CN108026518A - 新型endos突变型酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了EndoS突变型酶，以及其编码基因。所述EndoS突变型酶的特征在于其在EndoS D233Q的氨基酸序列中具有特定且额外的突变，且当与EndoS D233Q的活性比较时，表现出作为结合IgG中位置297的Asn的N‑连接的糖链(N297‑连接的糖链)的活性的降低的水解活性。

Description

新型ENDOS突变型酶
技术领域
本发明涉及内-β-N-乙酰葡糖苷酶S(EndoS)的新型突变体，编码所述突变体的基因，重组质粒，用所述质粒转化的转化体，和使用所述突变体修饰抗体的糖链的方法。
背景技术
糖蛋白广泛存在于动物和植物的组织、真核微生物的细胞膜和壁等中。近来，已变得清楚的是，糖蛋白的糖链在诸如细胞分化、癌化和细胞-细胞识别的机制中发挥重要作用，并且正在研究糖链的结构和功能之间的相关性以阐明这些机制。在培养细胞系中，糖蛋白被翻译为由一致氨基酸序列组成的蛋白，然后通过翻译后修饰糖基化以递送至培养基中。由于这种翻译后修饰不是仅根据其氨基酸序列确定，即使在相同培养系统中表达的相同蛋白上，添加的糖链在其结构上也有所不同。
抗体是具有连接至重链分子的Fc区的位置297的Asn侧链的N-连接的糖链(N297-连接的糖链)的糖蛋白分子。抗体是基础研究和医学领域中的重要分子，并且特别作为抗体药物被急切地研究和开发。因此，糖链的各种作用正变得清楚(非专利文献1：J. N.Arnold, 等人, Annu. Rev. Immunol, 2007, 25, 21050)。目前，使用的治疗性抗体主要是IgG类分子。这样的抗体通常由培养的动物细胞（诸如由CHO细胞和NS0细胞）产生，并且由这些动物细胞产生的抗体的N297-连接的糖链是由核心岩藻糖、末端唾液酸基和半乳糖基和二等分GlcNAc异质的双触角复合型糖链(非专利文献2：R. Jefferis, Biotechnol.Prog., 2005, 21-11-6)。已经揭示抗体的N297-连接的糖链对包括ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC的效应活性具有很大影响(非专利文献3：Nimmerjahn, Nat. Rev.Immunol. 2008, 8, 34-47；非专利文献4：Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery, 2009,8, 226-234)并且还报道了它们也具有对血液中的半衰期影响的可能性(非专利文献5：D.Bumbaca, AAPSJ, 2012, 14, 3)。而且，已经揭示，在N297-连接的糖链的非还原末端2,6-唾液酸化的抗体是IVIG中的活性药物成分(非专利文献6：Wang, ACS Chem. Biol. 2012,7, 110-122)。而且，认为包括IgG和Fc片段的治疗性分子中的N297-连接的糖链的异质性作为活性成分对其性质和质量具有很大影响，并且存在不可否认的可能性，即少量异质糖基化分子的污染显著改变了最终产品的性质。
针对该现状，正在开发在生产糖蛋白分子(包括治疗性抗体和抗体Fc区域)中使糖链同质的技术。用于使待添加至糖蛋白的糖链同质的已知方法包括使用酶的转糖苷反应(非专利文献6：Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110-122；非专利文献7：Wang, TrendsGlycosci. Glycotechnol. 2011, 23, 33-52.)。这是由在体外环境中的糖链的切割(水解反应)和糖链的缩合(转糖苷反应)组成的多阶段过程。具体地，为了转化N-型糖链，使用被称为内-β-N-乙酰葡糖苷酶的一组酶。这样的酶需要1)具有特异性水解复合型糖链（作为其底物）的能力和2)具有催化特定结构的转糖苷反应（作为其性质）的能力。内-β-N-乙酰葡糖苷酶分离自各种物种，并且根据待作为底物修饰的糖链的种类使用不同的野生型和突变型酶。EndoA(源自原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae)的酶)(非专利文献8：Takegawa, Biochem Int.1991 Jul; 24(5):849-55)、EndoD(源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的酶)(非专利文献9：Fan, J Biol Chem.2012 Mar 30; 287(14):11272-81)、EndoM (源自冻土毛霉(Mucor hiemalis)(非专利文献10：Umekawa,Biochem Biophys Res Commun.1994 Aug 30, 203(1):244-52)、EndoH(非专利文献11：Robbins, J Biol Chem.1984 Jun 25; 259(12):7577-83)、EndoF2 (源自脑膜炎败血性黄杆菌(Flavobacterium Meningosepticum)的酶)(非专利文献12：Huang,Chembiochem.2011 April 11; 12(6):932-941)、EndoE(源自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的酶)(非专利文献13：Collin, JBC 2004, 279-21)、EndoS (源自酿脓链球菌(Streptococcus pygenes)的酶)(非专利文献14：Collin, EMBO J.2001 Jun 15; 20(12):3046-55)等用于使糖链同质的目的，但是只有EndoS被证实是对作为底物的具有核心岩藻糖的复合型N297-连接的糖链具有水解活性和转糖苷活性的酶(非专利文献15：Allhorn,BMC Microbiol. 2008, 8, 3.；非专利文献16：Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012,134, 8030-8033)。
关于EndoS还知道的是，EndoS D233Q的水解活性在一定程度上受到抑制（其中在位置233存在用Gln取代Asp的突变，（在2个催化残基(位置233的Asp和位置235的Glu)之间的亲核催化残基））。已知这种突变体在其中反应体系中含有大量具有噁唑啉化还原末端的糖链的中间体的条件下选择性地催化转糖苷反应(非专利文献17：Huang, J. Am. Chem.Soc. 2012, 134, 12308-12318；专利文献1：WO 2013/120066 Al；非专利文献18：B.Trastoy等人, PNAS (2014) vol 111, No.18, pp6714-6719)。而且，已经报道了许多分类为EndoS酶的酶序列，这些序列是源自酿脓物种中不同菌株的不同血清型的序列。具体地，已报道了源自血清型M49的EndoS2(非专利文献19：Sjogren, Biochem J.2013 Oct 1; 455(1):107-18；其也可被称为EndoS49)具有相似的底物性质。
然而，这些已知的EndoS酶和突变型酶诸如EndoS D233Q的活性不足以在工业规模上进行治疗性抗体的糖重构，并且需要使得有效的糖重构成为可能的技术改进。
引文列表
专利文献
专利文献1：WO 2013/120066 Al pamphlet
非专利文献
非专利文献1: J. N. Arnold等人, Annu. Rev. Immunol, 2007, 25, 21050
非专利文献2: R. Jefferis, Biotechnol. Prog., 2005, 21-11-6
非专利文献3: Nimmerjahn, Nat. Rev. Immunol. 2008, 8, 34-47
非专利文献4: Jefferis Nat. Rev. Drug Discovery 2009, 8, 226-234
非专利文献5: D. Bumbaca, AAPSJ, 2012, 14, 3
非专利文献6: Wang, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 110-122
非专利文献7: Wang, Trends Glycosci. Glycotechnol. 2011, 23, 33-52
非专利文献8: Takegawa, Biochem Int. 1991 Jul; 24(5): 849-55
非专利文献9: Fan, J Biol Chem. 2012 Mar 30; 287(14): 11272-81
非专利文献10: Umekawa, Biochem Biophys Res Commun. 1994 Aug 30; 203(1):244-52
非专利文献11: Robbins, J Biol Chem. 1984 Jun 25; 259(12): 7577-83
非专利文献12: Huang, Chembiochem. 2011 April 11; 12(6): 932-941
非专利文献13: Collin, JBC 2004, 279-21
非专利文献14: Collin, EMBO J. 2001 Jun 15; 20(12): 3046-55
非专利文献15: Allhorn, BMC Microbiol. 2008, 8, 3.;
非专利文献16: Goodfellow, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030-8033
