KR102546854B1 - 신규 EndoS 변이 효소 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, EndoS D233Q 의 아미노산 서열에 추가로 특정한 추가 변이를 갖고, IgG 의 297 번째의 Asn 에 결합하는 N 결합형 당 사슬 (N297 결합 당 사슬) 에 대한 활성으로서, EndoS D233Q 의 활성과 비교하여 저감된 가수 분해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, EndoS 변이 효소, 그것을 코드하는 유전자 등을 제공한다.

Description

신규 EndoS 변이 효소{NOVEL ENDOS MUTANT ENZYME}
본 발명은, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 S (EndoS) 의 신규 변이체, 당해 변이체를 코드하는 유전자, 재조합 플라스미드, 그 플라스미드에 의해 형질 전환된 형질 전환체, 당해 변이체를 사용한 항체의 당 사슬 수식 방법에 관한 것이다.
당 단백질은 동식물의 조직, 진핵 미생물의 세포막, 벽 등에 널리 존재하고 있다. 최근, 당 단백질의 당 사슬이, 세포의 분화, 암화, 세포간의 인식 등의 기구에 중요한 역할을 하고 있는 것이 명확해지고 있고, 그 기구 해명을 위해서 당 사슬의 구조와 기능의 상관에 대하여 연구가 진행되고 있다. 배양 세포계에 있어서, 당 단백질은, 균일한 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서 번역되고, 그 후 번역 후 수식에 의해 당 사슬이 부가되어, 배양액 중에 생산된다. 이 번역 후 수식은, 아미노산 서열에 대응하여 일의적으로 결정되는 것은 아니기 때문에, 동일한 배양계에 발현시킨 동일한 단백질이어도 부가되는 당 사슬의 구조는 다양하다.
항체는, 중사슬 분자 중의 Fc 영역에 위치하는 297 번째의 Asn 측사슬에 결합한 N 결합형 당 사슬 (N297 결합 당 사슬) 을 갖는 당 단백 분자이다. 항체는, 기초 연구나 의료 분야에 있어서 중요한 분자이고, 특히 항체 의약으로서의 연구 개발이 활발히 진행되고 있어, 당 사슬의 다양한 영향이 분명해지고 있다 (비특허문헌 1 : J. N. Arnold et al., Annu. Rev. Immunol, 2007, 25, 21050). 현재, 주로 사용되고 있는 의료용 항체는, IgG 클래스의 분자이고, 이와 같은 항체는, 일반적으로 CHO 세포나 NS0 세포로 대표되는 배양 동물 세포를 사용하여 산생되고, 이들 동물 세포로 산생되는 항체의 N297 결합 당 사슬은 바이안테너리 (biantennary) 복합형 당 사슬이지만, 코어 푸코오스나 말단의 시알기나 갈락토실기 그리고 바이섹팅 (bisecting) GlcNAc 에 있어서 불균일한 것이 취득된다 (비특허문헌 2 : R. Jerfferis, Biotechnol. Prog., 2005, 21-11-6). 항체의 N297 결합 당 사슬이, ADCC (Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity) 나 CDC 를 포함하는 이펙터 활성에 크게 영향을 주는 것이 분명해져 있고 (비특허문헌 3 : Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34 - 47, (비특허문헌 4 : Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 226 - 234), 혈중 반감기에도 영향을 미칠 가능성이 지적되고 있다 (비특허문헌 5 : D. Bumbaca, AAPSJ, 2012, 14, 3). 또한, N297 결합 당 사슬의 비환원 말단이 2,6-sialyl 화된 항체가 IVIG 에 있어서의 주요 약효 성분인 것이 밝혀져 있다 (비특허문헌 6 : Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110 - 122). 또한, IgG 나 Fc 단편을 포함하는 의료용 분자에 있어서, N297 결합 당 사슬의 불균일성이 유효 성분으로서의 성질이나 품질에 큰 영향을 주는 것으로 생각되고 있고, 불균일인 당 사슬 수식 분자의 미량의 혼입이 최종 생산물의 특성을 크게 바꾸게 될 가능성을 부정할 수 없다.
이와 같은 현 상황으로부터, 의료용의 항체나 항체 Fc 영역을 포함하는 당 단백 분자의 제조에 있어서, 당 사슬을 균일화시키는 기술이 개발되고 있다. 당 단백질에 부가하는 당 사슬을 균일하게 하는 방법으로는, 효소를 사용한 당 전이 반응이 알려져 있다 (비특허문헌 6 : Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110 - 122, (비특허문헌 7 : Wang, Trends Glycosci. Glycotechnol. 2011, 23, 33 - 52.). 이것은, in vitro 환경에서의 당 사슬의 절단 (가수 분해 반응) 과 다른 당 사슬의 축합 (당 전이 반응) 으로 이루어지는, 다단계 프로세스이다. 특히 N 형 당 사슬의 변환을 목적으로 하는 경우, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제라고 불리는 1 군의 효소 패밀리가 사용된다. 이 효소의 특성으로서, 1) 기질 특이성으로서 복합형 당 사슬에 대한 가수 분해 반응을 실시하는 능력을 가지는 것, 및, 2) 특정한 구조에 대한 당 전이 반응을 실시하는 능력을 가지는 것이 요구된다. 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 다양한 종으로부터 분리되어 있고, 기질로 하는 당 사슬의 종류에 따라 야생형이나 변이체가 구분되어 사용된다. EndoA (Arthrobacter protophormiae 유래 효소) (비특허문헌 8 : Takegawa, Biochem Int. 1991 Jul ; 24(5) : 849 - 55), EndoD (Streptococcus pneumoniae 유래 효소) (비특허문헌 9 : Fan, J Biol Chem. 2012 Mar 30 ; 287(14) : 11272 - 81), EndoM (Mucor hiemalis 유래 효소) (비특허문헌 10 : Umekawa, Biochem Biophys Res Co㎜un. 1994 Aug 30 ; 203(1) : 244 - 52), EndoH (비특허문헌 11 : Robbins, J Biol Chem. 1984 Jun 25 ; 259(12) : 7577 - 83), EndoF2 (Flavobacterium Meningosepticum 유래 효소) (비특허문헌 12 : ; Huang, Chembiochem. 2011 April 11 ; 12(6) : 932 - 941), EndoE (Enterococcus faecalis 유래 효소) (비특허문헌 13 : Collin, JBC 2004, 279 - 21) 및 EndoS (Streptococcus pyogenes 유래 효소) (비특허문헌 14 : Collin, EMBO J. 2001 Jun 15 ; 20(12) : 3046 - 55) 등이 당 사슬 균일화의 목적으로 사용되고 있지만, 그 중에서도 코어 푸코오스를 갖는 복합형의 N297 결합 당 사슬을 기질로 하고, 가수 분해 활성과 당 전이 활성을 겸비하는 것이 확인되어 있는 효소는 EndoS 뿐이다 (비특허문헌 15 : Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3. ;, (비특허문헌 16 : Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030 - 8033).
또한 EndoS 에 있어서는, 2 개의 촉매 잔기인 233 번째의 Asp 와 235 번째의 Glu 중, 구핵 촉매 잔기인 233 번째의 Asp 를 Gln 으로 치환하는 변이를 도입한 EndoS D233Q 에 있어서, 가수 분해 활성이 어느 정도 억제되는 것이 알려져 있다. 이 변이체는 반응계 중에 당 사슬의 환원 말단을 옥사졸린화한 중간체가 대량으로 존재하는 조건하에서, 당 전이 반응이 선택적으로 진행되는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 17 : Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308 - 12318, 특허문헌 1 : WO 2013/120066 Al, (비특허문헌 18 : B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol 111, No.18, pp6714 - 6719)). 또한, EndoS 로 분류되는 효소의 서열은 pyogenes 종 중에서도 상이한 스트레인으로부터 상이한 세로타입에서 유래하는 서열이 다수 보고되어 있다. 특히 세로타입 M49 유래의 EndoS2 (비특허문헌 19 : Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1 ; 455(1) : 107 - 18, EndoS49 라고 불리는 경우도 있다) 는 동일한 기질 특성을 갖는 것으로 보고되어 있다.
그러나, 이들 이미 알려진 EndoS 나 EndoS D233Q 등의 변이 효소의 활성은, 의료용 항체의 당 사슬 리모델링을 공업 스케일로 실시하는 데에 충분한 것이 아니어서, 더욱 효율적인 당 사슬 리모델링을 가능하게 하는 기술 개량이 요구되고 있다.
WO 2013/120066 Al 팜플렛
J. N. Arnold et al., Annu. Rev. Immunol, 2007, 25, 21050 R. Jerfferis, Biotechnol. Prog., 2005, 21-11-6 Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34 - 47 Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 226 - 234 D. Bumbaca, AAPSJ, 2012, 14, 3 Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110 - 122 Wang, Trends Glycosci. Glycotechnol. 2011, 23, 33 - 52 Takegawa, Biochem Int. 1991 Jul ; 24(5) : 849 - 55 Fan, J Biol Chem. 2012 Mar 30 ; 287(14) : 11272 - 81 Umekawa, Biochem Biophys Res Co㎜un. 1994 Aug 30 ; 203(1) : 244 - 52 Robbins, J Biol Chem. 1984 Jun 25 ; 259(12) : 7577 - 83 Huang, Chembiochem. 2011 April 11 ; 12(6) : 932 - 941 Collin, JBC 2004, 279 - 21 Collin, EMBO J. 2001 Jun 15 ; 20(12) : 3046 - 55 Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3. ; Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030 - 8033 Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308 - 12318 B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol 111, No.18, pp 6714 - 6719) Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1 ; 455(1) : 107 - 18
본 발명은, IgG 의 Fc 영역의 당 사슬에 대한 특이성을 가진 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제, EndoS 의 가수 분해 활성이 억제된 변이체로서 알려져 있는 EndoS D233Q 와 비교하여, 그 가수 분해 활성이 보다 저감되고, 또한, 일정한 당 전이 활성을 유지하는 신규의 변이 효소를 제공하는 것을 목적으로 한다.
공지된 EndoS D233Q 를 사용한 연구로부터, 이 변이체가 일정한 가수 분해 활성을 유지하기 위해서, 당 전이 반응에 있어서, 반응 개시로부터의 시간 경과와 함께, 당 전이율이 저하하는 것을 알아냈다. 이 때문에, EndoS 나 기존의 변이체를 사용한 당 사슬 리모델링에 의해, 균일한 당 사슬을 갖는 항체를 고순도로 취득하는 것은 곤란하고, 특히 대용량에서의 반응에서는, 정제 공정으로 진행되기까지 필요로 하는 시간이 길어지기 때문에, 최종적으로 효소와 분리한 단계에서는, 당 사슬이 절단된 항체가 필연적으로 혼입하게 된다.
또한, 당 사슬 도너로서 사용되는 화학 합성되는 당 사슬 옥사졸린체는 고가인 경우가 많아, 대량으로 소비하는 것은, 생산 비용의 증대로 연결된다. 그 때문에, 균일한 당 사슬을 갖는 항체를 고순도로 제조하기 위해서는, EndoS D233Q 와 비교하여, 가수 분해 활성이 보다 억제되고, 또한 일정 이상의 당 사슬 전이 활성을 갖는 효소가 필요하다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, EndoS D233Q 의 아미노산 서열 정보와 입체 구조를 참고로, 다수의 변이체를 설계·제작하고, D233Q 에 더하여 특정한 아미노산에 추가 변이를 갖는 신규의 변이 효소가 목적으로 하는 활성을 갖는 것을 알아내고, 더욱 연구를 진행시킴으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 이하의 발명을 제공한다.
(1) 서열 번호 2 의 아미노산 번호 37 ∼ 995 의 아미노산 서열에 있어서, 122 번째 (H122), 184 번째 (P184), 279 번째 (D279), 282 번째 (Y282), 303 번째 (Q303), 348 번째 (Y348), 350 번째 (E350), 402 번째 (Y402), 405 번째 (D405), 및, 406 번째 (R406) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 지점에 추가 변이를 갖고, 또한, IgG 의 297 번째의 Asn 에 결합하는 N 결합형 당 사슬 (N297 결합 당 사슬) 에 대한 활성으로서, EndoS D233Q 의 활성과 비교하여 저감된 가수 분해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, EndoS 변이 효소.
(2) 추가 변이가, H122, P184, D279, Y282, Q303, Y348, E350, Y402, D405, 및, R406 으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 ∼ 4 아미노산으로 이루어지는 부위인 것을 특징으로 하는, (1) 의 EndoS 변이 효소.
