CN116670150A

CN116670150A - 免疫球蛋白结合多肽

Info

Publication number: CN116670150A
Application number: CN202180084489.3A
Authority: CN
Inventors: 真岛英司; 岛厚志
Original assignee: PROTENOVA CO Ltd
Current assignee: PROTENOVA CO Ltd
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2023-08-29
Also published as: US20240043478A1; JPWO2022138718A1; WO2022138718A1; EP4269590A1

Abstract

本发明的目的在于提供一种多肽，其通过改变蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，碱稳定性优异，而且能够在弱酸性区域中洗脱暂时结合的免疫球蛋白或其片段。通过在蛋白A的各免疫球蛋白结合结构域中，将第41位的丝氨酸替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸，能够得到如下多肽：对免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽具有结合活性、碱稳定性优异、而且能够在弱酸性的温和的条件下有效率地洗脱暂时结合的免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽。

Description

免疫球蛋白结合多肽

技术领域

本发明涉及与免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽结合的多肽。更具体而言，本发明涉及对免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽具有结合活性，碱条件下的稳定性(碱稳定性)优异，而且能够在弱酸性区域有效率地洗脱暂时结合的免疫球蛋白或其片段的多肽。进一步地，本发明涉及该多肽的制造方法、该多肽的固定化物以及利用了该多肽的免疫球蛋白或其片段的分离方法等。

背景技术

以往，免疫球蛋白(也称为抗体)对靶物质的结合特异性高，作为研究用试剂或临床检查试剂被广泛利用。另外，近年来，通过基因重组技术的进步，确立人抗体或人源化抗体的制作技术，免疫球蛋白作为抗体药物在风湿或癌等医疗领域中已经实现了实用化。

免疫球蛋白主要通过动物细胞培养而制造，在其纯化中广泛利用使用了具有免疫球蛋白结合能力的配体的亲和色谱。在利用于免疫球蛋白的纯化的亲和色谱中，作为与免疫球蛋白特异性地结合的配体，可以用蛋白A、蛋白L、蛋白G等多肽或这些的免疫球蛋白结合结构域。

另一方面，近年来，要求提高免疫球蛋白的纯化所使用的配体的稳定性。尤其是，在免疫球蛋白的纯化中，为了病毒等的失活、固定化有配体的载体的洗涤等而使用碱溶液，在免疫球蛋白的纯化所使用的配体中，对于碱具备高稳定性成为1个重要的要素。

以往，关于提高蛋白A的碱稳定性的技术，正在深入地进行研究。例如，专利文献1中报道有：通过替换蛋白A的C结构域的特定氨基酸或蛋白A的Z结构域的特定氨基酸残基，可具备优异的免疫球蛋白结合能力以及碱稳定性。另外，专利文献2中报道有：通过将蛋白A的天冬酰胺残基替换为其他氨基酸，可具备碱稳定性。

另一方面，在使与蛋白A或其免疫球蛋白结合结构域结合的免疫球蛋白洗脱时，通常使用强酸性(pH3以下左右)的洗脱液。使用这样的强酸性的洗脱液时，有时会导致免疫球蛋白的变性或与其相伴的凝集体形成。因此，希望开发一种能够在弱酸性的温和的条件下洗脱暂时结合的免疫球蛋白的免疫球蛋白结合多肽。

如上所述，关于蛋白A以及其免疫球蛋白结合结构域，虽然报道了各种赋予碱稳定性的技术，但目前还没有对在弱酸性区域有效率地洗脱暂时结合的免疫球蛋白或其片段的技术进行充分的研究。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开号第2007/097361号

专利文献2：国际公开第2000/023580号

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于，提供一种多肽，其通过改变蛋白A的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列，碱稳定性优异，而且能够在弱酸性区域洗脱暂时结合的免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽。

用于解决问题的技术方案

本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过在蛋白A的各免疫球蛋白结合结构域中，将第41位的丝氨酸被替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸，可得到对免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽具有结合活性、碱稳定性优异，而且能够在弱酸性的温和的条件下有效率地洗脱暂时结合的免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的多肽。进一步发现，通过除了上述第41位的替换以外，还将第9位的谷氨酰胺被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸，或者将第15位的谷氨酸被替换为丙氨酸或组氨酸且将第24位的谷氨酸或丙氨酸替换为谷氨酰胺，能够更进一步提高碱稳定性以及在弱酸性区域的洗脱性。本发明是基于上述的见解进一步反复研究而完成的。

即，本发明提供下述列举的方式的发明。

项1.一种多肽，其包含至少一个下述(A)～(C)的任一个所示的免疫球蛋白结合结构域：

(A)免疫球蛋白结合结构域，其包含在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中导入了满足以下(i)～(iv)的条件的改变的氨基酸序列：

(i)第41位的丝氨酸被替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸，

(ii)第9位的谷氨酰胺未被替换或者被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸，

(iii)第15位的谷氨酸或谷氨酰胺未被替换或者被替换为丙氨酸、组氨酸、酪氨酸或亮氨酸，

(iv)第24位的谷氨酸或丙氨酸未被替换，或者在序列号1～12的情况下被替换为谷氨酰胺、组氨酸或丙氨酸，或者在序列号13～15的情况下被替换为谷氨酰胺或组氨酸；

(B)免疫球蛋白结合结构域，其是在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中，导入了满足上述(i)～(iv)的条件的改变，未进行该改变的部位的氨基酸的1个或多个被替换、添加、插入和/或缺失而成的，并且，与包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽相比，碱稳定性为同等以上，并且在弱酸性区域的IgG洗脱能力高；

(C)免疫球蛋白结合结构域，其在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中，导入了满足上述(i)～(iv)的条件的改变，未进行该改变相对于对应的未改变的氨基酸序列的部位的序列一致性为80％以上，所述免疫球蛋白结合结构域与包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽相比，碱稳定性为同等以上，并且在弱酸性区域的IgG洗脱能力高。

项2.根据项1所述的多肽，其中，所述多肽为包含选自所述(A)～(C)所示的免疫球蛋白结合结构域中的1个免疫球蛋白结合结构域的单结构域型肽。

项3.根据项1所述的多肽，其中，所述多肽为选自所述(A)～(C)所示的免疫球蛋白结合结构域中的2个以上的免疫球蛋白结合结构域连结而成的多结构域型肽。

项4.根据项1～3中任一项所述的多肽，其中，在所述氨基酸序列中，第9位的谷氨酰胺被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸。

项5.根据项1～4中任一项所述的多肽，其中，在所述氨基酸序列中，第15位的谷氨酸或谷氨酰胺被替换为丙氨酸或组氨酸，并且，

在序列号1～12的情况下，第24位的谷氨酸被替换为谷氨酰胺，或在序列号13～15的情况下，第24位的丙氨酸被替换为谷氨酰胺。

项6.根据项1～5中任一项所述的多肽，其中，在所述氨基酸序列中，第41位的丝氨酸被替换为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸。

项7.根据项1～6中任一项所述的多肽，其中，在所述氨基酸序列中，第9位的谷氨酰胺被替换为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或组氨酸。

项8.一种DNA，其编码项1～7中任一项所述的多肽。

项9.一种重组载体，其包含项8所述的DNA。

项10.一种转化体，其是用项9所述的重组载体转化宿主而得到的。

项11.项1～7中任一项所述的多肽的制造方法，其包含对项10所述的转化体进行培养的工序。

项12.一种免疫球蛋白结合用载体，其是项1～7中任一项所述的多肽被固定化于不溶性载体而成的。

项13.一种免疫球蛋白或其片段的分离方法，其中，使用项12所述的免疫球蛋白结合用载体进行免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的分离。

项14.根据项13所述的分离方法，其中，在所述免疫球蛋白结合用载体上暂时结合免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽后，在pH3～5的条件下洗脱免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽。

发明效果

本发明的多肽对免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽具有结合能力，即使在碱条件下暴露，也能够维持对免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的结合能力，因此即使反复进行利用碱性溶液的洗脱或洗涤，也可以抑制对免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的结合能力的降低。另外，本发明的多肽能够在弱酸性(pH3～5左右)的温和的条件下有效率地洗脱暂时结合的免疫球蛋白或其片段，因此能够抑制分离的免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的变性。

附图说明

图1是用实施例56(PN-621改变体)以及比较例50(PN-621)的各多结构域型多肽测定根据pH梯度的IgG洗脱曲线的结果。图1中，(A)是实施例56(PN-621改变体)的结果，(B)是比较例50(PN-621)的结果。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。应予说明，在序列表以外，氨基酸序列中的20种氨基酸残基有时用一个文字缩写来表达。即，甘氨酸(Gly)是G，丙氨酸(Ala)是A，缬氨酸(Val)是V，亮氨酸(Leu)是L，异亮氨酸(Ile)是I，苯丙氨酸(Phe)是F，酪氨酸(Tyr)是Y，色氨酸(Trp)是W，丝氨酸(Ser)是S，苏氨酸(Thr)是T，半胱氨酸(Cys)是C，甲硫氨酸(Met)是M，天冬氨酸(Asp)是D，谷氨酸(Glu)是E，天冬酰胺(Asn)是N，谷氨酰胺(Gln)是Q，赖氨酸(Lys)是K，精氨酸(Arg)是R，组氨酸(His)是H，脯氨酸(Pro)是P。

在本说明书中，“Q9V”、“Q9V/S41V”等表达是氨基酸替换的标记。例如“Q9V”是指，某特定氨基酸序列中的N末端侧起第9位的谷氨酰胺被替换为缬氨酸。另外，例如，“Q9V/S41V”是指，某特定氨基酸序列中的N末端侧起第9位的谷氨酰胺被替换为缬氨酸，并且N末端侧起第41位的丝氨酸被替换为缬氨酸。

在本说明书中，“具有疏水性侧链的氨基酸”中包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸。另外，在本说明书中，“具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸”包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸以及甲硫氨酸。

1.多肽

作为本发明的多肽的一方式，可以举出包含至少一个下述(A)所示的免疫球蛋白结合结构域的多肽。

(A)包含在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中导入了满足以下(i)～(iv)条件的改变的氨基酸序列的免疫球蛋白结合结构域：

