ES2848861T3 - Enzima mutante EndoS - Google Patents

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Yukiko Sekiguchi
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Abstract

Una enzima mutante EndoS de acuerdo con uno de los siguientes: 1) una enzima mutante EndoS que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos números 37 a 995 de SEQ ID NO: 2 con una o más mutaciones en al menos una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consta de: aminoácido 122 (H122), aminoácido 279 (D279), aminoácido 282 (Y282), aminoácido 303 (Q303), aminoácido 348 (Y348), aminoácido 350 (E350), aminoácido 402 (Y402), aminoácido 405 (D405), y aminoácido 406 (R406), y que presenta una actividad de hidrólisis reducida en comparación con la actividad de EndoS D233Q, siendo la actividad una actividad en una cadena de azúcar unida a N (cadena de azúcar unida a N297) unida a Asn en la posición 297 en IgG; o 2) una enzima mutante EndoS de acuerdo con 1) en la que se sustituyen, eliminan, insertan y/o añaden de 1 a 20 aminoácidos en posiciones distintas a las posiciones de los aminoácidos números 98 a 445 y 765 a 923 de SEQ ID NO: 2; en la que la enzima mutante EndoS de acuerdo con 1) o 2) tiene actividad de transglicosilación a un nivel equivalente o superior al de EndoS D233Q.

Description

DESCRIPCIÓN
Enzima mutante EndoS
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo mutante de endo-p-N-acetilglucosaminidasa S (EndoS), un gen que codifica el mutante, un plásmido recombinante, un transformante transformado con el plásmido y un procedimiento para modificar una cadena de azúcar de un anticuerpo que usa el mutante.
Técnica antecedente
Las glicoproteínas residen ampliamente en tejidos de animales y plantas, la membrana celular y la pared de microorganismos eucarióticos y similares. Recientemente, ha quedado claro que las cadenas de azúcar de las glicoproteínas juegan un papel importante en mecanismos como la diferenciación de células, la cancelación y el reconocimiento de célula a célula, y se están realizando estudios sobre la correlación entre la estructura y la función de las cadenas de azúcar para dilucidar estos mecanismos. En las líneas celulares de cultivo, una glicoproteína se traduce como una proteína que consta de una secuencia de aminoácidos uniforme y luego se glicosila mediante modificación postraducción para administrarla al medio de cultivo. Dado que esta modificación postraducción no se determina únicamente de acuerdo con su secuencia de aminoácidos, las cadenas de azúcar que se agregan varían en sus estructuras incluso en la misma proteína expresada en el mismo sistema de cultivo.
Los anticuerpos son moléculas de glicoproteína que tienen cadenas de azúcar unidas a N (cadenas de azúcar unidas a N297) unidas a las cadenas laterales de Asn en la posición 297 ubicadas en las regiones Fc de las moléculas de cadena pesada. Los anticuerpos son moléculas importantes en los estudios básicos y en el campo de la medicina y se estudian y desarrollan con detenimiento, especialmente como medicamentos de anticuerpos. Como tal, se están volviendo claros varios efectos de las cadenas de azúcar (Literatura no patente 1: J. N. Arnold, et al., Annu. Rev. Immunol, 2007, 25, 21050). Actualmente, los anticuerpos terapéuticos que se utilizan son principalmente de la clase de moléculas IgG. Dichos anticuerpos son producidos por células animales cultivadas, como por células CHO y células NS0 en general, y las cadenas de azúcar de anticuerpos unidas a N297 producidas por estas células animales son cadenas de azúcar de tipo complejo biantenario, que son heterogéneas en el núcleo fucosa, el sialilo terminal. y grupos galactosilo, y GlcNAc bisectante (Literatura no patente 2: R. Jefferis, Biotechnol. Prog., 2005, 21­ 11-6). Se ha revelado que las cadenas de azúcar de anticuerpos unidas a N297 tienen una gran influencia en las actividades efectoras, incluida la ADCC (citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos) y los CDC (Literatura no patente 3: Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34-47; Literatura no patente 4: Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery, 2009, 8, 226-234) y se ha informado la posibilidad de que también influyan en la vida media en sangre (Literatura no patente 5: D. Bumbaca, AAPSJ, 2012, 14, 3). Además, se ha revelado que los anticuerpos 2,6-sialilados en los terminales no reductores de las cadenas de azúcar unidas a N297 son ingredientes farmacéuticos activos en la IVIG (Literatura no patente 6: Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110- 122). Además, se considera que la heterogeneidad de las cadenas de azúcar unidas a N297 en moléculas terapéuticas que incluyen fragmentos de IgG y Fc tiene una gran influencia en su naturaleza y calidad como ingrediente activo y existe una posibilidad innegable de que la contaminación con una pequeña cantidad de glicosilada heterogénea moléculas cambia significativamente las propiedades de los productos finales.
En respuesta a esta situación actual, se están desarrollando técnicas para hacer que las cadenas de azúcar sean homogéneas en la producción de moléculas de glicoproteínas que incluyen anticuerpos terapéuticos y regiones Fc de anticuerpos. Los procedimientos conocidos para hacer que las cadenas de azúcar se agreguen a una glicoproteína homogénea incluyen la reacción de transglicosidación usando enzimas (Literatura no patente 6: Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110-122; Literatura no patente 7: Wang, Trends Glycosci. Glicotecnol.2011, 23, 33-52.). Este es un proceso de múltiples etapas que consiste en la escisión (reacción de hidrólisis) de las cadenas de azúcar y la condensación de las cadenas de azúcar (reacción de transglicosilación) en un ambiente in vitro. En particular, con el fin de convertir cadenas de azúcar de tipo N, se utiliza un grupo de enzimas denominadas endo-p-N-acetilglucosaminidasas. Se requiere que tales enzimas 1) tengan la capacidad de hidrolizar cadenas de azúcar de tipo complejo específicamente como sus sustratos y 2) tengan la capacidad de catalizar la reacción de transglicosilación de una estructura particular, como sus propiedades. Las endo-p-N-acetilglucosaminidasas se aíslan de diversas especies y se utilizan diferentes enzimas mutantes y de tipo salvaje dependiendo del tipo de cadenas de azúcar que se van a modificar como sustratos. EndoA (enzima derivada de Arthrobacter protophormiae) (Literatura no patente 8: Takegawa, Biochem Int. 1991 Jul; 24 (5): 849-55), EndoD (enzima derivada de Streptococcus pneumoniae) (Literatura no patente 9: Fan, J Biol Chem.2012 30 de marzo; 287 (14): 11272-81), EndoM (enzima derivada de Mucor hiemalis) (Literatura no patente 10: Umekawa, Biochem Biophys Res Commun.
1994 30 de agosto, 203 (1): 244-52), EndoH (Literatura no patente 11: Robbins, J Biol Chem. 25 de junio de 1984; 259 (12): 7577-83), EndoF2 (enzima derivada de Flavobacterium Meningosepticum) (Literatura no patente 12: Huang, Chembiochem. 11 de abril de 2011; 12 (6): 932-941), EndoE (enzima derivada de Enterococcus faecalis) (Literatura no patente 13: Collin, JBC 2004, 279-21), EndoS (enzima derivada de Streptococcus pyogenes) (Literatura no patente 14: Collin, EMBO J. 2001 15 de junio; 20 (12): 3046-55), y similares se utilizan con el fin de hacer que las cadenas de azúcar sean homogéneas, pero solo se confirma que EndoS es una enzima que tiene actividad de hidrólisis ni actividad de transglicosilación sobre un sustrato que es cadenas de azúcar unidas a N297 de tipo complejo que tienen núcleo fucosa (Literatura no patente 15: Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3 .; Literatura no patente 16: Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030-8033).
También se sabe con respecto a EndoS que la actividad de hidrólisis de EndoS D233Q (en la que hay una mutación que sustituye a Asp en la posición 233, el residuo catalítico nucleófilo entre los 2 residuos catalíticos (que son Asp en la posición 233 y Glu en la posición 235) con Gln) se suprime hasta cierto punto. Se sabe que este mutante cataliza la reacción de transglicosilación selectivamente en condiciones en las que el sistema de reacción contiene una gran cantidad de productos intermedios que tienen cadenas de azúcar con terminales reductores oxazolinizados (Literatura no patente 17: Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308 -12318; Literatura de patentes 1: WO 2013/120066 A1; Literatura no patente 18: B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol 111, No,18, pp6714-6719). Además, se han informado muchas secuencias de enzimas clasificadas como enzimas EndoS que son secuencias derivadas de diferentes serotipos de diferentes cepas en la especie pyogenes. En particular, se ha informado que EndoS2 derivado del serotipo M49 (Literatura no patente 19: Sjogren, Biochem J. 1 de octubre de 2013; 455(1): 107-18; que también puede denominarse EndoS49) tiene propiedades de sustrato similares.
Sin embargo, la actividad de estas enzimas EndoS conocidas y enzimas mutantes tales como EndoS D233Q no es suficiente para realizar la remodelación del azúcar de los anticuerpos terapéuticos a escala industrial y se requiere una mejora técnica que haga posible una remodelación eficaz del azúcar.
