WO2023145812A1 - グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質 - Google Patents

グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質 Download PDF

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WO2023145812A1
WO2023145812A1 PCT/JP2023/002409 JP2023002409W WO2023145812A1 WO 2023145812 A1 WO2023145812 A1 WO 2023145812A1 JP 2023002409 W JP2023002409 W JP 2023002409W WO 2023145812 A1 WO2023145812 A1 WO 2023145812A1
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amino acid
seq
protein
substitution
position corresponding
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PCT/JP2023/002409
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Inventor
大祐 立岩
勇樹 牧野
泰治 下田
祐二 西内
健文 村瀬
由佳 松田
Original Assignee
株式会社日本触媒
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Definitions

  • the present invention relates to a glycosylated protein having glucocerebrosidase activity.
  • Lysosomal disease is a hereditary disease caused by decreased activity or deficiency of lysosomal enzymes and their related factors, resulting in the accumulation of substances that act as substrates for these enzymes in the body.
  • glucocerebrosidase ⁇ -glucosidase
  • GBA glucocerebrosidase
  • GBA ⁇ -glucosidase
  • Symptoms and findings such as anemia, thrombocytopenia, bone changes, and increased blood acid phosphatase and angiotensin-converting enzyme levels associated with hyperfunction are observed (Non-Patent Document 1).
  • enzyme replacement therapy is often used as a treatment method for such lysosomal diseases.
  • a recombinant cDNA encoding human glucocerebrosidase expressed in a Chinese hamster ovary (CHO) cell line was glycoengineered to facilitate uptake into target cell macrophages.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • an object of the present invention is to provide a glycosylated protein having glucocerebrosidase activity.
  • the present inventors have conducted extensive studies. As a result, the glycosylated protein having glucocerebrosidase activity, which is obtained by adding a sugar chain having a single structure to a protein having glucocerebrosidase activity and having no sugar chain added thereto, was found to We have found that the problem can be solved, and have completed the present invention.
  • X to Y includes X and Y and means "X or more and Y or less”. Unless otherwise specified, measurements of operations and physical properties are performed under the conditions of room temperature (20 to 25° C.)/relative humidity of 40 to 50% RH.
  • One embodiment of the present invention is a glycosylated protein having glucocerebrosidase activity, which is obtained by adding a sugar chain having a single structure to a protein having glucocerebrosidase activity and not having a sugar chain added thereto. is protein. According to this embodiment, a glycosylated protein having a sugar chain with a single structure and glucocerebrosidase activity is provided.
  • glucose-cocerebrosidase activity means activity to hydrolyze glucocerebroside.
  • the presence or absence of glucocerebrosidase activity is determined based on the presence or absence of enzymatic reactivity with respect to the synthetic substrate (p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside) described in the Examples section below.
  • the specific activity of the protein having glucocerebrosidase activity to which no sugar chain has been added after the refolding treatment according to the present invention is, for example, 0.5 U/mg or more, preferably 0.6 U/mg or more. and more preferably 1.2 U/mg or more.
  • the glycosylated protein of the present invention has a specific activity of 80% or more, preferably 100% or more, relative to the specific activity of the protein having glucocerebrosidase activity, which is not glycosylated. .
  • the mature protein of glucocerebrosidase is a polypeptide consisting of 497 amino acid residues produced by cleaving the propeptide from the precursor protein consisting of 536 amino acid residues.
  • Glucocerebrosidase biopharmaceuticals marketed for Gaucher disease include Cerezyme® (produced by Chinese Hamster Ovary (CHO) cells), VPRIV® (human fiber sarcoma cells (HT1080)), Elelyso® (produced by plant (carrot) cells).
  • the amino acid sequence constituting the protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity includes the amino acid sequence constituting the human wild-type GBA protein; Cerezyme (registered trademark); Amino acid sequences constituting VPRIV (registered trademark), Elelyso (registered trademark), etc.; synonymous with "homology” in the literature).
  • amino acid sequences can be determined using analysis programs such as BLAST, FASTA, and CLUSTAL W. When using BLAST, use the program's default parameters.
  • the "identity" of the amino acid sequences refers to aligning the two amino acid sequences so that the amino acid residues of the two amino acid sequences to be compared are matched as much as possible, and then determining the number of matched amino acid residues. is divided by the total number of amino acid residues and expressed as a percentage. In the above alignment, if necessary, gaps are inserted into one or both of the two sequences to be compared, and one inserted gap is counted as one amino acid residue to obtain the total number of amino acid residues. If the total number of amino acid residues determined in this way differs between the two sequences being compared, then the percent sequence identity is the total number of amino acid residues in the longer sequence and the number of matching amino acid residues. Calculated by dividing numbers.
  • the protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 or an amino acid having 90% or more identity with them Contains arrays.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 corresponds to the amino acid sequence of selezyme (the amino acid at the position corresponding to position 495 is histidine (H), unlike the human wild-type GBA protein).
  • the amino acid sequence is shown below, and the nucleotide sequence (including the termination codon) of the gene (cDNA) encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:134.
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is also simply referred to as "GBA gene".
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 corresponds to the amino acid sequence of biprib (the amino acid at the position corresponding to position 495 is arginine (R), unlike the human wild-type GBA protein).
  • the amino acid sequence is shown below.
  • the protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity is represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • Amino acid sequences having at least one of the above amino acid substitutions include, for example, the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOS: 16, 24, 28, 30, 37, 39, 41, 43-49, 136, 137, 141-145. .
  • the protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity according to the present invention is selected from the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 24, 30, 43, 136, 137, 141-145. including at least one
  • the protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity is the amino acid set forth in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity according to the present invention is more preferably an amino acid having at least one of the following amino acid substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2:
  • amino acids at the following positions are not substituted: In (a-2), the amino acid at the position corresponding to position 142 in (a-2), the amino acid at the position corresponding to position 144 in (a-2), the amino acid at the position corresponding to position 147 (a-2) In the amino acid (a-2) at the position corresponding to position 171, at the amino acid (a-2) at the position corresponding to position 347, at the amino acid (a-4) at the position corresponding to position 407, at position 248 In the amino acid at the corresponding position (a-9), the amino acid at the position corresponding to position 77 in (a-9), the amino acid at the position corresponding to position 290 in (a-9), the amino acid at the position corresponding to position 293 The amino acid at the position corresponding to position 333 in (a-9) The amino acid at the position corresponding to position 466 in (a-9).
  • Amino acid sequences having at least one of the above amino acid substitutions include, for example, SEQ ID NOs: 3-5, 7, 9-30, 32, 33, 35, 37-39, 41-51, 136, 137, 141-145. and the amino acid sequence of
  • the protein according to the invention is , 141-145.
  • the protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity according to the present invention is the amino acid of SEQ ID NO: 1 or 2
  • the non-glycosylated and having glucocerebrosidase activity according to the present invention contains at least one amino acid sequence selected from the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 17, 18 and 51. .
  • a protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity according to the present invention may consist of the amino acid sequence described above.
  • the glycosylated protein of the present invention is obtained by adding a sugar chain having a single structure to a protein having glucocerebrosidase activity and not having a sugar chain added thereto.
  • the number of amino acids to which sugar chains are added may be 1 or more, preferably 1-4.
  • sugar chain means a compound in which one or more unit sugars (monosaccharides and derivatives thereof) are linked. When two or more unit sugars are connected, the unit sugars are bonded to each other by dehydration condensation due to glycosidic bonds.
  • sugars include monosaccharides and polysaccharides contained in living organisms (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, complexes thereof and derivatives thereof); Degraded polysaccharides; sugar chains degraded or derived from complex biological substances such as glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, and glycolipids.
  • sugar chain having a single structure means that, when comparing the sugar chains to be added, the types of sugars constituting the sugar chain, the order of bonding, and the manner of bonding are the same as in the glycosylated protein. means that they are identical.
  • the glycosylated protein of the present invention may have only one type of sugar chain added per site, but may also include proteins with two or more types of sugar chains added. .
  • the sugar chain according to the present invention is not particularly limited as long as it does not eliminate the glucocerebrosidase activity of the glycosylated protein.
  • the sugar chain may be a sugar chain that exists as a complex carbohydrate (glycopeptide or glycoprotein, proteoglycan, glycolipid, etc.) in vivo, or a sugar chain that does not exist as a complex carbohydrate in vivo. good.
  • Sugar chains that exist as glycoconjugates in vivo include N-linked sugar chains, O-linked sugar chains, and the like.
  • the glycosylated protein has one or more sugar chains having a single structure added thereto, and the sugar chain having a single structure is derived from a compound represented by the following formula 1: has the structure
  • the sugar chain according to the present invention may be a sugar chain composed of the compound represented by Formula 1 above, or may be a sugar chain in which another sugar chain structure is bound to the compound represented by Formula 1.
  • Sugar chains to which other sugar chain structures are bound include high-mannose type, complex type, hybrid type, and the like.
  • the sugar chain according to the present invention consists of the compound represented by Formula 1 above.
  • the amino acid to which the sugar chain is added is not particularly limited, and any amino acid can be used.
  • the sugar chain may be directly bound to the amino acid, or may be attached via a linker.
  • the sugar chain is attached via a linker.
  • amino acids to which the sugar chain is added include cysteine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, histidine, and tryptophan, from the viewpoint of ease of binding to the linker. , serine, threonine, tyrosine, asparagine, glutamine, and the like.