(i)第41位的丝氨酸被替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸。

(ii)第9位的谷氨酰胺未被替换，或者被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸。

(iii)第15位的谷氨酸或谷氨酰胺未被替换，或者被替换为丙氨酸、组氨酸、酪氨酸或亮氨酸。

(iv)第24位的谷氨酸或丙氨酸未被替换，或者在序列号1～12的情况下被替换为谷氨酰胺、组氨酸或丙氨酸，或者在序列号13～15的情况下被替换为谷氨酰胺或组氨酸。

序列号1～15所示的各氨基酸序列是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的蛋白A的野生型免疫球蛋白结合结构域(A、B、C、D、E)以及其改变体的氨基酸序列。

具体而言，序列号1是野生型C结构域，序列号2以及3是C结构域的改变体，序列号4是野生型A结构域，序列号5以及6是A结构域的改变体，序列号7是野生型B结构域，序列号8以及9是B结构域的改变体，序列号10是野生型D结构域，序列号11以及12是D结构域的改变体，序列号13是野生型E结构域，序列号14以及15是E结构域的改变体。

序列号2所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型C结构域的氨基酸序列(序列号1)中，第4位的赖氨酸被替换为丙氨酸，第7位的赖氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第40位的缬氨酸被替换为赖氨酸，第43位的谷氨酸被替换为赖氨酸，第46位的丙氨酸被替换为赖氨酸，以及第53位的天冬氨酸被替换为赖氨酸。在序列号2所示的氨基酸序列中，通过在第40位、第43位、第46位以及第53位导入赖氨酸，第40位以后的序列变得富含赖氨酸，容易固定化于载体上。

序列号3所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型C结构域的氨基酸序列(序列号1)中，第4位的赖氨酸被替换为丙氨酸，第7位的赖氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第42位的赖氨酸被替换为丙氨酸，第49位的赖氨酸被替换为精氨酸，第50位的赖氨酸被替换为精氨酸，以及第58位的赖氨酸被替换为精氨酸。

序列号5所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型A结构域的氨基酸序列(序列号4)中，第4位的天冬酰胺被替换为丙氨酸，第7位的赖氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第40位的谷氨酰胺被替换为赖氨酸，第43位的天冬酰胺被替换为赖氨酸，第46位的丝氨酸被替换为赖氨酸，以及第53位的谷氨酸被替换为赖氨酸。在序列号5所示的氨基酸序列中，通过在第40位、第43位、第46位以及第53位导入赖氨酸，第40位以后的序列变得富含赖氨酸，容易固定化于载体上。

序列号6所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型A结构域的氨基酸序列(序列号4)中，第4位的天冬酰胺被替换为丙氨酸，第7位的赖氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第49位的赖氨酸被替换为精氨酸，第50位的赖氨酸被替换为精氨酸，以及第58位的赖氨酸被替换为精氨酸。

序列号8所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型B结构域的氨基酸序列(序列号7)中，第4位的赖氨酸被替换为丙氨酸，第7位的赖氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第40位的谷氨酰胺被替换为赖氨酸，第43位的天冬酰胺被替换为赖氨酸，第46位的丙氨酸被替换为赖氨酸，以及第53位的天冬氨酸被替换为赖氨酸。在序列号8所示的氨基酸序列中，通过在第40位、第43位、第46位以及第53位导入赖氨酸，第40位以后的序列变得富含赖氨酸，容易固定化于载体上。

序列号9所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型B结构域的氨基酸序列(序列号7)中，第4位的赖氨酸被替换为丙氨酸，第7位的赖氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第49位的赖氨酸被替换为精氨酸，第50位的赖氨酸被替换为精氨酸，以及第58位的赖氨酸被替换为精氨酸。

序列号11所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型D结构域的氨基酸序列(序列号10)中，第4位的天冬酰胺被替换为丙氨酸，第7位的赖氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第40位的谷氨酰胺被替换为赖氨酸，第43位的天冬酰胺被替换为赖氨酸，第46位的甘氨酸被替换为赖氨酸，以及第53位的谷氨酸被替换为赖氨酸。在序列号11所示的氨基酸序列中，通过在第40位、第43位、第46位以及第53位导入赖氨酸，第40位以后的序列变得富含赖氨酸，容易固定在载体上。

序列号12所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型D结构域的氨基酸序列(序列号10)中，第4位的天冬酰胺被替换为丙氨酸，第7位的赖氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第42位的苏氨酸被替换为丙氨酸，第49位的赖氨酸被替换为精氨酸，第50位的赖氨酸被替换为精氨酸，以及第58位的赖氨酸被替换为精氨酸。

序列号14所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型E结构域的氨基酸序列(序列号13)中，第4位的谷氨酰胺被替换为丙氨酸，第7位的谷氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第40位的谷氨酰胺被替换为赖氨酸，第43位的天冬酰胺被替换为赖氨酸，第46位的甘氨酸被替换为赖氨酸，以及第53位的天冬氨酸被替换为赖氨酸。在序列号14所示的氨基酸序列中，通过在第40位、第43位、第46位以及第53位导入赖氨酸，第40位以后的序列变得富含赖氨酸，容易固定化于载体上。

序列号15所示的氨基酸序列是如下的氨基酸序列：在野生型E结构域的氨基酸序列(序列号13)中，第4位的谷氨酰胺被替换为丙氨酸，第7位的谷氨酸被替换为苏氨酸，第35位的赖氨酸被替换为精氨酸，第49位的谷氨酰胺被替换为精氨酸，第50位的赖氨酸被替换为精氨酸，以及第58位的赖氨酸被替换为精氨酸。

蛋白A的免疫球蛋白结合结构域从N末端侧起存在第1α-螺旋、第2α-螺旋以及第3α-螺旋这3个α-螺旋。序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第41位的丝氨酸保存在全部的免疫球蛋白结合结构域(A～E)中，存在于免疫球蛋白结合结构域的3个α-螺旋内的第3α-螺旋，形成与第2α-螺旋的连结部，并且还与第1α-螺旋进行相互作用。通过将该第41位的丝氨酸替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸，可以提高免疫球蛋白结合结构域内的氨基酸间的疏水相互作用，提高碱稳定性。另外，第41位丝氨酸位于第1α-螺旋内的形成免疫球蛋白结合部位的第9位谷氨酰胺、第10位谷氨酰胺以及第11位天冬酰胺的α-螺旋结构的内侧，可以认为通过将该第41位的丝氨酸替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸，对这些形成的IgG结合结构产生影响。

序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第41位的丝氨酸被替换的氨基酸，只要被替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸即可，但优选举出丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸。

序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第9位的谷氨酰胺是IgG结合部位之一，通过与IgG的第254位丝氨酸形成氢键，有助于结合到IgG。序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第9位的谷氨酰胺可以未被替换，还可以被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸。在序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第9位的谷氨酰胺被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸的情况下，可以在进一步提高碱稳定性的同时，提高在弱酸性区域的洗脱性。虽然不希望进行限定性解释，但在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第41位和第9位的氨基酸位于空间上靠近的位置，因此可以类推，通过将序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第9位的谷氨酰胺替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸，利用存在于第41位的具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸与存在于第9位的具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸的相互作用，可以在进一步提高碱稳定性的同时，通过减少与IgG的相互结合来降低在弱酸性区域的结合活性。

作为序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第9位的谷氨酰胺被替换的氨基酸，优选举出丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或组氨酸，更优选举出丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或组氨酸。

序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第15位的谷氨酸或谷氨酰胺(在序列号1～12的情况下为谷氨酸，在序列号13～15的情况下为谷氨酰胺)可以未被替换，还可以被替换丙氨酸、组氨酸、酪氨酸或亮氨酸。另外，序列号1～12所示的各氨基酸序列中的第24位的谷氨酸可以未被替换，还可以被替换为谷氨酰胺、组氨酸或丙氨酸。另外，序列号13～15所示的各氨基酸序列中的第24位的丙氨酸可以未被替换，还可以被替换为谷氨酰胺或组氨酸。尤其是，在序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第15位的谷氨酸或谷氨酰胺被替换为丙氨酸或组氨酸并且第24位的谷氨酸或丙氨酸被替换为谷氨酰胺的情况下，可以进一步提高碱稳定性以及在弱酸性区域的洗脱性。

作为(A)的免疫球蛋白结合结构域的优选的一例，可以举出具有以下(1)～(5)所示的氨基酸序列的例子。

(1)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第9位、第15位以及第24位未被替换并且第41位被替换为缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸的氨基酸序列。

(2)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第15位以及第24位未被替换，第9位被替换为亮氨酸，并且第41位被替换为缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸或组氨酸的氨基酸序列。

(3)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第15位以及第24位未被替换，第9位被替换为缬氨酸，并且第41位被替换为亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸的氨基酸序列。

(4)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第15位以及第24位未被替换，第9位被替换为组氨酸，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(5)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第15位以及第24位未被替换，第9位被替换为丙氨酸，并且第41位被替换为苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸或组氨酸的氨基酸序列。

(6)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第15位以及第24位未被替换，第9位被替换为异亮氨酸，并且第41位的丝氨酸被替换为缬氨酸或丙氨酸的氨基酸序列。

(7)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第24位未被替换，第9位被替换为缬氨酸，第15位被替换为丙氨酸，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(8)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第24位未被替换，第9位被替换为亮氨酸或缬氨酸，第15位被替换为组氨酸，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(9)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第24位未被替换，第9位被替换为缬氨酸，第15位被替换为酪氨酸，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(10)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第24位未被替换，第9位未被替换或被替换为亮氨酸，第15位被替换为亮氨酸，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(10)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第9位未被替换，第15位被替换为丙氨酸或组氨酸，第24位被替换为谷氨酰胺，并且第41位被替换为缬氨酸或组氨酸的氨基酸序列。

(11)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第9位被替换为亮氨酸，第15位被替换为组氨酸，第24位被替换为谷氨酰胺，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(12)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第9位被替换为亮氨酸，第15位被替换为组氨酸或亮氨酸，第24位被替换为谷氨酰胺，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(13)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第15位未被替换，第9位被替换为亮氨酸，第24位被替换为组氨酸，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(14)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第9位被替换为亮氨酸，第15位被替换为组氨酸或亮氨酸，第24位被替换为组氨酸，并且第41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