非专利文献17: Huang, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318
非专利文献18: B. Trastoy等人, PNAS (2014) vol 111, No.18, pp6714-6719
非专利文献19: Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1; 455(1): 107-18。
发明概述
技术问题
本发明的一个目标是提供与EndoS D233Q相比具有降低的水解活性（所述EndoS D233Q是内-β-N-乙酰葡糖苷酶的突变体，其具有对IgG的Fc区的糖链的特异性且具有与EndoS相比受抑制的水解活性），，且维持一定转糖苷活性的内-β-N-乙酰葡糖苷酶的新型突变型酶。
从使用已知EndoS D233Q的研究发现，由于该突变体维持一定水解活性，所以转糖苷反应中的转糖苷速率在反应开始后随时间降低。因此，通过用EndoS或现有突变体进行糖重构以高纯度获取具有同质糖链的抗体是困难的。具体地，在大规模的反应中，由于在纯化步骤前花费时间长，所以从酶分离出的末期抗体不可避免地含有具有截短的糖链的抗体。
此外，用作糖供体的糖链的化学合成的噁唑啉衍生物经常是昂贵的，并且其大量使用导致生产成本的增加。因此，具有与EndoS D233Q相比降低的水解活性和等于或高于一定水平的转糖苷活性的酶对于以高纯度产生具有同质糖链的抗体是必需的。
问题的解决方案
作为实现上述目标而进行的辛勤研究的结果，本发明人已参照EndoS D233Q的氨基酸序列信息和三维结构设计和产生了大量突变体，并且发现，具有除了D233Q之外的特定氨基酸的额外突变的新型突变型酶具有期望的活性，并已经进行了进一步的研究以完成本发明。
本发明提供了以下发明：
(1) EndoS突变型酶，其包含SEQ ID NO: 2的氨基酸编号37至995的氨基酸序列且在至少一个选自如下的氨基酸位置具有额外突变：氨基酸122 (H122)、氨基酸184 (P184)、氨基酸279 (D279)、氨基酸282 (Y282)、氨基酸303 (Q303)、氨基酸348 (Y348)、氨基酸350(E350)、氨基酸402 (Y402)、氨基酸405 (D405)和氨基酸406 (R406)，且表现出与EndoSD233Q的活性相比降低的水解活性，所述活性是对IgG中的与位置297的Asn连接的N-连接的糖链(N297-连接的糖链)的活性。
(2) 根据(1)所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是在1至4个选自如下的氨基酸位置处：H122、P184、D279、Y282、Q303、Y348、E350、Y402、D405和R406。
(3) 根据(1)所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是在一个选自如下的氨基酸位置处的突变：Q303、E350和D405。
(4) 根据(1)至(3)中任一项所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是选自如下的至少一种：
在H122处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Glu、Asp、Leu、Ile、Pro、Met或Phe；
在P184处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Gln或Asn；
在D279处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala或Gln；
在Y282处突变为氨基酸：Arg、Lys或His；
在Q303处突变为氨基酸：Met、Pro或Leu；
在Y348处突变为氨基酸：His或Trp；
在E350处突变为氨基酸：Lys、Arg、His、Tyr、Gln、Asn、Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala；
在Y402处突变为氨基酸：Phe或Trp；
在D405处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala；且
在R406处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Glu、Asp、Gln或Asn。
(5) 根据(4)所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是选自如下的至少一种：
在H122处突变为Ala (H122A)或Phe (H122F)；
在P184处突变为Gln (P184Q)；
在D279处突变为Ser (D279S)或Gln (D279Q)；
在Y282处突变为Arg (Y282R)；
在Q303处突变为Leu (Q303L)；
在Y348处突变为His (Y348H)；
在E350处突变为Ala (E350A)、Asn (E350N)、Asp (E350D)或Gln (E350Q)；
在Y402处突变为Phe (Y402F)或Trp (Y402W)；
在D405处突变为Ala (D405A)；且
在R406处突变为Gln (R406Q)。
(6) 根据(5)所述的EndoS突变型酶，其包含至少一个选自如下的突变作为额外突变：Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q和D405A。
(7) 根据(6)所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q、D405A、
H122A/Q303L、H122F/Q303L、P184Q/Q303L、D279Q/Q303L、D279S/Q303L、Y282R/Q303L、Q303L/Y348H、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/Y402F、Q303L/Y402W、Q303L/D405A、Q303L/R406Q、
H122A/E350A、H122F/E350A、P184Q/E350A、D279Q/E350A、D279S/E350A、Y282R/E350A、Y348H/E350A、E350A/Y402F、E350A/Y402W、E350A/D405A、E350A/R406Q、
H122A/E350N、H122F/E350N、P184Q/E350N、D279Q/E350N、D279S/E350N、Y282R/E350N、Y348H/E350N、E350N/Y402F、E350N/Y402W、E350N/D405A、E350N/R406Q、
H122A/E350D、H122F/E350D、P184Q/E350D、D279Q/E350D、D279S/E350D、Y282R/E350D、Y348H/E350D、E350D/Y402F、E350D/Y402W、E350D/D405A、E350D/R406Q、
H122A/E350Q、H122F/E350Q、P184Q/E350Q、D279Q/E350Q、D279S/E350Q、Y282R/E350Q、E350Q/Y348H、E350Q/Y402F、E350Q/Y402W、E350Q/D405A、E350Q/R406Q、
H122A/D405A、H122F/D405A、P184Q/D405A、D279Q/D405A、D279S/D405A、Y282R/D405A、Y348H/D405A或D405A/R406Q。
(8) 根据(7)所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是
Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q、D405A、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/D405A、E350A/D405A、E350N/D405A、E350D/D405A或E350Q/D405A。
(9) 根据(4)所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是H122A、H122F、P184Q、D279Q、D279S、Y282R、Y348H、Y402F、Y402W或R406Q。
(10) 根据(1)所述的EndoS突变型酶，其中在pH 7.4的反应溶液中24小时后，在水解反应中对N297-连接的糖链的活性 保持50％或更低的水解率。
(11) 根据(1)所述的EndoS突变型酶，其中所述EndoS突变型酶进一步表现出对N297-连接的糖链的活性，其导致在pH 7.4的反应溶液中与5个当量的糖供体的转糖苷反应48小时后约60％或更多的转糖苷百分比。
(12) 多核苷酸，其编码根据(1)至(11)中任一项所述的EndoS突变型酶。
(13) 载体，其包含与根据(12)所述的多核苷酸互补的核苷酸。
(14) 用根据(13)所述的载体转化的宿主细胞。
(15) 生产包含糖重构的Fc区的分子的方法，其包括使包含具有核心GlcNAc且任选地添加岩藻糖的IgG的Fc区作为N297-连接的糖链的分子与具有包含噁唑啉化的GlcNAc的结构的糖供体在根据(1)至(11)中任一项所述的EndoS突变型酶存在的情况下反应，以产生包含具有N297连接的糖链的Fc区域的分子，所述Fc区域具有如下结构：其中糖供体具有的糖链被转移至N297-连接的糖链的核心GlcNAc。
(16) 根据(15)所述的生产方法，其中包含Fc区的分子是IgG单克隆抗体。
