊．グルコセレブロシダーゼが、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、特に、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも１０％が２つのマンノース－１－マンノース－６－ホスフェート部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、真菌細胞によって組換え発現される、グルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるか、または得られる、ステートメント１＊から１８＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント２０＊．グルコセレブロシダーゼが、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、特に、グリカンを含み、グリカンのうちの少なくとも１０％が２つのマンノース－１－ホスホ－６－マンノース部分を含むグルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａによって組換え発現される、グルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるか、または得られる、ステートメント１＊から１９＊のいずれか１つに記載の調製物または組成物。
ステートメント２１＊．ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物または組成物を含む、医薬組成物。
ステートメント２２＊．グルコセレブロシダーゼが、人工脳脊髄液（ａＣＦＳ）を用いて製剤化される、ステートメント２１＊に記載の医薬組成物。
ステートメント２３＊．医薬組成物が、約６．４～６．９、好ましくは約６．６のｐＨを有する、ステートメント２１＊または２２＊のいずれか１つに記載の医薬組成物。
ステートメント２４＊．治療において使用するための、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいはそれを必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２５＊．グルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる疾患を処置する方法において使用するための、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいはグルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる疾患の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２６＊．ゴーシェ病を処置する方法において使用するための、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいはゴーシェ病の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２７＊．非神経障害性ゴーシェ病を処置する方法において使用するための、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいは非神経障害性ゴーシェ病の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２８＊．神経障害性ゴーシェ病を処置する方法において使用するための、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいは神経障害性ゴーシェ病の処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント２９＊．神経障害性ゴーシェ病が、２型（ＧＤ２）、３型（ＧＤ３）、または周生期致死型（ＧＤＰＬ）である、ステートメント２８＊に記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２８＊に記載の方法。
ステートメント３０＊．グルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーを処置する方法において使用するための、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーの処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
ステートメント３１＊．グルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーが、パーキンソニズム、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）である、ステートメント３０＊に記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント３０＊に記載の方法。
ステートメント３２＊．調製物もしくは組成物または医薬組成物が、全身投与される、ステートメント２４＊から３１＊のいずれか１つに記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２４＊から３１＊のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント３３＊．調製物もしくは組成物または医薬組成物が、静脈内（ＩＶ）投与される、ステートメント２４＊から３２＊のいずれか１つに記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２４＊から３２＊のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント３４＊．調製物もしくは組成物または医薬組成物が、中枢神経系に投与される、ステートメント２４＊から３２＊のいずれか１つに記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２４＊から３２＊のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント３５＊．調製物もしくは組成物または医薬組成物が、脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内に投与される、ステートメント２４＊から３２＊のいずれか１つに記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物、あるいはステートメント２４＊から３２＊のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント３６＊．神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーを脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内投与によって処置する方法において使用するための、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいは神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーの処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物を脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内投与するステップを含む、方法。
ステートメント３７＊．神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーを脳室内（ＩＣＶ）投与によって処置する方法において使用するための、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物、あるいは神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーの処置を、それを必要とする被験体において行うための方法であって、被験体に、予防または治療有効量の、ステートメント１＊から２０＊のいずれか１つに記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、またはステートメント２１＊から２３＊のいずれか１つに記載の医薬組成物を脳室内（ＩＣＶ）投与するステップを含む、方法。
３文字コードおよび１文字コードのアミノ酸を、表１に列挙する。
Figure 2022523104000011
本発明は、その具体的な実施形態と関連して記載されているが、多数の代替形態、改変形態、および変形形態が、前の記述を踏まえれば当業者に理解されるであろうことは明らかである。したがって、以下のすべてのそのような代替形態、改変形態、および変形態が添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲に包含されることが意図される。
本明細書において開示される本発明の態様および実施形態を、以下の非限定的な実施例によってさらに裏付ける。
（実施例１）
組換えグルコセレブロシダーゼポリペプチドの構造
本明細書に報告される前臨床研究において使用したヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの図による概要を、図１に示す。「Ｌ２ｐｒｅ」は、アミノ酸配列ＭＫＬＳＴＩＬＦＴＡＣＡＴＬＡＡＡ（配列番号６）を有するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ＹＬ）リパーゼ２（Ｌｉｐ２）に由来するシグナルペプチドを指す。配列番号６のＣ末端に含まれる２つの余剰なアラニン残基（ＡＡ）により、小胞体におけるＬ２ｐｒｅの適切なプロセシングが確保される。ＡＡモチーフは、アミノペプチダーゼによって除去される。２つのアラニン残基は、本質的に、Ｌｉｐ２ｐｒｅの直後のＬｉｐ２プロ領域の最初の２つのアミノ酸である。Ｌ２ｐｒｅシグナルペプチドは、天然のシグナルペプチドが欠如したそれぞれのＧＣアーゼ配列のＮ末端に融合し、ＹＬ細胞によって組換え産生されるＧＣアーゼポリペプチドの分泌を促進するが、小胞体内でのポリペプチドのプロセシング中に酵素的に除去され、その結果、Ｌ２ｐｒｅシグナルペプチドは、さらなる実験に使用される分泌タンパク質には存在しなくなる。「Ｈｉｓ８」または「Ｈ８」は、ＧＣアーゼ配列のＣ末端に融合された８つの連続的なヒスチジン（８×Ｈｉｓ）のポリヒスチジンタグを指す。単一アミノ酸置換Ｈ１４５Ｌおよび／またはＫ３２１Ｎの位置は、成熟ヒト野生型ＧＣアーゼのアミノ酸配列と比べて示されており、すなわち、天然のシグナルペプチドは除去されている。成熟ヒト野生型ＧＣアーゼの例は、本明細書の他の箇所において、配列番号２に示されている）。
「ＧＣアーゼ（Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ）－Ｈｉｓ８」ポリペプチド構築物のアミノ酸配列は、ＹＬ細胞によって分泌される成熟ポリペプチドに不在のＬ２ｐｒｅシグナルペプチド（下線）を含め、以下の配列番号７に示されており、８×Ｈｉｓタグは太字で示されている。
Figure 2022523104000012
「ＧＣアーゼ（Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ）」ポリペプチド構築物のアミノ酸配列は、ＹＬ細胞によって分泌される成熟ポリペプチドに不在のＬ２ｐｒｅシグナルペプチド（下線）を含め、以下の配列番号８に示されている。
Figure 2022523104000013
Figure 2022523104000014
「ＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）」ポリペプチド構築物のアミノ酸配列は、ＹＬ細胞によって分泌される成熟ポリペプチドに不在のＬ２ｐｒｅシグナルペプチド（下線）を含め、以下の配列番号８に示されている。
Figure 2022523104000015
比較実験のために、商品名Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）でＧｅｎｚｙｍｅ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．、Ｎａａｒｄｅｎ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから商業的に入手可能な注射用イミグルセラーゼ（ＩＮＮ）（ＣＡＳ番号１５４２４８－９７－２）を使用した。イミグルセラーゼは、哺乳動物チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物において産生された組換えヒトグルコセレブロシダーゼである。イミグルセラーゼは、４つのＮ－結合型グリコシル化部位を含有する４９７個のアミノ酸のモノマー糖タンパク質であり、胎盤性グルコセレブロシダーゼとは、４９５位における１つのアミノ酸が異なり、そこではアルギニンがヒスチジンに置換されている。グリコシル化部位におけるオリゴ糖鎖は、マクロファージ上のエンドサイトーシス性炭水化物受容体によって認識されるマンノース糖で終わるように改変されている。
ある特定の比較実験のために、商品名ＶＰＲＩＶ（登録商標）でＳｈｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｉｍｉｔｅｄから商業的に入手可能な注射用ベラグルセラーゼアルファ（ＩＮＮ）も使用した。ベラグルセラーゼアルファは、野生型ヒトグルコセレブロシダーゼと同じアミノ酸配列を有し、ＨＴ－１０８０ヒト線維芽細胞系において組換え産生される。
（実施例２）
組換えグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドを発現する真菌細胞の産生
実施例１に記載されるグルコセレブロシダーゼＫ３２１ＮまたはＨ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ ＧＣアーゼバリアントをコードする核酸を、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａによる発現のためにコドン最適化し、示される箇所に８×Ｈｉｓタグを付加して、合成した。得られたコード配列を、Ｌ２ｐｒｅシグナルペプチドの後にインフレームでクローニングした。ＧＣアーゼ（Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ）－Ｈｉｓ８ポリペプチドをコードするコドン最適化したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列を、以下の配列番号９に示し、Ｌ２ｐｒｅシグナルペプチドおよび８×Ｈｉｓタグをコードする配列を、それぞれ、下線および太字で示す。開始コドンおよび終止コドンを、斜体で示す。Ｌ１４５およびＮ３２１のコドンを、枠で示す。
Figure 2022523104000016
ＧＣアーゼ（Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ）ＯＲＦは、配列番号９と実質的に同一であるが、８×Ｈｉｓタグをコードする太字のヌクレオチドが欠如している。ＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）ＯＲＦは、配列番号９と実質的に同一であるが、８×Ｈｉｓタグをコードする太字のヌクレオチドが欠如しており、Ｌ１４５コドンＣＴＣの代わりにヒスチジンをコードするコドンであるＣＡＣを有する。
