WO2023145813A1 - グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質およびその製造方法 - Google Patents

グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質およびその製造方法 Download PDF

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WO2023145813A1
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amino acid
seq
protein
position corresponding
substitution
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大祐 立岩
勇樹 牧野
Original Assignee
株式会社日本触媒
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a protein having glucocerebrosidase activity and a method for producing the same.
  • Lysosomal disease is a hereditary disease caused by decreased activity or deficiency of lysosomal enzymes and their related factors, resulting in the accumulation of substances that act as substrates for these enzymes in the body.
  • glucocerebrosidase ⁇ -glucosidase
  • GBA glucocerebrosidase
  • GBA ⁇ -glucosidase
  • Symptoms and findings such as anemia, thrombocytopenia, bone changes, and increased blood acid phosphatase and angiotensin-converting enzyme levels associated with hyperfunction are observed (Non-Patent Document 1).
  • enzyme replacement therapy is often used as a treatment method for such lysosomal diseases.
  • a recombinant cDNA encoding human glucocerebrosidase expressed in a Chinese hamster ovary (CHO) cell line was glycoengineered to facilitate uptake into target cell macrophages.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • glucocerebrosidase GAA
  • a technique for producing recombinant glucocerebrosidase (GBA) using cells derived from prokaryotes such as E. coli as hosts is also known.
  • GAA glucocerebrosidase
  • Such a technique does not pose the problems of infection risk, productivity, and production cost that occur when eukaryotes are used as hosts as described above.
  • prokaryotes do not carry out glycosylation, which is a post-translational modification of proteins, the problem of antigenicity derived from added sugar chains does not occur.
  • Non-Patent Document 2 describes that binding of a sugar chain to at least one glycosylation site (sugar chain-binding site) is necessary for the formation of an active GBA protein.
  • Patent Document 1 describes that the recombinant GBA protein expressed in E. coli does not have enzymatic activity.
  • the object of the present invention is to provide a protein that has glucocerebrosidase activity even if sugar chains are not added by post-translational modification.
  • X to Y includes X and Y and means "X or more and Y or less”. Unless otherwise specified, measurements of operations and physical properties are performed under the conditions of room temperature (20 to 25° C.)/relative humidity of 40 to 50% RH.
  • glucocerebrosidase activity means activity to hydrolyze glucocerebroside.
  • the presence or absence of glucocerebrosidase activity is determined based on the presence or absence of enzymatic reactivity with respect to the synthetic substrate (p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside) described in the Examples section below.
  • the specific activity of the protein after refolding treatment according to the present invention is, for example, 0.5 U/mg or more, preferably 0.6 U/mg or more, and more preferably 1.2 U/mg or more.
  • the mature protein of glucocerebrosidase is a polypeptide consisting of 497 amino acid residues produced by cleaving the propeptide from the precursor protein consisting of 536 amino acid residues.
  • Glucocerebrosidase biopharmaceuticals marketed for Gaucher disease include Cerezyme® (produced by Chinese Hamster Ovary (CHO) cells), VPRIV® (human fiber sarcoma cells (HT1080)), Elelyso® (produced by plant (carrot) cells).
  • One embodiment of the present invention is the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (corresponding to the amino acid sequence of selezyme; the amino acid at the position corresponding to position 495 is histidine (H), unlike the human wild-type GBA protein). It is a protein that contains no sugar chain and has glucocerebrosidase activity.
  • the amino acid sequence is shown below, and the base sequence (including the termination codon) of the gene (cDNA) encoding the amino acid sequence is SEQ ID NO: 134 shown in In this specification, the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is also simply referred to as "GBA gene".
  • amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 instead of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 below (corresponding to the amino acid sequence of biprib; the amino acid at the position corresponding to position 495 is human wild type
  • proteins containing arginine (R) unlike the GBA protein.
  • One embodiment of the present invention further includes, in place of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2, having 90% or more identity with them (more preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) (herein, "homology (synonymous with ").
  • the identity of SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is more preferably 95% or more, and still more preferably 99% or more.
  • a protein having glucocerebrosidase activity is provided even if sugar chains are not added by post-translational modification.
  • amino acid sequences can be determined using analysis programs such as BLAST, FASTA, and CLUSTAL W. When using BLAST, use the program's default parameters.
  • the "identity" of the amino acid sequences refers to aligning the two amino acid sequences so that the amino acid residues of the two amino acid sequences to be compared are matched as much as possible, and then determining the number of matched amino acid residues. is divided by the total number of amino acid residues and expressed as a percentage. In the above alignment, if necessary, gaps are inserted into one or both of the two sequences to be compared, and one inserted gap is counted as one amino acid residue to obtain the total number of amino acid residues. If the total number of amino acid residues determined in this way differs between the two sequences being compared, then the percent sequence identity is the total number of amino acid residues in the longer sequence and the number of matching amino acid residues. Calculated by dividing numbers.
  • a preferred embodiment of the present invention is a protein comprising an amino acid sequence having at least one of the following amino acid substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, from the viewpoint that glucocerebrosidase activity can be further improved: (1) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 26 with leucine (F26L); (2) substitution of isoleucine for the amino acid at the position corresponding to position 26 (F26I); (3) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 126 with threonine (C126T); (4) substituting serine for the amino acid at the position corresponding to position 126 (C126S) and substituting serine for the amino acid at the position corresponding to position 342 of SEQ ID NO: 1 or 2 (C342S); (5) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 57 with cysteine (Q57C); (6) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 60 with cysteine (H60C); (7) substitution of the amino acid at the position corresponding
  • the protein of the present invention is more preferably a protein comprising an amino acid sequence having at least one of the following amino acid substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2: (a-1) (1) F26L (a-2) (3) C126T (a-3) (2) F26I and (3) C126T (a-4) (1) F26L and (3) C126T (a-5) (4) C126S and C342S (a-6) (3) C126T and (5) Q57C (a-7) (3) C126T and (6) H60C (a-8) (3) C126T and (7) T63C (a-9) (3) C126T and (8) Q143C (a-10) (3) C126T and (9) H145C (a-11) (3) C126T and (10) K224C (a-12) (3) C126T and (11) K321C.
  • amino acids at the following positions are not substituted: In (a-2), the amino acid at the position corresponding to position 142 in (a-2), the amino acid at the position corresponding to position 144 in (a-2), the amino acid at the position corresponding to position 147 (a-2) In the amino acid (a-2) at the position corresponding to position 171, at the amino acid (a-2) at the position corresponding to position 347, at the amino acid (a-4) at the position corresponding to position 407, at position 248 In the amino acid at the corresponding position (a-9), the amino acid at the position corresponding to position 77 in (a-9), the amino acid at the position corresponding to position 290 in (a-9), the amino acid at the position corresponding to position 293 The amino acid at the position corresponding to position 333 in (a-9) The amino acid at the position corresponding to position 466 in (a-9).
  • amino acid sequences having at least one of the above amino acid substitutions include the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3-5, 7, 9-30, 32, 33, 35, 37-39, 41-51.
  • the protein according to the present invention has the amino acids set forth in including at least one selected from a sequence
  • a preferred embodiment of the present invention is a protein having at least one of the following amino acid substitutions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, from the viewpoint that the stability can be further improved: (12) Substitution of the amino acid at the position corresponding to position 248 with serine (C248S) and substitution of the amino acid at the position corresponding to position 342 with serine (C342S); (13) Substitution of the amino acid at the position corresponding to position 126 with threonine (C126T) and substitution of the amino acid at the position corresponding to position 342 with serine (C342S); (14) Substitution of the amino acid at the position corresponding to position 126 with serine (C126S), substitution of the amino acid at the position corresponding to position 248 with serine (C248S) and substitution of the amino acid at the position corresponding to position 342 with serine (C342S) and (15) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 126 with threonine (C126T), the amino acid at the
  • the protein of the present invention comprises at least one selected from the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 14, 17, 18 and 51.
