WO2022138718A1 - イムノグロブリン結合ポリペプチド - Google Patents

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WO2022138718A1
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amino acid
acid sequence
immunoglobulin
polypeptide
seq
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PCT/JP2021/047570
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英司 真島
厚志 島
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プロテノバ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide that binds to a polypeptide containing immunoglobulin or its Fc region. More specifically, the present invention has a binding activity to an immunoglobulin or a polypeptide containing an Fc region thereof, is excellent in stability under alkaline conditions (alkali stability), and is an immunoglobulin or a once bound immunoglobulin or It relates to a polypeptide capable of efficiently eluting the fragment in a weakly acidic region. Further, the present invention relates to a method for producing the polypeptide, a immobilized product of the polypeptide, a method for separating an immunoglobulin or a fragment thereof using the polypeptide, and the like.
  • immunoglobulins also called antibodies
  • advances in gene recombination technology have established techniques for producing human antibodies and humanized antibodies, and immunoglobulins have come to be put into practical use as antibody drugs in the medical field such as rheumatism and cancer.
  • Immunoglobulin is mainly produced by animal cell culture, and affinity chromatography using a ligand having an immunoglobulin binding ability is widely used for its purification.
  • affinity chromatography used for purification of immunoglobulin polypeptides such as protein A, protein L, and protein G, or immunoglobulin binding domains thereof are used as ligands that specifically bind to immunoglobulin.
  • Patent Document 1 may be provided with excellent immunoglobulin binding ability and alkali stability by substituting a specific amino acid in the C domain of protein A or a specific amino acid residue in the Z domain of protein A. Has been reported. Further, Patent Document 2 reports that alkali stability can be provided by substituting the asparagine residue of protein A with another amino acid.
  • An object of the present invention is to modify the amino acid sequence of the immunoglobulin binding domain of protein A so that the immunoglobulin having excellent alkali stability and the polypeptide containing the Fc region thereof once bound can be eluted in a weakly acidic region. Is to provide the peptide.
  • the present inventor replaced serine at position 41 with an amino acid having a hydrophobic side chain, tyrosine or histidine in each immunoglobulin binding domain of protein A. , It has a binding activity to a polypeptide containing an immunoglobulin or its Fc region, has excellent alkali stability, and is efficient for a polypeptide containing an immunoglobulin or its Fc region once bound under mildly acidic mild conditions. It has been found that a polypeptide that can be eluted in the above can be obtained.
  • glutamine at the 9th position is replaced with an amino acid or histidine having a hydrophobic aliphatic side chain, or glutamic acid at the 15th position is alanine or histidine and glutamic acid or alanine at the 24th position is glutamine. It has been found that by substituting with, the alkali stability and the elution property in the weakly acidic region can be further improved. The present invention has been completed by further studies based on such findings.
  • Item 1 A polypeptide containing at least one immunoglobulin binding domain shown in any of the following (A) to (C).
  • A) In the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 15, an immunoglobulin binding domain containing an amino acid sequence in which a modification satisfying the following conditions (i) to (iv) is introduced: (i) Serine at position 41 is replaced with an amino acid, tyrosine, or histidine having a hydrophobic side chain. (ii) Glutamine at position 9 is substituted with an amino acid or histidine that is not substituted or has a hydrophobic aliphatic side chain.
  • Glutamic acid or glutamine at position 15 is substituted or substituted with alanine, histidine, tyrosine or leucine.
  • Glutamic acid or alanine at position 24 is unsubstituted, replaced with glutamine, histidine or alanine in the case of SEQ ID NOs: 1 to 12, or replaced with glutamine or histidine in the case of SEQ ID NOs: 13 to 15.
  • B In the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 15, a modification satisfying the above conditions (i) to (iv) has been introduced, and one or the number of amino acids at the site where the modification has not been made.
  • Highly immunoglobulin binding domain. (C) In the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 15, the modification satisfying the conditions (i) to (iv) is introduced, and the modification is made to the corresponding unmodified amino acid sequence. Immunoglobulin binding with 80% or more sequence identity at the absence site, equivalent or better alkali stability compared to a polypeptide consisting of the corresponding unmodified amino acid sequence, and higher IgG elution capacity in the weakly acidic region. domain.
  • Item 2. The polypeptide according to Item 1, which is a monodomain-type peptide containing one immunoglobulin-binding domain selected from the immunoglobulin-binding domains shown in (A) to (C).
  • Item 3. Item 2. The polypeptide according to Item 1, which is a multidomain type peptide in which two or more immunoglobulin binding domains selected from the immunoglobulin binding domains shown in (A) to (C) are linked.
  • Item 4. Item 6. The polypeptide according to any one of Items 1 to 3, wherein in the amino acid sequence, glutamine at position 9 is replaced with an amino acid having a hydrophobic aliphatic side chain or histidine.
  • glutamic acid or glutamine at position 15 is replaced with alanine or histidine
  • glutamic acid at position 24 is glutamine in the case of SEQ ID NOs: 1 to 12, or alanine at position 24 in the case of SEQ ID NOs: 13 to 15.
  • Item 6. The polypeptide according to any one of Items 1 to 4, which is substituted with glutamine.
  • Item 6. The polypeptide according to any one of Items 1 to 5, wherein in the amino acid sequence, serine at position 41 is replaced with alanine, valine, leucine, phenylalanine, tyrosine, or histidine.
  • Item 7. Item 6.
  • Item 8. A DNA encoding the polypeptide according to any one of Items 1 to 7.
  • Item 9. Item 8.
  • Item 10. A transformant obtained by transforming a host with the recombinant vector according to Item 9.
  • a carrier for immunoglobulin binding wherein the polypeptide according to any one of Items 1 to 7 is immobilized on an insoluble carrier.
  • Item 13. Item 12. A method for separating an immunoglobulin or a fragment thereof, which separates a polypeptide containing an immunoglobulin or an Fc region thereof using the carrier for binding an immunoglobulin according to Item 12.
  • Item 14. Item 13. An item 13 in which a polypeptide containing an immunoglobulin or an Fc region thereof is once bound to the carrier for binding an immunoglobulin, and then the polypeptide containing the immunoglobulin or an Fc region thereof is eluted under the conditions of pH 3 to 5. Separation method.
  • the polypeptide of the present invention has an ability to bind to a polypeptide containing an immunoglobulin or its Fc region, and can maintain its ability to bind to a polypeptide containing an immunoglobulin or its Fc region even when exposed to alkaline conditions. Therefore, even if elution and washing with an alkaline solution are repeated, the decrease in the binding ability to the immunoglobulin or the polypeptide containing the Fc region thereof can be suppressed.
  • the polypeptide of the present invention contains an immunoglobulin or its Fc region to be separated because the once bound immunoglobulin or a fragment thereof can be efficiently eluted under mild conditions of weak acidity (pH about 3 to 5). Degeneration of polypeptides can be suppressed.
  • glycine G
  • alanine A
  • valine Val
  • Leu L
  • isoleucine I
  • Phe phenylalanine
  • Tyr tyrosine
  • Trp Tryptophan
  • Serin Serin
  • Seronin Thr
  • Cystein Cystein
  • Met Methionin
  • Met Methionin
  • Glutamic acid Glu
  • Aspartic acid Aspartic acid (Asn) is N
  • glutamine Gln
  • lysine Lys
  • arginine Arg
  • Histidine Histidine
  • Pro proline
  • expressions such as “Q9V” and “Q9V / S41V” are notations for amino acid substitutions.
  • “Q9V” means that glutamine at the 9-position from the N-terminal side in a specific amino acid sequence is replaced with valine.
  • “Q9V / S41V” means that glutamine at the 9th position from the N-terminal side in a specific amino acid sequence is replaced with valine, and serine at the 41st position from the N-terminal side is replaced with valine.
  • amino acid having a hydrophobic side chain includes alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, and tryptophan.
  • amino acid having a hydrophobic aliphatic side chain includes alanine, valine, leucine, isoleucine, and methionine.
  • polypeptide of the present invention includes a polypeptide containing at least one immunoglobulin binding domain shown in (A) below.
  • A In the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 15, an immunoglobulin binding domain containing an amino acid sequence in which a modification satisfying the following conditions (i) to (iv) is introduced:
  • Serine at position 41 is replaced with an amino acid having a hydrophobic side chain, tyrosine, or histidine.
  • Glutamine at position 9 is substituted with an amino acid or histidine that is not substituted or has a hydrophobic aliphatic side chain.
  • Glutamic acid or glutamine at position 15 is substituted or substituted with alanine, histidine, tyrosine or leucine.
  • Glutamic acid or alanine at position 24 is unsubstituted, replaced with glutamine, histidine or alanine in the case of SEQ ID NOs: 1 to 12, or replaced with glutamine or histidine in the case of SEQ ID NOs: 13 to 15.
  • Each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is the amino acid sequence of the wild-type immunoglobulin binding domain (A, B, C, D, E) of protein A derived from Staphylococcus aureus and its variants. Is.
  • SEQ ID NO: 1 is a wild-type C domain
  • SEQ ID NOs: 2 and 3 are variants of C domain
  • SEQ ID NO: 4 is a wild-type A domain
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 are variants of A domain
  • Is a wild type B domain SEQ ID NOs: 8 and 9 are variants of the B domain
  • SEQ ID NO: 10 is a wild type D domain
  • SEQ ID NOs: 11 and 12 are variants of the D domain
  • SEQ ID NO: 13 is a wild type E domain
  • SEQ ID NO: 14 and 15 are variants of the E domain.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence of the wild type C domain (SEQ ID NO: 1), lysine at position 4 is replaced with alanine, lysine at position 7 is replaced with threonine, and lysine at position 35 is replaced with arginine. It is an amino acid sequence in which valine at position 40 is replaced with lysine, glutamic acid at position 43 is replaced with lysine, alanine at position 46 is replaced with lysine, and asparagic acid at position 53 is replaced with lysine.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the amino acid sequence of the wild type C domain (SEQ ID NO: 1), lysine at position 4 is replaced with alanine, lysine at position 7 is replaced with threonine, and lysine at position 35 is replaced with arginine.
  • the amino acid sequence is such that the lysine at position 42 is replaced with alanine, the lysine at position 49 is replaced with arginine, the lysine at position 50 is replaced with arginine, and the lysine at position 58 is replaced with arginine.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the amino acid sequence of the wild type A domain (SEQ ID NO: 4), asparagine at position 4 is replaced with alanine, lysine at position 7 is replaced with threonine, and lysine at position 35 is replaced with arginine. It is an amino acid sequence in which glutamine at position 40 is replaced with lysine, alanine at position 43 is replaced with lysine, serine at position 46 is replaced with lysine, and glutamine at position 53 is replaced with lysine.
  • sequences after the 40th position are lysine-rich due to the introduction of lysine at the 40th, 43rd, 46th, and 53rd positions, which facilitates immobilization on the carrier. ing.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the amino acid sequence of the wild type A domain (SEQ ID NO: 4), asparagine at position 4 is replaced with alanine, lysine at position 7 is replaced with threonine, and lysine at position 35 is replaced with arginine.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the amino acid sequence of the wild type B domain (SEQ ID NO: 7), lysine at position 4 is replaced with alanine, lysine at position 7 is replaced with threonine, and lysine at position 35 is replaced with arginine. It is an amino acid sequence in which glutamine at position 40 is replaced with lysine, asparagine at position 43 is replaced with lysine, alanine at position 46 is replaced with lysine, and asparagic acid at position 53 is replaced with lysine.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the amino acid sequence of the wild type B domain (SEQ ID NO: 7), lysine at position 4 is replaced with alanine, lysine at position 7 is replaced with threonine, and lysine at position 35 is replaced with arginine. It is an amino acid sequence in which the lysine at position 49 is replaced with arginine, the lysine at position 50 is replaced with arginine, and the lysine at position 58 is replaced with arginine.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the amino acid sequence of the wild type D domain (SEQ ID NO: 10), asparagine at position 4 is replaced with alanine, lysine at position 7 is replaced with threonine, and lysine at position 35 is replaced with arginine. It is an amino acid sequence in which glutamine at position 40 is replaced with lysine, alanine at position 43 is replaced with lysine, glycine at position 46 is replaced with lysine, and glutamine at position 53 is replaced with lysine.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 asparagine at position 4 is replaced with alanine, lysine at position 7 is replaced with threonine, and lysine at position 35 is replaced with arginine in the amino acid sequence of the wild type D domain (SEQ ID NO: 10). It is an amino acid sequence in which threonine at position 42 is replaced with alanine, lysine at position 49 is replaced with arginine, lysine at position 50 is replaced with arginine, and lysine at position 58 is replaced with arginine.
  • glutamine at position 4 is replaced with alanine
  • glutamine at position 7 is replaced with threonine
  • lysine at position 35 is replaced with arginine in the amino acid sequence of the wild-type E domain (SEQ ID NO: 13).
  • glutamine at position 40 is replaced with lysine
  • aspartic acid at position 43 is replaced with lysine
  • glycine at position 46 is replaced with lysine
  • aspartic acid at position 53 is replaced with lysine.
  • glutamine at position 4 is replaced with alanine
  • glutamine at position 7 is replaced with threonine
  • lysine at position 35 is replaced with arginine in the amino acid sequence of the wild-type E domain (SEQ ID NO: 13). It is an amino acid sequence in which glutamine at position 49 is replaced with arginine, lysine at position 50 is replaced with arginine, and lysine at position 58 is replaced with arginine.
  • the immunoglobulin binding domain of protein A has three ⁇ -helices, a first ⁇ -helix, a second ⁇ -helix, and a third ⁇ -helix, from the N-terminal side.
  • Serine at position 41 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is conserved in all immunoglobulin-binding domains (A to E), and is the third ⁇ -helix of the three ⁇ -helices of the immunoglobulin-binding domain. It exists in the helix, forms a connection with the second ⁇ -helix, and interacts with the first ⁇ -helix.
  • this serine at position 41 By substituting this serine at position 41 with an amino acid having a hydrophobic side chain, tyrosine, or histidine, the hydrophobic interaction between amino acids in the immunoglobulin binding domain can be enhanced and the alkali stability can be improved. ..
  • the 41-position serine is located behind the ⁇ -helix structure of the 9-position glutamine, the 10-position glutamine, and the 11-position asparagine that form the immunoglobulin binding site in the 1st ⁇ -helix, and the 41-position serine is used. Substitution with amino acids having hydrophobic side chains, tyrosine or histidine is thought to affect the IgG binding structure they form.
  • amino acid in which serine at position 41 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is substituted may be substituted with an amino acid having a hydrophobic side chain, tyrosine, or histidine, preferably alanine, valine, and the like.
  • amino acid having a hydrophobic side chain, tyrosine, or histidine preferably alanine, valine, and the like. Examples include leucine, phenylalanine, tyrosine, or histidine.
  • Glutamine at position 9 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is one of the IgG binding sites and contributes to binding to IgG by forming a hydrogen bond with serine at position 254 of IgG.
