TW201708540A - 新穎ＥｎｄｏＳ變異酵素 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供一種EndoS變異酵素、編碼其之基因等，而該EndoS變異酵素之特徵為於EndoS D233Q之胺基酸序列進一步具有特定的追加變異，且作為對於鍵結於IgG的第297個之Asn的N鍵結型糖鏈(N297鍵結糖鏈)之活性，與EndoS D233Q之活性比較而顯示經降低的水解活性。

Description

新穎EndoS變異酵素
本發明係有關於內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶S(EndoS)的新穎變異體、編碼該變異體之基因、重組質體、藉由該質體而被轉形之轉形體、使用該變異體之抗體的糖鏈修飾方法。
醣蛋白質係廣泛地存在於動植物的組織、真核微生物的細胞膜、壁等。近年，逐漸明瞭醣蛋白質的糖鏈係於細胞的分化、癌化、細胞間的辨識等之機制擔任重要的任務，且為了解釋其機制而關於糖鏈的結構與機能之關聯，研究係正在進展中。於培養細胞系中，醣蛋白質係被轉譯為包含均勻的胺基酸序列之蛋白質，然後藉由轉譯後修飾而加成糖鏈，於培養液中生產。此轉譯後修飾由於並非對應於胺基酸序列而被無歧異地決定者，即使是於同一個培養系表現之同一個蛋白質，被加成之糖鏈的結構亦為多樣。
抗體係具有鍵結於位於重鏈分子中之Fc區域的第297個之Asn側鏈的N鍵結型糖鏈(N297鍵結糖鏈)之醣蛋白分子。抗體係於基礎研究或醫療領域中重要的分子，尤其是作為抗體醫藥之研究開發係被熱絡地進 行，而逐漸明瞭糖鏈之各式各樣的影響(非專利文獻1：J. N. Arnold et al., Annu. Rev. Immunol, 2007, 25, 21050)。現在，主要所使用的醫療用抗體係IgG級之分子，如此的抗體係一般而言使用以CHO細胞或NS0細胞代表的培養動物細胞而產生，以此等動物細胞所產生之抗體的N297鍵結糖鏈係雙觸角(biantennary)複合型糖鏈，但核心岩藻醣(core fucose)或末端的唾液基(sialyl)或半乳糖基以及於平分型(bisecting)GlcNAc中則會取得不均勻者(非專利文獻2：R. Jerfferis, Biotechnol. Prog., 2005, 21-11-6)。已逐漸明瞭抗體的N297鍵結糖鏈係大幅影響包含ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性，Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity)或CDC之效應子活性(effector activity)(非專利文獻3：Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34-47、非專利文獻4：Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 226-234)，而被指摘對血中半衰期亦造成影響之可能性(非專利文獻5：D.Bumbaca, AAPSJ, 2012, 14, 3)。又，已明瞭N297鍵結糖鏈的非還原末端被2,6-唾液基化之抗體為IVIG之主要藥效成分(非專利文獻6：Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110- 122)。又，認為於IgG或含Fc片段之醫療用分子中，N297鍵結糖鏈的不均勻性係對於作為有效成分之性質或品質會造成大的影響，無法否定不均勻的糖鏈修飾分子之微量的混入會大幅改變最終產物之特性的可能性。
由於如此之現狀，於醫療用的抗體或含抗體Fc區域之醣蛋白分子的製造中，使糖鏈均勻化之技術係被逐漸開發。作為使加成於醣蛋白質之糖鏈均勻的方法，已知使用了酵素的醣基轉移(transglycosylation)反應(非專利文獻6：Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110-122、非專利文獻7：Wang, Trends Glycosci. Glycotechnol. 2011, 23, 33- 52.)。這是包含在活體外(in vitro)環境之糖鏈的切斷(水解反應)與其他糖鏈的縮合(醣基轉移反應)之多階段程序。尤其是以N型糖鏈的轉換為目的之情況，是使用被稱為內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶的一群的酵素家族(family)。作為此酵素的特性，而要求有1)作為基質專一性而具有進行對於複合型糖鏈之水解反應的能力、及2)具有進行對於特定的結構之醣基轉移反應的能力。內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶係由各式各樣的種被分離，並因應作為基質之糖鏈的種類而適當使用野生型或變異體。於糖鏈均勻化之目的使用EndoA(來自Arthrobacter protophormiae的酵素)(非專利文獻8：Takegawa, Biochem Int. 1991 Jul; 24(5): 849-55)、EndoD(來自Streptococcus pneumoniae的酵素)(非專利文獻9：Fan, J Biol Chem. 2012 Mar 30; 287(14): 11272-81)、EndoM(來自Mucor hiemalis的酵素)(非專利文獻10：Umekawa, Biochem Biophys Res Commun. 1994 Aug 30; 203(1): 244-52)、EndoH(非專利文獻11：Robbins, J Biol Chem. 1984 Jun 25; 259(12): 7577-83)、EndoF2(來自Flavobacterium Meningosepticum的酵素)(非專利文獻 12：Huang, Chembiochem. 2011 April 11; 12(6): 932-941)、EndoE(來自Enterococcus faecalis的酵素)(非專利文獻13：Collin, JBC 2004, 279-21)及EndoS(來自Streptococcus pygenes的酵素)(非專利文獻14：Collin, EMBO J. 2001 Jun 15; 20(12): 3046-55)等，但其中以具有核心岩藻醣之複合型的N297鍵結糖鏈為基質，且可確認兼具水解活性與醣基轉移活性之酵素僅有EndoS(非專利文獻15：Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3.；非專利文獻16：Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030-8033)。
進一步於EndoS中，已知2個的觸媒殘基之第233個的Asp與第235個的Glu之中，於導入有將親核觸媒殘基之第233個的Asp取代為Gln之變異的EndoS D233Q中，水解活性係被某程度抑制。已知此變異體，在將糖鏈的還原末端唑啉化之中間物於反應系統中大量地存在之條件下，醣基轉移反應係選擇性地進行(非專利文獻17：Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318、專利文獻1：WO 2013/120066 A1、非專利文獻18：B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol111, No.18, pp6714-6719))。又，被分類為EndoS之酵素的序列有報告許多即使是pyogenes種之中也由不同的品系來自不同的血清型之序列。尤其是來自血清型M49的EndoS2(非專利文獻19：Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1; 455(1):107-18，有時被稱為EndoS49)，係有報告具有同樣的基質特性。
但是，此等習知的EndoS或EndoS D233Q等之變異酵素的活性，並非於以工業規模進行醫療用抗體之糖鏈重塑(remodeling)上為充分之物，冀求使更有效率的糖鏈重塑成為可能之技術改良。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 WO 2013/120066 A1小冊子
非專利文獻
非專利文獻1 J. N. Arnold et al., Annu. Rev. Immunol, 2007, 25, 21050
非專利文獻2 R. Jerfferis, Biotechnol. Prog., 2005, 21-11-6
非專利文獻3 Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34-47
非專利文獻4 Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 226-234