  • a preferred embodiment of the present invention is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 having any one of the substitutions (1) to (15) above, at least the following amino acid substitutions:
  • a protein that further has one: (16) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 61 with cysteine (T61C); (17) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 98 with cysteine (P98C); (18) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 143 with cysteine (Q143C); (19) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 224 with cysteine (K224C); (20) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 321 with cysteine (K321C); and (21) substitution of the amino acid at the position corresponding to position 407 with cysteine (T407C).
  • the protein of the present invention comprises at least one selected from the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 16, 24, 28, 30, 37, 39, 41, 43-49.
  • the protein according to the present invention may consist of the amino acid sequences described above.
  • the method for producing a peptide chain as a protein raw material according to the present invention is not particularly limited as long as a sugar chain is not added to the peptide chain.
  • the protein according to the present invention can preferably be derived from peptide chains produced by prokaryotes.
  • the protein of the present invention is produced by a prokaryote.
  • prokaryotes examples include E. coli such as Escherichia coli, Bacillus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas such as Pseudomonas putida, and Rhizobium such as Rhizobium meliloti. Bacteria belonging to.
  • the prokaryote used in the present invention is preferably E. coli.
  • a method for producing a protein according to the present invention comprises introducing a vector containing a nucleic acid encoding a protein according to the present invention into a prokaryote to produce a protein raw material in the prokaryote, and subjecting the protein material to a folding treatment.
  • a vector containing a nucleic acid encoding the protein of the present invention is introduced into a prokaryote to produce a raw protein material. This makes it possible to obtain a raw protein material to which sugar chains have not been added.
  • the method for producing the nucleic acid encoding the protein of the present invention and the vector containing it is not particularly limited, and conventionally known methods can be used.
  • vectors known vectors such as T vectors such as pTAKN-2 and plasmid vectors such as pET-21b(+) can be used.
  • the method for introducing the vector into prokaryotes is not particularly limited, and conventionally known methods can be used as appropriate.
  • Methods of introduction include a competent cell method, a conjugative transfer method, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method and the like.
  • the prokaryotic organism By culturing the prokaryotic organism into which the vector has been introduced, the prokaryotic organism can be made to produce a protein raw material. Cultivation of prokaryotes can be performed according to conventional methods used for the selected prokaryote.
  • Prokaryotes are cultured under aerobic or anaerobic conditions, depending on the type of prokaryotes used.
  • the prokaryotic culture may be subjected to shaking, aeration, or the like.
  • the culture conditions (culture temperature, culture time, medium pH, etc.) are appropriately selected depending on the composition of the medium and the culture method, and are not particularly limited as long as the conditions allow prokaryotes to proliferate. can be selected as appropriate.
  • the protein according to the present invention does not have a sugar chain added by post-translational modification, it is desirable that it is not post-translationally modified.
  • prokaryotes are collected from the resulting culture by methods such as centrifugation and filtration, and the collected prokaryotes are subjected to mechanical methods such as beads or enzymatic methods. crush. After crushing, the insoluble fraction is collected and treated with a buffer containing a surfactant to recover the protein raw material.
  • the collected protein raw material is subjected to folding treatment (refolding treatment including prior denaturation treatment is also acceptable).
  • a buffer containing an oxidizing agent and a reducing agent oxidized glutathione/reduced glutathione, cystine/cysteine, cysteamine/cystamine, etc.
  • oxidized glutathione/reduced glutathione, cystine/cysteine, cysteamine/cystamine, etc. is added to a liquid containing the recovered protein raw material, and the mixture is heated at about 20°C to about 20°C. It can be carried out by standing at about 30° C. for about 1 to 7 days. Further additives such as sucrose and glycerol can be added to the buffer.
  • the recovered protein raw material may be subjected to denaturation (solubilization) treatment before folding treatment, if necessary.
  • the denaturation treatment can be performed using a denaturant such as 6M guanidine hydrochloride and 8M urea. By applying the denaturation treatment, the recovered protein raw material can be brought into an unfolded state.
  • the method for producing a protein according to the present invention includes subjecting a protein raw material, which contains an unfolded amino acid sequence constituting the protein according to the present invention and to which a sugar chain has not been added, to a folding treatment.
  • a method for producing a protein having glucocerebrosidase activity comprising:
  • the protein of the present invention is produced by refolding a protein produced by a prokaryote. Proteins produced by prokaryotes may be subjected to denaturation (solubilization) treatment as necessary.
  • the protein according to the present invention is expected to reduce the risk of viral infection and reduce antigenicity to mammals.
  • the protein according to the present invention is suitable for the following uses.
  • An active recombinant GBA protein can be provided even when a recombinant GBA protein produced by a prokaryote is used as a raw material. Therefore, the protein according to the present invention can be suitably used in the treatment of lysosomal diseases such as Gaucher's disease.
  • the protein according to the present invention can be used to degrade plant-derived glucosylceramide to produce ceramide.
  • the protein according to the present invention can be used to obtain GBA antibodies.
  • the plasmid number and recombinant protein number are assigned the same number.
  • GBA Glucocerebrosidase
  • SEQ ID NO: 135 adds an initiation codon (atg) to the 5′-end of the codon encoding the mature GBA protein from which the signal peptide has been removed, and Modifications were made so that the sequence was optimized for the codon usage of E. coli (strain K-12).
  • the synthesis of the GBA gene represented by SEQ ID NO: 135 was outsourced to Eurofins Genomics, Inc., and delivered in a state of being inserted into pTAKN-2 containing the ampicillin resistance gene.
  • GBA gene-inserted plasmid In order to examine expression in E. coli, the GBA gene obtained above was inserted between the NdeI site and the His tag of the pET-21b(+) plasmid vector (Novagen). subcloned into. Specifically, PCR was performed using either pET-21b (+) or pTAKN-2 into which the GBA gene was inserted as a template, and linearized pET-21b (+) and the GBA gene (excluding the stop codon) were ) were obtained respectively.
  • the PCR amplification product obtained above was treated using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.) (cleavage and ligation with restriction enzyme DpnI), and the pET-21b(+) plasmid into which the GBA gene was inserted A vector (referred to herein as "H495 type") was obtained.
  • the GBA gene inserted into the plasmid vector encodes the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1.
  • the resulting PCR amplified product (linearized plasmid) was fused with T4 Polynucleotide Kinase (Toyobo Co., Ltd.) and Ligation high Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.) by self-ligation to obtain a plasmid into which the modified GBA gene was inserted (Table 5).
  • T4 Polynucleotide Kinase Toyobo Co., Ltd.
  • Ligation high Ver. 2 Toyobo Co., Ltd.
  • E. coli competent cells ECOS competent E. coli BL21 (DE3) (Nippon Gene Co., Ltd.)
  • Various recombinant E. coli strains were constructed that were transformed and carried plasmid vectors into which the GBA gene or modified GBA gene had been inserted.
  • a single colony grown on LB agar medium (containing ampicillin at a concentration of 100 mg/L) was added to 4 mL of LB liquid medium (containing ampicillin at a concentration of 100 mg/L) in a test tube.