(3) 추가 변이의 지점이, Q303, E350 및 D405 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 아미노산에 있어서의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, (1) 의 EndoS 변이 효소.
(4) 추가 변이가 이하의 군에서 선택되는 적어도 1 개인, (1) 또는 (2) 의 EndoS 변이 효소,
H122 의 변이 후의 아미노산은, Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala, Glu, Asp, Leu, Ile, Met 또는 Phe ;
P184 의 변이 후의 아미노산이 Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Ala, Gln 또는 Asn ;
D279 의 변이 후의 아미노산은, Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala 또는 Gln ;
Y282 의 변이 후의 아미노산은, Arg, Lys 또는 His ;
Q303 의 변이 후 아미노산은, Met, Pro 또는 Leu ;
Y348 의 변이 후 아미노산은, His 또는 Trp ;
E350 의 변이 후 아미노산은, Lys, Arg, His, Tyr, Gln, Asn, Asp, Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro 또는 Ala ;
Y402 의 변이 후의 아미노산은, Phe 또는 Trp ;
D405 의 변이 후 아미노산은, Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro 또는 Ala ;, 및,
R406 의 변이 후 아미노산은, Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro 또는 Ala, Glu, Asp, Gln 또는 Asn.
(5) 추가 변이가 이하의 군에서 선택되는 적어도 1 개인, (4) 의 EndoS 변이 효소,
H122 가 Ala (H122A) 또는 Phe (H122F) ;
P184 가 Gln (P184Q) ;
D279 가 Ser (D279S) 또는 Gln (D279Q) ;
Y282 가 Arg (Y282R) ;
Q303 이 Leu (Q303L) ;
Y348 이 His (Y348H) ;
E350 이 Ala (E350A), Asn (E350N), Asp (E350D) 또는 Gln (E350Q) ;
Y402 가 Phe (Y402F) 또는 Trp (Y402W) ;
D405 가 Ala (D405A) ; , 및,
R406 이 Gln (R406Q).
(6) 추가 변이로서, Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q 및 D405A 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, (5) 의 EndoS 변이 효소.
(7) 추가 변이가, Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q, D405A,
H122A/Q303L, H122F/Q303L, P184Q/Q303L, D279Q/Q303L, D279S/Q303L, Y282R/Q303L, Q303L/Y348H, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/Y402F, Q303L/Y402W, Q303L/D405A, Q303L/R406Q,
H122A/E350A, H122F/E350A, P184Q/E350A, D279Q/E350A, D279S/E350A, Y282R/E350A, Y348H/E350A, E350A/Y402F, E350A/Y402W, E350A/D405A, E350A/R406Q,
H122A/E350N, H122F/E350N, P184Q/E350N, D279Q/E350N, D279S/E350N, Y282R/E350N, Y348H/E350N, E350N/Y402F, E350N/Y402W, E350N/D405A, E350N/R406Q,
H122A/E350D, H122F/E350D, P184Q/E350D, D279Q/E350D, D279S/E350D, Y282R/E350D, Y348H/E350D, E350D/Y402F, E350D/Y402W, E350D/D405A, E350D/R406Q,
H122A/E350Q, H122F/E350Q, P184Q/E350Q, D279Q/E350Q, D279S/E350Q, Y282R/E350Q, E350Q/Y348H, E350Q/Y402F, E350Q/Y402W, E350Q/D405A, E350Q/R406Q,
H122A/D405A, H122F/D405A, P184Q/D405A, D279Q/D405A, D279S/D405A, Y282R/D405A, Y348H/D405A, 또는, D405A/R406Q, 인 것을 특징으로 하는, (6) 의 EndoS 변이 효소.
(8) 추가 변이가, Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q, D405A, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/D405A, E350A/D405A, E350N/D405A, E350D/D405A, 또는, E350Q/D405A 인, (7) 의 EndoS 변이 효소.
(9) 추가 변이가, H122A, H122F, P184Q, D279Q, D279S, Y282R, Y348H, Y402F, Y402W, 또는 R406Q 인, (4) 의 EndoS 변이 효소.
(10) N297 결합 당 사슬에 대한 활성이, pH 7.4 의 반응액 중에서의 가수 분해 반응에 있어서, 24 시간 후까지, 50 ％ 이하의 가수 분해율을 유지하는 것을 특징으로 하는, (1) 의 EndoS 변이 효소.
(11) N297 결합 당 사슬에 대한 활성으로서, 추가로, pH 7.4 의 반응액 중에서의, 당 사슬 도너가 N297 결합 당 사슬을 포함하는 억셉터 분자의 5 등량의 당 전이 반응에 있어서 48 시간 후의 당 전이율이 약 60 ％ 이상인 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는, (1) 의 EndoS 변이 효소.
(12) (1) ∼ (11) 의 어느 하나의 EndoS 변이 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
(13) (12) 의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
(14) (13) 의 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
(15) (1) ∼ (11) 의 어느 하나의 EndoS 변이 효소의 존재하에서, N297 결합 당 사슬로서, 푸코오스 부가하고 있어도 되는 코어 GlcNAc 를 갖는 IgG 의 Fc 영역을 포함하는 분자와 옥사졸린화된 GlcNAc 를 포함하는 구조를 갖는 당 사슬 도너를 반응시키고, 당해 Fc 영역 함유 분자의 N297 결합 당 사슬의 당해 코어 GlcNAc 에, 당해 당 사슬 도너가 갖는 당 사슬이 전이한 구조를 갖는 Fc 영역 함유 분자를 산생시키는 것을 특징으로 하는, 당 사슬 리모델링된 Fc 영역 함유 분자의 제조 방법.
(16) Fc 영역 함유 분자가, IgG 모노클로날 항체인, (15) 의 제조 방법.
본 발명의 신규의 EndoS 변이 효소는, 가수 분해 활성이 저감된 변이체로서 알려진 EndoS D233Q 와 비교하여, 가수 분해 활성이 더욱 저감되고, 또한, 일정 이상의 당 전이 활성을 유지하기 때문에, 당 사슬 리모델링에 의해, 균일한 당 사슬을 갖는 항체를, 보다 효율적으로, 보다 고순도로 취득하는 것이 가능하다. 또한, 당 사슬 리모델링에 있어서 사용하는 당 사슬 도너의 양도 저감시킬 수 있기 때문에, 당 사슬 리모델링된 항체의 제조 비용의 저감으로 연결된다.
도 1 은 당 사슬 리모델링에 있어서 당 사슬 도너로서 사용할 수 있는 SG-Oxa 의 화학 구조식 (좌) 및 그 당 사슬을 기호화한 표시 (우) 를 나타내는 도면이다.
도 2 는 EndoS 또는 EndoS 변이 효소를 사용한, 항체의 N297 결합 당 사슬에 대한 가수 분해 반응의 모식도이다.
도 3 은 EndoS 또는 EndoS 변이 효소를 사용한 당 전이 반응을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 4 는 각종 EndoS 변이 효소 (EndoS D233Q, EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/Q303L/E350Q, EndoS D233Q/Q303L/D405A, EndoS D233Q/E350Q, EndoS D233Q/D405A 및 EndoS D233Q/Y402F) 의 아미노산 서열의 얼라이먼트를 나타내는 도면이다. 아미노산 번호는 시그널 서열 (1 ∼ 36) 을 포함하는 코드 영역 전체 길이를 기준으로 번호 부여되어 있다. 도 4a 에는, 각 변이 효소의 아미노산 번호 37 ∼ 176 의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 4b 는 도 4a 의 계속이고, 각 변이 효소의 아미노산 번호 177 ∼ 316 의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 4c 은 도 4b 의 계속이고, 각 변이 효소의 아미노산 번호 317 ∼ 456 의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 4d 는 도 4c 의 계속이고, 각 변이 효소의 아미노산 번호 467 ∼ 596 의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 4e 는 도 4d 의 계속이고, 각 변이 효소의 아미노산 번호 597 ∼ 736 의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 4f 은 도 4e 의 계속이고, 각 변이 효소의 아미노산 번호 737 ∼ 876 의 얼라이먼트를 나타낸다.
도 4g 은 도 4f 의 계속이고, 각 변이 효소의 아미노산 번호 877 ∼ 995 의 얼라이먼트를 나타낸다.
이하에, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 명세서에 있어서, 분자 중에 포함되는 아미노산의 표기법은, 본 분야의 관례에 따라, 변이 지점을 나타내는 경우에는 야생형의 아미노산 (또는 핵산) 의 1 글자 표기와 그 번호 (예를 들어, 233 번째의 Asp 이면 「D233」) 에 의해 나타낸다. 또한, 변이에 대해서는, 야생형의 아미노산 (또는 핵산) 의 1 글자 표기, 그 번호 및 변이 후의 아미노산 (또는 핵산) 의 1 글자 표기 (예를 들어, 233 번째의 Asp 가 Gln 으로 치환된 변이는 「D233Q」) 에 의해 나타낸다. 또한, 변이를 갖는 특정한 변이체는, 분자명과 변이 (예를 들어, EndoS 의 233 번째 Asp 가 Gln 으로 치환된 변이체는, 「EndoS D233Q」) 에 의해 나타내고, 복수의 변이를 갖는 경우에는, 변이 사이를 「/」 로 단락 짓는 형태 (예를 들어, EndoS D233Q 에 있어서, 303 번째의 Gln 이 Leu 로 치환된 추가 변이를 갖는 변이체는, 「EndoS D233Q/Q303L」) 이라고 나타낸다.
본 발명에 있어서, 「N297 결합 당 사슬」 이란, IgG 중사슬의 297 번째 Asn 의 측사슬에 결합하는 당 사슬을 의미한다. IgG 를 단편화한 경우, 당해 Asn 을 포함하는 펩티드 단편에 있어서, 대응하는 Asn 에 결합하는 당 사슬이어도, N297 결합 당 사슬에 포함된다. 통상적으로, 동물 등에서 산생된 IgG 에 있어서의 N297 결합 당 사슬은, 하기 식의 구조로 이루어지는 기본 구조를 가지고 있고, 그 비환원 말단에는, 추가로 Gal 이나 시알산이 부가되어 있어도 된다.
[화학식 1]
Figure 112018004793860-pct00001
[화학식 2]
Figure 112018004793860-pct00002
세포가 산생하는 IgG 의 N297 결합 당 사슬의 대부분은, 이 기본 구조에 있어서, 그 환원 말단의 GlcNAc (코어 GlcNAc), 비환원 말단, 분기당 등에 있어서 추가로 당 사슬이 결합한 것을 포함하는, 당 사슬 구조의 다양성을 가지고 있다. 코어 GlcNAc 의 6 위치에는 푸코오스가 α1,6 결합한 코어 푸코오스를 갖는 구조 ((Fucα1,6) GlcNAc) 로 수식되어 있어도 된다. 분기당인 Man 에 있어서는, 그 5 위치에 추가로 GlcNAc 를 포함하는 당 사슬이 결합한 3 분기형의 당 사슬을 형성하고 있는 경우도 있다. 비환원 말단의 GlcNAc 에 있어서는, Gal 이나 시알산을 포함하는 당 사슬이 추가로 결합하고 있는 경우도 있다.
본 발명에 있어서, 「당 사슬 도너」 란, 당 사슬의 환원 말단에, 옥사졸린화된 GlcNAc 를 갖는 당 사슬 함유 분자이고, 다양한 당 사슬 구조의 분자를 사용할 수 있다.
창약을 목적으로 한 당 사슬 리모델링에 사용하는 경우, 인간에게 적용했을 때에 문제가 적은 인간형 당 사슬, 또는, 인간 적합형 당 사슬을 갖는 당 사슬 도너를 채용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 당 사슬은, 인간의 체내에서 항원성을 나타내지 않는 것이 알려져 있는 당 사슬이고, N 결합형 당 사슬에서는, 고만노오스형, 혼성 (하이브리드) 형, 복합 (컴플렉스) 형 등이 알려져 있다. 이들 3 개에는 공통의 기본 구조가 있다. 고만노오스형은, 환원 말단에 가까운 위치에 있는 만노오스 (β 만노오스) 로부터 분기한 2 개의 분기 사슬 (1-3 사슬, 1-6 사슬) 에, 복수의 만노오스가 연속한 만노오스 리치 구조를 갖는 당 사슬이다. 혼성형이란, 환원 말단에 가까운 위치에 있는 만노오스 (β 만노오스) 로부터 분기한 2 개의 분기 사슬 (1-3 사슬, 1-6 사슬) 중, 일방에 GlcNAc 를 갖는 구조로 된 것이다. 복합형이란, 환원 말단에 가까운 위치에 있는 만노오스 (β 만노오스) 로부터 분기한 2 개의 분기 사슬 (1-3 사슬, 1-6 사슬) 에 GlcNAc 를 갖는 구조로 되어 있고, 갈락토오스의 유무, 시알의 유무, 추가로 이들 결합 이성이나 위치 이성을 포함하는 다채로운 구조를 갖는 것이다. (표 1 참조). 대표적인 당 사슬 도너는 실시예 2 에서 제조된 SG-Oxa (도 1) 이다.