非專利文獻5 D. Bumbaca, AAPSJ, 2012, 14, 3
非專利文獻6 Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110-122
非專利文獻7 Wang, Trends Glycosci. Glycotechnol. 2011, 23, 33-52
非專利文獻8 Takegawa, Biochem Int. 1991 Jul; 24(5):849-55
非專利文獻9 Fan, J Biol Chem. 2012 Mar 30; 287(14):11272-81
非專利文獻10 Umekawa, Biochem Biophys Res Commun. 1994 Aug 30; 203(1):244-52
非專利文獻11 Robbins, J Biol Chem. 1984 Jun 25; 259(12):7577-83
非專利文獻12 Huang, Chembiochem. 2011 April 11; 12(6): 932-941
非專利文獻13 Collin, JBC 2004, 279-21
非專利文獻14 Collin, EMBO J. 2001 Jun 15; 20(12):3046-55
非專利文獻15 Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3.;
非專利文獻16 Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030-8033
非專利文獻17 Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318
非專利文獻18 B. Trastoy et al., PNAS(2014)vol111, No.18, pp6714-6719)
非專利文獻19 Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1; 455(1):107-18
[發明之概要]
本發明係以提供一種與已知為具有對於IgG之Fc區域的糖鏈之專一性的內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶、EndoS之水解活性經抑制的變異體EndoS D233Q比較，其水解活性更為減低且保持一定之醣基轉移活性的新穎變異酵素為目的。
由使用了周知的EndoS D233Q之研究發現了：由於此變異體保持一定之水解活性，所以於醣基轉移反應中，醣基轉移率係隨著自反應開始的時間經過而降低。因此，要藉由使用了EndoS或既有的變異體之糖鏈重塑，而以高純度取得具有均勻的糖鏈之抗體是困難的，尤其是在大容量的反應中，要進展至精製步驟為止所要的時間會變長，所以最終在已與酵素分離之階段，糖鏈已被切斷的抗體就必然會混入。
再者，作為糖鏈供體(donor)而被使用之化學合成的糖鏈唑啉體大多昂貴，大量地使用會造成生產成本的增加。因此，要以高純度來製造具有均勻的糖鏈之抗體，係需要與EndoS D233Q比較而水解活性更被抑制且具有某程度以上的糖鏈轉移活性之酵素。
本發明者們為了解決上述課題而專心致力反覆研究的結果，以EndoS D233Q的胺基酸序列資訊與立體結構作為參考而設計、製作許多的變異體，發現了在D233Q之外還於特定的胺基酸具有追加變異之新穎變異酵素係具有目的之活性，藉由進一步進行研究，而達到完成本發明。
本發明提供以下的發明。
(1)一種EndoS變異酵素，其特徵為於序列編號2之胺基酸編號37~995的胺基酸序列中，在含有選自包含第122個(H122)、第184個(P184)、第279個(D279)、第282個(Y282)、第303個(Q303)、第348個(Y348)、 第350個(E350)、第402個(Y402)、第405個(D405)、及第406個(R406)之群組的至少1個胺基酸的位置具有追加變異，且作為對於鍵結於IgG的第297個之Asn的N鍵結型糖鏈(N297鍵結糖鏈)之活性，與EndoS D233Q之活性比較而顯示經降低的水解活性。
(2)(1)之EndoS變異酵素，其特徵為追加變異係包含選自包含H122、P184、D279、Y282、Q303、Y348、E350、Y402、D405及R406之群組的1~4個胺基酸之部位。
(3)(1)之EndoS變異酵素，其特徵為追加變異的位置包含選自包含Q303、E350及D405之群組的1個胺基酸中之變異。
(4)(1)~(3)之EndoS變異酵素，其中，追加變異係選自以下之群組的至少1個：H122的變異後之胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Glu、Asp、Leu、Ile、Pro、Met或Phe；P184的變異後之胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Gln或Asn；D279的變異後之胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala或Gln；Y282的變異後之胺基酸為Arg、Lys或His；Q303的變異後胺基酸為Met、Pro或Leu；Y348的變異後胺基酸為His或Trp；E350的變異後胺基酸為Lys、Arg、His、Tyr、Gln、Asn、Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala； Y402的變異後之胺基酸為Phe或Trp；D405的變異後胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala；及R406的變異後胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala、Glu、Asp、Gln或Asn。
(5)(4)之EndoS變異酵素，其中，追加變異係選自以下之群組的至少1個：H122為Ala(H122A)或Phe(H122F)；P184為Gln(P184Q)；D279為Ser(D279S)或Gln(D279Q)；Y282為Arg(Y282R)；Q303為Leu(Q303L)；Y348為His(Y348H)；E350為Ala(E350A)、Asn(E350N)、Asp(E350D)或Gln(E350Q)；Y402為Phe(Y402F)或Trp(Y402W)；D405為Ala(D405A)；及R406為Gln(R406Q)。
(6)(5)之EndoS變異酵素，其特徵為作為追加變異而包含選自包含Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q及D405A之群組的至少1個之變異。
(7)(6)之EndoS變異酵素，其特徵為追加變異為Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q、D405A、H122A/Q303L、H122F/Q303L、P184Q/Q303L、D279Q/Q303L、D279S/Q303L、Y282R/Q303L、 Q303L/Y348H、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/Y402F、Q303L/Y402W、Q303L/D405A、Q303L/R406Q、H122A/E350A、H122F/E350A、P184Q/E350A、D279Q/E350A、D279S/E350A、Y282R/E350A、Y348H/E350A、E350A/Y402F、E350A/Y402W、E350A/D405A、E350A/R406Q、H122A/E350N、H122F/E350N、P184Q/E350N、D279Q/E350N、D279S/E350N、Y282R/E350N、Y348H/E350N、E350N/Y402F、E350N/Y402W、E350N/D405A、E350N/R406Q、H122A/E350D、H122F/E350D、P184Q/E350D、D279Q/E350D、D279S/E350D、Y282R/E350D、Y348H/E350D、E350D/Y402F、E350D/Y402W、E350D/D405A、E350D/R406Q、H122A/E350Q、H122F/E350Q、P184Q/E350Q、D279Q/E350Q、D279S/E350Q、Y282R/E350Q、E350Q/Y348H、E350Q/Y402F、E350Q/Y402W、E350Q/D405A、E350Q/R406Q、H122A/D405A、H122F/D405A、P184Q/D405A、D279Q/D405A、D279S/D405A、Y282R/D405A、Y348H/D405A或D405A/R406Q。