それぞれのＧＣアーゼＯＲＦを、Ｈｐ４ｄプロモーターの制御下において、ＹＬ発現ベクター（図２３に概略的に示される）に導入した。Ｅ．ｃｏｌｉからのベクターの増殖および単離の後、ベクターを、Ｎｏｔ Ｉ制限ヌクレアーゼによって消化させて、細菌配列を除去し、ＧＣアーゼ発現カセットおよびＹＬ選択マーカーを含有する組込み断片を得た。組込み断片は、アガロースゲル電気泳動によって、続いてＱｉａｇｅｎカラム精製によって分離した。ＹＬ細胞へのそれぞれの組込み断片の形質転換および形質転換体の選択を、十分に確立されているプロトコールに従って行った。
それぞれのＧＣアーゼＯＲＦを、ＹＬ細胞に形質転換し、分泌される糖タンパク質に多量のリン酸化Ｎ－グリカンを合成するように遺伝子操作した。この糖操作株は、野生型株Ｗ２９（ＡＴＣＣ（登録商標）２０４６０（商標）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ． Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０－２２０９、ＵＳＡから入手可能、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）の誘導体である研究室株ｐｏ１ｄ（ＣＬＩＢ１３９、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｄｅ Ｌｅｖｕｒｅｓ ｄ’Ｉｎｔｅｒｅｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｑｕｅ、ＣＩＲＭ－Ｌｅｖｕｒｅｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ＩＮＲＡ、Ｄｏｍａｉｎｅ ｄｅ Ｖｉｌｖｅｒｔ、Ｂａｔ．４４２、７８３５２ Ｊｏｕｙ－ｅｎ－Ｊｏｓａｓ、Ｆｒａｎｃｅから入手可能、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ６．ｉｎｒａ．ｆｒ／ｃｉｒｍ＿ｅｎｇ／Ｙｅａｓｔｓ／Ｓｔｒａｉｎ－ｃａｔａｌｏｇｕｅ）に由来し、以下の遺伝子型：Ｍａｔ Ａ、ｕｒａ３－３０２、ｌｅｕ２－２７０、ａｄｅ２－８４４、ｘｐｒ２－３２２を有する。株は、特に、以下を含むさらなる遺伝子改変を含む。
－ ＯＣＨ１遺伝子の欠失：これにより、分泌される糖タンパク質への高グリコシル構造の合成の可能性が抑止される。全細胞外タンパク質上の主要なＮ－グリカンは、中性Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２である。
－ Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＭＮＮ４遺伝子の２つのＨｐ４ｄプロモーター駆動型発現カセットの標的化された組込み：これは、ほぼすべての中性Ｎ－グリカンの、１つまたは２つのホスホマンノース部分を含有する構造への変換をもたらす。全細胞外タンパク質上の主要なＮ－グリカンは、ＭａｎＰ－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２および（ＭａｎＰ）２－Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２である。
形質転換したＹＬ細胞を、制御されたバイオリアクター培養中で成長させて、それぞれのＧＣアーゼＯＲＦを過剰発現させ、発酵ブロス内への分泌をもたらした。標準的な発酵プロセスは、３つの主要培養フェーズからなっていた：単一コロニーからの予備培養、主要発酵の出発材料としてのバイオマスを産生するための培養前培養、ならびにバッチフェーズおよび１つまたは複数の供給フェーズを含む主要発酵。標準的なＹＳＧ（１ｗ／ｖ％の酵母抽出物、２ｗ／ｖ％のｓｏｙｔｏｎ、２ｖ／ｖ％のグリセロール）培地を、予備培養および培養前培養に使用し、一方でグリセロールを炭素供給源として使用した既定培地（５ｇ／Ｌ）を、主要発酵において使用した。１つまたは複数の供給フェーズにおいて、６００ｇ／Ｌグリセロール、４．６％ｓｏｙｔｏｎ、および微量元素を添加した。
（実施例３）
組換えグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの単離、脱キャッピング、および脱マンノシル化
Ｈｉｓタグを付けたＧＣアーゼバリアントの精製プロセスは、Ｎｉ－ＩＭＡＣクロマトグラフィーステップに基づいていた。清澄化した発酵ブロスを、第１のＮｉ－ＩＭＡＣカラム（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）にローディングした。５０ｍＭイミダゾールで洗浄した後、Ｈｉｓタグを付けたＧＣアーゼを、４００ｍＭイミダゾールで溶出させた。５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５への緩衝液交換を、溶出画分に行った。ＺｎＣｌ２濃度を、０．２ｍＭに調整し、タチナタマメアルファ－マンノシダーゼを、重量対重量の比で１５／１００のマンノシダーゼ／ＧＣアーゼで添加した。マンノシダーゼがリン酸キャッピングマンノース残基を除去し、さらにタンパク質が連結したＮ－グリカンを脱マンノシル化するのを可能にするために、混合物を、３０℃で１６時間インキュベートし、９０ｒｐｍで振盪させた。インキュベーションの後、産物を、１０分間（４℃、４０００ｇで）遠心分離して、沈殿した材料を除去した。上清を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．２中に緩衝液交換し、Ｎｉ－ＩＭＡＣカラム（Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）に２回目のローディングを行い、タチナタマメマンノシダーゼおよび残留宿主細胞タンパク質を除去した。この目的で、カラムを、１００ｍＭで洗浄し、Ｈｉｓタグを付けたＧＣアーゼを、４００ｍＭイミダゾールで溶出させた。溶出画分を、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に緩衝液交換し、硫酸アンモニウムを、０．９Ｍの最終濃度まで添加した。混合物を、疎水性相互作用カラム（Ｅｔｈｅｒ ６５０－Ｍ）に最終精錬ステップとしてローディングした。Ｈｉｓタグを付けたＧＣアーゼは、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０に、９８％を上回る純度で溶出された。
タグしていないＧＣアーゼバリアントの精製に使用した１つのプロトコールを、以下に記載する。回収し清澄化した発酵ブロスに硫酸アンモニウム（０．９Ｍ最終濃度）を添加した後、ＰＰＧ－６００Ｍ樹脂上の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を、分泌されたＧＣアーゼバリアントの捕捉ステップとして使用した。目的のタンパク質を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．２を適用することによって、ＰＰＧカラムから溶出させた。ＨＩＣ溶出画分は、２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．０に交換し、２５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０のスパイクすることによって、さらにｐＨ４．５に調整した。中間体精製ステップとして、材料を、次に、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ樹脂でのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）によって処理した。ＧＣアーゼを、０から１０００ｍＭのＮａＣｌ勾配を適用することによって、カラムから溶出した。ＧＣアーゼを含有する画分を、プールした。プールのＺｎＣｌ２濃度を、０．２ｍＭに調整し、タチナタマメアルファ－マンノシダーゼを、重量対重量の比で１５／１００のマンノシダーゼ／ＧＣアーゼで添加した。マンノシダーゼがリン酸キャッピングマンノース残基を除去し、さらにタンパク質が連結したＮ－グリカンを脱マンノシル化するのを可能にするために、混合物を、３０℃で１６時間インキュベートし、９０ｒｐｍで振盪させた。インキュベーションの後、産物を、１０分間（４℃、４０００ｇで）遠心分離して、沈殿した材料を除去した。上清を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に交換した後、２回目のカチオン交換クロマトグラフィーステップ（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＳＥ樹脂）により、添加したタチナタマメアルファ－マンノシダーゼを除去し、宿主細胞タンパク質含量をさらに低減させた。タンパク質を、０から１０００ｍＭのＮａＣｌ勾配を適用することによって、カラムから溶出させた。ＧＣアーゼを含有する画分をプールし、続いて、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０に緩衝液交換し、硫酸アンモニウムを０．９Ｍの最終濃度まで添加した、次いで、産物を、２回目の疎水性相互作用カラム（Ｅｔｈｅｒ－６５０ Ｍ）にローディングし、これが、最終精錬クロマトグラフィーステップとしての機能を果たした。０．９Ｍから０Ｍの勾配の硫酸アンモニウムを適用して、結合したタンパク質を溶出させ、完全サイズのＧＣアーゼ産物のみを含有する画分をすべてプールした。この２回目のＨＩＣステップの導入により、９８％を上回る最終ＧＣアーゼ純度が得られた。
本実施例では、ＧＣアーゼ（Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ）－Ｈｉｓ８、ＧＣアーゼ（Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ）、またはＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）グルコセレブロシダーゼバリアント、特に、それらの脱キャッピングおよび脱マンノシル化形態は、それぞれ、標識「ＯｘｙＧＣアーゼ」で参照され得る。実施例および／または文脈により、そのバリアントがどの状況にあるべきかを定義する。
（実施例４）
組換えグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドのＮ－グリカン構造
Ｎ－グリカンを、Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）を用いて、最大１０μｇの変性した脱キャッピングおよび脱マンノシル化ＧＣアーゼポリペプチドから、溶液中に放出させた（３７℃で３時間）。インキュベーションした後、４体積の氷冷アセトンを添加し、混合物を、－２０℃で少なくとも２０分間インキュベートした。１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去した。沈殿したタンパク質および放出されたＮ－グリカンの混合物を含有するペレットに、６０％氷冷メタノールを添加して、Ｎ－グリカンを可溶化させた。遠心分離ステップ（１３，０００ｒｐｍで５分間）の後、Ｎ－グリカンを含有する上清を採取し、真空遠心分離機において６０℃で乾燥させた。乾燥したＮ－グリカン試料を、ＡＰＴＳ（８－アミノ－１，３，６－ピレントリスルホン酸三ナトリウム塩）で標識し、過剰な未反応標識を除去した後、ＤＳＡ－ＦＡＣＥ（ＤＮＡシーケンサー補助フルオロフォア補助炭水化物電気泳動）で分析した。グリカンの標識、後処理、および電気泳動の方法は、本質的に、Ｌａｒｏｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００６， ｖｏｌ． １， ３９７－４０５に記載されるプロトコールに従う。
本明細書において調製した脱キャッピングおよび脱マンノシル化ＧＣアーゼポリペプチドのうちの１つの単離したＮ－グリカンの代表的なＤＳＡ－ＦＡＣＥ電気泳動図を、ピーク注釈を含め、図２に示す。類似のプロファイルが、本明細書において調製したすべてのＧＣアーゼポリペプチドについて得られた（示されていない）。実質的にすべての検出可能なＮ－グリカンが、リン酸化されており、非常に高い比率が二リン酸化されていた（Ｍ５Ｐ２、Ｍ６Ｐ２）。図２における注釈に対応するＮ－グリカン構造は、図３に示される。
Ｎ－グリカン構造を、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）およびＶＰＲＩＶ（登録商標）調製物について、同様に決定した。図４は、脱キャッピングおよび脱マンノシル化したＯｘｙＧＣアーゼポリペプチドのうちの１つ（上部パネル）、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（中央パネル）、およびＶＰＲＩＶ（登録商標）（下部パネル）の単離されたＮ－グリカンの代表的なＤＳＡ－ＦＡＣＥ電気泳動図を、二リン酸化（２Ｐ）、一リン酸化（１Ｐ）、および非リン酸化（中性）Ｎ－グリカンに対応するピークの注釈を含めて示す。上部パネルには、本明細書に記載されているＧＣアーゼの実施形態を表し、実質的にすべての検出可能なＮ－グリカンが、リン酸化されており、４６％（数で）が二リン酸化Ｎ－グリカンであり、５４％（数で）が一リン酸化Ｎ－グリカンであった。中央のパネルには、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）を表し、１６％（数で）のＮ－グリカンのみがリン酸化されており、より具体的に一リン酸化されており、残りは中性であった。二リン酸化Ｎ－グリカンは、実質的に検出可能ではなかった。下部のパネルには、ＶＰＲＩＶ（登録商標）を表し、Ｎ－グリカンのうちの２５％（数で）のみがリン酸化されており、より具体的には一リン酸化されており、残りは中性であった。二リン酸化Ｎ－グリカンは、実質的に検出可能ではなかった。
（実施例５）
ニューロン細胞およびミクログリアによる組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの取込み