Figure 112018004793860-pct00003
본 발명에 있어서, 「억셉터 분자」 란, 비환원 말단에 GlcNAc 를 갖는 당 구조를 포함하는 분자이고, EndoS 또는 그 변이 효소 존재하에서, 당 사슬 도너 분자와 반응시킴으로써, 당해 비환원 말단의 GlcNAc 의 4 위치에 당 사슬 도너 분자의 옥사졸린 고리가 반응하여, 키토비오스 구조를 형성할 수 있다. 억셉터 분자로서 전형적인 것은, 모노클로날 항체에서 유래하는, 코어 Fuc 가 결합하고 있어도 되는 코어 GlcNAc 만으로 이루어지는 N297 결합 당 사슬을 갖는 IgG 또는 그 Fc 단편이다. 코어 GlcNAc 에는, 그 유래가 되는 항체 또는 그 산생 방법에 따라, 코어 Fuc 가 결합하고 있어도 되고, 결합하고 있지 않아도 된다. 억셉터 분자의 유래로는 다양한 모노클로날 항체 또는 Fc 영역 함유 분자 (Fc, 중사슬로부터 가변 영역을 결실시킨 정상 영역만으로 이루어지는 CH 와 경사슬의 정상 영역만으로 이루어지는 CL 과 조합한 CLCH 등) 를 이용할 수 있지만, 바람직하게는 (Fucα1,6)-GlcNAc-IgG, (Fucα1,6)-GlcNAc-Fc, (Fucα1,6)-GlcNAc-CLCH 등을 들 수 있고, 대표예로는, 실시예 3 에서 제조된 (Fucα1,6)-GlcNAc-Trastuzumab (트라스투주맙) 를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「EndoS」 란, 스트렙토코커스 피요제네스 (Streptococcus pyogenes) 에서 유래하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 (ENGase) 의 일종이고, 서열 번호 1 의 아미노산 번호 37 ∼ 995 (1 ∼ 36 번째의 아미노산은 시그널 서열을 나타낸다) 의 아미노산 서열에 있어서, 233 번째의 아미노산이 Asp 인 아미노산 서열로 이루어지는 효소 (EC 3.2.1.96, GH18) 이다. EndoS 는, IgG 에서 유래하는 Fc 부위의 N297 결합 당 사슬을 특이적으로 인식하고, 가수 분해 활성과 당 전이 활성을 겸비한다. EndoS 의 가수 분해 활성은 상기의 기본 구조를 갖는 N297 결합 당 사슬의 코어 키토비오스에 포함되는 β1,4 글리코시드 결합을 특이적으로 가수 분해하는 활성 (본 명세서에 있어서, 특별히 언급이 없는 한, 「가수 분해 활성」 이란, 이 활성을 의미한다. 반응 모식도를 도 2 에 나타낸다.) 이다. EndoS 의 당 전이 활성은, N297 에 코어 GlcNAc (코어 푸코오스가 부가하고 있어도 되고, 부가하고 있지 않아도 된다) 만을 갖는 Fc 부위를 포함하는 억셉터 분자에, 환원 말단에 옥사졸린화된 GlcNAc 를 갖는 당 사슬 도너에서 유래하는 당 사슬의 환원 말단을 글리코시드 결합시키는 활성 (이하, 「당 전이 활성」 이라고 한다. 반응 모식도를 도 3 에 나타낸다.) 이다.
EndoS 의 구조는, 엔도글리코시다제 효소 도메인 (endoglycosidase enzymatic domain, 촉매 도메인 : 서열 번호 1 의 아미노산 번호 98 ∼ 445), 류신-고 반복 도메인 (Leucine-rich repeat domain, 서열 번호 1 의 아미노산 번호 446 ∼ 631), 하이브리드 Ig 도메인 (hybrid Ig domain, 서열 번호 1 의 아미노산 번호 632 ∼ 764), 카르보하이드레이트-바인딩 모듈 (Carbohydrate-binding module, CBM : 서열 번호 1 의 아미노산 번호 765 ∼ 923), 및, 쓰리 헬릭스-번들 도메인 (three helix-bundle domain, 서열 번호 1 의 아미노산 번호 924 ∼ 995) 의 5 개의 도메인 구조를 갖는 것이 보고되어 있고 (B. Trastoy et al., PNAS (2014) vol 111, No. 18, pp 6714 - 6719), 그 중 항체와의 상호 작용에 중요한 부위는, 촉매 도메인과 CBM 의 2 개로 생각되고 있다.
EndoS 는, 그룹 A 스트렙토코커스 (Group A Streptococcus, GAS) 에 있어서 잘 보존된 효소이지만, GAS 의 세로타입 M49 에 속하는 NZ131 로부터 알아낸 EndoS2 (EndoS49 라고 불리는 경우도 있다. Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1 ; 455(1) : 107 - 18, US 2014/0302519 A1)) 는, 서열 동일성은 37 ％ 이지만, 촉매 도메인을 구성하는 아미노산 중 중요한 것이 잘 보존되어 있고, EndoS 와 유사한 기질 특이성을 나타낸다. 본 명세서에 있어서, 이와 같은 EndoS 의 활성 영역의 아미노산 상동성/동일성을 유지하는 효소를, 「EndoS 유연 효소」 라고 한다. EndoS 의 중요한 변이 부위인, H122, D233, D279, Q303, E350, Y402, D405, 및, R406 은, 각각 EndoS2 에 있어서는, H75, D184, D226, Q250, E289, Y339, D342, 및, R343 에 대응하고 있다. EndoS2 와 같은 유연 효소에 있어서, 대응하는 아미노산이 변이한 변이 효소도 본 발명의 변이 효소에 포함되는 것으로 한다.
본 발명에 있어서, 「EndoS D233Q」 란, 야생형 EndoS 의 233 번째의 Asp 가 Gln 으로 치환된 서열 (서열 번호 1 의 아미노산 번호 37 ∼ 995 의 아미노산 서열) 로 이루어지는 효소이고, EndoS 가 갖는 가수 분해 활성이 일정 정도 억제되고, 또한, 야생형과 동일한 정도의 당 전이 활성을 유지하는 변이 효소이다.
＜본 발명의 변이 효소＞
본 발명은, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 37 ∼ 995 의 아미노산 서열에 있어서 당 전이 활성에 필요한 영역을 함유하는 EndoS D233Q 의 변이 효소로서, D233Q 에 더하여 추가로, 특정한 필수 추가 변이 지점군에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 지점에 추가 변이를 갖고, 또한, IgG 의 N297 결합 당 사슬에 대한 활성으로서, EndoS D233Q 와 비교하여 가수 분해 활성이 저감되어 있는 것을 특징으로 하는, EndoS 의 변이 효소를 제공한다.
본 발명에 있어서, 「추가 변이」 란, EndoS D233Q 의 아미노산 서열에 있어서, D233 이외의 아미노산에서 발생하는, 추가적인 아미노산 변이를 의미한다. 본 발명에 있어서, 「필수 추가 변이 지점군」 이란, 본 발명의 변이 효소에 있어서, 반드시 추가 변이되는 지점의 후보군이고, 서열 번호 2 의 아미노산 서열에 있어서 Xaa 로서 나타나는 지점, 즉, H122, P184, D279, Y282, Q303, Y348, E350, Y402, D405, 및, R406 으로 이루어지는 군이지만, 바람직하게는, Q303, E350, 및, D405 로 이루어지는 군이다.
본 발명의 변이 효소는, EndoS D233Q 보다 저감된 가수 분해 활성, 및, 일정한 당 전이 활성을 겸비하는 (이하, 양방의 활성을 겸비하는 것을 「본 효소 활성」 을 갖는다 라고 한다) 것을 특징으로 한다. 변이 효소가, 본 효소 활성을 갖는지 여부는, 후술하는 실시예 4 의 방법에 의해, 그 가수 분해 활성 및 당 전이 활성을 평가할 수 있다.
본 발명의 변이 효소가 갖는 본 효소 활성 중, 가수 분해 활성은, EndoS D233Q 의 가수 분해 활성과 비교하여 억제되는, 즉, 실시예 4 에 기재된 pH 7.4 의 조건에 있어서의 가수 분해율이, 반응 개시로부터 1 ∼ 48 시간 후까지의 어느 시간점에 있어서, EndoS D233Q 의 가수 분해율보다 낮은 값을 나타내는 것이지만, 바람직하게는 가수 분해 반응 개시 후 24 시간 후의 가수 분해율이 50 ％ 이하, 또는, 48 시간 후의 가수 분해율이 60 ％ 이하이고, 보다 바람직하게는 가수 분해 반응 개시 후 24 시간까지의 가수 분해율이 40 ％ 이하를 유지하는 것이고, 더욱 바람직하게는 동시간까지 30 ％ 이하를 유지하는 것이고, 보다 더욱 바람직하게는 20 ％ 이하를 유지하는 것이고, 가장 바람직하게는, 모든 시간점에 있어서 가수 분해율이 0 ％ 를 나타내어, 가수 분해 활성을 완전하게 소실한 것이다.
본 발명의 변이 효소가 갖는 본 효소 활성 중, 당 전이 활성은, EndoS D233Q 의 당 전이 활성과 동일한 정도, 즉, 실시예 4 에 기재된 pH 7.4, 당 사슬 도너가 N297 결합 당 사슬을 포함하는 억셉터 분자의 5 등량 조건에 있어서의 당 전이율이, 반응 개시로부터 1 ∼ 48 시간 후까지의 어느 시간점 이후에 있어서, EndoS D233Q 의 당 전이율과 동등하거나 그 이상 (예를 들어, EndoS D233Q 의 값의 70 ％ 이상) 의 당 전이율을 나타내는 것이지만, 바람직하게는 반응 개시 후 48 시간까지 당 전이율이 50 ％ 를 초과하는 것이고, 보다 바람직하게는 반응 개시 후 48 시간까지 당 전이율이 60 ％ 를 초과하는 것이고, 더욱 바람직하게는 반응 개시 후 48 시간까지 당 전이율이 80 ％ 를 초과하는 것이고, 보다 더욱 바람직하게는 반응 개시 후 48 시간까지 당 전이율이 90 ％ 를 초과하는 것이다.
본 발명의 변이 효소는, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 37 ∼ 995 의 아미노산 서열에 있어서, EndoS D233Q 의 당 전이 활성에 중요한 영역을 유지하고 있으면, 그 전체 길이 서열일 필요는 없다. EndoS 의 도메인 해석으로부터, 촉매 도메인 (서열 번호 2 의 아미노산 번호 98 ∼ 445), 및, CRM (서열 번호 2 의 아미노산 번호 765 ∼ 923) 이 중요하다는 것이 알려져 있고, 이들을 포함하는 한, 본 발명의 변이 효소로서 사용할 수 있다. 또한, EndoS2 와 같은 유연 효소여도, 이들 도메인 영역에 대응하는 영역을 포함하고, 대응하는 지점의 아미노산 (EndoS 의 H122, D233, D279, Q303, E350, Y402, D405, 및, R406 은, 각각 EndoS2 에 있어서는, H75, D184, D226, Q250, E289, Y339, D342, 및, R343 에 대응하고 있다) 에 적절히 변이를 갖고, 또한, 본 효소 활성을 갖는 한 본 발명에 포함되는 것으로 한다. 바람직하게는, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 98 ∼ 923 을 포함하는 폴리펩티드이고, 보다 바람직하게는 서열 번호 2 의 아미노산 번호 98 ∼ 995 를 포함하는 폴리펩티드이고, 더욱 바람직하게는 서열 번호 2 의 아미노산 번호 37 ∼ 995 를 포함하는 폴리펩티드이다.