(8)(7)之EndoS變異酵素，其中，追加變異為Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q、D405A、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、 Q303L/E350Q、Q303L/D405A、E350A/D405A、E350N/D405A、E350D/D405A或E350Q/D405A。
(9)(4)之EndoS變異酵素，其中，追加變異為H122A、H122F、P184Q、D279Q、D279S、Y282R、Y348H、Y402F、Y402W或R406Q。
(10)(1)之EndoS變異酵素，其特徵為對N297鍵結糖鏈之活性係於在pH7.4之反應液中的水解反應中，維持50%以下的水解率至24小時後。
(11)(1)之EndoS變異酵素，其特徵為作為對N297鍵結糖鏈之活性，進一步顯示在pH7.4之反應液中的使用了5等量之糖鏈供體的醣基轉移反應中，48小時後的醣基轉移率為約60%以上之活性。
(12)一種多核苷酸，其係編碼(1)~(11)之任一者的EndoS變異酵素。
(13)一種載體，其包含與(12)之多核苷酸互補的核苷酸。
(14)一種宿主細胞，其係經(13)之載體所轉形。
(15)一種經糖鏈重塑之含Fc區域的分子之製造方法，其特徵為在(1)~(11)之任一者的EndoS變異酵素之存在下，使包含具有可進行岩藻醣加成之核心GlcNAc的IgG之Fc區域的分子作為N297鍵結糖鏈，與具有含有被唑啉化之GlcNAc的結構之糖鏈供體進行反應，使含Fc區域的分子產生，該所產生之含Fc區域的分子係具有該糖鏈供體所具有的糖鏈轉移至該含Fc區域的分子之N297鍵結糖鏈之該核心GlcNAc的結構。
(16)(15)之製造方法，其中，含Fc區域的分子為IgG單株抗體。
本發明之新穎的EndoS變異酵素由於與作為水解活性降低了的變異體而周知的EndoS D233Q比較，水解活性係進一步被減低，且保持某程度以上的醣基轉移活性，所以能夠藉由糖鏈重塑而更效率良好地以更高純度來取得具有均勻的糖鏈之抗體。又，由於亦可減少於糖鏈重塑中所使用的糖鏈供體之量，所以會降低糖鏈重塑之抗體的製造成本。
[第1圖]第1圖係顯示可於糖鏈重塑中作為糖鏈供體而使用之SG-Oxa的化學結構式(左)及符號化該糖鏈之表示(右)的圖。
[第2圖]第2圖係對於使用了EndoS或EndoS變異酵素之抗體的N297鍵結糖鏈之水解反應的示意圖。
[第3圖]第3圖係概略地顯示使用了EndoS或EndoS變異酵素之醣基轉移反應的圖。
[第4-1圖]第4圖係顯示各種EndoS變異酵素(EndoS D233Q、EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/Q303L/E350Q、EndoS D233Q/Q303L/D405A、EndoS D233Q/E350Q、EndoS D233Q/D405A及EndoS D233Q/Y402F)的胺基酸序列之排列的圖。胺基酸編號是以包含訊息序列(1~36)之編碼區域全長為基準而編號。第4-1圖中顯示各變異酵素的胺基酸編號37~176之排列。
[第4-2圖]第4-2圖為第4-1圖的延續，顯示各變異酵素的胺基酸編號177~316之排列。
[第4-3圖]第4-3圖為第4-2圖的延續，顯示各變異酵素的胺基酸編號317~456之排列。
[第4-4圖]第4-4圖為第4-3圖的延續，顯示各變異酵素的胺基酸編號467~596之排列。
[第4-5圖]第4-5圖為第4-4圖的延續，顯示各變異酵素的胺基酸編號597~736之排列。
[第4-6圖]第4-6圖為第4-5圖的延續，顯示各變異酵素的胺基酸編號737~876之排列。
[第4-7圖]第4-7圖為第4-6圖的延續，顯示各變異酵素的胺基酸編號877~995之排列。
於以下詳細地說明本發明。
本說明書中，分子中所包含之胺基酸的表示法在按照本領域之慣例顯示變異位置的情況，係藉由野生型之胺基酸(或核酸)的單字表示與其編號(例如，第233個之Asp則為「D233」)來表示。又，關於變異，係藉由野生型之胺基酸(或核酸)的單字表示、其編號及變異後之胺基酸(或核酸)的單字表示(例如，第233個之Asp被Gln所取代之變異為「D233Q」)來表示。又，具有變異之特定的變異體係藉由分子名與變異(例如，EndoS的第233個Asp被Gln所取代的變異體為EndoS D233Q))來表示，具有複數變異的情況，將變異之間以「/」來區隔的形式(例如，於EndoS D233Q中，具有第303個之Gln被Leu 所取代的追加變異之變異體表示為「EndoS D233Q/Q303L」)。
於本發明中，所謂「N297鍵結糖鏈」，係意指鍵結於IgG重鏈的第297個Asn之側鏈的糖鏈。IgG經片段化的情況，即使是於含有該Asn的胜肽片段中，鍵結於對應之Asn的糖鏈，其亦包含於N297鍵結糖鏈中。通常，動物等所產生的IgG中之N297鍵結糖鏈係具有包含下式之結構的基本結構，於其非還原末端亦可進一步加成Gal或唾液酸。
細胞所產生之IgG的N297鍵結糖鏈的多數具有糖鏈結構的多樣性，即包含於此基本結構中，糖鏈進一步鍵結於其還原末端的GlcNAc(核心GlcNAc)、非還原末端、支鏈糖等者。於核心GlcNAc的6位亦可被 具有岩藻醣α1,6鍵結之核心岩藻醣的結構((Fucα1,6)GlcNAc)修飾。於支鏈糖之Man中，亦有形成於其5位上進一步含有GlcNAc之糖鏈鍵結的3分枝型之糖鏈的情況。於非還原末端的GlcNAc中，亦有包含Gal或唾液酸的糖鏈係進一步鍵結的情況。
於本發明中，所謂「糖鏈供體」係含有於糖鏈之還原末端具有被唑啉化之GlcNAc的糖鏈之分子，可使用多種的糖鏈結構之分子。
用於以藥物開發作為目的之糖鏈重塑的情況，較佳為採用具有在對人應用之際問題較少的人型糖鏈、或人適合型糖鏈之糖鏈供體。如此的糖鏈係已知在人的體內不顯示抗原性的糖鏈，N鍵結型糖鏈則已知高甘露糖型、混成(hybrid)型、複合(complex)型等。此等3種有共通的基本結構。高甘露糖型係在由位於還原末端附近位置之甘露糖(β甘露糖)所分枝的2個分枝鏈(1-3鏈、1-6鏈)，具有複數甘露糖連續的甘露糖豐富之結構的糖鏈。所謂混成型係指由位於還原末端附近位置之甘露糖(β甘露糖)所分枝的2個分枝鏈(1-3鏈、1-6鏈)之中，於一方成為具有GlcNAc之結構者。所謂複合型係指成為在由位於還原末端附近位置之甘露糖(β甘露糖)所分枝的2個分枝鏈(1-3鏈、1-6鏈)具有GlcNAc之結構，係具有包含半乳糖之有無、唾液基之有無，甚至此等之鍵結異構性或位置異構性之多種類的結構者。(請參照表1)。代表性的糖鏈供體係實施例2所製造之SG-Oxa(第1圖)。
於本發明中，所謂「受體分子」係指含有於非還原末端具有GlcNAc之糖結構的分子，藉由使其在EndoS或其變異酵素存在下與糖鏈供體分子進行反應，而糖鏈供體分子的唑啉環可對該非還原末端之GlcNAc的4位反應，形成殼質雙糖結構。作為受體分子之典型者係具有僅包含來自單株抗體的核心Fuc亦可鍵結之核心GlcNAc之N297鍵結糖鏈的IgG或其Fc片段。於核心GlcNAc，因應其來源之抗體或其產生方法，而核心Fuc可鍵結，亦可未鍵結。就受體分子的來源而言，可利用各式各樣的單株抗體或含Fc區域的分子(Fc、使僅包含由重鏈使可變區缺失之恆定區的CH與僅包含輕 鏈之恆定區的CL組合而成之CLCH等)，但可列舉較佳為(Fucα1,6)-GlcNAc-IgG、(Fucα1,6)-GlcNAc-Fc、(Fucα1,6)-GlcNAc-CLCH等，就代表例而言，可列舉實施例3所製造的(Fucα1,6)-GlcNAc-Trastuzumab。
於本發明中，所謂「EndoS」係指來自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)之內-β-N-乙醯葡萄糖胺苷酶(ENGase)的一種，係包含於序列編號1之胺基酸編號37~995(第1~36個之胺基酸係顯示訊息序列)的胺基酸序列中第233個之胺基酸為Asp的胺基酸序列之酵素(EC 3.2.1.96，GH18)。EndoS係專一性地辨識來自IgG之Fc部位的N297鍵結糖鏈，兼具水解活性與醣基轉移活性。EndoS的水解活性係將具有上述之基本結構之N297鍵結糖鏈的核心殼質雙糖所含之β1,4醣苷鍵進行專一性水解之活性(於本說明書中，只要沒有特別說明，則所謂「水解活性」係意指此活性。於第2圖顯示反應示意圖。)。EndoS的醣基轉移活性係指對於包含於N297僅具有核心GlcNAc(核心岩藻醣係可加成亦可未加成)之Fc部位的受體分子，使來自在還原末端具有被唑啉化之GlcNAc的糖鏈供體之糖鏈的還原末端醣苷鍵結之活性(以下，稱為「醣基轉移活性」。於第3圖顯示反應示意圖。)。