培養したヒト神経芽細胞腫細胞（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ － ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＣＲＬ－２２６６）を、脱キャッピングおよび脱マンノシル化したＯｘｙＧＣアーゼポリペプチドと接触させ、ＧＣアーゼの取込みを測定した。Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）およびＶＰＲＩＶ（登録商標）は、対照として使用した。本質的には、細胞を、２４ウェルプレートの個々のウェルにつき０．８×１０５個の細胞で、増殖培地に播種した。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、内因性グルコセレブロシダーゼ活性を有するため、それらを、異なる濃度（二連に行う）の外来的に添加されるグルコセレブロシダーゼバリアントでの刺激の前に、まず、不可逆的阻害剤コンズリトールＢエポキシド（ＣＢＥ）で一晩処置した。２時間後に、刺激した細胞を、溶解させ、酵素取込み（総タンパク質１ｍｇ当たりの単位として表す）を、４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド（４ＭＵβＧｌｃ）アッセイを使用して、ライセートにおいて決定した。このアッセイは、ＧＣアーゼが、酸性条件下（ｐＨ４．５）および適合性の温度（３７℃）において、蛍光性４ＭＵβＧｌｃをグルコースおよび４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）に変換することができるという事実に基づく。所定量の時間の後に、アルカリ性停止溶液を添加することによって、反応を停止させ、これにより、放出される４－ＭＵの蛍光強度も最大化される。蛍光放出を、４６０／４０ｎｍにおいて、３６０／４０ｎｍでの励起で測定した。現在使用されているアッセイ条件下において、蛍光シグナルの強度は、活性酵素の量に比例し、４－ＭＵ標準曲線の蛍光値に基づいて、放出される４－ＭＵの量（μｍｏｌで表す）に変換することができる。活性の１単位は、以下のアッセイ緩衝液：１１１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４４ｍＭクエン酸、０．５％ＢＳＡ、１０ｍＭタウロコール酸ナトリウム、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、ｐＨ５．５中、５ｍＭの基質開始濃度で、３７℃において、１分当たり１μｍｏｌの４ＭＵβＧｌｃの加水分解（または１μｍｏｌの４－ＭＵの放出）を触媒する酵素の量と考える。酵素調製物の比活性（単位／ｍｇ）は、測定した単位／ｍＬを、確立されたタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬで表され、たとえば、ＯＤ２８０測定によって決定される）で除すことによって決定した。
未刺激のＣＢＥ処置細胞を使用して、ライセート内のバックグラウンド活性レベルを決定した。ライセートタンパク質１ｍｇ当たりの正規化したグルコセレブロシダーゼ活性を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて刺激濃度（ｎＭ単位）に対してプロットした。生成されたデータ点を、双曲線を使用して適合させ、刺激中の取込み速度と適用した酵素濃度との間の関係性を示し、試験した酵素バリアントのＫｕｐｄａｔｅ値の決定を可能にした。取込みの機序をさらに示すために、細胞を、Ｍ６Ｐ、マンナン、または両方の存在下でも刺激して、それぞれ、Ｍ６Ｐ受容体（Ｍ６ＰＲ）、マンノース受容体、または両方による取込みを特異的に遮断した。細胞取込みの程度における相違は、３つすべての酵素について、同じグラフに、正味のＭ６ＰＲに媒介される取込み（すなわち、Ｍ６ＰＲに媒介されない細胞取込みの値を、全体的な細胞取込みの値から差し引いた後）の曲線をプロットした場合に、もっとも良好に例証され（図５）、ＯｘｙＧＣアーゼが、ニューロン細胞によって、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（ＫＵＰＴＡＫＥ＝１０４±３３ｎＭ）またはＶＰＲＩＶ（登録商標）（ＫＵＰＴＡＫＥ＝１７０±４５ｎＭ）よりもかなり高い程度まで取り込まれたことを示す（ＫＵＰＴＡＫＥ＝１．９±０．８ｎＭ）。
培養したマウスミクログリア（ＡＴＣＣ（登録商標）受託番号ＣＲＬ－２４６７）を、上述のようにＯｘｙＧＣアーゼと接触させ、ＧＣアーゼ取込みを測定した。Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）を、対照として使用した。ある特定の実験では、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）を添加して、細胞上のＭ６Ｐ受容体と競合させた。ある特定の実験では、Ｍ６Ｐおよびマンナンの両方を添加して、細胞上のＭ６Ｐおよびマンノース受容体の両方と競合させた。図６は、ＯｘｙＧＣアーゼが、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）よりも効率的にマウスミクログリアによって取り込まれたことを示す。Ｍ６Ｐの添加により、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）単独の取込みと同様に、ＯｘｙＧＣアーゼ取込みが低減され、これは、Ｍ６Ｐ受容体に媒介される取込みの画分との競合と一致していた。Ｍ６Ｐ＋マンナンの添加により、ＯｘｙＧＣアーゼ取込みが、なおもさらに低減された。Ｍ６Ｐは、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）が、リン酸化マンノースを含有するＮ－グリカンを実質的に欠如しているという事実と一致して、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の取込みを観察できるほど低減させることはなかった。Ｍ６Ｐ＋マンナンは、ＯｘｙＧＣアーゼ＋Ｍ６Ｐ＋マンナンの取込みと実質的に同じように、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の取込みを低減させた。
（実施例６）
神経障害性ゴーシェ病のマウスモデル
本実施例では、ゴーシェ病モデルＧｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウスを用いる。Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスは、３型ゴーシェ病およびパーキンソン病のモデルとして生成され（Ｄａｖｅ ｅｔ ａｌ． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｈａｅｌｊｆｏｘ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅｓ／ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ／ＭＪＦＦＧＢＡ＿ＳＦＮ＿ＯＣＴ２０１５．ｐｄｆ）、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｏｃｋ番号０１９１０６で入手可能である。これらのマウスは、変異体Ｄ４２７ＶマウスＧｂａ１タンパク質を発現し、これは、ゴーシェ病患者におけるもっとも一般的なヒトＧＢＡ１変異のうちの１つ（Ｄ４０９Ｖ）に対応する（Ｈｒｕｓｋａ． Ｇａｕｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ： ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ （ＧＢＡ）． Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ． ２００８， ｖｏｌ． ２９， ５６７－８３）。Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスは、有利なことに、２～３週間の寿命しかない重症２型ゴーシェ病マウスモデル（Ｋ１４－Ｃｒｅ ｇｂａｌｎｌ／ｌｎｌおよびＮｅｓｔｉｎ－Ｃｒｅ ｇｂａｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）と比較して、より長い寿命を示す。ホモ接合型Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスは、ＧＣアーゼ基質のうちの１つであるグリコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）を、脳および肝臓の両方において蓄積することがこれまでに示されている（Ｄａｖｅ ｅｔ ａｌ．（上記））。
（実施例７）
マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの脳室内（ＩＣＶ）送達
続く実施例７～１２に記載される研究については、１８～２７週齢のマウスに、片側カニューレを埋め込んだ。カニューレ埋込みの適切な部位を確認するために、初回注入の開始時点で、脳脊髄液（ＣＳＦ）を、側脳室から引き出し、殺処分の直前に、マウスにメチレンブルーを注入した。マウスを、１週間に１回（ＥＷ）、１週間に２回（ＢＷ）、または１日おき（ＥＯＤ）に、１～１２週間連続で、試験物品のボーラス（１０～２０分）または緩徐注入（３時間）により処置した。研究の一部において、ＩＣＶ処置後の異なる時点で、血漿を採取した。最後の注入から３時間後、４８時間後、または１～２週間後に、マウスに麻酔を行い、血液およびＣＳＦ（最終研究の場合）を採取した後、食塩水灌流ならびに脳および肝臓の切開を行った。組織試料を、以下に記載されるように、さらなる分析のためにホモジナイズした。
ヘキソシルスフィンゴシン（ＨｅｘＳｐｈ）レベル（２つのエピマー、ＧｌｃＳｐｈおよびＧａｌＳｐｈを含む）を、ＲＰ－ＬＣ Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ（逆相液体クロマトグラフィーと高分解能四重極飛行時間型質量分析法を組み合わせたもの）分析によって分析した。動物のサブグループにおいて、ＧｌｃＳｐｈとＧａｌＳｐｈとの間の区別は、ＳＰＥ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ（固相抽出－親水性相互作用液体クロマトグラフィー－質量分析法）分析によって行った。ＨｅｘＳｐｈ分析のホモジナイゼーション緩衝液は、内部標準物ＧｌｃＳｐｈ－ｄ５（番号８６０６３６Ｐ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ストック１ｐｐｍまたは１ｎｇ／ｍＬ）およびＣ１８ ＧｌｃＣｅｒ－ｄ５（番号８６０６３８Ｐ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ストック２０ｐｐｍまたは２０ｎｇ／ｍＬ）でスパイクしたメタノールからなり、３００μＬのメタノール当たり５ｎｇのＧｌｃＳｐｈ－ｄ５および１００ｎｇのＣ１８ ＧｌｃＣｅｒ（ｄ１８：１－ｄ５／１８：０）の最終濃度であった。ＧａｌＳｐｈおよびＧｌｃＳｐｈ分析のホモジナイゼーション緩衝液は、内部標準物ＧｌｃＳｐｈ－ｄ５（番号８６０６３６Ｐ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ストック１ｐｐｍまたは１ｎｇ／ｍＬ）およびＣ１８ ＧｌｃＣｅｒ－ｄ５（番号８６０６３８Ｐ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ストック２００ｐｐｍまたは２００ｎｇ／ｍＬ）でスパイクしたアセトンからなり、アセトン１ｍＬ当たり４０ｎｇのＧｌｃＳｐｈ－ｄ５および４００ｎｇのＣ１８ ＧｌｃＣｅｒ（ｄ１８：１－ｄ５／１８：０）の最終濃度であった。いずれの分析についても、組織を、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）チューブ（番号ＫＴ０３９６１－１２０３．０．５）および１．４ｍｍ酸化ジルコニウムビーズ（番号ＫＴ０３９６１－１－１０３．ＢＫ）を使用して、２００ｍｇ／ｍＬの濃度でＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）Ｍｉｎｉビーズホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ）により、５０００ｒｐｍで３０秒間を２回、１５秒間隔でホモジナイズした。１４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離の後、上清を、新しいチューブに移し、３００μＬをＨｅｘＳｐｈ（およびＨｅｘＣｅｒ）分析に使用し、２５０μＬをＧｌｃＳｐｈおよびＧａｌＳｐｈ分析に使用した。
ＨｅｘＳｐｈ分析については、１ｍＬのメチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を３００μＬのホモジネート上清に添加することによって、脂質抽出を行った。振盪（１時間、室温）を行った後、２６０μＬの水を添加し、続いて、さらなる振盪およびインキュベーションステップ（１０分間、室温）を行った。遠心分離（１０分間、１０００ｇ）の後に、上部の相を採取し、真空蒸発させ、２／１のメタノール／クロロホルム（ｖ／ｖ）において再構成させた。この脂質画分を、次いで、ＲＰ－ＬＣ Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳによってさらに分析した。ＬＣ－ＭＳ方法は、Ｓａｎｄｒａら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ． ２０１０， ｖｏｌ． １２１７， ４０８７－４０９９から適合させた。以下の分析条件を適用した：カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８カラム（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）－カラム温度８０℃、注入体積１０μＬ；移動相：Ａ＝２０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ５；Ｂ＝メタノール；流量：０．５ｍＬ／分；勾配：０～５分は５０～７４％のＢ；５～６分は７４～８５％のＢ；６～１６分は８５～９０％のＢ；１６～１７分は９０～９４％のＢ、１７～２６分は９４～１００％のＢ、および９分のポストタイムは５０％のＢ。
高分解能の正確な質量スペクトルを、二重Ｊｅｔｓｔｒｅａｍエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えるＡｇｉｌｅｎｔ ６５４５ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計（ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で得た。この機器は、エレクトロスプレー正イオン化モードで操作した。クロマトグラフィー分離は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣシステム（１２９０ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｐｕｍｐ、Ｇ７１２０Ａ；１２９０ Ｍｕｌｔｉｓａｍｐｌｅｒ、Ｇ７１６７Ｂ；１２９０ ＭＣＴ、Ｇ７１１６Ｂ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で達成した。スタンドアロン型Ｓａｎｄｒａ／Ｓｅｌｅｒｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ ９０００ Ｐｏｌａｒａｔｈｅｒｍオーブン（Ｓｅｌｅｒｉｔｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＴ、ＵＳＡ）を、分析カラムの温度制御に使用した。生のデータを、付属のＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアパッケージ（Ｂ．０７ ＳＰ１、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して処理した。