본 발명의 변이 효소의 아미노산 서열에 있어서, 본 효소 활성에 영향을 주지 않는 범위에서, 후술하는 필수 변이 지점 이외의 지점에서, 1 ∼ 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는, 부가되어 있어도 된다. 이와 같은 아미노산 개변의 지점으로는, 본 효소 활성에 영향을 주지 않는 한, 전체 부위를 선택해도 되지만, 바람직하게는, 촉매 도메인 (서열 번호 2 의 아미노산 번호 98 ∼ 445), 및, CRM (서열 번호 2 의 아미노산 번호 765 ∼ 923) 이외의 지점이고, 보다 바람직하게는, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 37 ∼ 97 또는 아미노산 번호 924 ∼ 995 의 영역에 포함되는 부위이다. 본 발명에 있어서, 수 개란, 20 개 이하이고, 바람직하게는 10 개 이하이고, 더욱 바람직하게는 5 개 이하이고, 가장 바람직하게는 4 개, 3 개, 2 개 또는 1 개이다.
본 발명의 변이 효소에 있어서, D233Q 이외의 추가 변이 지점은, 필수 추가 변이 지점군에서 선택되는 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 지점이다. 이 추가 변이 지점의 개수는, 최종적인 변이체가 본 변이 효소가 본 효소 활성을 갖는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 10 개 지점 이하이고, 보다 바람직하게는 5 개 지점 이하이고, 더욱 바람직하게는, 4 개 지점, 3 개 지점, 2 개 지점 또는 1 개 지점이다. 복수 개 지점에 추가 변이를 갖는 경우, 필수 추가 변이 지점군의 적어도 1 개에 있어서 변이가 있으면, 그 밖의 변이 지점은, 최종적인 변이 효소가 본 효소 활성을 갖는 한 특별히 한정되지 않지만, 모든 추가 변이가 필수 추가 변이 지점군인 것이 바람직하다. 필수 추가 변이 지점 이외에 추가 변이를 갖는 경우, 필수 추가 변이 지점 이외의 추가 변이가 포함되는 영역으로는, 효소 활성에 관련하는 촉매 도메인 (서열 번호 2 의 아미노산 번호 98 ∼ 445) 이외의 아미노산인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 서열 번호 2 의 아미노산 번호 37 ∼ 97, 446 ∼ 764, 및 924 ∼ 995 의 영역이고, 더욱 바람직하게는, 서열 번호 2 의 아미노산 번호 37 ∼ 97, 및 924 ∼ 995 의 영역이다.
본 발명에 있어서, 추가 변이에 의한 치환 후의 아미노산은, 최종적으로 얻어지는 변이 효소가 본 효소 활성을 갖는 한 특별히 한정되는 것이 아니고, 천연에 존재하는 아미노산, 인공적으로 합성된 아미노산, 그들의 수식 아미노산 등, 다양한 아미노산을 채용할 수 있지만, 바람직하게는 천연에 존재하는 아미노산이고, 보다 바람직하게는 천연에 존재하는 L-아미노산이고, 더욱 바람직하게는 필수 아미노산이다. 이하에, 필수 추가 변이 지점에 있어서의, 바람직한 변이 후 아미노산을 나타낸다.
H122 의 변이 후의 아미노산은, 당해 부위와 주위의 아미노산의 상호 작용이 해소되는 것과 같은, 작은 측사슬 구조를 갖는 아미노산 (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala), 측사슬에 부전하를 갖는 아미노산 (Glu 또는 Asp) 또는, 측사슬에 반응성이 높은 관능기를 가지지 않는 아미노산 (Leu, Ile, Pro, Met, Phe) 이 바람직하고, 보다 바람직하게는, Ala 또는 Phe 이다.
P184 의 변이 후의 아미노산은, 작은 측사슬 구조를 갖는 아미노산 (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) 또는, 측사슬에 아미드기를 갖는 아미노산 (Gln, Asn) 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Gln 이다.
D279 의 변이 후의 아미노산은, 작은 측사슬 구조를 갖는 아미노산 (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) 또는 Gln 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Ser 또는 Gln 이다.
Y282 의 변이 후의 아미노산은, 측사슬이 염기성의 아미노산 (Arg, Lys, His) 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Arg 이다.
Q303 의 변이 후 아미노산은, 소수성의 아미노산 (Met, Pro, Leu) 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Leu 이다.
Y348 의 변이 후 아미노산은, 측사슬에 고리 구조를 갖는 아미노산 (His, Trp) 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 His 이다.
E350 의 변이 후 아미노산은, 수소 결합을 할 수 있는 큰 측사슬을 갖는 아미노산 (Lys, Arg, His, Tyr, Gln, Asn) 또는, 당해 부위와 주위의 아미노산의 상호 작용이 해소되는 것과 같은, 작은 측사슬 구조를 갖는 아미노산 (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) 이 바람직하고, 보다 바람직하게는, Ala, Asn, Asp 또는 Gln 이다.
Y402 의 변이 후의 아미노산은, 측사슬에 방향 고리를 가지는 큰 아미노산, Phe 또는 Trp 가 바람직하다.
D405 의 변이 후 아미노산은, 당해 부위와 주위의 아미노산의 상호 작용이 해소되는 것과 같은, 작은 측사슬 구조를 갖는 아미노산 (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Ala 이다.
R406 의 변이 후 아미노산은, 당해 부위와 주위의 아미노산의 상호 작용이 해소되는 것과 같은, 작은 측사슬 구조를 갖는 아미노산 (Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala) 또는 측사슬에 부전하를 갖는 아미노산 (Glu, Asp), 또는, 측사슬에 아미드기를 갖는 아미노산 (Gln, Asn) 이 바람직하고, 보다 바람직하게는, Ala 또는 Gln 이다.
상기와 같은 필수 추가 변이 지점에 있어서의 변이는, 단독이어도 되고, 다른 필수 추가 변이 지점의 변이 및/또는 그 외 지점의 변이와 조합되어도 된다. 필수 추가 변이 지점에 있어서의 변이의 조합으로는, 어떠한 조합이어도 되지만, 바람직하게는, 적어도 Q303, E350 또는 D405 에 있어서의 변이를 포함하는 조합이고, 보다 바람직하게는, 적어도 Q303L, E350A, E350N, E350Q 또는 D405A 를 포함하는 조합이다.
Q303L 을 포함하는 추가 변이의 조합으로는, 예를 들어, H122A/Q303L, H122F/Q303L, P184Q/Q303L, D279Q/Q303L, D279S/Q303L, Y282R/Q303L, Q303L/Y348H, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/Y402F, Q303L/Y402W, Q303L/D405A, Q303L/R406Q, 등을 들 수 있다.
E350A 를 포함하는 추가 변이의 조합으로는, 예를 들어, H122A/E350A, H122F/E350A, P184Q/E350A, D279Q/E350A, D279S/E350A, Y282R/E350A, Y348H/E350A, E350A/Y402F, E350A/Y402W, E350A/D405A, E350A/R406Q, 등을 들 수 있다.
E350N 을 포함하는 추가 변이의 조합으로는, 예를 들어, H122A/E350N, H122F/E350N, P184Q/E350N, D279Q/E350N, D279S/E350N, Y282R/E350N, Y348H/E350N, E350N/Y402F, E350N/Y402W, E350N/D405A, E350N/R406Q, 등을 들 수 있다.
E350D 를 포함하는 추가 변이의 조합으로는, 예를 들어, H122A/E350D, H122F/E350D, P184Q/E350D, D279Q/E350D, D279S/E350D, Y282R/E350D, Y348H/E350D, E350D/Y402F, E350D/Y402W, E350D/D405A, E350D/R406Q, 등을 들 수 있다.
E350Q 를 포함하는 추가 변이의 조합으로는, 예를 들어, H122A/E350Q, H122F/E350Q, P184Q/E350Q, D279Q/E350Q, D279S/E350Q, Y282R/E350Q, Y348H/E350Q, E350Q/Y402F, E350Q/Y402W, E350Q/D405A, E350Q/R406Q, 등을 들 수 있다.
D405A 를 포함하는 추가 변이의 조합으로는, 예를 들어, H122A/D405A, H122F/D405A, P184Q/D405A, D279Q/D405A, D279S/D405A, Y282R/D405A, Y348H/D405A, Y402F/D405A, Y402W/D405A, 또는, D405A/R406Q, 등을 들 수 있다.
본 발명의 변이 효소로서 바람직한 것은, EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/E350A, EndoS D233Q/E350N, EndoS D233Q/E350D, EndoS D233Q/E350Q, EndoS D233Q/D405A, EndoS D233Q/Q303L/E350A, EndoS D233Q/Q303L/E350N, EndoS D233Q/Q303L/E350D, EndoS D233Q/Q303L/E350Q, EndoS D233Q/Q303L/D405A, EndoS D233Q/E350A/D405A, EndoS D233Q/E350N/D405A, EndoS D233Q/E350D/D405A, EndoS D233Q/E350Q/D405A, 또는, EndoS D233Q/Y402F 이고, 보다 바람직하게는 EndoS D233Q/Q303L, EndoS D233Q/Q303L/E350Q, EndoS D233Q/Q303L/D405A, EndoS D233Q/E350A, 또는, EndoS D233Q/Y402F 이다.
＜유전자, 숙주 세포, 효소 산생 방법＞
본 발명은, 추가로 상기의 EndoS D233Q 에 추가 변이를 갖는 변이 효소를 코드하는 재조합 유전자, 당해 재조합 유전자를 포함하는 플라스미드나 발현 벡터 등의 유전자 구축물, 당해 유전자 구축물에 의해 형질 전환된 숙주 세포, 당해 숙주 세포의 배양물로부터 본 발명의 변이 효소를 회수하는 공정을 포함하는, 본 발명의 변이 효소의 제조 방법 등을 제공한다. 이들 재조합 유전자, 유전자 구축물, 숙주 세포당은, 본 발명의 변이 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 공지된 유전자 공학적 수법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 변이 효소를 코드하는 재조합 유전자는, 서열 번호 3 의 뉴클레오티드 번호 109 ∼ 2985 (1 ∼ 108 은 시그널 펩티드를 코드하는 영역) 에 기재된 EndoS D233Q 의 뉴클레오티드 서열에 기초하여, 목적으로 하는 추가 변이를 포함하는 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 등의 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 예를 들어, EndoS D233Q/Q303L 을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호 3 의 뉴클레오티드 번호 109 ∼ 2985 의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 907 ∼ 909 번째의 뉴클레오티드를 CAG 로부터 CTG 로 치환한 뉴클레오티드 서열이다. 또한, EndoS D233Q/E350A (N, Q) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호 3 의 뉴클레오티드 번호 109 ∼ 2985 의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 1048 ∼ 1050 번째의 뉴클레오티드를 GAA 로부터 GCA 로 치환한 뉴클레오티드 서열이다 (E350N 에서는 AAT, E350Q 에서는 CAG). 또한, EndoS D233Q/D405A 를 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호 3 의 뉴클레오티드 번호 109 ∼ 2985 의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 1213 ∼ 1215 번째의 뉴클레오티드를 GAT 로부터 GCA 로 치환한 뉴클레오티드 서열이다.
본 발명의 변이 효소를 코드하는 유전자의 도입에 의해 형질 전환된 숙주 세포 (동물 세포, 식물 세포, 대장균, 효모 등, 단백질 산생에 통상적으로 사용되는 세포 등을 적절히 선택할 수 있다) 는, 세포의 종류에 따라 적절한 조건하에서 배양되고, 그 배양물로부터 본 발명의 변이 효소를 회수할 수 있다. 변이 효소의 회수는, 당해 효소의 물성을 이용하여, 통상적인 정제 수법을 적절히 조합하여 실시하지만, 간편하게 회수하기 위해서, 미리 GST 등의 태그 펩티드를 변이 효소에 연결시킨 형태로 발현시키도록, 유전자 구축물을 설계해 둠으로써, 당해 태그 펩티드의 친화성을 이용한 회수를 실시할 수 있다. 태그 펩티드는, 정제 후에 제거해도 되지만, 효소 활성에 영향을 주지 않는 경우에는, 태그 펩티드를 연결시킨 채의 변이 효소를, 당 사슬 리모델링 등의 반응에 사용해도 된다. 본 발명의 변이 효소에는, 이와 같은 태그 펩티드가 연결된 아미노산 서열을 갖는 효소를 포함한다.