Lista de citaciones
Literatura de patentes
Literatura de patentes 1: folleto WO 2013/120066 A1
Literatura no patente
Literatura no patente 1: J. N. Arnold et al., Annu. Rev. Immunol, 2007, 25, 21050
Literatura no patente 2: R. Jefferis, Biotechnol. Prog., 2005, 21-11-6
Literatura no patente 3: Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34-47
Literatura no patente 4: Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 226-234
Literatura no patente 5: D. Bumbaca, AAPSJ, 2012, 14, 3
Literatura no patente 6: Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110-122
Literatura no patente 7: Wang, Trends Glycosci. Glicotecnol. 2011, 23, 33-52
Literatura no patente 8: Takegawa, Biochem Int. 1991 julio; 24 (5): 849-55
Literatura no patente 9: Fan, J Biol Chem. 201230 de marzo; 287(14): 11272-81
Literatura no patente 10: Umekawa, Biochem Biophys Res Commun. 30 de agosto de 1994; 203(1): 244-52
Literatura no patente 11: Robbins, J Biol Chem. 25 de junio de 1984; 259(2): 7577-83
Literatura no patente 12: Huang, Chembiochem. 11 de abril de 2011; 12(6): 932-941
Literatura no patente 13: Collin, JBC 2004, 279-21
Literatura no patente 14: Collin, EMBO J. 15 de junio de 2001; 20(12): 3046-55
Literatura no patente 15: Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3.;
Literatura no patente 16: Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030-8033
Literatura no patente 17: Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318
Literatura no patente 18: B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol 111, No,18, pp6714-6719
Literatura no patente 19: Sjogren, Biochem J. 1 de octubre de 2013; 455(1): 107-18
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objeto de la presente invención es proporcionar una nueva enzima mutante que tiene una actividad de hidrólisis reducida en comparación con EndoS D233Q (que se sabe que es un mutante de endo-p-N-acetilglucosaminidasa que tiene especificidad por las cadenas de azúcar de las regiones Fc de IgG y con actividad de hidrólisis suprimida en comparación con EndoS) y manteniendo una cierta actividad de transglicosilación.
A partir de un estudio que utiliza el conocido EndoS D233Q, se encontró que dado que este mutante mantiene una cierta actividad de hidrólisis, su velocidad de transglicosilación en la reacción de transglicosilación disminuye con el tiempo después del inicio de la reacción. Por lo tanto, es difícil obtener un anticuerpo que tenga cadenas de azúcar homogéneas con alta pureza mediante remodelación de azúcar con EndoS o mutantes existentes. En particular, en reacciones a gran escala, un anticuerpo de la etapa final separado de la enzima contiene inevitablemente el anticuerpo con cadenas de azúcar truncadas ya que la etapa de purificación lleva mucho tiempo.
Además, los derivados de oxazolina sintetizados químicamente de cadenas de azúcar utilizados como donantes de azúcar son a menudo costosos y su uso en gran cantidad conduce a un aumento del coste de producción. Por lo tanto, es necesaria una enzima que tenga una actividad de hidrólisis reducida en comparación con EndoS D233Q y una actividad de transglicosilación igual o superior a un cierto nivel para producir un anticuerpo que tenga cadenas de azúcar homogéneas con alta pureza.Solución al problema
Como resultado de estudios diligentes para lograr el objeto antes mencionado, los presentes inventores han diseñado y producido un gran número de mutantes con referencia a la información de la secuencia de aminoácidos y la estructura 3D de EndoS D233Q y encontraron que las enzimas mutantes novedosas que tienen un las mutaciones adicionales de un aminoácido particular además de D233Q tienen la actividad deseada y se han realizado más estudios para completar la presente invención.
La presente invención se refiere a:
(1) Una enzima mutante EndoS de acuerdo con uno de los siguientes:
1) una enzima mutante EndoS que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos números 37 a 995 de SEQ ID NO: 2 con una o más mutaciones en al menos una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consta de: aminoácido 122 (H122), aminoácido 279 (D279), aminoácido 282 (Y282), aminoácido 303 (Q303), aminoácido 348 (Y348), aminoácido 350 (E350), aminoácido 402 (Y402), aminoácido 405 (D405), y aminoácido 406 (R406), y que presenta una actividad de hidrólisis reducida en comparación con la actividad de EndoS D233Q, siendo la actividad una actividad en una cadena de azúcar unida a N (cadena de azúcar unida a N297) unida a Asn en la posición 297 en IgG; o
2) una enzima mutante EndoS de acuerdo con 1) en la que se sustituyen, eliminan, insertan y/o añaden de 1 a 20 aminoácidos en posiciones distintas a las posiciones de los aminoácidos números 98 a 445 y 765 a 923 de SEQ ID NO: 2;
en la que la enzima mutante EndoS tiene actividad de transglicosilación a un nivel equivalente o superior al de EndoS D233Q.
(2) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (1), en la que las mutaciones se encuentran en 1 a 4 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: H122, D279, Y282, Q303, Y348, E350, Y402, d405 y R406. (3) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (1), en la que la mutación es una mutación en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: Q303, E350 y D405.
(4) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (1) o (2), en la que la mutación es al menos una seleccionada del siguiente grupo:
una mutación en H122 en los aminoácidos: Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala, Glu, Asp, Leu, Ile, Met o Phe; una mutación en D279 en los aminoácidos: Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala o Gln;
una mutación en Y282 en los aminoácidos: Arg, Lys o His;
una mutación en Q303 en los aminoácidos: Met, Pro o Leu;
una mutación en Y348 en los aminoácidos: His o Trp;
una mutación en E350 en los aminoácidos: Lys, Arg, His, Tyr, Gln, Asn, Asp, Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro o Ala;
una mutación en Y402 en los aminoácidos: Phe o Trp;
una mutación en D405 en los aminoácidos: Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro o Ala; y
una mutación en R406 en los aminoácidos: Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala, Glu, Asp, Gln o Asn.
(5) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (4), en la que la mutación es al menos una seleccionada del siguiente grupo:
una mutación en H122 a Ala (H122A) o Phe (H122F);
una mutación en D279 a Ser (D279S) o Gln (D279Q);
una mutación en Y282 a Arg (Y282R);
una mutación en Q303 a Leu (Q303L);
una mutación en Y348 a His (Y348H);
una mutación en E350 a Ala (E350A), Asn (E350N), Asp (E350D) o Gln (E350Q);
una mutación en Y402 a Phe (Y402F) o Trp (Y402W);
una mutación en D405 a Ala (D405A); y
una mutación en R406 a Gln (R406Q).
(6) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (5), que comprende al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en Q303L, E350A, E350N, e350D, E350q y D405A como mutación.
(7) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (6), en la que la mutación es Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q, D405A, H122A/Q303L, H122F/Q303L, D279Q/Q303L, D279S/Q303L, Y282R/Q303L, Q303L/Y348H, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/Y402F, Q303L/Y402W, Q303L/D405A, Q303L/R406Q, H122A/E350A, H122F/E350A, D279Q/E350A, D279S/E350A, Y282R/E350A, Y348H/E350A, E350A/Y402F, E350A/Y402W, E350A/D405A, E350A/R406Q,
H122A/E350N, H122F/E350N, D279Q/E350N, D279S/E350N, Y282R/E350N, Y348H/E350N, E350N/Y402F, E350N/Y402W, E350N/D405A, E350N/R406Q,
H122A/E350D, H122F/E350D, D279Q/E350D, D279S/E350D, Y282R/E350D, Y348H/E350D, E350D/Y402F, E350D/Y402W, E350D/D405A, E350D/R406Q,
H122A/E350Q, H122F/E350Q, D279Q/E350Q, D279S/E350Q, Y282R/E350Q, E350Q/Y348H, E350Q/Y402F, E350Q/Y402W, E350Q/D405A, E350Q/R406Q,
H122A/D405A, H122F/D405A, D279Q/D405A, D279S/D405A, Y282R/D405A, Y348H/D405A, o D405A/R406Q.
(8) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (7), en la que la mutación es Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q, D405A, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/D405A, E350A/D405A, E350N/D405A, E350D/D405A, o E350Q/D405A.
(9) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (4), en la que la mutación es H122A, H122F, D279Q, D279S, Y282R, Y348H, Y402F, Y402Wo R406Q.
(10) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (1), en la que la actividad en la cadena de azúcar unida a N297 mantiene una tasa de hidrólisis del 50% o menos en una reacción de hidrólisis en una solución de reacción a pH 7,4 después de 24 horas.
(11) La enzima mutante EndoS de acuerdo con (1), en la que la enzima mutante EndoS exhibe además una actividad en la cadena de azúcar unida a N297 que conduce a un porcentaje de transglicosilación de aproximadamente 60% o más después de 48 horas de una reacción de transglicosilación con 5 equivalentes. de un donante de azúcar en relación con una molécula aceptora que comprende la cadena de azúcar unida a N297, en una solución de reacción a pH 7,4.(12) Un polinucleótido que codifica una enzima mutante EndoS de acuerdo con cualquiera de (1) a (11).
(13) Un vector que comprende un nucleótido complementario al polinucleótido de acuerdo con (12).
(14) Una célula huésped transformada con un vector de acuerdo con (13).
(15) Un procedimiento de producción de una molécula que comprende una región Fc remodelada con azúcar, que comprende hacer reaccionar una molécula que comprende una región Fc de IgG que tiene un GlcNAc central opcionalmente con adición de fucosa como una cadena de azúcar unida a N297 con un donante de azúcar que tiene una estructura que comprende una GlcNAc oxazolinizada en presencia de una enzima mutante EndoS de acuerdo con cualquiera de (1) a (11) para producir una molécula que comprende una región Fc con una cadena de azúcar unida a N297 que tiene una estructura en la que una cadena de azúcar poseída por el donante de azúcar se transfiere al núcleo GlcNAc de la cadena de azúcar unida a N297.
(16) El procedimiento de producción de acuerdo con (15), en el que la molécula que comprende una región Fc es un anticuerpo monoclonal IgG.
Efectos ventajosos de la invención
Las nuevas enzimas mutantes EndoS de la presente invención tienen una actividad de hidrólisis más reducida en comparación con EndoS D233Q, que se sabe que es un mutante que tiene una actividad de hidrólisis reducida, y mantienen una actividad de transglicosilación igual o superior a un cierto nivel. Por lo tanto, se puede adquirir un anticuerpo que tiene cadenas de azúcar homogéneas mediante remodelación del azúcar con las enzimas mutantes de la presente invención con una pureza más alta y más eficientemente. Además, conducen a una disminución en el costo de producción de anticuerpos remodelados con azúcar ya que se puede disminuir la cantidad de donante de azúcar utilizada en la remodelación del azúcar.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La Figura 1 ilustra una fórmula química estructural (izquierda) de SG-Oxa, que puede usarse como donante de azúcar en la remodelación de azúcar, y una representación (derecha) de la cadena de azúcar en forma de símbolo.
[Figura 2] La Figura 2 es una vista esquemática de la reacción de hidrólisis de una cadena de azúcar unida a N297 de un anticuerpo usando EndoS o una enzima mutante EndoS.