  • the cells were inoculated and cultured with shaking at 300 rpm and 30° C. overnight to obtain a preculture solution.
  • the culture medium is centrifuged at 6,000 x g for 10 minutes at 4°C, the supernatant is discarded, and the precipitate is suspended using buffer A (see Table 4 below for composition). let me After that, the mixture was centrifuged again at 6,000 ⁇ g and 4° C. for 10 minutes, and after discarding the supernatant, a precipitate of recombinant E. coli was obtained (then it was frozen and stored at ⁇ 80° C.).
  • the denominator of 1.7 is the extinction coefficient calculated based on the amino acid sequence information.
  • Incubation was started by standing at 25°C from the time of dilution, samples were collected 7 days after the start of incubation, and enzyme activity was measured by the following method.
  • GBA Glucocerebrosidase
  • Glc-Cer glucocerebroside; glycolipid
  • pNPG synthetic substrate p-nitrophenyl- ⁇ -D-glucopyranoside
  • the GBA protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (herein referred to as "H495 type protein") produced in E.
  • C342 is an amino acid residue necessary for enzymatic activity (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 7, pp. 4242-4253, February 17, 2006). However, it was found that the activity was maintained when the serine was substituted.
  • Liquid A Buffer C (see Table 8 below for the composition) and Liquid B: ethanol were used as solutions, and the active fraction eluted at 40% B was collected.
  • the recovered solution was concentrated with Amicon Ultra-15, 3 kDa (Merck) and then lyophilized.
  • Cerezyme registered trademark
  • purified recombinant GBA proteins No. 167 and No. 178
  • Table 10 shows the results.
  • a denatured protein solution of H495 protein was prepared from the obtained insoluble H495 protein by the method described in "2-3. Denaturation (solubilization) treatment".
  • This solution was diluted with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 8) containing 6 M guanidine hydrochloride and 0.014 w/v% Tween 80, based on the protein concentration calculated from the absorbance (280 nm) of the solution. was about 1 mg/mL. Then, it was diluted 50-fold with the refolding solution (at the start of refolding: 20 mg/L protein).
  • the composition of the refolding solution is 1 M sucrose, 0-3 mM reduced glutathione (GSSG), 0-30 mM oxidized glutathione (GSH), and 0.014 w/v% Tween against 20 mM potassium phosphate buffer (pH 8). 80 is added. At this time, the concentration of GSSG was varied between 0 and 3 mM, and the concentration of GSH was varied between 0 and 30 mM. Table 11 shows the results. These results confirmed that the highest enzymatic activity was achieved when 3 mM GSSG and 6 mM GSH were used together as additives.
  • composition of the refolding solution is 20 mM potassium phosphate buffer (pH 8) with glycerol, 3 mM reduced glutathione (GSSG), 6 mM oxidized glutathione (GSH), and 0.014 w/v% Tween 80 added. is. At this time, the concentration of glycerol was varied between 0 and 80 w/v% (see Table 13 below).
  • a solution was obtained by diluting an insoluble protein with a potassium phosphate buffer by the method described in "4-1. Examination of additives (oxidized glutathione, reduced glutathione)" above.
  • the protein concentration after dilution was set to 1.0 mg/mL.
  • it was diluted 50-fold with the refolding solution (at the start of refolding: 20 mg/L protein).
  • 0.25 w/v% or 0.5 w/v% Tween was used based on 20 mM potassium phosphate buffer (pH 8) to which 40 w/v% glycerol, 3 mM GSSG, and 6 mM GSH were added. Those to which 80, 20, 40 or 60 were added were used.
  • a solution was obtained by diluting an insoluble protein with a potassium phosphate buffer by the method described in "4-1. Examination of additives (oxidized glutathione, reduced glutathione)" above.
  • the protein concentration after dilution was set to 1.0 mg/mL.
  • it was diluted 50-fold with the refolding solution (at the start of refolding: 20 mg/L protein).
  • As the refolding solution 0.25 w/v% Tween 80, or 0.1 Those to which ⁇ 0.4 w/v% Tween 40 was added were used. Table 15 shows the results.
  • a solution was obtained by diluting an insoluble protein with a potassium phosphate buffer by the method described in "4-1. Examination of additives (oxidized glutathione, reduced glutathione)" above.
  • the protein concentration after dilution was set to 1.0 mg/mL.
  • it was diluted 50-fold with the refolding solution (at the start of refolding: 20 mg/L protein).
  • the refolding solution was based on 20 mM potassium phosphate buffer (pH 8) containing 40 w/v% glycerol and 0.25 w/v% Tween 80. 16 was adopted. The results are shown in Table 16.

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Abstract

本発明は、ウイルス感染を防止することができ、かつグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を提供する。（ａ）配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列またはそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）糖鎖が付加されておらず、（ｃ）グルコセレブロシダーゼ活性を有する、タンパク質。

Description

グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質およびその製造方法