  • the glutamine at position 9 in each of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 may be unsubstituted or substituted with an amino acid having a hydrophobic aliphatic side chain or histidine.
  • glutamine at position 9 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is replaced with an amino acid having a hydrophobic aliphatic side chain or histidine, the alkali stability is further improved and the weakly acidic region is used. Elution can be enhanced.
  • each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 the amino acids at positions 41 and 9 are spatially close to each other, so that each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is located.
  • the amino acid having a hydrophobic aliphatic side chain or histidine at the 9th position in the above, the amino acid having a hydrophobic side chain, tyrosine, or histidine existing at the 41st position and the hydrophobic fat existing at the 9th position
  • the binding activity in the weakly acidic region can be reduced by reducing the interconnection with IgG while further improving the alkali stability by interacting with an amino acid having a group side chain or histidine.
  • amino acid in which the 9-position glutamine in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is substituted examples include alanine, valine, leucine, isoleucine, or histidine, and more preferably alanine, valine, leucine, or histidine. Be done.
  • Glutamic acid or glutamine at position 15 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 may be unsubstituted and alanine.
  • Histidine, tyrosine or leucine may be substituted.
  • the glutamic acid at position 24 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 may be unsubstituted or substituted with glutamine, histidine or alanine.
  • the alanine at position 24 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 13 to 15 may be unsubstituted or substituted with glutamine or histidine.
  • immunoglobulin binding domain of (A) those having the amino acid sequences shown in the following (1) to (5) can be mentioned.
  • (1) In each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15, an amino acid sequence in which the 9th, 15th and 24th positions are unsubstituted and the 41st position is substituted with valine, phenylalanine, tyrosine or histidine.
  • positions 15 and 24 are unsubstituted, position 9 is substituted with leucine, and position 41 is valine, leucine, phenylalanine, alanine, tyrosine, or histidine. Amino acid sequence substituted with.
  • positions 15 and 24 are unsubstituted, position 9 is replaced with alanine, and position 41 is replaced with phenylalanine, valine, tyrosine, or histidine.
  • Amino acid sequence (6) In each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15, amino acids in which positions 15 and 24 are unsubstituted, position 9 is substituted with isoleucine, and serine at position 41 is substituted with valine or alanine. arrangement.
  • a polypeptide containing at least one immunoglobulin binding domain corresponding to any one of the following (B) and (C) can be mentioned.
  • the immunoglobulin-binding domains of (B) and (C) are variants of the immunoglobulin-binding domain of (A), and are at positions 9, 15, 24, and in the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 15.
  • the mode of amino acid substitution introduced at position 41, the preferred amino acid substitution site, and the like are the same as in the case of the immunoglobulin binding domain of (A) above.
  • the "amino acid at the site where the modification has not been made” means that the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 are modified by satisfying the conditions of (i) to (iv).
  • the positions other than the 41st and 9th positions are not used.
  • Amino acids correspond to "amino acids at the site where the modification has not been made".
  • the 41st, 15th and 24th positions are substituted with amino acids, and the 9th position is not amino acid substituted, the 41st, 15th and 24th positions are substituted.
  • Amino acids other than the position correspond to "amino acids at the site where the modification has not been made".
  • the modification of the amino acid introduced in the immunoglobulin binding domain of (B) may include only one modification (eg, substitution) from substitutions, additions, insertions, and deletions. It may include more than a species of modification (eg, substitution and insertion).
  • the number of amino acids to be modified may be one, a plurality or several, for example, 1 to 13, preferably 1 to 6, 1 to 5, 1 to 1. 4 pieces, 1 to 3 pieces, 1 or 2 pieces, or 1 piece may be mentioned.
  • the "corresponding unmodified amino acid sequence” refers to the base amino acid sequence, for example, if it is a modification of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. , Refers to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • sequence identity of the unmodified site means an amino acid other than the amino acid substituted by the modification satisfying the conditions of (i) to (iv). Refers to the sequence identity calculated by comparing the amino acid sequences extracted from.
  • amino acids other than the 41st position are used.
  • sequence identity calculated by comparing the amino acid sequences (amino acid sequences excluding the 41st position) extracted from the above corresponds to "sequence identity of the site not modified". Further, for example, when the 41st and 9th positions are amino acid substituted and the 15th and 24th positions are not amino acid substituted by the modification satisfying the conditions (i) to (iv), the positions other than the 41st and 9th positions are not substituted.
  • sequence identity calculated by comparing the amino acid sequences obtained by extracting the amino acids corresponds to "the sequence identity of the unmodified site". Further, for example, by modifying the conditions of (i) to (iv) above, the 41st, 15th and 24th positions are substituted with amino acids, and the 9th position is not amino acid substituted, the 41st, 15th and 24th positions are substituted.
  • sequence identity calculated by comparing the amino acid sequences (amino acid sequences excluding the 41st, 15th, and 24th positions) extracted from amino acids other than the above corresponds to "sequence identity of the unmodified site". do.
  • sequence identity means BLAST PACKAGE [sgi32 bit edition, Version 2.0.12; available from National Center for Biotechnology Information (NCB)).
  • NCB National Center for Biotechnology Information
  • the sequence identity may be 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • the immunoglobulin binding domain of (B) and (C) at least the asparagine at the 3-position in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 is replaced with alanine, valine, or aspartic acid. Things can be mentioned. Further, as one embodiment of the immunoglobulin binding domain of (B) and (C), at least alanine at the 3-position in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 13 to 15 is replaced with valine or aspartic acid. Be done.
  • At least alanine, glutamine, asparagine, or lysine at the 4-position in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is valine, histidine, arginine. , Or those substituted with isoleucine.
  • immunoglobulin binding domain of (B) and (C) at least asparagine at position 6 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 is replaced with alanine, valine, glutamine, or aspartic acid. There is something that is. Further, as one embodiment of the immunoglobulin binding domain of (B) and (C), at least aspartic acid at position 6 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 13 to 15 is replaced with alanine, glutamine, or valine. Can be mentioned.
  • At least threonine or lysine at position 7 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12, 14 and 15 is glutamic acid, histidine, arginine, and the like. Alternatively, those substituted with valine can be mentioned. Further, as one embodiment of the immunoglobulin binding domain of (B) and (C), at least glutamic acid at position 7 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 is replaced with histidine, arginine, or valine. ..
  • At least asparagine or serine at position 11 in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 is alanine, valine, histidine, glutamine, or arginine. The one replaced with is mentioned.
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 15 are modified to satisfy the conditions of (i) to (iv). In addition, at least those having the following amino acid substitutions can be mentioned.
  • the 11th position is replaced with alanine, glutamine, histidine or arginine.
  • the 7-position is replaced with glutamic acid (in the case of SEQ ID NO: 13, the 7-position is not substituted).
  • the 4-position is replaced with isoleucine, the 7-position is replaced with arginine or glutamic acid in the case of SEQ ID NOs: 1 to 12, 14 and 15, or the 7-position is substituted or replaced with arginine in the case of SEQ ID NO: 13. 11th place is replaced with alanine.
  • the 4-position is replaced with isoleucine or valine, and in the case of SEQ ID NOs: 1 to 12, 14 and 15, the 7-position is replaced with glutamic acid (in the case of SEQ ID NO: 13, the 7-position is not substituted).
  • 3-position is replaced with aspartic acid, 6-position is replaced with asparagic acid in the case of SEQ ID NOs: 1 to 12, 6-position is not substituted in the case of SEQ ID NOs: 13 to 15, SEQ ID NOs: 1-12, 14 and In the case of 15, the 7-position is replaced with valine or glutamic acid, or in the case of SEQ ID NO: 13, the 7-position is unsubstituted or replaced with valine, and the 11-position is replaced with alanine.
  • the lysine substituted at the 40th, 43rd, 46th, 49th, 50th, 53rd, and 58th positions plays a role of facilitating immobilization on the carrier (B).
  • C as a preferred embodiment of the immunoglobulin binding domain, 4 or more lysines, preferably 6 of the 40, 43, 46, 49, 50, 53, and 58 positions. More than one lysine, more preferably all lysines, may not be mutated (substituted and / or deleted).
  • the alkali stability is equal to or higher than that of the polypeptide, and the IgG elution ability is high in the weakly acidic region.
  • Means that there is a binding activity to IgG, and the residual activity after alkali treatment measured under the following measurement condition 1 is the corresponding unmodified amino acid sequence measured under the same conditions (base SEQ ID NOs: 1 to 15).
  • the elution rate in weak acidity measured under the following measurement condition 2 is equal to or higher than the residual activity of the polypeptide consisting of any of the amino acid sequences) after alkali treatment, and the corresponding unmodified unmodified one measured under the same conditions. It means that it is higher than the dissolution rate in weak acidity when a polypeptide consisting of an amino acid sequence is used.
  • the residual activity after alkali treatment measured under the following measurement condition 1 is 1.1 compared to the residual activity after alkali treatment of the polypeptide consisting of the corresponding unmodified amino acid sequence measured under the same conditions.
  • the elution rate in weak acidity which is more than doubled and is measured under the following measurement condition 2, is the elution rate in weak acidity when a polypeptide consisting of the corresponding unmodified amino acid sequence measured under the same conditions is used.
  • the alkali stability is equal to or higher than that of the polypeptide consisting of the corresponding unmodified amino acid sequence, and the IgG elution ability is high in the weakly acidic region.
  • I can say.
  • the immunoglobulin binding domain of (B) and (C) the residual activity after alkali treatment measured under the following measurement condition 1 is after alkali treatment of the polypeptide consisting of the corresponding unmodified amino acid sequence measured under the same conditions.
  • immunoglobulin binding domain of (B) and (C) a polypeptide consisting of the corresponding unmodified amino acid sequence whose elution rate in weak acidity measured under the following measurement condition 2 was measured under the same conditions was used. It is preferably 1.3 times or more, more preferably 1.3 to 1.52 times, and more preferably 1.4 to 1.55 times, as compared with the elution rate in weak acidity. More preferred.
  • ⁇ Measurement condition 1 (measurement of residual activity after alkaline treatment)>
  • the polypeptide immobilized on the agarose gel carrier is washed 3 times with a 0.1 M NaOH aqueous solution, replaced with the same alkaline solution, and then kept warm at 25 ° C. for 68 hours (alkaline treatment). Then, after washing with PBS, the amount of human IgG bound (mg / ml gel) is measured. Even when not treated with alkali, the amount of human IgG bound to the polypeptide immobilized on the agarose gel carrier (mg / ml gel) is measured.
  • the ratio of the binding amount of human IgG of the polypeptide after the alkali treatment is calculated as "residual activity (%) after the alkali treatment", assuming that the binding amount of human IgG of the polypeptide without alkali treatment is 100%.
  • ⁇ Measurement condition 2 (measurement of elution rate in weak acidity)> Human IgG is bound to the polypeptide immobilized on the agarose gel carrier. The immobilized polypeptide is then washed with PBS and then eluting human IgG bound to the immobilized polypeptide using 0.1 M citrate buffer (pH 4.0). Subsequently, 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 2.8) is used to elute the remaining human IgG bound to the immobilized polypeptide. The amount of human IgG eluted at pH 4.0 and the amount of human IgG eluted at pH 2.8 are measured.
  • the total amount of human IgG eluted at pH 4.0 and the amount of human IgG eluted at pH 2.8 is 100%, and the ratio of the amount of human IgG eluted at pH 4.0 is the elution rate (%) in weak acidity. calculate.
  • the polypeptide of the present invention may be a single domain type polypeptide having one immunoglobulin-binding domain, or may be a multi-domain type polypeptide in which two or more immunoglobulin-binding domains are linked.
  • the polypeptide of the present invention is a multi-domain type polypeptide, there is an advantage that the binding ability of the immunoglobulin or the Fc region-containing polypeptide thereof is increased.
  • polypeptide of the present invention is a monodomain type polypeptide, it is sufficient that one of the immunoglobulin binding domains (A) to (C) is contained.
  • the immunoglobulin binding domain containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11 and 14 as a base (hereinafter referred to as "lysine rich domain"). Since there is also a carrier-binding property, when the immunoglobulin-binding domain is used as a monodomain-type polypeptide, it is not necessary to add an amino acid sequence having a carrier-binding property. In order to further improve the binding property to the carrier, an amino acid sequence having the binding property to the carrier may be added.
  • the immunoglobulin binding domains of (A) to (C) the immunoglobulin binding containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, and 15 as a base.
  • a domain hereinafter, also referred to as "lysine non-rich domain”
  • an amino acid sequence having binding property to the carrier is added in order to impart binding property to the carrier. It is preferable that it is.
  • the polypeptide of the present invention is a multidomain type polypeptide, it suffices to contain at least one domain among the immunoglobulin binding domains of (A) to (C), and (A) to ((A) to ( It may consist of two or more domains within the immunoglobulin binding domain of C)), and one or more of the immunoglobulin binding domains of (A) to (C) and protein A. It may contain one or more of each immunoglobulin binding domain constituting the protein L and each immunoglobulin binding domain constituting the protein L.
  • the polypeptide of the present invention is a multi-domain type polypeptide
  • all of the constituent immunoglobulin-binding domains are (A) from the viewpoint of providing even better alkali stability and antibody elution characteristics in a weakly acidic region. )-(C), preferably composed of any of the immunoglobulin binding domains.
  • the total number of linked immunoglobulin-binding domains may be 2 or more, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 6. Individuals can be mentioned.
  • each of the constituent immunoglobulin-binding domains may have its C-terminal and N-terminal directly linked, and each immunoglobulin-binding domain has one interval. It may be linked via ⁇ 40, preferably 1-10 amino acid residues.
  • polypeptide of the present invention is made into a multi-domain type polypeptide, a structure in which one or more lysine-free domains and one or more lysine-rich domains are linked; more preferably, lysine-non-rich.
  • an amino acid sequence having the binding property to the carrier is added in order to impart the binding property to the carrier. Is preferable.
  • amino acid sequence of the "amino acid sequence having binding property to the carrier” examples include an amino acid sequence in which 1 to 15, preferably 3 to 10, and more preferably 4 to 8 lysines are linked. This linkage sequence may contain amino acids other than lysine in addition to lysine.
  • an amino acid sequence having a binding property to a carrier it may be added to either the N-terminal side or the C-terminal side, but it is preferably the C-terminal.
  • a polypeptide having other functions, a peptide tag, etc. are added to the N-terminal side or the C-terminal side in order to improve the expression of the polypeptide, impart the ease of purification, and the like. You may.
  • the number of amino acids added to the N-terminal side and / or the C-terminal side of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 1 to 400, preferably 1 to 100, and further. The number is preferably 1 to 30.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention is, for example, DNA encoding protein A derived from Staphylococcus aureus. Can be obtained by obtaining a DNA encoding a target immunoglobulin binding domain by PCR or the like and introducing a mutation into the DNA so that a desired amino acid substitution or the like is introduced into the DNA. Further, the DNA of the present invention can also be artificially synthesized by a gene synthesis method.
  • the DNA encoding the wild-type protein A derived from Staphylococcus aureus is known as, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 16, and is obtained from Staphylococcus aureus by a conventional method using PCR. Can be isolated.