ＧｌｃＳｐｈ＋ＧａｌＳｐｈ分析のために、上清に対する脂質抽出を、１．５ｍＬのアセトンを２５０μＬのホモジネートに添加し、続いて強力なボルテックスおよび遠心分離ステップ（１０分間、１５．０００ｇ）を行い、その後に、上清を、遠心分離真空蒸発によって乾燥させ、２／１のクロロホルム／メタノール（ｖ／ｖ）５００μＬにおいて再構成させた。これらの試料に対して、試料をＳＰＥカートリッジ（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｖａｃ １ ｃｃ Ａｃｃｅｌｌ Ｐｌｕｓ ＣＭ（Ｗａｔｅｒｓ、番号ＷＡＴ０２３６２５）にローディングし、２×１ｍＬの２／１（ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノールでコンディショニングし、続いてフロースルー（＝ブレークスルー画分）を採取することによって、固相抽出（ＳＰＥ）を行う。溶出は、３０／６０／８（ｖ／ｖ／ｖ）のクロロホルム／メタノール／水５００μＬで４回溶出することによって行った。第１の画分は、ブレークスルー画分と一緒に採取し、これは、Ｇｌｃ－およびＧａｌＣｅｒからなる。Ｇｌｃ－およびＧａｌＳｐｈは、第２～第４の溶出画分において採取される。画分を、遠心分離真空蒸発によって乾燥させた。両方の画分を、２０μＬのメタノール中に溶解させ、ＨＩＬＩＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ＨＩＬＩＣ Ｐｌｕｓ ＲＲ ＨＤ（２．１×１５０ｍｍ、１．８μｍ））においてｖ／ｖ／ｖで８６／７／７のアセトニトリル／水／メタノール＋０．１％ギ酸＋３１５ｍｇ／Ｌ ギ酸アンモニウムからなる均一濃度溶出で分離した。適用した流量は、０．８ｍＬ／分であり、カラム温度は、２５℃である。
組織内のＧＣアーゼレベルの分析を、４ＭＵβＧｌｃ活性アッセイ（本質的には実施例５に記載される通り）またはａｌｐｈａＬＩＳＡによって行った。組織試料のホモジナイゼーション（１重量体積の脳組織に、５重量体積のホモジナイゼーション緩衝液を添加する（組織２００ｍｇ／ｍＬとなる））を、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）Ｍｉｎｉビーズホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１．４ｍｍ酸化ジルコニウムビーズ（０．５ｍＬチューブ、参照番号Ｐ０００９３３－ＬＹＳＫ０－Ａ、もしくは２ｍＬチューブ、ＶＷＲ参照番号４３２－３７５１）を事前充填したＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）チューブを使用して行った。活性アッセイおよびａｌｐｈａＬＩＳＡとの適合性のために使用したホモジナイゼーション緩衝液は、１１１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４４ｍＭクエン酸、１０ｍＭタウロコール酸ナトリウム、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）－ＥＤＴＡ非含有、Ｒｏｃｈｅ、番号０４６９３１５９００１）からなっており、ｐＨ５．５に調整されていた。ビーズによる組織破壊は、５０００ｒｐｍで２回、３０秒間が、１５秒間隔で発生する。１０．０００ｇで１５分間の遠心分離の後、上清を、アリコートに分け、－８０℃で保管したか、またはさらに分析した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡビーズに基づく技術は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒの排他的増幅発光近接ホモジニアスアッセイ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標））に依存し、発光酸素チャネリング化学を使用する。開発されたＧＣアーゼＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイは、ストレプトアビジンをコーティングしたドナービーズに結合したビオチン化抗ｈｕＧＣアーゼ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、番号６７６０００２Ｂ）およびＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズにコンジュゲートした第２の抗ｈｕＧＣアーゼ抗体（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、番号３３１３８３）によるｈｕＧＣアーゼの捕捉に基づいていた。抗体のビオチン化は、ＰＢＳ ｐＨ ７．４中、０．６ｍｇ／ｍＬの濃度まで行い、ビオチン化抗体を、１倍ＨｉＢｌｏｃｋ緩衝液（１０倍ＨｉＢｌｏｃｋ緩衝液、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、番号ＡＬ００４Ｆから調製）において、０．００６２５μＭの濃度で使用した。アクセプタービーズへの抗体のコンジュゲーションは、ＰＢＳ＋０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ ３００中、５ｍｇ／ｍＬの濃度で行い、ａｌｐｈａＬＩＳＡアッセイでの使用については、コンジュゲートした抗体を、１倍ＨｉＢｌｏｃｋ緩衝液中、１００μｇ／ｍＬに希釈した。使用の直前に、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンドナービーズを、１倍ＨｉＢｌｏｃｋ緩衝液中、１５０μｇ／ｍＬに希釈した。２つの抗体のＧＣアーゼへの結合により、ドナービーズとアクセプタービーズが近傍に置かれる。６８０ｎｍでのドナービーズのレーザー照射により、一重項酸素のフローが生成され、近傍のアクセプタービーズにおいて化学事象カスケードが誘発され、６１５ｎｍでの化学発光放出が生じる。放出シグナルは、ウェルにおけるｈｕＧＣアーゼ濃度に比例する。ｈｕＧＣアーゼ標準曲線を使用して、組織試料中のＧＣアーゼ濃度を計算した。
（実施例８）
マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの血漿薬物動態
血液中の活性ＯｘｙＧＣアーゼの動態を、基質として４ＭＵβＧｌｃを使用して酵素活性アッセイによって決定した。Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスに、７０μｇのｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）を、ボーラス注射（約１５分間、ｎ＝１１匹）または緩徐注入（約３時間、ｎ＝６匹）によって、脳室内（ＩＣＶ）注入した。ＩＣＶ注入の最中および後の異なる時点で採取した血液を、血漿調製前に、高ｐＨでのＧＣアーゼ活性の消失を防止するために、１３０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ５．８で即座に緩衝化した（１：１）。血漿を、４ＭＵβＧｌｃ活性測定のために、本質的には実施例５に記載されるように調製した。得られた薬物動態（ＰＫ）曲線を、図７および図８に示す。
側脳室におけるｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）の注射後の循環中の最大濃度は、緩徐注入では、ボーラス注入と比較して低かった。しかしながら、総薬物曝露は、類似のＡＵＣによって示されるように、両方の注入速度（特に、初回注入後）について、類似であった。いずれの事例でも、ＧＣアーゼは、循環から急速にクリアランスされた。実施例９および１０に示されるように、多量の循環ＧＣアーゼが、肝臓に到達した。
ＰＫパラメーターは、図８（右パネル）において観察することができるように、有意な動物の変動にもかかわらず、初回または４回目の緩徐注入後に有意に変化しなかった。対照的に、ＡＵＣは、複数回のボーラスＩＣＶ注射では、循環からのクリアランスがより緩徐であることに起因して、倍となった（図８、左パネル）。
（実施例９）
マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの生体分布
ＯｘｙＧＣアーゼの生体分布（ＢＤ）を、様々な研究にまたがる複数の直交アッセイによって評価した。これらのアッセイは、脳全体（カニューレ埋込みの反対側、深層脳領域、ＣＳＦなど）および末梢器官、たとえば、肝臓にわたるＯｘｙＧＣアーゼ拡散の程度を決定する目的を果たした。
ＡＢＰ標識化ＧＣアーゼによって評価したＢＤ
Ｗｉｔｔｅら（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１０， ｖｏｌ． ６， ９０７－９１３）は、活性に基づくプローブ（ＡＢＰ）を用いてＧＣアーゼ分子を可視化する技術を開発した。
蛍光ホウ素－ジピロメテン含有シクロフェリトールβ－エポキシドは、ＧＣアーゼの触媒二重変位機序を奪って、不可逆的阻害剤－求核試薬付加物を形成する（図９、右パネル）。この共有結合標識化は、高度に特異的であり、蛍光標識した酵素の検出は、超高感度である（検出限界がアトモル範囲である）。赤色ＭＤＷ９４１ β－エポキシドＡＢＰ（図９、左パネル）を使用して、本質的に、Ｋａｌｌｅｍｉｊｎら（Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｅｌ－ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｙｃｌｏｐｈｅｌｌｉｔｏｌ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄ／ｂａｓｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１４， ｖｏｌ． ２８９， ３５３５１－６２）に記載されるように、ＯｘｙＧＣアーゼを標識する。
野生型（ＷＴ）マウスに、１０μｇのＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８（図１を参照されたい）を、０．１μＬ／分で２０分間または１μＬ／分で２分間のいずれかの注入速度で、片側ＩＣＶ注入した。血液、ＣＳＦ、脳、および、肝臓組織を、注入の１時間後または３時間後に採取した。生体分布を、ＡＢＰ標識の量を定量することによって、決定した。これのために、凍結した脳組織を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および組織：体積比１：１０（５００μｌの緩衝液中５０ｍｇの組織）のプロテアーゼ阻害剤を補充した２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５において、ガラス乳棒およびチューブを備えるＫｉｍｂｌｅ Ｋｏｎｔｅｓ駆動装置を２０００～３０００ｒｐｍで使用して、ホモジナイズした。ホモジネートを、次いで、１０．０００ｇ（４℃）で遠心分離し、アリコートに分け、暗所で保管した。アリコートを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって、総タンパク質濃度を決定した。別のアリコートに、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加し、試料を、９６℃で４分間煮沸した後、４～１５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにローディングした。ゲル電気泳動中、装置は、光への曝露を回避するために、被覆した。以下の量を、分析のためにローディングした：脳ホモジネート：２４μｌ、血清：５μｌ、およびＣＳＦ：０．５μｌ。１００％全脳ホモジネート（１匹の対照動物の６つの領域からプール）、血清（３匹の対照動物のプール）、またはＣＳＦ（１匹の対照動物から）においてスパイクした標識化ＧＣアーゼの５つのキャリブレーション試料（０、ならびに８、４０、２００から、１０００フェムトモルまでの範囲を含む）をローディングして、キャリブレーション曲線を生成した。キャリブレーション試料は、実験試料と同じ量の組織を含有していた（それぞれの組織について、２４、５、および０．５μｌ）。湿式スラブゲルを、励起５３２ｎｍおよび放出波長６１０ｎｍで、ＦＬＡ－５０００イメージングシステム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して蛍光についてスキャンした。ゲル画像は、ＩｍａｇｅＪで視覚化し、すべてのレーンについて、ＧＣアーゼに対応するバンド、ならびにこのバンドの上下の空間を手作業で選択した。「Ｐｌｏｔ ｌａｎｅｓ」機能を使用して、相対密度をプロットした後、バックグラウンドレベルを上回るピークを選択し、定量した。線形近似曲線（ｌｉｎｅａｒ ｔｒｅｎｄ ｌｉｎｅ）の傾きおよび切片ならびに検出限界を、それぞれのゲルの４０、２００、および１０００ｆｍｏｌのバンドの密度を使用して計算した。傾きおよび切片を使用して、実験試料のバンド密度を、１レーン当たりのローディングされるｆｍｏｌに変換した。脳試料については、レーン当たりの量を、タンパク質濃度について補正した。次に、脳領域当たりの標識化ＧＣアーゼの総量を、ホモジナイゼーション体積を使用して計算した。組織１ｍｇ当たりのＧＣアーゼの量を、組織重量を使用して計算した。血清およびＣＳＦ試料については、１μｌ当たりの標識化ＧＣアーゼの総量を、ゲルにローディングされた組織体積（それぞれ、５および０．５μｌ）を使用して計算した。動物当たりの検出された総ＧＣアーゼ（脳、血清、およびＣＳＦ）は、３５μｌのＣＳＦ体積および１５００μｌの血清体積を想定して計算した。
図１０に示されるように、ＡＢＰ標識は、注射側とは反対側を含め、脳全体で検出することができ、後頭部領域でもっとも濃度が高かった（５および６）。０．１μＬ／分（２０分間）および１μｌ／分（２分間）の注入の間で、分布に明らかな差はなかった。標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８は、注入の１時間後および３時間後に、脳ホモジネートにおいて類似の量で検出された：総注入用量（１６７ｐｍｏｌ）のおよそ１２～１４ｐｍｏｌまたは７～８％のＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８。脳におけるＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８の大部分は、側脳室周囲に位置していた（図１１）。しかしながら、ＩＣＶ注入後３時間で採取した、脳室なしの脳領域を分析した後、ＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８が、程度は低いものの、深層脳領域にも分布していたことは明らかであった（示されていない）。おおまかな推測に基づくと、注射した用量（４６０ｐｍｏｌ）のうちの３．７ｐｍｏｌまたは０．８％が、注入の３時間後に、深層脳領域に存在していた。
注入の１時間後に、注射した用量のうちのおよそ２０％が、脳脊髄液（ＣＳＦ）中で検出された。しかしながら、ＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８は、ＣＳＦにおける注入の３時間後には、もはや検出することができなかった。およそ２時間ごとに、全体積のＣＳＦが補充され（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔｓ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｓ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１１， ｖｏｌ． ２０， ２７６０－９）、注入の１時間後には、脳室系全体におけるＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８の有意な分布があり、注入の３時間後には、ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８がＣＳＦから吸収された（脳室壁またはＣＳＦ排液経路を通って）ことが示唆された。