EndoS之結構係被報告為具有糖苷內切酶催化域(endoglycosidase enzymatic domain)(催化域：序列編號1之胺基酸編號98~445)、富白胺酸重複域(Leucine-rich repeat domain)(序列編號1之胺基酸編號 446~631)、雜種Ig域(hybrid Ig domain)(序列編號1之胺基酸編號632~764)、碳水化合物結合模組(Carbohydrate-binding module)(CBM：序列編號1之胺基酸編號765~923)、及三螺旋束域(three helix-bundle domain)(序列編號1之胺基酸編號924~995)的5個領域結構(B.Trastoy et al.,PNAS(2014)vol111,No.18,pp6714-6719)，其中對於與抗體之交互作用重要的部位係認為是催化域與CBM的2個。
EndoS係於A群鏈球菌(Group A Streptococcus)(GAS)中常被保存之酵素，但在屬於GAS之血清型M49的NZ131所發現的EndoS2(有時亦被稱為EndoS49。Sjogren,Biochem J.2013 Oct 1；455(1)：107-18、US 2014/0302519 A1))，雖然序列同一性為37%，但構成催化域的胺基酸之中重要者係被良好地保存，且顯示與EndoS類似的基質專一性。於本說明書中，將保持如此之EndoS的活性區域之胺基酸相同性/同一性的酵素稱為「EndoS類緣酵素」。EndoS之重要的變異部位之H122、D233、D279、Q303、E350、Y402、D405及R406係分別於EndoS2中對應於H75、D184、D226、Q250、E289、Y339、D342及R343。將在如EndoS2的類緣酵素中，對應之胺基酸經變異的變異酵素亦當成包含於本發明之變異酵素者。
於本發明中，所謂「EndoS D233Q」係指包含野生型EndoS的第233個之Asp被Gln所取代的序列(序列編號1之胺基酸編號37~995的胺基酸序列)之酵 素，是EndoS所具有之水解活性被一定程度抑制，且保持與野生型相同程度之醣基轉移活性的變異酵素。
<本發明之變異酵素>
本發明提供一種EndoS之變異酵素，其係於序列編號2之胺基酸編號37~995的胺基酸序列中含有醣基轉移活性所需要之區域的EndoS D233Q之變異酵素，其特徵為：在D233Q之外進一步於包含選自特定的必須追加變異位置群之至少1個胺基酸的位置具有追加變異，且作為IgG的對N297鍵結糖鏈之活性，與EndoS D233Q比較而水解活性被減低。
於本發明中，所謂「追加變異」意指於EndoS D233Q之胺基酸序列中，在D233以外的胺基酸所發生之追加的胺基酸變異。於本發明中，所謂「必須追加變異位置群」係指於本發明之變異酵素中、必定被追加變異的位置之候選群，是在序列編號2之胺基酸序列中被表示為Xaa的位置，亦即包含H122、P184、D279、Y282、Q303、Y348、E350、Y402、D405及R406之群組，但較佳為包含Q303、E350及D405之群組。
本發明之變異酵素之特徵在於兼具較EndoS D233Q還經降低的水解活性、及一定的醣基轉移活性(以下，將兼具二者之活性稱為具有「本酵素活性」)。變異酵素是否具有本酵素活性，係可藉由後述之實施例4的方法來評價其水解活性及醣基轉移活性。
本發明之變異酵素具有的本酵素活性之中，與EndoS D233Q的水解活性比較而水解活性係被抑制， 亦即，實施例4所記載之pH7.4之條件下的水解率，係於自反應開始至1~48小時後為止之任一者的時間點中顯示較EndoS D233Q的水解率還低的數值，但較佳為水解反應開始後24小時後的水解率為50%以下、或48小時後的水解率為60%以下，更佳為水解反應開始後至24小時為止的水解率係維持40%以下者，進一步較佳為至同時間為止維持30%以下者，再者，進一步更佳為維持20%以下者，最佳為在全部的時間點中顯示水解率為0%而完全地喪失水解活性者。
本發明之變異酵素具有的本酵素活性之中，醣基轉移活性係與EndoS D233Q的醣基轉移活性相同程度，亦即，實施例4所記載之pH7.4、糖鏈供體為受體分子的5等量之條件下的醣基轉移率，係於自反應開始至1~48小時後為止之任一者的時間點之後顯示與EndoS D233Q的醣基轉移率同等或其以上(例如EndoS D233Q之數值的70%以上)的醣基轉移率，但較佳為在反應開始後至48小時為止，醣基轉移率超過50%者，更佳為反應開始後至48小時為止醣基轉移率超過60%者，進一步較佳為至反應開始後48小時為止醣基轉移率超過80%者，進一步更佳為至反應開始後48小時為止醣基轉移率超過90%者。
本發明之變異酵素若是於序列編號2之胺基酸編號37~995的胺基酸序列中，保持著對EndoS D233Q的醣基轉移活性為重要的區域，則不需要是其全長序列。由EndoS的領域分析已知催化域(序列編號2之胺基 酸編號98~445)、及CRM(序列編號2之胺基酸編號765~923)為重要的，只要包含此等，則可作為本發明之變異酵素使用。又，即使是如EndoS2的類緣酵素，只要包含對應於此等之領域區域的區域，於對應之位置的胺基酸(EndoS之H122、D233、D279、Q303、E350、Y402、D405及R406係分別於EndoS2中對應於H75、D184、D226、Q250、E289、Y339、D342及R343)具有適當變異，且具有本酵素活性，則將其作為包含於本發明者。較佳為包含序列編號2之胺基酸編號98~923的多胜肽，更佳為包含序列編號2之胺基酸編號98~995的多胜肽，進一步較佳為包含序列編號2之胺基酸編號37~995的多胜肽。
於本發明之變異酵素的胺基酸序列中，在不影響本酵素活性的範圍，亦可在後述之必須變異位置以外的位置，1~數個的胺基酸進行取代、缺失、插入、及/或加成。就如此之胺基酸改變的位置而言，只要不影響本酵素活性，則亦可選擇所有的部位，但較佳為催化域(序列編號2之胺基酸編號98~445)及CRM(序列編號2之胺基酸編號765~923)以外的位置，更佳為序列編號2之胺基酸編號37~97或胺基酸編號924~995的區域所包含的部位。於本發明中，所謂數個係指20個以下，較佳為10個以下，進一步較佳為5個以下，最佳為4個、3個、2個或一個。
於本發明之變異酵素中，D233Q以外的追加變異位置係包含選自必須追加變異位置群之至少1個胺 基酸的位置。此追加變異位置的個數只要是最終的變異體為本變異酵素具有本酵素活性，則並未被特別限定，但較佳為10個位置以下，更佳為5個位置以下，進一步較佳為4個位置、3個位置、2個位置或一個位置。於複數個位置具有追加變異的情況，若於必須追加變異位置群的至少1個中有變異，而其他的變異位置只要是最終的變異酵素具有本酵素活性，則並未被特別限定，但較佳為全部的追加變異為必須追加變異位置群。於必須追加變異位置以外具有追加變異的情況，就包含必須追加變異位置以外之追加變異的區域而言，較佳為酵素活性相關之催化域(序列編號2之胺基酸編號98~445)以外胺基酸，更佳為序列編號2之胺基酸編號37~97、446~764及924~995的區域，進一步較佳為序列編號2之胺基酸編號37~97及924~995的區域。
於本發明中，追加變異所致之取代後的胺基酸，只要是最終所得之變異酵素具有本酵素活性，則並非被特別限定者，可採用天然存在之胺基酸、人工合成之胺基酸、該等之修飾胺基酸等、各式各樣的胺基酸，較佳為天然存在之胺基酸，更佳為天然存在之L-胺基酸，再者，進一步較佳為必須胺基酸。於以下顯示必須追加變異位置中的較佳變異後胺基酸。
H122的變異後之胺基酸係較佳為如該部位與周圍的胺基酸之交互作用會被解除的下述胺基酸：具有小的側鏈結構之胺基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)、於側鏈帶負電荷之胺基酸(Glu或Asp)、或於 側鏈不具反應性高的官能基之胺基酸(Leu、Ile、Pro、Met、Phe)，更佳為Ala或Phe。
P184的變異後之胺基酸係較佳為具有小的側鏈結構之胺基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)、或於側鏈具有醯胺基之胺基酸(Gln，Asn)，更佳為Gln。
D279的變異後之胺基酸係較佳為具有小的側鏈結構之胺基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)或Gln，更佳為Ser或Gln。
Y282的變異後之胺基酸係較佳為側鏈是鹼性的胺基酸(Arg、Lys、His)，更佳為Arg。
Q303的變異後胺基酸係較佳為疏水性的胺基酸(Met、Pro、Leu)，更佳為Leu。
Y348的變異後胺基酸係較佳為於側鏈具有環結構的胺基酸(His，Trp)，更佳為His。
E350的變異後胺基酸係較佳為具有可進行氫鍵結之大的側鏈之胺基酸(Lys、Arg、His、Tyr、Gln、Asn)、或如該部位與周圍的胺基酸之交互作用會被解除之具有小的側鏈結構之胺基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)，更佳為Ala、Asn、Asp或Gln。
Y402的變異後之胺基酸係較佳為於側鏈具有芳香環之大的胺基酸、Phe或Trp。