  • the DNA encoding wild-type protein A can also be artificially synthesized by a gene synthesis method.
  • a method for introducing a specific mutation into a specific site of a base sequence is known, and for example, a site-specific mutation introduction method for DNA can be used.
  • a site-specific mutation introduction method for DNA can be used as a specific method for converting a base in DNA.
  • a commercially available kit can be used as a specific method for converting a base in DNA.
  • the base sequence of DNA in which a mutation has been introduced into the base sequence can be confirmed using a DNA sequencer. Once the base sequence is determined, the DNA encoding the polypeptide is obtained by chemical synthesis, PCR using a cloned probe as a template, or hybridization using a DNA fragment having the base sequence as a probe. be able to.
  • a mutant type of DNA encoding the peptide having the same function as before the mutation by a site-specific mutagenesis method or the like.
  • Introducing a mutation into the DNA encoding the peptide can be carried out by a known method such as the Kunkel method, the Gapped doublex method, or the megaprimer PCR method.
  • the DNA of the present invention is preferably one in which the frequency of codon utilization is optimized for the host.
  • DNA whose codon utilization frequency is optimized for Escherichia coli is suitable.
  • Recombinant vector A recombinant vector containing DNA encoding the polypeptide of the present invention (hereinafter, also referred to as “recombinant vector of the present invention”) can be obtained by inserting the DNA of the present invention into an expression vector. be able to.
  • the recombinant vector of the present invention contains a regulatory factor such as a promoter operably linked to the DNA of the present invention.
  • a regulatory factor such as a promoter is typically mentioned, but if necessary, a transcription element such as an enhancer, a CCAAT box, a TATA box, or an SPI site may be included.
  • operably linked means that the DNA of the present invention is linked to various regulatory factors such as promoters and enhancers that regulate the DNA of the present invention in a state in which they can act in the host cell.
  • the expression vector a vector constructed from phages, plasmids, or viruses that can grow autonomously in the host for gene recombination is suitable.
  • Such expression vectors are known, and for example, commercially available expression vectors include pQE-based vector (Qiagen Co., Ltd.), pDR540, pRIT2T (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), and pET-based vector (Merck). Co., Ltd.) and the like.
  • the expression vector may be used by selecting an appropriate combination with the host cell.
  • Escherichia coli when Escherichia coli is used as the host cell, a combination of a pET system vector and a BL21 (DE3) Escherichia coli strain, or a pDR540 vector and JM109 Escherichia coli. A combination of strains and the like is preferable.
  • Transformant of the present invention can be obtained by transforming a host with the recombinant vector of the present invention.
  • the host used for producing the transformant is not particularly limited as long as the recombinant vector is stable, autonomously proliferative, and can express the trait of an exogenous gene, and is not particularly limited.
  • Escherichia coli and the like Bacteria belonging to the genus Escherichia, the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, the genus Pseudomonas putida, etc .; yeast and the like are preferable examples, but other animal cells, insect cells, etc. , Plants and the like. Of these, Escherichia coli is particularly preferable.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into the host, and the conditions for introducing the recombinant vector into the host may be appropriately set according to the type of host and the like.
  • the host is a bacterium, for example, a method using competent cells treated with calcium ions, an electroporation method, and the like can be mentioned.
  • the host is yeast, for example, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method and the like can be mentioned.
  • the host is an animal cell, for example, an electroporation method, a calcium phosphate method, a lipofection method and the like can be mentioned.
  • the host is an insect cell, for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method and the like can be mentioned.
  • the host is a plant, for example, an electroporation method, an Agrobacterium method, a particle gun method, a PEG method and the like can be mentioned.
  • polypeptide of the present invention can be produced by culturing the transformant.
  • the culture conditions of the transformant may be appropriately set in consideration of the nutritional and physiological properties of the host, but liquid culture is preferable. Further, in the case of industrial production, aeration stirring culture is preferable.
  • the transformant of the present invention is cultured, and the culture supernatant or cells are collected by a method such as centrifugation. If the polypeptide of the present invention is accumulated in the cells, the cells are treated with a mechanical method such as ultrasonic waves or French press or a lytic enzyme such as lysozyme, and if necessary, an enzyme such as protease is applied. It can be solubilized by using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) or a water-soluble fraction containing the polypeptide of the present invention.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the expressed polypeptide of the present invention can be secreted into the culture medium.
  • the culture broth or the water-soluble fraction containing the polypeptide of the present invention obtained as described above may be subjected to the purification treatment as it is, but the polypeptide of the present invention in the culture broth or the water-soluble fraction may be used as it is. After concentration, it may be subjected to a purification treatment.
  • Concentration can be performed by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment, fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent (for example, methanol, ethanol and acetone), or the like.
  • a hydrophilic organic solvent for example, methanol, ethanol and acetone
  • the purification treatment of the polypeptide of the present invention can be performed, for example, by appropriately combining methods such as gel filtration, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the polypeptite of the present invention purified in this manner may be powdered by freeze-drying, vacuum-drying, spray-drying or the like, if necessary.
  • the polypeptide of the present invention is immobilized on an insoluble carrier and used as an immunoglobulin-binding carrier in order to easily recover and purify the immunoglobulin.
  • the insoluble carrier used for immobilization of the polypeptide of the present invention is not particularly limited, but is not particularly limited, and is, for example, naturally derived polymer materials such as chitosan, dextran, cellulose and agarose; synthetic organics such as vinyl alcohol, polyimide and methacrylate. Materials: Examples thereof include inorganic materials such as glass and silica.
  • the shape of the insoluble carrier is not particularly limited, and may be any shape such as a hollow fiber membrane shape, a monolith shape, and a bead shape.
  • the bead shape is generally suitable because it has a relatively large surface area per volume and is suitable for producing an affinity carrier having a high immunoglobulin binding ability.
  • the amino group, carboxyl group, or thiol group in the polypeptide of the present invention may be coupled with the insoluble carrier.
  • the insoluble carrier may be activated by reacting with a coupling agent such as cyanogenbromid, epichlorohydrin, N-hydroxysuccinimide, tosilylloride, tresilylloride, carbodiimide, glutaraldehyde, or hydrazine.
  • an immobilization method in which a reactive functional group such as a carboxyl group or a thiol group is introduced into the carrier and then a coupling reaction is carried out with the polypeptide of the present invention can be mentioned.
  • Such coupling reactions are well known in the art (eg, Janson, J.C., edited [Protein purification], 3rd edition, pp. 221-258, ISBN 978-0-471-74661-. 4) It can be done according to the conventional method.
  • a reactive functional group such as toyopearl AF-Tresyl-650, Toyopearl AF-Epoxide-650, Toyopearl AF-carboxy-650, Toyopearl AF-Holmyl-650 (above, Toso Co., Ltd.), NHS activated sepharose, and bromide.
  • Cyanogen activated cepharose epoxy activated cepharose (above, GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.), Profinity Epoxide (Biorad Co., Ltd.), Glyoxal-Agarose (Agarose Bead Technologies Co., Ltd.), Cellfine Holmill (JNC Co., Ltd.) Etc., and these commercially available products can be used.
  • polypeptide of the present invention can be immobilized on the insoluble carrier by adding a condensation or cross-linking reagent such as carbodiimide or glutaraldehyde to the system in which the polypeptide of the present invention and the insoluble carrier coexist.
  • a condensation or cross-linking reagent such as carbodiimide or glutaraldehyde
  • an insoluble carrier on which the polypeptide of the present invention is immobilized may be used.
  • the isolation of immunoglobulin using an insoluble carrier on which the polypeptide of the present invention is immobilized can be performed by an affinity column chromatography method.
  • a column packed with an insoluble carrier on which the polypeptide of the invention is immobilized is passed a solution containing the immunoglobulin or the polypeptide containing its Fc region.
  • a solution containing the immunoglobulin or the polypeptide containing its Fc region After binding the polypeptide containing munoglobulin or its Fc region to the polypeptide of the present invention, the inside of the column is washed if necessary, and then an eluent adjusted to an appropriate pH is passed through the column. Thereby, the polypeptide containing the immunoglobulin or its Fc region may be eluted.
  • the pH of the solution containing the immunoglobulin or the polypeptide containing the Fc region thereof may be 6.5 or more, preferably 6.5 to 8.0.
  • the pH of the eluate may be weakly acidic or less, specifically pH 5 or less, but in order to prevent the separated immunoglobulin or a fragment thereof from being exposed to strongly acidic conditions, the eluate may be prepared.
  • the pH is preferably 3 to 5, more preferably 3.4 to 4.5, and even more preferably 3.6 to 4.5.
  • Test Example 1 Production and evaluation of monodomain-type polypeptide (1) 1.
  • Production of monodomain -type polypeptide A monodomain-type polypeptide in which the C domain of protein A was modified was produced.
  • the specific manufacturing method is as follows.
  • PN-32 The polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 was named PN-32.
  • the expression plasmid of PN-32 was produced by the following method.
  • a double-stranded DNA having a base sequence in which the recognition sequence of the restriction enzyme NdeI, the sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the translation termination codon, and the recognition sequence of the restriction enzyme BamHI are arranged in this order is synthesized at the site of the translation start codon. It was made using an oligonucleotide. Fragments obtained by cleaving both ends of the synthetic oligonucleotide with the restriction enzymes NdeI and BamHI, respectively, were incorporated into the pET9a plasmid similarly cleaved with these two restriction enzymes by a ligation reaction, and then incorporated into Escherichia coli DH-5 ⁇ competent cells. Transformed. The Escherichia coli was cultured in the presence of kanamycin to purify the PN-32 expression plasmid (pET9a / PN-32).
  • the nucleic acid sequence of pET9a / PN-32 thus obtained was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter Co., Ltd.), and it was confirmed that the sequence was as designed.
  • a double-stranded DNA encoding the desired variant was prepared by PCR using pET9a / PN-32 as a template and an oligonucleotide DNA designed and synthesized so as to have one amino acid substitution of interest as a primer.
  • pET9a / PN-32 it was cleaved with restriction enzymes NdeI and BamHI and incorporated into the pET9a plasmid by a ligation reaction to obtain an expression plasmid of a PN-32 variant having one amino acid substitution.
  • the same operation as described above was carried out to prepare an expression plasmid of the PN-32 variant having two amino acid substitutions.
  • the nucleic acid sequence of the expression plasmid of the PN-32 variant thus obtained was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter Co., Ltd.), and it was confirmed that the sequence was as designed.
  • PN-32 and its variants Expression of PN-32 and its variants by transforming Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells (Merck Co., Ltd.) with the expression plasmids of PN-32 and its variants obtained above. Got a stock.
  • Each expressed Escherichia coli strain of PN-32 and its variants was cultivated for 12 hours in LB medium containing 25 mg / L kanamycin and 2.0% glucose.
  • the obtained seed culture solution was inoculated into 2 ⁇ TY medium containing 25 mg / L kanamycin and 0.8% glucose, and cultured at 37 ° C. for 16 hours to express the desired PN-32 and its variants.
  • Escherichia coli was recovered by centrifugation.
  • the recovered Escherichia coli was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), ultrasonically treated to crush the Escherichia coli, and further centrifuged to recover PN-32 and its variants in the supernatant.
  • PN-32 and its variants were separated by a linear concentration gradient of 0.3 M NaCl. As a result of subjecting each separation solution to SDS-PAGE and confirming the purity, it was confirmed that PN-32 and its variants were purified as a single band at the position of the theoretical molecular weight.
  • the absorption of the eluate eluted at pH 4.0 and the eluate eluted at pH 2.8 at 280 nm was measured with a spectrophotometer, and the specific extinction coefficient of 13.8 (1 g -1 cm -1 ) was also obtained.
  • the amount of IgG contained in each eluate was determined.
  • the amount of human IgG in the eluate eluted at pH 4.0, where the total amount of the human IgG amount of the eluate eluted at pH 4.0 and the human IgG amount of the eluate eluted at pH 2.8 is 100%.
  • the ratio was determined as "elution rate (%) in weak acidity".
  • Glutamine at position 9 is replaced with an amino acid having a hydrophobic aliphatic side chain (alanine, valine, leucine, or isoleucine), and serine at position 41 is an amino acid having a hydrophobic side chain (alanine, valine, leucine, phenylalanine).
  • the variant substituted with, tyrosine, or histidine the residual activity after alkali treatment is higher than that of the monovariant variant at position 41, and the dissolution rate in weak acidity is dramatically improved as compared with PN-32. It was confirmed that.
  • the variant in which serine at position 41 is replaced with alanine or leucine has high residual activity after alkali treatment by further substituting glutamine at position 9 with an amino acid or histidine having a hydrophobic aliphatic side chain, and is weakly acidic.
  • the dissolution rate was dramatically improved as compared with the monovariant substitution product.
  • glutamine at position 9 was replaced with phenylalanine and serine at position 41 was replaced with an amino acid having a hydrophobic side chain, tyrosine, or histidine
  • only the residual activity at position 41 was replaced after alkali treatment. It was not higher than the variant.
  • Test Example 2 Production and evaluation of monodomain-type polypeptide (2) 1.
  • PN-32 SEQ ID NO: 2
  • an expression plasmid of the PN-32 variant into which the amino acid substitution shown in Table 2 was introduced was produced by the same method as in Test Example 1.
  • the nucleic acid sequence of the expression plasmid of the PN-32 variant thus obtained was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter Co., Ltd.), and it was confirmed that the sequence was as designed.
  • Each expressed E. coli strain of the variant of PN-32 was seed-cultured in LB medium containing 25 mg / L kanamycin and 2.0% glucose for 12 hours.
  • the obtained seed culture solution was inoculated into 2 ⁇ TY medium containing 25 mg / L kanamycin and 0.8% glucose, and cultured at 37 ° C. for 16 hours to express the desired PN-32 and its variants.
  • Escherichia coli was recovered by centrifugation.
  • the recovered Escherichia coli was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), ultrasonically treated to crush the Escherichia coli, and further centrifuged to recover a variant of PN-32 in the supernatant.
  • the cell extract of each expressed Escherichia coli strain of the variant of PN-32 was adjusted to pH 6.0 and then applied to a cation exchanger SP-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Co., Ltd.) column. After washing with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0), the protein was eluted from the column with a linear concentration gradient of 0.5 M NaCl. When the eluate was confirmed by SDS-PAGE, the variant of PN-32 was eluted between 0.1 and 0.2 M NaCl. Next, the pH of each eluate containing the variant of PN-32 was adjusted to 9, and then added to the anion exchanger Gigacap Q (Tosoh Corporation) column.
  • variants of PN-32 were separated with a 0.3 M NaCl linear concentration gradient. As a result of subjecting each separation solution to SDS-PAGE and confirming the purity, it was confirmed that the variant of PN-32 was purified as a single band at the position of the theoretical molecular weight.