本发明的有利效果
本发明的新型EndoS突变型酶与EndoS D233Q相比具有进一步降低的水解活性，其已知是具有降低的水解活性的突变体，并且维持等于或高于一定水平的转糖苷活性。因此，可以通过本发明的突变型酶以更高纯度且更高效地重构糖而获得具有同质糖链的抗体。此外，由于可以减少用于糖重构的糖供体的量，所以它们导致糖重构的抗体的生产成本降低。
附图简述
[图1]图1说明可用作糖重构中的糖供体的SG-Oxa的化学结构式(左)和以符号形式代表的糖链(右)。
[图2]图2是使用EndoS或EndoS突变型酶的抗体的N297-连接的糖链的水解反应的示意图。
[图3]图3示意性说明使用EndoS或EndoS突变型酶的转糖苷反应。
[图4-1]图4说明EndoS突变型酶(EndoS D233Q、EndoS D233Q/Q303L、EndoSD233Q/Q303L/E350Q、EndoS D233Q/Q303L/D405A、EndoS D233Q/E350Q、EndoS D233Q/D405A和EndoS D233Q/Y402F)的氨基酸序列的比对。基于包括信号序列(1-36)的全长编码区对氨基酸进行编号。图4-1说明突变型酶的氨基酸编号37-176的比对。
[图4-2]图4-2是图4-1的延续，且说明突变型酶的氨基酸编号177-316的比对。
[图4-3]图4-3是图4-2的延续，且说明突变型酶的氨基酸编号317-456的比对。
[图4-4]图4-4是图4-3的延续，且说明突变型酶的氨基酸编号467-596的比对。
[图4-5]图4-5是图4-4的延续，且说明突变型酶的氨基酸编号597-736的比对。
[图4-6]图4-6是图4-5的延续，且说明突变型酶的氨基酸编号737-876的比对。
[图4-7]图4-7是图4-6的延续，且说明突变型酶的氨基酸编号877-995的比对。
实施方案的描述
下面详细描述本发明。
本文分子中含有的氨基酸的注释符合本领域的习惯，并且突变的位置由野生型氨基酸(或核酸)的单字符符号及其编号(例如，在位置233的Asp被称为“D233”)所指明。突变由野生型氨基酸(或核酸)的单字符符号、其编号和突变后的氨基酸(或核酸)的单字符符号所指明(例如，用Gln取代位置233的Asp的突变被称为“D233Q”)。此外，具有突变的特定突变体由分子名称和突变所指明(例如，位置233的Asp被Gln取代的EndoS突变体被称为“EndoSD233Q”)，并且如果突变体具有多个突变，所述突变用突变之间的分隔符“/”指明(例如，具有用Leu取代位置303的Gln的额外突变的EndoS D233Q突变体被称为“EndoS D233Q/Q303L”)。
在本发明中，术语“N297连接的糖链”是指与IgG重链的位置297的Asn侧链连接的糖链。当IgG被片段化时，在术语“N297连接的糖链”中还包括与含有Asn的肽片段中的相应Asn连接的糖链。通常，在动物等中产生的IgG中的N297连接的糖链具有由下式表示的基本结构，并且可以进一步将Gal或唾液酸添加至其非还原末端。
[式1]
。
[式2]
。
由细胞产生的IgG的大多数N297连接的糖链具有各种糖链结构，包括其中其它糖链连接至该基本结构中的还原末端处的GlcNAc(核心GlcNAc)和/或非还原末端、支链糖等处的部分的糖链。核心GlcNAc可以被修饰成具有核心岩藻糖的结构((Fucα1,6)GlcNAc)，其中岩藻糖α1,6连接至核心GlcNAc的第6位。支化甘露糖可以形成三支链型糖链，其中含有GlcNAc的其它糖链与甘露糖的第5位连接。对于非还原末端处的GlcNAc，可以连接含有Gal或唾液酸的糖链。
在本发明中，“糖供体”是在其糖链的还原末端处具有噁唑啉化的GlcNAc的含糖链分子，并且具有各种糖链结构的分子是可得的。
当为了药物发现的目的而将糖供体用于糖重构时，优选采用具有人糖链或人相容的糖链的糖供体，其在应用于人时引起很少的问题。这样的糖链是已知在人体内没有表现出抗原性的糖链，并且作为N-连接的糖链的这样的糖链的已知实例包括高甘露糖型、杂合型和复合型。这三者具有共同的基本结构。高甘露糖型的糖链是具有富含甘露糖结构的糖链，其中多个甘露糖残基在接近于还原末端的位置连接至甘露糖(β-甘露糖)分支的2个支链(1-3和1-6链)。糖链的杂合类型是在接近于还原末端的位置的甘露糖(β-甘露糖)分支的2个支链(1-3和1-6链)之一中具有GlcNAc的结构的那些糖链。复合型糖链是在接近于还原末端的位置的甘露糖(β-甘露糖)分支的2个支链(1-3和1-6链)中具有GlcNAc的结构的那些，并且具有各种结构，包括具有或不具有半乳糖、具有或不具有唾液酸（sial）以及其连接异构体和区域异构体的那些结构。(参见表1)。代表性供体糖是实施例2中生产的SG-Oxa(图1)。
[表1]
人N-连接的糖链的类型
在本发明中，“受体分子”是在非还原末端含有具有GlcNAc的糖结构的分子，并且当它们在EndoS或其突变型酶的存在下与糖供体分子反应时，它们可以形成壳二糖结构，这是由于糖供体分子中的噁唑啉环与受体分子的非还原末端的GlcNAc的第4位的反应。通常受体分子是源自单克隆抗体并且具有仅由任选地与核心岩藻糖连接的核心GlcNAc组成的N297连接的糖链的IgG或其Fc片段。取决于衍生受体分子的抗体或其生产方法，核心岩藻糖可以连接或不连接至核心GlcNAc。包含Fc区(诸如Fc，CLCH，其为仅由通过从重链中缺失可变区获得的恒定区组成的CH和仅由轻链的恒定区组成的CL的组合 )的各种单克隆抗体或分子可以用作受体分子的来源，但其优选实例包括(Fucα1,6)-GlcNAc-IgG、(Fucα1,6)-GlcNAc-Fc和(Fucα1,6)-GlcNAc-CLCH，且代表性实例包括实施例3中产生的(Fucα1,6)-GlcNAc-曲妥珠单抗。
在本发明中，“EndoS”是一种源自酿脓链球菌的内-β-N-乙酰葡糖苷酶(ENGase)，和由SEQ ID NO:1的氨基酸编号37至995(位置1至36的氨基酸对应于信号序列)的氨基酸序列组成的酶，其中位置233的氨基酸是Asp (EC 3.2.1.96, GH18)。EndoS特异性识别来自IgG的Fc位点上的N297连接的糖链，并且具有水解活性和转糖苷酶活性。EndoS的水解活性是这样的活性，其特异性水解具有上述基本结构的N297连接的糖链的核心壳二糖中含有的β-1,4-糖苷键(如本文所用，除非另有说明，“水解活性”是指该活性。反应的示意图显示于图2中)。EndoS的转糖苷活性是这样的活性，其源自在还原末端具有噁唑啉化的GlcNAc(可以添加或可以不添加核心岩藻糖)的糖供体的糖链的还原末端和含有仅在N297具有核心GlcNAc的Fc位点的受体分子之间形成糖苷键(下文将该活性称为“转糖苷活性”。该反应的示意图显示于图3中)。
已经报道了EndoS的结构具有5个结构域：内糖苷酶酶促结构域(催化结构域：SEQID NO:1的氨基酸编号98至445)，富含亮氨酸的重复结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸编号446至631)，杂合Ig结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸编号632至764)，碳水化合物结合模块(CBM：SEQ ID NO:1的氨基酸编号765至923)，和三螺旋-束结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸编号924至995)(B. Trastoy等人,PNAS (2014) vol 111, No. 18, pp6714-6719)，其中对于与抗体的相互作用重要的位点被认为是以下两个结构域：催化结构域和CBM。
EndoS是一种在甲类链球菌(GAS)中非常保守的酶。在属于GAS的血清型M49的NZ131中发现的EndoS2(其也可以称为EndoS49; Sjogren, Biochem J. 2013 Oct 1; 455(1):107-18; US 2014/0302519 A1)具有37％的序列同一性，但构成催化结构域的重要氨基酸非常保守，并且EndoS2表现出与EndoS相似的底物特异性。如本文所用，与EndoS的活性区具有氨基酸同源性/同一性的这种酶被称为“EndoS相关的酶”。EndoS中的重要突变位点H122、D233、D279、Q303、E350、Y402、D405和R406分别对应于EndoS2中的H75、D184、D226、Q250、E289、Y339、D342和R343。本发明的突变型酶还包括其中相应的氨基酸从相关酶诸如EndoS2突变的突变型酶。
在本发明中，“EndoS D233Q”是由其中野生型EndoS的位置233的Asp被Gln取代的序列(SEQ ID NO:1的氨基酸编号37至995的氨基酸序列)组成的突变型酶，且所述突变型酶具有被一定程度抑制的EndoS的水解活性并且将转糖苷活性保持在与野生型等效的水平。
<本发明的突变型酶>
本发明提供了EndoS D233Q突变型酶，其含有SEQ ID NO:2的氨基酸编号37至995的氨基酸序列中的转糖苷活化所必需的区域，且除了D233Q之外，在选自某些必需额外突变的位置的至少一个氨基酸位置具有额外突变；与EndoS D233Q相比对于IgG的N297连接的糖链具有降低的水解活性。
在本发明中，术语“额外突变”是指EndoS D233Q的氨基酸序列中除D233以外的氨基酸的额外氨基酸改变。在本发明中，“必需额外突变的位置组”是在本发明的突变型酶中必需额外突变的位置的候选组，且是SEQ ID NO:2的氨基酸序列中由Xaa指明的位置组成的组，即H122、P184、D279、Y282、Q303、Y348、E350、Y402、D405和R406，且优选为Q303、E350和D405组成的组。