  • the amino acid to which a sugar chain is added is preferably an amino acid selected from the group consisting of cysteine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, serine, threonine and glutamine, and more preferably. Cysteine.
  • the linker is not particularly limited, and conventionally known ones can be used.
  • the number of sugar chains linked to the linker is, for example, 1 or more, and It is preferably 1 to 3, more preferably 2 or 3, still more preferably 3, from the viewpoint of improving the amount of uptake.
  • Examples in which three sugar chains are linked to a linker include a form in which a sugar chain is linked to each amino acid of a linker containing a tripeptide.
  • the glycosylated protein of the present invention is not glycosylated, and a cysteine residue constituting a protein having glucocerebrosidase activity is glycosylated with a single-structure sugar chain. ing.
  • the linker has a reactive functional group, preferably a maleimide structure, at its end.
  • the protein having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, wherein the above (1) to ( A protein having at least one amino acid substitution of 6) is preferred.
  • the method for producing a peptide chain as a raw material for a protein having glucocerebrosidase activity and having no sugar chain according to the present invention is not particularly limited as long as a sugar chain is not added to the peptide chain. It may be a produced peptide chain or a peptide chain synthesized by organic synthesis. From the viewpoint of high productivity and low cost, the protein according to the present invention can preferably be derived from peptide chains produced by prokaryotes.
  • prokaryotes examples include E. coli such as Escherichia coli, Bacillus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas such as Pseudomonas putida, and Rhizobium such as Rhizobium meliloti. Bacteria belonging to.
  • the prokaryote used in the present invention is preferably E. coli.
  • the method for producing a protein having glucocerebrosidase activity and not having a sugar chain includes introducing a vector containing a nucleic acid encoding the protein into a prokaryote, It includes producing a protein raw material in a prokaryote and subjecting the recovered protein raw material to a folding treatment.
  • a vector containing a nucleic acid encoding the protein of the present invention is introduced into a prokaryote to produce a raw protein material. This makes it possible to obtain a raw protein material to which sugar chains have not been added.
  • a method for producing a nucleic acid encoding a protein having glucocerebrosidase activity and having no added sugar chain according to the present invention and a vector containing the nucleic acid is not particularly limited, and conventionally known methods can be used. .
  • vectors known vectors such as T vectors such as pTAKN-2 and plasmid vectors such as pET-21b(+) can be used.
  • the method for introducing the vector into prokaryotes is not particularly limited, and conventionally known methods can be used as appropriate.
  • Methods of introduction include a competent cell method, a conjugative transfer method, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method and the like.
  • the prokaryotic organism By culturing the prokaryotic organism into which the vector has been introduced, the prokaryotic organism can be made to produce a protein raw material. Cultivation of prokaryotes can be performed according to conventional methods used for the selected prokaryote.
  • Prokaryotes are cultured under aerobic or anaerobic conditions, depending on the type of prokaryotes used.
  • the prokaryotic culture may be subjected to shaking, aeration, or the like.
  • the culture conditions (culture temperature, culture time, medium pH, etc.) are appropriately selected depending on the composition of the medium and the culture method, and are not particularly limited as long as the conditions allow prokaryotes to proliferate. can be selected as appropriate.
  • the protein according to the present invention having no sugar chain and having glucocerebrosidase activity does not have a sugar chain due to post-translational modification, it is desirable that the protein is not post-translationally modified.
  • prokaryotes are collected from the resulting culture by methods such as centrifugation and filtration, and the collected prokaryotes are subjected to mechanical methods such as beads or enzymatic methods. crush. After crushing, the insoluble fraction is collected and treated with a buffer containing a surfactant to recover the protein raw material.
  • the collected protein raw material is subjected to folding treatment (refolding treatment including prior denaturation treatment is also acceptable).
  • a buffer containing an oxidizing agent and a reducing agent oxidized glutathione/reduced glutathione, cystine/cysteine, cysteamine/cystamine, etc.
  • oxidized glutathione/reduced glutathione, cystine/cysteine, cysteamine/cystamine, etc. is added to a liquid containing the recovered protein raw material, and the mixture is heated at about 20°C to about 20°C. It can be carried out by standing at about 30° C. for about 1 to 7 days. Further additives such as sucrose and glycerol can be added to the buffer.
  • the recovered protein raw material may be subjected to denaturation (solubilization) treatment before folding treatment, if necessary.
  • the denaturation treatment can be performed using a denaturant such as 6M guanidine hydrochloride and 8M urea. By applying the denaturation treatment, the recovered protein raw material can be brought into an unfolded state.
  • the method for producing a sugar chain having a single structure according to the present invention is not particularly limited, and conventionally known methods can be used as appropriate.
  • conventionally known methods can be used as appropriate.
  • the methods described in WO03/008431, WO2004/058984, WO2004/058824, WO2004/070046, WO2007/011055, etc. can be used. can.
  • cysteine which constitutes a protein having glucocerebrosidase activity and not having sugar chains added
  • cysteine which constitutes a protein having glucocerebrosidase activity and not having sugar chains added
  • sugar chain derivative (glycosylation reagent in the Examples) in which the sugar chain and the linker are bound is added to the glucocerebrosidase without the addition of a sugar chain. React with an active protein.
  • a sugar chain derivative is, for example, a compound represented by Formula 1 in which the group bonded to the 1-position carbon of GalNac at the sugar chain terminal is replaced with a linker. Methods for producing linkers and sugar chain derivatives are not particularly limited, and conventionally known methods can be used.
  • a sugar chain derivative and a protein having glucocerebrosidase activity to which no sugar chain has been added are reacted in a phosphate buffer at about 0°C to room temperature.
  • the phosphate buffer may contain tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) or the like to prevent dimer formation.
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride
  • the final concentration of TCEP, etc. is, for example, 10 ⁇ M to 10 mM.
  • the glycosylated protein can be obtained by purifying with HPLC.
  • the glycosylated protein having glucocerebrosidase activity of the present invention has a sugar chain with a single structure added, unlike conventional glycosylated glucocerebrosidase proteins. Therefore, stable efficacy can be expressed. In addition, the stability at near neutral pH can be improved (see Examples). Therefore, it can be suitably used in the treatment of lysosomal diseases such as Gaucher disease.
  • one embodiment of the present invention relates to compositions comprising said glycosylated proteins, preferably compositions comprising only one of said glycosylated proteins.
  • the type and proportion of the glycosylated protein in the composition can be controlled.
  • only one type of glycosylated protein in the composition means that the positions of amino acids to which sugar chains are added, the number of amino acids to which sugar chains are added, and the number of sugar chains to be added are the same. It means that some glycosylated protein is present in the composition.
  • composition according to the present invention can have a constant quality, it is particularly suitable for uses such as pharmaceuticals and assays.
  • the plasmid number and recombinant protein number are assigned the same number.
  • GBA Glucocerebrosidase
  • SEQ ID NO: 135 adds an initiation codon (atg) to the 5′-end of the codon encoding the mature GBA protein from which the signal peptide has been removed, and Modifications were made so that the sequence was optimized for the codon usage of E. coli (strain K-12).
  • the synthesis of the GBA gene represented by SEQ ID NO: 135 was outsourced to Eurofins Genomics, Inc., and delivered in a state of being inserted into pTAKN-2 containing the ampicillin resistance gene.
  • GBA gene-inserted plasmid In order to examine expression in E. coli, the GBA gene obtained above was inserted between the NdeI site and the His tag of the pET-21b(+) plasmid vector (Novagen). subcloned into. Specifically, PCR was performed using either pET-21b (+) or pTAKN-2 into which the GBA gene was inserted as a template, and linearized pET-21b (+) and the GBA gene (excluding the stop codon) were ) were obtained respectively.
  • the PCR amplification product obtained above was treated using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) (cleavage and ligation with restriction enzyme DpnI), and the pET-21b(+) plasmid into which the GBA gene was inserted A vector (referred to herein as "H495 type") was obtained.
  • the GBA gene inserted into the plasmid vector encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • the resulting PCR amplified product (linearized plasmid) was fused with T4 Polynucleotide Kinase (Toyobo Co., Ltd.) and Ligation high Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.) by self-ligation to obtain a plasmid into which the modified GBA gene was inserted (Table 5).
  • T4 Polynucleotide Kinase Toyobo Co., Ltd.
  • Ligation high Ver. 2 Toyobo Co., Ltd.
  • E. coli competent cells ECOS competent E. coli BL21 (DE3) (Nippon Gene Co., Ltd.)
  • Various recombinant E. coli strains were constructed that were transformed and carried plasmid vectors into which the GBA gene or modified GBA gene had been inserted.
  • a single colony grown on LB agar medium (containing ampicillin at a concentration of 100 mg/L) was added to 4 mL of LB liquid medium (containing ampicillin at a concentration of 100 mg/L) in a test tube.
  • the cells were inoculated and cultured with shaking at 300 rpm and 30° C. overnight to obtain a preculture solution.
  • the culture medium is centrifuged at 6,000 x g for 10 minutes at 4°C, the supernatant is discarded, and the precipitate is suspended using buffer A (see Table 4 below for composition). let me After that, the mixture was centrifuged again at 6,000 ⁇ g and 4° C. for 10 minutes, and after discarding the supernatant, a precipitate of recombinant E. coli was obtained (then it was frozen and stored at ⁇ 80° C.).
  • the denominator of 1.7 is the extinction coefficient calculated based on the amino acid sequence information.