[Figura 3] La Figura 3 ilustra esquemáticamente la reacción de transglicosilación usando EndoS o una enzima mutante EndoS.
[Figura 4-1] La Figura 4 ilustra una alineación de las secuencias de aminoácidos de enzimas mutantes EndoS (EndoS D233Q, EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/Q303L/E350Q, EndoS D233Q/Q303L/D405A, EndoS D233Q/E350Q, EndoS D233Q/D405A, y EndoS D233Q/Y402F). Los aminoácidos se numeran basándose en la región codificante de longitud completa que incluye la secuencia de señalización (1-36). La Figura 4-1 ilustra una alineación de los números de aminoácidos 37-176 de las enzimas mutantes.
[Figura 4-2] La Figura 4-2 es una continuación de la Figura 4-1 e ilustra un alineamiento de los números de aminoácidos 177-316 de las enzimas mutantes.
[Figura 4-3] La Figura 4-3 es una continuación de la Figura 4-2 e ilustra un alineamiento de los números de aminoácidos 317-456 de las enzimas mutantes.
[Figura 4-4] La Figura 4-4 es una continuación de la Figura 4-3 e ilustra una alineación de los números de aminoácidos 467-596 de las enzimas mutantes.
[Figura 4-5] La Figura 4-5 es una continuación de la Figura 4-4 e ilustra una alineación de los números de aminoácidos 597-736 de las enzimas mutantes.
[Figura 4-6] La Figura 4-6 es una continuación de la Figura 4-5 e ilustra una alineación de los números de aminoácidos 737-876 de las enzimas mutantes.
[Figura 4-7] La Figura 4-7 es una continuación de la Figura 4-6 e ilustra una alineación de los números de aminoácidos 877-995 de las enzimas mutantes.
Descripción de realizaciones
La presente invención se describe en detalle a continuación.
La notación de los aminoácidos contenidos en una molécula en este documento se ajusta a las costumbres del campo y la posición de una mutación se indica mediante la notación de un carácter del aminoácido de tipo salvaje (o ácido nucleico) y su número (por ejemplo, Asp en la posición 233 se denomina "D233"). Las mutaciones se indican mediante la notación de un carácter del aminoácido de tipo salvaje (o ácido nucleico), su número y la notación de un carácter del aminoácido (o ácido nucleico) después de la mutación (por ejemplo, la mutación que sustituye a Asp en la posición 233 con Gln se denomina "D233Q"). Además, los mutantes particulares que tienen una mutación se indican mediante el nombre de la molécula y la mutación (por ejemplo, el mutante de EndoS en el que Asp en la posición 233 está sustituida con Gln se denomina "EndoS D233Q") y, si el mutante tiene una pluralidad de mutaciones, las mutaciones se indican con un separador "/" entre las mutaciones (por ejemplo, el mutante de EndoS D233Q que tiene una mutación adicional que sustituye Gln en la posición 303 con Leu se denomina "EndoS D233Q/Q303L").
En la presente invención, el término "cadenas de azúcar unidas a N297" significa cadenas de azúcar unidas a la cadena lateral Asn en la posición 297 de una cadena pesada de IgG. Cuando una IgG se fragmenta, una cadena de azúcar unida al Asn correspondiente en un fragmento de péptido que contiene el Asn también se incluye dentro del término "cadena de azúcar unida a N297". Normalmente, las cadenas de azúcar unidas a N297 en IgG producidas en animales y similares tienen una estructura básica representada por la siguiente fórmula y se puede añadir Gal o ácido siálico a sus terminales no reductores.
[Formula 1]
Figure imgf000007_0001
[ 002 0
[Formula 2]
GIcNAcB 1 -2Mana 1
ManR 1 -4GlcNAcR 1 -4GlcNAcR 1 -(Asn297)
GICNAC|31-2 Mana
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000007_0003
La mayoría de las cadenas de azúcar de IgG unidas a N297 producidas por las células tienen una variedad de estructuras de cadenas de azúcar, incluidas las cadenas de azúcar en las que más cadenas de azúcar están unidas a una GlcNAc en el terminal reductor (GlcNAc central) y/o resto en los terminales no reductores, azúcares ramificados o similares en esta estructura básica. El núcleo GlcNAc puede modificarse en la estructura ((Fuca1,6) GlcNAc) que tiene un núcleo fucosa en el que la fucosa está a1,6 unida a la sexta posición del núcleo GlcNAc. La manosa ramificada puede formar una cadena de azúcar de tipo tribramificada en la que una cadena de azúcar adicional que contiene GlcNAc está unida a la quinta posición de la manosa. A GlcNAc en los terminales no reductores, se pueden unir cadenas de azúcar que contienen Gal o ácido siálico.
En la presente invención, los "donantes de azúcar" son moléculas que contienen cadenas de azúcar que tienen GlcNAc oxazolinizada en los terminales reductores de sus cadenas de azúcar y están disponibles moléculas con diversas estructuras de cadena de azúcar.
Cuando se usan donantes de azúcar para remodelar el azúcar con el propósito de descubrir fármacos, se prefiere emplear un donante de azúcar que tenga una cadena de azúcar humana o una cadena de azúcar compatible con humanos que cause pocos problemas cuando se aplica a humanos. Dichas cadenas de azúcar son cadenas de azúcar que se sabe que no presentan antigenicidad en el cuerpo humano y los ejemplos conocidos de tales cadenas de azúcar que son cadenas de azúcar unidas a N incluyen el tipo con alto contenido de manosa, el tipo híbrido y el tipo complejo. Estos 3 tienen estructuras básicas comunes. El tipo de cadenas de azúcar con alto contenido de manosa son aquellas que tienen una estructura rica en manosa en la que una pluralidad de residuos de manosa están conectados a las 2 cadenas ramificadas (las cadenas 1-3 y 1-6) ramificadas de manosa (p-manosa) en la posición cercana al terminal reductor. El tipo híbrido de cadenas de azúcar son aquellas en una estructura que tiene GlcNAc en una de las 2 cadenas ramificadas (las cadenas 1-3 y 1-6) ramificadas de manosa (p-manosa) en la posición cercana al terminal reductor. El tipo complejo de cadenas de azúcar son aquellas que están en una estructura que tiene GlcNAc en las 2 cadenas ramificadas (las cadenas 1-3 y 1-6) ramificadas de manosa (pmanosa) en la posición cercana al terminal reductor y tienen varias estructuras que incluyen aquellas con o sin galactosa, con o sin sial, y sus isómeros de enlace y regioisómeros. (Ver Tabla 1). Un donante de azúcar representativo es SG-Oxa producido en el Ejemplo 2 (Figura 1).
[Tabla 1]
Tipos de cadenas de azúcar ligadas a N humanas
[Tipo con alto contenido
de mañosa]
Figure imgf000008_0001
En la presente invención, las "moléculas aceptoras" son moléculas que contienen una estructura de azúcar que tiene GlcNAc en un terminal no reductor y, cuando reaccionan con moléculas donantes de azúcar en presencia de EndoS o una enzima mutante de la misma, pueden formar la estructura de la quitobiosa como resultado de la reacción de los anillos de oxazolina en las moléculas donantes de azúcar con la 4a posición de GlcNAc en un terminal no reductor de las moléculas aceptoras. Una molécula aceptora típica es la IgG o un fragmento Fc de la misma que se deriva de un anticuerpo monoclonal y tiene una cadena de azúcar unida a N297 que consta únicamente de GlcNAc central unido opcionalmente con fucosa central. Al núcleo de GlcNAc, el núcleo de Fucosa puede estar unido o no dependiendo del anticuerpo del que se deriva la molécula aceptora o del procedimiento de producción del mismo. Diversos anticuerpos monoclonales o moléculas que comprenden una región Fc (como Fc, CLCH, que es una combinación de CH, solo, que consiste en la región constante obtenida al eliminar la región variable de la cadena pesada y CL, solo, que consiste en la región constante de la cadena ligera) como fuente de moléculas aceptoras, pero los ejemplos preferibles de las mismas incluyen (Fuca1,6)-GlcNAc-IgG, (Fuca1,6)-GlcNAc-Fc y (Fuca1,6)-GlcNAc-CLCH y los ejemplos representativos incluyen (Fuca1,6)-GlcNAc-Trastuzumab, que se produce en el Ejemplo 3.
En la presente invención, "EndoS" es un tipo de endo-p-N-acetilglucosaminidasa (ENGase) derivada de Streptococcus pyogenes y la enzima consiste en una secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 37 a 995 (aminoácidos en las posiciones 1 a 36 corresponden a una secuencia de señalización) de SEQ ID NO: 1 en la que el aminoácido en la posición 233 es Asp (EC 3.2,1,96, GH18). EndoS reconoce específicamente cadenas de azúcar unidas a N297 en el sitio Fc de IgG y tiene actividad de hidrólisis y actividad de transglicosilación. La actividad de hidrólisis de EndoS es la actividad que hidroliza específicamente el enlace p-1,4-glicosídico contenido en la quitobiosa central de las cadenas de azúcar unidas a N297 que tienen la estructura básica descrita anteriormente (como se usa en este documento, a menos que se especifique lo contrario, "actividad de hidrólisis" significa esta actividad; una vista esquemática de la reacción se muestra en la Figura 2). La actividad de transglicosilación de EndoS es la actividad que forma un enlace glicosídico entre el terminal reductor de una cadena de azúcar derivada de un donante de azúcar que tiene GlcNAc oxazolinizada (el núcleo de fucosa puede o no agregarse) en el terminal reductor y una molécula aceptora que contiene un sitio Fc que tiene solamente GlcNAc de núcleo en N297 (esta actividad se denomina, en lo sucesivo, "actividad de transglicosilación"; se muestra una vista esquemática de la reacción en la Figura 3).