  • PN-32 SEQ ID NO: 2
  • the 9th position is replaced with an amino acid having a hydrophobic aliphatic side chain
  • the 41st position is replaced with an amino acid having a hydrophobic side chain
  • the 15th position is replaced with alanine
  • 11 In the variant in which the position was replaced with arginine, the alkali stability was improved and the elution rate in weak acidity could be further improved.
  • the 15-position is replaced with alanine or histidine
  • the 24-position is replaced with glutamine
  • the 41-position is replaced with an amino acid having a hydrophobic side chain
  • the residue remains after alkali treatment. It was confirmed that the activity was 1.40 times or more that of PN-32, and the dissolution rate in weak acidity was 1.40 times that of PN-32, which was dramatically improved.
  • Test Example 3 Production and evaluation of monodomain-type polypeptide (3) 1.
  • the specific manufacturing method is as follows.
  • PN-128 expression plasmid In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the polypeptide consisting of the amino acid sequence in which threonine at position 7 is replaced with glutamic acid was named PN-128.
  • An expression plasmid of PN-128 was produced in the same manner as in Test Example 1.
  • the nucleic acid sequence of the PN-128 expression plasmid thus obtained was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter Co., Ltd.), and it was confirmed that the sequence was as designed.
  • the nucleic acid sequence of the expression plasmid of the PN-128 variant thus obtained was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter Co., Ltd.), and it was confirmed that the sequence was as designed.
  • PN-128 and its variants Expression of PN-32 and its variants by transforming Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells (Merck Co., Ltd.) with the expression plasmids of PN-128 and its variants obtained above. Got a stock.
  • Each expressed Escherichia coli strain of PN-128 and its variants was cultivated for 12 hours in LB medium containing 25 mg / L kanamycin and 2.0% glucose.
  • the obtained seed culture solution was inoculated into 2 ⁇ TY medium containing 25 mg / L kanamycin and 0.8% glucose, and cultured at 37 ° C. for 16 hours to express the desired PN-128 and its variants.
  • Escherichia coli was recovered by centrifugation.
  • the recovered Escherichia coli was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), ultrasonically treated to crush the Escherichia coli, and further centrifuged to recover PN-32 and its variants in the supernatant.
  • PN-128 and its variants were separated by a linear concentration gradient of 0.3 M NaCl. As a result of subjecting each separation solution to SDS-PAGE and confirming the purity, it was confirmed that PN-128 and its variants were purified as a single band at the position of the theoretical molecular weight.
  • Test Example 4 Production and evaluation of a multi-domain polypeptide 1.
  • Production of multi-domain polypeptide A multi-domain polypeptide having 6 modified sequences of the C domain of protein A was produced. The specific manufacturing method is as follows.
  • PN-621 expression plasmid From the N-terminal side, a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which five amino acid sequences (SEQ ID NO: ⁇ ) shown in SEQ ID NO: 3 and one amino acid sequence (sequence ⁇ ) shown in SEQ ID NO: 2 are directly linked in this order is PN-. It was named 621.
  • the expression plasmid of PN-621 was produced by the method described in Patent Document 3.
  • the nucleic acid sequence of the PN-621 expression plasmid thus obtained was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter Co., Ltd.), and it was confirmed that the sequence was as designed.
  • the nucleic acid sequence of the expression plasmid of the PN-621 variant thus obtained was analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter Co., Ltd.), and it was confirmed that the sequence was as designed.
  • PN-621 and its variants Expression of PN-621 and its variants by transforming Escherichia coli BL21 (DE3) competent cells (Merck Co., Ltd.) with the expression plasmids of PN-621 and its variants obtained above. Got a stock.
  • Each expressed Escherichia coli strain of PN-621 and its variants was cultivated for 12 hours in LB medium containing 25 mg / L kanamycin and 2.0% glucose.
  • the obtained seed culture solution was inoculated into 2 ⁇ TY medium containing 25 mg / L kanamycin and 0.8% glucose, and cultured at 37 ° C. for 16 hours to express the desired PN-621 and its variants.
  • Escherichia coli was recovered by centrifugation.
  • the recovered Escherichia coli was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), ultrasonically treated to crush the Escherichia coli, and further centrifuged to recover PN-621 and its variants in the supernatant.
  • a multi-domain type polypeptide having a plurality of amino acid sequences substituted with histidine and having an amino acid having a hydrophobic side chain at the 41st position or with histidine It was found that even a multi-domain type polypeptide having a plurality of amino acid sequences in which the 24-position is substituted with glutamine and the 41-position is substituted with histidine also has high residual activity after alkali treatment and IgG elution ability in weak acidity. rice field.
  • sequences ⁇ , ⁇ , sequences ⁇ 1 to 12, and sequences ⁇ 1 to 10 shown in Table 4 are as follows.
  • Sequence ⁇ Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 1 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7R / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 1 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7R / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 2 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7R / Q9V / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 2 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7R / Q9V / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 3 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4V / T7E / Q9L / E15H / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 3 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4V / T7E / Q9L / E15H / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 4 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / N11H / E15L / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 4 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / N11H / E15L / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 5 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9A / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 5 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9A / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 6 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9V / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 6 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9V / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 7 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9H / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 7 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9H / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 8 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7R / Q9V / N11A / E15H / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 8 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7R / Q9V / N11A / E15H / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 9 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9V / N11A / E15A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 9 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9V / N11A / E15A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 10 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9L / N11H / E15L / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 10 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of A4I / T7E / Q9L / N11H / E15L / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Sequence ⁇ 11 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of N3D / A4A / N6D / T7V / Q9A / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 12 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of N3D / A4A / N6D / T7E / Q9V / N11A / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 13 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of N3V / A4A / N6Q / T7V / Q9I / N11Q / S41V is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Sequence ⁇ 14 Amino acid sequence in which the amino acid substitution of N3D / A4V / N6Q / T7V / N11Q / E15H / E24Q / S41H is introduced in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • Test Example 5 IgG elution profile by pH gradient A human polyclonal is placed in a column packed with a gel carrier on which each multidomain polypeptide of Example 56 (PN-621 variant) and Comparative Example 50 (PN-621) are immobilized. IgG (obtained from Japan Blood Product Organization) was injected and bound. Human IgG was then eluted with a linear pH gradient using 0.1 M citrate buffer at pH 7.2 and 0.1 M citrate buffer at pH 2.3, and the absorbance of the eluate at 280 nm was monitored.
  • FIG. 1 shows the result of using Example 56 (PN-621 variant), and (B) shows the result of using Comparative Example 50 (PN-621).
  • PN-621 variant shows the result of using Comparative Example 50
  • FIG. 1 shows the result of using Example 56 (PN-621 variant)
  • FIG. 2 shows the result of using Comparative Example 50 (PN-621).
  • human IgG was eluted at pH 4.02.
  • the gel carrier on which the multi-domain type polypeptide of Comparative Example 50 (PN-621) was immobilized human IgG was eluted at pH 3.19.
  • Test Example 6 Production and evaluation of wild-type monodomain polypeptide and its variants 1.
  • An expression plasmid was prepared. Specifically, wild-type domain A (SEQ ID NO: 4), wild-type domain B (SEQ ID NO: 7), wild-type domain C (SEQ ID NO: 1), wild-type domain D (SEQ ID NO: 10), wild-type domain E (SEQ ID NO: 10).
  • the nucleic acid sequences of the wild-type single domain polypeptide and the expression plasmids of these variants were analyzed using a CEQ8000 type DNA sequencer (Beckman Coulter Co., Ltd.), and it was confirmed that the sequences were as designed.
  • Each expressed Escherichia coli strain obtained above was seed-cultured in LB medium containing 25 mg / L kanamycin and 2.0% glucose for 12 hours.
  • the obtained seed culture medium was inoculated into 2 ⁇ TY medium containing 25 mg / L kanamycin and 0.8% glucose, and cultured at 37 ° C. for 16 hours to obtain each wild-type single domain polypeptide of interest and these.
  • E. coli was recovered by centrifugation. Next, the recovered E. coli was suspended in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5), ultrasonically treated to crush the E. coli, and further centrifuged to remove each wild-type single domain polypeptide and variants thereof. It was recovered in Qing.
  • each of the obtained supernatants was subjected to sodium dodecyl sulfate-15% polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) as a cell extract, each wild-type monodomain polypeptide and variants thereof were produced as intended. It was confirmed that it was done.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-15% polyacrylamide gel electrophoresis
  • the cell extract of each expressed Escherichia coli strain obtained above was adjusted to pH 6.0 and then applied to a cation exchanger SP-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Co., Ltd.) column. After washing with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0), the protein was eluted from the column with a linear concentration gradient of 0.5 M NaCl. When the eluate was confirmed by SDS-PAGE, each wild-type monodomain polypeptide and variants thereof were eluted between 0.1 and 0.2 MNaCl. Next, the pH of each eluate containing each wild-type monodomain polypeptide and variants thereof was adjusted to 9, and then added to an anion exchanger Gigacap Q (Tosoh Corporation) column.
  • an anion exchanger Gigacap Q Tosoh Corporation
  • each wild-type monodomain polypeptide and variants thereof were separated by a linear concentration gradient of 0.3 M NaCl.
  • SDS-PAGE SDS-PAGE

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Abstract