  • Incubation was started by standing at 25°C from the time of dilution, samples were collected 7 days after the start of incubation, and enzyme activity was measured by the following method.
  • GBA Glucocerebrosidase
  • Glc-Cer glucocerebroside; glycolipid
  • pNPG synthetic substrate p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside
  • the GBA protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (herein referred to as "H495 type protein") produced in E.
  • C342 is an amino acid residue necessary for enzymatic activity (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 7, pp. 4242-4253, February 17, 2006). However, it was found that the activity was maintained when the serine was substituted.
  • Each recombinant GBA protein was obtained from each recombinant E. coli strain carrying the plasmids listed in Table 6 by the same method as 2-1 to 2-3 above.
  • Liquid A buffer C (see Table 9 below for the composition) and liquid B: ethanol were used as solutions, and the active fraction eluted at 40% B was collected. The recovered solution was concentrated with Amicon Ultra-15, 3 kDa (Merck) and then lyophilized.
  • DiMan-Asn 1 (119.8 mg, MW: 1024.9, 117 ⁇ mol) was suspended in DMF, and N-Succinimidyl 3-Maleimidopropionate (78.0 mg, MW: 266.2, 293 ⁇ mol, 2.5 eq, Wako, product code : QA-2328) and diisopropylethylamine (DIPEA, 102 ⁇ L, 585 ⁇ mol, 5.0 eq, nacalai tesque, product code: 14014-84) were added and allowed to react at room temperature for 24 hours. After 24 hours from the initiation of the reaction, the reaction mixture was dropped into ethyl acetate to precipitate. The precipitate was washed twice with ethyl acetate and dried. Purification by HPLC gave Di-Man-Asn-MAL 2 (92.0 mg, MW: 1176.05, 78.2 ⁇ mol, 67%).
  • S242C was confirmed to have a reduced enzymatic activity due to modification.
  • T61C, P98C, Q143C, K224C, K321C and T407C are suitable as modification positions.
  • Cerezyme registered trademark
  • purified recombinant GBA proteins No. 167 and No. 178
  • Table 11 shows the results.
  • Cell uptake test (Test example 1) NR8383 cells (purchased from ATCC) were cultured in Ham's F12K medium (containing 2 mM L-glutamine, 1.5 g/L sodium bicarbonate, and 10% heat-inactivated fetal bovine serum).
  • a test solution was prepared in a 1.5 mL tube using Ham's F12K medium so as to have the following composition.
  • a glycosylated active glucocerebrosidase variant No. 178-G1 or No. 178-G3 was used.
  • Test example 2 A recombinant GBA protein (No. 178) or a glycosylated active glucocerebrosidase variant (No. 178-G3) was used as a sample, and the test solution was prepared so as to have the following composition. The specific activity was calculated as in Example 1. Table 15 shows the results.
  • Test example 3 Sugar chain-modified active glucocerebrosidase variant (No. 178-G3 or No. 234-G3) was used as a sample, a test solution was prepared to have the following composition, and incubated at 37°C for 1.5 minutes. The specific activity was calculated in the same manner as in Test Example 1, except that it was carried out for a period of time. The results are shown in Table 16.

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Abstract

本発明は、グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質を提供する。糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質に、単一構造を有する糖鎖を付加したものである、グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質。

Description

グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質
　本発明は、グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質に関する。
　リソソーム病は、リソソーム酵素およびその関連因子の活性低下又は欠損が原因となり、当該酵素の基質となる物質が体内に蓄積することにより生じる遺伝病である。例えば、リソソーム病の一つであるゴーシェ病では、グルコセレブロシダーゼ（β－グルコシダーゼ；ＧＢＡ）の活性低下により、細網内皮系組織のマクロファージなどの細胞にグルコセレブロシドが蓄積して、肝脾腫、脾機能亢進に伴う貧血や血小板減少、骨変化、血中酸性フォスファターゼおよびアンギオテンシン変換酵素値の上昇等の症状や所見が見られる（非特許文献１）。
　このようなリソソーム病の治療方法としては、従来、酵素補充療法がよく採用されている。例えば、ゴーシェ病では、ヒトのグルコセレブロシダーゼをコードするｃＤＮＡをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株で発現させた組換え酵素が、標的細胞マクロファージへの取り込みが容易となるように糖鎖改変された形（例えば、酵素の糖鎖の非還元末端にマンノース残基を有するタイプとし、標的細胞マクロファージの表面に存在するマンノース受容体に認識され易くしたもの）で用いられている。
　しかしながら、上述のＣＨＯ細胞株のような哺乳動物培養細胞を宿主とした組換え酵素の生産には、培養液が高価である、人畜共通感染ウイルスによる感染リスクがある、細胞の増殖が遅い、糖鎖構造が不均一である、といった問題がある。また、植物に由来する細胞を宿主として用いてグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）の組換え体を生産する技術も提案されている（特許文献１）。しかしながら、植物や出芽酵母などの真核生物を宿主として用いて生産された組換え酵素においては、翻訳後修飾によって当該酵素に付加している糖鎖の構造が哺乳細胞とは大きく異なるため、哺乳動物に対して抗原性を示すという問題がある。したがって、野生型の植物や出芽酵母に由来する細胞を宿主として用いて生産された組換え酵素をバイオ医薬品として用いることには難点がある。
特表２００６－５２４５０６号公報
Bou-Gharios G. et al., Histochem J. (1993) 25, 593-605
　このように、従来の糖鎖が付加されたグルコセレブロシダーゼタンパク質は、糖鎖構造に起因する問題がある。
　そこで本発明は、グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質を提供すること、を目的とする。
　本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質に、単一構造を有する糖鎖を付加したものである、グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質により、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　以下、本発明に係る実施の形態を詳細に説明する。但し以下の記載は本発明を説明するための例示であり、本発明をこの記載範囲にのみ特別限定する趣旨ではない。
　本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。
　本発明の一形態は、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質に、単一構造を有する糖鎖を付加したものである、グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質である。本形態によれば、単一構造を有する糖鎖を有し、グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質が提供される。
　本明細書において、「グルコセレブロシダーゼ活性」とは、グルコセレブロシドを加水分解する活性を意味する。そして、グルコセレブロシダーゼ活性の有無は、後述する実施例の欄に記載の合成基質（ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコピラノシド）に対する酵素反応性の有無に基づき判定するものとする。本発明に係るリフォールディング処理後の糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質の比活性は、例えば０．５Ｕ／ｍｇ以上であり、好ましくは０．６Ｕ／ｍｇ以上であり、より好ましくは１．２Ｕ／ｍｇ以上である。また、本発明の糖鎖付加タンパク質は、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質の比活性に対して、８０％以上、好ましくは１００％以上の比活性を有する。
　グルコセレブロシダーゼの成熟型タンパク質は、５３６のアミノ酸残基からなる前駆体タンパク質からプロペプチドが切断されて生じる４９７のアミノ酸残基からなるポリペプチドである。ゴーシェ病を適応症として上市されているグルコセレブロシダーゼのバイオ医薬品としては、セレザイム（Cerezyme（登録商標））（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生）、ビプリブ（VPRIV（登録商標））（ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）により産生）、エレライソ（Elelyso（登録商標））（植物（ニンジン）細胞により産生）がある。
　本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を構成するアミノ酸配列としては、ヒト野生型ＧＢＡタンパク質を構成するアミノ酸配列；セレザイム（Cerezyme（登録商標））、ビプリブ（VPRIV（登録商標））、エレライソ（Elelyso（登録商標））などを構成するアミノ酸配列；これらと９０％以上（より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上）の同一性（本明細書において“相同性”と同義）を有するアミノ酸配列が挙げられる。