(15)在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，第9位被替换为缬氨酸，第15位被替换为组氨酸或亮氨酸，第24位被替换为丙氨酸，并且41位被替换为缬氨酸的氨基酸序列。

另外，作为本发明的多肽的一方式，可以举出包含至少一个相当于下述(B)以及(C)的任一个的免疫球蛋白结合结构域的多肽。

(B)免疫球蛋白结合结构域，其是在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中，导入了满足上述(i)～(iv)的条件的改变，未进行该改变的部位的氨基酸的1个或多个被替换、添加、插入和/或缺失而成的，并且，与由包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽相比，碱稳定性为同等以上，并且在弱酸性区域的IgG洗脱能力高。

(C)免疫球蛋白结合结构域，其在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中，导入了满足上述(i)～(iv)的条件的改变，未进行该改变的部位相对于对应的未改变的氨基酸序列的序列一致性为80％以上，所述免疫球蛋白结合结构域与包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽相比，碱稳定性为同等以上，并且在弱酸性区域的IgG洗脱能力高。

上述(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域是上述(A)的免疫球蛋白结合结构域的改变体，导入到序列号1～15所示的氨基酸序列中的第9位、第15位、第24位以及第41位的氨基酸替换的方式、优选的氨基酸替换部位等与上述(A)的免疫球蛋白结合结构域的情况相同。

在上述(B)的免疫球蛋白结合结构域中，“未进行该改变的部位的氨基酸”是指，在序列号1～15所示的氨基酸序列中，除通过满足(i)～(iv)的条件的改变而被替换的氨基酸以外的氨基酸。例如，在通过满足上述(i)～(iv)的条件的改变，仅对第41位进行氨基酸替换，而对第9位、第15位以及第24位未进行氨基酸替换的情况下，除第41位以外的氨基酸相当于“未进行该改变的部位的氨基酸”。另外，例如，在通过满足上述(i)～(iv)的条件的改变，对第41位以及第9位进行氨基酸替换，而对第15位以及第24位未进行氨基酸替换的情况下，除第41位以及第9位以外的氨基酸相当于“未进行该改变的部位的氨基酸”。另外，例如，在通过满足上述(i)～(iv)的条件的改变，对第41位、第15位以及第24位进行氨基酸替换，而对第9位未进行氨基酸替换的情况下，除第41位、第15位以及24位以外的氨基酸相当于“未进行该改变的部位的氨基酸”。

在上述(B)的免疫球蛋白结合结构域中，导入的氨基酸的改变可以仅包括替换、添加、插入以及缺失中的1种改变(例如替换)，也可以包括2种以上的改变(例如，替换和插入)。在上述(B)的免疫球蛋白结合结构域中，被改变的氨基酸只要是1个或多个或者数个即可，例如可以举出1～13个，优选1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1或2个，或者1个。

在上述(C)的免疫球蛋白结合结构域中，“对应的未改变的氨基酸序列”是指作为基础的氨基酸序列，例如，如果是序列号1所示的氨基酸序列的改变的情况下，则是指序列号1所示的氨基酸序列。另外，在上述(C)的免疫球蛋白结合结构域中，“未进行该改变的部位的序列一致性”是指，将抽出除通过满足上述(i)～(iv)的条件的改变而被替换的氨基酸以外的氨基酸的氨基酸序列进行比较而算出的序列一致性。例如，在通过满足上述(i)～(iv)的条件的改变，仅对第41位进行氨基酸替换，而对第9位、第15位以及24位未进行氨基酸替换的情况下，将抽出除第41位以外的氨基酸的氨基酸序列(除去第41位的氨基酸序列)进行比较而算出的序列一致性相当于“未进行该改变的部位的序列一致性”。另外，例如，在通过满足上述(i)～(iv)的条件的改变，对第41位以及第9位进行氨基酸替换，而对第15位以及第24位未进行氨基酸替换的情况下，将抽出除第41位以及第9位以外的氨基酸的氨基酸序列(除去第41位以及第9位的氨基酸序列)进行比较而算出的序列一致性相当于“未进行该改变的部位的序列一致性”。另外，例如，在通过满足上述(i)～(iv)的条件的改变，对第41位、第15位以及第24位进行氨基酸替换，而对第9位未进行氨基酸替换的情况下，对抽出除第41位、第15位以及第24位以外的氨基酸的氨基酸序列(除去第41位、第15位以及第24位的氨基酸序列)进行比较而算出的序列一致性相当于“未进行该改变的部位的序列一致性”。另外，在上述(C)的免疫球蛋白结合结构域中，“序列一致性”表示通过BLAST PACKAGE[sgi32 bit edition，Version 2.0.12；available from National Center forBiotechnology Information(NCBI)]的bl2seq程序(Tatiana A.Tatsusova，ThomasL.Madden，FEMS Microbiol.Lett.,Vol.174,p247-250，1999)获得的氨基酸序列的一致性的值。参数设定为Gap insertion Cost value：11，Gap extension Cost value：1即可。

在上述(C)的免疫球蛋白结合结构域中，虽然序列一致性只要是80％以上即可，但可以举出优选85％以上，更优选90％以上，进一步优选95％以上。

另外，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的一方式，至少可以举出序列号1～12所示的各氨基酸序列中的第3位的天冬酰胺被替换为丙氨酸、缬氨酸或天冬氨酸的方式。进一步地，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的一方式，至少可以举出序列号13～15所示的各氨基酸序列中的第3位的丙氨酸被替换为缬氨酸或天冬氨酸的方式。

另外，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的一方式，至少可以举出序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第4位的丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或赖氨酸被替换为缬氨酸、组氨酸、精氨酸或异亮氨酸的方式。

另外，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的一方式，至少可以举出序列号1～12所示的各氨基酸序列中的第6位的天冬酰胺被替换为丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺或天冬氨酸的方式。进一步地，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的一方式，至少可以举出序列号13～15所示的各氨基酸序列中的第6位的天冬氨酸被替换为丙氨酸、谷氨酰胺或缬氨酸的方式。

另外，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的一方式，至少可以举出序列号1～12、14以及15所示的各氨基酸序列中的第7位的苏氨酸或赖氨酸被替换为谷氨酸、组氨酸、精氨酸或缬氨酸的方式。进一步地，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的一方式，至少可以举出序列号13所示的氨基酸序列中的第7位的谷氨酸被替换为组氨酸、精氨酸或缬氨酸的方式。

另外，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的一方式，至少可以举出序列号1～15所示的各氨基酸序列中的第11位的天冬酰胺或丝氨酸被替换为丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、谷氨酰胺或精氨酸的方式。

作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的具体例，可以举出在序列号1～15所示的各氨基酸序列中，除了进行了满足上述(i)～(iv)的条件的改变之外，至少具有以下氨基酸替换的具体例。

(i)第11位被替换为丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸或精氨酸。

(ii)在序列号1～12、14以及15的情况下，第7位被替换为谷氨酸(在序列号13的情况下，第7位未被替换)。

(iii)在序列号1～12、14以及15的情况下，第7位被替换为谷氨酸(在序列号13的情况下，第7位未被替换)，并且第11位被替换为丙氨酸或缬氨酸。

(iv)第4位被替换为异亮氨酸，并且在序列号1～12、14以及15的情况下，第7位被替换为精氨酸或谷氨酸，或者在序列号13的情况下，第7位未被替换或被替换为精氨酸。

(v)第4位被替换为异亮氨酸，在序列号1～12、14以及15的情况下，第7位被替换为精氨酸或谷氨酸，或者在序列号13的情况下，第7位未被替换或被替换为精氨酸，并且第11位被替换为丙氨酸。

(vi)第4位被替换为异亮氨酸或缬氨酸，并且在序列号1～12、14以及15的情况下，第7位被替换为谷氨酸(在序列号13的情况下，第7位未被替换)。

(vii)第3位被替换为天冬氨酸，在序列号1～12的情况下，第6位被替换为天冬氨酸(在序列号13～15的情况下，第6位未被替换)，在序列号1～12、14以及15的情况下，第7位被替换为缬氨酸或谷氨酸，或者在序列号13的情况下，第7位未被替换或被替换为缬氨酸，并且第11位被替换为丙氨酸。

在序列号1所示的氨基酸序列中，在第40位、第43位、第46位、第49位、第50位、第53位以及第58位进行了替换的赖氨酸起到容易固定化于载体上的作用，因此作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域的优选的一方式，可以举出在第40位、第43位、第46位、第49位、第50位、第53位以及第58位之中，4个以上的赖氨酸，优选6个以上的赖氨酸，更优选全部的赖氨酸未发生突变(替换和/或缺失)。

在(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域中，“与包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽相比，碱稳定性为同等以上，并且在弱酸性区域的IgG洗脱能力高”意味着，对IgG具有结合活性，在下述测定条件1下测定的碱处理后的残留活性比在相同条件下测定的包含对应的未改变的氨基酸序列(作为基础的序列号1～15的任一个的氨基酸序列)的多肽的碱处理后的残留活性为同等以上，并且在下述测定条件2下测定的弱酸性下的洗脱率比在相同条件下测定的使用包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽的情况下的弱酸性下的洗脱率高。具体而言，在下述测定条件1下测定的碱处理后的残留活性与在相同条件下测定的包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽的碱处理后的残留活性相比为1.1倍以上，并且在下述测定条件2下测定的弱酸性下的洗脱率与在相同条件下测定的使用包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽的情况下的弱酸性下的洗脱率相比为1.2倍以上时，可以说“与包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽相比，碱稳定性为同等以上，并且在弱酸性区域的IgG洗脱能力高”。作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域，在下述测定条件1下测定的碱处理后的残留活性与在相同条件下测定的包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽的碱处理后的残留活性相比，优选为1.14倍以上，更优选为1.14～1.21倍，进一步优选为1.15～1.21倍。另外，作为(B)以及(C)的免疫球蛋白结合结构域，在下述测定条件2下测定的弱酸性下的洗脱率与在相同条件下测定的使用包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽的情况下的弱酸性下的洗脱率相比，优选为1.3倍以上，更优选为1.3～1.52倍，进一步优选为1.4～1.55倍。