Se ha informado que la estructura de EndoS es una estructura de 5 dominios: el dominio enzimático endoglicosidasa (dominio catalítico: números de aminoácidos 98 a 445 de SEQ ID NO: 1), el dominio repetido rico en leucina (números de aminoácidos 446 a 631 de SEQ ID NO: 1), el dominio de Ig híbrido (números de aminoácidos 632 a 764 de SEQ ID NO: 1), el módulo de unión a carbohidratos (CBM: números de aminoácidos 765 a 923 de SEQ ID NO: 1), y el dominio de haz de tres hélices (números de aminoácidos 924 a 995 de SEQ ID NO: 1) (B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol 111, No. 18, pp6714-6719), entre los que se encuentran los sitios que son importantes para la interacción con los anticuerpos se consideran los siguientes dos dominios: el dominio catalítico y CBM.
EndoS es una enzima bien conservada en Streptococcus del grupo A (GAS). EndoS2 (que también puede denominarse EndoS49; Sjogren, Biochem J. 1 de octubre de 2013; 455(1): 107-18; US 2014/0302519 A1) que se encuentra en NZ131 que pertenece al serotipo M49 de GAS tiene una identidad de secuencia de 37%, pero los aminoácidos importantes que componen el dominio catalítico están bien conservados y EndoS2 exhibe una especificidad de sustrato similar a EndoS. Como se usa en este documento, dichas enzimas que tienen una homología/identidad de aminoácidos con la región activa de EndoS se denominan "enzimas relacionadas con EndoS". Las posiciones de mutación importantes, H122, D233, D279, Q303, E350, Y402, D405 y R406 en EndoS corresponden respectivamente a H75, D184, D226, Q250, E289, Y339, D342 y R343 en EndoS2. También se describen aquí enzimas mutantes en las que los aminoácidos correspondientes se mutan a partir de enzimas relacionadas tales como EndoS2.
En la presente invención, "EndoS D233Q" es una enzima mutante que consiste en una secuencia en la que Asp en la posición 233 en EndoS de tipo salvaje está sustituida con Gln (la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 37 a 995 de SEQ ID NO: 1) y la enzima mutante tiene la actividad de hidrólisis de EndoS suprimida en cierto grado y mantiene la actividad de transglicosilación al nivel equivalente al de tipo salvaje.
<Enzima mutante de la presente invención>
La presente invención proporciona enzimas mutantes EndoS D233Q que contienen la región necesaria para la actividad de transglicosilación en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos números 37 a 995 de SEQ ID NO: 2 y que tienen una mutación adicional en al menos un posición de aminoácido seleccionada del grupo de posiciones de ciertas mutaciones adicionales esenciales, además de D233Q; y que tienen una actividad de hidrólisis reducida a cadenas de azúcar de IgG unidas a N297 en comparación con EndoS D233Q.
En la presente invención, el término "mutaciones adicionales" significa alteraciones de aminoácidos adicionales de aminoácidos distintos de D233 en la secuencia de aminoácidos de EndoS D233Q. En la presente invención, el "grupo de posiciones de mutaciones adicionales esenciales" es un grupo candidato de posiciones que necesariamente están mutadas adicionalmente en las enzimas mutantes de la presente invención y es el grupo que consiste en las posiciones indicadas por Xaa en la secuencia de aminoácidos. de SEQ ID NO: 2, es decir, H122, D279, Y282, Q303, Y348, E350, Y402, D405 y R406, y es preferiblemente el grupo que consiste en Q303, E350 y D405.
Las enzimas mutantes de la presente invención se caracterizan por tener tanto una actividad de hidrólisis menor que EndoS D233Q como un cierto nivel de actividad de transglicosilación (en adelante, tener ambas actividades se denomina tener "la presente actividad enzimática"). En cuanto a si una enzima mutante tiene la presente actividad enzimática, las actividades de hidrólisis y transglicosilación pueden evaluarse mediante un procedimiento del Ejemplo 4 descrito a continuación.
En cuanto a la presente actividad enzimática que tienen las enzimas mutantes de la presente invención, la actividad de hidrólisis se suprime en comparación con la actividad de hidrólisis de EndoS D233Q y, más específicamente, el porcentaje de hidrólisis en condiciones a pH 7,4 como se describe en el Ejemplo 4 exhibe un valor menor que el porcentaje de hidrólisis de EndoS D233Q en cualquier momento desde el inicio de la reacción hasta 1 a 48 horas después, pero preferiblemente el porcentaje de hidrólisis a las 24 horas después del inicio de la reacción de hidrólisis es 50% o menos o el porcentaje de hidrólisis a las 48 horas después es 60% o menos que el de EndoS D233Q, más preferiblemente el porcentaje de hidrólisis se mantiene en 40% o menos que el de EndoS D233Q durante 24 horas desde el inicio de la reacción de hidrólisis, más preferiblemente a 30% o menos, incluso más preferiblemente al 20% o menos durante el mismo período de tiempo, y lo más preferiblemente el porcentaje de hidrólisis exhibido es 0% en todos los puntos de tiempo y la actividad de hidrólisis disminuye por completo.
En cuanto a la presente actividad enzimática que tienen las enzimas mutantes de la presente invención, la actividad de transglicosilación está a un nivel equivalente a la actividad de transglicosilación de EndoS D233Q y, más específicamente, el porcentaje de transglicosilación en condiciones a pH 7,4 con 5 equivalentes de un donante de azúcar en relación con una molécula aceptora que comprende la cadena de azúcar unida a N297 como se describe en el Ejemplo 4 es igual o mayor que el porcentaje de transglicosilación de EndoS D233Q (por ejemplo, 70% o más del valor de EndoS D233Q) en y después de un punto de tiempo de 1 a 48 horas después del inicio de la reacción, pero preferiblemente el porcentaje de transglicosilación alcanza el 50% o más que el de EndoS D233Q 48 horas después del inicio de la reacción, más preferiblemente el porcentaje de transglicosilación alcanza el 60% o más que el de EndoS D233Q por 48 horas después del inicio de la reacción, más preferiblemente el porcentaje de transglicosilación alcanza el 80% o más que el de EndoS D233Q por 48 horas después del inicio de la reacción, e incluso más preferiblemente, el porcentaje de transglicosilación alcanza el 90% o más que el de EndoS D233Q a las 48 horas después del inicio de la reacción.
Las enzimas mutantes de la presente invención no tienen que ser de la secuencia de longitud completa siempre que las regiones importantes para la actividad de transglicosilación de EndoS D233Q se conserven en la secuencia de aminoácidos de los números de aminoácidos 37 a 995 de SEQ ID. NO: 2 y la enzima comprende la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos números 37 a 995 de SEQ ID NO: 2. A partir de análisis de dominio de EndoS, se sabe que el dominio catalítico (aminoácidos números 98 a 445 de SEQ ID NO: 2) y CRM (números de aminoácidos 765 a 923 de SEQ ID NO: 2) son importantes.
En las secuencias de aminoácidos de las enzimas mutantes de la presente invención, se pueden sustituir, eliminar, insertar y/o añadir de uno a varios aminoácidos en posiciones distintas a las posiciones de las mutaciones esenciales descritas a continuación en la medida en que no afecta la presente actividad enzimática. Se puede seleccionar cualquier posición para tales alteraciones de aminoácidos siempre que no afecte a la presente actividad enzimática y sea una posición fuera del dominio catalítico (números de aminoácidos 98 a 445 de SEQ ID NO: 2) y CRM (números de aminoácidos 765 a 923 de SEQ ID NO: 2) y más preferiblemente una posición contenida en las regiones de los aminoácidos números 37 a 97 o los aminoácidos números 924 a 995 de SEQ ID NO: 2. En la presente invención, el término "varios" se refiere a 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 5 o menos, y lo más preferiblemente 4, 3, 2 o 1.
En una enzima mutante de la presente invención, las posiciones para mutaciones adicionales distintas de D233Q incluyen al menos una de las posiciones seleccionadas del grupo de posiciones de las mutaciones adicionales esenciales. El número de posiciones para mutaciones adicionales no está particularmente limitado siempre que la enzima mutante producida tenga la presente actividad enzimática, pero preferiblemente es 10 o menos, más preferiblemente 5 o menos, y más preferiblemente 4, 3, 2 o 1. Cuando la enzima mutante tiene mutaciones adicionales en varias posiciones, si hay una mutación en al menos una del grupo de posiciones de mutaciones adicionales esenciales, entonces las otras posiciones de la mutación no están particularmente limitadas siempre que la enzima mutante producida tenga el presente actividad enzimática, pero se prefiere que todas las mutaciones adicionales estén en el grupo de posiciones de mutaciones adicionales esenciales. Cuando la enzima mutante tiene una mutación adicional en una posición diferente a las posiciones de las mutaciones adicionales esenciales, la región que contiene la mutación adicional en una posición diferente a las posiciones de las mutaciones adicionales esenciales es de un aminoácido fuera del dominio catalítico (aminoácido números 98 a 445 de SEQ ID NO: 2), que se refiere a la actividad enzimática y los números de aminoácidos externos 765 a 923 de SEQ ID NO: 2, más preferiblemente la región de los aminoácidos números 37 a 97, 446 a 764, y 924 a 995 de SEQ ID NO: 2, y más preferiblemente la región de los aminoácidos números 37 a 97 y 924 a 995 de SEQ ID NO: 2.
En la presente invención, el aminoácido después de realizar la sustitución de la mutación adicional no está particularmente limitado siempre que la enzima mutante finalmente obtenida tenga la presente actividad enzimática y cualquiera de varios aminoácidos tales como aminoácidos naturales, aminoácidos sintetizados artificialmente y se pueden aminoácidos modificados de los mismos, pero el aminoácido es preferiblemente un aminoácido de origen natural, más preferiblemente un L-aminoácido de origen natural y más preferiblemente un aminoácido esencial. Los aminoácidos que se prefieren para el aminoácido mutante en una de las posiciones de mutaciones adicionales esenciales se ilustran a continuación.
El aminoácido mutante en H122 es preferiblemente un aminoácido (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) que tiene una estructura de cadena lateral pequeña, como las que disminuyen la interacción entre la posición y los aminoácidos circundantes, un aminoácido (Glu o Asp) que tiene una carga negativa en la cadena lateral, o un aminoácido (Leu, Ile, Pro, Met, Phe) que no tiene un grupo funcional altamente reactivo en la cadena lateral y más preferiblemente Ala o Phe.