D405的變異後胺基酸係較佳為如該部位與周圍的胺基酸之交互作用會被解除之具有小的側鏈結構之胺基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)，更佳為Ala。
R406的變異後胺基酸係較佳為如該部位與周圍的胺基酸之交互作用會被解除之下述胺基酸：具有小的側鏈結構之胺基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)、於側鏈帶負電荷之胺基酸(Glu、Asp)、或於側鏈具有醯胺基之胺基酸(Gln，Asn)，更佳為Ala或Gln。
如上述之在必須追加變異位置的變異可為單獨，亦可與其他的必須追加變異位置的變異及/或其他位置的變異組合。就必須追加變異位置中的變異之組合而言，可為任何的組合，但較佳為至少包含在Q303、E350或D405之變異的組合，更佳為至少包含Q303L、E350A，E350N、E350Q或D405A的組合。
就包含Q303L之追加變異的組合而言，可舉出例如H122A/Q303L、H122F/Q303L、P184Q/Q303L、D279Q/Q303L、D279S/Q303L、Y282R/Q303L、Q303L/Y348H、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/Y402F、Q303L/Y402W、Q303L/D405A、Q303L/R406Q等。
就包含E350A之追加變異的組合而言，可舉出例如H122A/E350A、H122F/E350A、P184Q/E350A、D279Q/E350A、D279S/E350A、Y282R/E350A、Y348H/E350A、E350A/Y402F、E350A/Y402W、E350A/D405A、E350A/R406Q等。
就包含E350N之追加變異的組合而言，可舉出例如H122A/E350N、H122F/E350N、P184Q/E350N、D279Q/E350N、D279S/E350N、Y282R/E350N、 Y348H/E350N、E350N/Y402F、E350N/Y402W、E350N/D405A、E350N/R406Q等。
就包含E350D之追加變異的組合而言，可舉出例如H122A/E350D、H122F/E350D、P184Q/E350D、D279Q/E350D、D279S/E350D、Y282R/E350D、Y348H/E350D、E350D/Y402F、E350D/Y402W、E350D/D405A、E350D/R406Q等。
就包含E350Q之追加變異的組合而言，可舉出例如H122A/E350Q、H122F/E350Q、P184Q/E350Q、D279Q/E350Q、D279S/E350Q、Y282R/E350Q、Y348H/E350Q、E350Q/Y402F、E350Q/Y402W、E350Q/D405A、E350Q/R406Q等。
就包含D405A之追加變異的組合而言，可舉出例如H122A/D405A、H122F/D405A、P184Q/D405A、D279Q/D405A、D279S/D405A、Y282R/D405A、Y348H/D405A、Y402F/D405A、Y402W/D405A、或D405A/R406Q等。
作為本發明之變異酵素而較佳者為EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/E350A、EndoS D233Q/E350N、EndoS D233Q/E350D，EndoS D233Q/E350Q，EndoS D233Q/D405A，EndoS D233Q/Q303L/E350A、EndoS D233Q/Q303L/E350N、EndoS D233Q/Q303L/E350D、EndoS D233Q/Q303L/E350Q、EndoS D233Q/Q303L/D405A、EndoS D233Q/E350A/D405A、EndoS D233Q/E350N/D405A、EndoS D233Q/E350D/D405A、EndoS D233Q/E350Q/D405A、或EndoS D233Q/Y402，更佳為EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/Q303L/E350Q、EndoS D233Q/Q303L/D405A、EndoS D233Q/E350A、或EndoS D233Q/Y402F。
<基因、宿主細胞、酵素產生方法>
本發明進一步提供編碼於上述之EndoS D233Q具有追加變異的變異酵素之重組基因、含有該重組基因之質體或表現載體等之基因構築體(genetic construct)、藉由該基因構築體而被轉形之宿主細胞、包含由該宿主細胞之培養物回收本發明之變異酵素的步驟之本發明之變異酵素的製造方法等。此等之重組基因、基因構築體、宿主細胞糖可根據本發明之變異酵素的胺基酸序列，依照周知的基因工學的手法製得。
編碼本發明之變異酵素的重組基因，係可根據序列編號3之核苷酸編號109~2985(1~108係編碼訊息胜肽之區域)所記載的EndoS D233Q之核苷酸序列，製得編碼包含作為目的之追加變異的胺基酸序列之cDNA等的多核苷酸。例如，編碼EndoS D233Q/Q303L的核苷酸序列，係於序列編號3之核苷酸編號109~2985的核苷酸序列中，將第907~909個之核苷酸由CAG取代為CTG的核苷酸序列。又，編碼EndoS D233Q/E350A(N、Q)的核苷酸序列，係於序列編號3之核苷酸編號109~2985的核苷酸序列中，將第1048~1050個之核苷酸由GAA取代為GCA的核苷酸序列(E350N則為AAT，E350Q則為 CAG)。又，編碼EndoS D233Q/D405A的核苷酸序列，係於序列編號3之核苷酸編號109~2985的核苷酸序列中，將第1213~1215個之核苷酸由GAT取代為GCA的核苷酸序列。
藉由編碼本發明之變異酵素的基因之導入而被轉形的宿主細胞(可適當選擇動物細胞、植物細胞、大腸菌、酵母等、蛋白質產生所通常使用之細胞等)可因應細胞的種類而在適當的條件下被培養，並由其回收本發明之變異酵素。變異酵素的回收係利用該酵素的物性而適當組合通常的精製手法來進行，但為了要簡便地進行回收，可藉由以預先以使GST等之標籤胜肽(tag peptide)鍵結於變異酵素的形式使其表現的方式設計基因構築體，而進行利用該標籤胜肽之親和性的回收。標籤胜肽亦可於精製後除去，但不影響酵素活性的情況，亦可於糖鏈重塑等之反應使用使標籤胜肽鍵結著之狀態的變異酵素。本發明之變異酵素中係包含如此之具有標籤胜肽鍵結著的胺基酸序列之酵素。
<糖鏈重塑>
本發明係提供使用了本發明之EndoS變異酵素的IgG或含Fc區域的分子中之N297鍵結糖鏈的糖鏈重塑方法、及具有包含藉由該糖鏈重塑所製造之實質上均勻的結構之N297鍵結糖鏈的IgG或含Fc區域的分子。
所謂「糖鏈重塑」係意指藉由下述來製造N297鍵結糖鏈是來自糖鏈供體之均勻的糖鏈結構之IgG或含Fc區域的分子之方法：首先，製作將特定的單株抗 體之IgG、或包含IgG之Fc片段或只有恆定區的CLCH等之含Fc區域的分子之N297鍵結糖鏈留下核心GlcNAc(核心岩藻醣亦可加成)而進行切除的受體分子，接著，對於該受體分子的核心GlcNAc，利用本發明之EndoS變異酵素的醣基轉移活性使來自糖鏈供體的糖鏈轉移。
糖鏈重塑所使用的IgG或含Fc區域的分子，係只要是來自包含同一個胺基酸序列之IgG重鏈，且以具有N297鍵結糖鏈之形式所產生者即可，其產生方法並非受限定者，可利用藉由通常周知的單株抗體之生產方法所產生的IgG、IgG之CLCH、或將其進行酵素處理所得之Fc片段等。又，如此之IgG或Fc片段亦可採用不同的生產方法或不同批(lot)所得之樣品的混合物。
就用於糖鏈重塑之受體分子的製備方法而言，可將上述之IgG或含Fc區域的分子，以保持著將N297鍵結糖鏈的核心殼質雙糖結構中之GlcNAc間的1.4-醣苷鍵進行專一性水解之活性的ENGase進行處理，藉此而進行調整。此情況，就ENGase而言，可採用EndoA、EndoD、EndoE、EndoS等各式各樣者，較佳為野生型EndoS。
就用於糖鏈重塑之糖鏈供體而言，可採用各式各樣的糖鏈結構者，但以將重塑後之抗體作成抗體醫藥為目的之情況，較佳為採用與人所保有之糖鏈結構類似的、或同一個的人型糖鏈、或具有人適合型糖鏈結構的糖鏈供體。作為如此的糖鏈供體之代表性者，可舉出 於上述之N鍵結型糖鏈的基本結構中，核心GlcNAc被除去且自還原末端起第2個的GlcNAc被唑啉化之分子，較佳為包含第1圖所示之結構的SG-Oxa。
糖鏈重塑中之水解反應的反應條件，關於EndoS可採用通常周知的方法。反應係於緩衝液中進行，但能夠適當選自檸檬酸緩衝液(pH3.5~5.5)、醋酸緩衝液(pH4.5~6.0)、磷酸緩衝液(pH6.0~7.5)、MOPS-NaOH緩衝液(pH6.5~8.0)、Tris-HCl緩衝液(pH7.0~9.0)等通常的酵素反應所使用的緩衝液。較佳為Tris-HCl緩衝液(pH7.0~9.0)。反應液中，亦可在使酵素安定化之目的下加入不阻礙酵素反應之添加劑，也可不加。