＜당 사슬 리모델링＞
본 발명은, 본 발명의 EndoS 변이 효소를 사용한, IgG 또는 Fc 영역 함유 분자에 있어서의 N297 결합 당 사슬의 당 사슬 리모델링 방법, 및, 당해 당 사슬 리모델링에 의해 제조된 실질적으로 균일한 구조로 이루어지는 N297 결합 당 사슬을 갖는 IgG 또는 Fc 영역 함유 분자, 를 제공한다.
「당 사슬 리모델링」 이란, 먼저, 특정한 모노클로날 항체의 IgG 또는 IgG 의 Fc 단편이나 정상 영역만으로 이루어지는 CLCH 등의 Fc 영역 함유 분자의 N297 결합 당 사슬을 코어 GlcNAc (코어 푸코오스가 부가되어 있어도 된다) 를 남기고 절제한 억셉터 분자를 제작하고, 이어서, 당해 억셉터 분자의 코어 GlcNAc 에 대하여, 본 발명의 EndoS 변이 효소의 당 전이 활성을 이용하여, 당 사슬 도너에서 유래하는 당 사슬을 전이시킴으로써, N297 결합 당 사슬이 당 사슬 도너에서 유래하는 균일한 당 사슬 구조인 IgG 또는 Fc 영역 함유 분자를 제조하는 방법을 의미한다.
당 사슬 리모델링에 사용되는 IgG 또는 Fc 영역 함유 분자는, IgG 중사슬에서 유래하고, IgG 중사슬의 아미노산 서열은 원래의 분자의 아미노산 서열과 동일하며, N297 결합 당 사슬을 갖는 형태로 산생된 것이면 되고, 그 산생 방법은 한정되는 것이 아니고, 통상적으로 알려진 모노클로날 항체의 생산 방법에 의해 산생된 IgG, IgG 의 CLCH, 또는, 그것을 효소 처리하여 얻어진 Fc 단편 등을 이용할 수 있다. 또한, 이와 같은 IgG 또는 Fc 단편은, 상이한 생산 방법이나 상이한 로트로 얻어진 샘플의 혼합물을 채용해도 된다.
당 사슬 리모델링에 사용하는 억셉터 분자의 조제 방법으로는, 상기 서술한 IgG 또는 Fc 영역 함유 분자를, N297 결합 당 사슬의 코어 키토비오스 구조에 있어서의 GlcNAc 간의 1.4-글리코시드 결합을 특이적으로 가수 분해하는 활성을 유지한 ENGase 로 처리함으로써 조정할 수 있다. 이 경우, ENGase 로는, EndoA, EndoD, EndoE, EndoS 를 비롯하여 다양한 것을 채용할 수 있지만, 바람직하게는, 야생형 EndoS 이다.
당 사슬 리모델링에 사용하는 당 사슬 도너로는, 다양한 당 사슬 구조의 것을 채용할 수 있지만, 리모델링 후의 항체를 항체 의약으로 하는 것을 목적으로 한 경우, 인간이 보유하는 당 사슬 구조와 유사하거나, 또는, 동일한, 인간형 당 사슬, 또는, 인간 적합형 당 사슬 구조를 갖는 당 사슬 도너를 채용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 당 사슬 도너의 대표적인 것으로서, 상기의 N 결합형 당 사슬의 기본 구조에 있어서, 코어 GlcNAc 가 제외되고, 환원 말단으로부터 2 번째의 GlcNAc 가 옥사졸린화된 분자를 들 수 있고, 바람직하게는 도 1 에 나타나는 구조로 이루어지는 SG-Oxa 이다.
당 사슬 리모델링에 있어서의 가수 분해 반응의 반응 조건은 EndoS 에 관해서 통상적으로 알려진 방법을 채용할 수 있다. 반응은 완충액 중에서 실시하는데, 시트르산 완충액 (pH 3.5 ∼ 5.5), 아세트산 완충액 (pH 4.5 ∼ 6.0), 인산 완충액 (pH 6.0 ∼ 7.5), MOPS-NaOH 완충액 (pH 6.5 ∼ 8.0), Tris-HCl 완충액 (pH 7.0 ∼ 9.0) 등 통상적인 효소 반응에서 사용되는 완충액으로부터 적절히 선택하는 것이 가능하다. 바람직하게는, Tris-HCl 완충액 (pH 7.0 ∼ 9.0) 이다. 반응액에는, 효소를 안정화시킬 목적으로, 효소 반응을 저해하지 않는 첨가제를 첨가해도 되지만, 첨가하지 않아도 된다.
반응 온도는, 10 ℃ 내지 50 ℃ 의 사이에서, 적절히 선택할 수 있지만, 바람직하게는, 25 ℃ ∼ 38 ℃ 이다.
반응 시간은, 10 분 내지 96 시간의 사이에서, 적절히 선택할 수 있지만, 반응액의 소량을 시간 경과적으로 채취하고, 가수 분해의 진행도를 확인하면서 반응의 종료를 판단해도 된다. 일반적으로, 당 사슬 가수 분해 반응의 진행도는, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE), 전자동 전기 영동 시스템, 혹은 액체 크로마토그래피 질량 분석 (LC-MS) 등에 의해 모니터링할 수 있다. 본 특허에서는, 시판 항체 혹은 당 사슬 리모델링 항체를 중사슬과 경사슬로 프래그먼트화한 후, 전자동 전기 영동 시스템을 사용하여, N297 결합 당 사슬이 부가되어 있는 중사슬측만 유지 시간이 변화함으로써 확인하였다.
당 사슬 리모델링에 있어서의 당 전이 반응의 반응 조건은, 다른 효소에 있어서 알려져 있는 조건에 준하여 적절히 선택할 수 있다.
반응은, 완충액 중에서 실시하지만, SG-Oxa 의 분해를 촉진시키지 않는 것이 바람직하고, 인산 완충액 (pH 6.0 ∼ 7.5), MOPS-NaOH 완충액 (pH 6.5 ∼ 8.0), Tris-HCl 완충액 (pH 7.0 ∼ 9.0) 등에서 적절히 선택하는 것이 가능하다. 바람직하게는, Tris-HCl 완충액 (pH 7.0 ∼ 9.0) 이다. 효소를 안정화시킬 목적으로, 반응액 중에 효소 반응을 저해하지 않는 첨가제를 첨가해도 되지만, 첨가하지 않아도 된다.
반응 온도는, 10 ℃ 내지 50 ℃ 의 사이에서, 적절히 선택할 수 있지만, 바람직하게는 25 ℃ ∼ 38 ℃ 이다.
반응 시간은, 10 분 내지 96 시간의 사이에서, 적절히 선택할 수 있지만, 반응액의 소량을 시간 경과적으로 채취하고, 당 전이 반응의 진행도를 확인하면서 반응의 종료를 판단해도 된다. 일반적으로, 당 사슬 전이 반응의 진행도는, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE), 전자동 전기 영동 시스템, 혹은 액체 크로마토그래피 질량 분석 (LC-MS) 등에 의해 모니터링할 수 있다. 본 특허에서는, 시판 항체 혹은 당 사슬 리모델링 항체를 중사슬과 경사슬로 프래그먼트화한 후, 전자동 전기 영동 시스템을 사용하여, N297 결합 당 사슬이 부가되어 있는 중사슬측만 유지 시간이 변화함으로써 확인하였다.
실시예
이하, 실시예를 사용하여, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 실시예에 나타난 것은, 본 발명의 실시형태의 일례이고, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 은, 본 발명에 사용한 EndoS 변이 효소의 조제예이다. 실시예 2 는, 본 발명에 사용한 당 사슬 도너의 제조예이다. 실시예 3 은, 당 사슬 전이 활성을 측정할 때에 사용한 억셉터 분자의 조제예이다. 실시예 4 는, 본 발명의 EndoS 변이 효소의 가수 분해율의 측정예와 본 발명의 EndoS 변이 효소의 당 사슬 전이율의 측정예이다.
본 명세서에 기재되어 있는 단백 농도는, 초미량 분광 광도계 NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific 제조) 혹은 NanoDrop2000 (Thermo Fisher Scientific 제조) 을 사용하여 정량하였다.
당 사슬 리모델링 항체 ((Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 및, SG-Trastuzumab) 의 질량은, 다음의 방법으로 확인하였다. 당 사슬 리모델링 항체를 중사슬과 경사슬로 프래그먼트화한 후에, 각각의 피크를 분석 칼럼으로 분리하여, 질량 분석하였다. 장치에는, ACUITY UPLC (Waters 제조), SYNAPT G2-S (Waters) 및 BEH Phenyl 칼럼 (1.7 ㎛, 1.0 x 50 ㎜) 을 사용하고, 이동상에는 0.05 ％ 트리플루오로아세트산 첨가 아세토니트릴을, 3 분 동안 25 ％ 로부터 35 ％ 로 변화하는 그래디언트로 사용하고, 유속 0.34 ㎕/분, 80 ℃ 에서 분석하였다.
＜실시예 1＞ EndoS 변이 효소의 반응액 조제
(1-1) EndoS 변이 효소의 디자인
EndoS D233Q 에 변이를 도입함으로써, EndoS D233Q 의 당 전이 활성을 유지하면서, 가수 분해 활성을 억제하는 것이 달성되는 것으로 생각되는 변이형 EndoS 를 설계하였다. EndoS 의 입체 구조 정보 (PDB ID : 4NUY) 에 기초하여, EndoS 의 촉매 도메인을, 당 사슬의 인식에 관여하는 것이 예측되는 부위, 활성 중심 부근, 항체의 인식에 관여하는 것이 예측되는 부위의 3 부위로 구별하고, 각각 변이 도입의 대상으로 하였다. 당 사슬의 인식에 관여하는 것이 예측되는 부위로는, H122, Y348, E350, Y402, D405, 및 R406 의 6 잔기를 설정하고, 당 사슬의 결합과 해리의 회전을 효율화하기 위해서, 상기의 아미노산 잔기가 형성하는 상호 작용을 절단하기 위하여, 혹은 상기의 아미노산 중 큰 측사슬을 가지는 아미노산 잔기를 작은 측사슬을 가지는 아미노산 잔기로 치환하기 위하여 효소를 디자인하였다. 활성 중심 부근으로는, P184, D279, 및 Q303 을 설정하고, 야생형의 아미노산 잔기와 유사한 성질을 가지는 아미노산, 혹은 상이한 성질을 가지는 아미노산으로 폭넓게 치환하는 변이를 디자인하였다. 항체의 인식에 관여하는 것이 예측되는 부위로는 Y282 를 설정하고, 항체 당 사슬이 결합하는 Asn 297 부근의 부전하와의 상호 작용을 강하게 하기 위하여, 염기성의 아미노산으로 치환하는 변이를 디자인하였다. 상기의 3 부위 내, 혹은 3 부위 사이에서의 조합 변이도 고려하여, 표 2 의 각 변이 효소를 디자인하였다.
(1-2) EndoS 변이 효소의 발현
콤피텐시가 107 cfu/㎕ 인 빙냉된 대장균 BL21(DE3) 주, 50 ㎕ 에 대하여, 상기 (1-1) 에 기초하여 디자인한 각 EndoS 변이 효소의 아미노산 서열을 코드한 유전자를 포함하는 단백질 발현용 플라스미드 (pGEX4T3, 50 ㎍/㎕) 를 3 ㎕ 첨가하고, 37 ℃ 에서 40 초간 가열함으로써, 대장균을 형질 전환하였다. 이들 대장균을 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 포함하는 LB 한천 배지에서 하룻밤 배양하고, 다음날 얻어진 콜로니를 채취하여 100 ㎍/㎖ 의 암피실린을 포함하는 1 ℓ 의 TB 배지로 O.D.600 이 0.8 이 될 때까지 37 ℃ 에서 진탕 배양하였다. O.D.600 이 상승한 후, 배양 온도를 16 ℃ 로 낮추고, 1 시간 후에 종농도가 0.1 mM 이 되도록 이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노시드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG) 를 첨가함으로써, EndoS 변이 효소의 발현을 하룻밤 유도하였다. 다음날, 배양액을 5,000 × G 로 10 분간 원심 분리함으로써 균체를 회수하고, 40 U/㎖ 의 DNaseI, 및 0.5 ㎎/㎖ 라이소자임 (Lysozyme) 을 포함하는 PBS 버퍼를 50 ㎖ 첨가하고, 균체를 재현탁하였다. 얻어진 균액에 대하여 초음파 처리함으로써 균체를 파쇄하고, 20,000 × g 로 30 분간 원심 분리함으로써 가용성 획분에 목적으로 하는 EndoS 변이 효소를 얻었다.