本发明的突变型酶的特征在于具有比EndoS D233Q更低的水解活性和一定水平的转糖苷活性(下文中，具有两种活性被称为具有“本酶活性(the present enzymeactivity)”)。至于突变型酶是否具有本酶活性，可以通过下述实施例4的方法来评估水解和转糖苷活性。
关于本发明的突变型酶具有的本酶活性，与EndoS D233Q的水解活性相比，水解活性受到抑制，并且更具体地，如实施例4中所述，在pH7.4的条件下的水解百分比在从反应开始到1至48小时后的任何一个时间点表现出低于EndoS D233Q的水解百分比的值，但优选地，水解反应开始后24小时的水解百分比为EndoS D233Q的50％或更少，或者在48小时后的水解百分比为EndoS D233Q的60％或更少，更优选地水解反应开始24小时，水解百分比维持在EndoS D233Q的40％或更少，进一步优选地，对于相同时间段，维持在30％或更少，甚至更优选20％或更少，并且最优选地，所有时间点的水解百分数均表现出0％，并且水解活性被完全消除。
关于本酶活性，本发明的突变型酶具有水平与EndoS D233Q的转糖苷活性等效的转糖苷活性，并且更具体地，在pH 7.4与相对于如实施例4中描述的受体分子的5个当量的糖供体的条件下的转糖苷百分比在开始反应后1至48小时的时间点时和之后等于或大于EndoS D233Q的转糖苷百分比(例如，EndoS D233Q的值的70％或更多)，但优选地，到反应开始后48小时，转糖苷百分比达到EndoS D233Q的50％或更多，更优选地，到反应开始后48小时，转糖苷百分比达到EndoS D233Q的60％或更多，进一步优选地，到反应开始后48小时，转糖苷百分比达到EndoS D233Q的80％或更多，并且甚至更优选地，到反应开始后48小时，转糖苷百分比达到EndoS D233Q的90％或更多。
本发明的突变型酶不必具有全长序列，只要保留了对于EndoS D233Q的转糖苷活性重要的区域在SEQ ID NO:2的氨基酸编号37至995的氨基酸序列。从EndoS的结构域分析可知，催化结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸编号98至445)和CRM (SEQ ID NO:2的氨基酸编号765至923)是重要的，并且突变型酶可以用作本发明的突变型酶，只要它们含有这些结构域。此外，本发明还包括相关的酶诸如EndoS2，只要它们含有对应于这些结构域的区域并且适当地在相应的位置(EndoS的H122、D233、D279、Q303、E350、Y402、D405和R406分别对应于EndoS2的H75、D184、D226、Q250、E289、Y339、D342和R343)具有氨基酸的突变和展示本酶活性。它们优选为含有SEQ ID NO:2的氨基酸编号98至923的多肽，更优选为含有SEQ ID NO:2的氨基酸编号98至995的多肽，并且进一步优选为含有SEQ ID NO:2的氨基酸编号37至995的多肽。
在本发明的突变型酶的氨基酸序列中，可以在不影响本酶活性的程度上，在除了下述必需突变的位置以外的位置取代、缺失、插入和/或添加一个至几个氨基酸。任何位置都可以选择用于此类氨基酸改变，只要其不影响本酶活性，但该位置优选为催化结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸编号98至445)和CRM (SEQ ID NO:2的氨基酸编号765至923)以外的位置，且更优选为SEQ ID NO:2的氨基酸编号37至97或氨基酸编号924至995的区域中所含的位置。在本发明中，术语“几个”是指20个或更少个，优选10个或更少个，进一步优选5个或更少个，最优选4个、3个、2个或1个。
在本发明的突变型酶中，除了D233Q以外的额外突变的位置包括选自必要额外突变的位置的至少一个位置。额外突变的位置的数目没有特别限制，只要产生的突变型酶具有本酶活性，但其优选为10个或更少个，更优选为5个或更少个，进一步优选为4个、3个、2个或1个。当突变型酶在多个位置具有额外突变时，如果在必需额外突变的位置组中的至少一个上存在突变，则突变的其他位置不受特别限制，只要产生的突变型酶具有本酶活性，但优选的是所有额外突变都位于必需额外突变的位置组中。当所述突变型酶在除了必需额外突变的位置以外的位置具有额外突变时，在除了必需额外突变的位置之外的位置含有额外突变的区域优选为涉及酶活性的催化结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸编号98至445)以外的氨基酸，更优选为SEQ ID NO:2的氨基酸编号37至97、446至764和924至995的区域，且进一步优选为SEQ ID NO:2的氨基酸编号37至97和924至995的区域。
在本发明中，执行额外突变中的取代后的氨基酸没有特别限制，只要最终获得的突变型酶具有本酶活性，并且可以使用任何各种氨基酸诸如天然存在的氨基酸、人工合成的氨基酸及其修饰的氨基酸，但所述氨基酸优选为天然存在的氨基酸，更优选天然存在的L-氨基酸，并且进一步优选必需氨基酸。以下举例说明在必需额外突变的位置之一处的突变氨基酸优选的氨基酸。
在H122处的突变氨基酸优选为具有小侧链结构的氨基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)，诸如减少所述位置和周围氨基酸之间的相互作用的那些氨基酸，在侧链中具有负电荷的氨基酸(Glu或Asp)或在侧链中不具有高反应性官能团的氨基酸(Leu、Ile、Pro、Met、Phe)，且更优选为Ala或Phe。
在P184的突变氨基酸优选为具有小侧链结构的氨基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)或在侧链中具有酰胺基的氨基酸(Gln、Asn)，且更优选为Gln。
在D279的突变氨基酸优选为具有小侧链结构的氨基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)或Gln，且更优选为Ser或Gln。
在Y282的突变氨基酸优选为其侧链为碱性的氨基酸(Arg、Lys、His)，且更优选为Arg。
在Q303的突变氨基酸优选为疏水性氨基酸(Met、Pro、Leu)，且更优选为Leu。
在Y348的突变氨基酸优选为在侧链中具有环结构的氨基酸(His、Trp)，且更优选为His。
在E350的突变氨基酸优选为具有能够形成氢键的大侧链的氨基酸(Lys、Arg、His、Tyr、Gln、Asn)或具有小侧链结构的氨基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)，诸如减少所述位置和周围氨基酸之间的相互作用的那些，且更优选为Ala、Asn、Asp或Gln。
在Y402的突变氨基酸优选为在侧链中具有芳香环的大氨基酸，Phe或Trp。
在D405的突变氨基酸优选为具有小侧链结构的氨基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)，诸如减少所述位置和周围氨基酸之间的相互作用的氨基酸，且更优选为Ala。
在R406的突变氨基酸优选为具有小侧链结构的氨基酸(Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala)，诸如减少所述位置和周围氨基酸之间的相互作用的那些氨基酸，或在侧链中具有负电荷的氨基酸(Glu、Asp)，或在侧链中具有酰胺基团的氨基酸(Gln, Asn)，且更优选为Ala或Gln。
如上所述的必需额外突变的位置的突变可以是单独的或与另一必需额外突变的位置处的突变和/或另一位置处的突变组合。必需额外突变的位置处的突变的组合可以是任何组合，但是优选为含有至少Q303、E350或D405处的突变的组合，并且更优选为含有至少Q303L、E350A、E350N、E350Q或D405A的组合。
含有Q303L的额外突变的组合的实例可以包括H122A/Q303L、H122F/Q303L、P184Q/Q303L、D279Q/Q303L、D279S/Q303L、Y282R/Q303L、Q303L/Y348H、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/Y402F、Q303L/Y402W、Q303L/D405A和Q303L/R406Q。
含有E350A的额外突变的组合的实例可以包括H122A/E350A、H122F/E350A、P184Q/E350A、D279Q/E350A、D279S/E350A、Y282R/E350A、Y348H/E350A、E350A/Y402F、E350A/Y402W、E350A/D405A和E350A/R406Q。
含有E350N的额外突变的组合的实例可以包括H122A/E350N、H122F/E350N、P184Q/E350N、D279Q/E350N、D279S/E350N、Y282R/E350N、Y348H/E350N、E350N/Y402F、E350N/Y402W、E350N/D405A和E350N/R406Q。
含有E350D的额外突变的组合的实例可以包括H122A/E350D、H122F/E350D、P184Q/E350D、D279Q/E350D、D279S/E350D、Y282R/E350D、Y348H/E350D、E350D/Y402F、E350D/Y402W、E350D/D405A和E350D/R406Q。