＜测定条件1(碱处理后的残留活性的测定)＞

对固定化于琼脂糖凝胶载体上的多肽，用0.1M NaOH水溶液洗涤3次，替换为该碱溶液后，在25℃下保温68小时(碱处理)。然后，用PBS洗涤之后，测定人IgG的结合量(mg/ml凝胶)。对于未进行碱处理的情况下，也测定固定化于琼脂糖凝胶载体上的多肽的人IgG的结合量(mg/ml凝胶)。将未进行碱处理的情况下的多肽的人IgG的结合量设为100％，算出碱处理后的多肽的人IgG的结合量的比例作为“碱处理后的残留活性(％)”。

＜测定条件2(弱酸性下的洗脱率的测定)＞

对固定化于琼脂糖凝胶载体上的多肽，结合人IgG。然后，用PBS洗涤固定化多肽后，用0.1M柠檬酸缓冲液(pH4.0)，洗脱与固定化多肽结合的人IgG。接着，使用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.8)，洗脱与固定化多肽结合而残留的人IgG。测定在pH4.0下洗脱的人IgG量和在pH2.8下洗脱的人IgG量。将在pH4.0下洗脱的人IgG量和在pH2.8下洗脱的人IgG量的合计量设为100％，将在pH4.0下洗脱的人IgG量的比例作为弱酸性下的洗脱率(％)进行计算。

本发明的多肽可以是具有1个免疫球蛋白结合结构域的单结构域型多肽，也可以是连结了2个以上免疫球蛋白结合结构域的多结构域型多肽。在本发明的多肽为多结构域型多肽的情况下，具有提高免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的结合能力的优点。

本发明的多肽为单结构域型多肽的情况下，只要包含(A)～(C)的免疫球蛋白结合结构域中的1个结构域即可。

在(A)～(C)的免疫球蛋白结合结构域之中，将序列号2、5、8、11以及14所示的氨基酸序列作为基础而包含的免疫球蛋白结合结构域(以下，有时还标记为“赖氨酸富含结构域”)具有与载体的结合性，因此将该免疫球蛋白结合结构域作为单结构域型多肽进行使用的情况下，可以不添加具有与载体的结合性的氨基酸序列，但为了进一步提高与载体的结合性，也可以添加具有与载体的结合性的氨基酸序列。

另外，在(A)～(C)的免疫球蛋白结合结构域之中，将序列号1、3、4、6、7、9、10、12、13以及15所示的氨基酸序列作为基础而包含的免疫球蛋白结合结构域(以下，有时还标记为“赖氨酸非富含结构域”)作为单结构域型多肽进行使用的情况下，为了赋予对载体的结合性，优选添加了具有对载体的结合性的氨基酸序列。

在本发明的多肽为多结构域型多肽的情况下，只要包含(A)～(C)的免疫球蛋白结合结构域之中的至少1个结构域即可，可以包含(A)～(C)的免疫球蛋白结合结构域之中的2个以上的结构域，也可以包含(A)～(C)的免疫球蛋白结合结构域之中的1个以上的结构域和构成蛋白A的各免疫球蛋白结合结构域或构成蛋白L的各免疫球蛋白结合结构域中的1个以上。在本发明的多肽为多结构域型多肽的情况下，从使其具备更进一步优异的碱稳定性以及在弱酸性区域的抗体洗脱特性的观点出发，构成的免疫球蛋白结合结构域全部优选由(A)～(C)的免疫球蛋白结合结构域的任一个构成。

在将本发明的多肽设为多结构域型多肽的情况下，关于连结的免疫球蛋白结合结构域的总数，只要为2个以上即可，但优选可以举出2～10个，进一步优选可以举出2～6个。

在将本发明的多肽设为多结构域型多肽的情况下，构成的各免疫球蛋白结合结构域中，各自的C末端与N末端可以直接连结，另外，各免疫球蛋白结合结构域之间也可以介由1～40个，优选1～10个氨基酸残基连结。

另外，作为在将本发明的多肽设为多结构域型多肽的情况下的优选例子，可以举出连结有1个以上赖氨酸非富含结构域和1个以上赖氨酸富含结构域的结构；更优选连结有1个以上赖氨酸非富含结构域和1个赖氨酸富含结构域的结构；进一步优选连结有2～10个赖氨酸非富含结构域和1个赖氨酸富含结构域的结构；尤其优选连结有3～5个赖氨酸非富含结构域，并且在C末端侧或N末端侧(优选C末端侧)连结有1个赖氨酸富含结构域的结构。这样，通过在多结构域型多肽中包含1个赖氨酸富含结构域，可以具备对载体的结合性。因此，在包含赖氨酸富含结构域的多结构域型多肽中，也可以不添加具有对载体的结合性的氨基酸序列。但是，即使是这样的多结构域型多肽，为了进一步提高对载体的结合性，也可以添加具有对载体的结合性的氨基酸序列。

另外，在多结构域型多肽中，在包含赖氨酸非富含结构域并且不包含赖氨酸富含结构域的情况下，为了赋予对载体的结合性，优选添加具有对载体的结合性的氨基酸序列。

作为“具有对载体的结合性的氨基酸序列”的氨基酸序列，例如，可以举出使赖氨酸连结1～15个，优选3～10个，更优选4～8个的氨基酸序列。在该连结序列中，除了赖氨酸以外，还可以包含赖氨酸以外的氨基酸。另外，在添加具有对载体的结合性的氨基酸序列的情况下，可以添加在N末端侧或C末端侧的任意末端，但优选为C末端。

另外，为了提高多肽的表达、赋予纯化的容易性等，本发明的多肽也可以在N末端侧或C末端侧添加具有其他功能的多肽、多肽标签等。出于这样的目的，本发明的多肽的N末端侧和/或C末端侧添加的氨基酸的数量没有特别限制，但可以举出例如1～400个，优选1～100个，进一步优选1～30个。

2.DNA

编码本发明的多肽的DNA(以下，有时还标记为“本发明的DNA”)例如可以通过如下获得：以编码来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的DNA为模板，通过PCR等获得编码目标免疫球蛋白结合结构域的DNA，以在该DNA中导入所需的氨基酸替换等的方式导入突变。另外，本发明的DNA也可以通过基因合成法进行人工合成。

其中，编码来自金黄色葡萄球菌的野生型蛋白A的DNA，例如，作为序列号16所示的碱基序列而被知晓，可以通过使用PCR的常规方法从金黄色葡萄球菌进行分离。另外，编码野生型蛋白A的DNA也可以通过基因合成法进行人工合成。

在碱基序列的特定部位导入特定突变的方法是公知的，例如可以利用DNA的定点诱变法等。作为转换DNA中的碱基的具体方法，例如，也可以使用市售的试剂盒进行。

在碱基序列中导入了突变的DNA可以使用DNA测序仪来确认碱基序列。一旦确定碱基序列，之后通过化学合成、以克隆的探针为模板的PCR或以具有该碱基序列的DNA片段为探针的杂交，可以得到编码上述多肽的DNA。

另外，通过定点诱变法等，可以合成作为编码上述肽的DNA的突变型并且具有与突变前相同的功能的DNA。应予说明，为了在编码上述肽的DNA中导入突变，可以通过Kunkel法、缺口双链诱变法(Gapped duplex)、大引物PCR法(megaprimer PCR)等公知的方法进行。

本发明的DNA优选将密码子使用频率优化至最适合于宿主。例如，如果是在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，则优选使密码子使用频率优化至最适合于大肠杆菌的DNA。

3.重组载体

包含编码本发明的多肽的DNA的重组载体(以下，有时还标记为“本发明的重组载体”)可以通过将本发明的DNA插入表达载体来获得。

本发明的重组载体包含可作用地连结到本发明的DNA的启动子等控制因子。作为控制因子，典型地可以举出启动子，但进一步可以根据需要包含增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等转录要素。另外，可作用地连结是指，调节本发明的DNA的启动子、增强子等各种控制因子与本发明的DNA在宿主细胞中以可作用的状态连结。

作为表达载体，优选由能够在宿主内自主增殖的噬菌体、质粒或病毒作为基因重组用而构建的载体。这样的表达载体是公知的，例如，作为商业上可获得的表达载体，可以举出pQE系载体(Kirgen Co.,Ltd.)、pDR540、pRIT2T(GE Healthcare Bioscience Co.,Ltd.)、pET系载体(Merck Co.,Ltd.)等。表达载体只要选择与宿主细胞的合适的组合来使用即可，例如，在将大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，优选举出pET系载体和BL21(DE3)大肠杆菌株的组合或pDR 540载体和JM109大肠杆菌株的组合等。

4.转化体

通过使用本发明的重组载体转化宿主来获得转化体(以下，有时还标记为“本发明的转化体”)。

作为在转化体的制造中使用的宿主，只要重组载体稳定并且能够自主增殖且能够表达外源性基因的性状，则没有特别限制，例如，作为优选的例子，可举出属于大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等芽孢杆菌属、恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida)等假单孢菌属等的细菌；酵母等，但除此之外，也可以是动物细胞、昆虫细胞、植物等。这些中，特别优选大肠杆菌。

本发明的转化体可以通过向宿主导入本发明的重组载体而获得，向宿主导入重组载体的条件可以根据宿主的种类等适当设定。在宿主为细菌的情况下，例如，可以举出使用通过钙离子处理的感受态细胞的方法以及电转染法等。在宿主为酵母的情况下，例如，可以举出电穿孔法(电转染法)、原生质球法以及醋酸锂法等。在宿主为动物细胞的情况下，例如，可以举出电转染法、磷酸钙法以及脂质体转染法等。在宿主为昆虫细胞的情况下，例如，可以举出磷酸钙法、脂质体转染法以及电转染法等。在宿主为植物的情况下，例如，可以举出电转染法、农杆菌法、粒子枪法以及PEG法等。

5.多肽的制造

本发明的多肽可以通过培养上述转化体来制造。

转化体的培养条件只要考虑宿主的营养生理性质来适当设定即可，优选可以举出液体培养。另外，在进行工业性制造的情况下，优选通气搅拌培养。

培养本发明的转化体，并通过离心分离等方法对培养液回收培养上清液或菌体。在本发明的多肽蓄积在菌体内的情况下，通过超声波、弗氏压碎器等机械方法或溶菌酵素等溶菌酶对菌体实施处理，根据需要使用蛋白酶等酶或十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂，由此进行增溶，可以得到包含本发明的多肽的水溶性组分。