(1-3) EndoS 변이 효소의 정제
상기 (1-2) 에서 얻어진 EndoS 변이 효소의 가용성 획분에 대하여 구멍 직경이 0.45 ㎛ 인 PVDF 막을 통과시키고, 통과 후의 용액을 글루타티온 어피니티 크로마토그래피와 겔 여과 크로마토그래피의 2 단계 공정으로 정제하였다.
먼저, PBS 로 평형화한 글루타티온 세파로스 4B 칼럼에 PVDF 막 통과막을 통과한 EndoS 변이 효소의 가용성 획분을 전체량 제공하고, 칼럼 용량의 3 배 이상의 PBS 버퍼로 칼럼을 세정하였다. 계속해서 10 mM 의 환원형 글루타티온을 포함하는 PBS 버퍼로 GST 융합 EndoS 변이 효소를 용출하고, 한외 여과 (Amicon Ultra-15 30K) 에 의해 농축하였다. 농축 후, PBS 로 평형화한 HiLoad 26/60 Superdex200pg 칼럼 (GE 헬스케어 바이오사이언스) 을 통과시켜, 용출에 사용한 글루타티온을 제거함과 함께 최종 정제 샘플을 얻었다. 이와 같이 조제한 각종 EndoS 변이 효소의 수량을 표 2 에 나타낸다.
얻어진 EndoS 변이 효소 용액은, 2 ㎎/㎖ 가 되도록 조제하여, 이들을 가수 분해 활성 측정 및 당 사슬 전이 활성 측정에 사용하였다.
Figure 112018004793860-pct00004
＜실시예 2＞ SG-Oxa (도 1 의 구조로 이루어지는 화합물) 의 반응액 조제
이후의 실시예에서 당 사슬 도너로서 사용하는 SG-Oxa 는, 이하의 방법으로 제조하였다.
디시알로옥타사카리드 (토쿄 화성 공업 (주), 100 ㎎, 49.5 μ㏖) 에 대하여, 2-클로로-1,3-디메틸-1H-벤즈이미다졸-3-이움 클로라이드 (CDMBI) ((주) 후시미 제약소 제조) (53.7 ㎎, 245 μ㏖) 의 수용액 (520 ㎕) 을 첨가하였다. 빙냉 후의 반응액에 인산삼칼륨 (158 ㎎, 743 μ㏖) 의 수용액 (520 ㎕) 을 첨가하고, 빙냉하에서 2 시간 교반하였다. 얻어진 반응액을, 아미콘 울트라 (울트라 셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 한외 여과하고, 고형물을 제거하였다. 그 통과액을, 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 장치에는 Purif-Rp2 (쇼코 사이언티픽 제조) 를 사용하고, 칼럼에는 HiPrep 26/10 Desalting (GE 헬스케어 제조) 를 사용하고, 이동상에 0.03 ％ - NH3 수용액을 사용하고, 유속을 10 ㎖/분, 분획 용량을 10 ㎖ 로 하였다. 용출 중에 UV 검출 (220 ㎚) 된 목적물을 포함하는 프랙션을 1 개로 합치고 0.1 N 수산화나트륨 수용액 (100 ㎕) 을 첨가하여 동결 건조시켜, 목적으로 하는 SG-Oxa 를 무색 고체 (87.0 ㎎, 43.4 μ㏖, 수율 88 ％) 로서 얻었다.
얻어진 화합물의 NMR 차트로부터, 목적물 (HELVETICA CHIMICA ACTA, 2012, 95, 1928 - 1936) 인 것을 확인하였다.
얻어진 SG-Oxa (1.19 ㎎) 에 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) (23.8 ㎕) 을 첨가하여, 50 ㎎/㎖ SG-Oxa 용액 (50 mM 트리스 완충액 pH 7.4) 을 조제하였다. 이것을 당 사슬 전이 활성 측정에 사용하였다.
＜실시예 3＞ (Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 의 조제
당 전이 반응에 사용하는 억셉터 분자로서 사용하는 (Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 를, 이하의 방법으로 제작하였다.
11.3 ㎎/㎖ Trastuzumab (트라스투주맙)(Genentech 사 제조) 용액 (50 mM 트리스 완충액 pH 8.0) (2 ㎖) 에 1.18 ㎎/㎖ 야생형 EndoS 용액 (PBS) (10 ㎕) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 5 시간 인큐베이트하였다. 반응의 진행 정도를 Experion 전기 영동 스테이션을 사용하여 확인하였다. 반응 종료 후, 어피니티 크로마토그래피에 의한 정제와 하이드록시 어퍼타이트 칼럼에 의한 정제를 실시하였다.
(1) 어피니티 칼럼에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant25 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : HiTrap Protein A HP 칼럼 (5 ㎖) (GE 헬스케어 제조)
유속 : 5 ㎖/분 (차지시에는 1 ㎖/분)
칼럼에 대한 결합시에는, 상기에서 얻은 반응액을 칼럼 상부에 첨가하고, 결합 버퍼 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)) 를 1 ㎖/분으로 1 CV 흘리고, 추가로 5 ㎖/분으로 5 CV 흘렸다. 중간 세정시에는, 세정 용액 (20 mM 인산 완충액 (pH 7.0), 0.5 M 염화나트륨 용액) 을 15 CV 흘렸다. 용출시에는, 용출 버퍼 (I㎜unoPure IgG Eution buffer, PIERCE 제조) 를 6 CV 흘렸다. 용출액을 1 M 트리스 완충액 (pH 9.0) 으로 즉시 중화하였다. 용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 초미량 분광 광도계 NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific 제조), 및 Experion 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD 제조) 을 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘 울트라 (울트라 셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축하고, 완충액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 용액, pH 6.8) 교환을 실시하였다.
(2) 하이드록시 어퍼타이트 칼럼에 의한 정제
정제 장치 : AKTA avant25 (GE 헬스케어 제조)
칼럼 : Bio-Scale Mini CHT Type I 카트리지 (5 ㎖) (BIO-RAD 제조)
유속 : 5 ㎖/min (차지시에는 1 ㎖/분)
상기 (1) 에서 얻어진 용액을 칼럼의 상부에 첨가하고, A 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), pH 6.8) 을 4 CV 흘렸다. 그 후, A 액과 B 액 (5 mM 인산 완충액, 50 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), pH 6.8, 2 M 염화나트륨 용액) 을 사용하여, 용출하였다. 용출 조건은, A 액 : B 액 = 100 : 0 ∼ 0 : 100 (15 CV) 이다.
용출 중에 UV 검출 (280 ㎚) 된 프랙션에 대하여, 초미량 분광 광도계 NanoDrop1000 (Thermo Fisher Scientific 제조), 및 ExperionTM 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD) 을 사용하여 확인하였다.
목적물을 포함하는 프랙션을 아미콘 울트라 (울트라 셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용하여 농축하고, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 완충액 교환을 실시하여, 9.83 ㎎/㎖ (Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 용액 (인산 완충액, pH 6.0) (1.8 ㎖) 이 얻어졌다.
LC-MS :
(Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 의 중사슬에 대한 계산치, M = 49497.86, 확인치 (m/z), 49497 (deconvolution data, 데콘볼루션 데이터).
(Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 의 경사슬에 대한 계산치, M = 23439.1, 확인치 (m/z), 23439.1 (데콘볼루션 데이터).
＜실시예 4＞ EndoS 변이 효소의 가수 분해 활성 및 당 사슬 전이 활성의 측정 (pH 7.4)
(4-1) 가수 분해 활성의 측정
각종 EndoS 변이 효소의, 시판되는 트라스투주맙 (Trastuzumab) 의 N297 결합 당 사슬에 대한 가수 분해 활성을, 이하와 같이 측정하였다. 당해 가수 분해 반응의 모식도를 도 2 에 나타낸다.
가수 분해 반응의 기질 용액으로서 사용하는 20 ㎎/㎖ 트라스투주맙 (Trastuzumab) 용액을, 다음과 같이 조제하였다. 100 mM 트리스 완충액 (pH 7.4, CALBIOCHEM 제조) (10 ㎖) 에, 오오츠카 증류수 (10 ㎖) 를 첨가하여, 50 mM 트리스 완충액 (pH 7.4) (40 ㎖) 을 조제하였다. 시판되는 트라스투주맙 (Trastuzumab) (440 ㎎/바이알, Genentech 제조) 에 부속의 용해액 (20 ㎖) 을 첨가하고, 트라스투주맙 (ca.21 ㎎/㎖) 용액으로 하였다. 트라스투주맙 (ca.21 ㎎/㎖) 용액 (2 ㎖) 에 대하여, 아미콘 울트라 (울트라 셀 30K, Merck Millipore 제조) 를 사용한 한외 여과를 실시하고, 상기에서 조제한 50 mM 트리스 완충액 pH 7.4 로 용매 치환하여, 20 ㎎/㎖ 트라스투주맙 용액 (50 mM 트리스 완충액 pH 7.4) 을 얻었다.
상기에서 조제한 기질 용액 (25 ㎕) 에 대하여, 실시예 1 에서 조제한 2.0 ㎎/㎖ EndoS D233Q 용액 (5 ㎕) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 48 시간 인큐베이션하였다. 반응 개시의 1 시간 후, 2 시간 후, 4 시간 후, 8 시간 후, 24 시간 후, 및, 48 시간 후에, 이 반응액의 일부를 채취하고, 반응의 진행도를 ExperionTM 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD) 을 사용하여 측정하였다. 측정에 있어서는, 기기에 부수하고 있는 안내서에 따라, 측정 샘플을 조제하였다. 이 과정에서, 채취한 반응액을 디티오트레이톨을 포함하는 용액에 노출시켜, 95 ℃ 에서 5 분간 가열하는 조작이 있기 때문에, 가수 분해 반응은 즉시 정지된다.
얻어진 측정 샘플을 ExperionTM Pro260 Chips 로 옮겨, ExperionTM 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD) 에 부수하고 있는 안내서에 따라 측정하였다. 얻어진 크로마토그램으로부터, 미반응물과 가수 분해체가 분리된 피크로서 확인된다. 미반응물과 가수 분해체의 피크 면적비로부터 가수 분해율을, 이하의 산출식에 의해 산출하였다.
가수 분해율 (％ = [(Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 유래의 H 사슬의 피크 면적]/{[시판되는 트라스투주맙 유래의 H 사슬 피크 면적 + [(Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 유래의 H 사슬의 피크 면적]｝ × 100
동일하게 하여, 실시예 1 에서 조제한 다른 EndoS 변이 효소의, 각 반응 시간에 있어서의 가수 분해율을 산출하였다 (표 3).
(4-2) 당 사슬 전이 활성의 측정
실시예 1 에서 제작한 각종 EndoS 변이 효소의 당 전이 활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 당 사슬 도너로는, 실시예 2 에서 조제한 SG-Oxa 를, 억셉터 분자로는 실시예 3 에서 조제한, (Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 를, 각각 사용하였다. 당 전이 반응의 모식도를 도 3 에 나타낸다.
실시예 3 에서 조제한 9.83 ㎎/㎖ (Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 용액 (인산 완충액, pH 6.0) 으로부터, (4-1) 의 기질 용액 조제와 동일한 수법에 따라, 20 ㎎/㎖ (Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 용액 (50 mM 트리스 완충액 pH 7.4) 을 조제하였다. 20 ㎎/㎖ (Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 용액 (50 mM 트리스 완충액 pH 7.4) (40 ㎕) 에 대하여, 실시예 2 에서 조제한 50 ㎎/㎖ SG-Oxa 용액 (50 mM 트리스 완충액 pH 7.4) (1.07 ㎕), 및, 실시예 1 에서 조제한 2.0 ㎎/㎖ EndoS D233Q 용액 (8 ㎕) 을 첨가하고, 30 ℃ 에서 48 시간 인큐베이션하였다. 반응 개시로부터, 1 시간 후, 2 시간 후, 4 시간 후, 8 시간 후, 24 시간 후 및 48 시간 후의 각 시점에서, 이 반응액의 일부를 채취하고, 반응의 진행도를 ExperionTM 전기 영동 스테이션을 사용하여 측정하였다. 측정에 있어서는, 기기에 부수하고 있는 안내서에 따라, 측정 샘플을 조제하였다. 이 과정에서, 채취한 반응액을 디티오트레이톨을 포함하는 용액에 노출시켜, 95 ℃ 에서 5 분간 가열하는 조작이 있기 때문에, 당 사슬 전이 반응은 즉시 정지된다.