含有E350Q的额外突变的组合的实例可以包括H122A/E350Q、H122F/E350Q、P184Q/E350Q、D279Q/E350Q、D279S/E350Q、Y282R/E350Q、Y348H/E350Q、E350Q/Y402F、E350Q/Y402W、E350Q/D405A和E350Q/R406Q。
含有D405A的额外突变的组合的实例可以包括H122A/D405A、H122F/D405A、P184Q/D405A、D279Q/D405A、D279S/D405A、Y282R/D405A、Y348H/D405A、Y402F/D405A、Y402W/D405A或D405A/R406Q。
本发明的优选的突变型酶是EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/E350A、EndoSD233Q/E350N、EndoS D233Q/E350D、EndoS D233Q/E350Q、EndoS D233Q/D405A、EndoSD233Q/Q303L/E350A、EndoS D233Q/Q303L/E350N、EndoS D233Q/Q303L/E350D、EndoSD233Q/Q303L/E350Q、EndoS D233Q/Q303L/D405A、EndoS D233Q/E350A/D405A、EndoSD233Q/E350N/D405A、EndoS D233Q/E350D/D405A、EndoS D233Q/E350Q/D405A、or EndoSD233Q/Y402F、more preferably EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/Q303L/E350Q、EndoSD233Q/Q303L/D405A、EndoS D233Q/E350A或EndoS D233Q/Y402F。
<产生酶的基因、宿主细胞、方法>
本发明进一步提供编码具有在上述EndoS D233Q中额外突变的突变型酶的重组基因，包含该重组基因的基因构建体诸如质粒或表达载体，用该基因构建体转化的宿主细胞，产生本发明的突变型酶的方法，其包括从宿主细胞的培养物中收集本发明的突变型酶的步骤等。所述重组基因、基因构建体、宿主细胞等可以根据已知基因工程改造技术基于本发明的突变型酶的氨基酸序列来制备。
关于编码本发明的突变型酶的重组基因，可以基于SEQ ID NO:3的核苷酸编号109至2985(1至108是编码信号肽的区域)中所示的EndoS D233Q的核苷酸序列制备多核苷酸（诸如编码含有额外目标突变的氨基酸序列的cDNA）。例如，编码EndoS D233Q/Q303L的核苷酸序列是通过用CTG取代位置907至909的核苷酸CAG而从SEQ ID NO:3的核苷酸编号109至2985的核苷酸序列修饰的核苷酸序列。此外，编码EndoS D233Q/E350A (N、Q)的核苷酸序列是通过用GCA取代位置1048至1050的核苷酸GAA (E350N中的AAT和E350Q中的CAG)而从SEQID NO:3的核苷酸编号109至2985的核苷酸序列修饰的核苷酸序列。此外，编码EndoSD233Q/D405A的核苷酸序列是通过用GCA取代位置1213至1215的核苷酸GAT而从SEQ ID NO:3的核苷酸编号109至2985的核苷酸序列修饰的核苷酸序列。
可以根据细胞的种类在适当的条件下培养通过引入编码本发明的突变型酶的基因而转化的宿主细胞(可以适当地选择通常用于蛋白生产的细胞，诸如动物细胞、植物细胞、大肠杆菌、酵母等)，并且可以从培养物中收集本发明的突变型酶。突变型酶的收集通过适当地基于酶的物理性质组合常规纯化技术来进行。为了促进收集，可以设计基因构建体，以具有标签肽诸如GST的形式表达突变型酶，所述标签肽预先与突变型酶连接以使得可能使用与标签肽的亲和力进行收集。所述标签肽可以在纯化后除去，但当其对酶活性没有影响时，可以使用具有与之连接的标签肽的突变型酶用于反应诸如糖重构。本发明的突变型酶包括这样的酶，其具有包含与之连接的标签肽的氨基酸序列的氨基酸序列。
<糖重构>
本发明提供了使用本发明EndoS突变型酶的在IgG或包含Fc区的分子上的N297-连接的糖链的糖重构的方法，以及通过所述糖重构获得的由基本同质结构组成的具有N297-连接的糖链的IgG或包含Fc区的分子。
术语“糖重构”是指通过首先产生受体分子(其中特定单克隆抗体的IgG的包含Fc区的分子诸如IgG或Fc片段或CLCH(仅由恒定区组成)的N297-连接的糖被切除，除了核心GlcNAc(可向其中添加核心岩藻糖))；然后使用本发明的EndoS突变型酶的转糖苷活性将源自糖供体的糖链转移至受体分子的核心GlcNAc上来产生具有N297-连接的糖链的IgG或包含Fc区的分子的方法。
用于糖重构中的IgG或包含Fc区的分子可以是源自由相同的氨基酸序列组成的IgG重链，并且以具有N297-连接的糖链的形式产生的IgG或包含Fc区的分子，并且其生产方法不受限制，但也可以使用通过公知的生产单克隆抗体的方法产生的IgG、该IgG的CLCH或通过其酶促处理获得的Fc片段。此外，可以使用在不同批次中通过不同生产方法获得的样品的混合物作为这样的IgG或Fc片段。
用于制备待用于糖重构中的受体分子的方法可以包括通过用Engase处理上述包含Fc区的IgG或分子来制备受体分子，所述Engase维持用于特异性水解N297连接的糖链的核心壳二糖结构中的GlcNAc之间的1,4-糖苷键的活性。在这种情况下，作为ENGase，可以使用各种酶，包括EndoA、EndoD、EndoE和EndoS，但所述ENGase优选为野生型EndoS。
作为用于糖重构的糖供体，可以采用具有各种糖链结构的分子。但是，为了将重构后的抗体用作抗体药物的目的，优选使用具有人类糖链结构的糖供体，其与人类具有的糖链结构或人类相容的糖链结构类似或相同。这种糖供体的代表性实例可以包括具有通过除去核心GlcNAc并从还原末端噁唑啉化第二GlcNAc而从上述N-连接的糖链的基本结构修饰的结构的分子，并且所述糖供体优选为由图1中所示的结构组成的SG-Oxa。
作为糖重构中的水解反应的反应条件，可以使用通常已知的EndoS方法中的那些条件。反应在缓冲溶液中进行，其适当地可以选自通常的酶促反应中使用的缓冲溶液：诸如柠檬酸盐缓冲溶液(pH3.5-5.5)，乙酸盐缓冲溶液(pH4.5-6.0)，磷酸盐缓冲溶液(pH6.0-7.5)，MOPS-NaOH缓冲溶液(pH6.5-8.0)和Tris-HCl缓冲溶液(pH7.0-9.0)。优选的缓冲溶液是Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.0-9.0)。为了使酶稳定化，可以向反应溶液中添加不抑制酶促反应的添加剂，但其不是必需的。
反应温度可以适当地在10℃至50℃的范围内选择，但是优选的温度是25℃至38℃。
反应时间可以适当地在10分钟至96小时的范围内选择，但是可以通过随时间收集少量的反应溶液并确定水解的进展程度来确定反应的结束。通常，可以通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、全自动电泳系统、液相色谱-质谱(LC-MS)等来监测糖链水解反应的进展程度。在本专利中，将市售抗体或糖重构的抗体片段化为重链和轻链，然后将它们用全自动电泳系统检查，以确认仅添加了N297连接的糖链的重链的保留时间改变。
糖重构中的转糖苷的反应条件可以适当地基于对于其他酶已知的条件进行选择。
反应在缓冲溶液中进行，这样的缓冲液优选为不促进SG-Oxa的降解的缓冲液，并且可以适当地选自磷酸盐缓冲溶液(pH6.0-7.5)，MOPS-NaOH缓冲溶液(pH6.5-8.0)和Tris-HCl缓冲溶液(pH7.0-9.0)。优选的缓冲液是Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.0-9.0)。为了使酶稳定化，可以向反应溶液中添加不抑制酶促反应的添加剂，但其不是必需的。
反应温度可以适当地在10℃至50℃的范围内选择，但是优选的温度是25℃至38℃。
反应时间可以适当地在10分钟至96小时的范围内选择，但是可以通过随时间收集少量的反应溶液并确定转糖苷的进展程度来确定反应的结束。通常，可以通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、全自动电泳系统、液相色谱-质谱仪(LC-MS)等来监测转糖苷反应的进展程度。在本专利中，将市售抗体或糖重构的抗体片段化为重链和轻链，然后它们用全自动电泳系统检查，以确认仅添加了N297连接的糖链的重链的保留时间改变。
实施例
参照以下实施例具体描述本发明。实施例中的描述是本发明的实施方案的实例，并且本发明不限于此。
实施例1是本发明中使用的EndoS突变型酶的制备实施例。实施例2是本发明中使用的糖供体的生产实例。实施例3是用于测量转糖苷活性的受体分子的制备实例。实施例4是通过本发明的EndoS突变型酶的水解百分比的测量实例和通过本发明的EndoS突变型酶的转糖苷百分比的测量实例。
使用超微分光光度计NanoDrop 1000 (由Thermo Fisher Scientific制造的产品)或NanoDrop 2000 (由Thermo Fisher Scientific制造的产品)定量本文所述的蛋白浓度。
通过以下方法确认糖重构的抗体((Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗和SG-曲妥珠单抗)的质量。将糖重构的抗体片段化成重链和轻链，然后用分析柱分离其峰，并通过质谱分析。所用的设备是ACUITY UPLC(由Waters制造的产品)、SYNAPT G2-S (Waters)和BEH苯基柱(1.7 μm, 1.0 × 50 mm)，所用的流动相是含有0.05％三氟乙酸的乙腈，梯度在3分钟内从25％变为35％，并且在80℃下以0.34 μL/min的流速进行分析。