　本発明は、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質およびその製造方法に関する。
　リソソーム病は、リソソーム酵素およびその関連因子の活性低下又は欠損が原因となり、当該酵素の基質となる物質が体内に蓄積することにより生じる遺伝病である。例えば、リソソーム病の一つであるゴーシェ病では、グルコセレブロシダーゼ（β－グルコシダーゼ；ＧＢＡ）の活性低下により、細網内皮系組織のマクロファージなどの細胞にグルコセレブロシドが蓄積して、肝脾腫、脾機能亢進に伴う貧血や血小板減少、骨変化、血中酸性フォスファターゼおよびアンギオテンシン変換酵素値の上昇等の症状や所見が見られる（非特許文献１）。
　このようなリソソーム病の治療方法としては、従来、酵素補充療法がよく採用されている。例えば、ゴーシェ病では、ヒトのグルコセレブロシダーゼをコードするｃＤＮＡをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株で発現させた組換え酵素が、標的細胞マクロファージへの取り込みが容易となるように糖鎖改変された形（例えば、酵素の糖鎖の非還元末端にマンノース残基を有するタイプとし、標的細胞マクロファージの表面に存在するマンノース受容体に認識され易くしたもの）で用いられている。
　しかしながら、上述のＣＨＯ細胞株のような哺乳動物培養細胞を宿主とした組換え酵素の生産には、培養液が高価である、人畜共通感染ウイルスによる感染リスクがある、細胞の増殖が遅い、といった問題がある。また、植物に由来する細胞を宿主として用いてグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）の組換え体を生産する技術も提案されている（特許文献１）。しかしながら、真核生物のうち植物や出芽酵母を宿主として用いて生産された組換え酵素においては、翻訳後修飾によって当該酵素に付加している糖鎖の構造が哺乳細胞とは大きく異なるため、哺乳動物に対して抗原性を示すという問題がある。したがって、野生型の植物や出芽酵母に由来する細胞を宿主として用いて生産された組換え酵素をバイオ医薬品として用いることには難点がある。
　一方、大腸菌のような原核生物に由来する細胞を宿主として用いて組換えグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）を生産する技術も知られている。このような技術によれば、上述したような真核生物を宿主とした場合のような感染リスクや生産性、生産コストの問題は生じない。また、原核生物はタンパク質の翻訳後修飾である糖鎖付加を行わないため、付加された糖鎖に由来する抗原性の問題も生じない。
　しかしながら、非特許文献２には、少なくとも１つのグリコシル化部位（糖鎖結合部位）への糖鎖の結合が、活性を有するＧＢＡタンパク質の形成に必要であることが記載されている。また、特許文献１には、大腸菌で発現させた組換えＧＢＡタンパク質は酵素活性を有さないことが記載されている。このように、原核生物が産生した組換えＧＢＡタンパク質は翻訳後修飾による糖鎖の付加がなされていないために所望の活性を有していないというのが本技術分野における当業者の共通の認識である。
特表２００６－５２４５０６号公報
Bou-Gharios G. et al., Histochem J. (1993) 25, 593-605 Marie E. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1990) Vol.168, No. 2, 771-777
　そこで本発明は、翻訳後修飾による糖鎖の付加がなされていなくともグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質を提供すること、を目的とする。
　本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討を行った。その結果、以下のタンパク質等により、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させるに至った：
　（ａ）配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列またはそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
　（ｂ）糖鎖が付加されておらず、
　（ｃ）グルコセレブロシダーゼ活性を有する、タンパク質。
　以下、本発明に係る実施の形態を詳細に説明する。但し以下の記載は本発明を説明するための例示であり、本発明をこの記載範囲にのみ特別限定する趣旨ではない。
　本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。
　本明細書において、「グルコセレブロシダーゼ活性」とは、グルコセレブロシドを加水分解する活性を意味する。そして、グルコセレブロシダーゼ活性の有無は、後述する実施例の欄に記載の合成基質（ｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコピラノシド）に対する酵素反応性の有無に基づき判定するものとする。本発明に係るリフォールディング処理後のタンパク質の比活性は、例えば０．５Ｕ／ｍｇ以上であり、好ましくは０．６Ｕ／ｍｇ以上であり、より好ましくは１．２Ｕ／ｍｇ以上である。
　グルコセレブロシダーゼの成熟型タンパク質は、５３６のアミノ酸残基からなる前駆体タンパク質からプロペプチドが切断されて生じる４９７のアミノ酸残基からなるポリペプチドである。ゴーシェ病を適応症として上市されているグルコセレブロシダーゼのバイオ医薬品としては、セレザイム（Cerezyme（登録商標））（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生）、ビプリブ（VPRIV（登録商標））（ヒト繊維肉腫細胞（ＨＴ１０８０）により産生）、エレライソ（Elelyso（登録商標））（植物（ニンジン）細胞により産生）がある。
　本発明の一実施形態は、配列番号１に記載のアミノ酸配列（セレザイムのアミノ酸配列に相当；４９５位に相当する位置のアミノ酸がヒト野生型ＧＢＡタンパク質と異なってヒスチジン（Ｈ）になっている）を含み、糖鎖が付加されておらず、かつ、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質である。当該アミノ酸配列を以下に示し、其のアミノ酸配列をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列（終止コドンを含む）を配列番号１３４
に示す。本明細書中、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を単に「ＧＢＡ遺伝子」とも称する。
　本発明の一実施形態には、配列番号１に記載のアミノ酸配列に代え、下記の配列番号２に記載のアミノ酸配列（ビプリブのアミノ酸配列に相当；４９５位に相当する位置のアミノ酸がヒト野生型ＧＢＡタンパク質と異なってアルギニン（Ｒ）になっている）を含むタンパク質も挙げられる。
　本発明の一実施形態には更に、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列に代え、それら（より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列）と９０％以上の同一性（本明細書において“相同性”と同義）を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列と配列番号１の同一性は、より好ましくは９５％以上であり、更により好ましくは９９％以上である。
　本発明によれば、翻訳後修飾による糖鎖の付加がなされていなくともグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質が提供される。
　本明細書において、アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
　ここで、アミノ酸配列の「同一性」とは、比較対象である２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が可能な限り多く一致するように両アミノ酸配列を並列させた上、そこで一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入し、挿入した１つのギャップは１つのアミノ酸残基として数えて全アミノ酸残基数を求める。このようにして求めた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
　本発明の好ましい実施形態は、グルコセレブロシダーゼ活性をより向上できるとの観点から、配列番号１または２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質である：
　（１）２６位に相当する位置のアミノ酸をロイシンに置換（Ｆ２６Ｌ）；
　（２）２６位に相当する位置のアミノ酸をイソロイシンに置換（Ｆ２６Ｉ）；
　（３）１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）；
　（４）１２６位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ１２６Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
　（５）５７位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ５７Ｃ）；
　（６）６０位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｈ６０Ｃ）；
　（７）６３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ６３Ｃ）；
　（８）１４３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ１４３Ｃ）；
　（９）１４５位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｈ１４５Ｃ）；
　（１０）２２４位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ２２４Ｃ）；ならびに
　（１１）３２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ３２１Ｃ）。
　また、本発明に係るタンパク質は、より好ましくは配列番号１または２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むタンパク質である：
　（ａ－１）（１）Ｆ２６Ｌ
　（ａ－２）（３）Ｃ１２６Ｔ
　（ａ－３）（２）Ｆ２６Ｉおよび（３）Ｃ１２６Ｔ
　（ａ－４）（１）Ｆ２６Ｌおよび（３）Ｃ１２６Ｔ
　（ａ－５）（４）Ｃ１２６ＳおよびＣ３４２Ｓ
　（ａ－６）（３）Ｃ１２６Ｔおよび（５）Ｑ５７Ｃ
　（ａ－７）（３）Ｃ１２６Ｔおよび（６）Ｈ６０Ｃ
　（ａ－８）（３）Ｃ１２６Ｔおよび（７）Ｔ６３Ｃ
　（ａ－９）（３）Ｃ１２６Ｔおよび（８）Ｑ１４３Ｃ
　（ａ－１０）（３）Ｃ１２６Ｔおよび（９）Ｈ１４５Ｃ
　（ａ－１１）（３）Ｃ１２６Ｔおよび（１０）Ｋ２２４Ｃ
　（ａ－１２）（３）Ｃ１２６Ｔおよび（１１）Ｋ３２１Ｃ。
　ただし、（ａ－１）～（ａ－１２）において、以下の位置のアミノ酸は、置換されていない：