El aminoácido mutante en D279 es preferiblemente un aminoácido (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) que tiene una estructura de cadena lateral pequeña o Gln y más preferiblemente Ser o Gln.
El aminoácido mutante en Y282 es preferiblemente un aminoácido (Arg, Lys, His) cuya cadena lateral es básica y más preferiblemente Arg.
El aminoácido mutante en Q303 es preferiblemente un aminoácido hidrófobo (Met, Pro, Leu) y más preferiblemente Leu.
El aminoácido mutante en Y348 es preferiblemente un aminoácido (His, Trp) que tiene una estructura de anillo en la cadena lateral y más preferiblemente His.
El aminoácido mutante en E350 es preferiblemente un aminoácido (Lys, Arg, His, Tyr, Gln, Asn) que tiene una cadena lateral grande capaz de formar un enlace de hidrógeno o un aminoácido (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) que tienen una estructura de cadena lateral pequeña, como las que disminuyen la interacción entre la posición y los aminoácidos circundantes, y más preferiblemente Ala, Asn, Asp o Gln.
El aminoácido mutante en Y402 es preferiblemente un aminoácido grande que tiene un anillo aromático en la cadena lateral, Phe o Trp.
El aminoácido mutante en D405 es preferiblemente un aminoácido (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) que tiene una estructura de cadena lateral pequeña, como las que disminuyen la interacción entre la posición y el aminoácido circundante y más preferiblemente Ala.
El aminoácido mutante en R406 es preferiblemente un aminoácido (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) que tiene una estructura de cadena lateral pequeña, como las que disminuyen la interacción entre la posición y el aminoácido circundante, o un aminoácido (Glu, Asp) que tiene una carga negativa en la cadena lateral, o un aminoácido (Gln, Asn) que tiene un grupo amida en la cadena lateral y más preferiblemente Ala o Gln.
La mutación en la posición de una mutación adicional esencial como se describe anteriormente puede estar sola o combinada con una mutación en la posición de otra mutación adicional esencial y/o una mutación en otra posición. La combinación de mutaciones en posiciones de mutaciones adicionales esenciales puede ser cualquier combinación, pero preferiblemente es una combinación que contiene una mutación al menos Q303, E350 o D405 y más preferiblemente una combinación que contiene al menos Q303L, E350A, E350N, E350Q o D405A.
Ejemplos de la combinación de mutaciones adicionales que contienen Q303L pueden incluir H122A/Q303L, H122F/Q303L, D279Q/Q303L, D279S/Q303L, Y282R/Q303L, Q303L/Y348H, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/Y402F, Q303L/Y402W, Q303L/D405A, y Q303L/R406Q.
Ejemplos de la combinación de mutaciones adicionales que contienen E350A pueden incluir H122A/E350A, H122F/E350A, D279Q/E350A, D279S/E350A, Y282R/E350A, Y348H/E350A, E350A/Y402F, E350A/Y402W, E350A/D405A, y E350A/R406Q.
Ejemplos de la combinación de mutaciones adicionales que contienen E350N pueden incluir H122A/E350N, H122F/E350N, D279Q/E350N, D279S/E350N, Y282R/E350N, Y348H/E350N, E350N/Y402F, E350N/Y402W, E350N/D405A, y E350N/R406Q.
Ejemplos de la combinación de mutaciones adicionales que contienen E350D pueden incluir H122A/E350D, H122F/E350D, D279Q/E350D, D279S/E350D, Y282R/E350D, Y348H/E350D, E350D/Y402F, E350D/Y402W, E350D/D405A, y E350D/R406Q.
Ejemplos de la combinación de mutaciones adicionales que contienen E350Q pueden incluir H122A/E350Q, H122F/E350Q, D279Q/E350Q, D279S/E350Q, Y282R/E350Q, Y348H/E350Q, E350Q/Y402F, E350Q/Y402W, E350Q/D405A, y E350Q/R406Q.
Ejemplos de la combinación de mutaciones adicionales que contienen D405A pueden incluir H122A/D405A, H122F/D405A, D279Q/D405A, D279S/D405A, Y282R/D405A, Y348H/D405A, Y402F/D405A, Y402W/D405A, o D405A/R406Q.
Las enzimas mutantes preferidas de la presente invención son D233Q/Q303L, EndoS D233Q/E350A, EndoS D233Q/E350N, EndoS D233Q/E350D, EndoS D233Q/E350Q, EndoS D233Q/D405A, EndoS D233Q/Q303L/E350A, EndoS D233Q/Q303L/E350N, EndoS D233Q/Q303L/E350D, EndoS D233Q/Q303L/E350Q, EndoS D233Q/Q303L/D405A, EndoS D233Q/E350A/D405A, EndoS D233Q/E350N/D405A, EndoS D233Q/E350D/D405A, EndoS D233Q/E350Q/D405A, o EndoS D233Q/Y402F, más preferiblemente EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/Q303L/E350Q, EndoS D233Q/Q303L/D405A, EndoS D233Q/E350A, o EndoS D233Q/Y402F.
<Gen, célula huésped, procedimiento de producción de enzimas>
La presente invención proporciona además un gen recombinante que codifica una enzima mutante de la presente invención que tiene una mutación adicional en EndoS D233Q, una construcción génica tal como un plásmido o un vector de expresión que comprende el gen recombinante, una célula huésped transformada con el constructo de gen, un procedimiento para producir la enzima mutante de la presente invención, que comprende la etapa de recolectar la enzima mutante de la presente invención a partir de un cultivo de la célula huésped, y similares. El gen recombinante, el constructo de gen, la célula huésped y similares se pueden preparar de acuerdo con técnicas de ingeniería genética conocidas basadas en las secuencias de aminoácidos de las enzimas mutantes de la presente invención.
Con respecto a un gen recombinante que codifica una enzima mutante de la presente invención, un polinucleótido tal como un ADNc que codifica una secuencia de aminoácidos que contiene una mutación adicional de interés se puede preparar basándose en la secuencia de nucleótidos de EndoS D233Q expuesta en los nucleótidos números 109 a 2985 (1 a 108 es la región que codifica el péptido señal) de SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica EndoS D233Q/Q303L es una secuencia de nucleótidos modificada a partir de la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótidos 109 a 2985 de SEQ ID NO: 3 sustituyendo los nucleótidos CAG en la posición 907 a 909 con CTG. Además, la secuencia de nucleótidos que codifica EndoS D233Q/E350A (N, Q) es una secuencia de nucleótidos modificada de la secuencia de nucleótidos de los números de nucleótidos 109 a 2985 de SEQ ID NO: 3 sustituyendo los nucleótidos GAA en la posición 1048 a 1050 con GCA (AAT en E350N y CAG en E350Q). Además, la secuencia de nucleótidos que codifica EndoS D233Q/D405A es una secuencia de nucleótidos modificada a partir de la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos números 109 a 2985 de SEQ ID NO: 3 sustituyendo los nucleótidos GAT en la posición 1213 a 1215 por GCA.
Las células hospedadoras (células, tales como células animales, células vegetales, Escherichia coli, levadura o similares, normalmente utilizadas para la producción de proteínas pueden seleccionarse según sea apropiado) transformadas mediante la introducción de un gen que codifica una enzima mutante de la presente invención se cultivan en condiciones apropiadas dependiendo del tipo de célula y la enzima mutante de la presente invención se puede recolectar del cultivo. La recolección de la enzima mutante se realiza combinando las técnicas de purificación habituales basadas en las propiedades físicas de la enzima, según corresponda. Para facilitar la recolección, el constructo de gen se puede diseñar para expresar la enzima mutante en una forma con un péptido marcador como GST conectado a la enzima mutante de antemano para hacer posible la recolección usando afinidad por el péptido marcador. El péptido marcador se puede eliminar después de la purificación, pero, cuando no tiene ningún efecto sobre la actividad enzimática, se puede usar una enzima mutante con el péptido marcador conectado al mismo para reacciones tales como remodelación de azúcar. Las enzimas mutantes de la presente invención incluyen aquellas enzimas que tienen una secuencia de aminoácidos que comprende la de un péptido marcador conectado a la misma.
<Remodelación de azúcar>
La presente invención proporciona un procedimiento de remodelación de azúcar de una cadena de azúcar unida a N297 en IgG o una molécula que comprende una región Fc usando una enzima mutante EndoS de la presente invención e IgG o una molécula que comprende una región Fc que tiene un cadena de azúcar enlazada a N297 que consiste en una estructura sustancialmente homogénea obtenida por la remodelación del azúcar.
El término "remodelación de azúcar" significa un procedimiento para producir IgG o una molécula que comprende una región Fc que tiene cadenas de azúcar unidas a N297 que tienen una estructura de cadena de azúcar homogénea derivada de un donante de azúcar produciendo primero moléculas aceptoras en las que están unidas a N297 las cadenas de azúcar de la molécula que comprende una región Fc, como IgG o un fragmento Fc o CLCH (que solo consta de la región constante) de IgG de un anticuerpo monoclonal particular, son cortadas excepto para un núcleo GlcNAc (una fucosa central puede ser añadido al mismo); y luego se transfiere una cadena de azúcar derivada de un donante de azúcar al núcleo GlcNAc de la molécula aceptora usando la actividad de transglicosilación de una enzima mutante EndoS de la presente invención.
La IgG, o molécula que comprende una región Fc utilizada en la remodelación del azúcar, puede ser una derivada de una cadena pesada de IgG, en la que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de IgG es la misma que la de la molécula original y se produce en una forma que tiene una cadena de azúcar unida a N297 y los procedimientos de producción de la misma no están limitados, pero también se puede usar la IgG producida por un procedimiento comúnmente conocido para producir un anticuerpo monoclonal, CLCH de la IgG, o un fragmento Fc obtenido por tratamiento enzimático del mismo. Además, una mezcla de muestras obtenidas por diferentes procedimientos de producción en diferentes lotes puede usarse como tal IgG o fragmento Fc.