<实施例1> EndoS突变型酶的反应溶液的制备
(1-1) EndoS突变型酶的设计
设计EndoS突变体，其被认为通过向EndoS D233Q中引入突变实现抑制的水解活性，同时维持EndoS D233Q的转糖苷活性。基于EndoS的3D结构信息(PDB ID:4NUY)，将EndoS的催化结构域分为3组位点：预测参与糖链的识别的位点，活性中心的邻近的位点，和预测参与抗体的识别的位点。向所述位点引入突变。选择6个残基H122、Y348、E350、Y402、D405和R406作为预测参与糖链的识别的位点，并且设计酶，使得由上述氨基酸残基形成的相互作用应该被切断或使得在选择的氨基酸中具有大侧链的氨基酸残基应当被具有小侧链的氨基酸残基取代，以便使糖链的偶联和解离的周转有效。选择P184、D279和Q303作为活性中心的邻近的位点，并且设计突变以用各种的氨基酸(包括具有与野生型氨基酸残基类似的性质的那些氨基酸或具有与野生型氨基酸残基不同的性质的那些氨基酸)来取代它们。选择Y282作为预测参与抗体的识别的位点之一，并且设计突变以用碱性氨基酸取代所述氨基酸残基，以加强与抗体的糖链连接的Asn297附近的负电荷的相互作用。在上述3个位点中或考虑3个位点间的组合突变来设计表2中记载的突变型酶。
(1-2) EndoS突变型酶的表达
通过将含有编码基于上述(1-1)设计的每种EndoS突变型酶的氨基酸序列的基因的用于蛋白表达的3μL质粒(pGEX4T3, 50 μg/μL)添加至50μL 107 cfu/μL的冰冷的感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌株并将混合物在37℃下加热40秒来转化大肠杆菌。将这些大肠杆菌细胞在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养过夜，并挑取在第二天获得的菌落，并在37℃下在含有100μg/mL氨苄青霉素的1L TB培养基中振荡培养，直到O.D. 600达到0.8。在O.D. 600增加之后，培养温度降至16℃，并且1小时后加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)至0.1mM的最终浓度以过夜诱导EndoS突变型酶的表达。在第二天，通过将液体培养物以5000 × G离心10分钟来收集细胞，并加入50 mL含有40 U/mL DNA酶I和0.5mg/mL溶菌酶的PBS缓冲液以重悬细胞。通过声波处理获得的细菌悬浮液来破碎细胞，并以20000 × g离心30分钟，以获得可溶性级分中的目标EndoS突变型酶。
(1-3) EndoS突变型酶的纯化
将上述(1-2)中获得的EndoS突变型酶的可溶级分通过具有0.45μm的孔径的PVDF膜过滤，并且过滤后的溶液通过2个步骤（通过谷胱甘肽亲和色谱和凝胶过滤色谱）来纯化。
首先，将过滤通过PVDF膜的EndoS突变型酶的可溶级分的总量各自应用至用PBS平衡的谷胱甘肽sepharose4B柱，并用3个或更多柱体积的PBS缓冲液洗涤柱。随后，用含有10mM还原形式的谷胱甘肽的PBS缓冲液洗脱GST-融合的EndoS突变型酶，并通过超滤(AmiconUltra-15 30K)浓缩。浓缩之后，将浓缩物在用PBS平衡的HiLoad 26/60 Superdex 200 pg柱(GE Healthcare Bioscience)上分离，以除去用于洗脱的谷胱甘肽并获得最终纯化的样品。以该方式制备的EndoS突变型酶的产率显示于表2中。
以2mg/mL制备获得的EndoS突变型酶溶液，并将这些用于测量水解和转糖苷活性。
[表2]
EndoS突变型酶的产率
。
<实施例2> SG-Oxa(图1中结构的化合物)的反应溶液的制备
在以下实施例中用作糖供体的SG-Oxa通过以下方法生产。
将2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓氯化物(CDMBI)(由FUSHIMIPharmaceutical Co., Ltd.制造的产品)(53.7 mg, 245 μmol)的水溶液(520μl)加入二唾液基八糖(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 100 mg, 49.5 μmol)中。在冰上冷却后，向反应溶液中加入磷酸三钾(158 mg, 743 μmol)的水溶液(520μl)，并将混合物在冰上搅拌2小时。用Amicon Ultra (Ultracel 30K，由Merck Millipore制造)超滤获得的反应溶液以除去固体物质。滤液通过凝胶过滤色谱纯化。所用的设备是Purif-Rp2 (由ShokoScientific Co., Ltd.制造的产品)，所用的柱是HiPrep 26/10 Desalting (由GEHealthcare制造的产品)，所用的流动相是0.03% - NH3水溶液，流速为10 ml/min，且级分体积为10 ml。将洗脱期间含有根据UV检测(220nm)的目标产物的级分合并在一起，向合并物中加入0.1N氢氧化钠水溶液(100μl)，并将混合物冷冻干燥以获得目标SG-Oxa作为无色固体(87.0 mg，43.4 μmol，产率88％)。
从获得的化合物的NMR图，其为确认是目标化合物(HELVETICA CHIMICA ACTA,2012, 95, 1928-1936)。
向获得的SG-Oxa (1.19 mg) 50 mM tris缓冲溶液(pH 7.4) (23.8 μl)中加入50mg/ml SG-Oxa溶液(50mM Tris缓冲液pH7.4)。这被用于测量转糖苷活性。
<实施例3> (Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗的制备
待用于转糖苷反应中的待用作受体分子的(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗通过以下方法产生。
将1.18 mg/ml野生型EndoS溶液(PBS)(10μl)添加至11.3mg/ml曲妥珠单抗(由Genentech制造的产品)溶液(50mM Tris缓冲溶液pH8.0)(2ml)，并在30℃下孵育5小时。使用Experion电泳站确认反应的进展。反应结束后，进行通过亲和色谱的纯化和用羟基磷灰石柱的纯化。
(1)用亲和柱纯化
纯化设备：AKTA avant 25 (由GE Healthcare制造的产品)
柱：HiTrap蛋白A HP柱(5 ml) (由GE Healthcare制造的产品)
流速：5 ml/min (在进样时，1ml/min)。
在结合色谱柱时，将如上所述获得的反应溶液加入柱的顶部上，以1 ml/min运行1CV的结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0))，并进一步以5ml/min运行5CV。在中间洗涤时，运行15 CV的洗涤溶液(20mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)，0.5 M氯化钠溶液)。在洗脱时，运行6 CV的洗脱缓冲液(ImmunoPure IgG洗脱缓冲液，由PIERCE制造的产品)。洗脱液立即用1M Tris缓冲液(pH9.0)中和。用超微分光光度计NanoDrop 1000(由Thermo FisherScientific制造的产品)和Experion电泳站(由BIO-RAD制造的产品)检查洗脱期间通过UV检测(280nm)检测的级分。
用Amicon Ultra (Ultracel 30K，由Merck Millipore制造的产品)浓缩含有目标的级分，并且进行缓冲液(5mM磷酸盐缓冲液，50mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)溶液，pH 6.8)交换。
(2)用羟基磷灰石柱纯化
纯化设备：AKTA avant25 (由GE Healthcare制造的产品)
柱：Bio-Scale Mini CHT I型滤筒(5 ml) (由BIO-RAD制造的产品)
流速：5 ml/min (在进样时，1ml/min)。
将上述(1)中获得的溶液加入柱的顶部上，并且运行4CV的溶液A(5mM磷酸盐缓冲液，50mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)，pH 6.8)。然后，使用溶液A和溶液B(5mM磷酸盐缓冲液，50mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)，pH6.8，2M氯化钠溶液)进行洗脱。洗脱条件为溶液A：溶液B =100:0至0:100 (15 CV)。
用超微分光光度计NanoDrop 1000(由Thermo Fisher Scientific制造的产品)和Experion(TM)电泳站(BIO-RAD)检查洗脱期间通过UV检测(280nm)检测的级分。
使用Amicon Ultra(Ultracel 30K，由Merck Millipore制造的产品)浓缩含有目标的级分，并且进行缓冲液交换至50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)以获得9.83 mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗溶液(磷酸盐缓冲溶液，pH 6.0)(1.8ml)。
LC-MS：
计算(Fucα1, 6) GlcNAc-曲妥珠单抗的重链，M = 49497.86，found(m/z)，49497(去卷积数据)。