血液試料の分析により、上述のように循環中および循環からの急速なクリアランスを確認した。血清中のＡＢＰ標識の定量は、このマトリックスにおける高いバックグラウンドによって阻止された。ＡＢＰ標識を、さらに、肝臓組織において定量し（ホモジネートの調製および試料の分析は、脳組織と本質的に同じであった）、結果は、ＣＳＦに注射したＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８の有意な量（約２５％）が、注入後１時間程度の速さで、肝臓に到達したことを示す。同様のレベルのＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８が、注入の３時間後に肝臓において確認されたため、これは、最大値であるとみられた。２分間の片側ＩＣＶ注射時のＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８の相対分布は、図１２に示されている。
酵素活性（４ＭＵβＧｌｃ基質）により評価したＢＤ
ＡＢＰ標識化ＧＣアーゼを使用して得られた結果を非標識化ＧＣアーゼによる技法を用いて再生するために、４ＭＵβＧｌｃ酵素アッセイを使用した（本質的に実施例５に記載される通り）。４ＭＵβＧｌｃは、ＧＣアーゼに特異的ではない基質であり、組織中に存在する他のβ－グルコシダーゼもまた、それを変換できる可能性がある。ＧＣアーゼ活性を特異的に定量するために、ホモジネートを、ＧＣアーゼ特異的阻害剤であるコンズリトールＢエポキシド（ＣＢＥ）ありまたはなしでインキュベートした。ＧＣアーゼ活性を、次いで、ＣＢＥで阻害可能な４ＭＵβＧｌｃ活性として表した。
第１の実験では、ＧＣアーゼ活性を、ホモジナイズした脳領域、より具体的には脳室周囲の領域と対比して脳室を除く実質において、１日おき（ＥＯＤ）で４回の７０μｇのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８での片側ＩＣＶ注入の最後の回から３時間後に、決定した（図１３）。これにより、ＡＢＰの結果を確認した：注入の３時間後に、もっとも高い量のＧＣアーゼ活性を、脳室周囲で見出すことができ、ＷＴレベルの３～４５倍の範囲であった。免疫染色により、この活性が、細胞内および細胞外ＧＣアーゼの両方を起源としていたことが示唆される。７０μｇまたは１４００ｍＵのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８（平均比活性２０ｍＵ／μｇ）での４回目のＥＯＤ処置から３時間後に、脳室を除く脳組織において存在しているＧＣアーゼ活性の総量は、３～１０ｍＵ（４００ｍｇの脳体積で計算）の範囲であった。これは、注射した用量の０．３～０．７％に相当し、これは、ＡＢＰ標識化によって決定したものと同じ範囲であった。
時間とともに、分布は、脳全体でより均一となった。４回または８回の７０μｇのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８の注入の最後の回から４８時間後に、類似のＧＣアーゼ活性レベルが、皮質（脳室なし）および線条体（脳室領域を含有する）において存在していた（図１４）。内因性ＧＣアーゼ活性は、Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩおよびＷＴマウスの両方において、皮質では線条体よりもわずかに高かった。まとめると、これは、わずかに少ないＧＣアーゼが、線条体と比較して、より遠位な皮質に分布し、脳室にすぐ隣接して局在化されたことを示唆した。
いくつかの研究では、ＧＣアーゼ活性を、最後の注入の４８時間後に、ホモジナイズした左または右の脳半球および肝臓組織において決定した（それぞれ、図１５ＡおよびＢ）。
ＯｘｙＧＣアーゼバリアントまたはＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）のいずれの処置でも、左半球対右半球において、ＧＣアーゼ活性に同様の増加があり、注射した側から反対側への同等の分布が存在したことが確認された（図１０）。
ＷＴマウスでは、ＧＣアーゼ活性は、肝臓において、脳と比較して高かった。しかしながら、Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスは、有意に低いＧＣアーゼ活性レベルを示し、これは、両方の器官で同程度であった。結果として、ＫＩの脳における残留活性％（ＷＴの脳に対して１５％）は、ＫＩの肝臓（ＷＴの肝臓に対して３％）よりも高かった。ＯｘｙＧＣアーゼバリアントの反復ＩＣＶ注射後に、脳と比較して肝臓において相対的に多くの活性ＧＣアーゼを、検出することができた。週１回で４回の７０μｇのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８での注入の最後の回から４８時間後に、たとえば、未処置のＫＩマウスと比較して、脳における３．５倍の増加と比較して、肝臓において２５倍の増加があった。しかしながら、ＷＴレベルとＫＩレベルとの間の治療域が、脳では肝臓よりも小さかったため、ＷＴと比較した％活性は、肝臓（約７５％）よりも脳（約５０％）においてわずかに低いだけであった。
これらのデータを使用して、注射用量％を計算した：７０μｇまたは１４００ｍＵのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８（平均比活性２０ｍＵ／μｇ）の最後の注射から４８時間後に、脳においておよそ４ｍＵ（０．４ｇで計算）および肝臓においておよそ９０ｍＵ（１．７５ｇで計算）のＧＣアーゼ活性が存在していた。これらの値は、それぞれ、注射用量の０．３％および６％に相当する。脳と比較して肝臓において高い注射用量％は、ＡＢＰ標識化ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８の注入から３時間後にも観察された（上記を参照されたい）。より重要なことには、注射したＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８用量％は、４回目の処置から３時間後および４８時間後で類似であったため（０．３～０．７％から０．３％の範囲）、ＧＣアーゼは、脳組織に取り込まれた後、比較的安定であるとみられた。
ＯｘｙＧＣアーゼと比較して、ＩＣＶ送達したＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）は、ＧＣアーゼ活性の増加という点に関しては有意に性能が低く、脳（ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８についてはＫＩレベルの３．５倍、対してＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）ではＫＩレベルの１．５倍、いずれも週１回で４回の７０μｇのＩＣＶ注射の最後の回から４８時間後に決定、図１５Ａ）および肝臓（ＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８についてはＫＩレベルの２５倍、対してＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）についてはＫＩレベルの５倍、いずれも週１回で４回の７０μｇのＩＣＶ注射の最後の回から４８時間後に決定、図１５Ｂ）においてわずかな改善しか示さなかった。ＯｘｙＧＣアーゼの細胞内取込みは、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）と比較して有意に高かったことに留意されたい（図５を参照されたい）。肝臓における実質的な違いは、さらに、ＯｘｙＧＣアーゼと比較して、循環中のＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）のより低い安定性に起因する可能性があり得る。
薬物曝露は、７０μｇのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８でのＩＣＶ処置を１ヶ月間から３ヶ月間に延長させた場合に、肝臓ならびに脳において低下し、これは、抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答に起因する可能性が高かった（実施例１１を参照されたい）。脳における薬物曝露の減少は、血液中の抗体はわずかなパーセンテージしか血液脳関門を通過しないことを考慮すると、いくらか予想外であった。しかしながら、抗原によって活性化されると、ＴおよびＢ－リンパ球はいずれも、脳に進入し得ることが公知である。
脳において達成される活性レベルは、注射を緩徐注入（３時間）またはボーラス注射（１０～１５分間）で行った場合に、それほど違いはなかった。対照的に、ボーラス注射ではなく緩徐注入の場合に肝臓に到達するＧＣアーゼはより少なく、これは、循環中での異なる速度のＧＣアーゼ放出に関連し得る（図７および図８を参照されたい）。
ヒトＧＣアーゼａｌｐｈａＬＩＳＡによって評価したＢＤ
活性測定によって決定した生体分布（図１３を参照されたい）を、ａｌｐｈａＬＩＳＡによっても検証して、ヒト特異的ＧＣアーゼタンパク質レベルを決定した（図１６）。両方の方法から、類似の結果を得ることができた。
（実施例１０）
マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの有効性および薬力学
前述のように、ＧＣアーゼ基質であるグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）およびグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）の蓄積は、ゴーシェ病患者における病理症状の重要な原因である。Ｇｂａ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスは、脳および末梢器官、たとえば、肝臓において、ＧｌｃＳｐｈを蓄積するがＧｌｃＣｅｒは蓄積しない。脳および肝臓におけるＧｌｃＳｐｈレベルの低減を評価することによって、ゴーシェ病の処置に関して、ＩＣＶ注射されるＯｘｙＧＣアーゼバリアントの、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）と比較して優れた治療能力を示した。
全脳半球におけるＧｌｃＳｐｈの低減
脳における基質低減の結果の概要を、図１７に提示する。
ＨｅｘＳｐｈレベルは、ＧｌｃＳｐｈおよびガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）という２つのエピマーからなり、そのうち、ＧｌｃＳｐｈのみが、ＧＣアーゼの基質である。本発明者らは、ＷＴマウスにおけるＨｅｘＳｐｈレベルが、ＧａｌＳｐｈのみを示し、このＧａｌＳｐｈレベルが、ＷＴと、処置および未処置Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスとで同一であったことを実証した（示されていない）。
すべてのＯｘｙＧＣアーゼバリアントは、同一の用量およびレジメンで投与した場合に、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）よりも高性能であった。週１回で４回の７０μｇのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８、ＧＣアーゼＭｕｔ１、またはｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）でのボーラスＩＣＶ処置により、ビヒクル処置ＫＩマウスと比較して、統計学的に有意なＨｅｘＳｐｈレベルの低減がもたらされたが、これは、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）には当てはまらなかった。したがって、週１回で４回の７０μｇのＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）でのＩＣＶ処置後の脳におけるＧＣアーゼ活性の検出にもかかわらず（図１５Ａ）、基質レベルは、有意に減少しなかった。低いレベルのＯｘｙＧＣアーゼ（脳全体でおよそ２００ｎｇ、７０μｇの０．３％）により、脳内の基質を効果的に低減させることができることを考慮すると、観察されたＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）活性と基質低減能力との間の不一致の可能性のある説明は、タンパク質（およびしたがってその活性）が、ＧｌｃＳｐｈを蓄積しない細胞型にしか実質的に存在しないことである。
週１回の１５μｇ、４０μｇ、７０μｇ、および１４０μｇのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８での処置を比較すると、最大７０μｇまでは良好な用量応答が観察された。これらの結果に基づいて、週１回のＯｘｙＧＣアーゼ処置の最適な用量を、７０μｇに設定した。脳の重量に基づいて非ヒト霊長類（ＮＨＰ）および小児患者に変換すると、７０μｇの用量は、週１回で、ＮＨＰ（脳重量６０ｇ）については１０．５ｍｇ、および２～３歳の小児（脳重量およそ１．２ｋｇ）については２１０ｍｇの用量に相当し得る。
レジメンを、週１回から、週２回、１日おきの処置へと増加させると、基質低減効率はさらに改善された（示されていない）。
異なるＯｘｙＧＣアーゼバリアント（ＧＣアーゼ（Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ）－Ｈｉｓ８、ＧＣアーゼ（Ｈ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ）、または実施例１に記載されるＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ））の有効性および安定性に関して、観察可能な違いはなかった。
本発明者らは、ＩＣＶ処置を１ヶ月間から３ヶ月間に延長した場合に、脳において薬物曝露が減少したことを、活性測定によってすでに上記に示している。これを、ＧｌｃＳｐｈ結果によってさらに実証した。図１８は、異なる動物におけるＧＣアーゼ活性と基質レベルとの間の相関の存在を示す。薬物曝露の減少は、ＧＣアーゼ酵素に対する免疫応答に起因する可能性が高い。
異なる脳領域におけるＧｌｃＳｐｈの低減
皮質、小脳、線条体／海馬、および中脳を、分離し、ＨｅｘＳｐｈレベルを決定した。それぞれの領域から得られた、ＧｌｃＳｐｈレベルとして表される（ＷＴ ＨｅｘＳｐｈ（＝ＧａｌＳｐｈ）レベルを差し引くことによって）結果を、図１９に示す。
基質レベルは、すべての脳領域において効率的に低減され、ＧｌｃＳｐｈ蓄積は、わずかに領域依存性であり、もっとも低い蓄積は皮質に存在していた。これは、その領域における高いＧＣアーゼ活性に対応する（図１４を参照されたい）。週２回で８回のＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８での処置の後、基質の低減が、すべての領域において生じ、線条体、海馬、および小脳では、中脳および皮質と比較して程度が高かった。これもまた、活性を通じて測定した酵素のレベルと一致する。重要なことに、週１回で４回の７０μｇのＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）でのＩＣＶ注入では、分析した領域において、ＧｌｃＳｐｈが低減されなかったか、わずかにしか低減されなかった。基質低減の領域依存性は、ＯｘｙＧＣアーゼおよびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）の間で異なるとみられた。これは、分析した領域の細胞組成における違いによって説明できる可能性がある。