Un procedimiento para preparar una molécula aceptora para usar en la remodelación de azúcar puede comprender preparar la molécula aceptora tratando la IgG o la molécula que comprende una región Fc descrita anteriormente con una ENGasa que mantiene la actividad de hidrolizar específicamente el enlace 1,4-glicosídico entre GlcNAc en la estructura central de la quitobiosa de la cadena de azúcar unida a N297. En este caso, como ENGasa, pueden usarse diversas enzimas que incluyen EndoA, EndoD, EndoE y EndoS, pero la ENGasa es preferiblemente EndoS de tipo salvaje.
Como donante de azúcar para utilizar en la remodelación de azúcar, se pueden emplear moléculas que tengan diversas estructuras de cadena de azúcar. Sin embargo, con el fin de usar el anticuerpo después de la remodelación como medicamento de anticuerpos, se prefiere emplear un donante de azúcar que tenga una estructura de cadena de azúcar humana, que sea similar o igual a la estructura de la cadena de azúcar que tienen los humanos o una estructura de la cadena de azúcar compatible con humanos. Los ejemplos representativos de un donante de azúcar de este tipo pueden incluir moléculas que tienen una estructura modificada de la estructura básica mencionada anteriormente de cadenas de azúcar unidas a N eliminando la GlcNAc del núcleo y oxazolinizando la segunda GlcNAc del terminal reductor y el donante de azúcar es preferiblemente SG-Oxa que consiste en la estructura ilustrada en la Figura 1.
Como condiciones de reacción para la reacción de hidrólisis en la remodelación del azúcar, se pueden emplear las de los procedimientos comúnmente conocidos para EndoS. La reacción se lleva a cabo en una solución tampón, que puede seleccionarse, según corresponda, de las soluciones tampón utilizadas en las reacciones enzimáticas habituales: como una solución tampón de citrato (pH 3,5-5,5), una solución tampón de acetato (pH 4,5-6,0), una solución tampón de fosfato (pH 6,0-7,5), una solución tampón MOPS-NaOH (pH 6,5-8,0) y una solución tampón Tris-HCl (pH 7,0-9,0). Una solución tampón preferida es una solución tampón Tris-HCl (pH 7,0-9,0). A la solución de reacción, se puede agregar un aditivo que no inhiba la reacción enzimática con el fin de estabilizar la enzima, pero no es necesario.
La temperatura de reacción puede seleccionarse en el intervalo de 10°C a 50°C según sea apropiado, pero la temperatura preferible es de 25°C a 38°C.
El tiempo de reacción puede seleccionarse según sea apropiado en el intervalo de 10 minutos a 96 horas, pero el final de la reacción puede determinarse recogiendo pequeñas cantidades de la solución de reacción a lo largo del tiempo y confirmando el grado de progreso de la hidrólisis. En general, el grado de progreso de la reacción de hidrólisis de la cadena de azúcar se puede controlar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), sistemas electroforéticos completamente automáticos, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) o similares. En esta patente, un anticuerpo disponible comercialmente o un anticuerpo remodelado con azúcar se fragmentó en cadenas pesadas y ligeras y luego se examinaron con un sistema electroforético completamente automático para confirmar que solo la cadena pesada, a la que se agregaron cadenas de azúcar unidas a N297, estaba cambiado en el tiempo de retención.
Las condiciones de reacción para la transglicosilación en la remodelación del azúcar pueden seleccionarse según sea apropiado basándose en las condiciones conocidas para otras enzimas.
La reacción se realiza en una solución tampón y tal tampón es preferiblemente uno que no promueva la degradación de SG-Oxa y se puede seleccionar de una solución tampón fosfato (pH 6,0-7,5), una solución tampón MOPS-NaOH (pH 6,5-8,0) y una solución tampón Tris-HCl (pH 7,0-9,0) según corresponda. Un tampón preferido es una solución tampón Tris-HCl (pH 7,0-9,0). En la solución de reacción, se puede agregar un aditivo que no inhiba la reacción enzimática con el fin de estabilizar la enzima, pero no es necesario.
La temperatura de reacción puede seleccionarse en el intervalo de 10°C a 50°C según sea apropiado, pero la temperatura preferible es de 25°C a 38°C.
El tiempo de reacción puede seleccionarse según sea apropiado en el rango de 10 minutos a 96 horas, pero el final de la reacción puede determinarse recolectando pequeñas cantidades de la solución de reacción a lo largo del tiempo y confirmando el grado de progreso de la reacción de transglicosilación. En general, el grado de progreso de la reacción de transglicosilación se puede controlar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), sistemas electroforéticos completamente automáticos, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) o similares. En esta patente, un anticuerpo disponible comercialmente o un anticuerpo remodelado con azúcar se fragmentó en cadenas pesadas y ligeras y luego se examinaron con un sistema electroforético completamente automático para confirmar que solo la cadena pesada, a la que se agregaron cadenas de azúcar unidas a N297, estaba cambiado en el tiempo de retención.
Ejemplos
La presente invención se describe específicamente con referencia a los ejemplos siguientes. La descripción en los Ejemplos es un ejemplo de realizaciones de la presente invención y la presente invención no se limita a las mismas. El ejemplo 1 es un ejemplo de preparación de enzimas mutantes EndoS utilizadas en la presente invención. El ejemplo 2 es un ejemplo de producción del donante de azúcar utilizado en la presente invención. El ejemplo 3 es un ejemplo de preparación de la molécula aceptora usada para medir la actividad de transglicosilación. El ejemplo 4 es un ejemplo de medición del porcentaje de hidrólisis por las enzimas mutantes EndoS de la presente invención y un ejemplo de medición del porcentaje de transglicosilación por las enzimas mutantes EndoS de la presente invención. Las concentraciones de proteína descritas en el presente documento se cuantificaron con un ultramicroespectrofotómetro NanoDrop 1000 (un producto fabricado por Thermo Fisher Scientific) o NanoDrop 2000 (un producto fabricado por Thermo Fisher Scientific).
La masa de anticuerpos remodelados con azúcar ((Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab y SG-Trastuzumab) se confirmó mediante el siguiente procedimiento. Los anticuerpos remodelados con azúcar se fragmentaron en cadenas pesadas y ligeras y luego sus picos se separaron con una columna analítica y se analizaron por espectrometría de masas. Los aparatos utilizados fueron a Cu ITY UPLC (un producto de Waters), SYNAPT G2-S (Waters) y columna BEH Phenyl (1,7 pm, 1,0 * 50 mm), la fase móvil utilizada fue acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,05% en un gradiente cambiante del 25% al 35% en 3 minutos, y el análisis se llevó a cabo a un caudal de 0,34 pl/min a 80°C. <Ejemplo 1> Preparación de la solución de reacción de enzimas mutantes EndoS
(1-1) Diseño de enzimas mutantes EndoS
Se diseñaron mutantes de EndoS que se consideró que lograban la actividad de hidrólisis suprimida mientras mantenían la actividad de transglicosilación de EndoS D233Q mediante la introducción de una mutación o mutaciones en EndoS D233Q. Basado en la información de estructura 3D (ID de PDB: 4NUY) de EndoS, el dominio catalítico de EndoS se dividió en 3 grupos de sitios: sitios que se predice que estarán involucrados en el reconocimiento de cadenas de azúcar, sitios en las cercanías del centro activo y sitios que se predice que están involucrados en el reconocimiento de anticuerpos. Se introdujeron mutaciones en los sitios. Los 6 residuos H122, Y348, E350, Y402, D405 y R406 se seleccionaron como los sitios que se predice que estarían involucrados en el reconocimiento de cadenas de azúcar y las enzimas se diseñaron de tal manera que la interacción formada por los residuos de aminoácidos descritos anteriormente debería cortarse o tal que los residuos de aminoácidos que tienen una cadena lateral grande entre los aminoácidos seleccionados deben sustituirse por residuos de aminoácidos que tienen una cadena lateral pequeña para que el recambio del acoplamiento y la disociación de la cadena de azúcar sea eficaz. Se seleccionaron P184, D279 y Q303 como sitios en las proximidades del centro activo y se diseñaron mutaciones para sustituirlos con una amplia variedad de aminoácidos, incluidos los que tienen propiedades similares al residuo de aminoácidos de tipo salvaje o los que tienen propiedades diferentes del residuo de aminoácido de tipo salvaje. Y282 se selecciona como uno de los sitios que se predice que participarán en el reconocimiento de anticuerpos y se diseñó una mutación para sustituir el residuo de aminoácido con un aminoácido básico con el fin de fortalecer la interacción con la carga negativa cerca de Asn 297 a la que pertenecen las cadenas de azúcar de los anticuerpos. Las enzimas mutantes expuestas en la Tabla 2 se diseñaron en los 3 sitios descritos anteriormente o en consideración de mutaciones combinadas entre los 3 sitios.
(1-2) Expresión de enzimas mutantes EndoS
Se transformó Escherichia coli añadiendo 3 pl de un plásmido (pGEX4T3, 50 pg/pl) para la expresión de la proteína que contiene un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de cada una de las enzimas mutantes EndoS diseñadas en base a (1-1) anterior para 50 pL de cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) enfriada con hielo que tiene una competencia de 107 ufc/pl y se calienta la mezcla a 37°C durante 40 segundos. Estas células de Escherichia coli se cultivaron durante la noche en medio de agar LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina y las colonias obtenidas al día siguiente se recogieron y cultivaron con agitación en 1 l de medio TB que contenía 100 pg/ml de ampicilina a 37°C hasta sobredosis 600 alcanzó 0,8. Después de O.D. 600 aumentó, la temperatura de cultivo se redujo a 16°C y 1 hora más tarde se añadió isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,1 mM para inducir la expresión de la enzima mutante EndoS durante la noche. Al día siguiente, las células se recolectaron centrifugando el cultivo líquido a 5000 * G durante 10 minutos y se agregaron 50 ml de tampón PBS con 40 U/ml de DNasa I y 0,5 mg/ml de lisozima para resuspender las células. Las células se rompieron sonicando la suspensión bacteriana obtenida y se centrifugaron a 20000 x g durante 30 minutos para obtener la enzima mutante EndoS diana en la fracción soluble.