　本明細書において、アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　ここで、アミノ酸配列の「同一性」とは、比較対象である２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が可能な限り多く一致するように両アミノ酸配列を並列させた上、そこで一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入し、挿入した１つのギャップは１つのアミノ酸残基として数えて全アミノ酸残基数を求める。このようにして求めた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
　本発明の一実施形態において、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列またはそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列は、セレザイムのアミノ酸配列に相当する（４９５位に相当する位置のアミノ酸がヒト野生型ＧＢＡタンパク質と異なってヒスチジン（Ｈ）になっている）。当該アミノ酸配列を以下に示し、其のアミノ酸配列をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列（終止コドンを含む）を配列番号１３４に示す。本明細書中、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を単に「ＧＢＡ遺伝子」とも称する。
　配列番号２に記載のアミノ酸配列は、ビプリブのアミノ酸配列に相当する（４９５位に相当する位置のアミノ酸がヒト野生型ＧＢＡタンパク質と異なってアルギニン（Ｒ）になっている）。当該アミノ酸配列を以下に示す。
　本発明の好ましい実施形態において、糖鎖修飾の容易性およびグルコセレブロシダーゼ活性の観点から、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つ有するタンパク質である：
　（１）配列番号１または２の６１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ６１Ｃ）；
　（２）配列番号１または２の９８位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｐ９８Ｃ）；
　（３）配列番号１または２の１４３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ１４３Ｃ）；
　（４）配列番号１または２の２２４位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ２２４Ｃ）；
　（５）配列番号１または２の３２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ３２１Ｃ）；および
　（６）配列番号１または２の４０７位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ４０７Ｃ）。
　上記アミノ酸置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列としては、例えば配列番号１６、２４、２８、３０、３７、３９、４１、４３～４９、１３６、１３７、１４１～１４５に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　さらに好ましくは、本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号２４、３０、４３、１３６、１３７、１４１～１４５に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つを含む。
　本発明の好ましい実施形態において、グルコセレブロシダーゼ活性をより向上できるとの観点から、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つ有するタンパク質である：
　（７）配列番号１または２の２６位に相当する位置のアミノ酸をロイシンに置換（Ｆ２６Ｌ）；
　（８）配列番号１または２の２６位に相当する位置のアミノ酸をイソロイシンに置換（Ｆ２６Ｉ）；
　（９）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）；
　（１０）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ１２６Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
　（１１）配列番号１または２の５７位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ５７Ｃ）；
　（１２）配列番号１または２の６０位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｈ６０Ｃ）；
　（１３）配列番号１または２の６３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ６３Ｃ）；
　（１４）配列番号１または２の１４３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ１４３Ｃ）；
　（１５）配列番号１または２の１４５位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｈ１４５Ｃ）；
　（１６）配列番号１または２の２２４位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ２２４Ｃ）；ならびに
　（１７）配列番号１または２の３２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ３２１Ｃ）。
　また、本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、より好ましくは配列番号１または２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質である：
　（ａ－１）（７）Ｆ２６Ｌ
　（ａ－２）（９）Ｃ１２６Ｔ
　（ａ－３）（８）Ｆ２６Ｉおよび（９）Ｃ１２６Ｔ
　（ａ－４）（７）Ｆ２６Ｌおよび（９）Ｃ１２６Ｔ
　（ａ－５）（１０）Ｃ１２６ＳおよびＣ３４２Ｓ
　（ａ－６）（９）Ｃ１２６Ｔおよび（１１）Ｑ５７Ｃ
　（ａ－７）（９）Ｃ１２６Ｔおよび（１２）Ｈ６０Ｃ
　（ａ－８）（９）Ｃ１２６Ｔおよび（１３）Ｔ６３Ｃ
　（ａ－９）（９）Ｃ１２６Ｔおよび（１４）Ｑ１４３Ｃ
　（ａ－１０）（９）Ｃ１２６Ｔおよび（１５）Ｈ１４５Ｃ
　（ａ－１１）（９）Ｃ１２６Ｔおよび（１６）Ｋ２２４Ｃ
　（ａ－１２）（９）Ｃ１２６Ｔおよび（１７）Ｋ３２１Ｃ。
　ただし、（ａ－１）～（ａ－１２）において、以下の位置のアミノ酸は、置換されていない：
　（ａ－２）において、１４２位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、１４４位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、１４７位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、１７１位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、３４７位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、４０７位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－４）において、２４８位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、７７位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、２９０位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、２９３位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、３３３位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、４６６位に相当する位置のアミノ酸。
　上記アミノ酸置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列としては、例えば配列番号３～５、７、９～３０、３２、３３、３５、３７～３９、４１～５１、１３６、１３７、１４１～１４５に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　さらに好ましくは、本発明に係るタンパク質は、配列番号３、５、７、９、１０、１２～１６、１８～２８、３０、３２、３３、３５、３７～３９、４２、４７、１３６、１３７、１４１～１４５に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つを含む。
　本発明の好ましい実施形態において、安定性をより向上できるとの観点から、本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号１または２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを有する、タンパク質である：
　（１８）配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
　（１９）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
　（２０）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ１２６Ｓ）、配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；ならびに
　（２１）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）、配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）。
　より望ましくは、本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するは、配列番号１４、１７、１８および５１に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つを含む。
　本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は上記で説明されるアミノ酸配列からなるものであっても良い。
　本発明の糖鎖付加タンパク質は、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質に、単一構造を有する糖鎖を付加したものである。
　本発明の糖鎖付加タンパク質において、糖鎖が付加されるアミノ酸の数は、１以上であればよく、好ましくは１～４である。
　本明細書において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖およびその誘導体）が１つ以上連なった化合物を意味する。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。糖類としては、例えば生体中に含有される単糖類および多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸、それらの複合体およびそれらの誘導体）；分解された多糖；糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体物質から分解または誘導された糖鎖などが挙げられる。
　本明細書において、「単一の構造を有する糖鎖」とは、付加される糖鎖同士を比較した場合、糖鎖を構成する糖の種類、結合順序および結合様式が糖鎖付加タンパク質内において同一であることを意味する。本発明の糖鎖付加タンパク質は、1箇所につき糖鎖が１種類のみ付加されたものであってよいが、ほかにも糖鎖が２種類又は３種類以上付加されたものも含み得るものである。
　本発明に係る糖鎖は、糖鎖付加タンパク質のグルコセレブロシダーゼ活性を消失させない糖鎖であれば、特に制限されない。糖鎖は、生体内で複合糖質（糖ペプチドまたは糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖質であってもよい。生体内で複合糖質として存在する糖鎖としては、Ｎ－結合型糖鎖、Ｏ－結合型糖鎖などが挙げられる。
　本発明の一実施形態において、糖鎖付加タンパク質は、単一構造を有する糖鎖が、１つ以上付加されており、単一構造を有する糖鎖は、以下の式１で表される化合物由来の構造を有する。
　本発明に係る糖鎖は、上記式１で表される化合物からなる糖鎖であってもよく、式１で表される化合物に別の糖鎖構造が結合した糖鎖であってもよい。別の糖鎖構造が結合した糖鎖としては、高マンノース型、複合型、混成型などが挙げられる。
　一実施形態では、本発明に係る糖鎖は、上記式１で表される化合物からなる。
　本発明の糖鎖付加タンパク質において、糖鎖が付加されるアミノ酸は、特に限定されず、任意のアミノ酸を使用できる。
　糖鎖は、アミノ酸に直接結合してもよく、リンカーを介して付加されていてもよい。
　一実施形態において、糖鎖は、リンカーを介して付加されている。糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点から、糖鎖が付加されるアミノ酸としては、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられる。糖鎖が付加されるアミノ酸としては、反応性の観点から、好ましくはシステイン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニンおよびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはシステインである。