　（ａ－２）において、１４２位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、１４４位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、１４７位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、１７１位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、３４７位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－２）において、４０７位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－４）において、２４８位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、７７位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、２９０位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、２９３位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、３３３位に相当する位置のアミノ酸
　（ａ－９）において、４６６位に相当する位置のアミノ酸。
　上記アミノ酸置換の少なくとも１つを有するアミノ酸配列としては、例えば配列番号３～５、７、９～３０、３２、３３、３５、３７～３９、４１～５１に記載のアミノ酸配列が挙げられる。
　さらに好ましくは、本発明に係るタンパク質は、配列番号３、５、７、９、１０、１２～１６、１８～２８、３０、３２、３３、３５、３７～３９、４２、４７に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つを含む。
　本発明の好ましい実施形態は、安定性をより向上できるとの観点から、配列番号１または２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを有する、タンパク質が望ましい：
　（１２）２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
　（１３）１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）および３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
　（１４）１２６位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ１２６Ｓ）、２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；ならびに
　（１５）１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）、２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）。
　より望ましくは、本発明に係るタンパク質は、配列番号１４、１７、１８および５１に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つを含む。
　本発明の好ましい実施形態は、配列番号１もしくは２のアミノ酸配列、または上記（１）～（１５）のいずれか１つの置換を有する配列番号１もしくは２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つをさらに有する、タンパク質である：
　（１６）６１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ６１Ｃ）；
　（１７）９８位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｐ９８Ｃ）；
　（１８）１４３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ１４３Ｃ）；
　（１９）２２４位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ２２４Ｃ）；
　（２０）３２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ３２１Ｃ）；および
　（２１）４０７位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ４０７Ｃ）。
　より好ましくは、本発明に係るタンパク質は、配列番号１６、２４、２８、３０、３７、３９、４１、４３～４９に記載のアミノ酸配列から選択される少なくとも１つを含む。
　本発明に係るタンパク質は上記で説明されるアミノ酸配列からなるものであっても良い。
　本発明に係るタンパク質の製造方法の一例を以下に記載する。
　本発明に係るタンパク質原料としてのペプチド鎖の製造方法は、ペプチド鎖に糖鎖が付加されない限り特に制限されず、原核生物によって産生されたペプチド鎖であっても、有機合成により合成されたペプチド鎖であってもよい。本発明に係るタンパク質は、高い生産性と低コストとの観点から、好ましくは原核生物によって産生されたペプチド鎖を原料とすることが可能である。
　すなわち、一実施形態において、本発明に係るタンパク質は、原核生物によって産生されたものである。
　原核生物としては、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の大腸菌属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。本発明で使用される原核生物は、好ましくは大腸菌である。
　一実施形態において、本発明に係るタンパク質の製造方法は、本発明に係るタンパク質をコードする核酸を含むベクターを原核生物に導入して、前記原核生物にタンパク質原料を産生させることと、回収した前記タンパク質原料に対してフォールディング処理を施すことと、を含む。
　まず、本発明に係るタンパク質をコードする核酸を含むベクターを原核生物に導入して、前記原核生物にタンパク質原料を産生させる。これにより、糖鎖が付加されていないタンパク質原料を得ることができる。
　本発明に係るタンパク質をコードする核酸およびそれを含むベクターの製造方法は、特に制限されず、従来公知の手法を用いることができる。
　ベクターは、公知のベクター、例えばｐＴＡＫＮ－２などのＴベクター、ｐＥＴ－２１ｂ（＋）などのプラスミドベクターを使用することができる。
　原核生物へのベクターの導入方法は、特に制限されず、従来公知の方法を適宜使用することができる。導入方法としては、コンピテントセル法、接合伝達法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
　ベクターを導入した原核生物を培養することにより、前記原核生物にタンパク質原料を産生させることができる。原核生物の培養は、選択した原核生物に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　使用する原核生物の種類によって、好気的条件下または嫌気的条件下で、原核生物を培養する。前者の場合には、原核生物の培養は、振とうあるいは通気攪拌などが行われてもよい。また、培養の条件（培養温度、培養時間、培地のｐＨなど）は、培地の組成や培養法によって適宜選択され、原核生物が増殖できる条件であれば特に制限されず、培養する原核生物の種類に応じて適宜選択できる。
　本発明に係るタンパク質は翻訳後修飾による糖鎖が付加されていないものであるから、即ち翻訳後修飾を受けていないことが望まれる。
　原核生物が産生したタンパク質原料を回収する方法としては、従来公知の方法を適宜使用することができる。例えばタンパク質原料が原核生物内に存在する場合は、得られた培養物から遠心分離、ろ過などの方法により原核生物を集菌し、採取した原核生物をビーズなどによる機械的方法、酵素的方法により破砕する。破砕後、不溶性画分を回収し、界面活性剤を含むバッファーで処理することで、タンパク質原料を回収することができる。
　次に、回収したタンパク質原料に対してフォールディング処理（変性処理を事前に行うことも含むリフォールディング処理であっても良い）を施す。
　フォールディング処理としては、例えば回収したタンパク質原料を含む液に、酸化剤と還元剤とを含むバッファー（酸化型グルタチオン／還元型グルタチオン、シスチン／システイン、システアミン／シスタミンなど）を添加し、約２０℃～約３０℃にて約１日～７日静置することによって、行うことができる。当該バッファーにはスクロースやグリセロールといった添加剤を更に添加することが可能である。
　回収したタンパク質原料は、フォールディング処理の前に、必要に応じて変性（可溶化）処理を施してもよい。変性処理は、６Ｍのグアニジン塩酸塩、８Ｍの尿素などの変性剤を用いて行うことができる。変性処理を施すことで、回収したタンパク質原料をフォールディングされていない状態にすることができる。
　一実施形態において、本発明に係るタンパク質の製造方法は、フォールディングされていない、本発明に係るタンパク質を構成するアミノ酸配列を含み、糖鎖が付加されていないタンパク質原料に対してフォールディング処理を施すことを含む、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法である。
　一実施形態において、本発明に係るタンパク質は、原核生物によって産生されたタンパク質をリフォールディングすることによって製造されたものである。原核生物によって産生されたタンパク質は、必要に応じて変性（可溶化）処理を施してもよい。
　本発明に係るタンパク質は、従来の動物細胞および植物細胞を用いた組換えＧＢＡタンパク質とは異なり、ウイルス感染リスクを抑えることができ、また哺乳動物に対する抗原性を抑えることも期待される。
　また、本発明に係るタンパク質は、以下の用途に好適である。
　原核生物が産生した組換えＧＢＡタンパク質を原料とした場合であっても、活性を有する組換えＧＢＡタンパク質を提供することができる。よって、本発明に係るタンパク質は、ゴーシェ病などのリソソーム病の治療において好適に使用できる。
　本発明に係るタンパク質は、植物由来などのグルコシルセラミドを分解し、セラミドを生成するのに利用することができる。
　本発明に係るタンパク質は、ＧＢＡ抗体を取得するのに利用することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。特に、ＧＢＡタンパク質及び組換えＧＢＡタンパク質を生産する細菌株の構築及び培養・細胞の破砕に関する部分（１－１～２－２）は、一般に知られている他の手段を適宜用いることが可能である。
　実施例において、プラスミド番号と組換えタンパク質番号とは同一の番号を付す。
　［ＧＢＡ遺伝子およびその改変遺伝子導入組換え大腸菌の構築］
　１－１．グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子の合成
　配列番号１３５で示されるＧＢＡ遺伝子は、シグナルペプチドが除去された成熟型のＧＢＡタンパク質をコードするコドンの５’－末端に開始コドン（ａｔｇ）を付加し、また大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ－１２株）のコドン使用頻度に対して最適化された配列になるような変更を加えたものである。当該配列番号１３５で示されるＧＢＡ遺伝子の合成を、ユーロフィンジェノミクス株式会社に外部委託し、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＴＡＫＮ－２に挿入された状態で納入された。