另外，通过选择适当的表达载体和宿主，也可以使进行表达的本发明的多肽分泌到培养液中。

如上所述得到的包含本发明的多肽的培养液或水溶性组分可以直接供给于纯化处理，但也可以将该培养液或水溶性组分中的本发明的多肽进行浓缩后供给于纯化处理。

例如，可以通过减压浓缩、膜浓缩、盐析处理、利用亲水性有机溶剂(例如，甲醇、乙醇以及丙酮)的分级沉淀法等进行浓缩。

例如，可以通过适当组合凝胶过滤、疏水性色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等方法来进行本发明的多肽的纯化处理。

如此纯化的本发明的多肽，根据需要，也可以通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等来形成粉末。

6.免疫球蛋白结合载体

为了简便地进行免疫球蛋白的回收或纯化，本发明的多肽被固定化于不溶性载体，作为免疫球蛋白结合载体来使用。作为用于固定化本发明的多肽的不溶性载体，没有特别限制，例如，可以举出壳聚糖、葡聚糖、纤维素、琼脂糖等天然来源的高分子材料；乙烯醇、聚酰亚胺、甲基丙烯酸酯等合成有机材料；玻璃、二氧化硅等无机材料等。

关于不溶性载体的形状，没有特别限制，可以是中空纤维膜状、单块状、珠子状等任意形状。在这些形状中，珠子状一般适合于制造每单位体积的表面积比较大、免疫球蛋白结合能力高的亲和载体，因此优选。

为了将本发明的多肽固定化于不溶性载体，例如，可以使本发明的多肽中的氨基、羧基或硫醇基与不溶性载体进行偶联反应。具体而言，可以举出如下所述的固定化方法：对于不溶性载体，使其与溴化氰、环氧氯丙烷、N-羟基丁二酰亚胺、对甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯(Tresyl chloride)、碳二亚胺、戊二醛、肼等偶联剂反应而活化，或者在载体中导入羧基或硫醇基等反应性官能团后，与本发明的多肽进行偶联反应。这样的偶联反应是该技术领域中公知的(例如，Janson,J.-C.,编集[Protein purification]，第3版，221-258页，ISBN 978-0-471-74661-4)，可以按照惯用的方法进行。

另外，在介由本发明的多肽中的氨基固定化于不溶性载体的情况下，优选使用具有能够与氨基反应而形成共价键的反应性官能团(三氟代乙烷基(Tresyl)、环氧基、羧基、甲酰基等)的载体。作为这样的不溶性载体，作为Toyopearl AF-tresyl-650、ToyopearlAF-epoxy-650、Toyopearl AF-carboxy-650、Toyopearl AF-formyl-650(以上，东曹株式会社)、NHS活化琼脂糖、溴化氰活化琼脂糖、环氧活化琼脂糖(以上，GE HealthcareBioscience Co.,Ltd.)、Profinity Epoxide(Bio-Rad Co.,Ltd.)、乙二醛-琼脂糖(Agarose Bead Technologies Co.,Ltd.)、Cellufine Formyl(JNC Co.,Ltd.)等而被市售，可以使用这些市售品。

进一步地，也可以通过在本发明的多肽与不溶性载体共存的体系中加入碳二亚胺或戊二醛等缩合或交联试剂，将本发明的多肽固定化于不溶性载体上。

7.免疫球蛋白或其片段的分离方法

本发明的多肽与免疫球蛋白的Fc区域结合，因此可以用于分离IgG、IgM、IgA等免疫球蛋白以及含有这些的Fc区域的多肽(Fc融合蛋白等)等的分离。

为了使用本发明的多肽分离免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽，只要使用固定化本发明的多肽的不溶性载体即可。具体而言，使用固定化本发明的多肽的不溶性载体的免疫球蛋白的分离可以通过亲和柱色谱法进行。

为了通过亲和柱色谱法分离免疫球蛋白，在填充了固定化本发明的多肽的不溶性载体的柱中使包含免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的溶液通过，使本发明的多肽与免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽结合后，根据需要，洗涤柱内部，接着，将调整为合适的pH的洗脱液通过柱，从而使免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽洗脱即可。免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的溶液的pH只要为6.5以上，优选为6.5～8.0即可。另外，洗脱液的pH只要为弱酸性以下，具体而言，pH5以下即可，但为了抑制被分离的免疫球蛋白或其片段暴露于强酸性条件下，洗脱液的pH优选为3～5，更优选为3.4～4.5，进一步优选为3.6～4.5。

实施例

FP230243JP

以下，举出实施例具体说明本发明，但本发明不限定于以下的实施例来解释。

试验例1：单结构域型多肽的制造与评价(1)

1.单结构域型多肽的制造

制造了改变蛋白A的C结构域的单结构域型多肽。具体的制造方法如下。

＜PN-32表达质粒的制造＞

将包含序列号2所示的氨基酸序列的多肽命名为PN-32。通过以下方法制造了PN-32的表达质粒。

使用合成寡核苷酸制作了在翻译起始密码子的部位按顺序排列有限制酶NdeI的识别序列、编码序列号2的氨基酸序列的序列、翻译终止密码子、限制酶BamHI的识别序列的碱基序列的双链DNA。将分别用限制酶NdeI以及BamHI切断该合成寡核苷酸的两端的片段，通过连接(ligation)反应插入同样用这两个限制酶切断的pET9a质粒后，引入大肠杆菌DH-5α感受态细胞而进行了转化。在卡那霉素存在下培养该大肠杆菌，纯化了PN-32的表达质粒(pET9a·PN-32)。

用CEQ8000型DNA测序仪(Beckman Coulter Co.,Ltd.)对如此得到的pET9a·PN-32的核酸序列进行分析，确认是按照设计的序列。

＜PN-32改变体表达质粒的制造＞

另外，在序列号2所示的氨基酸序列中，通过以下方法制造了导入了表1所示的氨基酸替换的PN-32改变体的表达质粒。

以pET9a·PN-32为模板，通过使用设计为具有1个目标氨基酸替换而合成的寡核苷酸DNA作为引物的PCR，制备编码目标改变体的双链DNA，与制作pET9a·PN-32的情况同样，用限制酶NdeI以及BamHI进行切断，通过连接反应插入pET9a质粒，得到具有1个氨基酸替换的PN-32改变体的表达质粒。另外，将具有1个氨基酸替换的改变体的表达质粒作为模板，进行与上述同样的操作，制作具有2个氨基酸替换的PN-32改变体的表达质粒。

用CEQ8000型DNA测序仪(Beckman Coulter Co.,Ltd.)对如此得到的PN-32改变体的表达质粒的核酸序列进行分析，确认是按照设计的序列。

＜PN-32以及其改变体的制造＞

通过用上述得到的PN-32以及其改变体的各表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Merck Co.,Ltd.)，得到了PN-32以及其改变体的各表达株。

将PN-32以及其改变体的各表达大肠杆菌株在含有25mg/L卡那霉素以及2.0％葡萄糖的LB培养基中增殖培养了12小时。将得到的增殖培养液接种到含有25mg/L卡那霉素以及0.8％葡萄糖的2×TY培养基，在37℃下培养16小时，使目标PN-32以及其改变体表达后，通过离心分离回收大肠杆菌。然后，将回收的大肠杆菌悬浮在50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，进行超声波处理使大肠杆菌破碎，进一步通过离心分离，将PN-32以及其改变体回收到上清液中。将得到的各上清液作为菌体提取液，供给于十二烷基硫酸钠-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果能够确认生产了按照目标的PN-32以及其改变体。

将PN-32以及其改变体的各表达大肠杆菌株的菌体提取液调整至pH6.0后，应用于阳离子交换体SP-琼脂糖快流速(GE HealthCare Co.,Ltd.)柱中。用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)洗涤后，以0.5M NaCl的线性浓度梯度，从柱洗脱蛋白质。用SDS-PAGE确认洗脱液，结果PN-32以及其改变体在0.1～0.2M NaCl之间进行洗脱。然后，将含有PN-32以及其改变体的各洗脱液的pH调整为9后，添加到阴离子交换体Gigacap Q(东曹株式会社)柱。用20mM磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤后，以0.3M NaCl线性浓度梯度分离PN-32以及其改变体。将各分离液供给于SDS-PAGE，确认纯度，结果确认了PN-32以及其改变体在理论值的分子量的位置作为单一带被纯化。

2.单结构域型多肽在凝胶载体上的固定化

在甲酰基活化琼脂糖凝胶载体上以10mg/mL凝胶浓度按照常规方法分别固定化经纯化的PN-32以及其改变体。回收固定化后的反应溶液，并测定固定化率，结果在PN-32以及其改变体的全部中，固定化效率为90％以上。

3.免疫球蛋白结合活性的测定

用PBS洗涤固定化有PN-32以及其改变体的各凝胶载体后，加入含有40mg/mL的人多克隆IgG(由日本血液制剂机构获得)的PBS(pH7.5)，振荡1小时后，用PBS(pH7.5)洗涤凝胶载体。接着，用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.8)从凝胶载体洗脱与凝胶载体结合的人IgG。用分光光度计对该洗脱液测定280nm的吸收，以13.8(1g^-1cm^-1)的比吸光系数为基础，求出结合的IgG量(IgG结合量)。

4.碱处理后的残留活性的测定

用PBS洗涤固定化有PN-32以及其改变体的各凝胶载体后，进一步用0.1M NaOH水溶液洗涤3次，替换为该碱溶液后，在25℃下保存68小时(碱处理)。接着，用PBS洗涤3次后，在与上述相同的条件下测定了免疫球蛋白结合活性。将碱处理前的各个IgG结合量设为100％时的碱处理后的残留IgG结合量的比例作为“碱处理后的残留活性(％)”求出。