本発明の目的は、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を改変することにより、アルカリ安定性に優れ、しかも一旦結合させたイムノグロブリン又はその断片を弱酸性領域で溶出できるポリペプチドを提供することである。 プロテインＡの各イムノグロブリン結合ドメインにおいて、４１位のセリンを、疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン又はヒスチジンに置換することによって、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドに対する結合活性があり、アルカリ安定性に優れ、しかも一旦結合させたイムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを弱酸性の穏和な条件で効率的に溶出できるポリペプチドが得られる。

Description

イムノグロブリン結合ポリペプチド
　本発明は、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドに結合するポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドに対する結合活性があり、アルカリ条件下での安定性（アルカリ安定性）に優れ、しかも一旦結合させたイムノグロブリン又はその断片を弱酸性領域で効率的に溶出できるポリペプチドに関する。更に、本発明は、当該ポリペプチドの製造方法、当該ポリペプチドの固定化物、及び当該ポリペプチドを利用したイムノグロブリン又はその断片の分離方法等に関する。
　従来、イムノグロブリン（抗体とも称される）は、標的物質に対する結合特異性が高く、研究用試薬や臨床検査試薬として広く利用されている。また、近年では、遺伝子組換え技術の進歩によって、ヒト抗体やヒト化抗体の作製技術が確立され、イムノグロブリンは、抗体医薬としてリウマチや癌等の医療分野で実用化されるに至っている。
　イムノグロブリンは、主に動物細胞培養により製造されており、その精製にはイムノグロブリン結合能を有するリガンドを使用したアフィニティークロマトグラフィーが広く利用されている。イムノグロブリンの精製に利用されるアフィニティークロマトグラフィーでは、イムノグロブリンに特異的に結合するリガンドとして、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ等のポリペプチド、又はこれらのイムノグロブリン結合ドメインが用いられている。
　一方、近年、イムノグロブリンの精製に使用されるリガンドの安定性の向上が求められるようになっている。特に、イムノグロブリンの精製では、ウイルス等の不活化や、リガンドを固定化した担体の洗浄等のためにアルカリ溶液が使用されており、イムノグロブリンの精製に使用されるリガンドには、アルカリに対して高い安定性を備えていることが１つの重要な要素になっている。
　従来、プロテインＡのアルカリ安定性を向上させる技術については精力的に検討されている。例えば、特許文献１には、プロテインＡのＣドメインの特定のアミノ酸、又はプロテインＡのＺドメインの特定のアミノ酸残基を置換することにより、優れたイムノグロブリン結合能及びアルカリ安定性を備えさせ得ることが報告されている。また、特許文献２には、プロテインＡのアスパラギン残基を別のアミノ酸に置換することによってアルカリ安定性を備えさせ得ることが報告されている。
　一方、プロテインＡ又はそのイムノグロブリン結合ドメインに結合させたイムノグロブリンを溶出させる場合、通常、強酸性（ｐＨ３以下程度）の溶出液が使用されている。このような強酸性の溶出液を使用すると、イムノグロブリンの変性やそれに伴った凝集体形成を招くことがある。そのため、一旦結合させたイムノグロブリンを弱酸性の穏和な条件で溶出できるイムノグロブリン結合ポリペプチドの開発が望まれている。
　前述の通り、プロテインＡ及びそのイムノグロブリン結合ドメインについては、アルカリ安定性を付与する技術が種々報告されているものの、一旦結合させたイムノグロブリン又はその断片を弱酸性領域で効率的に溶出させる技術については、十分な検討がなされていないのが現状である。
国際公開番号第２００７／０９７３６１号 国際公開第２０００／０２３５８０号
　本発明の目的は、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を改変することにより、アルカリ安定性に優れ、しかも一旦結合させたイムノグロブリン又はそのＦｃ領域含有ポリペプチドを弱酸性領域で溶出できるポリペプチドを提供することである。
　本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、プロテインＡの各イムノグロブリン結合ドメインにおいて、４１位のセリンを、疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン又はヒスチジンに置換することによって、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドに対する結合活性があり、アルカリ安定性に優れ、しかも一旦結合させたイムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを弱酸性の穏和な条件で効率的に溶出できるポリペプチドが得られることを見出した。更に、前記４１位の置換に加えて、９位のグルタミンを、疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換、或は１５位のグルタミン酸をアラニン又はヒスチジン且つ２４位のグルタミン酸又はアラニンをグルタミンに置換することによって、アルカリ安定性及び弱酸性領域での溶出性をより一層向上させ得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　下記(A)～(C)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチド。
(A)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、以下の(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン：
(i)４１位のセリンが、疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン、又はヒスチジンに置換。
(ii)９位のグルタミンが、未置換、或は疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換。
(iii)１５位のグルタミン酸又はグルタミンが、未置換、或はアラニン、ヒスチジン、チロシン又はロイシンに置換。
(iv)２４位のグルタミン酸又はアラニンが、未置換、配列番号１～１２の場合はグルタミン、ヒスチジン又はアラニンに置換、或は配列番号１３～１５の場合はグルタミン又はヒスチジンに置換。
(B)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されており、当該改変がなされていない部位のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入及び／又は欠失されてなり、且つ、対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、アルカリ安定性が同等以上、且つ弱酸性領域でのＩｇＧ溶出能が高いイムノグロブリン結合ドメイン。
(C)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されており、対応する未改変のアミノ酸配列に対する、当該改変がなされていない部位の配列同一性が８０％以上であり、対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、アルカリ安定性が同等以上、且つ弱酸性領域でのＩｇＧ溶出能が高いイムノグロブリン結合ドメイン。
項２．　前記(A)～(C)に示すイムノグロブリン結合ドメインの中から選択される１個のイムノグロブリン結合ドメインが含まれる単ドメイン型ペプチドである、項１に記載のポリペプチド。
項３．　前記(A)～(C)に示すイムノグロブリン結合ドメインから選択される２個以上のイムノグロブリン結合ドメインが連結されてなる複ドメイン型ペプチドである、項１に記載のポリペプチド。
項４．　前記アミノ酸配列において、９位のグルタミンが疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換されている、項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
項５．　前記アミノ酸配列において、１５位のグルタミン酸又はグルタミンが、アラニン又はヒスチジンに置換され、且つ
　配列番号１～１２の場合は２４位のグルタミン酸がグルタミン、又は配列番号１３～１５の場合は２４位のアラニンがグルタミンに置換されている、項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
項６．　前記アミノ酸配列において、４１位のセリンが、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、又はヒスチジンに置換されている、項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
項７．　前記アミノ酸配列において、９位のグルタミンが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はヒスチジンに置換されている、項１～６のいずれかに記載のポリペプチド。
項８．　項１～７のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項９．　項８に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項１０．　項９に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項１１．　項１０に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１～７のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
項１２．　項１～７のいずれかに記載のポリペプチドが不溶性担体に固定化されてなる、イムノグロブリン結合用担体。
項１３．　項１２に記載のイムノグロブリン結合用担体を用いて、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドの分離を行う、イムノグロブリン又はその断片の分離方法。
項１４．　前記イムノグロブリン結合用担体にイムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを一旦結合させた後に、ｐＨ３～５の条件でイムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを溶出させる、項１３に記載の分離方法。
　本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドに対する結合能があり、アルカリ条件下に晒されても、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドに対する結合能を維持できるので、アルカリ性溶液による溶出や洗浄を繰り返しても、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドに対する結合能の低下を抑制できる。また、本発明のポリペプチドは、一旦結合させたイムノグロブリン又はその断片を弱酸性（ｐＨ３～５程度）の穏和な条件で効率的に溶出できるので、分離するイムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドの変性を抑制できる。
実施例５６（ＰＮ－６２１改変体）及び比較例５０（ＰＮ－６２１）の各複ドメイン型ポリペプチドを用いて、ｐＨ勾配によるＩｇＧ溶出プロファイルを測定した結果である。図１において、（Ａ）は実施例５６（PN-621改変体）の結果であり、（Ｂ）は比較例５０（ＰＮ－６２１）の結果である。
　以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
　本明細書において、「Ｑ９Ｖ」、「Ｑ９Ｖ／Ｓ４１Ｖ」等の表現は、アミノ酸置換の表記である。例えば「Ｑ９Ｖ」とは、ある特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から９位のグルタミンがバリンに置換されていることを意味する。また、例えば、「Ｑ９Ｖ／Ｓ４１Ｖ」とは、ある特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から９位のグルタミンがバリンに置換され、且つＮ末端側から４１位のセリンがバリンに置換されていることを意味する。
　本明細書において、「疎水性側鎖を有するアミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。また、本明細書において「疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びメチオニンが含まれる。
１．ポリペプチド
　本発明のポリペプチドの一態様として、下記(A)に示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドが挙げられる。
(A)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、以下の(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン：
(i)４１位のセリンが、疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン、又はヒスチジンに置換。
(ii)９位のグルタミンが、未置換、或は疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換。
(iii)１５位のグルタミン酸又はグルタミンが、未置換、或はアラニン、ヒスチジン、チロシン又はロイシンに置換。
(iv)２４位のグルタミン酸又はアラニンが、未置換、配列番号１～１２の場合はグルタミン、ヒスチジン又はアラニンに置換、或は配列番号１３～１５の場合はグルタミン又はヒスチジンに置換。
　配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列は、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のプロテインＡの野生型イムノグロブリン結合ドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）及びその改変体のアミノ酸配列である。
　具体的には、配列番号１は野生型Ｃドメイン、配列番号２及び３はＣドメインの改変体、配列番号４は野生型Ａドメイン、配列番号５及び６はＡドメインの改変体、配列番号７は野生型Ｂドメイン、配列番号８及び９はＢドメインの改変体、配列番号１０は野生型Ｄドメイン、配列番号１１及び１２はＤドメインの改変体、配列番号１３は野生型Ｅドメイン、配列番号１４及び１５はＥドメインの改変体である。
　配列番号２に示すアミノ酸配列は、野生型Ｃドメインのアミノ酸配列（配列番号１）において、４位のリジンがアラニンに置換、７位のリジンがスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４０位のバリンがリジンに置換、４３位のグルタミン酸がリジンに置換、４６位のアラニンがリジンに置換、及び５３位のアスパラギン酸がリジンに置換されたアミノ酸配列である。配列番号２に示すアミノ酸配列では、４０位、４３位、４６位、及び５３位にリジンが導入されていることにより、４０位以降の配列がリジンリッチになっており、担体に固定化し易くなっている。
　配列番号３に示すアミノ酸配列は、野生型Ｃドメインのアミノ酸配列（配列番号１）において、４位のリジンがアラニンに置換、７位のリジンがスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４２位のリジンがアラニンに置換、４９位のリジンがアルギニンに置換、５０位のリジンがアルギニンに置換、及び５８位のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列である。
　配列番号５に示すアミノ酸配列は、野生型Ａドメインのアミノ酸配列（配列番号４）において、４位のアスパラギンがアラニンに置換、７位のリジンがスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４０位のグルタミンがリジンに置換、４３位のアスパラギンがリジンに置換、４６位のセリンがリジンに置換、及び５３位のグルタミン酸がリジンに置換されたアミノ酸配列である。配列番号５に示すアミノ酸配列では、４０位、４３位、４６位、及び５３位にリジンが導入されていることにより、４０位以降の配列がリジンリッチになっており、担体に固定化し易くなっている。
　配列番号６に示すアミノ酸配列は、野生型Ａドメインのアミノ酸配列（配列番号４）において、４位のアスパラギンがアラニンに置換、７位のリジンがスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４９位のリジンがアルギニンに置換、５０位のリジンがアルギニンに置換、及び５８位のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列である。
　配列番号８に示すアミノ酸配列は、野生型Ｂドメインのアミノ酸配列（配列番号７）において、４位のリジンがアラニンに置換、７位のリジンがスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４０位のグルタミンがリジンに置換、４３位のアスパラギンがリジンに置換、４６位のアラニンがリジンに置換、及び５３位のアスパラギン酸がリジンに置換されたアミノ酸配列である。配列番号８に示すアミノ酸配列では、４０位、４３位、４６位、及び５３位にリジンが導入されていることにより、４０位以降の配列がリジンリッチになっており、担体に固定化し易くなっている。
　配列番号９に示すアミノ酸配列は、野生型Ｂドメインのアミノ酸配列（配列番号７）において、４位のリジンがアラニンに置換、７位のリジンがスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４９位のリジンがアルギニンに置換、５０位のリジンがアルギニンに置換、及び５８位のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列である。
　配列番号１１に示すアミノ酸配列は、野生型Ｄドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）において、４位のアスパラギンがアラニンに置換、７位のリジンがスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４０位のグルタミンがリジンに置換、４３位のアスパラギンがリジンに置換、４６位のグリシンがリジンに置換、及び５３位のグルタミン酸がリジンに置換されたアミノ酸配列である。配列番号１１に示すアミノ酸配列では、４０位、４３位、４６位、及び５３位にリジンが導入されていることにより、４０位以降の配列がリジンリッチになっており、担体に固定化し易くなっている。
　配列番号１２に示すアミノ酸配列は、野生型Ｄドメインのアミノ酸配列（配列番号１０）において、４位のアスパラギンがアラニンに置換、７位のリジンがスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４２位のスレオニンがアラニンに置換、４９位のリジンがアルギニンに置換、５０位のリジンがアルギニンに置換、及び５８位のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列である。
　配列番号１４に示すアミノ酸配列は、野生型Ｅドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）において、４位のグルタミンがアラニンに置換、７位のグルタミン酸がスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４０位のグルタミンがリジンに置換、４３位のアスパラギンがリジンに置換、４６位のグリシンがリジンに置換、及び５３位のアスパラギン酸がリジンに置換されたアミノ酸配列である。配列番号１４に示すアミノ酸配列では、４０位、４３位、４６位、及び５３位にリジンが導入されていることにより、４０位以降の配列がリジンリッチになっており、担体に固定化し易くなっている。
　配列番号１５に示すアミノ酸配列は、野生型Ｅドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）において、４位のグルタミンがアラニンに置換、７位のグルタミン酸がスレオニンに置換、３５位のリジンがアルギニンに置換、４９位のグルタミンがアルギニンに置換、５０位のリジンがアルギニンに置換、及び５８位のリジンがアルギニンに置換されたアミノ酸配列である。
　プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、Ｎ末端側から第１α－ヘリックス、第２α－ヘリックス、及び第３α－ヘリックスの３つのα－ヘリックスが存在している。配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における４１位のセリンは、全てのイムノグロブリン結合ドメイン（Ａ～Ｅ）で保存されており、イムノグロブリン結合ドメインの３つのα－ヘリックスの内の第３α－ヘリックスに存在し、第２α－ヘリックスとの連結部を形成すると共に第１α－ヘリックスとも相互作用している。この４１位のセリンを疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン、又はヒスチジンに置換することにより、イムノグロブリン結合ドメイン内のアミノ酸間の疎水的相互的作用を高め、アルカリ安定性を向上させることができる。また、４１位セリンは、第１α－ヘリックス内のイムノグロブリン結合部位を形成する９位グルタミン、１０位グルタミン及び１１位アスパラギンのα－ヘリックス構造の裏側に位置しており、この４１位のセリンを疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン又はヒスチジンに置換することにより、これらが形成するIgＧ結合構造に影響を及ぼすものと考えられる。
　配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における４１位のセリンが置換されるアミノ酸は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン、又はヒスチジンに置換されていればよいが、好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、又はヒスチジンが挙げられる。
　配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における９位のグルタミンは、ＩｇＧ結合部位の一つであり、ＩｇＧの２５４位のセリンと水素結合を形成することによりＩｇＧへの結合に寄与している。配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における９位のグルタミンは、未置換であってもよく、また疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換されていてもよい。配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における９位のグルタミンが疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換されている場合には、アルカリ安定性を更に向上させつつ、弱酸性領域での溶出性を高めることができる。限定的な解釈を望むものではないが、配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、４１位と９位のアミノ酸は空間的に近い位置にあるので、配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における９位のグルタミンを疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換することにより、４１位に存在する疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン、又はヒスチジンと、９位に存在する疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンとの相互作用によって、アルカリ安定性を更に向上させつつ、ＩｇＧとの相互結合を減じることにより弱酸性領域での結合活性を低下させ得ると類推される。
　配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における９位のグルタミンが置換されるアミノ酸としては、好ましくは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はヒスチジン、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、又はヒスチジンが挙げられる。
　配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における１５位のグルタミン酸又はグルタミン（配列番号１～１２の場合はグルタミン酸、配列番号１３～１５の場合はグルタミン）は、未置換であってもよく、またアラニン、ヒスチジン、チロシン又はロイシンに置換に置換されていてもよい。また、配列番号１～１２に示す各アミノ酸配列における２４位のグルタミン酸は、未置換であってもよく、またグルタミン、ヒスチジン又はアラニンに置換されていてもよい。また、配列番号１３～１５に示す各アミノ酸配列における２４位のアラニンは、未置換であってもよく、またグルタミン又はヒスチジンに置換されていてもよい。特に、配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における１５位のグルタミン酸又はグルタミンがアラニン又はヒスチジンに置換され、且つ２４位のグルタミン酸又はアラニンがグルタミンに置換されている場合には、アルカリ安定性及び弱酸性領域での溶出性をより一層向上させることができる。
　(A)のイムノグロブリン結合ドメインの好適な一例として、以下の(1)～(5)に示すアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
(1)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、９位、１５位及び２４位が未置換であり、且つ４１位がバリン、フェニルアラニン、チロシン、又はヒスチジンに置換されているアミノ酸配列。
(2)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、１５位及び２４位が未置換であり、９位がロイシンに置換され、且つ４１位がバリン、ロイシン、フェニルアラニン、アラニン、チロシン、又はヒスチジンに置換されているアミノ酸配列。