얻어진 측정 샘플을 ExperionTM Pro260 Chips 로 옮겨, ExperionTM 전기 영동 스테이션 (BIO-RAD) 에 부수하고 있는 안내서에 따라 측정하였다. 얻어진 크로마토그램으로부터, 미반응물과 당 사슬 전이체가 분리된 피크로서 확인된다. 미반응물과 당 사슬 전이체의 피크 면적비로부터 당 사슬 전이율을 하기 산출식에 의해 산출하였다.
당 사슬 전이율 (％) = [SG-Trastuzumab 유래의 H 사슬의 피크 면적]/{[(Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 유래의 H 사슬 피크 면적 + [SG-Trastuzumab 유래의 H 사슬의 피크 면적]} × 100
동일하게 하여, 실시예 1 에서 조제한 다른 EndoS 변이 효소의, 각 반응 시간에 있어서의 당 사슬 전이율을 산출하였다 (표 3).
당 사슬 전이 생성물인 SG-Trastuzumab 는, 실시예 3 에 있어서의 (Fucα1,6) GlcNAc-Trastuzumab 의 정제와 동일한 방법으로 정제하였다. 얻어진 SG-Trastuzumab 의 LC-MS 분석 데이터를 이하에 나타낸다.
SG-Trastuzumab 의 중사슬에 대한 계산치, M = 51500.6 Da ; 확인치 (m/z), 51501 (데콘볼루션 데이터, deconvolution data).
SG-Trastuzumab 의 경사슬에 대한 계산치, M = 23439.1 Da, 확인치 (m/z), 23439 (데콘볼루션 데이터).
Figure 112018004793860-pct00005
SEQUENCE LISTING <110> Daiichi Sankyo Company, Limited <120> NOVEL ENDOS MUTANT ENZYME <130> DS2015007 <150> JP2015-141901 <151> 2015-07-16 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 995 <212> PRT <213> Artificial Sequencec <220> <223> D233Q mutant of Endo-S <400> 1 Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn 20 25 30 Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro 35 40 45 Ser Ile Asp Ser Leu His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe 50 55 60 Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu 65 70 75 80 Ile Leu Ala Lys Ala Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala 85 90 95 Lys Met Lys Ile Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro 100 105 110 Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro 115 120 125 Thr Glu Lys Asp Lys Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val 130 135 140 Asp Leu Ala Phe Ile Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe 145 150 155 160 Trp Lys Glu Leu Ala Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly 165 170 175 Thr Arg Val Ile Arg Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp 180 185 190 Asn Ser Gly Ile Ala Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu 195 200 205 Gly Asn Lys Ala Leu Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys 210 215 220 Tyr Asn Leu Asp Gly Leu Asp Val Gln Val Glu His Asp Ser Ile Pro 225 230 235 240 Lys Val Asp Lys Lys Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln 245 250 255 Val Phe Glu Glu Ile Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys 260 265 270 Ser Arg Leu Phe Ile Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro 275 280 285 Leu Ile Glu Arg Gly Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Gln Val 290 295 300 Tyr Gly Ser Gln Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg 305 310 315 320 Pro Glu Lys Thr Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile 325 330 335 Arg Pro Glu Gln Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala 340 345 350 Gln Glu Gly Asn Leu Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp 355 360 365 Lys Ala Asn Gly Ile Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg 370 375 380 Tyr Ala Arg Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe 385 390 395 400 Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr 405 410 415 Ala Lys Gln Lys Glu Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser 420 425 430 Asp Tyr Ser Val Ser Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys 435 440 445 Ser Tyr Asp Leu Ile Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg 450 455 460 Glu Ala Val Met Ala Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg 465 470 475 480 Phe Asn Gly Thr Leu Arg Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser Leu Glu 485 490 495 Gly Leu Asn Lys Phe Lys Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile Gly Leu 500 505 510 Ser Arg Ile Thr Lys Leu Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn Met Lys 515 520 525 Pro Gly Lys Asp Thr Leu Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys Lys Asp 530 535 540 Asn Lys Glu Glu Pro Ala Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys Val Ser 545 550 555 560 Gly Leu Thr Gly Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu 565 570 575 Thr Leu Ala Gly Leu Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val 580 585 590 Asp Ile Ser Gly Asn Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg 595 600 605 Gln Ile Phe Asp Thr Met Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val Gly Ser 610 615 620 Asn Glu Gln Thr Val Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr 625 630 635 640 Pro Asp Thr Tyr Gly Lys Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala Asn Glu 645 650 655 Lys Val Asp Leu Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln 660 665 670 Gly Thr Leu Ile Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Asn His 675 680 685 Lys Ile Ala Gly Arg Ser Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr Asn Asn 690 695 700 Phe Lys Val Ser Tyr Glu Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp Ser Thr 705 710 715 720 Leu Gly Thr Thr Thr Asp Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu Glu Thr 725 730 735 Tyr Lys Val Asp Phe Phe Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala Val His 740 745 750 Thr Ala Lys Val Ile Val Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu 755 760 765 Ala Glu Gly Ala Thr Val Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val Asn Ala 770 775 780 Arg Lys Val Phe Asp Gly Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn Ile Ser 785 790 795 800 Leu Gly Trp Asp Ser Lys Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys Glu Asp 805 810 815 Gly Leu Ile Lys His Trp Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg Asn Pro 820 825 830 Glu Thr Thr Asn Lys Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile Phe Asn 835 840 845 Ile Lys Asp Tyr Asn Leu Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn Lys Phe 850 855 860 Asp Asp Glu Lys Tyr Trp Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala Gln Gly 865 870 875 880 Glu Arg Ala Thr Ala Phe Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr Ser Lys 885 890 895 Tyr Trp Arg Val Val Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Pro 900 905 910 Val Val Pro Glu Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn Ala Asp 915 920 925 Thr Ile Met Lys Thr Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln Gln Lys 930 935 940 Asp Lys Phe Ser Gln Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys Glu Met 945 950 955 960 Ala Leu Glu Thr Ser Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr Ala Ile 965 970 975 Asn Ala Asn Ala Gly Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg Gln Leu 980 985 990 Leu Lys Lys 995 <210> 2 <211> 995 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Novel mutants of Endo-S D233Q having at least one mutation other than D233Q. <220> <221> mutation <222> (122)..(122) <223> The amino acid is His in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (184)..(184) <223> The amino acid is Pro in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (187)..(187) <223> The amino acid is Phe in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (279)..(279) <223> The amino acid is Asp in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (281)..(281) <223> The amino acid is Thr in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (282)..(282) <223> The amino acid is Tyr in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (303)..(303) <223> The amino acid is Gln in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (348)..(348) <223> The amino acid is Tyr in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (350)..(350) <223> The amino acid is Glu in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (402)..(402) <223> The amino acid is Tyr in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (405)..(405) <223> The amino acid is Asp in wild type EndoS and can be mutated. <220> <221> mutation <222> (406)..(406) <223> The amino acid is Arg in wild type EndoS and can be mutated. <400> 2 Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala 1 5 10 15 Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn 20 25 30 Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro 35 40 45 Ser Ile Asp Ser Leu His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe 50 55 60 Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu 65 70 75 80 Ile Leu Ala Lys Ala Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala 85 90 95 Lys Met Lys Ile Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro 100 105 110 Leu Tyr Gly Gly Tyr Phe Arg Thr Trp Xaa Asp Lys Thr Ser Asp Pro 115 120 125 Thr Glu Lys Asp Lys Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val 130 135 140 Asp Leu Ala Phe Ile Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe 145 150 155 160 Trp Lys Glu Leu Ala Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly 165 170 175 Thr Arg Val Ile Arg Thr Ile Xaa Trp Arg Xaa Leu Ala Gly Gly Asp 180 185 190 Asn Ser Gly Ile Ala Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu 195 200 205 Gly Asn Lys Ala Leu Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys 210 215 220 Tyr Asn Leu Asp Gly Leu Asp Val Gln Val Glu His Asp Ser Ile Pro 225 230 235 240 Lys Val Asp Lys Lys Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln 245 250 255 Val Phe Glu Glu Ile Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys 260 265 270 Ser Arg Leu Phe Ile Met Xaa Ser Xaa Xaa Met Ala Asp Lys Asn Pro 275 280 285 Leu Ile Glu Arg Gly Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Xaa Val 290 295 300 Tyr Gly Ser Gln Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg 305 310 315 320 Pro Glu Lys Thr Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile 325 330 335 Arg Pro Glu Gln Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Xaa Glu Xaa Asn Ala 340 345 350 Gln Glu Gly Asn Leu Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp 355 360 365 Lys Ala Asn Gly Ile Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg 370 375 380 Tyr Ala Arg Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe 385 390 395 400 Ser Xaa Ala Ile Xaa Xaa Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr 405 410 415 Ala Lys Gln Lys Glu Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser 420 425 430 Asp Tyr Ser Val Ser Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys 435 440 445 Ser Tyr Asp Leu Ile Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg 450 455 460 Glu Ala Val Met Ala Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg 465 470 475 480 Phe Asn Gly Thr Leu Arg Leu Asp Asn Pro Ala Ile Gln Ser Leu Glu 485 490 