5.弱酸性下的洗脱率的测定

用PBS洗涤固定化有PN-32以及其改变体的各凝胶载体后，加入含有40mg/mL的人多克隆IgG(由日本血液制剂机构获得)的PBS(pH7.5)，振荡1小时后，用PBS(pH7.5)洗涤凝胶载体。接着，用0.1M柠檬酸缓冲液(pH4.0)，洗脱与凝胶载体结合的人IgG。接着，用0.1M甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.8)，洗脱与凝胶载体结合而残留的人IgG。用分光光度计对pH4.0下洗脱的洗脱液和pH2.8下洗脱的洗脱液测定280nm的吸收，以13.8(1g^-1cm^-1)的比吸光系数为基础，求出各洗脱液中含有的IgG量。以pH4.0下洗脱的洗脱液的人IgG量和pH2.8下洗脱的洗脱液的人IgG量的合计量作为100％，以pH4.0下洗脱的洗脱液的人IgG量的比例作为“弱酸性下的洗脱率(％)”求出。

6.结果

结果示于表1。其结果发现，在PN-32(序列号2)中，第41位的丝氨酸被替换为具有疏水性侧链的氨基酸(缬氨酸、苯丙氨酸)、组氨酸或酪氨酸的改变体中，碱处理后的残留活性为PN-32的1.1倍以上，弱酸性下的洗脱率提高到PN-32的1.2倍以上。同时具有这两种效果的单突变改变部位仅是第41位。

在第9位的谷氨酰胺被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)并且第41位的丝氨酸被替换为具有疏水性侧链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)、酪氨酸或组氨酸的改变体中，确认了与第41位的单突变改变体相比，碱处理后的残留活性更高，弱酸性下的洗脱率比PN-32有飞跃性提高。将第41位的丝氨酸替换为丙氨酸或亮氨酸的改变体通过进一步将第9位的谷氨酰胺替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸，碱处理后的残留活性更高，弱酸性下的洗脱率比单突变替换体飞跃性地提高。应予说明，将第9位的谷氨酰胺替换为苯丙氨酸并且将第41位的丝氨酸替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸的改变体中，碱处理后的残留活性与仅替换41位的改变体相比不高。

【表1】

单结构域型多肽[PN-32(序列号2)及其改变体]

/>

试验例2：单结构域型多肽的制造与评价(2)

1.单结构域型多肽的制造

通过与上述试验例1同样的方法制造了在PN-32(序列号2)中导入表2所示的氨基酸替换的PN-32改变体的表达质粒。

＜PN-32改变体的制造＞

通过用上述得到的PN-32改变体的各表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Merck Co.,Ltd.)，得到了PN-32以及其改变体的各表达株。

将PN-32改变体的各表达大肠杆菌株在含有25mg/L卡那霉素以及2.0％葡萄糖的LB培养基中增殖培养12小时。将得到的增殖培养液接种到含有25mg/L卡那霉素以及0.8％葡萄糖的2×TY培养基，在37℃下培养16小时，使目标PN-32以及其改变体表达后，通过离心分离回收大肠杆菌。然后，将回收的大肠杆菌悬浮在50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，进行超声波处理，使大肠杆菌破碎，进一步通过离心分离，将PN-32改变体回收到上清液中。将得到的各上清液作为菌体提取液，供给于十二烷基硫酸钠-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果能够确认生产了按照目标的PN-32改变体。

将PN-32改变体的各表达大肠杆菌株的菌体提取液调整至pH6.0后，应用于阳离子交换体SP-琼脂糖快流速(GE HealthCare Co.,Ltd.)柱中。用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)洗涤后，以0.5M NaCl的线性浓度梯度，从柱洗脱蛋白质。用SDS-PAGE确认洗脱液，结果PN-32改变体在0.1～0.2M NaCl之间进行洗脱。然后，将含有PN-32改变体的各洗脱液的pH调整为9后，添加到阴离子交换体Gigacap Q(东曹株式会社)柱。用20mM磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤后，以0.3M NaCl线性浓度梯度分离PN-32改变体。将各分离液供给于SDS-PAGE，确认纯度，结果确认了PN-32改变体在理论值的分子量的位置作为单一带被纯化。

2.单结构域型多肽在凝胶载体上的固定化

在甲酰基活化琼脂糖凝胶载体上以10mg/mL凝胶浓度按照常规方法分别固定化经纯化的PN-32改变体。回收固定化后的反应溶液，并测定固定化率，结果在PN-32改变体的全部中，固定化效率为90％以上。

3.免疫球蛋白结合活性的测定

用固定化有PN-32以及其改变体的各凝胶载体，在与上述试验例1相同的条件下求出IgG结合量。

4.碱处理后的残留活性的测定

用PBS洗涤固定化有PN-32改变体的各凝胶载体后，进一步用0.5MNaOH水溶液洗涤3次，替换为该碱溶液后，在25℃下保存17小时(碱处理)。接着，用PBS洗涤3次后，在与上述相同的条件下测定了免疫球蛋白结合活性。将碱处理前的各个IgG结合量设为100％时的碱处理后的残留IgG结合量的比例作为“碱处理后的残留活性(％)”求出。

5.弱酸性下的洗脱率的测定

用固定化有PN-32以及其改变体的各凝胶载体，在与上述试验例1相同的条件下求出弱酸性下的洗脱率。

6.结果

结果示于表2。根据该结果，确认了在PN-32(序列号2)中，即使在第9位被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸、第41位被替换为具有疏水性侧链的氨基酸并且第11位被替换为丙氨酸的改变体中，碱处理后的残留活性也是PN-32的1.49倍以上，弱酸性下的洗脱率比PN-32飞跃性地提高到1.27倍。进一步地，在PN-32(序列号2)中，第9位被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸、第41位被替换为具有疏水性侧链的氨基酸、第15位被替换为丙氨酸并且第11位被替换为精氨酸的改变体中，在提高碱稳定性的同时，可以进一步提高弱酸性下的洗脱率。另外，确认了即使在第9位未被替换、第15位被替换为丙氨酸或组氨酸、第24位被替换为谷氨酰胺并且第41位被替换为具有疏水性侧链的氨基酸的改变体中，碱处理后的残留活性也是PN-32的1.40倍以上，弱酸性下的洗脱率比PN-32飞跃性地提高到1.40倍。

【表2】

单结构域型多肽[PN-32(序列号2)及其改变体]

试验例3：单结构域型多肽的制造与评价(3)

1.单结构域型多肽的制造

＜PN-128表达质粒的制造＞

在序列号2所示的氨基酸序列中，将包含第7位的苏氨酸被替换为谷氨酸的氨基酸序列的多肽命名为PN-128。用与上述试验例1同样的方法制造了PN-128的表达质粒。

用CEQ8000型DNA测序仪(Beckman Coulter Co.,Ltd.)对如此得到的PN-128的表达质粒的核酸序列进行分析，确认是按照设计序列。

＜PN-128改变体表达质粒的制造＞

另外，通过与上述试验例1同样的方法制造了在序列号2所示的氨基酸序列中导入表3所示的氨基酸替换的PN-128改变体的表达质粒。

用CEQ8000型DNA测序仪(Beckman Coulter Co.,Ltd.)对如此得到的PN-128改变体的表达质粒的核酸序列进行分析，确认是按照设计的序列。

＜PN-128以及其改变体的制造＞

通过用上述得到的PN-128以及其改变体的各表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Merck Co.,Ltd.)，得到了PN-32以及其改变体的各表达株。

将PN-128以及其改变体的各表达大肠杆菌株在含有25mg/L卡那霉素以及2.0％葡萄糖的LB培养基中增殖培养12小时。将得到的增殖培养液接种到含有25mg/L卡那霉素以及0.8％葡萄糖的2×TY培养基，在37℃下培养16小时，使目标PN-128以及其改变体表达后，通过离心分离回收大肠杆菌。然后，将回收的大肠杆菌悬浮在50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，进行超声波处理，使大肠杆菌破碎，进一步通过离心分离，将PN-32以及其改变体回收到上清液中。将得到的各上清液作为菌体提取液，供给于十二烷基硫酸钠-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果能够确认生产了按照目标的PN-128以及其改变体。

将PN-128以及其改变体的各表达大肠杆菌株的菌体提取液调整至pH6.0后，应用于阳离子交换体SP-琼脂糖快流速(GE HealthCare Co.,Ltd.)柱中。用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)洗涤后，以0.5M NaCl的线性浓度梯度，从柱洗脱蛋白质。用SDS-PAGE确认洗脱液的结果，PN-128以及其改变体在0.1～0.2M NaCl之间进行洗脱。然后，将含有PN-128以及其改变体的各洗脱液的pH调整为9后，添加到阴离子交换体Gigacap Q(东曹株式会社)柱。用20mM磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤后，以0.3M NaCl线性浓度梯度分离PN-128以及其改变体。将各分离液供给于SDS-PAGE，确认纯度，结果确认了PN-128以及其改变体在理论值的分子量的位置作为单一带被纯化。

2.单结构域型多肽在凝胶载体上的固定化

在甲酰基活化琼脂糖凝胶载体上以10mg/mL凝胶浓度按照常规方法分别固定化经纯化的PN-128以及其改变体。回收固定化后的反应溶液，并测定固定化率，结果在PN-128以及其改变体的全部中，固定化效率为90％以上。

3.免疫球蛋白结合活性的测定

用固定化有PN-128以及其改变体的各凝胶载体，在与上述试验例1相同的条件下求出IgG结合量。

4.碱处理后的残留活性的测定

用固定化有PN-128以及其改变体的各凝胶载体，在与上述试验例2相同的条件下求出碱处理后的残留活性。

5.弱酸性下的洗脱率的测定

用固定化有PN-128以及其改变体的各凝胶载体，在与上述试验例1相同的条件下求出弱酸性下的洗脱率。

6.结果

结果示于表3。其结果，确认了在PN-128(序列号2所示的氨基酸序列中第7位被替换为谷氨酸的氨基酸序列)中，除了第9位被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸、第41位被替换为具有疏水性侧链的氨基酸或组氨酸以外，还具有(i)第11位被替换为具有疏水性侧链的氨基酸、(ii)第15位被替换为具有疏水性侧链的氨基酸、酪氨酸或组氨酸、(iii)第24位被替换为丙氨酸、谷氨酰胺或组氨酸的至少任意一种的改变体中，碱处理后的残留活性与PN-128相比为同等以上，弱酸性下的洗脱率比PN-128飞跃性地提高。

【表3】

单结构域型多肽[PN-128及其改变体]