(1-3) Purificación de enzimas mutantes EndoS
Las fracciones solubles de las enzimas mutantes EndoS obtenidas en (1-2) anteriormente se filtraron a través de una membrana de PVDF que tenía un tamaño de poro de 0,45 pm y las soluciones después de la filtración se purificaron mediante el proceso de 2 pasos mediante cromatografía de afinidad de glutatión y cromatografía de filtración en gel.
En primer lugar, se aplicaron las cantidades totales de las fracciones solubles de las enzimas mutantes EndoS filtradas a través de la membrana de PVDF a una columna de glutatión sefarosa 4B equilibrada con PBS y la columna se lavó con 3 o más volúmenes de columna de tampón PBS. Posteriormente, la enzima mutante EndoS fusionada con GST se eluyó con tampón PBS que contenía glutatión 10 mM en forma reducida y se concentró por ultrafiltración (Amicon Ultra-1530K). Después de la concentración, el concentrado se separó en una columna HiLoad 26/60 Superdex de 200 pg (GE Healthcare Bioscience) equilibrada con PBS para eliminar el glutatión usado para la elución y obtener la muestra purificada final. Los rendimientos de las enzimas mutantes EndoS preparadas de esta manera se muestran en la Tabla 2.
Las soluciones de enzima mutante EndoS obtenidas se prepararon a 2 mg/ml y se utilizaron para medir las actividades de hidrólisis y transglicosilación.
[Tabla 2]
Figure imgf000014_0001
continuación
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<Ejemplo 2> Preparación de la solución de reacción de SG-Oxa
(compuesto de la estructura en la Figura 1)
El SG-Oxa utilizado como donante de azúcar en los siguientes Ejemplos se produjo mediante el siguiente proceso. Una solución acuosa (520 jl) de cloruro de 2-cloro-1,3-dimetil-1H-bencimidazol-3-io (CDMBI) (un producto fabricado por FUSHIMI Pharmaceutical Co., Ltd.) (53,7 mg, 245 jmol) a disialooctasacárido (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 100 mg, 49,5 jmol). A la solución de reacción, después de enfriar en hielo, se le añadió una solución acuosa (520 jl) de fosfato tripotásico (158 mg, 743 jmol) y la mezcla se agitó en hielo durante 2 horas. La solución de reacción obtenida se ultrafiltró con Amicon Ultra (Ultracel 30K, un producto fabricado por Merck Millipore) para eliminar materiales sólidos. El filtrado se purificó mediante cromatografía de filtración en gel. El aparato utilizado fue Purif-Rp2 (producto fabricado por Shoko Scientific Co., Ltd.), la columna utilizada fue Desalinización HiPrep 26/10 (producto fabricado por GE Healthcare), la fase móvil utilizada fue una solución acuosa de NH3 al 0,03% solución, el caudal fue de 10 ml/min y el volumen de la fracción fue de 10 ml. Las fracciones que contenían el producto objetivo de acuerdo con la detección UV (220 nm) durante la elución se agruparon, se añadió una solución acuosa 0,1 N de hidróxido de sodio (100 jl) a la agrupación y la mezcla se liofilizó para obtener el SG objetivo Oxa como un sólido incoloro (87,0 mg, 43,4 jmol, 88% de rendimiento).
A partir del gráfico de RMN del compuesto obtenido, se confirmó que era el compuesto diana (HELVETICA CHIMICA ACTA, 2012, 95, 1928-1936).
A la solución tampón tris 50 mM de SG-Oxa (1,19 mg) (pH 7,4) (23,8 jl) obtenida se le añadió para preparar una solución SG-Oxa 50 mg/ml (solución tampón tris 50 mM pH 7,4). Esto se usó para medir la actividad de transglicosilación.
<Ejemplo 3> Preparación de (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab
Se produjo (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab para ser usado como molécula aceptora en la reacción de transglicosilación mediante el siguiente proceso.
Se añadió una solución de EndoS de tipo salvaje (PBS) de 1,18 mg/ml (10 jl) a una solución de Trastuzumab (un producto elaborado por Genentech) de 11,3 mg/ml (solución tampón tris 50 mM pH 8,0) (2 ml) y la mezcla se incubó a 30°C durante 5 horas. El progreso de la reacción se confirmó usando la estación de electroforesis Experion. Una vez finalizada la reacción, se realizó la purificación por cromatografía de afinidad y la purificación con una columna de hidroxiapatita.
(1) Purificación con columna de afinidad
Aparato de purificación: AKTA avant 25 (un producto fabricado por GE Healthcare)
Columna: columna HiTrap Protein A HP (5 ml) (un producto fabricado por GE Healthcare)
Caudal: 5 ml/min (1 ml/min en el momento de la carga)
En el momento de la unión a la columna, la solución de reacción obtenida como se describe anteriormente se añadió a la parte superior de la columna, se corrió 1 CV del tampón de unión (solución tampón de fosfato 20 mM (pH 7,0)) a 1 ml/min, y se corrieron 5 CV adicionales a 5 ml/min. En el momento del lavado intermedio, se procesaron 15 CV de la solución de lavado (solución tampón de fosfato 20 mM (pH 7,0), solución de cloruro de sodio 0,5 M). En el momento de la elución, se procesaron 6 CV del tampón de elución (tampón ImmunoPure IgG Eution, un producto elaborado por PIERCE). El eluido se neutralizó inmediatamente con solución tampón tris 1 M (pH 9,0). Las fracciones detectadas por detección UV (280 nm) durante la elución se examinaron con el ultramicrospectrofotómetro NanoDrop 1000 (un producto fabricado por Thermo Fisher Scientific) y la estación de electroforesis Experion (un producto fabricado por BIO-RAD).
Las fracciones que contenían la diana se concentraron con Amicon Ultra (Ultracel 30K, un producto fabricado por Merck Millipore) y tampón (solución tampón fosfato 5 mM, solución 50 mM de ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES), pH 6,8).
(2) Purificación con columna de hidroxiapatita
Aparato de purificación: AKTA avant25 (un producto fabricado por GE Healthcare)
Columna: Cartucho Bio-Scale Mini CHT Tipo I (5 ml) (un producto fabricado por BIO-RAD)
Caudal: 5 ml/min (1 ml/min en el momento de la carga)
La solución obtenida en (1) anterior se añadió a la parte superior de la columna y se procesaron 4 CV de Solución A (solución tampón fosfato 5 mM, ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) 50 mM, pH 6,8). A continuación, se llevó a cabo la elución usando la Solución A y la Solución B (solución tampón fosfato 5 mM, ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) 50 mM, pH 6,8, solución 2 M de cloruro de sodio). Las condiciones de elución fueron Solución A: Solución B = 100: 0 a 0: 100 (15 CV).
Las fracciones detectadas por detección UV (280 nm) durante la elución se examinaron con el ultramicrospectrofotómetro NanoDrop 1000 (un producto fabricado por Thermo Fisher Scientific) y la estación de electroforesis Experion™ (BIO-RAD).
Las fracciones que contenían la diana se concentraron usando Amicon Ultra (Ultracel 30K, un producto fabricado por Merck Millipore) y se realizó un intercambio de tampón a una solución tampón de fosfato 50 mM (pH 6,0) para obtener una solución 9,83 mg/ml de (Fuca1,6)GlcNAc-Trastuzumab (solución tampón de fosfato, pH 6,0) (1,8 ml). LC-MS:
calculado para la cadena pesada de (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab, M = 49497,86 encontrado (m/z), 49497 (datos de desconvolución).
calculado para la cadena ligera de (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab, M = 23439,1, encontrado (m/z), 23439,1 (datos de desconvolución).
<Ejemplo 4> Medición de las actividades de hidrólisis y transglicosilación de enzimas mutantes EndoS (pH 7,4)
(4-1) Medición de la actividad de hidrólisis
La actividad de hidrólisis de las enzimas mutantes EndoS en cadenas de azúcar unidas a N297 de Trastuzumab disponible comercialmente se midió como sigue. En la Figura 2 se ilustra una vista esquemática de la reacción de hidrólisis.
Se preparó una solución de Trastuzumab de 20 mg/ml para usar como solución de sustrato para la reacción de hidrólisis como sigue. Se añadió agua destilada de Otsuka (10 ml) a una solución tampón tris 100 mM (pH 7,4, un producto elaborado por CALBIOCHEM) (10 ml) para preparar una solución tampón tris 50 mM (pH 7,4) (40 ml). A Trastuzumab disponible comercialmente (440 mg/vial, un producto fabricado por Genentech), se añadió el líquido de solubilización (20 ml) unido al mismo para preparar una solución de Trastuzumab (aproximadamente 21 mg/ml). Se realizó una ultrafiltración de la solución de trastuzumab (aproximadamente 21 mg/ml) (2 ml) con Amicon Ultra (Ultracel 30K, un producto fabricado por Merck Millipore) para desplazar el disolvente con una solución tampón tris 50 mM de pH 7,4 preparada como se describe anteriormente y obtener la solución de Trastuzumab a 20 mg/ml (solución tampón tris 50 mM pH 7,4).
A la solución de sustrato (25 pl) preparada como se describió anteriormente, se le añadió la solución de EndoS D233Q 2,0 mg/ml (5 pl) preparada en el Ejemplo 1 y la mezcla se incubó a 30°C durante 48 horas. 1, 2, 4, 8, 24 y 48 horas después del inicio de la reacción, se recogió una porción de esta solución de reacción y se midió el grado de progreso de la reacción utilizando una estación de electroforesis Experion (TM) (BIO- RAD). Para la medición, se prepararon muestras de medición de acuerdo con el protocolo adjunto al aparato. En este proceso, la solución de reacción recogida se expone a una solución que contiene ditiotreitol y se calienta a 95°C durante 5 minutos y la reacción de hidrólisis se detiene inmediatamente.
Las muestras de medición obtenidas se transfirieron a los chips Experion (TM) Pro260 y se midieron de acuerdo con el protocolo adjunto a una estación de electroforesis Experion (TM) (BIO-RAD). A partir del cromatograma obtenido, el sustrato sin reaccionar y el producto hidrolizado se confirmaron como picos separados. A partir de la relación de las áreas de los picos del sustrato sin reaccionar y el producto hidrolizado, se calculó el porcentaje de hidrólisis mediante la siguiente fórmula de cálculo.