　リンカーとしては、特に制限されず、従来公知のものを使用することができる。リンカーとしては、例えば置換または非置換の炭素数１～２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数２～２０のアルケニレン基、置換または非置換の炭素数２～２０のアルキニレン基、置換または非置換の炭素数３～２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３～２０のシクロアルケニレン基、置換または非置換の炭素数６～２０のアリーレン基、置換または非置換の炭素数３～２０のヘテロアリーレン基、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、ポリオキシアルキレン基、アミノ酸残基、ペプチド鎖、ポリエチレングリコール、反応性官能基（例えば、マレイミド構造、ハロゲン化アセチル構造、アクリロイル構造またはＳ－Ｎｐｙｓ（Ｓ－３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル由来の基）、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
　糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーに結合している糖鎖の数（一つのアミノ酸に付加される糖鎖の数）は、例えば１以上であり、細胞への取込量を向上できるとの観点から、好ましくは１～３であり、より好ましくは２または３であり、さらに好ましくは３である。３つの糖鎖がリンカーに結合している例としては、トリペプチドを含むリンカーの各アミノ酸に糖鎖が結合している形態が挙げられる。
　好ましい実施形態において、本発明の糖鎖付加タンパク質は、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を構成するシステイン残基に、単一構造を有する糖鎖が付加されている。システイン残基に糖鎖を付加する場合、リンカーは、反応性官能基、好ましくはマレイミド構造をその末端に有する。
　システイン残基に糖類が付加されている場合、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、上記（１）～（６）のアミノ酸置換の少なくとも１つ有するタンパク質であることが好ましい。
　本発明の糖鎖付加タンパク質の製造方法の一例を以下に記載する。
　本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質の原料としてのペプチド鎖の製造方法は、ペプチド鎖に糖鎖が付加されない限り特に制限されず、原核生物によって産生されたペプチド鎖であっても、有機合成により合成されたペプチド鎖であってもよい。本発明に係るタンパク質は、高い生産性と低コストとの観点から、好ましくは原核生物によって産生されたペプチド鎖を原料とすることが可能である。
　原核生物としては、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の大腸菌属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。本発明で使用される原核生物は、好ましくは大腸菌である。
　一実施形態において、本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法は、当該タンパク質をコードする核酸を含むベクターを原核生物に導入して、前記原核生物にタンパク質原料を産生させることと、回収した前記タンパク質原料に対してフォールディング処理を施すことと、を含む。
　まず、本発明に係るタンパク質をコードする核酸を含むベクターを原核生物に導入して、前記原核生物にタンパク質原料を産生させる。これにより、糖鎖が付加されていないタンパク質原料を得ることができる。
　本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸およびそれを含むベクターの製造方法は、特に制限されず、従来公知の手法を用いることができる。
　ベクターは、公知のベクター、例えばｐＴＡＫＮ－２などのＴベクター、ｐＥＴ－２１ｂ（＋）などのプラスミドベクターを使用することができる。
　原核生物へのベクターの導入方法は、特に制限されず、従来公知の方法を適宜使用することができる。導入方法としては、コンピテントセル法、接合伝達法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
　ベクターを導入した原核生物を培養することにより、前記原核生物にタンパク質原料を産生させることができる。原核生物の培養は、選択した原核生物に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　使用する原核生物の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で、原核生物を培養する。前者の場合には、原核生物の培養は、振とうあるいは通気攪拌などが行われてもよい。また、培養の条件（培養温度、培養時間、培地のｐＨなど）は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、原核生物が増殖できる条件であれば特に制限されず、培養する原核生物の種類に応じて適宜選択できる。
　本発明に係る糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質は翻訳後修飾による糖鎖が付加されていないものであるから、即ち翻訳後修飾を受けていないことが望まれる。
　原核生物が産生したタンパク質原料を回収する方法としては、従来公知の方法を適宜使用することができる。例えばタンパク質原料が原核生物内に存在する場合は、得られた培養物から遠心分離、ろ過などの方法により原核生物を集菌し、採取した原核生物をビーズなどによる機械的方法、酵素的方法により破砕する。破砕後、不溶性画分を回収し、界面活性剤を含むバッファーで処理することで、タンパク質原料を回収することができる。
　次に、回収したタンパク質原料に対してフォールディング処理（変性処理を事前に行うことも含むリフォールディング処理であっても良い）を施す。
　フォールディング処理としては、例えば回収したタンパク質原料を含む液に、酸化剤と還元剤とを含むバッファー（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン、シスチン／システイン、システアミン／シスタミンなど）を添加し、約２０℃～約３０℃にて約１日～７日静置することによって、行うことができる。当該バッファーにはスクロースやグリセロールといった添加剤を更に添加することが可能である。
　回収したタンパク質原料は、フォールディング処理の前に、必要に応じて変性（可溶化）処理を施してもよい。変性処理は、６Ｍのグアニジン塩酸塩、８Ｍの尿素などの変性剤を用いて行うことができる。変性処理を施すことで、回収したタンパク質原料をフォールディングされていない状態にすることができる。
　このようにして、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を得ることができる。
　本発明に係る単一構造を有する糖鎖の製造方法は、特に制限されず、従来公知の方法を適宜使用することができる。例えば、国際公開第０３／００８４３１号、国際公開第２００４／０５８９８４号、国際公開第２００４／０５８８２４号、国際公開第２００４／０７００４６号、国際公開第２００７／０１１０５５号などに記載の方法を用いることができる。
　糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質に単一構造を有する糖鎖を付加する方法としては、例えば国際公開第２０１４/１５７１０７号などに記載の方法を用いることができる。
　以下、一例として、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を構成するシステインに化学合成により糖鎖を付加する方法について説明する。本方法については、国際公開第２００５／０１００５３号などに記載の方法を用いることができる。
　糖鎖がリンカーを介してシステインに結合している場合、糖鎖とリンカーとを結合した糖鎖誘導体（実施例における糖鎖修飾試薬）を糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質と反応させる。糖鎖誘導体は、例えば式１で表される化合物において、糖鎖末端のＧａｌＮａｃの１位の炭素に結合している基をリンカーで置換した化合物である。リンカーおよび糖鎖誘導体の製造方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。
　具体的には、糖鎖誘導体と糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質とをリン酸バッファー中、０℃～室温程度で反応させる。リン酸バッファーは、２量体の形成を防止するために、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）などを含んでもよい。ＴＣＥＰなどの最終濃度は、例えば１０μＭ～１０ｍＭである。
　反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより、糖鎖付加タンパク質を得ることができる。
　本発明のグルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質は、従来の糖鎖修飾グルコセレブロシダーゼタンパク質とは異なり、単一構造を有する糖鎖が付加されたものである。そのため、安定な薬効を発現することができる。また、中性付近のｐＨでの安定性を向上することができる（実施例参照）。そのため、ゴーシェ病などのリソソーム病の治療において好適に使用できる。
　したがって、本発明の一実施形態は、上記糖鎖付加タンパク質を含む、組成物に関し、好ましくは上記糖鎖付加タンパク質の１種のみを含む、組成物に関する。本発明の糖鎖付加タンパク質を用いることにより、組成物中の糖鎖付加タンパク質の種類および割合を制御することができる。例えば、組成物中の糖鎖付加タンパク質が１種のみであるとは、糖鎖が付加されるアミノ酸の位置、糖鎖が付加されるアミノ酸の数、および付加される糖鎖の数が同一である糖鎖付加タンパク質が組成物中に存在することを意味する。
　本発明に係る組成物は、品質を一定にすることができるため、特に医薬、アッセイなどの用途に好適である。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。特に、ＧＢＡタンパク質及び組換えＧＢＡタンパク質を生産する細菌株の構築及び培養・細胞の破砕に関する部分（１－１～２－２）は、一般に知られている他の手段を適宜用いることが可能である。
　実施例において、プラスミド番号と組換えタンパク質番号とは同一の番号を付す。
　［ＧＢＡ遺伝子およびその改変遺伝子導入組換え大腸菌の構築］
　１－１．グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子の合成
　配列番号１３５で示されるＧＢＡ遺伝子は、シグナルペプチドが除去された成熟型のＧＢＡタンパク質をコードするコドンの５’－末端に開始コドン（ａｔｇ）を付加し、また大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ－１２株）のコドン使用頻度に対して最適化された配列になるような変更を加えたものである。当該配列番号１３５で示されるＧＢＡ遺伝子の合成を、ユーロフィンジェノミクス株式会社に外部委託し、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＴＡＫＮ－２に挿入された状態で納入された。
　１－２．ＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドの調製
　大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現検討を行うため、上記で取得したＧＢＡ遺伝子をｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩサイトとＨｉｓタグとの間にサブクローニングした。具体的には、ｐＥＴ－２１ｂ（＋）またはＧＢＡ遺伝子が挿入されたｐＴＡＫＮ－２のいずれかをテンプレートとするＰＣＲをそれぞれ行い、線状化ｐＥＴ－２１ｂ（＋）およびＧＢＡ遺伝子（終止コドンを除く）の増幅産物をそれぞれ得た。
　上記で得られたＰＣＲ増幅産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて処理（制限酵素ＤｐｎＩによる切断及びライゲーション）し、ＧＢＡ遺伝子が挿入されたｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドベクター（本明細書において、「Ｈ４９５型」と呼ぶ）を得た。当該プラスミドベクターに挿入されたＧＢＡ遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードしている。
　１－３．改変ＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドの調製
　上記１－２．で調製したＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドをテンプレートとして、下記表１に記載の変異導入用プライマー（ＧＢＡ遺伝子がコードするアミノ酸を別のアミノ酸に置換させることが目的のもの）を用いてＰＣＲを行うことで、ＧＢＡ遺伝子（終止コドンを除く）に変異が導入されたプラスミド（線状化されたもの）を各種増幅した。当該各種の改変ＧＢＡ遺伝子におけるアミノ酸配列の置換箇所及び置換後のアミノ酸に対応するコドンは表２の通りである。得られたＰＣＲ増幅産物（線状化プラスミド）をマニュアルに従い、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡株式会社）およびＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（東洋紡株式会社）によりセルフライゲーションして環状化させることで、改変ＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドを得た（表５）。複数の変異を導入する際には、上記と同様の方法を繰り返すことで変異を追加していった。