　１－２．ＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドの調製
　大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現検討を行うため、上記で取得したＧＢＡ遺伝子をｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩサイトとＨｉｓタグとの間にサブクローニングした。具体的には、ｐＥＴ－２１ｂ（＋）またはＧＢＡ遺伝子が挿入されたｐＴＡＫＮ－２のいずれかをテンプレートとするＰＣＲをそれぞれ行い、線状化ｐＥＴ－２１ｂ（＋）およびＧＢＡ遺伝子（終止コドンを除く）の増幅産物をそれぞれ得た。
　上記で得られたＰＣＲ増幅産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて処理（制限酵素ＤｐｎＩによる切断及びライゲーション）し、ＧＢＡ遺伝子が挿入されたｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドベクター（本明細書において、「Ｈ４９５型」と呼ぶ）を得た。当該プラスミドベクターに挿入されたＧＢＡ遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードしている。
　１－３．改変ＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドの調製
　上記１－２．で調製したＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドをテンプレートとして、下記表１に記載の変異導入用プライマー（ＧＢＡ遺伝子がコードするアミノ酸を別のアミノ酸に置換させることが目的のもの）を用いてＰＣＲを行うことで、ＧＢＡ遺伝子（終止コドンを除く）に変異が導入されたプラスミド（線状化されたもの）を各種増幅した。当該各種の改変ＧＢＡ遺伝子におけるアミノ酸配列の置換箇所及び置換後のアミノ酸に対応するコドンは表２の通りである。得られたＰＣＲ増幅産物（線状化プラスミド）をマニュアルに従い、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡株式会社）およびＬｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（東洋紡株式会社）によりセルフライゲーションして環状化させることで、改変ＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドを得た（表５）。複数の変異を導入する際には、上記と同様の方法を繰り返すことで変異を追加していった。
　１－４．組換え大腸菌株の構築
　１－２および１－３で構築した各プラスミドの其々につき、マニュアルに従って大腸菌のコンピテントセル（ＥＣＯＳ　コンピテントＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（株式会社ニッポンジーン））に対して形質転換し、ＧＢＡ遺伝子または改変ＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドベクターを保持する各種組換え大腸菌株を構築した。
　［組換え大腸菌によるタンパク質の合成方法・比較評価方法・比較評価結果］
　２－１．組換え大腸菌によるＧＢＡタンパク質の合成
　上記１－４．で構築した組換え大腸菌を用いて、ＧＢＡタンパク質または組換えＧＢＡタンパク質を合成した。
　具体的には、まず、試験管内のＬＢ液体培地４ｍＬ（１００ｍｇ／Ｌの濃度でアンピシリンを含有）に、ＬＢ寒天培地（１００ｍｇ／Ｌの濃度でアンピシリンを含有）上に生育した単一のコロニーを植菌し、３００ｒｐｍ、３０℃にて一晩振とう培養して、前培養液を得た。
　前培養液２ｍＬを、坂口フラスコ内の本培養用培地（組成は下記の表３参照）５０ｍＬに植菌し、１２０ｒｐｍ、３０℃にて７２時間振とう培養して本培養を行った。
　本培養後の培養液を、６，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して、上清を廃棄後、バッファーＡ（組成は下記の表４参照）を用いて沈殿物を懸濁させた。その後、６，０００×ｇ、４℃にて再度１０分間遠心分離し、上清を廃棄後、組換え大腸菌の沈殿物を得た（其の後、－８０℃にて凍結保存した）。
　２－２．菌体の破砕処理
　上記２－１で得られた組換え大腸菌を、バッファーＡに懸濁し、濁度（ＯＤ６６０）を測定した後、ＯＤ６６０＝１０となるようにバッファーＡで希釈した。次いで、この懸濁液にジルコニアシリカビーズ（０．６ｍｍ）を添加し、氷上で冷却したアルミブロックを用いて冷却しながら、ビーズ式細胞破砕装置（株式会社バイオメディカルサイエンス製、シェイクマスターネオｖｅｒ１．０）により１３００ｒｐｍで５分間振盪し、その後さらにアルミブロックで５分間冷却した。この操作を計６回繰り返して菌体の細胞に対して破砕処理を施した。
　次いで、６，０００×ｇ、４℃にて１５分間遠心分離し、沈殿物（不溶性画分）を回収した。そして、回収された不溶性画分に対し、以下の（１）～（４）の溶液（２００μＬ）の其々につき順次、懸濁後に６０００×ｇにて２分間の遠心分離処理することを２回ずつ行って、不溶性タンパク質を得た：
　（１）バッファーＡ
　（２）０．０５ｗ／ｖ％デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ・Ｎａ）添加バッファーＡ
　（３）１ｗ／ｖ％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００添加バッファーＡ
　（４）バッファーＡ（ｐＨ６）。
　２－３．変性（可溶化）処理
　続いて、上記遠心分離処理により得られた不溶性タンパク質を、６Ｍグアニジン塩酸塩、０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０および４０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）により懸濁した後、２５℃にて２時間静置してインキュベートを行った（変性（可溶化）処理）。
　次いで、６，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離し、上清を回収することにより不溶性成分を除去した。そして、分光光度計を用いて、溶液の吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、得られた値（Ａ２８０）から、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝Ａ２８０／１．７の数式に従ってタンパク質を定量した。なお、分母の１．７は、アミノ酸配列情報をもとに算出した吸光係数である。
　２－４．リフォールディング処理
　その後、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように６Ｍグアニジン塩酸塩および０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）を用いて調製後、４０ｗ／ｖ％グリセロール、０．２５ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０、３ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および６ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＨ）が添加された添加２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）にて５０倍に希釈した。
　希釈の時点から２５℃にて静置することによりインキュベートを開始し、インキュベートの開始から７日後にサンプルを回収して、以下の手法により酵素活性を測定した。
　２－５．酵素活性の測定
　グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）は、Ｇｌｃ－Ｃｅｒ（グルコセレブロシド；糖脂質）の糖と脂質との脱水縮合部位を加水分解する反応を触媒する酵素である。ここでは、合成基質であるｐ－ニトロフェニル－β－Ｄ－グルコピラノシド（ｐＮＰＧ）を基質として用いて、上記で得られた組換えＧＢＡタンパク質の酵素活性を測定した。
　具体的には、まず、１ｗ／ｖ％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００添加バッファーＡ　９０μＬおよびサンプル（７日後）　３０μＬおよび５０ｍＭ　ｐＮＰＧ添加バッファーＡ　３０μＬを混合し、サーモミキサーコンフォート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて７００ｒｐｍ、３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、０．２Ｎ　ＮａＯＨ溶液を１５０μＬ添加し、ボルテックスした後、数千ｒｐｍ程度、室温にて数秒間遠心分離した。
　上清２００μＬをマイクロプレートに移し、反応生成物（４－ニトロフェノール）に対応する吸光度（４００ｎｍ）を測定した。そして、予め作成しておいた４－ニトロフェノールの検量線に基づき、組換えＧＢＡタンパク質の容量活性（Ｕ／ｍＬ）を算出した。また、仕掛けたタンパク質濃度（２０ｍｇ／Ｌ）で容量活性の値を叙することにより、組換えＧＢＡタンパク質の比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。なお、１Ｕは、ｐＮＰＧを１分間に１μｍｏｌ分解する活性の単位である。また、上記１－２．で調製したＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドを用いて上記と同様にして大腸菌に産生させた、配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＢＡタンパク質（本明細書において「Ｈ４９５型タンパク質」と呼ぶ）についても上記と同様にしてリフォールディング処理および酵素活性の測定を実施した。なお、Ｈ４９５型タンパク質の比活性は、１．２Ｕ／ｍｇであった。
　酵素活性測定の結果を下記の表５に示す。ここで、表５に示す値は、Ｈ４９５型タンパク質の比活性の値を１００％としたときの相対値（％）である。
　尚、本明細書における酵素活性の測定は、特記されない限り、上記の方法に準じて行われている。
　（考察）
　Ｈ４９５型タンパク質において、糖鎖の修飾がされていないにも関わらず、酵素活性を有することが新たに見出された。