反應溫度可在10℃至50℃之間適當選擇，但較佳為25℃~38℃。
反應時間可在10分鐘至96小時之間適當選擇，但亦可經時性地採樣反應液之少量，一邊確認水解的進行度並判斷反應的結束。一般而言，糖鏈水解反應的進行度可藉由十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)、全自動電泳系統、或者是液相層析質譜儀(LC-MS)等來進行監控。在本專利，係將市售抗體或者是糖鏈重塑抗體對重鏈與輕鏈進行片段化之後，使用全自動電泳系統，確認了僅有N297鍵結糖鏈加成之重鏈側保持時間會變化。
糖鏈重塑中之醣基轉移反應的反應條件可依照在其他的酵素中周知之條件而適當選擇。
反應在緩衝液中進行，但希望是不促進SG-Oxa之分解者，能夠從磷酸緩衝液(pH6.0~7.5)、MOPS-NaOH緩衝液(pH6.5~8.0)、Tris-HCl緩衝液(pH7.0~9.0)等適當選擇。較佳為Tris-HCl緩衝液(pH7.0~9.0)。亦可在使酵素安定化之目的下加入不阻礙酵素反應之添加劑，也可不加。
反應溫度可在10℃至50℃之間適當選擇，但較佳為25℃~38℃。
反應時間可在10分鐘至96小時之間適當選擇，但亦可經時性地採樣反應液之少量，一邊確認醣基轉移反應的進行度並判斷反應的結束。一般而言，糖鏈轉移反應的進行度可藉由十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)、全自動電泳系統、或者是液相層析質譜儀(LC-MS)等來進行監控。在本專利，係將市售抗體或者是糖鏈重塑抗體對重鏈與輕鏈進行片段化之後，使用全自動電泳系統，確認了僅有N297鍵結糖鏈加成之重鏈側保持時間會變化。
[實施例]
以下，使用實施例來具體地說明本發明。實施例所示者為本發明的實施型態之一例，本發明並非此等所限定者。
實施例1係本發明中使用之EndoS變異酵素的製備例。實施例2係本發明中使用之糖鏈供體的製造例。實施例3係於測定糖鏈轉移活性之際使用之受體分子的製備例。實施例4係本發明之EndoS變異酵素之水 解率的測定例與本發明之EndoS變異酵素之糖鏈轉移活性率的測定例。
本說明書所記載之蛋白質濃度係使用超微量分光光度計NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific製)或者是NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific製)來進行定量。
糖鏈重塑抗體((Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab及SG-Trastuzumab)的質量係以以下的方法進行確認。將糖鏈重塑抗體對重鏈與輕鏈進行片段化之後，將各個波峰以分析管柱分離，進行質量分析。於裝置使用ACUITY UPLC(Waters製)、SYNAPT G2-S(Waters)及BEH Phenyl管柱(1.7μm、1.0x50mm)，於移動相係將0.05%三氟乙酸添加之乙腈以在3分鐘間由25%變化為35%之梯度來使用，以流速0.34μL/min、80℃進行分析。
<實施例1>EndoS變異酵素之反應液製備
(1-1)EndoS變異酵素的設計
於EndoS D233Q導入變異，以設計被認為可達成一邊維持EndoS D233Q之醣基轉移活性並抑制水解活性的變異型EndoS。根據EndoS之立體結構資訊(PDB ID：4NUY)，而將EndoS的催化域區分成被預測為會參與糖鏈的辨識之部位、活性中心附近、被預測為會參與抗體的辨識之部位的3部位，分別作為變異導入的對象。就被預測為會參與糖鏈的辨識之部位而言，係設定H122、Y348、E350、Y402、D405、及R406的6殘基，且為了使與糖鏈之鍵結解離的轉變效率化，而應設計酵 素為切斷上述之胺基酸殘基所形成之交互作用、或者是將上述之胺基酸之中具有大的側鏈之胺基酸殘基取代為具有小的側鏈之胺基酸殘基。就活性中心附近而言，係設定P184、D279、及Q303，設計為具有與野生型之胺基酸殘基類似的性質之胺基酸、或者是對具有不同的性質之胺基酸廣泛地進行取代之變異。就被預測為會參與抗體的辨識之部位而言，係設定Y282，且應加強與抗體糖鏈所鍵結之AsN297附近之負電荷的交互作用，設計為對鹼性的胺基酸進行取代之變異。亦考慮在上述之3部位內、或者是3部位間之組合變異，而設計表2之各變異酵素。
(1-2)EndoS變異酵素之表現
對於轉形效率(competency)為107cfu/μL之經冰冷的大腸菌BL21(DE3)株50μL，添加根據上述(1-1)而設計之包含編碼各EndoS變異酵素的胺基酸序列之基因的蛋白質表現用質體(pGEX4T3，50μg/μL)3μL，於37℃加熱40秒鐘，以將大腸菌進行轉形。將此等大腸菌在含有100μg/mL之胺苄青黴素的LB瓊脂培養基進行隔夜培養，次日將所得之菌落採樣而在含有100μg/mL之胺苄青黴素的1L之TB培養基於37℃進行震盪培養至O.D.600成為0.8。O.D.600上升之後，將培養溫度降低為16℃，於1小時後以終濃度成為0.1mM之方式添加異丙基β-D-1-硫代半乳哌喃糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，以進行隔夜誘導EndoS變異酵素的表現。次日，將培養液以5,000×G進 行10分鐘離心分離以回收菌體，加入50mL含有40U/mL之DNaseI及0.5mg/mL溶菌酶(Lysozyme)的PBS緩衝溶液，將菌體再懸浮。對於所得之菌液進行超音波處理以破碎菌體，以20,000×g進行30分鐘離心分離，藉此在可溶性部分得到作為目的之EndoS變異酵素。
(1-3)EndoS變異酵素之精製
關於在上述(1-2)所得之EndoS變異酵素的可溶性部分，使其通過孔徑為0.45μm的PVDF膜，將通過後的溶液以麩胱甘肽親和性層析法與膠體過濾層析法的二階段步驟進行精製。
首先，將通過PVDF膜通過膜的EndoS變異酵素之可溶性部分全量通入以PBS進行了平衡化的麩胱甘肽瓊脂糖(glutathione sepharose)4B管柱，以管柱容量的3倍以上之PBS緩衝溶液清洗管柱。接著以含有10mM之還原型麩胱甘肽的PBS緩衝溶液將GST融合EndoS變異酵素溶出，藉由超微過濾(Amicon Ultra-15 30K)進行濃縮。濃縮後，通過以PBS進行平衡化之HiLoad 26/60 Superdex200pg管柱(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES)，於除去將用於溶出之麩胱甘肽之同時得到最終精製樣品。將如此地進行製備之各種EndoS變異酵素的產量表示於表2。
所得之EndoS變異酵素溶液係以成為2mg/mL的方式進行製備，而將此等用於水解活性測定及糖鏈轉移活性測定。
<實施例2>SG-Oxa(包含第1圖之結構的化合物)之反應液製備
在以下的實施例作為糖鏈供體而使用之SG-Oxa係藉由以下的方法製造。
對於二唾液酸八糖(disialyloctasaccharide)(東京化成工業(股)，100mg，49.5μmol)加入2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓氯化物(2-Chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazole-3-ium chloride)(CDMBI)(伏見製藥所(股)製)(53.7mg，245μmol)之水溶液(520μl)。於冰冷後的反應液中加入磷酸三鉀(158mg，743μmol)之水溶液(520μl)，在冰冷下攪拌2小時。將所得之反應液使用Amicon Ultra離心管(Ultracel 30K，Merck Millipore製)進行超微過濾，除去固形物。將該通過液以膠體過濾層析法進行精製。裝置係使用Purif-Rp2(Shoko Scientific製)，管柱係使用HiPrep 26/10 Desalting(GE HEALTHCARE 製)，於移動相使用0.03%-NH3水溶液，設定流速為10ml/min，分劃容量為10ml。將於溶出中經UV檢出(220nm)之包含目的物的部分彙整為一，加入0.1N氫氧化鈉水溶液(100μl)而進行冷凍乾燥，得到為無色固體(87.0mg，43.4μmol，產量88%)之目的的SG-Oxa。
由所得之化合物的NMR譜確認目的物(HELVETICA CHIMICA ACTA,2012,95,1928-1936)。
於所得之SG-Oxa(1.19mg)加入50mM Tris緩衝液(pH7.4)(23.8μl)，製備50mg/ml SG-Oxa溶液(50mM Tris緩衝液pH7.4)。將此用於糖鏈轉移活性測定。
<實施例3>(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab之製備