(3)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、１５位及び２４位が未置換であり、９位がバリンに置換され、且つ４１位がロイシン、バリン、フェニルアラニン、チロシン、又はヒスチジンに置換されているアミノ酸配列。
(4)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、１５位及び２４位が未置換であり、９位がヒスチジンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
(5)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、１５位及び２４位が未置換であり、９位がアラニンに置換され、且つ４１位がフェニルアラニン、バリン、チロシン、又はヒスチジンに置換されているアミノ酸配列。
(6)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、１５位及び２４位が未置換であり、９位がイソロイシンに置換され、且つ４１位のセリンがバリン、又はアラニンに置換されているアミノ酸配列。
(7)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、２４位が未置換であり、９位がバリンに置換され、１５位がアラニンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されに置換されているアミノ酸配列。
(8)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、２４位が未置換であり、９位がロイシン又はバリンに置換され、１５位がヒスチジンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
(9)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、２４位が未置換であり、９位がバリンに置換され、１５位がチロシンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
(10)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、２４位が未置換であり、９位が未置換又はロイシンに置換され、１５位がロイシンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
(10)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、９位が未置換であり、１５位がアラニン又はヒスチジンに置換され、２４位がグルタミンに置換され、且つ４１位がバリン又はヒスチジンに置換されているアミノ酸配列。
(11)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、９位がロイシンに置換され、１５位がスチジンに置換され、２４位がグルタミンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
(12)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、９位がロイシンに置換され、１５位がヒスチジン又はロイシンに置換され、２４位がグルタミンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
(13)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、１５位が未置換であり、９位がロイシンに置換され、２４位がヒスチジンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
(14)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、９位がロイシンに置換され、１５位がヒスチジン又はロイシンに置換され、２４位がヒスチジンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
(15)配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、９位がバリンに置換され、１５位がヒスチジン又はロイシンに置換され、２４位がアラニンに置換され、且つ４１位がバリンに置換されているアミノ酸配列。
　また、本発明のポリペプチドの一態様として、下記(B)及び(C)のいずれか該当するイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドが挙げられる。
(B)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されており、当該改変がなされていない部位のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入及び／又は欠失されてなり、且つ、対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、アルカリ安定性が同等以上、且つ弱酸性領域でのＩｇＧ溶出能が高いイムノグロブリン結合ドメイン。
(C)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されており、対応する未改変のアミノ酸配列に対する、当該改変がなされていない部位の配列同一性が８０％以上であり、対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、アルカリ安定性が同等以上、且つ弱酸性領域でのＩｇＧ溶出能が高いイムノグロブリン結合ドメイン。
　前記(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(A)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列における９位、１５位、２４位、及び４１位に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(A)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
　前記(B)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、「当該改変がなされていない部位のアミノ酸」とは、配列番号１～１５に示すアミノ酸配列において、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変によって置換されたアミノ酸以外のアミノ酸を指す。例えば、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変によって、４１位のみをアミノ酸置換し、９位、１５位、及び２４位はアミノ酸置換されていない場合は、４１位以外のアミノ酸が「当該改変がなされていない部位のアミノ酸」に該当する。また、例えば、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変によって、４１位及び９位をアミノ酸置換し、１５位及び２４位はアミノ酸置換されていない場合は、４１位及び９位以外のアミノ酸が「当該改変がなされていない部位のアミノ酸」に該当する。また、例えば、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変によって、４１位、１５位及び２４位をアミノ酸置換し、９位はアミノ酸置換されていない場合は、４１位、１５位及び２４位以外のアミノ酸が「当該改変がなされていない部位のアミノ酸」に該当する。
　前記(B)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(B)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、改変されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１～１３個、好ましくは１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個、或いは１個が挙げられる。
　前記(C)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、「対応する未改変のアミノ酸配列」とは、ベースとなっているアミノ酸配列を指し、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列の改変である場合であれば、配列番号１に示すアミノ酸配列を指す。また、前記(C)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、「当該改変がなされていない部位の配列同一性」とは、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変によって置換されたアミノ酸以外のアミノ酸を抜き出したアミノ酸配列を比較して算出される配列同一性を指す。例えば、例えば、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変によって、４１位のみをアミノ酸置換し、９位、１５位、及び２４位はアミノ酸置換されていない場合は、４１位以外のアミノ酸を抜き出したアミノ酸配列（４１位を除いたアミノ酸配列）を比較して算出される配列同一性が、「当該改変がなされていない部位の配列同一性」に該当する。また、例えば、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変によって、４１位及び９位をアミノ酸置換し、１５位及び２４位はアミノ酸置換されていない場合は、４１位及び９位以外のアミノ酸を抜き出したアミノ酸配列（４１位及び９位を除いたアミノ酸配列）を比較して算出される配列同一性が、「当該改変がなされていない部位の配列同一性」に該当する。また、例えば、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変によって、４１位、１５位及び２４位をアミノ酸置換し、９位はアミノ酸置換されていない場合は、４１、１５位及び２４位以外のアミノ酸を抜き出したアミノ酸配列（４１位、１５位及び２４位を除いたアミノ酸配列）を比較して算出される配列同一性が、「当該改変がなされていない部位の配列同一性」に該当する。また、前記(C)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ　ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２　ｂｉｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ　ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｃｏｓｔ　ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
　前記(C)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上が挙げられる。
　また、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの一態様として、少なくとも、配列番号１～１２に示す各アミノ酸配列における３位のアスパラギンが、アラニン、バリン、又はアスパラギン酸に置換されているものが挙げられる。更に、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの一態様として、少なくとも、配列番号１３～１５に示す各アミノ酸配列における３位のアラニンが、バリン又はアスパラギン酸に置換されているものが挙げられる。
　また、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの一態様として、少なくとも、配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における４位のアラニン、グルタミン、アスパラギン、又はリジンが、バリン、ヒスチジン、アルギニン、又はイソロイシンに置換されているものが挙げられる。
　また、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの一態様として、少なくとも、配列番号１～１２に示す各アミノ酸配列における６位のアスパラギンが、アラニン、バリン、グルタミン、又はアスパラギン酸に置換されているものが挙げられる。更に、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの一態様として、少なくとも、配列番号１３～１５に示す各アミノ酸配列における６位のアスパラギン酸がアラニン、グルタミン、又はバリンに置換されているものが挙げられる。
　また、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの一態様として、少なくとも、配列番号１～１２、１４及び１５に示す各アミノ酸配列における７位のスレオニン又はリジンが、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、又はバリンに置換されているものが挙げられる。更に、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの一態様として、少なくとも、配列番号１３に示すアミノ酸配列における７位のグルタミン酸が、ヒスチジン、アルギニン、又はバリンに置換されているものが挙げられる。
　また、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの一態様として、少なくとも、配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列における１１位のアスパラギン又はセリンが、アラニン、バリン、ヒスチジン、グルタミン、又はアルギニンに置換されているものが挙げられる。
　(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの具体例としては、配列番号１～１５に示す各アミノ酸配列において、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変が行われていることに加え、少なくとも、以下のアミノ酸置換を有するものが挙げられる。
(i)１１位がアラニン、グルタミン、ヒスチジン又はアルギニンに置換。
(ii)配列番号１～１２、１４及び１５の場合は７位がグルタミン酸に置換（配列番号１３の場合は７位は未置換）。
(iii)配列番号１～１２、１４及び１５の場合は７位がグルタミン酸に置換（配列番号１３の場合は７位は未置換）、且つ１１位がアラニン又はバリンに置換。
(iv)４位がイソロイシンに置換、且つ配列番号１～１２、１４及び１５の場合は７位がアルギニン又はグルタミン酸に置換、或は配列番号１３の場合は７位が未置換又はアルギニンに置換。
(v)４位がイソロイシンに置換、配列番号１～１２、１４及び１５の場合は７位がアルギニン又はグルタミン酸に置換、或は配列番号１３の場合は７位が未置換又はアルギニンに置換、且つ１１位がアラニンに置換。
(vi)４位がイソロイシン又はバリンに置換、且つ配列番号１～１２、１４及び１５の場合は７位がグルタミン酸に置換（配列番号１３の場合は７位は未置換）。
(vii)３位がアスパラギン酸に置換、配列番号１～１２の場合は６位がアスパラギン酸に置換（配列番号１３～１５の場合は６位は未置換）、配列番号１～１２、１４及び１５の場合は７位がバリン又はグルタミン酸に置換、或は配列番号１３の場合は７位が未置換又はバリンに置換、且つ１１位がアラニンに置換。
　配列番号１に示すアミノ酸配列において、４０位、４３位、４６位、４９位、５０位、５３位、及び５８位で置換したリジンは、担体に固定化し易くする役割を果たしているので、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインの好適な一態様として、４０位、４３位、４６位、４９位、５０位、５３位、及び５８位の内、４個以上のリジン、好ましくは６個以上のリジン、より好ましくは全てのリジンは、変異（置換及び／又は欠失）が施されていないことが挙げられる。
　(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、「対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、アルカリ安定性が同等以上、且つ弱酸性領域でのＩｇＧ溶出能が高い」とは、ＩｇＧに対する結合活性があり、下記測定条件１で測定されるアルカリ処理後の残存活性が、同条件で測定した対応する未改変のアミノ酸配列（ベースとなっている配列番号１～１５のいずれかのアミノ酸配列）からなるポリペプチドのアルカリ処理後の残存活性と同等以上であり、且つ下記測定条件２で測定される弱酸性での溶出率が、同条件で測定した対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用した場合の弱酸性での溶出率よりも高いことを意味する。具体的には、下記測定条件１で測定されるアルカリ処理後の残存活性が、同条件で測定した対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアルカリ処理後の残存活性に比べて１．１倍以上であり、且つ下記測定条件２で測定される弱酸性での溶出率が、同条件で測定した対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用した場合の弱酸性での溶出率に比べて１．２倍以上である場合には、「対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、アルカリ安定性が同等以上、且つ弱酸性領域でのＩｇＧ溶出能が高い」といえる。(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインとして、下記測定条件１で測定されるアルカリ処理後の残存活性が、同条件で測定した対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドのアルカリ処理後の残存活性に比べて１．１４倍以上であることが好ましく、１．１４～１．２１倍であることがより好ましく、１．１５～１．２１倍であることが更に好ましい。また、(B)及び(C)のイムノグロブリン結合ドメインとして、下記測定条件２で測定される弱酸性での溶出率が、同条件で測定した対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用した場合の弱酸性での溶出率に比べて１．３倍以上であることが好ましく、１．３～１．５２倍であることがより好ましく、１．４～１．５５倍であることが更に好ましい。
＜測定条件１（アルカリ処理後の残存活性の測定）＞
　アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドに対して、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて６８時間保温する（アルカリ処理）。次いで、ＰＢＳで洗浄した後に、ヒトＩｇＧの結合量（ｍｇ/ｍｌゲル）を測定する。アルカリ処理しなかった場合についても、アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量（ｍｇ/ｍｌゲル）を測定する。アルカリ処理しなかった場合のポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量を１００％として、アルカリ処理後のポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量の割合を「アルカリ処理後の残存活性（％）」として算出する。
＜測定条件２（弱酸性での溶出率の測定）＞
　アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドに対して、ヒトＩｇＧを結合させる。次いで、固定化ポリペプチドをＰＢＳで洗浄した後に、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．０）を用いて、固定化ポリペプチドに結合しているヒトＩｇＧを溶出させる。続いて、０．１Ｍグリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．８）を用いて、固定化ポリペプチドに結合して残存しているヒトＩｇＧを溶出させる。ｐＨ４．０で溶出したヒトＩｇＧ量とｐＨ２．８溶出したヒトＩｇＧ量を測定する。ｐＨ４．０で溶出したヒトＩｇＧ量とｐＨ２．８で溶出したヒトＩｇＧ量との合計量を１００％として、ｐＨ４．０で溶出したヒトＩｇＧ量の割合を弱酸性での溶出率（％）として算出する。
　本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン結合ドメインを１個有する単ドメイン型ポリペプチドであってもよく、またイムノグロブリン結合ドメインを２個以上連結した複ドメイン型ポリペプチドであってもよい。本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合には、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域含有ポリペプチドの結合能が高くなるという利点がある。
　本発明のポリペプチドが単ドメイン型ポリペプチドである場合には、(A)～(C)のイムノグロブリン結合ドメインの内の１個のドメインが含まれていればよい。
　(A)～(C)のイムノグロブリン結合ドメインの内、配列番号２、５、８、１１及び１４に示すアミノ酸配列をベースとして含むイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「リジンリッチドメイン」と表記することもある）は担体への結合性を有しているので、当該イムノグロブリン結合ドメインを単ドメイン型ポリペプチドとして使用する場合、担体への結合性を有するアミノ酸配列を付加しなくてもよいが、担体への結合性を更に向上させるために、担体への結合性を有するアミノ酸配列が付加されていてもよい。
　また、(A)～(C)のイムノグロブリン結合ドメインの内、配列番号１、３、４、６、７、９、１０、１２、１３、及び１５に示すアミノ酸配列をベースとして含むイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「リジン非リッチドメイン」と表記することもある）を単ドメイン型ポリペプチドとして使用する場合、担体への結合性を付与するために、担体への結合性を有するアミノ酸配列が付加されていることが好ましい。
　本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合には、(A)～(C)のイムノグロブリン結合ドメインの内の少なくとも１個のドメインが含まれていればよく、(A)～(C))のイムノグロブリン結合ドメインの内の２個以上のドメインからなるものであってもよく、また(A)～(C)のイムノグロブリン結合ドメインの内の１個以上のドメインと、プロテインＡを構成している各イムノグロブリン結合ドメインやプロテインＬを構成している各イムノグロブリン結合ドメインが１個以上含まれているものであってもよい。本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合、より一層優れたアルカリ安定性及び弱酸性領域での抗体溶出特性を備えさせるという観点から、構成するイムノグロブリン結合ドメインの全てが、(A)～(C)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれかで構成されていることが好ましい。
　本発明のポリペプチドを複ドメイン型ポリペプチドにする場合、連結されているイムノグロブリン結合ドメインの総数については、２個以上であればよいが、好ましくは２～１０個、更に好ましくは２～６個が挙げられる。
　本発明のポリペプチドを複ドメイン型ポリペプチドにする場合、構成する各イムノグロブリン結合ドメインは、それぞれのＣ末端とＮ末端が直接連結されていてもよく、また各各イムノグロブリン結合ドメイン間が１～４０個、好ましくは１～１０個のアミノ酸残基を介して連結されていてもよい。
　また、本発明のポリペプチドを複ドメイン型ポリペプチドにする場合の好適な例として、リジン非リッチドメイン１個以上と、リジンリッチドメイン１個以上とが連結された構造；より好ましくはリジン非リッチドメイン１個以上とリジンリッチドメイン１個が連結されている構造；更に好ましくはリジン非リッチドメイン２～１０個と、リジンリッチドメイン１個が連結されている構造；特に好ましくは、リジン非リッチドメインが３～５個が連結され、且つＣ末端側又はＮ末端側（好ましくはＣ末端側）にリジンリッチドメイン１個が連結されている構造が挙げられる。このように複ドメイン型ポリペプチドにリジンリッチドメイン１個を含ませることにより、担体への結合性を具備できる。そのため、リジンリッチドメインを含む複ドメイン型ポリペプチドでは、担体への結合性を有するアミノ酸配列を付加しなくてもよい。但し、このような複ドメイン型ポリペプチドであっても、担体への結合性を更に向上させるために、担体への結合性を有するアミノ酸配列が付加されていてもよい。
　また、複ドメイン型ポリペプチドにおいて、リジン非リッチドメインを含み、リジンリッチドメインが含まれない場合には、担体への結合性を付与するために、担体への結合性を有するアミノ酸配列が付加されていることが好ましい。
　「担体への結合性を有するアミノ酸配列」のアミノ酸配列としては、例えば、リジンを１～１５個、好ましくは３～１０個、より好ましくは４～８個連結させたアミノ酸配列が挙げられる。この連結配列にはリジンに加えてリジン以外のアミノ酸が含まれていてもよい。また、担体への結合性を有するアミノ酸配列を付加する場合、Ｎ末端側又はＣ末端側のいずれの末端に付加してもよいが、好ましくはＣ末端である。
　また、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの発現の向上、精製の容易性の付与等のために、他の機能を有するポリペプチド、ペプチドタグ等がＮ末端側又はＣ末端側に付加されていてもよい。このような目的で、本発明のポリペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加されるアミノ酸の数については、特に制限されないが、例えば１～４００個、好ましくは１～１００個、更に好ましくは１～３０個が挙げられる。
２．ＤＮＡ
　本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のプロテインＡをコードしているＤＮＡを鋳型として、目的のイムノグロブリン結合ドメインをコードしているＤＮＡをＰＣＲ等によって取得し、当該ＤＮＡに所望のアミノ酸置換等が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
　ここで、スタフィロコッカス・アウレウス由来の野生型のプロテインＡをコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号１６に示す塩基配列として知られており、スタフィロコッカス・アウレウスからＰＣＲを用いた定法により単離することができる。また、野生型のプロテインＡをコードしているＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
　塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキットを用いて行うこともできる。
　塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
　また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
　本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合であれば、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡが好適である。
３．組換えベクター
　本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
　本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
　発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせなどが好ましく挙げられる。
４．形質転換体
　本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
　形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。これらの中でも大腸菌が特に好ましい。
　本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
５．ポリペプチドの製造
　本発明のポリペプチドは、前記形質転換体を培養することによって製造することができる。
　形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
　本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離等の方法により培養上清又は菌体を回収する。本発明のポリペプチドが菌体内に蓄積されている場合であれば、菌体を超音波、フレンチプレス等の機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
　また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
　上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む培養液又は水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、当該培養液又は水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
　濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
　本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
　このようにして精製された本発明のポリペプチは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
６．イムノグロブリン結合担体
　本発明のポリペプチドは、イムノグロブリンの回収や精製を簡便に行うために、不溶性担体に固定化され、イムノグロブリン結合担体として使用される。本発明のポリペプチドの固定化に使用される不溶性担体としては、特に制限されないが、例えば、キトサン、デキストラン、セルロース、アガロースなどの天然由来の高分子材料；ビニルアルコール、ポリイミド、メタクリレートなどの合成有機材料；ガラス、シリカ等の無機材料等が挙げられる。
　不溶性担体の形状については、特に制限されず、中空糸膜状、モノリス状、ビーズ状等のいずれの形状のものであってもよい。これらの形状の中でも、ビーズ状は、一般的に、体積当たりの表面積が比較的大きく、イムノグロブリン結合能の高いアフィニティー担体の製造に適しているので、好適である。
　本発明のポリペプチドを不溶性担体に固定化するには、例えば、本発明のポリペプチド中のアミノ基、カルボキシル基、又はチオール基を不溶性担体とカップリング反応させればよい。具体的には、不溶性担体に対して、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、トシルクロリド、トレシルクロリド、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、ヒドラジン等のカップリング剤と反応させて活性化したり、或は担体にカルボキシル基やチオール基等の反応性官能基を導入したりした後に、本発明のポリペプチドとカップリング反応を行う固定化方法が挙げられる。このようなカップリング反応は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｊａｎｓｏｎ, Ｊ.-Ｃ., 編集［Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ］、第３版、２２１－２５８頁、ＩＳＢＮ ９７８－０－４７１－７４６６１－４）、慣用されている方法に従って行うことができる。
　また、本発明のポリペプチド中のアミノ基を介して不溶性担体に固定化する場合であれば、アミノ基と反応して共有結合を形成できる反応性官能基（トレシル基、エポキシ基、カルボキシル基、ホルミル基等）を有する担体を用いることが望ましい。このような不溶性担体としては、トヨパールＡＦ－トレシル－６５０、トヨパールＡＦ－エポキシ－６５０、トヨパールＡＦ－カルボキシ－６５０、トヨパールＡＦ－ホルミル－６５０（以上、東ソー株式会社）、ＮＨＳ活性化セファロース、臭化シアン活性化セファロース、エポキシ活性化セファロース（以上、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、プロフィニティエポキシド（バイオラッド株式会社）、グリオキサール－アガロース（アガロースビーズテクノロジーズ株式会社）、セルファインホルミル（ＪＮＣ株式会社）等として市販されており、これらの市販品を使用することができる。
　更に、本発明のポリペプチドと不溶性担体が共存する系に、カルボジイミドやグルタルアルデヒド等の縮合又は架橋試薬を加えることって、本発明のポリペプチドを不溶性担体に固定化することもできる。
７．イムノグロブリン又はその断片の分離方法
　本発明のポリペプチドは、イムノグロブリンのＦｃ領域に結合するので、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ等のイムノグロブリン、及びこれらのＦｃ領域を含有するポリペプチド（Ｆｃ融合タンパク質等）等の分離に使用できる。
　本発明のポリペプチドを用いてイムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを分離するには、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を使用すればよい。具体的には、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を用いたイムノグロブリンの分離は、アフィニティーカラム・クロマトグラフィー法によって行うことができる。
　アフィニティーカラム・クロマトグラフィー法によってイムノグロブリンを分離するには、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を充填したカラムに、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを含む溶液を通液させて本発明のポリペプチドにムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを結合させた後に、必要に応じてカラム内部を洗浄し、次いで、適切なｐＨに調整した溶出液をカラムに通液することによって、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを溶出させればよい。イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを含む溶液のｐＨは６．５以上、好ましくは６．５～８．０であればよい。また、溶出液のｐＨは、弱酸性以下、具体的にはｐＨ５以下であればよいが、分離されるイムノグロブリン又はその断片が強酸性条件下に晒されるのを抑制するために、溶出液のｐＨは、好ましくは３～５、より好ましくは３．４～４．５、更に好ましくは３．６～４．５である。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
試験例１：単ドメイン型ポリペプチドの製造と評価（１）
１．単ドメイン型ポリペプチドの製造
　プロテインＡのＣドメインを改変した単ドメイン型ポリペプチドを製造した。具体的な製造方法は、以下の通りである。
＜ＰＮ－３２発現プラスミドの製造＞
　配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＮ－３２と命名した。ＰＮ－３２の発現プラスミドを以下の手法で製造した。
　翻訳開始コドンの部位に制限酵素ＮｄｅＩの認識配列、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列、翻訳終止コドン、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列がこの順に配列された塩基配列の２本鎖ＤＮＡを、合成オリゴヌクレオチドを用いて作製した。当該合成オリゴヌクレオチドの両端をそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断した断片を、同様にこれら２つの制限酵素で切断したｐＥＴ９ａプラスミドにライゲーション反応によって組み込んだ後、大腸菌ＤＨ－５αコンピテントセルに取り込ませて形質転換した。カナマイシン存在下で当該大腸菌を培養してＰＮ－３２の発現プラスミド（ｐＥＴ９ａ・ＰＮ－３２）を精製した。
　斯くして得たｐＥＴ９ａ・ＰＮ－３２の核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。
＜ＰＮ－３２改変体発現プラスミドの製造＞
　また、配列番号２に示すアミノ酸配列において、表１に示すアミノ酸置換が導入されたＰＮ－３２改変体の発現プラスミドを以下の手法で製造した。
　ｐＥＴ９ａ・ＰＮ－３２を鋳型とし、目的のアミノ酸置換１個を有するように設計して合成したオリゴヌクレオチドＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲにより、目的の改変体をコードする２本鎖ＤＮＡを調製し、ｐＥＴ９ａ・ＰＮ－３２の作製の場合と同様に制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断してｐＥＴ９ａプラスミドにライゲーション反応によって組み込み、アミノ酸置換１個を有するＰＮ－３２改変体の発現プラスミドを得た。また、アミノ酸置換１個を有する改変体の発現プラスミドを鋳型として、前記と同様の操作を行い、アミノ酸置換２個を有するＰＮ－３２改変体の発現プラスミドを作成した。
　斯くして得たＰＮ－３２改変体の発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。
＜ＰＮ－３２及びその改変体の製造＞
　前記で得られたＰＮ－３２及びその改変体の各発現プラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することにより、ＰＮ－３２及びその改変体の各発現株を得た。
　ＰＮ－３２及びその改変体の各発現大腸菌株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養した。得られた種培養液を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的のＰＮ－３２及びその改変体を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に、回収した大腸菌を５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によってＰＮ－３２及びその改変体を上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてドデシル硫酸ナトリウム－１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供したところ、目的通りのＰＮ－３２及びその改変体が生産されていることが確認できた。
　ＰＮ－３２及びその改変体の各発現大腸菌株の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整したのちに、陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライした。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配によりカラムからタンパク質を溶出した。溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認したところ、ＰＮ－３２及びその改変体は０．１～０．２Ｍ ＮａＣｌ間に溶出していた。次に、ＰＮ－３２及びその改変体を含む各溶出液のｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にてＰＮ－３２及びその改変体を分離した。各分離液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、ＰＮ－３２及びその改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
２．単ドメイン型ポリペプチドのゲル担体への固定化
　精製したＰＮ－３２及びその改変体をホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、ＰＮ－３２及びその改変体の全てにおいて固定化効率が９０％以上であった。
３．イムノグロブリン結合活性の測定
　ＰＮ－３２及びその改変体が固定化されている各ゲル担体をＰＢＳで洗浄後、４０ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ（日本血液製剤機構より入手）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．５）を加えて1時間振とうした後に、ゲル担体をＰＢＳ（ｐＨ７．５）で洗浄した。次いで、ゲル担体から０．１Ｍ　グリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．８）でゲル担体に結合したヒトＩｇＧを溶出した。その溶出液を分光光度計にて２８０ｎｍの吸収を測定し、１３．８（１ｇ-1ｃｍ-1）の比吸光係数をもとに結合したＩｇＧ量（ＩｇＧ結合量）を求めた。
４．アルカリ処理後の残存活性の測定
　ＰＮ－３２及びその改変体が固定化されている各ゲル担体をＰＢＳで洗浄後、更に０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて６８時間保存した（アルカリ処理）。次いで、ＰＢＳで３回洗浄した後に、前記と同条件でイムノグロブリン結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときのアルカリ処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合を「アルカリ処理後の残存活性（％）」として求めた。
５．弱酸性での溶出率の測定
　ＰＮ－３２及びその改変体が固定化されている各ゲル担体をＰＢＳで洗浄後、４０ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＩｇＧ（日本血液製剤機構より入手）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．５）を加えて1時間振とうした後に、ゲル担体をＰＢＳ（ｐＨ７．５）で洗浄した。次いで、０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．０）を用いて、ゲル担体に結合しているヒトＩｇＧを溶出させた。続いて、０．１Ｍグリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．８）を用いて、ゲル担体に結合して残存しているヒトＩｇＧを溶出させた。ｐＨ４．０で溶出させた溶出液と、ｐＨ２．８で溶出させた溶出液を分光光度計にて２８０ｎｍの吸収を測定し、１３．８（１ｇ-1ｃｍ-1）の比吸光係数をもとに各溶出液に含まれるＩｇＧ量を求めた。ｐＨ４．０で溶出させた溶出液のヒトＩｇＧ量とｐＨ２．８で溶出させた溶出液のヒトＩｇＧ量との合計量を１００％として、ｐＨ４．０で溶出させた溶出液のヒトＩｇＧ量の割合を「弱酸性での溶出率（％）」として求めた。
６．結果
　結果を表１に示す。この結果、ＰＮ－３２（配列番号２）において、４１位のセリンが疎水性側鎖を有するアミノ酸（バリン、フェニルアラニン）、ヒスチジン又はチロシンに置換されている改変体では、アルカリ処理後の残存活性がＰＮ－３２の１．１倍以上であり、弱酸性での溶出率がＰＮ－３２の１．２倍以上と向上することが見出された。これらの２つの効果を併せ持つ単変異改変部位は４１位だけであった。
　９位のグルタミンが疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、又はイソロイシン）に置換され、且つ４１位のセリンが疎水性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン）、チロシン、又はヒスチジンに置換されている改変体では、４１位の単変異改変体よりも更にアルカリ処理後の残存活性が高く、弱酸性での溶出率がＰＮ－３２よりも飛躍的に向上することが確認された。４１位のセリンをアラニン又はロイシンに置換した改変体は、更に９位のグルタミンを疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換することによりアルカリ処理後の残存活性が高く、弱酸性での溶出率が単変異置換体よりも飛躍的に向上していた。なお、９位のグルタミンをフェニルアラニンに置換、且つ４１位のセリンを疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン、又はヒスチジンに置換された改変体では、アルカリ処理後の残存活性は４１位のみを置換した改変体と比べて高くならなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
試験例２：単ドメイン型ポリペプチドの製造と評価（２）
１．単ドメイン型ポリペプチドの製造
　ＰＮ－３２（配列番号２）において、表２に示すアミノ酸置換が導入されたＰＮ－３２改変体の発現プラスミドを、前記試験例１と同様の手法で製造した。
　斯くして得たＰＮ－３２改変体の発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。
＜ＰＮ－３２の改変体の製造＞
　前記で得られたＰＮ－３２の改変体の各発現プラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することにより、ＰＮ－３２及びその改変体の各発現株を得た。
　ＰＮ－３２の改変体の各発現大腸菌株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養した。得られた種培養液を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的のＰＮ－３２及びその改変体を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に、回収した大腸菌を５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によってＰＮ－３２の改変体を上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてドデシル硫酸ナトリウム－１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供したところ、目的通りのＰＮ－３２の改変体が生産されていることが確認できた。
　ＰＮ－３２の改変体の各発現大腸菌株の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整したのちに、陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライした。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配によりカラムからタンパク質を溶出した。溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認したところ、ＰＮ－３２の改変体は０．１～０．２Ｍ ＮａＣｌ間に溶出していた
。次に、ＰＮ－３２の改変体を含む各溶出液のｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にてＰＮ－３２の改変体を分離した。各分離液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、ＰＮ－３２の改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
２．単ドメイン型ポリペプチドのゲル担体への固定化
　精製したＰＮ－３２の改変体をホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、ＰＮ－３２の改変体の全てにおいて固定化効率が９０％以上であった。
３．イムノグロブリン結合活性の測定
　ＰＮ－３２及びその改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、前記試験例１と同条件でＩｇＧ結合量を求めた。
４．アルカリ処理後の残存活性の測定
　ＰＮ－３２の改変体が固定化されている各ゲル担体をＰＢＳで洗浄後、更に０．５Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて１７時間保存した（アルカリ処理）。次いで、ＰＢＳで３回洗浄した後に、前記と同条件でイムノグロブリン結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときのアルカリ処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合を「アルカリ処理後の残存活性（％）」として求めた。
５．弱酸性での溶出率の測定
　ＰＮ－３２及びその改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、前記試験例１と同条件で弱酸性での溶出率を求めた。
６．結果
　結果を表２に示す。この結果からも、ＰＮ－３２（配列番号２）において、９位が疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸に置換、４１位が疎水性側鎖を有するアミノ酸に置換、且つ１１位がアラニンに置換されている改変体においても、アルカリ処理後の残存活性がＰＮ－３２の１．４９倍以上であり、弱酸性での溶出率がＰＮ－３２よりも１．２７倍と飛躍的に向上することが確認された。更に、ＰＮ－３２（配列番号２）において、９位が疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸に置換、４１位が疎水性側鎖を有するアミノ酸に置換、１５位がアラニンに置換され、且つ１１位がアルギニンに置換されている改変体では、アルカリ安定性の向上と共に弱酸性での溶出率を更に向上させることができた。また、９位が未置換、１５位がアラニン又はヒスチジンに置換、２４位がグルタミンに置換、且つ４１位が疎水性側鎖を有するアミノ酸に置換されている改変体においても、アルカリ処理後の残存活性がＰＮ－３２の１．４０倍以上であり、弱酸性での溶出率がＰＮ－３２よりも１．４０倍と飛躍的に向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
試験例３：単ドメイン型ポリペプチドの製造と評価（３）
１．単ドメイン型ポリペプチドの製造
　プロテインＡのＣドメインを改変した単ドメイン型ポリペプチドを製造した。具体的な製造方法は、以下の通りである。
＜ＰＮ－１２８発現プラスミドの製造＞
　配列番号２に示すアミノ酸配列において、７位のスレオニンがグルタミン酸に置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＮ－１２８と命名した。ＰＮ－１２８の発現プラスミドを前記試験例１と同様の手法で製造した。
　斯くして得たＰＮ－１２８の発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。
＜ＰＮ－１２８改変体発現プラスミドの製造＞
　また、配列番号２に示すアミノ酸配列において、表３に示すアミノ酸置換が導入されたＰＮ－１２８改変体の発現プラスミドを前記試験例１と同様の手法で製造した。
　斯くして得たＰＮ－１２８改変体の発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。
＜ＰＮ－１２８及びその改変体の製造＞
　前記で得られたＰＮ－１２８及びその改変体の各発現プラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することにより、ＰＮ－３２及びその改変体の各発現株を得た。
　ＰＮ－１２８及びその改変体の各発現大腸菌株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養した。得られた種培養液を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的のＰＮ－１２８及びその改変体を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に、回収した大腸菌を５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によってＰＮ－３２及びその改変体を上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてドデシル硫酸ナトリウム－１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供したところ、目的通りのＰＮ－１２８及びその改変体が生産されていることが確認できた。
　ＰＮ－１２８及びその改変体の各発現大腸菌株の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整したのちに、陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライした。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配によりカラムからタンパク質を溶出した。溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認したところ、ＰＮ－１２８及びその改変体は０．１～０．２Ｍ ＮａＣｌ間に溶出していた。次に、ＰＮ－１２８及びその改変体を含む各溶出液のｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にてＰＮ－１２８及びその改変体を分離した。各分離液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、ＰＮ－１２８及びその改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