Porcentaje de hidrólisis (%) = [área del pico de la cadena H derivada de (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab] /{[área de pico de la cadena H derivada de Trastuzumab comercialmente disponible] [área de pico de la cadena H derivada de (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab]]} x l0o
De manera similar, se calculó el porcentaje de hidrólisis de las otras enzimas mutantes EndoS preparadas en el Ejemplo 1 en cada tiempo de reacción (Tabla 3).
(4-2) Medición de la actividad de transglicosilación
La actividad de transglicosilación de las enzimas mutantes EndoS producidas en el Ejemplo 1 se midió mediante el siguiente procedimiento. El SG-Oxa preparado en el Ejemplo 2 y (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab preparado en el Ejemplo 3 se utilizaron como molécula donadora y aceptora de azúcar, respectivamente. En la Figura 3 se ilustra una vista esquemática de la reacción de transglicosilación.
A partir de la solución de 9,83 mg/ml (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab (solución tampón fosfato, pH 6,0) preparada en el Ejemplo 3, una solución de 20 mg/ml (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab (solución tampón tris 50 mM pH 7,4) se preparó de acuerdo con un procedimiento similar a la preparación de la solución de sustrato como se describe en (4­ 1). A la solución de 20 mg/ml (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab (solución tampón tris 50 mM pH 7,4), la solución SG-Oxa 50 mg/ml (solución tampón tris 50 mM pH 7,4) (1,07 pl) preparada en el 2 y se añadieron 2,0 mg/ml de solución de EndoS D233Q (8 pl) preparada en el Ejemplo 1 y la mezcla se incubó a 30°C durante 48 horas. En los puntos de tiempo 1, 2, 4, 8, 24 y 48 horas después del inicio de la reacción, se recogió una porción de esta solución de reacción y se midió el grado de progreso de la reacción usando una estación de electroforesis Experion (TM). Para la medición, se prepararon muestras de medición de acuerdo con el protocolo adjunto al aparato. En este proceso, la solución de reacción recogida se expone a una solución que contiene ditiotreitol y se calienta a 95°C durante 5 minutos y la reacción de transglicosilación se detiene inmediatamente.
Las muestras de medición obtenidas se transfirieron a los chips Experion (TM) Pro260 y se midieron de acuerdo con el protocolo adjunto a una estación de electroforesis Experion (TM) (BIO-RAD). A partir del cromatograma obtenido, se confirmó que el sustrato sin reaccionar y el producto de transglicosilación eran picos separados. A partir de la relación de las áreas de los picos del sustrato sin reaccionar y el producto de transglicosilación, se calculó el porcentaje de transglicosilación mediante la siguiente fórmula de cálculo
.Porcentaje de transglicosilacion (%) = [área del pico de la cadena H derivada de SG-trastuzumab]/ {[área de pico de la cadena H derivada de (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab] [área de pico de la cadena H derivada de SG-Trastuzumab]} x 100
De manera similar, se calculó el porcentaje de transglicosilación de las otras enzimas mutantes EndoS preparadas en el Ejemplo 1 en cada tiempo de reacción (Tabla 3).
Se purificó SG-Trastuzumab, que es un producto de transglicosilación, mediante un procedimiento similar a la purificación de (Fuca1,6) GlcNAc-Trastuzumab en el Ejemplo 3. Los datos obtenidos del análisis LC-MS de SG-Trastuzumab se muestran a continuación.
calculado para la cadena pesada de SG-Trastuzumab, M = 51500,6 Da; encontrado (m/z), 51501 (datos de desconvolución).
calculado para la cadena ligera de SG-Trastuzumab, M = 23439,1 Da, encontrado (m/z), 23439 (datos de desconvolución).

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una enzima mutante EndoS de acuerdo con uno de los siguientes:
1) una enzima mutante EndoS que comprende una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos números 37 a 995 de SEQ ID NO: 2 con una o más mutaciones en al menos una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consta de: aminoácido 122 (H122), aminoácido 279 (D279), aminoácido 282 (Y282), aminoácido 303 (Q303), aminoácido 348 (Y348), aminoácido 350 (E350), aminoácido 402 (Y402), aminoácido 405 (D405), y aminoácido 406 (R406), y que presenta una actividad de hidrólisis reducida en comparación con la actividad de EndoS D233Q, siendo la actividad una actividad en una cadena de azúcar unida a N (cadena de azúcar unida a N297) unida a Asn en la posición 297 en IgG; o
2) una enzima mutante EndoS de acuerdo con 1) en la que se sustituyen, eliminan, insertan y/o añaden de
1 a 20 aminoácidos en posiciones distintas a las posiciones de los aminoácidos números 98 a 445 y 765 a 923 de SEQ ID NO: 2;
en la que la enzima mutante EndoS de acuerdo con 1) o 2) tiene actividad de transglicosilación a un nivel equivalente o superior al de EndoS D233Q.
2. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 1,
en la que las mutaciones están en 1 a 4 posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: H122, D279, Y282, Q303, Y348, E350, Y402, D405 y R406.
3. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 1,en la que la mutación es una mutación en una posición de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: Q303, E350 y D405.
4. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,
en la que la mutación es al menos una seleccionada del siguiente grupo:
una mutación en H122 en los aminoácidos: Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro,
Figure imgf000033_0001
Ala, Glu, Asp, Leu, Ile, Met o Phe; una mutación en D279 en los aminoácidos: Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala o Gln;
una mutación en Y282 en los aminoácidos: Arg, Lys o His;
una mutación en Q303 en los aminoácidos: Met, Pro o Leu;
una mutación en Y348 en los aminoácidos: His o Trp;
una mutación en E350 en los aminoácidos: Lys, Arg, His, Tyr, Gln, Asn, Asp, Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro o Ala;
una mutación en Y402 en los aminoácidos: Phe o Trp;
una mutación en D405 en los aminoácidos: Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro
Figure imgf000033_0002
o Ala; y
una mutación en R406 en los aminoácidos: Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala, Glu, Asp, Gln o Asn.
5. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 4,
en la que la mutación es al menos una seleccionada del siguiente grupo:
una mutación en H122 a Ala (H122A) o Phe (H122F);
una mutación en D279 a Ser (D279S) o Gln (D279Q);
una mutación en Y282 a Arg (Y282R);
una mutación en Q303 a Leu (Q303L);
una mutación en Y348 a His (Y348H);
una mutación en E350 a Ala (E350A), Asn (E350N), Asp (E350D) o Gln (E350Q);
una mutación en Y402 a Phe (Y402F) o Trp (Y402W);
una mutación en D405 a Ala (D405A); y
una mutación en R406 a Gln (R406Q).
6. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q y D405A como mutación.
7. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 6,
en la que la mutación es Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q, D405A,
H122A/Q303L, H122F/Q303L, D279Q/Q303L, D279S/Q303L, Y282R/Q303L, Q303L/Y348H, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/Y402F, Q303L/Y402W, Q303L/D405A, Q303L/R406Q, H122A/E350A, H122F/E350A, D279Q/E350A, D279S/E350A, Y282R/E350A, Y348H/E350A, E350A/Y402F, E350A/Y402W, E350A/D405A, E350A/R406Q,
H122A/E350N, H122F/E350N, D279Q/E350N, D279S/E350N, Y282R/E350N, Y348H/E350N, E350N/Y402F, E350N/Y402W, E350N/D405A, E350N/R406Q,
H122A/E350D, H122F/E350D, D279Q/E350D, D279S/E350D, Y282R/E350D, Y348H/E350D, E350D/Y402F, E350D/Y402W, E350D/D405A, E350D/R406Q,
H122A/E350Q, H122F/E350Q, D279Q/E350Q, D279S/E350Q, Y282R/E350Q, E350Q/Y348H, E350Q/Y402F, E350Q/Y402W, E350Q/D405A, E350Q/R406Q,
H122A/D405A, H122F/D405A, D279Q/D405A, D279S/D405A, Y282R/D405A, Y348H/D405A, o D405A/R406Q.
8. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 7,
en la que la mutación es Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q, D405A, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/D405A, E350A/D405A, E350N/D405A, E350D/D405A, o E350Q/D405A.
9. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 4,
en la que la mutación es H122A, H122F, D279Q, D279S, Y282R, Y348H, Y402F, Y402W, o R406Q.
10. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 1,
en la que la actividad en la cadena de azúcar unida a N297 mantiene una tasa de hidrólisis del 50% o menos en una reacción de hidrólisis en una solución de reacción a pH 7,4 después de 24 horas.
11. La enzima mutante EndoS de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la enzima mutante EndoS exhibe además una actividad en la cadena de azúcar unida a N297 que conduce a un porcentaje de transglicosilación de aproximadamente 60% o más después de 48 horas de una reacción de transglicosilación con 5 equivalentes de un donante de azúcar en relación con una molécula aceptora que comprende la cadena de azúcar enlazada a N297, en una solución de reacción a pH 7,4.
12. Un polinucleótido que codifica una enzima mutante EndoS de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Un vector que comprende un nucleótido complementario al polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 12.
14. Una célula huésped transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 13.
15. Un procedimiento de producción de una molécula que comprende una región Fc remodelada con azúcar, que comprende hacer reaccionar una molécula que comprende una región Fc de IgG que tiene un GlcNAc central opcionalmente con adición de fucosa como una cadena de azúcar unida a N297 con un donante de azúcar que tiene una estructura que comprende una GlcNAc oxazolinizada en presencia de una enzima mutante EndoS de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para producir una molécula que comprende una región Fc con una cadena de azúcar unida a N297 que tiene una estructura en la que se transfiere una cadena de azúcar que posee el donante de azúcar al núcleo GlcNAc de la cadena de azúcar unida a N297.
16. El procedimiento de producción de acuerdo con la reivindicación 15,
en el que la molécula que comprende una región Fc es un anticuerpo monoclonal igG.
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