计算(Fucα1, 6) GlcNAc-曲妥珠单抗的轻链，M = 23439.1，found(m/z)，23439.1(去卷积数据)。
<实施例4> EndoS突变型酶(pH 7.4)的水解和转糖苷活性的测量
(4-1)水解活性的测量
EndoS突变型酶对市售曲妥珠单抗的N297连接的糖链的水解活性如下测量。水解反应的示意图示于图2中。
如下制备待用作水解反应的底物溶液的20mg/ml曲妥珠单抗溶液。将Otsuka蒸馏水(10ml)加入100mM tris缓冲液(pH7.4，由CALBIOCHEM制造的产品)(10ml)中，以制备50mMtris缓冲溶液(pH 7.4)(40ml)。向市售的曲妥珠单抗(440mg/小瓶，由Genentech制造的产品)中加入与其连接的增溶液(20ml)以制备曲妥珠单抗(约21mg/ml)溶液。进行用AmiconUltra (Ultracel 30K，由Merck Millipore制造的产品)超滤曲妥珠单抗(约21mg/ml)溶液(2ml)，以用如上所述制备的50 mM tris缓冲溶液pH7.4替换溶剂，并获得20mg/ml曲妥珠单抗溶液(50mM tris缓冲液，pH7.4)。
向如上所述制备的底物溶液(25μl)中加入实施例1中制备的2.0mg/ml EndoSD233Q溶液(5μl)，并将混合物在30℃下孵育48小时。在反应开始后1、2、4、8、24和48小时，收集该反应溶液的一部分，并使用Experion（TM）电泳站(BIO-RAD)测量反应的进行程度。为了测量，根据附属于设备的方案制备测量样品。在该过程中，将收集的反应溶液暴露于含有二硫苏糖醇的溶液中，并在95℃下加热5分钟，并立即停止水解反应。
将获得的测量样品转移至Experion (TM) Pro260芯片，并根据附属于Experion(TM)电泳站(BIO-RAD)的方案进行测量。从获得的色谱图，将未反应的底物和水解产物确认为分离的峰。从未反应底物和水解产物的峰面积比率，通过下面的计算公式计算水解百分比。
水解百分比(%) = [源自(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗的H链的峰面积]/{[源自市售曲妥珠单抗的H链的峰面积] + [源自(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗的H链的峰面积]}×100
类似地，计算在每个反应时间在实施例1中制备的其他EndoS突变型酶的水解百分比(表3)。
(4-2)转糖苷活性的测量
通过以下方法测量实施例1中产生的EndoS突变型酶的转糖苷活性。实施例2中制备的SG-Oxa和实施例3中制备的(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗分别用作糖供体和受体分子。转糖苷反应的示意图示于图3中。
根据与如(4-1)中所述的底物溶液的制备类似的方法，从实施例3中制备的9.83mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗溶液(磷酸盐缓冲液，pH6.0)制备20 mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗溶液(50mM tris缓冲溶液pH7.4)。向20 mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗溶液(50mM tris缓冲溶液pH7.4)中加入实施例2中制备的50 mg/ml SG-Oxa溶液(50 mM tris缓冲溶液 pH 7.4) (1.07 μl)和实施例1中制备的2.0 mg/ml EndoS D233Q溶液(8 μl)，并将混合物在30℃下孵育48小时。在反应开始后1、2、4、8、24和48小时的时间点，收集该反应溶液的一部分，并使用Experion TM电泳站测量反应的进行程度。为了测量，根据附属于设备的方案制备测量样品。在该过程中，将收集的反应溶液暴露于含有二硫苏糖醇的溶液中，并在95℃下加热5分钟，并立即停止转糖苷反应。
将获得的测量样品转移至Experion (TM) Pro260芯片，并根据附属于Experion(TM)电泳站(BIO-RAD)的方案进行测量。从获得的色谱图，将未反应的底物和转糖苷产物确认为分离的峰。从未反应底物和转糖苷产物的峰面积比率，通过下面的计算公式计算转糖苷百分比。
转糖苷百分比(%) = [源自SG-曲妥珠单抗的H链的峰面积]/{[源自(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗的H链的峰面积] + [源自SG-曲妥珠单抗的H链的峰面积]}×100
类似地，计算在每个反应时间在实施例1中制备的其他EndoS突变型酶的转糖苷百分比(表3)。
通过类似于实施例3中(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠单抗的纯化的方法纯化作为转糖苷产物的SG-曲妥珠单抗。下面显示获得的SG-曲妥珠单抗的LC-MS分析数据。
计算SG-曲妥珠单抗的重链，M = 51500.6 Da；found(m/z)，51501(去卷积数据)。
计算SG-曲妥珠单抗的轻链，M = 23439.1 Da，found(m/z)，23439(去卷积数据)。
[表3]
EndoS突变型酶(pH7.4)的水解百分比和转糖苷百分比随时间的变化
。

Claims (16)

1.一种EndoS突变型酶，其包含SEQ ID NO: 2的氨基酸编号37至995的氨基酸序列且在至少一个选自如下的氨基酸位置具有额外突变：氨基酸122 (H122)、氨基酸184 (P184)、氨基酸279 (D279)、氨基酸282 (Y282)、氨基酸303 (Q303)、氨基酸348 (Y348)、氨基酸350(E350)、氨基酸402 (Y402)、氨基酸405 (D405)和氨基酸406 (R406)，且表现出与EndoSD233Q的活性相比降低的水解活性，所述活性是对IgG中的与位置297的Asn连接的N-连接的糖链(N297-连接的糖链)的活性。
2.根据权利要求1所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变选自如下的1至4个氨基酸位置：H122、P184、D279、Y282、Q303、Y348、E350、Y402、D405和R406。
3.根据权利要求1所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是选自如下的一个氨基酸位置的突变：Q303、E350和D405。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是选自如下的至少一种：
在H122处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Glu、Asp、Leu、Ile、Pro、Met或Phe；
在P184处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Gln或Asn；
在D279处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala或Gln；
在Y282处突变为氨基酸：Arg、Lys或His；
在Q303处突变为氨基酸：Met、Pro或Leu；
在Y348处突变为氨基酸：His或Trp；
在E350处突变为氨基酸：Lys、Arg、His、Tyr、Gln、Asn、Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala；
在Y402处突变为氨基酸：Phe或Trp；
在D405处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro或Ala；且
在R406处突变为氨基酸：Gly、Cys、Thr、Ser、Val、Pro、Ala、Glu、Asp、Gln或Asn。
5.根据权利要求4所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是选自如下的至少一种：
在H122处突变为Ala (H122A)或Phe (H122F)；
在P184处突变为Gln (P184Q)；
在D279处突变为Ser (D279S)或Gln (D279Q)；
在Y282处突变为Arg (Y282R)；
在Q303处突变为Leu (Q303L)；
在Y348处突变为His (Y348H)；
在E350处突变为Ala (E350A)、Asn (E350N)、Asp (E350D)或Gln (E350Q)；
在Y402处突变为Phe (Y402F)或Trp (Y402W)；
在D405处突变为Ala (D405A)；和
在R406处突变为Gln (R406Q)。
6.根据权利要求5所述的EndoS突变型酶，其包含至少一个选自如下的突变作为额外突变：Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q和D405A。
7.根据权利要求6所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q、D405A、
H122A/Q303L、H122F/Q303L、P184Q/Q303L、D279Q/Q303L、D279S/Q303L、Y282R/Q303L、Q303L/Y348H、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/Y402F、Q303L/Y402W、Q303L/D405A、Q303L/R406Q、