　１－４．組換え大腸菌株の構築
　１－２および１－３で構築した各プラスミドの其々につき、マニュアルに従って大腸菌のコンピテントセル（ＥＣＯＳ　コンピテントＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（株式会社ニッポンジーン））に対して形質転換し、ＧＢＡ遺伝子または改変ＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドベクターを保持する各種組換え大腸菌株を構築した。
　［組換え大腸菌によるタンパク質の合成方法・比較評価方法・比較評価結果］
　２－１．組換え大腸菌によるＧＢＡタンパク質の合成
　上記１－４．で構築した組換え大腸菌を用いて、ＧＢＡタンパク質または組換えＧＢＡタンパク質を合成した。
　具体的には、まず、試験管内のＬＢ液体培地４ｍＬ（１００ｍｇ／Ｌの濃度でアンピシリンを含有）に、ＬＢ寒天培地（１００ｍｇ／Ｌの濃度でアンピシリンを含有）上に生育した単一のコロニーを植菌し、３００ｒｐｍ、３０℃にて一晩振とう培養して、前培養液を得た。
　前培養液２ｍＬを、坂口フラスコ内の本培養用培地（組成は下記の表３参照）５０ｍＬに植菌し、１２０ｒｐｍ、３０℃にて７２時間振とう培養して本培養を行った。
　本培養後の培養液を、６，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して、上清を廃棄後、バッファーＡ（組成は下記の表４参照）を用いて沈殿物を懸濁させた。その後、６，０００×ｇ、４℃にて再度１０分間遠心分離し、上清を廃棄後、組換え大腸菌の沈殿物を得た（其の後、－８０℃にて凍結保存した）。
　２－２．菌体の破砕処理
　上記２－１で得られた組換え大腸菌を、バッファーＡに懸濁し、濁度（ＯＤ６６０）を測定した後、ＯＤ６６０＝１０となるようにバッファーＡで希釈した。次いで、この懸濁液にジルコニアシリカビーズ（０．６ｍｍ）を添加し、氷上で冷却したアルミブロックを用いて冷却しながら、ビーズ式細胞破砕装置（株式会社バイオメディカルサイエンス製、シェイクマスターネオｖｅｒ１．０）により１３００ｒｐｍで５分間振盪し、その後さらにアルミブロックで５分間冷却した。この操作を計６回繰り返して菌体の細胞に対して破砕処理を施した。
　次いで、６，０００×ｇ、４℃にて１５分間遠心分離し、沈殿物（不溶性画分）を回収した。そして、回収された不溶性画分に対し、以下の（１）～（４）の溶液（２００μＬ）の其々につき順次、懸濁後に６０００×ｇにて２分間の遠心分離処理することを２回ずつ行って、不溶性タンパク質を得た：
　（１）バッファーＡ
　（２）０．０５ｗ／ｖ％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ・Ｎａ）添加バッファーＡ
　（３）１ｗ／ｖ％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００添加バッファーＡ
　（４）バッファーＡ（ｐＨ６）。
　２－３．変性（可溶化）処理
　続いて、上記遠心分離処理により得られた不溶性タンパク質を、６Ｍグアニジン塩酸塩、０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０および４０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）により懸濁した後、２５℃にて２時間静置してインキュベートを行った（変性（可溶化）処理）。
　次いで、６，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、上清を回収することにより不溶性成分を除去した。そして、分光光度計を用いて、溶液の吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、得られた値（Ａ２８０）から、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝Ａ２８０／１．７の数式に従ってタンパク質を定量した。なお、分母の１．７は、アミノ酸配列情報をもとに算出した吸光係数である。
　２－４．リフォールディング処理
　その後、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように６Ｍグアニジン塩酸塩および０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）を用いて調製後、４０ｗ／ｖ％グリセロール、０．２５ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０、３ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および６ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が添加された添加２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）にて５０倍に希釈した。
　希釈の時点から２５℃にて静置することによりインキュベートを開始し、インキュベートの開始から７日後にサンプルを回収して、以下の手法により酵素活性を測定した。
　２－５．酵素活性の測定
　グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）は、Ｇｌｃ－Ｃｅｒ（グルコセレブロシド；糖脂質）の糖と脂質との脱水縮合部位を加水分解する反応を触媒する酵素である。ここでは、合成基質であるｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）を基質として用いて、上記で得られた組換えＧＢＡタンパク質の酵素活性を測定した。
　具体的には、まず、１ｗ／ｖ％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００添加バッファーＡ　９０μＬおよびサンプル（７日後）　３０μＬおよび５０ｍＭ　ｐＮＰＧ添加バッファーＡ　３０μＬを混合し、サーモミキサーコンフォート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて７００ｒｐｍ、３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、０．２Ｎ　ＮａＯＨ溶液を１５０μＬ添加し、ボルテックスした後、数千ｒｐｍ程度、室温にて数秒間遠心分離した。
　上清２００μＬをマイクロプレートに移し、反応生成物（４－ニトロフェノール）に対応する吸光度（４００ｎｍ）を測定した。そして、予め作成しておいた４－ニトロフェノールの検量線に基づき、組換えＧＢＡタンパク質の容量活性（Ｕ／ｍＬ）を算出した。また、仕掛けたタンパク質濃度（２０ｍｇ／Ｌ）で容量活性の値を除することにより、組換えＧＢＡタンパク質の比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。なお、１Ｕは、ｐＮＰＧを１分間に１μｍｏｌ分解する活性の単位である。また、上記１－２．で調製したＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドを用いて上記と同様にして大腸菌に産生させた、配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＢＡタンパク質（本明細書において「Ｈ４９５型タンパク質」と呼ぶ）についても上記と同様にしてリフォールディング処理および酵素活性の測定を実施した。なお、Ｈ４９５型タンパク質の比活性は、１．２Ｕ／ｍｇであった。
　酵素活性測定の結果を下記の表５に示す。ここで、表５に示す値は、Ｈ４９５型タンパク質の比活性の値を１００％としたときの相対値（％）である。
　尚、本明細書における酵素活性の測定は、特記されない限り、上記の方法に準じて行われている。
　（考察）
　Ｈ４９５型タンパク質とＮｏ．１４２との比較、Ｎｏ．１４５とＮｏ．１５９との比較、およびＮｏ．１４７とＮｏ．１４９との比較から、Ｆ２６Ｌの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１４５とＮｏ．１６５との比較から、Ｆ２６Ｉの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１８とＮｏ．１４５との比較、Ｎｏ．２７とＮｏ．１２５との比較、Ｎｏ．１８４とＮｏ．１８５との比較、およびＮｏ．３７とＮｏ．１６７との比較から、Ｃ１２６Ｔの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．３とＮｏ．１８とＮｏ．２７との比較から、Ｃ３４２ＳおよびＣ１２６Ｓの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１６７とＮｏ．１６８とＮｏ．１８６－１９３との比較から、Ｑ５７Ｃ、Ｈ６０Ｃ、およびＴ６３Ｃの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１６７とＮｏ．１７１－１７６との比較から、Ｑ１４３ＣおよびＨ１４５Ｃの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１６７とＮｏ．１９４－１９８とＮｏ．２００とＮｏ．２０１とＮｏ．２１５との比較、およびＮｏ．１７８とＮｏ．２４３とＮｏ．２５２とＮｏ．２５４とＮｏ．２５７とＮｏ．２５９とＮｏ．２６３との比較から、Ｋ２２４ＣおよびＫ３２１Ｃの活性向上効果が見出された。
　Ｃ３４２は酵素活性に必要なアミノ酸残基であることが報告されていた（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 7, pp. 4242-4253, February 17, 2006）。しかし、セリンに置換した場合には活性が維持されることが見出された。
　［糖鎖修飾グルコセレブロシダーゼ改変体の合成］
　３－１．糖鎖修飾用糖鎖なし活性型グルコセレブロシダーゼ改変体の合成
　上記１－３と同様の方法で、下記表６記載の変異を含む組換えＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドを得た。その後、当該プラスミドを保持する組換え大腸菌株についても上記１－４と同様の方法で用意した。
　表６記載のプラスミドを保持する各組換え大腸菌株から、上記２－１～２－３と同様の方法によって、各組換えＧＢＡタンパク質を得た。
　下記表６の組換えＧＢＡタンパク質について、上記２－４．リフォールディング処理を行った後、７日間経過した溶液（サンプル）に１Ｍクエン酸溶液を添加し、ｐＨを４．５に調整した。次に、ろ過滅菌フィルター（Ｎａｌｇｅｎ製，０．２μｍ，ＰＥＳ）によりろ過した後、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　２，　Ｂｉｏｍａｘ，１０　ｋＤａ，０．１　ｍ２，Ｖ－スクリーン（Ｍｅｒｃｋ）にて、脱塩、濃縮（それぞれ約１０倍）した。得られた濃縮液をＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　ＨＰ，５　ｍＬ（ＧＥヘルスケア）にて、精製した。溶液としてＡ液：バッファーＢ（組成は下記表８参照）およびＢ液：１Ｍ　ＮａＣｌ添加バッファーＡを用い、Ｂ　２５％で溶出される活性フラクションを回収した。次に、ＨｉＴｒａｐ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＨＰ，５ｍＬ（ＧＥヘルスケア）にて、精製した。溶液としてＡ液：バッファーＣ（組成は下記表９参照）及びＢ液：エタノールを用い、Ｂ　４０％で溶出される活性フラクションを回収した。回収した溶液をＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３　ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）にて濃縮後、凍結乾燥した。
　３－２．糖鎖なし活性型グルコセレブロシダーゼ改変体の糖鎖修飾
　（糖鎖修飾試薬の合成）
　（１）Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳ－ＰＥＧ２－ＭＡＬの調製
　（１－１）Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳＨの調製
　Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＢｒ（５２．５ｍｇ，ＭＷ：１０３０．８，５０．９μｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４，２．０ｍＬ）に溶解し、チオ酢酸カリウム（７．０ｍｇ，ＭＷ：１１４．２，６１．１μｍｏｌ，１．２ｅｑ）加えて室温で１時間反応させた。反応開始から１時間後、システイン（８．９ｍｇ，ＭＷ：１２１．２，７３．３μｍｏｌ，１．２ｅｑ　ｏｆ　チオ酢酸カリウム）を加えた。ＨＰＬＣによって精製し、Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳＨ（３８ｍｇ，ＭＷ：９８３．９，３８．６μｍｏｌ，７６％）を得た。
　精製条件を以下に記載する。
＜Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳＨの精製条件＞
　検出波長：２５４ｎｍ
　カラム：ＤＡＩＳＯＰＡＫ　ＳＰ－３００－５－ＯＤＳ－ＢＩＯ（１０×２５０ｍｍ，Ｏｓａｋａ　Ｓｏｄａ）
　カラム温度：４０℃
　移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液