/>

试验例4：多结构域型多肽的制造和评价

1.多结构域型多肽的制造

制造了具有6个蛋白A的C结构域的改变序列的多结构域型多肽。具体的制造方法如下。

＜PN-621表达质粒的制造＞

将包含从N末端侧起按顺序直接连结序列号3所示的氨基酸序列(序列α)5个以及序列号2所示的氨基酸序列(序列β)1个的氨基酸序列的多肽命名为PN-621。通过专利文献3记载的方法制造了PN-621的表达质粒。

用CEQ8000型DNA测序仪(Beckman Coulter Co.,Ltd.)对如此得到的PN-621的表达质粒的核酸序列进行分析，确认是按照设计的序列。

＜PN-621改变体表达质粒的制造＞

用上述试验例1以及专利文献3中记载的方法制造了导入了具有表4所示的氨基酸序列的替换的PN-621改变体的表达质粒。

用CEQ8000型DNA测序仪(Beckman Coulter Co.,Ltd.)对如此得到的PN-621改变体的表达质粒的核酸序列进行分析，确认是按照设计的序列。

＜PN-621以及其改变体的制造＞

通过用上述得到的PN-621以及其改变体的各表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Merck Co.,Ltd.)，得到了PN-621以及其改变体的各表达株。

将PN-621以及其改变体的各表达大肠杆菌株在含有25mg/L卡那霉素以及2.0％葡萄糖的LB培养基中增殖培养了12小时。将得到的增殖培养液接种到含有25mg/L卡那霉素以及0.8％葡萄糖的2×TY培养基，在37℃下培养16小时，使目标PN-621以及其改变体表达后，通过离心分离回收大肠杆菌。然后，将回收的大肠杆菌悬浮在50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，进行超声波处理，使大肠杆菌破碎，进一步通过离心分离，将PN-621以及其改变体回收到上清液中。将得到的各上清液作为菌体提取液供给于十二烷基硫酸钠-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果能够确认生产了按照目标的PN-621以及其改变体。

将PN-621以及其改变体的各表达大肠杆菌株的菌体提取液调整至pH6.0后，应用于阳离子交换体SP-琼脂糖快流速(GE HealthCare Co.,Ltd.)柱中。用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)洗涤后，以0.5M NaCl的线性浓度梯度，从柱洗脱蛋白质。将含有PN-621以及其改变体的各洗脱液的pH调整为8后，添加到阴离子交换体Gigacap Q(东曹株式会社)柱。用20mM磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤后，以0.3M NaCl线性浓度梯度分离PN-621以及其改变体。将各分离液供给于SDS-PAGE，确认纯度，结果确认了PN-621以及其改变体在理论值的分子量的位置作为单一带被纯化。

2.多结构域型多肽在凝胶载体上的固定化

在甲酰基活化琼脂糖凝胶载体上以10mg/mL凝胶浓度按照常规方法分别固定化经纯化的PN-621以及其改变体。回收固定化后的反应溶液，并测定固定化率，结果PN-621以及其改变体全部中固定化效率为90％以上。

3.免疫球蛋白结合活性的测定

将固定化有PN-621以及其改变体的各凝胶载体0.5ML量填充到Tricorn 5/20柱(GE HealthCare Co.,Ltd.)。将柱安装于液体色谱装置AKTApure 25(GE HealthCare Co.,Ltd.)，并用PBS平衡柱后，以滞留时间5分钟的流速流动3mg/mL浓度的人多克隆IgG(由日本血液制剂机构获得)溶液。监测柱通过液在280nm处的吸光度，求出通过液中的IgG浓度达到所使用的IgG溶液的10％浓度时的添加IgG量。根据该值，按照下述式计算每1mL凝胶的IgG动态结合量(mg/mL凝胶)。

【数1】

IgG动态结合量(mg/mL凝胶)＝IgG添加量(mg)/柱容量(mL)

IgG添加量(mg)＝所添加的IgG溶液量(mL)×IgG浓度(mg/mL)

所添加的IgG溶液量：通过液中的IgG浓度达到所使用的IgG溶液的10％浓度时为止所添加的IgG溶液量

4.碱处理后的残留活性的测定

用固定化有PN-621以及其改变体的各凝胶载体，在与上述试验例2相同的条件下求出碱处理后的残留活性。

5.弱酸性下的洗脱率的测定

用固定化有PN-621以及其改变体的各凝胶载体，在与上述试验例1相同的条件下求出弱酸性下的洗脱率。

6.结果

结果示于表4。其结果，可知即便是在序列号2或3中，具有多个第41位被替换为具有疏水性侧链的氨基酸或组氨酸的氨基酸序列的多结构域型多肽；具有多个第9位被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸并且第41位被替换为具有疏水性侧链的氨基酸或组氨酸的氨基酸序列的多结构域型多肽；以及，具有多个第9位未被替换、第15位被替换为组氨酸、第24位被替换为谷氨酰胺并且第41位被替换为组氨酸的氨基酸序列的多结构域型多肽，碱处理后的残留活性以及弱酸性下的IgG洗脱能力也高。

【表4】

多结构域型多肽[PN-621及其改变体]

#1表4中所示的序列α、序列β、序列α1～12以及序列β1～10如下。

序列α：序列号3所示的氨基酸序列

序列β：序列号2所示的氨基酸序列

序列α1：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7R/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β1：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7R/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α2：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7R/Q9V/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β2：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7R/Q9V/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α3：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4V/T7E/Q9L/E15H/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β3：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4V/T7E/Q9L/E15H/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α4：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/N11H/E15L/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β4：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/N11H/E15L/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α5：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9A/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β5：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9A/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α6：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9V/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β6：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9V/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α7：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9H/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β7：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9H/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α8：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7R/Q9V/N11A/E15H/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β8：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7R/Q9V/N11A/E15H/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α9：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9V/N11A/E15A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β9：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9V/N11A/E15A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α10：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9L/N11H/E15L/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列β10：在序列号2所示的氨基酸序列中导入了A4I/T7E/Q9L/N11H/E15L/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α11：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了N3D/A4A/N6D/T7V/Q9A/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α12：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了N3D/A4A/N6D/T7E/Q9V/N11A/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α13：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了N3V/A4A/N6Q/T7V/Q9I/N11Q/S41V的氨基酸替换的氨基酸序列

序列α14：在序列号3所示的氨基酸序列中导入了N3D/A4V/N6Q/T7V/N11Q/E15H/E24Q/S41H的氨基酸替换的氨基酸序列

试验例5：根据pH梯度的IgG洗脱曲线

将人多克隆IgG(由日本血液制剂机构获得)注入到填充有固定化实施例56(PN-621改变体)以及比较例50(PN-621)的各多结构域型多肽的凝胶载体的柱中，并使其结合。接着，用pH7.2的0.1M柠檬酸缓冲液和pH2.3的0.1M柠檬酸缓冲液，以线性pH梯度洗脱人IgG，并监测洗脱液在280nm处的吸光度。

结果示于图1。图1中，(A)表示使用了实施例56(PN-621改变体)的结果，(B)表示使用了比较例50(PN-621)的结果。在固定化实施例56的多结构域型多肽的凝胶载体中，人IgG在pH4.02下洗脱。另一方面，固定化比较例50(PN-621)的多结构域型多肽的凝胶载体中，人IgG在pH3.19下洗脱。由这些结果表明，本发明的蛋白A改变体可以在弱酸性条件的更高的pH值下纯化IgG。

试验例6：野生型单结构域多肽以及其改变体的制造与评价

1.野生型、单突变型以及双突变型的单结构域多肽的制造

制作了蛋白A的5个结构域(A、B、C、D、E)的野生型单结构域多肽以及这些的改变体的表达质粒。具体而言，用与上述试验例1同样的方法制造了野生型结构域A(序列号4)、野生型结构域B(序列号7)、野生型结构域C(序列号1)、野生型结构域D(序列号10)、野生型结构域E(序列号13)、这些各野生型结构域的第41位被替换为组氨酸的单突变改变体以及这些各野生型结构域的第9位被替换为亮氨酸以及第41位被替换为组氨酸的双突变改变体的表达质粒。应予说明，在这些野生型结构域以及其改变体中，以能够利用于固定化在凝胶载体上的方式，形成在C末端连结了5个赖氨酸的序列。

用CEQ8000型DNA测序仪(Beckman Coulter Co.,Ltd.)对野生型单结构域多肽以及这些的改变体的表达质粒的核酸序列进行分析，确认是按照设计的序列。

＜结构域改变体的制造＞

通过用上述得到的各表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Merck Co.,Ltd.)，得到了各野生型单结构域多肽以及这些的改变体的各表达株。

将上述得到的各表达大肠杆菌株在含有25mg/L卡那霉素以及2.0％葡萄糖的LB培养基中增殖培养了12小时。将得到的增殖培养液接种到含有25mg/L卡那霉素以及0.8％葡萄糖的2×TY培养基，在37℃下培养16小时，使目标的各野生型单结构域多肽以及这些的改变体表达后，通过离心分离回收大肠杆菌。然后，将回收的大肠杆菌悬浮在50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)中，进行超声波处理，使大肠杆菌破碎，进一步通过离心分离，将各野生型单结构域多肽以及这些的改变体回收到上清液中。将得到的各上清液作为菌体提取液，供给于十二烷基硫酸钠-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果能够确认生产了按照目标的各野生型单结构域多肽以及这些的改变体。

将上述得到的各表达大肠杆菌株的菌体提取液调整至pH6.0后，应用于阳离子交换体SP-琼脂糖快流速(GE HealthCare Co.,Ltd.)柱中。用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)洗涤后，以0.5M NaCl的线性浓度梯度，从柱洗脱蛋白质。用SDS-PAGE确认洗脱液，结果各野生型单结构域多肽以及这些的改变体在0.1至0.2M NaCl之间进行洗脱。然后，将含有各野生型单结构域多肽以及这些的改变体的各洗脱液的pH调整为9后，添加到阴离子交换体GigacapQ(东曹株式会社)柱。用20mM磷酸缓冲液(pH7.8)洗涤后，以0.3M NaCl线性浓度梯度分离各野生型单结构域多肽以及这些的改变体。将各分离液供给于SDS-PAGE，确认纯度，结果确认了各野生型单结构域多肽以及这些的改变体在理论值的分子量的位置作为单一带被纯化。