　Ｈ４９５型タンパク質とＮｏ．１４２との比較、Ｎｏ．１４５とＮｏ．１５９との比較、およびＮｏ．１４７とＮｏ．１４９との比較から、Ｆ２６Ｌの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１４５とＮｏ．１６５との比較から、Ｆ２６Ｉの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１８とＮｏ．１４５との比較、Ｎｏ．２７とＮｏ．１２５との比較、Ｎｏ．１８４とＮｏ．１８５との比較、およびＮｏ．３７とＮｏ．１６７との比較から、Ｃ１２６Ｔの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．３とＮｏ．１８とＮｏ．２７との比較から、Ｃ３４２ＳおよびＣ１２６Ｓの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１６７とＮｏ．１６８とＮｏ．１８６－１９３との比較から、Ｑ５７Ｃ、Ｈ６０Ｃ、およびＴ６３Ｃの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１６７とＮｏ．１７１－１７６との比較から、Ｑ１４３ＣおよびＨ１４５Ｃの活性向上効果が見出された。
　Ｎｏ．１６７とＮｏ．１９４－１９８とＮｏ．２００とＮｏ．２０１とＮｏ．２１５との比較、およびＮｏ．１７８とＮｏ．２４３とＮｏ．２５２とＮｏ．２５４とＮｏ．２５７とＮｏ．２５９とＮｏ．２６３との比較から、Ｋ２２４ＣおよびＫ３２１Ｃの活性向上効果が見出された。
　Ｃ３４２は酵素活性に必要なアミノ酸残基であることが報告されていた（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 7, pp. 4242-4253, February 17, 2006）。しかし、セリンに置換した場合には活性が維持されることが見出された。
　［安定性評価］
　・糖鎖が付加されていない、グルコセレブロシダーゼ改変体の合成
　上記１－３と同様の方法で、Ｃ２４８ＳまたはＣ２４８ＳおよびＣ３４２Ｓの変異を含む組換えＧＢＡ遺伝子が挿入されたプラスミドを追加で得た（Ｎｏ．１９および４２）。その後、当該プラスミドを保持する組換え大腸菌株についても上記１－４と同様の方法で追加で用意した。
　表６記載のプラスミドを保持する各組換え大腸菌株から、上記２－１～２－３と同様の方法によって、Ｈ４９５型タンパク質及び各組換えＧＢＡタンパク質を得た。
　３－１．リフォールディング溶液中の安定性評価
　上記で得られたＨ４９５型タンパク質および下記表６の７種の組換えＧＢＡタンパク質について、上記２－４．リフォールディング処理を行った後、７日間経過した溶液（サンプル）を３７℃に移し、残存活性の推移を測定した。結果を表６に示す。
　表６に示すように、Ｈ４９５型タンパク質と比べて、Ｃｙｓ残基を置換することで安定性が向上し、さらに複数のＣｙｓ残基を置換することで、より安定性が向上することを確認した。
　３－２．バッファー中での安定性評価１
　下記表９の組換えＧＢＡタンパク質について、上記２－４．リフォールディング処理を行った後、７日間経過した溶液（サンプル）に１Ｍクエン酸溶液を添加し、ｐＨを４．５に調整した。次に、ろ過滅菌フィルター（Ｎａｌｇｅｎ製，０．２μｍ，ＰＥＳ）によりろ過した後、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ　２，　Ｂｉｏｍａｘ，１０　ｋＤａ，０．１　ｍ２，Ｖ－スクリーン（Ｍｅｒｃｋ）にて、脱塩、濃縮（それぞれ約１０倍）した。得られた濃縮液をＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　ＨＰ，５　ｍＬ（ＧＥヘルスケア）にて、精製した。溶液としてＡ液：バッファーＢ（組成は下記表７参照）およびＢ液：１Ｍ　ＮａＣｌ添加バッファーＡを用い、Ｂ　２５％で溶出される活性フラクションを回収した。次に、ＨｉＴｒａｐ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＨＰ，５ｍＬ（ＧＥヘルスケア）にて、精製した。溶液としてＡ液：バッファーＣ（組成は下記表８参照）及びＢ液：エタノールを用い、Ｂ　４０％で溶出される活性フラクションを回収した。回収した溶液をＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，３　ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ）にて濃縮後、凍結乾燥した。
　Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）および精製済みの組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１７６）を０．０１５ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０添加２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）により、０．０５ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、３７℃でインキュベートして、残存活性の推移を測定した。結果を表９に示す。
　表９に示すように、組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１７６）は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅに対して、安定性が向上していることを確認した。
　３－３．バッファー中での安定性評価２
　上記バッファー中での安定性評価１と同様の方法で、組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１６７およびＮｏ．１７８）を精製した。
　Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）および精製済みの組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１６７およびＮｏ．１７８）を０．1ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０添加５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）により、０．０１ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、３７℃でインキュベートして、残存活性の推移を測定した。結果を表１０に示す。
　表１０に示すように、組換えＧＢＡタンパク質（Ｎｏ．１６７およびＮｏ．１７８）は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅに対して、安定性が向上していることを確認した。
　［組換えＧＢＡタンパク質を対象としたリフォールディング条件の検討］
　４－１．添加剤の検討（酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン）
　上記１－２．で調製した野生型プラスミドを用いて上記と同様にして大腸菌に産生させた配列番号１のアミノ酸配列を有するＧＢＡタンパク質（Ｈ４９５型タンパク質）について、上記「２－２．菌体の破砕処理」に記載の手法により、不溶性タンパク質を調製した。
　次いで、得られたＨ４９５型タンパク質の不溶性タンパク質を「２－３．変性（可溶化）処理」に記載の手法により、Ｈ４９５型タンパク質の変性タンパク質溶液を調製した。この溶液について、溶液の吸光度（２８０ｎｍ）より算出したタンパク質濃度に基づき、６Ｍグアニジン塩酸塩、０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）にて希釈し、タンパク質濃度を約１ｍｇ／ｍＬとした。その後、リフォールディング溶液を用いて５０倍に希釈した（リフォールディング開始時：２０ｍｇ／Ｌタンパク質）。なお、リフォールディング溶液の組成は、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）に対して１Ｍスクロース、０～３ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、０～３０ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０を添加したものである。この際、ＧＳＳＧについては０～３ｍＭの間で濃度を変化させ、また、ＧＳＨについては０～３０ｍＭの間で濃度を変化させた。結果を表１１に示す。これらの結果から、３ｍＭのＧＳＳＧおよび６ｍＭのＧＳＨを添加剤として併用した場合に最も高い酵素活性が達成されることが確認された。
　４－２．添加剤の検討（スクロース対グリセロール）
　リフォールディング溶液として、下記の（１）または（２）のいずれかを用いたこと以外は、上記「４－１．添加剤の検討（酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン）」に記載の手法によりリフォールディング処理を行い、酵素活性を測定した。
　（１）１Ｍスクロース、３ｍＭ　ＧＳＳＧ、６ｍＭ　ＧＳＨ、０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）
　（２）３０ｗ／ｖ％グリセロール、３ｍＭ　ＧＳＳＧ、６ｍＭ　ＧＳＨ、０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）。
　結果を表１２に示す。これらの結果から、リフォールディング溶液の添加剤の主剤をスクロースからグリセロールに変更することで、活性が２倍程度向上することが判明した。
　４－３．リフォールディング溶液中のグリセロール濃度の影響の検討
　上記「４－１．添加剤の検討（酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン）」に記載の手法により、不溶性タンパク質をリン酸カリウムバッファーで希釈した溶液を得た。ただし、希釈後のタンパク質濃度を約０．８ｍｇ／ｍＬとした。その後、リフォールディング溶液を用いて５０倍に希釈した（リフォールディング開始時：１６ｍｇ／Ｌタンパク質）。なお、リフォールディング溶液の組成は、２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）に対してグリセロール、３ｍＭ還元型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、６ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＨ）、０．０１４ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０を添加したものである。この際、グリセロールについては０～８０ｗ／ｖ％の間で濃度を変化させた（下記の表１３を参照）。
　結果を表１３に示す。これらの結果から、グリセロール濃度が４０ｗ／ｖ％のときに最も高い酵素活性が達成されることが判明された。
　４－４．リフォールディング溶液への添加剤としてのＴｗｅｅｎ　２０、４０、６０、８０の比較検討
　上記での検討において用いたリフォールディング溶液中の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ　８０）のほか、Ｔｗｅｅｎ系の非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ　２０、４０、６０をそれぞれ用いてリフォールディングの検討を行った（各非イオン性界面活性剤の構造は下記の通り）。