495 Gly Leu Asn Lys Phe Lys Lys Leu Ala Gln Leu Asp Leu Ile Gly Leu 500 505 510 Ser Arg Ile Thr Lys Leu Asp Arg Ser Val Leu Pro Ala Asn Met Lys 515 520 525 Pro Gly Lys Asp Thr Leu Glu Thr Val Leu Glu Thr Tyr Lys Lys Asp 530 535 540 Asn Lys Glu Glu Pro Ala Thr Ile Pro Pro Val Ser Leu Lys Val Ser 545 550 555 560 Gly Leu Thr Gly Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu 565 570 575 Thr Leu Ala Gly Leu Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val 580 585 590 Asp Ile Ser Gly Asn Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg 595 600 605 Gln Ile Phe Asp Thr Met Leu Ser Thr Ile Ser Asn His Val Gly Ser 610 615 620 Asn Glu Gln Thr Val Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr 625 630 635 640 Pro Asp Thr Tyr Gly Lys Thr Ser Leu Arg Leu Pro Val Ala Asn Glu 645 650 655 Lys Val Asp Leu Gln Ser Gln Leu Leu Phe Gly Thr Val Thr Asn Gln 660 665 670 Gly Thr Leu Ile Asn Ser Glu Ala Asp Tyr Lys Ala Tyr Gln Asn His 675 680 685 Lys Ile Ala Gly Arg Ser Phe Val Asp Ser Asn Tyr His Tyr Asn Asn 690 695 700 Phe Lys Val Ser Tyr Glu Asn Tyr Thr Val Lys Val Thr Asp Ser Thr 705 710 715 720 Leu Gly Thr Thr Thr Asp Lys Thr Leu Ala Thr Asp Lys Glu Glu Thr 725 730 735 Tyr Lys Val Asp Phe Phe Ser Pro Ala Asp Lys Thr Lys Ala Val His 740 745 750 Thr Ala Lys Val Ile Val Gly Asp Glu Lys Thr Met Met Val Asn Leu 755 760 765 Ala Glu Gly Ala Thr Val Ile Gly Gly Ser Ala Asp Pro Val Asn Ala 770 775 780 Arg Lys Val Phe Asp Gly Gln Leu Gly Ser Glu Thr Asp Asn Ile Ser 785 790 795 800 Leu Gly Trp Asp Ser Lys Gln Ser Ile Ile Phe Lys Leu Lys Glu Asp 805 810 815 Gly Leu Ile Lys His Trp Arg Phe Phe Asn Asp Ser Ala Arg Asn Pro 820 825 830 Glu Thr Thr Asn Lys Pro Ile Gln Glu Ala Ser Leu Gln Ile Phe Asn 835 840 845 Ile Lys Asp Tyr Asn Leu Asp Asn Leu Leu Glu Asn Pro Asn Lys Phe 850 855 860 Asp Asp Glu Lys Tyr Trp Ile Thr Val Asp Thr Tyr Ser Ala Gln Gly 865 870 875 880 Glu Arg Ala Thr Ala Phe Ser Asn Thr Leu Asn Asn Ile Thr Ser Lys 885 890 895 Tyr Trp Arg Val Val Phe Asp Thr Lys Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Pro 900 905 910 Val Val Pro Glu Leu Gln Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Asn Ala Asp 915 920 925 Thr Ile Met Lys Thr Val Thr Thr Ala Lys Glu Leu Ser Gln Gln Lys 930 935 940 Asp Lys Phe Ser Gln Lys Met Leu Asp Glu Leu Lys Ile Lys Glu Met 945 950 955 960 Ala Leu Glu Thr Ser Leu Asn Ser Lys Ile Phe Asp Val Thr Ala Ile 965 970 975 Asn Ala Asn Ala Gly Val Leu Lys Asp Cys Ile Glu Lys Arg Gln Leu 980 985 990 Leu Lys Lys 995 <210> 3 <211> 2985 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA of EndoS D233Q <400> 3 atggacaaac atctgctggt taaacgtacc ctgggttgtg tttgtgcagc aaccctgatg 60 ggtgcagcac tggcaaccca tcatgatagc ctgaataccg ttaaagcaga agaaaaaacc 120 gttcaggttc agaaaggtct gccgagcatt gatagtctgc attatctgag cgaaaacagc 180 aaaaaagaat ttaaagaaga actgagcaaa gccggtcaag aaagccagaa agttaaagaa 240 attctggcaa aagcacagca ggcagataaa caggcacaag aactggccaa aatgaaaatc 300 ccggaaaaaa ttccgatgaa accgctgcat ggtccgctgt atggtggtta ttttcgtacc 360 tggcatgata aaaccagcga tccgaccgaa aaagataaag ttaatagcat gggtgaactg 420 ccgaaagaag ttgatctggc atttatcttt cacgactgga ccaaagatta tagcctgttt 480 tggaaagaac tggcgaccaa acatgttccg aaactgaata aacagggcac ccgtgttatt 540 cgtaccattc cgtggcgttt tctggcaggc ggtgataata gcggtattgc agaagatacc 600 agcaaatatc cgaatacacc ggaaggtaat aaagcactgg cgaaagcaat tgtggatgag 660 tatgtgtata aatacaatct ggatggcctg gatgttcaag ttgaacatga tagcattccg 720 aaagtggaca aaaaagagga taccgcaggc gttgaacgta gcattcaggt ttttgaagaa 780 atcggcaaac tgattggtcc gaaaggtgtt gataaaagcc gtctgtttat tatggatagc 840 acctatatgg ccgataaaaa cccgctgatt gaacgtggtg caccgtatat taacctgctg 900 ctggttcagg tttatggtag ccagggtgaa aaaggtggtt gggaaccggt tagcaatcgt 960 cctgaaaaaa ccatggaaga acgttggcag ggttatagca aatatatccg tccggaacag 1020 tatatgatcg gctttagctt ttatgaagaa aatgcccaag agggcaatct gtggtatgat 1080 attaacagcc gtaaagatga ggataaagcc aatggcatta acaccgatat caccggtaca 1140 cgtgcagaac gttatgcccg ttggcagccg aaaaccggtg gtgttaaagg tggtattttt 1200 agctatgcca ttgatcgtga tggtgttgca catcaaccga aaaaatacgc caaacagaaa 1260 gagttcaaag acgccaccga taacattttc catagcgatt atagcgttag caaagccctg 1320 aaaaccgtga tgctgaaaga caaaagctat gatctgatcg acgagaaaga ttttccggat 1380 aaagcgctgc gtgaagcagt tatggcacag gttggcaccc gtaaaggtga tctggaacgt 1440 tttaatggca ccctgcgtct ggataatccg gcaattcaga gcctggaagg tctgaacaaa 1500 ttcaaaaaac tggcacagct ggatctgatt ggcctgagcc gtattaccaa actggatcgt 1560 agcgttctgc ctgcaaatat gaaaccgggt aaagataccc tggaaaccgt tctggaaacc 1620 tacaaaaaag acaacaaaga agaaccggca accattccgc ctgttagcct gaaagttagc 1680 ggtctgaccg gtctgaaaga gctggacctg tcaggttttg atcgcgaaac cctggcaggt 1740 ctggatgcag ccacactgac cagcctggaa aaagttgata ttagcggcaa taaactggac 1800 ctggcaccgg gtacagaaaa tcgtcagatc ttcgatacca tgctgagcac cattagcaat 1860 catgttggta gcaatgaaca gaccgtgaaa tttgataaac agaaaccgac cggtcattat 1920 cctgatacct atggtaaaac cagtctgcgt ctgccggttg caaatgaaaa agtggatctg 1980 cagagccagc tgctgtttgg caccgttacc aatcagggca cactgattaa tagcgaagca 2040 gattataaag cctatcagaa ccataaaatt gccggtcgta gctttgtgga tagcaactac 2100 cattacaaca acttcaaagt gagctacgag aactataccg tgaaagttac cgatagcacc 2160 ctgggcacca ccacagataa aacactggcc acggataaag aggaaaccta taaagtcgat 2220 tttttcagcc ctgccgacaa aaccaaagca gttcataccg caaaagttat cgtgggtgat 2280 gaaaaaacga tgatggttaa tctggcagaa ggtgcaaccg ttattggtgg tagcgcagat 2340 ccggttaatg cacgtaaagt ttttgatggt cagctgggta gcgaaaccga taatatcagc 2400 ctgggttggg atagcaaaca gagcattatc tttaaactga aagaggacgg cctgattaaa 2460 cattggcgct tttttaacga tagcgcacgt aatccggaaa ccacaaataa accgattcaa 2520 gaagcaagcc tgcagatttt taacatcaaa gattacaacc tggacaacct gctggaaaac 2580 ccgaacaaat ttgatgatga gaaatactgg attaccgtgg atacctatag cgcacagggt 2640 gaacgtgcaa ccgcatttag caataccctg aataatatca cgagcaaata ttggcgtgtg 2700 gtgtttgata ccaaaggcga tcgttatagc agtccggttg tgccggaact gcagattctg 2760 ggttatccgc tgccgaatgc agataccatt atgaaaacag ttaccaccgc caaagaactg 2820 tcacagcaga aagacaaatt tagccagaaa atgctggacg aactgaaaat caaagaaatg 2880 gcactggaaa ccagcctgaa ctccaaaatt ttcgatgtta ccgccattaa tgcaaatgcc 2940 ggtgttctga aagattgcat tgaaaaacgt cagctgctga aaaaa 2985

Claims (16)

  1. 서열 번호 2 의 아미노산 번호 37 ∼ 995 의 아미노산 서열에 있어서, 122 번째 (H122), 279 번째 (D279), 282 번째 (Y282), 303 번째 (Q303), 348 번째 (Y348), 350 번째 (E350), 402 번째 (Y402), 405 번째 (D405), 및, 406 번째 (R406) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 아미노산 지점에 변이를 갖고, 또한, IgG 의 297 번째의 Asn 에 결합하는 N 결합형 당 사슬 (N297 결합 당 사슬) 에 대한 활성으로서, EndoS D233Q 의 활성과 비교하여 저감된 가수 분해 활성을 나타내는 것, 및 일정한 당 전이 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 EndoS 변이 효소로서,
    상기 변이가 이하의 군에서 선택되는 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개인, EndoS 변이 효소,
    H122 의 변이 후의 아미노산은 Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala, Glu, Asp, Leu, Ile, Met 또는 Phe ;
    D279 의 변이 후의 아미노산은 Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala 또는 Gln ;
    Y282 의 변이 후의 아미노산은 Arg, Lys 또는 His ;
    Q303 의 변이 후 아미노산은 Met, Pro 또는 Leu ;
    Y348 의 변이 후 아미노산은 His 또는 Trp ;
    E350 의 변이 후 아미노산은 Lys, Arg, His, Tyr, Gln, Asn, Asp, Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro 또는 Ala ;
    Y402 의 변이 후의 아미노산은 Phe 또는 Trp ;
    D405 의 변이 후 아미노산은 Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro 또는 Ala ; 및,
    R406 의 변이 후 아미노산은 Gly, Cys, Thr, Ser, Val, Pro, Ala, Glu, Asp, Gln 또는 Asn.
  2. 제 1 항에 있어서,
    변이의 지점이, Q303, E350 및 D405 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 아미노산에 있어서의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 EndoS 변이 효소.
  3. 제 1 항에 있어서,
    변이가 이하의 군에서 선택되는 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개인 EndoS 변이 효소,
    H122 가 Ala (H122A) 또는 Phe (H122F) ;
    D279 가 Ser (D279S) 또는 Gln (D279Q) ;
    Y282 가 Arg (Y282R) ;
    Q303 이 Leu (Q303L) ;
    Y348 이 His (Y348H) ;
    E350 이 Ala (E350A), Asn (E350N), Asp (E350D) 또는 Gln (E350Q) ;
    Y402 가 Phe (Y402F) 또는 Trp (Y402W) ;
    D405 가 Ala (D405A) ; 및,
    R406 이 Gln (R406Q).
  4. 제 3 항에 있어서,
    변이로서, Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q 및 D405A 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 EndoS 변이 효소.
  5. 제 4 항에 있어서,
    변이가 Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q, D405A,
    H122A/Q303L, H122F/Q303L, D279Q/Q303L, D279S/Q303L, Y282R/Q303L, Q303L/Y348H, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/Y402F, Q303L/Y402W, Q303L/D405A, Q303L/R406Q,
    H122A/E350A, H122F/E350A, D279Q/E350A, D279S/E350A, Y282R/E350A, Y348H/E350A, E350A/Y402F, E350A/Y402W, E350A/D405A, E350A/R406Q,
    H122A/E350N, H122F/E350N, D279Q/E350N, D279S/E350N, Y282R/E350N, Y348H/E350N, E350N/Y402F, E350N/Y402W, E350N/D405A, E350N/R406Q,
    H122A/E350D, H122F/E350D, D279Q/E350D, D279S/E350D, Y282R/E350D, Y348H/E350D, E350D/Y402F, E350D/Y402W, E350D/D405A, E350D/R406Q,
    H122A/E350Q, H122F/E350Q, D279Q/E350Q, D279S/E350Q, Y282R/E350Q, E350Q/Y348H, E350Q/Y402F, E350Q/Y402W, E350Q/D405A, E350Q/R406Q,
    H122A/D405A, H122F/D405A, D279Q/D405A, D279S/D405A, Y282R/D405A, Y348H/D405A, 또는, D405A/R406Q, 인 것을 특징으로 하는 EndoS 변이 효소.
  6. 제 5 항에 있어서,
    변이가 Q303L, E350A, E350N, E350D, E350Q, D405A, Q303L/E350A, Q303L/E350N, Q303L/E350D, Q303L/E350Q, Q303L/D405A, E350A/D405A, E350N/D405A, E350D/D405A, 또는, E350Q/D405A 인 EndoS 변이 효소.
  7. 제 1 항에 있어서,
    변이가 H122A, H122F, D279Q, D279S, Y282R, Y348H, Y402F, Y402W, 또는 R406Q 인 EndoS 변이 효소.
  8. 제 1 항에 있어서,
    N297 결합 당 사슬에 대한 활성이, pH 7.4 의 반응액 중에서의 가수 분해 반응에 있어서, 24 시간 후까지, 50 ％ 이하의 가수 분해율을 유지하는 것을 특징으로 하는 EndoS 변이 효소.
  9. 제 1 항에 있어서,
    N297 결합 당 사슬에 대한 활성으로서, 추가로, pH 7.4 의 반응액 중에서의, 5 등량의 당 사슬 도너가 N297 결합 당 사슬을 포함하는 억셉터 분자의 5 등량 조건의 당 전이 반응에 있어서 48 시간 후의 당 전이율이 60 ％ 이상인 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 EndoS 변이 효소.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 EndoS 변이 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 10 항의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  12. 제 11 항의 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 EndoS 변이 효소의 존재하에서, N297 결합 당 사슬로서, 코어 GlcNAc 를 갖는 IgG 의 Fc 영역을 포함하는 분자와 옥사졸린화된 GlcNAc 를 포함하는 구조를 갖는 당 사슬 도너를 반응시키고, 당해 Fc 영역 함유 분자의 N297 결합 당 사슬의 당해 코어 GlcNAc 에, 당해 당 사슬 도너가 갖는 당 사슬이 전이한 구조를 갖는 Fc 영역 함유 분자를 산생시키는 것을 특징으로 하는 당 사슬 리모델링된 Fc 영역 함유 분자의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    코어 GlcNAc 가 푸코오스 부가되어 있는 것인, 당 사슬 리모델링된 Fc 영역 함유 분자의 제조 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    Fc 영역 함유 분자가, IgG 모노클로날 항체인, 당 사슬 리모델링된 Fc 영역 함유 분자의 제조 방법.
  16. 삭제
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