將作為於醣基轉移反應使用的受體分子而使用之(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab以以下的方法製作。
於11.3mg/ml Trastuzumab(曲妥珠單株抗體)(基因泰克公司製)溶液(50mM Tris緩衝液pH8.0)(2ml)加入1.18mg/ml野生型EndoS溶液(PBS)(10μl)，在30℃保溫5小時。使用Experion電泳儀(Electrophoresis Station)確認反應的進行狀況。反應結束後，進行藉由親和性層析法之精製與藉由氫氧磷灰石管柱之精製。
(1)藉由親和管柱之精製
精製裝置：AKTA avant25(GE HEALTHCARE製)
管柱：HiTrap Protein A HP管柱(5ml)(GE HEALTHCARE製)
流速：5ml/min(充填時為1ml/min)
對管柱之結合時，對管柱上部添加上述所得之反應液，以1ml/min流通結合緩衝溶液(20mM磷酸緩衝液(pH7.0))1CV，進一步以5ml/min流通5CV。中間清洗時係流通清洗溶液(20mM磷酸緩衝液(pH7.0)、0.5M氯化鈉溶液)15CV。溶出時係流通溶出緩衝溶液(ImmunoPure IgG洗提緩衝液，PIERCE製)6CV。立刻將溶出液以1M Tris緩衝液(pH9.0)進行中和。針對於溶出中經UV檢出(280nm)之部分，使用超微量分光光度計NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific製)、及Experion電泳儀(BIO-RAD製)進行確認。
將包含目的物的部分使用Amicon Ultra離心管(Ultracel 30K，Merck Millipore製)進行濃縮，進行緩衝液(5mM磷酸緩衝液，50mM 2-啉乙基磺酸(MES)溶液，pH6.8)交換。
(2)藉由氫氧磷灰石管柱之精製
精製裝置：AKTA avant25(GE HEALTHCARE製)
管柱：Bio-Scale Mini CHT Type I匣筒(5ml)(BIO-RAD製)
流速：5ml/min(充填時為1ml/min)
對管柱的上部添加上述(1)所得之溶液，流通A液(5mM磷酸緩衝液，50mM 2-啉乙基磺酸(MES)，pH6.8)4CV。然後，使用A液與B液(5mM磷酸緩衝液，50mM 2-啉乙基磺酸(MES)，pH6.8，2M氯化鈉溶液)進行溶出。溶出條件為A液：B液=100：0~0：100(15CV)。
針對於溶出中經UV檢出(280nm)之部分，使用超微量分光光度計NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific製)、及ExperionTM電泳儀(BIO-RAD)進行確認。
將包含目的物的部分使用Amicon Ultra離心管(Ultracel 30K，Merck Millipore製)進行濃縮，對50mM磷酸緩衝液(pH6.0)進行緩衝液交換，得到9.83mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液(磷酸緩衝液、pH6.0)(1.8ml)。
LC-MS：
(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab的重鏈的計算值，M=49497.86；實測值(m/z),49497(反摺積(deconvolution)數據).
(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab的輕鏈的計算值，M=23439.1；實測值(m/z),23439.1(反摺積數據).
<實施例4>EndoS變異酵素的水解活性及糖鏈轉移活性之測定(pH7.4)
(4-1)水解活性之測定
將各種EndoS變異酵素對市售之Trastuzumab的N297鍵結糖鏈之水解活性如以下地進行測定。於第2圖顯示該水解反應的示意圖。
如下述地製備作為水解反應的基質溶液而使用的20mg/ml Trastuzumab溶液。於100mM Tris緩衝液(pH7.4，CALBIOCHEM製)(10ml)加入大塚蒸餾水(Otsuka distilled water)(10ml)，製備50mM Tris緩衝液 (pH7.4)(40ml)。於市售的Trastuzumab(440mg/vial、Genentech製)加入附屬的溶解液(20ml)，製成Trastuzumab(ca.21mg/ml)溶液。對於Trastuzumab(ca.21mg/ml)溶液(2ml)進行使用Amicon Ultra離心管(Ultracel 30K，Merck Millipore製)的超微過濾，以在上述調整的50mM Tris緩衝液pH7.4進行溶媒取代，得到20mg/ml Trastuzumab溶液(50mM Tris緩衝液pH7.4)。
對於在上述製備的基質溶液(25μl)，加入實施例1中製備的2.0mg/ml EndoS D233Q溶液(5μl)，在30℃保溫48小時。於反應開始的1小時後、2小時後、4小時後、8小時後、24小時後、及48小時後，採樣此反應液的一部份，使用ExperionTM電泳儀(BIO-RAD)測定反應的進行度。在測定之際，係依照附帶於儀器的說明書製備測定樣品。此過程中，由於有將採樣的反應液暴露於含有二硫蘇糖醇的溶液而在95℃進行加熱5分鐘的操作，水解反應係立即被停止。
將所得之測定樣品移到ExperionTM Pro260 Chips，依照附帶於ExperionTM電泳儀(BIO-RAD)的說明書進行測定。由所得之層析圖確認未反應物與糖鏈轉移物為分離之波峰。自未反應物與水解物的波峰面積比，藉由以下的計算式算出水解率。
水解率(%)=[來自(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab的H鏈之波峰面積]/{[來自市售之Trastuzumab的H鏈波峰面積+[來自(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab的H鏈之波峰面積]}×100
同樣地進行，而算出實施例1中製備之其他的EndoS變異酵素之各反應時間下的水解率(表3)。
(4-2)糖鏈轉移活性之測定
以以下的方法測定實施例1中製作之各種EndoS變異酵素的醣基轉移活性。分別使用實施例2中調整的SG-Oxa作為糖鏈供體，使用實施例3中製備的(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab作為受體分子。於第3圖顯示醣基轉移反應的示意圖。
自實施例3中製備的9.83mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液(磷酸緩衝液、pH6.0)，依照與(4-1)之基質溶液調整同樣的手法，製備20mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液(50mM Tris緩衝液pH7.4)。對於20mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液(50mM Tris緩衝液pH7.4)(40μl)，加入實施例2中製備的50mg/ml SG-Oxa溶液(50mM Tris緩衝液pH7.4)(1.07μl)、及實施例1中製備的2.0mg/ml EndoS D233Q溶液(8μl)，在30℃保溫48小時。在自反應開始1小時後、2小時後、4小時後、8小時後、24小時後及48小時後的各時間點，採樣此反應液的一部份，使用ExperionTM電泳儀測定反應的進行度。在測定之際，係依照附帶於儀器的說明書製備測定樣品。此過程中，由於有將採樣的反應液暴露於含有二硫蘇糖醇的溶液而在95℃進行加熱5分鐘的操作，水解反應係立即被停止。
將所得之測定樣品移到ExperionTM Pro260 Chips，依照ExperionTM電泳儀(BIO-RAD)附帶於儀器的說明書進行測定。由所得之層析圖確認未反應物與糖鏈轉移體為分離之波峰。自未反應物與糖鏈轉移物的波峰面積比藉由下記計算式算出糖鏈轉移率。
糖鏈轉移率(%)=[來自SG-Trastuzumab的H鏈之波峰面積]/{[來自(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab的H鏈波峰面積+[來自SG-Trastuzumab的H鏈之波峰面積]}×100
同樣地進行，而算出實施例1中製備之其他的EndoS變異酵素之各反應時間下的糖鏈轉移率(表3)。
糖鏈轉移生成物的SG-Trastuzumab係以與實施例3中的(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab之精製同樣的方法進行精製。於以下顯示所得之SG-Trastuzumab的LC-MS分析數據。
SG-Trastuzumab的重鏈的計算值，M=51500.6Da；實測值(m/z),51501(反摺積數據).