2.单结构域型多肽在凝胶载体上的固定化

在甲酰基活化琼脂糖凝胶载体上以10mg/mL凝胶浓度按照常规方法分别固定化经纯化的各野生型单结构域多肽以及这些的改变体。回收固定化后的反应溶液，并测定固定化率，结果在各野生型单结构域多肽以及这些的改变体的全部中固定化效率为90％以上。

3.免疫球蛋白结合活性的测定

用固定化有各野生型单结构域多肽以及这些的改变体的各凝胶载体，在与上述试验例1相同的条件下求出IgG结合量。

4.碱处理后的残留活性的测定

用PBS洗涤固定化有各野生型单结构域多肽以及这些的改变体的各凝胶载体后，进一步用0.1M NaOH水溶液洗涤3次，替换为该碱溶液后，在25℃下，保存6小时、17小时或68小时(碱处理)。接着，用PBS洗涤3次后，在与上述相同的条件下测定了免疫球蛋白结合活性。将碱处理前的各个IgG结合量设为100％时的碱处理后的残留IgG结合量的比例作为“碱处理后的残留活性(％)”求出。

5.弱酸性下的洗脱率的测定

用固定化有各野生型单结构域多肽以及这些的改变体的各凝胶载体，除了在IgG的洗脱中用0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.0)以外，在与上述试验例1相同的条件下求出弱酸性下的洗脱率。

6.结果

结果示于表5以及6。根据该结果，确认了蛋白A的5个结构域中，第41位被替换为组氨酸的单突变改变体以及第9位被替换为亮氨酸并且第41位被替换为组氨酸的双突变改变体的碱处理后的残留活性与野生型相比为同等以上，弱酸性下的洗脱率也分别提高。

【表5】

【表6】

/>

序列表

<110> 普罗泰纳瓦株式会社

<120> 免疫球蛋白结合多肽

<130> 21075WO

<150> JP2020-212695

<151> 2020-12-22

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 1

Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 C

<400> 2

Ala Asp Asn Ala Phe Asn Thr Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Lys Ser Lys Lys Ile Leu Lys Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Lys Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 3

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 C

<400> 3

Ala Asp Asn Ala Phe Asn Thr Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Ala Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Arg Arg Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Arg

50 55

<210> 4

<211> 58

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 4

Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 5

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 A

<400> 5

Ala Asp Asn Ala Phe Asn Thr Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Lys Ser Ala Lys Leu Leu Lys Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Lys Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 6

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 A

<400> 6

Ala Asp Asn Ala Phe Asn Thr Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala

35 40 45

Arg Arg Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Arg

50 55

<210> 7

<211> 58

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 7

Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 8

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 B

<400> 8

Ala Asp Asn Ala Phe Asn Thr Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Lys Ser Ala Lys Leu Leu Lys Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Lys Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 9

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 B

<400> 9

Ala Asp Asn Ala Phe Asn Thr Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Arg Arg Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Arg

50 55

<210> 10

<211> 58

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 10

Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 11

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 D

<400> 11

Gln Gln Asn Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Lys Ser Thr Lys Val Leu Lys Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Lys Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 12

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 D

<400> 12

Gln Gln Asn Ala Phe Asn Thr Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Arg Arg Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Arg

50 55

<210> 13

<211> 58

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 13

Asn Ala Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 14

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 E

<400> 14

Asn Ala Ala Ala His Asp Thr Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Lys Ser Ala Lys Val Leu Lys Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Lys Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 15

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 改变的结构域 E

<400> 15

Asn Ala Ala Ala His Asp Thr Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Arg Arg Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Arg

50 55

<210> 16

<211> 1921

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

<400> 16

tcgaaatagc gtgattttgc ggttttaagc cttttacttc ctgaataaat ctttcagcaa 60

aatatttatt ttataagttg taaaacttac ctttaaattt aattataaat atagatttta 120

gtattgcaat acataattcg ttatattatg atgactttac aaatacatac agggggtatt 180

aatttgaaaa agaaaaacat ttattcaatt cgtaaactag gtgtaggtat tgcatctgta 240

actttaggta cattacttat atctggtggc gtaacacctg ctgcaaatgc tgcgcaacac 300

gatgaagctc aacaaaatgc tttttatcaa gtcttaaata tgcctaactt aaatgctgat 360

caacgcaatg gttttatcca aagccttaaa gatgatccaa gccaaagtgc taacgtttta 420

ggtgaagctc aaaaacttaa tgactctcaa gctccaaaag ctgatgcgca acaaaataac 480

ttcaacaaag atcaacaaag cgccttctat gaaatcttga acatgcctaa cttaaacgaa 540

gcgcaacgta acggcttcat tcaaagtctt aaagacgacc caagccaaag cactaacgtt 600

ttaggtgaag ctaaaaaatt aaacgaatct caagcaccga aagctgataa caatttcaac 660

aaagaacaac aaaatgcttt ctatgaaatc ttgaatatgc ctaacttaaa cgaagaacaa 720

cgcaatggtt tcatccaaag cttaaaagat gacccaagcc aaagtgctaa cctattgtca 780

gaagctaaaa agttaaatga atctcaagca ccgaaagcgg ataacaaatt caacaaagaa 840

caacaaaatg ctttctatga aatcttacat ttacctaact taaacgaaga acaacgcaat 900

ggtttcatcc aaagcctaaa agatgaccca agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct 960

aaaaagctaa atgatgctca agcaccaaaa gctgacaaca aattcaacaa agaacaacaa 1020

aatgctttct atgaaatttt acatttacct aacttaactg aagaacaacg taacggcttc 1080

atccaaagcc ttaaagacga tccttcggtg agcaaagaaa ttttagcaga agctaaaaag 1140

ctaaacgatg ctcaagcacc aaaagaggaa gacaataaca agcctggcaa agaagacaat 1200

aacaagcctg gcaaagaaga caataacaag cctggcaaag aagacaacaa caagcctggc 1260

aaagaagaca acaacaagcc tggtaaagaa gacaacaaca agcctggcaa agaagacggc 1320

aacaagcctg gtaaagaaga caacaaaaaa cctggtaaag aagatggcaa caagcctggt 1380

aaagaagaca acaaaaaacc tggtaaagaa gacggcaaca agcctggcaa agaagatggc 1440

aacaaacctg gtaaagaaga tggtaacgga gtacatgtcg ttaaacctgg tgatacagta 1500

aatgacattg caaaagcaaa cggcactact gctgacaaaa ttgctgcaga taacaaatta 1560

gctgataaaa acatgatcaa acctggtcaa gaacttgttg ttgataagaa gcaaccagca 1620

aaccatgcag atgctaacaa agctcaagca ttaccagaaa ctggcgaaga aaatccattc 1680

atcggtacaa ctgtatttgg tggattatca ttagccttag gtgcagcgtt attagctgga 1740

cgtcgtcgcg aactataaaa acaaacaata cacaacgata gatatcattt tatgcaaacc 1800

aattttaact tatatacgtt gattaacaca ttcttatttg aaatgataag aatcatctaa 1860

atgcacgagc aacatctttt gttgctcagt gcatttttta ttttacttac ttttctaaac 1920

a 1921

Claims

1.一种多肽，其包含至少一个下述(A)～(C)的任一个所示的免疫球蛋白结合结构域：

(A)免疫球蛋白结合结构域，其含有在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中导入了满足以下(i)～(iv)的条件的改变的氨基酸序列：

(ii)第9位的谷氨酰胺未被替换、或者被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸，

(iii)第15位的谷氨酸或谷氨酰胺未被替换、或者被替换为丙氨酸、组氨酸、酪氨酸或亮氨酸，

(B)免疫球蛋白结合结构域，其是在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中，导入了满足所述(i)～(iv)的条件的改变，未进行该改变的部位的氨基酸的1个或多个被替换、添加、插入和/或缺失而成的，并且，与包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽相比，碱稳定性为同等以上，并且在弱酸性区域中的IgG洗脱能力更高；

(C)免疫球蛋白结合结构域，其在序列号1～15的任一个所示的氨基酸序列中，导入了满足所述(i)～(iv)的条件的改变，未进行该改变的部位相对于对应的未改变的氨基酸序列的序列一致性为80％以上，所述免疫球蛋白结合结构域与包含对应的未改变的氨基酸序列的多肽相比，碱稳定性为同等以上，并且在弱酸性区域中的IgG洗脱能力更高。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽为包含选自所述(A)～(C)所示的免疫球蛋白结合结构域中的1个免疫球蛋白结合结构域的单结构域型肽。

3.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述多肽为选自所述(A)～(C)所示的免疫球蛋白结合结构域中的2个以上的免疫球蛋白结合结构域连结而成的多结构域型肽。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的多肽，其中，在所述氨基酸序列中，第9位的谷氨酰胺被替换为具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸或组氨酸。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的多肽，其中，在所述氨基酸序列中，第15位的谷氨酸或谷氨酰胺被替换为丙氨酸或组氨酸，并且，

在序列号1～12的情况下，第24位的谷氨酸被替换为谷氨酰胺；或在序列号13～15的情况下，第24位的丙氨酸被替换为谷氨酰胺。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的多肽，其中，在所述氨基酸序列中，第41位的丝氨酸被替换为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或组氨酸。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的多肽，其中，在所述氨基酸序列中，第9位的谷氨酰胺被替换为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或组氨酸。

8.一种DNA，其编码权利要求1～7中任一项所述的多肽。

9.一种重组载体，其包含权利要求8所述的DNA。

10.一种转化体，其是用权利要求9所述的重组载体转化宿主而得到的。

11.权利要求1～7中任一项所述的多肽的制造方法，其包含对权利要求10所述的转化体进行培养的工序。

12.一种免疫球蛋白结合用载体，其是权利要求1～7中任一项所述的多肽被固定化于不溶性载体而成的。

13.一种免疫球蛋白或其片段的分离方法，其特征在于，使用权利要求12所述的免疫球蛋白结合用载体进行免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽的分离。

14.根据权利要求13所述的分离方法，其中，在所述免疫球蛋白结合用载体上暂时结合免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽后，在pH3～5的条件下洗脱免疫球蛋白或含有其Fc区域的多肽。