　移動相Ｂ：０．０９％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水混液（９：１）
　流速：３．５ｍＬ／ｍｉｎ
　測定時間：３０ｍｉｎ。
　（１－２）Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳ－ＰＥＧ２－ＭＡＬの調製
　（１－１）で調製したＤｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳＨ（３８ｍｇ，ＭＷ：９８３．９，３８．６μｍｏｌ，７６％）をあらかじめ冷却した０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．４，７５０μＬ）に溶解し、ＤＭＦ（１８８μＬ）に溶解させたＢＭ（ＰＥＧ）２（２３．８ｍｇ，ＭＷ：３０８．３，７７．２μｍｏｌ，２ｅｑ）を加えて０℃下で３０分間反応させた。反応後ＨＰＬＣによって精製し、Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳ－ＰＥＧ２－ＭＡＬ（２３．０ｍｇ，ＭＷ：１２９２．２，１７．８μｍｏｌ，４６％）を得た。
　精製条件を以下に記載する。
＜Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳ－ＰＥＧ２－ＭＡＬの精製条件＞
　検出波長：２５４ｎｍ
　カラム：ＤＡＩＳＯＰＡＫ　ＳＰ－３００－５－ＯＤＳ－ＢＩＯ（１０×２５０ｍｍ，Ｏｓａｋａ　Ｓｏｄａ）
　カラム温度：４０℃
　移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液
　移動相Ｂ：０．０９％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水混液（９：１）
　流速：３．５ｍＬ／ｍｉｎ
　測定時間：３０ｍｉｎ。
　（２）Ｄｉ－Ｍａｎ－Ａｓｎ－ＭＡＬの調製
　ＤｉＭａｎ－Ａｓｎ　１（１１９．８ｍｇ，ＭＷ：１０２４．９，１１７μｍｏｌ）をＤＭＦに懸濁し、Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　３－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（７８．０ｍｇ，ＭＷ：２６６．２，２９３μｍｏｌ，２．５ｅｑ，Ｗａｋｏ，商品コード：ＱＡ－２３２８）およびＤｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＰＥＡ，１０２μＬ，５８５μｍｏｌ，５．０ｅｑ，ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ，商品コード：１４０１４－８４）を加えて室温で２４時間反応させた。反応開始から２４時間後、反応混合物を酢酸エチル中に滴下し沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで２回洗浄し、乾燥させた。ＨＰＬＣによって精製し、Ｄｉ－Ｍａｎ－Ａｓｎ－ＭＡＬ　２（９２．０ｍｇ，ＭＷ：１１７６．０５，７８．２μｍｏｌ，６７％）を得た。
　精製条件を以下に記載する。
＜Ｄｉ－Ｍａｎ－Ａｓｎ－ＭＡＬの精製条件＞
　検出波長：２８０ｎｍ
　カラム：ＤＡＩＳＯＰＡＫ　ＳＰ－３００－５－ＯＤＳ－ＢＩＯ（１０×２５０ｍｍ，Ｏｓａｋａ　Ｓｏｄａ）
　カラム温度：４０℃
　移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液
　移動相Ｂ：０．０９％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水混液（９：１）
　流速：３．５ｍＬ／ｍｉｎ
　測定時間：３０ｍｉｎ。
　（３）（Ｄｉ－Ｍａｎ－Ｃ）３－ＭＡＬの調製
　（３－１）ＳＰＰＳ工程、切出し工程
　２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｒｅｓｉｎ（５７０μｍｏｌ，１．７ｍｍｏｌ／ｇ（メーカー規格値（０．４～３．０ｍｍｏｌ／ｇ）の平均値）に対し、ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２３４ｍｇ，０．７ｅｑ．，４００μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．７ｅｑ．，４００μｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応した。１時間後、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝８５：１０：５で洗浄することにより未反応の樹脂上の活性塩素の不活化を行い、その後、ＤＣＭとＤＭＦで洗浄し、樹脂への１残基目のアミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）の担持を完了した。
　１残基目を樹脂に担持後、２０％ピペリジン／ＤＭＦを加え、室温で１５分間振とう機で攪拌した後、ＤＣＭとＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ基の脱保護を完了した。洗浄後、予めＤＭＦ（８ｍＬ）中でＨＯＢｔ（５．０ｅｑ．，２．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（５．０ｅｑ．，２．０ｍｍｏｌ）によって２０分間、予備活性化されたＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（５．０ｅｑ．，２．０ｍｍｏｌ）溶液を加え、室温で１時間振とう機で攪拌した。その後、ＤＣＭとＤＭＦで洗浄し、２残基目のアミノ酸（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ）の縮合を完了した。同様の手順を再度繰り返すことによって、２－Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｒｙｌ樹脂上に３残基のＣｙｓ（Ｔｒｔ）の担持を行った。
　３残基のＣｙｓ担持後、上記手順によって、Ｆｍｏｃ基を脱保護して、洗浄した。
　樹脂はＤＣＭで十分に洗浄し、乾燥した。乾燥した樹脂の一部（１５０μｍｏｌ）に対して、ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ：Ｈ２Ｏ＝９２．５：２．５：２．５：２．５（４ｍＬ）を加えて室温で２．５時間撹拌した後、氷冷したＤＣＭに加え、エバポレーターによって濃縮した。濃縮後、再びＤＣＭを加えてエバポレーターによって濃縮することによって共沸した。共沸は２回繰り返した。共沸後、乾固させたペプチド残渣をＭｉｌｌＱに懸濁した。懸濁させたペプチド成分をＤＣＭで洗浄し、水層を回収した。回収した水層を凍結乾燥することにより、ペプチド残渣３（４９．２ｍｇ，ＭＷ：３２７．４，１５０μｍｏｌ，１００％）を得た。
　（３－２）糖鎖修飾工程
　ペプチド残渣３（２９．５ｍｇ，ＭＷ：３２７．４，９０μｍｏｌ）を８Ｍ　Ｇｎ・ＨＣｌ、２００ｍＭリン酸緩衝液、５ｍＭ　ＴＣＥＰ（ｐＨ＝７．５，１．５ｍＬ）に溶解した。溶解したペプチド溶液に、Ｄｉ－Ｍａｎ－ＡｃＢｒ（２７８．４ｍｇ，Ｍｗ：１０３０．８，２７０μｍｏｌ，３ｅｑ）を加え、８Ｍ水酸化ナトリウム水溶液によってｐＨ＝７に調整した後、室温で１時間振とうした。１時間振とうした後、ＨＰＬＣによって精製し、３残基のＣｙｓに対しＤｉ－Ｍａｎが３つ修飾された糖鎖修飾ペプチド（Ｄｉ－Ｍａｎ－Ｃ）３　４（１４１．９ｍｇ，ＭＷ：３１７７．０，４４．７μｍｏｌ，５０％）を得た。
　精製条件を以下に記載する。
＜（Ｄｉ－Ｍａｎ－Ｃ）３の精製条件＞
　検出波長：２２０ｎｍ
　カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ　ＵＧ１２０（２０×２５０ｍｍ，Ｏｓａｋａ　Ｓｏｄａ）
　カラム温度：４０℃
　移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液
　移動相Ｂ：０．０９％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水混液（９：１）
　流速：７．０ｍＬ／ｍｉｎ
　測定時間：４５ｍｉｎ。
　（３－３）（Ｄｉ－Ｍａｎ－Ｃ）３－ＭＡＬの調製
　糖鎖修飾ペプチド（Ｄｉ－Ｍａｎ－Ｃ）３　４（１４０．０ｍｇ，ＭＷ：３１７７．０，４４．１μｍｏｌ）をＤＭＦに懸濁し、Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　３－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（２９．３ｍｇ，ＭＷ：２６６．２，１１０μｍｏｌ，２．５ｅｑ）およびＤＩＰＥＡ（３８．５μＬ，２２１μｍｏｌ，５．０ｅｑ）を加えて室温で２．５時間反応させた。反応開始から２．５時間後、反応混合物を酢酸エチル中に滴下し沈殿させた。沈殿物を酢酸エチルで２回洗浄し、乾燥させた。乾燥した沈殿物をＭｉｌｌｉ－Ｑに溶解してＨＰＬＣによって精製し、糖鎖修飾ペプチド（Ｄｉ－Ｍａｎ－Ｃ）３－ＭＡＬ　５（１００．３ｍｇ，ＭＷ：３３２８．１，３０．１μｍｏｌ，６８％）を得た。
　精製条件を以下に記載する。
＜（Ｄｉ－Ｍａｎ－Ｃ）３－ＭＡＬの精製条件＞
　検出波長：２２０ｎｍ
　カラム：ＤＡＩＳＯＰＡＫ　ＳＰ－３００－５－ＯＤＳ－ＢＩＯ（１０×２５０ｍｍ，Ｏｓａｋａ　Ｓｏｄａ）
　カラム温度：４０℃
　移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液
　移動相Ｂ：０．０９％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水混液（９：１）
　流速：３．５ｍＬ／ｍｉｎ
　測定時間：３０ｍｉｎ。
　（糖鎖修飾方法）
　糖鎖なし活性型グルコセレブロシダーゼ改変体の凍結乾燥品を１２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）で溶解して、６０ｍＭ　ＴＣＥＰ添加１２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）を添加した。４℃にて２時間インキュベートした。糖鎖修飾試薬を添加して、４℃にて約２４時間インキュベートした。
　ＬＣ－ＭＳによって精製して、糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体を得た。酵素活性測定を実施し、修飾反応の進行および酵素活性への影響を評価した。
　結果を下記の表６に示す。糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体について、糖鎖修飾試薬としてＤｉ－Ｍａｎ－Ａｓｎ－ＭＡＬまたはＤｉ－Ｍａｎ－ＡｃＳ－ＰＥＧ２－ＭＡＬを使用した場合、組換えタンパク質番号の末尾に「－Ｇ１」を付加し、糖鎖修飾試薬として（Ｄｉ－Ｍａｎ－Ｃ）３－ＭＡＬを使用した場合、組換えタンパク質番号の末尾に「－Ｇ３」を付加する。
　Ｈ４９５型のフリーのＣｙｓ残基（Ｃ１２６、Ｃ２４８およびＣ３４２）は修飾されないことを確認した。
　Ｓ１４８ＣおよびＣ－ｅｎｄ＿Ｃ（Ｃ末端にＣｙｓを付加したもの）は、修飾漏れが確認された。
　Ｓ２４２Ｃは、修飾による酵素活性の低下が確認された。
　修飾位置として、Ｔ６１Ｃ、Ｐ９８Ｃ、Ｑ１４３Ｃ、Ｋ２２４Ｃ、Ｋ３２１ＣおよびＴ４０７Ｃが適切であることが確認された。
　なお、Ｎｏ．２３４において、４箇所（修飾対象残基＋Ｃ２４８）が修飾された微量成分が検出された。
　［安定性評価］
　・糖鎖が付加されていない、グルコセレブロシダーゼ改変体の合成
　上記１－３と同様の方法で、Ｃ２４８ＳまたはＣ２４８ＳおよびＣ３４２Ｓの変異を含む組換えＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドを追加で得た（Ｎｏ．１９および４２）。その後、当該プラスミドを保持する組換え大腸菌株についても上記１－４と同様の方法で追加で用意した。
　表７記載のプラスミドを保持する各組換え大腸菌株から、上記２－１～２－３と同様の方法によって、Ｈ４９５型タンパク質及び各組換えＧＢＡタンパク質を得た。
　４－１．リフォールディング溶液中の安定性評価
　上記で得られたＨ４９５型タンパク質および下記表７の７種の組換えＧＢＡタンパク質について、上記２－４．リフォールディング処理を行った後、７日間経過した溶液（サンプル）を３７℃に移し、残存活性の推移を測定した。結果を表７に示す。
　表７に示すように、Ｈ４９５型タンパク質と比べて、Ｃｙｓ残基を置換することで安定性が向上し、さらに複数のＣｙｓ残基を置換することで、より安定性が向上することを確認した。
　４－２．バッファー中での安定性評価１
　下記表１０の組換えＧＢＡタンパク質について、上記２－４．リフォールディング処理を行った後、７日間経過した溶液（サンプル）に１Ｍクエン酸溶液を添加し、ｐＨを４．５に調整した。次に、ろ過滅菌フィルター（Ｎａｌｇｅｎ製，０．２μｍ，ＰＥＳ）によりろ過した後、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　２，　Ｂｉｏｍａｘ，１０　ｋＤａ，０．１　ｍ２，Ｖ－スクリーン（Ｍｅｒｃｋ）にて、脱塩、濃縮（それぞれ約１０倍）した。得られた濃縮液をＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　ＨＰ，５　ｍＬ（ＧＥヘルスケア）にて、精製した。溶液としてＡ液：バッファーＢ（組成は下記表８参照）およびＢ液：１Ｍ　ＮａＣｌ添加バッファーＡを用い、Ｂ　２５％で溶出される活性フラクションを回収した。次に、ＨｉＴｒａｐ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＨＰ，５ｍＬ（ＧＥヘルスケア）にて、精製した。溶液としてＡ液：バッファーＣ（組成は下記表９参照）及びＢ液：エタノールを用い、Ｂ　４０％で溶出される活性フラクションを回収した。回収した溶液をＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３　ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）にて濃縮後、凍結乾燥した。