H122A/E350A、H122F/E350A、P184Q/E350A、D279Q/E350A、D279S/E350A、Y282R/E350A、Y348H/E350A、E350A/Y402F、E350A/Y402W、E350A/D405A、E350A/R406Q、
H122A/E350N、H122F/E350N、P184Q/E350N、D279Q/E350N、D279S/E350N、Y282R/E350N、Y348H/E350N、E350N/Y402F、E350N/Y402W、E350N/D405A、E350N/R406Q、
H122A/E350D、H122F/E350D、P184Q/E350D、D279Q/E350D、D279S/E350D、Y282R/E350D、Y348H/E350D、E350D/Y402F、E350D/Y402W、E350D/D405A、E350D/R406Q、
H122A/E350Q、H122F/E350Q、P184Q/E350Q、D279Q/E350Q、D279S/E350Q、Y282R/E350Q、E350Q/Y348H、E350Q/Y402F、E350Q/Y402W、E350Q/D405A、E350Q/R406Q、
H122A/D405A、H122F/D405A、P184Q/D405A、D279Q/D405A、D279S/D405A、Y282R/D405A、Y348H/D405A或D405A/R406Q。
8.根据权利要求7所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是
Q303L、E350A、E350N、E350D、E350Q、D405A、Q303L/E350A、Q303L/E350N、Q303L/E350D、Q303L/E350Q、Q303L/D405A、E350A/D405A、E350N/D405A、E350D/D405A或E350Q/D405A。
9.根据权利要求4所述的EndoS突变型酶，其中所述额外突变是H122A、H122F、P184Q、D279Q、D279S、Y282R、Y348H、Y402F、Y402W或R406Q。
10.根据权利要求1所述的EndoS突变型酶，其中在pH 7.4的反应溶液中24小时后，对N297-连接的糖链的所述活性在水解反应中保持50％或更低的水解率。
11.根据权利要求1所述的EndoS突变型酶，其中所述EndoS突变型酶还表现出对N297-连接的糖链的活性，导致在pH 7.4的反应溶液中与5个当量的糖供体的转糖苷反应48小时后约60％或更多的转糖苷百分比。
12.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至11中任一项所述的EndoS突变型酶。
13.一种载体，其包含与根据权利要求12所述的多核苷酸互补的核苷酸。
14.一种宿主细胞，其用根据权利要求13所述的载体转化。
15.一种生产包含糖重构的Fc区的分子的方法，其包括使包含具有核心GlcNAc且任选地添加岩藻糖的IgG的Fc区作为N297-连接的糖链的分子与具有包含噁唑啉化的GlcNAc的结构的糖供体在根据权利要求1至权利要求11中任一项所述的EndoS突变型酶存在的情况下反应，以产生包含具有N297连接的糖链的Fc区域的分子，所述Fc区域具有如下结构：其中糖供体具有的糖链被转移至N297-连接的糖链的核心GlcNAc。
16.根据权利要求15所述的生产方法，其中包含Fc区的分子是IgG单克隆抗体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114026229A (zh) * 2019-08-05 2022-02-08 醣基生医股份有限公司 用于重塑抗体醣型之融合蛋白

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018532990A (ja) 2015-09-04 2018-11-08 オービーアイ ファーマ，インコーポレイテッド グリカンアレイおよび使用の方法
TWI780045B (zh) 2016-03-29 2022-10-11 台灣浩鼎生技股份有限公司 抗體、醫藥組合物及方法
US10980894B2 (en) 2016-03-29 2021-04-20 Obi Pharma, Inc. Antibodies, pharmaceutical compositions and methods
CN109379889A (zh) 2016-04-22 2019-02-22 台湾浩鼎生技股份有限公司 通过经由globo系列抗原的免疫激活或免疫调节的癌症免疫疗法
EP4159749A3 (en) 2016-07-01 2023-06-14 Daiichi Sankyo Company, Limited A method for producing fc-containing molecule with remodeled sugar chain
CN110062767B (zh) 2016-07-29 2023-07-11 台湾浩鼎生技股份有限公司 人抗体、药物组合物和方法
US11208442B2 (en) 2016-12-02 2021-12-28 Daiichi Sankyo Company, Limited Endo-beta-N-acetylglucosaminidase
CN116999573A (zh) 2017-09-29 2023-11-07 第一三共株式会社 抗体－药物偶联物及其制造方法、药物组合物及其在制备治疗肿瘤的药物中的应用
WO2020006176A1 (en) * 2018-06-27 2020-01-02 Obi Pharma, Inc. Glycosynthase variants for glycoprotein engineering and methods of use
AU2019379418A1 (en) 2018-11-14 2021-06-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-CDH6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
KR20210143237A (ko) 2019-03-25 2021-11-26 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 컨쥬게이트
US20220177601A1 (en) 2019-03-25 2022-06-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
CA3139180A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate and parp inhibitor
JPWO2021140981A1 (zh) 2020-01-10 2021-07-15
WO2021254479A1 (zh) * 2020-06-18 2021-12-23 上海宝济药业有限公司 一种免疫球蛋白降解酶IdeE的突变体
JPWO2022050300A1 (zh) 2020-09-02 2022-03-10
WO2022211075A1 (ja) * 2021-03-31 2022-10-06 日本マイクロバイオファーマ株式会社 抗体薬物複合体の製造方法及びそれに用いる酵素

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104220603A (zh) * 2012-02-10 2014-12-17 马里兰大学，巴尔的摩 抗体及其Fc片段的化学酶法糖基化工程

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009033670A2 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Genovis Ab Method and kits for dissociating fcgamma-receptor-igg complexes and for igg purification and detection
WO2013012066A1 (ja) * 2011-07-21 2013-01-24 京セラ株式会社 照明装置、イメージセンサヘッドおよびこれを備える読取装置
GB201201314D0 (en) * 2012-01-26 2012-03-07 Isis Innovation Composition

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104220603A (zh) * 2012-02-10 2014-12-17 马里兰大学，巴尔的摩 抗体及其Fc片段的化学酶法糖基化工程
JP2015507925A (ja) * 2012-02-10 2015-03-16 ユニバーシティー オブ メリーランド，ボルティモア 抗体及びそのＦｃフラグメントの酵素化学的糖鎖改変

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114026229A (zh) * 2019-08-05 2022-02-08 醣基生医股份有限公司 用于重塑抗体醣型之融合蛋白

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