SG-Trastuzumab的輕鏈的計算值，M=23439.1Da；實測值(m/z),23439(反摺積數據).
[表3]各EndoS變異酵素的水解率及醣基轉移率的經時變化(pH7.4)
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 新穎EndoS變異體(變異酵素)
<130> DS2015007
<150> JP2015-141901
<151> 2015-07-16
<160> 3
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 995
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Endo-S之D233Q變異
<400> 1
<210> 2
<211> 995
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有至少1個D233Q以外之變異的Endo-S D233Q之新穎變異體
<220>
<221> 變異
<222> (122)..(122)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之His，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (184)..(184)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Pro，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (187)..(187)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Phe，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (279)..(279)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Asp，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (281)..(281)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Thr，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (282)..(282)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Tyr，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (303)..(303)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Gln，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (348)..(348)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Tyr，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (350)..(350)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Glu，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (402)..(402)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Tyr，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (405)..(405)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Asp，且可變異。
<220>
<221> 變異
<222> (406)..(406)
<223> 胺基酸為野生型EndoS中之Arg，且可變異。
<400> 2
<210> 3
<211> 2985
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EndoS D233Q之cDNA
<400> 3

Claims (16)

  1. 一種EndoS變異酵素，其特徵為於序列編號2之胺基酸編號37~995的胺基酸序列中，在包含選自包含第122個(H122)、第184個(P184)、第279個(D279)、第282個(Y282)、第303個(Q303)、第348個(Y348)、第350個(E350)、第402個(Y402)、第405個(D405)、及第406個(R406)之群組的至少1個胺基酸的位置具有追加變異，且作為對於鍵結於IgG的第297個之Asn的N鍵結型糖鏈(N297鍵結糖鏈)之活性，與EndoS D233Q之活性比較而顯示經降低的水解活性。
  2. 如請求項1之EndoS變異酵素，其中，追加變異係包含選自包含H122、P184、D279、Y282、Q303、Y348、E350、Y402、D405及R406之群組的1~4個胺基酸之部位。
  3. 如請求項1之EndoS變異酵素，其中，追加變異的位置包含選自包含Q303、E350及D405之群組的1個胺基酸中之變異。
  4. 如請求項1至3中任一項之EndoS變異酵素，其中，追加變異係選自以下之群組的至少1個：H122的變異後之胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Glu、Asp、Leu、Ile、Pro、Met或Phe；P184的變異後之胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Gln或Asn；D279的變異後之胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala或Gln； Y282的變異後之胺基酸為Arg、Lys或His；Q303的變異後胺基酸為Met、Pro或Leu；Y348的變異後胺基酸為His或Trp；E350的變異後胺基酸為Lys、Arg、His、Tyr、Gln、Asn、Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala；Y402的變異後之胺基酸為Phe或Trp；D405的變異後胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala；及R406的變異後胺基酸為Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Glu、Asp、Gln或Asn。
  5. 如請求項4之EndoS變異酵素，其中，追加變異係選自以下之群組的至少1個：H122為Ala(H122A)或Phe(H122F)；P184為Gln(P184Q)；D279為Ser(D279S)或Gln(D279Q)；Y282為Arg(Y282R)；Q303為Leu(Q303L)；Y348為His(Y348H)；E350為Ala(E350A)、Asn(E350N)、Asp(E350D)或Gln(E350Q)；Y402為Phe(Y402F)或Trp(Y402W)；D405為Ala(D405A)；及R406為Gln(R406Q)。
  6. 如請求項5之EndoS變異酵素，其中，作為追加變異而包含選自包含Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q及D405A之群組的至少1個之變異。
  7. 如請求項6之EndoS變異酵素，其中，追加變異為Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q、D405A、H122A/Q303L、H122F/Q303L、P184Q/Q303L、D279Q/Q303L、D279S/Q303L、Y282R/Q303L、Q303L/Y348H、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/Y402F、Q303L/Y402W、Q303L/D405A、Q303L/R406Q、H122A/E350A、H122F/E350A、P184Q/E350A、D279Q/E350A、D279S/E350A、Y282R/E350A、Y348H/E350A、E350A/Y402F、E350A/Y402W、E350A/D405A、E350A/R406Q、H122A/E350N、H122F/E350N、P184Q/E350N、D279Q/E350N、D279S/E350N、Y282R/E350N、Y348H/E350N、E350N/Y402F、E350N/Y402W、E350N/D405A、E350N/R406Q、H122A/E350D、H122F/E350D、P184Q/E350D、D279Q/E350D、D279S/E350D、Y282R/E350D、Y348H/E350D、E350D/Y402F、E350D/Y402W、E350D/D405A、E350D/R406Q、H122A/E350Q、H122F/E350Q、P184Q/E350Q、D279Q/E350Q、D279S/E350Q、Y282R/E350Q、E350Q/Y348H、E350Q/Y402F、E350Q/Y402W、E350Q/D405A、E350Q/R406Q、H122A/D405A、H122F/D405A、P184Q/D405A、D279Q/D405A、D279S/D405A、Y282R/D405A、Y348H/D405A或D405A/R406Q。
  8. 如請求項7之EndoS變異酵素，其中，追加變異為Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q、D405A、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/D405A、E350A/D405A、E350N/D405A、E350D/D405A或E350Q/D405A。
  9. 如請求項4之EndoS變異酵素，其中，追加變異為H122A、H122F、P184Q、D279Q、D279S、Y282R、Y348H、Y402F、Y402W或R406Q。
  10. 如請求項1之EndoS變異酵素，其中，對N297鍵結糖鏈之活性係於在pH7.4之反應液中的水解反應中，維持50%以下的水解率至24小時後。
  11. 如請求項1之EndoS變異酵素，其中，作為對N297鍵結糖鏈之活性，進一步顯示在pH7.4之反應液中的使用了5等量之糖鏈供體的醣基轉移反應中，48小時後的醣基轉移率為約60%以上之活性。
  12. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至11中任一項之EndoS變異酵素。
  13. 一種載體，其包含與如請求項12之多核苷酸互補的核苷酸。
  14. 一種宿主細胞，其係經如請求項13之載體所轉形。
  15. 一種經糖鏈重塑之含Fc區域的分子之製造方法，其特徵為在如請求項1至11中任一項之EndoS變異酵素之存在下，使含有具有可進行岩藻醣加成之核心GlcNAc的IgG之Fc區域的分子作為N297鍵結糖鏈，與具有含有被唑啉化之GlcNAc的結構之糖鏈供體進 行反應，使含Fc區域的分子產生，該所產生之含Fc區域的分子係具有該糖鏈供體所具有的糖鏈轉移至該含Fc區域的分子之N297鍵結糖鏈之該核心GlcNAc的結構。
  16. 如請求項15之製造方法，其中，含Fc區域的分子為IgG單株抗體。
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