選別された異なる脳細胞におけるＧｌｃＳｐｈの低減
Ｐ７よりも高齢のげっ歯類の神経組織の解離、およびそれに続くニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞の単離のために、ヒーターを備えるＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０－０９６－４２７）およびＡｄｕｌｔ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０－１０７－６７７）の組合せを使用して、単一細胞を脳半球から調製した。細胞解離ステップ、残屑除去ステップを含め、星状細胞集団の単離、星状細胞特異的抗ＡＣＳＡ－２マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０－０９７－６７８）を使用した磁気標識化、および磁気分離は、本質的に、製造業者によって説明されているように行った（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｕｐｌｏａｄ／ａｓｓｅｔｓ／ＩＭ００１６２９０．ＰＤＦ）。得られた星状細胞画分の純度を、陽性細胞画分に対して２回目の磁気分離を行うことによって、さらに増加させた。上記の手順の間に得られた未標識細胞（ミクログリア、ニューロン、乏突起膠細胞、および内皮細胞）を、さらに処理して、本質的に製造業者によって説明されているように（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ／ｕｐｌｏａｄ／ａｓｓｅｔｓ／ＩＭ００１６８９１．ＰＤＦ）抗ＣＤ１１ｂマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０－０９３－６３４）を使用したミクログリアの磁気除去を可能にした。星状細胞およびミクログリアの両方の単離の後に得られた未標識細胞画分には、主として、ニューロン細胞が含有されていた。いずれの磁気分離ステップについても、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０－０４２－４０１）および対応する好適なＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、番号１３０－０９０－９７６）を使用した。
まとめると、星状細胞およびミクログリアは、特異的抗体（それぞれ、抗ＡＣＳＡ－２、抗ＣＤ１１ｂ）によって陽性選択し、一方でニューロン細胞は、前述の細胞型を枯渇させ、ニューロンが濃縮された集団を得ることによって得た。本質的には実施例７に記載されるように決定した、ニューロン画分におけるＨｅｘＳｐｈレベルは、星状細胞およびミクログリアよりも高かった（図２０）。Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスは、すべての細胞画分においてＨｅｘＳｐｈの上方調節を示した。週１回で４回の７０μｇのＧＣアーゼＭｕｔ１－Ｈ８のＩＣＶ注射でのマウスの処置により、３つすべての細胞型において蓄積されたＨｅｘＳｐｈの低減がもたらされたが、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）を用いた同様の処置レジメンでは、ミクログリアにおける基質が低減されただけであった。これらの結果により、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）と比較して、ＩＣＶ ＯｘｙＧＣアーゼの優越性がさらに強調される。
肝臓におけるＧｌｃＳｐｈの低減
肝臓における基質レベルに対する、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）と比較したＯｘｙＧＣアーゼバリアントでの反復的なＩＣＶ処置の影響を、評価した（図２１）。
基質の蓄積は、肝臓においては、脳よりも高くかつより変動性であり（図２１および図１７を参照されたい）、これもまた、測定したＧＣアーゼ活性レベルと関連し得る（図１５Ａおよび１５Ｂ）。週１回で４回の７０μｇの異なるＯｘｙＧｃアーゼバリアントでのＩＣＶ処置は、基質を非常に効率的に低減させ、ほぼＷＴレベルに達した（ＯｘｙＧＣアーゼ処置群とＷＴ対照との間に統計学的に有意な差はなかった、図２１）。これにより、レジメンを増加させること（たとえば、ＥＷで４回の７０μｇのＧＣアーゼｍｕｔ１－Ｈ８と比べて、ＥＯＤで８回の７０μｇのＧＣアーゼｍｕｔ１－Ｈ８／ＡＢＸ、図２１）が、肝臓において効率をさらに改善しないのはなぜかを説明することができる。脳で観察されたものとは対照的に、緩徐注入は、肝臓において、ボーラス注射と比較して効率の低い基質低減をもたらす。まとめると、これらの結果は、ＩＣＶ注射したＯｘｙＧＣアーゼは、ゴーシェ病患者、特に、神経障害性ゴーシェ病患者において、身体症状を処置するための治療能力を有することを示す。
週１回で４回の７０μｇのＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）でのＩＣＶ処置は、肝臓において活性をわずかにしか増加させなかったとはいえ、たしかに基質を低減させたが、ＯｘｙＧＣアーゼよりも効率が低かった。これは、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）が、単に、マンノース受容体に媒介される様式でクッパー細胞によって取り込まれるためであり得る。結果として、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）によるＧｌｃＳｐｈ低減は、肝臓組織における限定的な細胞集団に制限される。
（実施例１１）
マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドによって誘導される免疫応答
抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）のための全身的酵素補充療法（ＥＲＴ）の一般的な特徴である（Ｈａｒｍａｔｚ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ： Ｉｓ Ｔｈｅｒｅ ａ Ｐａｔｔｅｒｎ？ Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ． ２０１５， ｖｏｌ． ３７， ２１３０－４）。相当量のＩＣＶにより送達されるＯｘｙＧＣアーゼが循環に進入するため、本発明者らは、これが、マウスにおいて免疫応答を誘導するかどうかを評価した。
この目的で使用される抗薬物抗体アッセイは、コーティング剤として精製されたＯｘｙＧＣアーゼ（１×ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの濃度）を使用した、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイであった。１００μＬのコーティング溶液を、ウェルごとに添加し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、コーティング剤を廃棄し、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、１×ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した。アッセイ緩衝液（１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を、ウェルに添加し、続いて、３７℃で１時間インキュベートした。アッセイ緩衝液を廃棄した後、１００μＬの希釈した（血漿）試料（１×ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を、ウェルごとに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。試料を廃棄した後、プレートのウェルを、１×ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した。洗浄ステップの後、検出抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体、Ｓｉｇｍａ、番号Ａ４４１６）を、アッセイ緩衝液中に１０．０００倍で希釈し、１００μＬをそれぞれのウェルに添加した。プレートを、３７℃で１時間、再度インキュベートし、続いて、検出抗体溶液を除去し、ウェルを１×ＰＢＳ＋０．０５％ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０で３回洗浄した。次のステップでは、すぐに使用できるＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号００２０２３）を１００μＬ添加し、プレートを、室温で２０分間、暗所でインキュベートした。ＴＭＢを、ペルオキシダーゼによって加水分解させ、血漿中に存在する抗ＧＣアーゼ抗体の量に比例する有色化合物を得た。反応を、ウェルごとに５０μＬの０．５Ｍ硫酸を添加することによって、停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、硫酸の添加後１５分以内に測定した。
図２２において観察することができるように、抗ＧＣアーゼ抗体は、週１回で４回の７０μｇのＯｘｙＧＣアーゼでのＩＣＶ処置の後にすでに存在しており、そのレベルは、処置を最大２ヶ月間または３ヶ月間に延長した場合に、さらに増加した。免疫応答は、個々のマウス間で有意に変動し、これは、上述のように、長期処置の際の脳および肝臓における変動性のＧＣアーゼ活性およびＨｅｘＳｐｈレベルと相関していた。
ＯｘｙＧＣアーゼは、マウスにとって外来である糖構造を含有し、したがって、免疫応答を引き起こし得る。抗薬物抗体が、ＧＣアーゼ酵素に対するものであるか、そうではなくＮ－グリカンに対するものであるかを決定するために、ＯｘｙＧＣアーゼと同一の糖構造を有する別のリソソーム酵素を使用するＡＤＡアッセイを開発した。抗ＧＣアーゼ抗体を含有した１３匹のマウスのうちの１匹だけが、約１００分の１の力価とはいえ、その酵素に対して反応性であった。したがって、Ｎ－グリカンではなくＧＣアーゼ酵素が、マウスにおいて抗原性であると結論付けることができる。
（実施例１２）
組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドを投与したマウスにおける組織病理学
未処置、ビヒクル処置、およびＯｘｙＧＣアーゼ処置のＷＴおよびＧｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスから、組織病理学的分析のために、複数の器官（肝臓、脳、脾臓、腎臓、肺、および心臓）を採取した。カニューレ挿入および脳室内注射により、ＷＴおよびＧｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスの両方に、軽度の脳炎および／または髄膜炎が生じ、これは、注射した物質とは関係なかった。脳における炎症は、ビヒクル処置およびＯｘｙＧＣアーゼ処置動物で、類似であった。組織病理学により、いかなるＯｘｙＧＣアーゼ関連毒性も判明しなかった。
（実施例１３）
マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの静脈内（ＩＶ）送達
ゴーシェ病患者における静脈内（ＩＶ）送達したＯｘｙＧＣアーゼの治療能力を評価するために、いくつかの前臨床研究を、野生型（ＷＴ）およびＧｂａ１ Ｄ４０９Ｖノックイン（ＫＩ）マウス（実施例６を参照されたい）において行って、異なるＯｘｙＧＣアーゼバリアントのＩＶ注射時の生体分布（ＢＤ）、薬物動態（ＰＫ）、薬力学（ＰＤ）、および有効性を、その市販対応物であるＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）と比較して評価した。これらの研究を、実施例１４～１６に記載する。
簡単に述べると、ＷＴまたはＧｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスを、週１回（ＥＷ）の試験物品のボーラスＩＶで、１～４週間連続で処置した。研究の一部において、ＩＶ処置後の異なる時点で、血漿を採取した。最後の注射の１日後に、マウスに麻酔を行い、血液を採取した後、食塩水灌流および末梢器官、たとえば、肝臓、脾臓、心臓、および肺、ならびに脳の切開を行った。試料を、ＲＰ－ＬＣ Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ（実施例７を参照されたい）によってヘキソシルスフィンゴシン（ＨｅｘＳｐｈ）レベルについて、および４ＭＵβＧｌｃ活性アッセイ（実施例５を参照されたい）によってＧＣアーゼレベルについて分析した。
（実施例１４）
マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの血漿薬物動態（ＰＫ）
活性ｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）の循環半減期（Ｔ１／２）を、ＷＴマウスへの６０Ｕ／ｋｇの酵素のＩＶ注射によって評価した。ＩＶ投与後の２４時間の期間にわたって、異なる血液試料を尾静脈から採取し、そこから、緩衝化血漿（ｐＨ７．４）を、活性分析のために調製した。得られたＧＣアーゼの濃度－時間曲線により、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、ｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）の循環半減期を計算することが可能であった。全体として、試験したＯｘｙＧＣアーゼは、約６分間（５．６±１．８分間）という非常に短い半減期を有した。
（実施例１５）
酵素活性によって（４ＭＵβＧｌｃ基質を使用して）評価した、マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの生体分布
ＯｘｙＧＣアーゼバリアントでの全身（ＩＶ）処置後の活性ＧＣアーゼの生体分布を、肝臓において４ＭＵβＧｌｃアッセイで決定した（図２４）。４ＭＵβＧｌｃは、しかしながら、ＧＣアーゼのみに特異的なわけではない合成基質であるため、これは、組織に存在する他のβ－グルコシダーゼもまた、それを加水分解し得ることを意味する。ＧＣアーゼ活性を特異的に定量するために、ホモジネートを、ＧＣアーゼ特異的阻害剤であるコンズリトール－ｂ－エポキシド（ＣＢＥ）ありまたはなしでインキュベートした。ＧＣアーゼ活性を、次いで、ＣＢＥで阻害可能な４ＭＵβＧｌｃ活性として表した。
Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスの肝臓におけるＧＣアーゼ活性は、ＷＴレベルの３％±１％であった。週１回で３０Ｕ／ｋｇのｈｕＧＣアーゼまたはｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）でのＩＶ投与により、活性が、最後の処置から２４時間後に、それぞれ、ＷＴレベルの２８％±１０％、３３％±１１％に増加した。重要なことに、市販対応物であるＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）を用いた同一のＩＶ投薬レジメンでは、ＷＴ ＧＣアーゼ活性レベルの１６％±４％にしか増加しなかった。いかなる仮説にも理論にも限定されることを望むものではないが、肝臓の肝細胞による、本発明の原理を具現化するマンノース－６－リン酸に媒介されるＧＣアーゼバリアントの取込みは、マクロファージのよってのみ取り込まれるＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）と比較した場合の肝臓における高いＧＣアーゼ活性を説明し得る。この一連の結果から、さらには、測定したＧＣアーゼ活性がｈｕＧＣアーゼおよびｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）の処置で類似であったため、ｈｕＧＣアーゼ（およびＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））に対するｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）の循環（すなわち、生理学的条件）における高い安定性は、肝臓細胞に到達する活性ＧＣアーゼの量に対して有意な影響を有さなかったと考えられた。ｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）の用量を３００Ｕ／ｋｇに増加させた場合、ＷＴ ＧＣアーゼ活性レベルが、肝臓においてほぼ達成された（ＷＴレベルの９３％±２３％）。
（実施例１６）
マウスにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの有効性および薬力学
ＧＣアーゼ基質であるグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＳｐｈ）およびグルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）の蓄積は、ゴーシェ病患者における病理症状の重要な原因を表す。Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスは、脳、ならびに末梢器官、たとえば、肝臓、脾臓、および心臓において、ＧｌｃＳｐｈを蓄積するがＧｌｃＣｅｒは蓄積しない。ＩＶ注射したＯｘｙＧＣアーゼバリアントが、ゴーシェ病の処置に関して、市販対応物であるＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）よりも優れた治療能力を有するかどうかを評価するために、ＧｌｃＳｐｈレベルの低減を、肝臓、脾臓、心臓、および肺において決定した。
３０Ｕ／ｋｇのｈｕＧＣアーゼまたはｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）でＩＶ処置したＫＩマウスの肝臓において観察される、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）と比較して高いＧＣアーゼ活性レベルはまた、ＯｘｙＧＣアーゼバリアントの、その市販対応物と比較してより良好な基質低減有効性に変換される（図２５）。肝臓と同様に、ＯｘｙＧＣアーゼバリアントのＩＶ投与は、同じ投薬レジメンで提供した場合にＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）よりも効率的に、脾臓において基質レベルを低減させた。心臓では、ＯｘｙＧＣアーゼバリアントとＣｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）との間に基質低減において統計学的に有意な差はなかったが、実施した短期間研究内では、ｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）バリアントがより高性能である傾向があると見られた。対照的に、３つのＧＣアーゼバリアントはいずれも、少なくとも、週１回で４回の３０Ｕ／ｋｇの用量のＩＶ注射が終わるまでは、Ｇｂａ１ Ｄ４０９Ｖ ＫＩマウスの肺に蓄積するＨｅｘＳｐｈ基質を低減することができなかった。
実施例１３～１６は、したがって、週１回で４回の３０Ｕ／ｋｇのｈｕＧＣアーゼ、ｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ）、およびＣｅｒｅｚｙｍｅのＩＶ注射時の異なる末梢器官内のＨｅｘＳｐｈレベルに基づいて、ｈｕＧＣアーゼが、Ｋ３２１Ｎ変異ありまたはなしのいずれでも、１型ゴーシェ病患者の現在の標準治療と少なくとも同程度またはそれよりも良好に機能したことを示す。この投薬レジメンは、患者におけるＣｅｒｅｚｙｍｅの現在の治療用量（６０Ｕ／ｋｇ、１週おきに）に対応する。
（実施例１７）
カニクイザルにおける組換えヒトグルコセレブロシダーゼ（ＧＣアーゼ）ポリペプチドの毒性研究
研究設計
両性別の小児患者を表す３０匹の初回投薬の時点で１５ヶ月齢の若齢のカニクイザル（雄性１５匹、雌性１５匹）に、用量投与のために、左側脳室にＩＣＶカテーテルを外科手術により埋め込んだ。２６匹の動物を、研究に配置した。動物に、２．１ｍＬのＯｘｙ５５９５（前述の実施例に記載されるｈｕＧＣアーゼ（Ｋ３２１Ｎ））またはビヒクル（人工脳脊髄液、ａＣＳＦ、ｐＨ６．６）を、１週間に１回、ＩＣＶ注入によって、合計２３用量を受容させた。研究設計を、表２に示す。低用量の１０ｍｇの投薬は、脳サイズの差（０．４ｇのマウスの脳重量に対して、５５～６０ｇの非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の脳重量）に基づいて、マウスにおける治療用量（７０μｇ）から外挿した。Ｏｘｙ５５９５の溶解度および注入体積の制限に起因して、治療用量の５倍（５０ｍｇ）が、ＩＣＶ投与することができる最大量である。
Figure 2022523104000017
生体における観察および測定には、体重、食物消費量、臨床観察、神経学的検査および身体検査、眼科検査、心電図、血圧、毒物動態および免疫原性サンプリング、ならびに臨床病理評価が含まれた。ＩＴカテーテルを、ＣＳＦサンプリングのために腰椎に取り付け、ＣＳＦ Ｏｘｙ５５９５動態を研究した。最終用量からおよそ４８時間後または１４日後（回復群）に、動物を安楽死させ、回収した組織を生体分布および／または組織病理評価に選択した。
生体における結果
Ｏｘｙ５５９５関連の臨床徴候はなかった。体重、食物消費量、身体検査および神経学的検査、心電図、眼科検査、または器官重量に変化はなかった。週１回のＯｘｙ５５９５の用量投与により、変動するが一貫性のある様式で、ＣＳＦおよび血液の両方において好酸球数の増加が生じた。しかしながら、用量投与の完了後、その数は、２週間以内にほぼ正常値まで戻った。観察した臨床病理パラメーターに、さらなるＯｘｙ５５９５関連の変化はなかった。
ＣＳＦおよび血漿における活性ＧＣアーゼの濃度－時間曲線
研究を通しての５つの異なる場合で（用量１、４、８、１２、および１９）、血漿（投薬前、および投薬の２分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、７２時間後）、ならびにＣＳＦ（投薬前、および投薬の１時間後、４時間後、２４時間後、７２時間後）を、検証したアッセイでＧＣアーゼ活性測定のために採取した。ＧＣアーゼ活性を、ＧＣアーゼ標準曲線に基づいて、１ｍＬ当たりの活性ＧＣアーゼタンパク質のｎｇに外挿して、濃度－時間プロファイルを確立した（図２６）。ＰＫ分析を、Ｐｈｅｏｎｉｘ（登録商標）ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）バージョン６．３ソフトウェアにおいて、非コンパートメント分析を使用して、ＧＬＰガイドラインに従って行った。
ＣＳＦの結果（図２６、左パネル）：定量可能なＧＣアーゼレベルを、ＣＳＦにおける注射から最大２４時間後まで測定した。ＣＳＦ採取のもっとも早い時点は、注入終了の１時間後であり、これは、測定したもっとも高い活性ＧＣアーゼ濃度を表す。投薬の７２時間後に、活性ＧＣアーゼ濃度は、定量限界（ＬＬＯＱ）を下回ったが、依然として検出可能であった。ＣＳＦにおけるＧＣアーゼレベルのプロファイルは、両方の用量群について、単回および複数回の投与後、同等であった。用量の５倍の増加により、６．３～１０．５倍の範囲で、性別を合わせて、比例よりもわずかに高い曝露（ＣｍａｘおよびＡＵＣｌａｓｔ）の増加が生じた。ＣＳＦにおけるＯｘｙ５５９５曝露は、ＡＵＣｌａｓｔに関して、両方の用量群について、血漿と比較して、数千倍高かった。１０ｍｇ用量の場合のＣＳＦにおける活性ＧＣアーゼの濃度は、処置の回数には関係なく、注射後およそ２日で、ニューロン細胞におけるＯｘｙ５５９５のＫｕｐｔａｋｅに達した（１７８±２２ｎｇ／ｍＬ）。ＣＳＦ ＰＫパラメーターには、一貫した性別関連の相違は観察されなかった。
血漿の結果（図２６、右パネル）：もっとも高いＧＣアーゼレベルは、注入（２分）の直後に測定され、投薬後８時間でおよそＬＬＯＱのレベルまで低下した。血漿濃度プロファイルは、動物間で有意に変動するが、いずれの用量群のプロファイルも、単回および複数回の投与の後に劇的に変化するとはみられなかった。用量の５倍の増加により、３．５～１８．８倍の範囲で、性別を合わせて、比例と同様かそれよりもわずかに高い曝露（ＣｍａｘおよびＡＵＣｌａｓｔ）の増加が生じた。血漿ＰＫには、一貫した性別関連の相違はなかった。
ＧＣアーゼの脳での分布
最後の（２３回目の）ＩＣＶ処置の２日後に、動物を、器官採取のために殺処分した。灌流後、脳を回収し、３ｍｍ幅のスラブ（動物１匹当たりおよそ１７枚のスライス）に冠状にスライスした。第１のスライスおよびそれ以降のすべての他のスライスを、組織学的分析のために中性緩衝化ホルマリンに固定した（以下の「組織病理学」の節を参照されたい）。第２のスライスおよびそれ以降のすべての他のスライスから、試験物品の活性分析（合成ＧＣアーゼ基質、４ＭＵβＧｌｃを使用したＧＬＰ対応の検証済みアッセイ）のために、様々な脳領域から標本を採取した。分析に選択した領域（図２７）は、主として、神経障害性ゴーシェ病患者において影響を受けると記載されている領域であった：大脳皮質、小脳、脳幹（脳橋および延髄）、視床、ならびに線条体（Ｍａｌｏｎｅｙ ａｎｄ Ｃｕｍｉｎｇｓ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． Ｐｓｙｃｈｉａｔ． １９６０， ｖｏｌ． ２３， ２０７、Ｎｉｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｒｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８２， ｖｏｌ． ３９， ７０９－７１８、Ｏｒｖｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２００２， ｖｏｌ． ７６， ２６２－２７０、Ｐｅｒｒｕｃａ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ ２０１８， ｖｏｌ． ６０， １３５３－１３５６、Ｂｒｅｍｏｖａ－Ｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１８， ｖｏｌ． １５， ７１１、Ｋａｙｅ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． １９８６， ｖｏｌ． ２０， ２２３－３０）。海馬は、近年、ＮＨＰにおいて比較的高いＧＣアーゼ発現を有することが公表され、したがって、それも分析した（Ｄｏｐｅｓｏ－Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ． ２０１８， ｖｏｌ． ２２３， ３４３－３５５）。
図２８および２９は、ＧＣアーゼ活性が、ビヒクル処置のＷＴ動物の様々な脳領域全体で比較的均質に存在していたことを示す。１０ｍｇまたは５０ｍｇのＯｘｙ５５９５での片側ＩＣＶ処置により、左および右の小脳における類似の活性ＧＣアーゼレベルによって明らかなように、両方の脳半球への同等なＧＣアーゼ活性の分布がもたらされた。この観察は、本発明者らが以前に得たマウスにおける結果を裏付け、そこでは、ＩＣＶ投与したＯｘｙ５５９５もまた、両半球に均一に分布されていた。ＧＣアーゼ活性は、脳の複数の領域で検出され、もっとも高いレベルは、前頭部および頭頂葉の新皮質の深層に存在していた。わずかに低いＧＣアーゼ活性が、海馬、脳橋、延髄、および後頭皮質において観察され、続いて、小脳でＧＣアーゼ活性の中等度の増加が示された。尾状核（線条体）および視床は、ＧＣアーゼ活性の有意な増加を示さなかった。陽性の領域において、５０ｍｇのＯｘｙ５５９５は、１０ｍｇのＯｘｙ５５９５と比較して１．８±０．３倍高いＧＣアーゼ活性の増加をもたらした（図３０）。Ｏｘｙ５５９５処置時の脳全体の活性ＧＣアーゼの分布の概略図は、図３１において見出すことができる。
マウスにおいて、ＧＣアーゼ活性は、未処置Ｇｂａ１欠損（ＫＩ）動物におけるＷＴレベルの約１０％から、Ｏｘｙ５５９５処置ＫＩマウスの左および右半球におけるＷＴレベルの約３０％まで増加した（１週間に１回で４回の７０μｇの投与）。マウスにおけるこの２０％の増加は、ＮＨＰにおける対応する１０ｍｇの用量のＯｘｙ５５９５でも観察された（用量外挿は脳体積に基づく）（図２９）。図３２において観察することができるように、Ｏｘｙ５５９５ ＩＣＶ処置から４８時間後のマウスおよびＮＨＰにおける組織１ｇ当たりのＯｘｙ５５９５レベルは、皮質、海馬、および小脳において類似であったが、ＮＨＰの脳幹ではマウスと比較してわずかに高かった。マウス線条体および中脳は、Ｏｘｙ５５９５を蓄積したが、これは、ＮＨＰの場合では生じないと見られたが、後者では、部分領域のみを分析していた（それぞれ、尾状核および視床）。重要なことに、ＧＣアーゼ活性は、ＩＣＶ注入の最大６日後まで、ほとんどのマウスの脳領域においてビヒクル処置レベルを上回ったままであった（図３２）。
Ｇｂａ１欠損マウスにおける７０μｇのＯｘｙ５５９５での反復ＩＣＶ処置により、ビヒクル処置マウスと比較して、脳において、ＧＣアーゼ基質、グルコシルスフィンゴシンの蓄積の３倍の低減が生じた（最終用量から４８時間後に測定した）。この用量が、マウスおよびサルにおいて類似のＧＣアーゼレベルをもたらしたため、この用量はまた、特に、神経障害性ゴーシェ病患者のほとんどが、依然として多様な程度で残留ＧＣアーゼ活性を有することを考慮すると、ヒトの脳においてＧＣアーゼ基質を低減するのに十分に有効であるはずである。
免疫原性
血清およびＣＳＦを、用量１、２、５、９、１３、および２０の前、ならびに剖検時に採取して、検証済みのスクリーニングアッセイを使用して、Ｏｘｙ５５９５に特異的な抗体の存在を決定した。陽性試料と陰性試料とを区別する分断点は、９５％の信頼区間で設定し、これは、試料のうちの５％が、偽陽性とスクリーニングされるであろうことを意味する。ビヒクル処置動物はいずれも、抗ＧＣアーゼ抗体を生じていなかったが、Ｏｘｙ５５９５処置は、１匹を除くすべての動物において、血清では５回目の用量の前、およびＣＳＦでは９回目の用量の前に、抗体応答を誘導したことが、結果により示される。一部の動物では、抗体応答は、一過性であると見られた。免疫原性応答の強度は、動物間で変動したが、用量関連性であるとは見られず、血清およびＣＳＦで同じ傾向であった（表３および表４）。
Figure 2022523104000018
Figure 2022523104000019