　具体的には、まず、上記「４－１．添加剤の検討（酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン）」に記載の手法により、不溶性タンパク質をリン酸カリウムバッファーで希釈した溶液を得た。ここで、希釈後のタンパク質濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。その後、リフォールディング溶液を用いて５０倍に希釈した（リフォールディング開始時：２０ｍｇ／Ｌタンパク質）。なお、リフォールディング溶液としては、４０ｗ／ｖ％グリセロール、３ｍＭ　ＧＳＳＧ、６ｍＭ　ＧＳＨが添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）をベースとして、０．２５ｗ／ｖ％または０．５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ　８０、２０、４０または６０をそれぞれ添加したものを用いた。
　結果を表１４に示す。
　これらの結果から、Ｔｗｅｅｎ　８０と比較して、Ｔｗｅｅｎ　６０やＴｗｅｅｎ　４０を用いた方がより良好な結果が得られた。
　４－５．界面活性剤Ｔｗｅｅｎ　４０の濃度のリフォールディングへの影響の評価
　上記４－４．の結果を受けて、リフォールディング溶液中の界面活性剤としてＴｗｅｅｎ　４０を用い、その濃度を変化させた場合の影響を検討した。
　具体的には、まず、上記「４－１．添加剤の検討（酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン）」に記載の手法により、不溶性タンパク質をリン酸カリウムバッファーで希釈した溶液を得た。ここで、希釈後のタンパク質濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。その後、リフォールディング溶液を用いて５０倍に希釈した（リフォールディング開始時：２０ｍｇ／Ｌタンパク質）。なお、リフォールディング溶液としては、４０ｗ／ｖ％グリセロール、３ｍＭ　ＧＳＳＧ、６ｍＭ　ＧＳＨが添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）をベースとして、０．２５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ　８０、あるいは、０．１～０．４ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ　４０をそれぞれ添加したものを用いた。結果を表１５に示す。
　これらの結果から、０．３ｗ／ｖ％の濃度のＴｗｅｅｎ　４０を用いた場合に最も良好な結果が得られた。
　４－６．リフォールディング時の酸化還元剤の影響の評価
　リフォールディング溶液中の酸化還元剤の種類および濃度を変化させた場合の影響を検討した。
　具体的には、まず、上記「４－１．添加剤の検討（酸化型グルタチオン、還元型グルタチオン）」に記載の手法により、不溶性タンパク質をリン酸カリウムバッファーで希釈した溶液を得た。ここで、希釈後のタンパク質濃度を１．０ｍｇ／ｍＬとした。その後、リフォールディング溶液を用いて５０倍に希釈した（リフォールディング開始時：２０ｍｇ／Ｌタンパク質）。なお、リフォールディング溶液としては、４０ｗ／ｖ％グリセロール、０．２５ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）をベースとして、酸化還元剤の種類および濃度としては下記の表１６に示すものを採用した。結果を表１６に示す。
　これらの結果から、上記の検討において最適な条件であると考えられていた「３ｍＭ　ＧＳＳＧ、６ｍＭ　ＧＳＨ」という条件と比較して、「１ｍＭ　シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）、２ｍＭ　システイン（Ｃｙｓ）」という条件の方がより良好な結果を示した。
　４－７．リフォールディング時のシスチン／システイン濃度の最適化検討
　上記４－６．の結果を受けて、リフォールディング溶液として、４０ｗ／ｖ％グリセロール、０．２５ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　８０、０．３ｗ／ｖ％　Ｔｗｅｅｎ　４０が添加された２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ８）をベースとして、下記の表１７に示す濃度の組み合わせでシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）およびシステイン（Ｃｙｓ）をそれぞれ添加したものを用いて、リフォールディングの検討を行った。結果を表１７に示す。
　これらの結果から、酸化還元剤として、２ｍＭシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）および６ｍＭシステイン（Ｃｙｓ）が添加されたリフォールディング溶液を用いてリフォールディング処理を施した場合に最大の容量活性が達成されることが判明した。
　本出願は、２０２２年１月３１日に出願された日本特許出願番号２０２２－０１３０５２号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。

Claims (8)

  1. 　（ａ）配列番号１もしくは２に記載のアミノ酸配列またはそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    　（ｂ）糖鎖が付加されておらず、
    　（ｃ）グルコセレブロシダーゼ活性を有する、タンパク質。
  2. 　配列番号１または２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを有する、請求項１に記載のタンパク質：
    　（１）配列番号１または２の２６位に相当する位置のアミノ酸をロイシンに置換（Ｆ２６Ｌ）；
    　（２）配列番号１または２の２６位に相当する位置のアミノ酸をイソロイシンに置換（Ｆ２６Ｉ）；
    　（３）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）；
    　（４）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ１２６Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
    　（５）配列番号１または２の５７位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ５７Ｃ）；
    　（６）配列番号１または２の６０位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｈ６０Ｃ）；
    　（７）配列番号１または２の６３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ６３Ｃ）；
    　（８）配列番号１または２の１４３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ１４３Ｃ）；
    　（９）配列番号１または２の１４５位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｈ１４５Ｃ）；
    　（１０）配列番号１または２の２２４位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ２２４Ｃ）；ならびに
    　（１１）配列番号１または２の３２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ３２１Ｃ）。
  3. 　配列番号１または２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを有する、請求項１に記載のタンパク質：
    　（１２）配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
    　（１３）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；
    　（１４）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ１２６Ｓ）、配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）；ならびに
    　（１５）配列番号１または２の１２６位に相当する位置のアミノ酸をトレオニンに置換（Ｃ１２６Ｔ）、配列番号１または２の２４８位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ２４８Ｓ）および配列番号１または２の３４２位に相当する位置のアミノ酸をセリンに置換（Ｃ３４２Ｓ）。
  4. 　配列番号１または２のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸置換の少なくとも１つを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質：
    　（１６）配列番号１または２の６１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ６１Ｃ）；
    　（１７）配列番号１または２の９８位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｐ９８Ｃ）；
    　（１８）配列番号１または２の１４３位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｑ１４３Ｃ）；
    　（１９）配列番号１または２の２２４位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ２２４Ｃ）；
    　（２０）配列番号１または２の３２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｋ３２１Ｃ）；および
    　（２１）配列番号１または２の４０７位に相当する位置のアミノ酸をシステインに置換（Ｔ４０７Ｃ）。
  5. 　原核生物によって産生されたものである、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. 　フォールディングされていない、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質に対してフォールディング処理を施すことを含む、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸を含むベクターを原核生物に導入して、前記原核生物にタンパク質を産生させることと、
    　回収した前記原核生物により産生されたタンパク質に対してフォールディング処理を施すことと、
    を含む、請求項６に記載のグルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
  8. 　請求項５に記載のタンパク質をリフォールディングすることによって製造された、グルコセレブロシダーゼ活性を有するタンパク質。
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JP2014500722A (ja) * 2010-11-08 2014-01-16 カリダス・バイオファーマ，インコーポレーテッド 増加した安定性および増加した保持触媒活性を有する変異型組換えβ−グルコセレブロシダーゼタンパク質

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