　Ｃeｒｅｚｙｍｅ（登録商標）および精製済みの組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１７６）を０．０１５ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０添加２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）により、０．０５ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、３７℃でインキュベートして、残存活性の推移を測定した。結果を表１０に示す。
　表１０に示すように、組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１７６）は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅに対して、安定性が向上していることを確認した。
　４－３．バッファー中での安定性評価２
　上記バッファー中での安定性評価１と同様の方法で、組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１６７およびＮｏ．１７８）を精製した。
　Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）および精製済みの組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１６７およびＮｏ．１７８）を０．1ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０添加５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）により、０．０１ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、３７℃でインキュベートして、残存活性の推移を測定した。結果を表１１に示す。
　表１１に示すように、組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１６７およびＮｏ．１７８）は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅに対して、安定性が向上していることを確認した。
　４－４．バッファー中での安定性評価３
　Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）および糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体（Ｎｏ．１７８－Ｇ１）を０．０１５ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０添加２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）により、０．０４ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、３７℃でインキュベートして、活性の推移を測定した。結果を表１２に示す。
　表１２に示すように、糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体（Ｎｏ．１７８－Ｇ１）は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅに対して、安定性が向上していることを確認した。
　４－５．バッファー中での安定性評価４
　Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）および糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体（Ｎｏ．１７８－Ｇ３）を０．１ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０添加５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）により、０．０１ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、３７℃でインキュベートして、活性の推移を測定した。結果を表１３に示す。
　表１３に示すように、糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体（Ｎｏ．１７８－Ｇ３）は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅに対して、安定性が向上していることを確認した。
　５．細胞取込試験
　（試験例１）
　ＮＲ８３８３細胞（ＡＴＣＣより購入）をＨａｍ’ｓ　Ｆ１２Ｋ　ｍｅｄｉｕｍ（２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、１０％熱不活化ウシ胎児血清を含む）にて培養した。
　１．５ｍＬチューブに、以下の組成となるようにＨａｍ’ｓ　Ｆ１２Ｋ　ｍｅｄｉｕｍを用いて試験液を調製した。サンプルとして、糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体（Ｎｏ．１７８－Ｇ１またはＮｏ．１７８－Ｇ３）を使用した。
　試験液を３７℃で３時間インキュベートした後、氷上で冷却した。遠心分離（５００×ｇ、５分、４℃）後、上清を除き、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２Ｋ　ｍｅｄｉｕｍを０．５ｍＬ添加して懸濁した。遠心分離（５００×ｇ、１０分、４℃）後、上清を除き、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２Ｋ　ｍｅｄｉｕｍを０．５ｍＬ添加して懸濁した。遠心分離（２００×ｇ、１０分、４℃）を２回行った。上清を除き、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００添加バッファー　Ａを添加して、細胞を溶解した。酵素活性およびタンパク質濃度（６６０ｎｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を測定し、比活性を算出した。結果を表１４に示す。
　表１４に示すように、糖鎖をクラスター化することで細胞取込量が向上することを確認した。
　（試験例２）
　サンプルとして組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１７８）または糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体（Ｎｏ．１７８－Ｇ３）を使用し、試験液を以下の組成となるように調製したこと以外は、試験例１と同様にして、比活性を算出した。結果を表１５に示す。
　表１５に示すように、糖鎖修飾することで取込量が顕著に向上することを確認した。
　（試験例３）
　サンプルとして糖鎖修飾活性型グルコセレブロシダーゼ改変体（Ｎｏ．１７８－Ｇ３またはＮｏ．２３４－Ｇ３）を使用し、試験液を以下の組成となるように調製し、インキュベートを３７℃で１．５時間行ったこと以外は、試験例１と同様にして、比活性を算出した。結果を表１６に示す。
　表１６に示すように、糖鎖修飾箇所を追加することおよびＣ２４８を置換しないことで、取込量が向上することを確認した。
　本出願は、２０２２年１月３１日に出願された日本特許出願番号２０２２－０１３０４８号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。

Claims (9)

  1. 　糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質に、単一構造を有する糖鎖を付加したものである、グルコセレブロシダーゼ活性を有する糖鎖付加タンパク質。
  2. 　前記糖鎖が、リンカーを介して付加されている、請求項１に記載の糖鎖付加タンパク質。
  3. 　前記リンカーが、マレイミド構造を含む、請求項２に記載の糖鎖付加タンパク質。
  4. 　前記単一構造を有する糖鎖が、１つ以上付加されており、
    　前記単一構造を有する糖鎖が、以下の式１：

     
    で表される化合物由来の構造を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の糖鎖付加タンパク質。
  5. 　前記糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換：
    　（１）配列番号１または２の６１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ６１Ｃ）；
    　（２）配列番号１または２の９８位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｐ９８Ｃ）；
    　（３）配列番号１または２の１４３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ１４３Ｃ）；
    　（４）配列番号１または２の２２４位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ２２４Ｃ）；
    　（５）配列番号１または２の３２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ３２１Ｃ）；および
    　（６）配列番号１または２の４０７位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ４０７Ｃ）
    の少なくとも１つ有するタンパク質である、請求項１～４のいずれか１項に記載の糖鎖付加タンパク質。
  6. 　前記糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を構成するシステイン残基に、前記単一構造を有する糖鎖が付加されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の糖鎖付加タンパク質。
  7. 　前記糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換：
    　（７）配列番号１または２の２６位に相当する位置のアミノ酸をロイシンに置換（Ｆ２６Ｌ）；
    　（８）配列番号１または２の２６位に相当する位置のアミノ酸をイソロイシンに置換（Ｆ２６Ｉ）；
    　（９）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）；
    　（１０）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ１２６Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
    　（１１）配列番号１または２の５７位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ５７Ｃ）；
    　（１２）配列番号１または２の６０位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｈ６０Ｃ）；
    　（１３）配列番号１または２の６３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ６３Ｃ）；
    　（１４）配列番号１または２の１４３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ１４３Ｃ）；
    　（１５）配列番号１または２の１４５位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｈ１４５Ｃ）；
    　（１６）配列番号１または２の２２４位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ２２４Ｃ）；ならびに
    　（１７）配列番号１または２の３２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ３２１Ｃ）
    の少なくとも１つ有するタンパク質である、請求項１～６のいずれか１項に記載の糖鎖付加タンパク質。
  8. 　前記糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１または２に記載のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換：
    　（１８）配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
    　（１９）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
    　（２０）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ１２６Ｓ）、配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；ならびに
    　（２１）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）、配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）
    の少なくとも１つ有するタンパク質である、請求項１～６のいずれか１項に記載の糖鎖付加タンパク質。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の糖鎖付加タンパク質の１種のみを含む、組成物。
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