他の組換えＧＣアーゼ酵素（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）、ＶＰＲＩＶ（登録商標）、Ｔａｌｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ（登録商標））もまた、反復全身注射後にカニクイザルにおいて、抗体応答を誘導する。一部のゴーシェ病患者は、免疫原性応答を生じるが、それは、一般に、確立された有効性パラメーターについての、処置に対する臨床応答の低減とは関連付けられていない（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ １９９９， ｖｏｌ． ９３， ２０８１－２０８８、Ｓｔａｒｚｙｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２００７， ｖｏｌ． ９０， １５７－１６３、Ｐａｓｔｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１６， ｖｏｌ． ５９， ３７－４３、Ｚｉｍｒａｎ ｅｔ ａｌ． Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ． ２０１８， ｖｏｌ． １３， ３６）。
動物モデルにおけるＡＤＡ応答による患者における応答の予測は良好ではなく、したがって、ＣＨＭＰガイドラインは、「ヒトにおける免疫原性を予測することを目的とした非臨床研究は通常必要とされないが、動物モデルは、免疫応答の結果を評価することにおいて有用であり得る」と述べている。本発明者らの研究では、抗Ｏｘｙ５５９５抗体の存在は、いかなる臨床徴候も引き起こさず、ＣＳＦまたは血漿における曝露に対しても大きな影響を有さなかった。
組織病理学
脳、脊髄、脊髄神経根、感覚神経節（後根神経節／三叉神経節）、末梢神経、視神経を有する眼、および非神経系組織を、パラフィン包埋切片ならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用して試験した。加えて、脳切片を、星状細胞およびミクログリアの反応について染色した。
ｉｎ ｖｉｖｏでの実験手順と関連するいくつかの併発症、たとえば、壊死、小膠細胞症、および星状細胞増加症が、脳におけるカテーテルの通り道の周囲に存在する。これは、脳への直接的な送達を利用する研究においては比較的一般的であるが、必ずしも臨床試験において安全性の問題を引き起こすわけではない。
主として好酸球から構成される細胞浸潤物の用量関連の全般的な増加が、Ｏｘｙ５５９５の両方の用量レベルで、脳、脊髄、脊髄神経根、感覚神経節（後根神経節および三叉神経節）、ならびにその周囲の組織（髄膜／神経上膜）において観察された。２週間の回復期間の後、浸潤物の全体的な重症度は、もっとも高い用量群では低減された（中等度用量の動物では回復はなかった）。肉眼的所見および微視的所見は、浸潤物が、ニューロンに対してなんらかの損傷を引き起こすことも特定の膠細胞応答を誘起することもないと見られたことを考慮すると、５０ｍｇのＯｘｙ５５９５が、「観察される有害作用がないレベル」と考えられるという解釈と一致した。臨床徴候または他の有害性の徴候の不在により、これらの浸潤物は、試験したもっとも高い用量であっても、試験動物によって耐容されると見られた。
結論
結論として、週１回で２３回の、１０ｍｇまたは５０ｍｇのＯｘｙ５５９５（ａＣＳＦ、ｐＨ６．６において製剤化）のおよそ４０分間にわたるＩＣＶ注入が、若齢カニクイザルにおいて十分に耐容された。ＣＳＦおよび血液中の好酸球の増加は、用量投与の完了後２週間以内にほぼ正常な値に戻った。好酸球増加症は、ほとんどが臨床結果を伴わずに生じる薬物関連のアレルギー反応を示し得るが、これは、ＩＣＶデバイスによっても引き起こされ得る。実際に、ＣＳＦ好酸球増加症は、脳室シャントを有する患者において比較的一般的な所見である。主として好酸球から構成される細胞浸潤物の用量関連の全般的な増加が、Ｏｘｙ５５９５の両方の用量レベルで、ＣＮＳにおいて観察されたが、ニューロンに対してなんらかの損傷を引き起こすことも特定の膠細胞応答を誘起することもないと見られた。浸潤は、２週間の回復期間中に改善された。ＩＣＶ投与したＯｘｙ５５９５は、カニクイザルにおいて免疫原性応答を誘導したが、ＣＳＦおよび循環における薬物曝露に対する影響を有するとは見られず、なんらかの臨床徴候を引き起こすこともなかった。ＩＣＶ投与したＯｘｙ５５９５は、マウスにおいて基質を効率的に低減することが示された量で、神経障害性ゴーシェ病に関与することが説明されている領域を含め、脳組織全体に分布した。
（実施例１８）
以下により、本発明の原理によるＧＣアーゼ組成物および処置レジメンのある特定の実施形態を例示する。
２型ゴーシェ病を有する２歳の被験体に、左脳室に埋め込んだカテーテルによって送達される人工ＣＳＦ ｐＨ６．６中に製剤化した２１０ｍｇのＯｘｙＧＣアーゼＫ３２１Ｎ（１時間の注入用量当たり±１０ｍＬ体積）で、１週間に１回処置を行う。
２型ゴーシェ病を有する３歳の被験体に、右脳室に埋め込んだカテーテルによって送達される人工ＣＳＦ ｐＨ６．６中に製剤化した２１０ｍｇのＯｘｙＧＣアーゼＨ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ（１時間の注入用量当たり±１０ｍＬ体積）で、１週間に１回処置を行う。
３型ゴーシェ病を有する３歳の被験体に、右脳室に埋め込んだカテーテルによって送達される人工ＣＳＦ ｐＨ６．６中に製剤化した２１０ｍｇのＯｘｙＧＣアーゼＨ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎ（１時間の注入用量当たり±１０ｍＬ体積）で、１週間に１回処置を行う。
３型ゴーシェ病を有する２歳の被験体に、左脳室に埋め込んだカテーテルによって送達される人工ＣＳＦ ｐＨ６．６中に製剤化した２１０ｍｇのＯｘｙＧＣアーゼＫ３２１Ｎ（１時間の注入用量当たり±１０ｍＬ体積）で、１週間に１回処置を行う。
Ｇｂａ１関連のパーキンソン病を有する成人被験体に、右脳室に埋め込んだカテーテルによって送達される人工ＣＳＦ ｐＨ６．６中に製剤化した２５０ｍｇのＯｘｙＧＣアーゼＫ３２１Ｎ（１時間の注入用量当たり±１０ｍＬ体積）で、１週間に１回処置を行う。
１型ゴーシェ病を有する２歳の被験体に、ボーラス注射によって静脈内送達される、５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．５中４０単位／ｍＬで製剤化した３０Ｕ／ｋｇのＯｘｙＧＣアーゼＫ３２１Ｎで、１週間に１回処置を行う。
１型ゴーシェ病を有する３歳の被験体に、注入によって静脈内送達される、５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．５中４０単位／ｍＬで製剤化した３０Ｕ／ｋｇのＯｘｙＧＣアーゼＨ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎで、１週間に１回処置を行う。
１型ゴーシェ病を有する２歳の被験体に、ボーラス注射によって静脈内送達される、凍結乾燥させ、５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．５中４０単位／ｍＬで再構成した６０Ｕ／ｋｇのＯｘｙＧＣアーゼＫ３２１Ｎで、１週間に２回処置を行う。
１型ゴーシェ病を有する成人被験体に、注入によって静脈内送達される、凍結乾燥させ、５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．５中４０単位／ｍＬで再構成した６０Ｕ／ｋｇのＯｘｙＧＣアーゼＨ１４５Ｌ／Ｋ３２１Ｎで、１週間に２回処置を行う。

Claims (15)

  1. グルコセレブロシダーゼ調製物またはグルコセレブロシダーゼを含む組成物であって、前記グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも３０％が、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、調製物または組成物。
  2. 前記グルコセレブロシダーゼによって含まれる前記グリカンのうちの少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべてが、少なくとも１つのマンノース－６－リン酸部分を含む、請求項１に記載の調製物または組成物。
  3. 前記マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのうちの少なくともいくつかが、２つのマンノース－６－リン酸部分を含み、たとえば、前記マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンのうちの少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、請求項１または２に記載の調製物または組成物。
  4. グルコセレブロシダーゼを含む調製物または組成物であって、前記グルコセレブロシダーゼによって含まれるグリカンのうちの少なくとも１０％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、調製物または組成物。
  5. 前記グルコセレブロシダーゼによって含まれる前記グリカンのうちの少なくとも１５％、または少なくとも２０％、または少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％、または少なくとも４５％が、２つのマンノース－６－リン酸部分を含む、請求項４に記載の調製物または組成物。
  6. 前記グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも４０％が、グリコシル化されており、前記グルコセレブロシダーゼ分子のうちの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または実質的にすべてが、グリコシル化されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
  7. 前記グルコセレブロシダーゼが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼ、またはヒト野生型グルコセレブロシダーゼと比べて増加した安定性および／もしくは特異性を有するヒト野生型グルコセレブロシダーゼのバリアントである、請求項１から６のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
  8. 前記グルコセレブロシダーゼバリアントが、ヒト野生型グルコセレブロシダーゼとは、Ｋ３２１、Ｈ１４５、Ｆ３１６、およびＬ３１７からなる群より選択される１つまたは複数の位置における単一アミノ酸置換、たとえば、好ましくは、Ｋ３２１、またはＨ１４５、またはＫ３２１およびＨ１４５における単一アミノ酸置換、たとえば、より好ましくは、Ｋ３２１Ｎ置換、またはＨ１４５Ｌ置換、またはＫ３２１ＮおよびＨ１４５Ｌ置換によって異なる、請求項７に記載の調製物または組成物。
  9. 前記マンノース－６－リン酸部分のマンノースが、末端マンノースである、請求項１から８のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
  10. 前記マンノース－６－リン酸部分を含むグリカンが、それぞれ独立して、ＰＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、ＰＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｐ２Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、およびＰ２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含むかまたはそれからなる群より選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
  11. 前記グルコセレブロシダーゼが、グルコセレブロシダーゼを産生するように遺伝子操作された真菌細胞、たとえば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞によって組換え発現されたグルコセレブロシダーゼの脱キャッピングおよび脱マンノシル化によって得ることができるかまたは得られる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の調製物または組成物。
  12. 請求項１から１１のいずれか一項に記載のグルコセレブロシダーゼ調製物または組成物を含む、医薬組成物であって、必要に応じて、
    － グルコセレブロシダーゼが、人工脳脊髄液（ａＣＦＳ）を用いて製剤化されるか、
    － 前記医薬組成物が、約６．４～６．９、好ましくは、約６．６のｐＨを有するか、または
    － 前記グルコセレブロシダーゼが、ａＣＦＳを用いて製剤化され、前記医薬組成物が、約６．４～６．９、好ましくは、約６．６のｐＨを有する、
    医薬組成物。
  13. 治療において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、または請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. グルコセレブロシダーゼ欠損によって特徴付けられる疾患を処置する方法において使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物、または請求項１２に記載の医薬組成物。
  15. － 前記疾患が、ゴーシェ病であるか、
    － 前記疾患が、非神経障害性ゴーシェ病であるか、
    － 前記疾患が、神経障害性ゴーシェ病であるか、
    － 前記疾患が、２型（ＧＤ２）、３型（ＧＤ３）、または周生期致死型（ＧＤＰＬ）の神経障害性ゴーシェ病であるか、
    － 前記疾患が、グルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーであるか、
    － 前記疾患が、パーキンソニズム、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）から選択されるグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーであるか、
    － 前記調製物もしくは組成物または医薬組成物が、全身投与されるか、
    － 前記調製物もしくは組成物または医薬組成物が、静脈内（ＩＶ）投与されるか、
    － 前記調製物もしくは組成物または医薬組成物が、中枢神経系に投与されるか、
    － 前記調製物もしくは組成物または医薬組成物が、脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内に投与されるか、
    － 前記疾患が、神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーであり、前記調製物もしくは組成物または医薬組成物が、脳室内（ＩＣＶ）または髄腔内投与されるか、あるいは
    － 前記疾患が、神経障害性ゴーシェ病またはグルコセレブロシダーゼ関連アルファ－シヌクレイノパチーであり、前記調製物もしくは組成物または医薬組成物が、脳室内（ＩＣＶ）投与される、
    請求項１４に記載の使用のためのグルコセレブロシダーゼ調製物もしくは組成物または医薬組成物。
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