２．単ドメイン型ポリペプチドのゲル担体への固定化
　精製したＰＮ－１２８及びその改変体をホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、Ｎ－１２８及びその改変体の全てにおいて固定化効率が９０％以上であった。
３．イムノグロブリン結合活性の測定
　ＰＮ－１２８及びその改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、前記試験例１と同条件でＩｇＧ結合量を求めた。
４．アルカリ処理後の残存活性の測定
　ＰＮ－１２８及びその改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、前記試験例２と同条件でアルカリ処理後の残存活性を求めた。
５．弱酸性での溶出率の測定
　ＰＮ－１２８及びその改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、前記試験例１と同条件で弱酸性での溶出率を求めた。
６．結果
　結果を表３に示す。この結果、ＰＮ－１２８（配列番号２に示すアミノ酸配列において７位がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列）において、９位が疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸に、４１位が疎水性側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換されていることに加え、（ｉ）１１位を疎水性側鎖を有するアミノ酸への置換、（ｉｉ）１５位を疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン、又はヒスチジンへの置換、（ｉｉｉ）２４位をアラニン、グルタミン又はヒスチジンへの置換のいずれか少なくとも１つを有する改変体では、アルカリ処理後の残存活性がＰＮ－１２８と同等以上であり、弱酸性での溶出率がＰＮ－１２８よりも飛躍的に向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
試験例４：複ドメイン型ポリペプチドの製造と評価
１．複ドメイン型ポリペプチドの製造
　プロテインＡのＣドメインの改変配列を６個有する複ドメイン型ポリペプチドを製造した。具体的な製造方法は、以下の通りである。
＜ＰＮ－６２１発現プラスミドの製造＞
　Ｎ末端側から、配列番号３に示すアミノ酸配列（配列α）５個、及び配列番号２に示すアミノ酸配列（配列β）１個がこの順に直接連結されているアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＮ－６２１と命名した。ＰＮ－６２１の発現プラスミドは特許文献３に記載の方法で製造した。
　斯くして得たＰＮ－６２１の発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。
＜ＰＮ－６２１発改変体発現プラスミドの製造＞
　表４に示すアミノ酸配列を有する置換が導入されたＰＮ－６２１改変体の発現プラスミドを、前記試験例１及び特許文献３に記載の手法を用いて製造した。
　斯くして得たＰＮ－６２１改変体の発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。
＜ＰＮ－６２１及びその改変体の製造＞
　前記で得られたＰＮ－６２１及びその改変体の各発現プラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することにより、ＰＮ－６２１及びその改変体の各発現株を得た。
　ＰＮ－６２１及びその改変体の各発現大腸菌株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養した。得られた種培養液を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的のＰＮ－６２１及びその改変体を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に、回収した大腸菌を５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によってＰＮ－６２１及びその改変体を上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてドデシル硫酸ナトリウム－１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供したところ、目的通りのＰＮ－６２１及びその改変体が生産されていることが確認できた。
　ＰＮ－６２１及びその改変体の各発現大腸菌株の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整したのちに、陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライした。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配によりカラムからタンパク質を溶出した。ＰＮ－６２１及びその改変体が含まれる各溶出液のｐＨを８に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にてＰＮ－６２１及びその改変体を分離した。各分離液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、ＰＮ－６２１及びその改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
２．複ドメイン型ポリペプチドのゲル担体への固定化
　精製したＰＮ－６２１及びその改変体をホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、Ｎ－６２１及びその改変体の全てにおいて固定化効率が９０％以上であった。
３．イムノグロブリン結合活性の測定
　ＰＮ－６２１及びその改変体が固定化されている各ゲル担体０．５ｍＬ量をＴｒｉｃｏｒｎ５／２０カラム（ＧＥヘルスケア株式会社）にパッキングした。液体クロマトグラフィ装置ＡＫＴＡ　ｐｕｒｅ２５（ＧＥヘルスケア株式会社）にセットし、ＰＢＳでカラムを平衡化後、３ｍｇ／ｍＬ濃度のヒトポリクローナルＩｇＧ（日本血液製剤機構より入手）溶液を滞留時間５分の流速で流した。カラム通過液の２８０ｎｍにおける吸光度をモニターし、通過液中のＩｇＧ濃度が、使用したＩｇＧ溶液の１０％濃度に達した時点での添加ＩｇＧ量を求めた。この値から、下記式に従ってゲル１ｍＬ当たりのＩｇＧ動的結合量(mg/mL gel)を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
４．アルカリ処理後の残存活性の測定
　ＰＮ－６２１及びその改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、前記試験例２と同条件でアルカリ処理後の残存活性を求めた。
５．弱酸性での溶出率の測定
　ＰＮ－６２１及びその改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、前記試験例１と同条件で弱酸性での溶出率を求めた。
６．結果
　結果を表４に示す。この結果、配列番号２又は３において、４１位が疎水性側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換されているアミノ酸配列を複数有する複ドメイン型ポリペプチド；９位が疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換され、且つ４１位が疎水性側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換されているアミノ酸配列を複数有する複ドメイン型ポリペプチド；並びに、９位が未置換で１５位がヒスチジンに置換、２４位がグルタミンに置換され、且つ４１位がヒスチジンに置換されているアミノ酸配列を複数有する複ドメイン型ポリペプチドでも、アルカリ処理後の残存活性、及び弱酸性でのＩｇＧ溶出能が高いことが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＃１　表４中に示す配列α、配列β、配列α１～１２、及び配列β１～１０は、以下の通りである。
配列α：配列番号３に示すアミノ酸配列
配列β：配列番号２に示すアミノ酸配列
配列α１：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7R/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β１：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7R/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α２：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7R/Q9V/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β２：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7R/Q9V/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α３：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4V/T7E/Q9L/E15H/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β３：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4V/T7E/Q9L/E15H/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α４：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/N11H/E15L/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β４：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/N11H/E15L/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α５：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9A/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β５：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9A/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α６：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9V/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β６：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9V/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α７：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9H/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β７：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9H/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α８：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7R/Q9V/N11A/E15H/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β８：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7R/Q9V/N11A/E15H/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α９：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9V/N11A/E15A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β９：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9V/N11A/E15A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α１０：配列番号３に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9L/N11H/E15L/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列β１０：配列番号２に示すアミノ酸配列において、A4I/T7E/Q9L/N11H/E15L/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α１１：配列番号３に示すアミノ酸配列において、N3D/A4A/N6D/T7V/Q9A/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α１２：配列番号３に示すアミノ酸配列において、N3D/A4A/N6D/T7E/Q9V/N11A/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α１３：配列番号３に示すアミノ酸配列において、N3V/A4A/N6Q/T7V/Q9I/N11Q/S41Vのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
配列α１４：配列番号３に示すアミノ酸配列において、N3D/A4V/N6Q/T7V/N11Q/E15H/E24Q/S41Hのアミノ酸置換が導入されているアミノ酸配列
試験例５：ｐＨ勾配によるＩｇＧ溶出プロファイル
　実施例５６（PN-621改変体）及び比較例５０（ＰＮ－６２１）の各複ドメイン型ポリペプチドを固定化したゲル担体をパッキングしたカラムに、ヒトポリクローナルＩｇＧ（日本血液製剤機構より入手）を注入し結合させた。次いで、ｐＨ７．２の０．１Ｍ　クエン酸バッファーとｐＨ２．３の０．１Ｍ　クエン酸バッファーを用いて直線的ｐＨ勾配をかけてヒトＩｇＧを溶出させ、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。
　結果を図１に示す。図１中、（Ａ）には実施例５６（PN-621改変体）を使用した結果を示し、（Ｂ）には比較例５０（ＰＮ－６２１）を使用した結果を示す。実施例５６の複ドメイン型ポリペプチドを固定化したゲル担体ではｐＨ４．０２でヒトＩｇＧは溶出した。一方、比較例５０（ＰＮ－６２１）の複ドメイン型ポリペプチドを固定化したゲル担体ではヒトＩｇＧはｐＨ３．１９で溶出した。これらの結果から、本発明のプロテインＡ改変体は弱酸性条件のより高いｐＨ値でＩｇＧを精製できることが明らかである。
試験例６：野生型単ドメインポリペプチド及びその改変体の製造と評価
１．野生型、単変異型、及び２変異型の単ドメインポリペプチドの製造
　プロテインＡの５つの各ドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）の野生型単ドメインポリペプチド、及びこれらの改変体の発現プラスミドを作製した。具体的には、野生型ドメインＡ（配列番号４）、野生型ドメインＢ（配列番号７）、野生型ドメインＣ（配列番号１）、野生型ドメインＤ（配列番号１０）、野生型ドメインＥ（配列番号１３）、これらの各野生型ドメインの４１位をヒスチジンに置換した単変異改変体、並びにこれらの各野生型ドメインの９位をロイシン及び４１位をヒスチジンに置換した２変異改変体の発現プラスミドを前記試験例１と同様の手法で製造した。なお、これらの野生型ドメイン及びその改変体には、ゲル担体に固定化に利用できるように、Ｃ末端に５個のリジンを連結した配列とした。
　野生型単ドメインポリペプチド、及びこれらの改変体の発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。
＜ドメイン改変体の製造＞
　前記で得られた各発現プラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することにより、各野生型単ドメインポリペプチド、及びこれらの改変体の各発現株を得た。
　前記で得られた各発現大腸菌株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養した。得られた種培養液を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的の各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に、回収した大腸菌を５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によって各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体を上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてドデシル硫酸ナトリウム－１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供したところ、目的通りの各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体が生産されていることが確認できた。
　前記で得られた各発現大腸菌株の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整したのちに、陽イオン交換体ＳＰ－セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライした。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線
的濃度勾配によりカラムからタンパク質を溶出した。溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認したところ、各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体は０．１から０．２ＭＮａＣｌ間に溶出していた。次に、各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体を含む各溶出液のｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にて各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体を分離した。各分離液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
２．単ドメイン型ポリペプチドのゲル担体への固定化
　精製した各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体をホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体の全てにおいて固定化効率が９０％以上であった。
３．イムノグロブリン結合活性の測定
　各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、前記試験例１と同条件でＩｇＧ結合量を求めた。
４．アルカリ処理後の残存活性の測定
　各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体が固定化されている各ゲル担体をＰＢＳで洗浄後、更に０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて、６時間、１７時間、又は６８時間保存した（アルカリ処理）。次いで、ＰＢＳで３回洗浄した後に、前記と同条件でイムノグロブリン結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときのアルカリ処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合を「アルカリ処理後の残存活性（％）」として求めた。
５．弱酸性での溶出率の測定
　各野生型単ドメインポリペプチド及びこれらの改変体が固定化されている各ゲル担体を用いて、ＩｇＧの溶出に０．１Ｍ　クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）を用いたこと以外は前記試験例１と同条件で弱酸性での溶出率を求めた。
６．結果
　結果を表５及び６に示す。この結果から、プロテインＡの５つのドメインにおいて、４１位をヒスチジンに置換した単変異改変体、並びに９位をロイシン且つ４１位をヒスチジンに置換した２変異改変体は、アルカリ処理後の残存活性が野生型よりも同等以上となり、弱酸性での溶出率もそれぞれ向上することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009

Claims (14)

  1. 　下記(A)～(C)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチド。
    (A)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、以下の(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン：
    (i)４１位のセリンが、疎水性側鎖を有するアミノ酸、チロシン、又はヒスチジンに置換。
    (ii)９位のグルタミンが、未置換、或は疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換。
    (iii)１５位のグルタミン酸又はグルタミンが、未置換、或はアラニン、ヒスチジン、チロシン又はロイシンに置換。
    (iv)２４位のグルタミン酸又はアラニンが、未置換、配列番号１～１２の場合はグルタミン、ヒスチジン又はアラニンに置換、或は配列番号１３～１５の場合はグルタミン又はヒスチジンに置換。
    (B)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されており、当該改変がなされていない部位のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入及び／又は欠失されてなり、且つ、対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、アルカリ安定性が同等以上、且つ弱酸性領域でのＩｇＧ溶出能が高いイムノグロブリン結合ドメイン。
    (C)配列番号１～１５のいずれかに示すアミノ酸配列において、前記(i)～(iv)の条件を満たす改変が導入されており、対応する未改変のアミノ酸配列に対する、当該改変がなされていない部位の配列同一性が８０％以上であり、対応する未改変のアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較して、アルカリ安定性が同等以上、且つ弱酸性領域でのＩｇＧ溶出能が高いイムノグロブリン結合ドメイン。
  2. 　前記(A)～(C)に示すイムノグロブリン結合ドメインの中から選択される１個のイムノグロブリン結合ドメインが含まれる単ドメイン型ペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　前記(A)～(C)に示すイムノグロブリン結合ドメインから選択される２個以上のイムノグロブリン結合ドメインが連結されてなる複ドメイン型ペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 　前記アミノ酸配列において、９位のグルタミンが疎水性脂肪族側鎖を有するアミノ酸又はヒスチジンに置換されている、請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
  5. 　前記アミノ酸配列において、１５位のグルタミン酸又はグルタミンが、アラニン又はヒスチジンに置換され、且つ
    　配列番号１～１２の場合は２４位のグルタミン酸がグルタミン、又は配列番号１３～１５の場合は２４位のアラニンがグルタミンに置換されている、請求項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
  6. 　前記アミノ酸配列において、４１位のセリンが、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、又はヒスチジンに置換されている、請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
  7. 　前記アミノ酸配列において、９位のグルタミンが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、又はヒスチジンに置換されている、請求項１～６のいずれかに記載のポリペプチド。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
  9. 　請求項８に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
  10. 　請求項９に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
  11. 　請求項１０に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１～７のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
  12. 　請求項１～７のいずれかに記載のポリペプチドが不溶性担体に固定化されてなる、イムノグロブリン結合用担体。
  13. 　請求項１２に記載のイムノグロブリン結合用担体を用いて、イムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドの分離を行う、イムノグロブリン又はその断片の分離方法。
  14. 　前記イムノグロブリン結合用担体にイムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを一旦結合させた後に、ｐＨ３～５の条件でイムノグロブリン又はそのＦｃ領域を含有するポリペプチドを溶出させる、請求項１３に記載の分離方法。
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