KR20130028083A - 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 단백질 및 면역 글로불린 결합성의 친화성 리간드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기존의 개변형 단백질 A 리간드보다 우수한 항체 산 해리 특성을 갖는 신규 개변 단백질 A 리간드를 창출하는 것을 과제로 한다. 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 어느 하나의 도메인에서 유래한 아미노산 서열에 대하여, 모든 도메인에서 보존되어 있는, A, B 및 C 도메인의 31 내지 37 위치(E 도메인에서는 29 내지 35 위치, D 도메인에서는 34 내지 40 위치)에 대응하는 아미노산 잔기에 대하여, 적어도 1개의 아미노산 치환 변이를 도입한 아미노산 서열을 가지며, 상기 변이를 도입하기 전의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 비해 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 친화성이 저하되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질을 제공한다.

Description

면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 단백질 및 면역 글로불린 결합성의 친화성 리간드{PROTEIN CAPABLE OF BINDING SPECIFICALLY TO IMMUNOGLOBULIN, AND IMMUNOGLOBULIN-BINDING AFFINITY LIGAND}

본 발명은 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 및 이 단백질을 면역 글로불린 결합성의 친화성 리간드로 하는 친화성 분리 매트릭스 및 이 매트릭스를 사용하여 항체를 분리 정제 또는 흡착 제거하는 방법에 관한 것이다.

항체는 항원이라고 불리는 물질에 특이적으로 결합하는 기능 및 다른 생체 분자나 세포와 협동해서 항원을 갖는 인자를 무독화·제거하는 기능을 갖는다. 항체라고 하는 명칭은 이러한 항원에 결합한다고 하는 기능을 중시한 명칭이며, 물질로서는 「면역 글로불린(Ig)」이라고 불린다.

최근, 유전자 공학, 단백질 공학 및 세포 공학의 발전에 따라, 항체 의약이라고 불리는, 항체가 갖는 기능을 이용한 의약품의 개발이 활발히 행해지고 있다. 항체 의약은 종래의 의약에 비해 표적 분자에 대하여 보다 특이적으로 작용하기 때문에, 부작용을 보다 경감시키고, 높은 치료 효과가 얻어지는 것이 기대되고 있고, 실제로 여러 가지의 병태의 개선에 기여하고 있다.

한편, 항체 의약은, 생체에 대량으로 투여되는 점에서 다른 재조합 단백질 의약품과 비교한 경우에, 그 순도가 품질에 주는 영향이 크다고 알려져 있다. 따라서, 순도가 높은 항체를 제조하기 위해서, 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 분자를 리간드로 하는 흡착 재료를 이용하는, 친화성 크로마토그래피 등의 방법이 일반적으로 사용되고 있다.

항체 의약으로서 개발되어 있는 것은 기본적으로 모노클로널 항체이며, 재조합 배양 세포 기술 등을 사용하여 대량으로 생산되고 있다. 「모노클로널 항체」란, 단일의 항체 생산 세포에서 유래하는 클론으로부터 얻어진 항체를 가리킨다. 현재 출시되어 있는 항체 의약의 대부분은, 분자 구조적으로는 면역 글로불린 G(IgG) 서브클래스이다. IgG 항체에 친화성을 갖는 면역 글로불린 결합성 단백질로서, 단백질 A가 잘 알려져 있다. 단백질 A는 그램 양성 세균 스타필로코커스·아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의해 생산되는 세포벽 단백질의 1종이며, 시그널 서열 S, 5개의 면역 글로불린 결합성 도메인(E 도메인, D 도메인, A 도메인, B 도메인, C 도메인) 및 세포벽 결합 도메인인 XM 영역으로 구성되어 있다(비특허문헌 1). 항체 의약 제조 공정에 있어서의 초기 정제 공정(포획 공정)에서는, 단백질 A가 리간드로서 수불용성 담체에 고정화된 친화성 크로마토그래피용 칼럼(이하, 단백질 A 칼럼)이 일반적으로 이용되고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2, 비특허문헌 3).

단백질 A 칼럼의 성능을 개량하기 위해서, 여러 가지의 기술 개발이 이루어져 왔다. 리간드 측면에서의 기술 개발도 진행되고 있다. 처음에는 천연형의 단백질 A가 리간드로서 이용되어 왔지만, 단백질 공학적으로 개변을 가한 재조합 단백질 A를 리간드로 해서, 칼럼의 성능을 개량하는 기술도 다수 보이게 되었다.

대표적인 재조합 단백질 A로서는, 면역 글로불린 결합 활성이 없는 XM 영역을 제거한 재조합 단백질 A를 들 수 있다(rProtein A Sepharose(등록 상표), GE 헬스케어·재팬(주)제). XM 영역을 제거한 재조합 단백질 A를 리간드로 한 칼럼은, 종래품보다 단백질의 비특이 흡착이 억제된다고 하는 이점이 있어, 현재 공업적으로도 널리 사용되고 있다.

그 밖에, 단백질 A에 1개의 Cys를 변이 도입한 재조합 단백질 A(특허문헌 1) 또는 복수의 Lys를 변이 도입한 재조합 단백질 A(특허문헌 2)를 리간드로서 이용하는 발명이 있다. 이들 기술은, 수불용성 담체에 대한 고정화에 있어서 효과를 나타내고, 항체의 칼럼에 대한 결합 용량이나 고정화 리간드의 누출 저감에서 이점을 갖는다.

개변을 가한 재조합 단백질 A로서, B 도메인에 변이를 도입한 개변 도메인(Z 도메인이라고 불림)을 리간드에 이용하는 기술도 잘 알려져 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 4, 특허문헌 3). Z 도메인은, B 도메인에 대하여, 29 위치의 Gly를 Ala로 치환하는 변이를 도입한 개변 도메인이다. 또한, Z 도메인에서는, B 도메인 1 위치의 Ala를 Val로 치환하는 변이도 동시에 도입되어 있지만, 이것은 유전자 공학적으로 복수의 도메인을 연결한 코딩 유전자를 제작하기 쉽게 하는 것을 목적으로 한 변이로, 도메인의 기능에 대하여 영향은 미치지 않는다(예를 들어, 특허문헌 4에는, Z 도메인 1 위치의 Val을 Ala로 치환한 변이체를 사용한 실시예가 있음).

Z 도메인은, B 도메인보다 알칼리 내성이 높은 것이 알려져 있고, 살균·세정 효과가 높은 알칼리 용액을 사용한 세정에 의한, 칼럼의 반복 사용에 이점을 갖는다. Z 도메인을 베이스로 해서, Asn을 다른 아미노산으로 치환함으로써 한층 더한 알칼리 내성을 부여한 리간드가 발명되고(특허문헌 5, 특허문헌 6), 공업적 사용도 개시되어 있다.

이와 같이, 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인(E, D, A, B 및 C 도메인)에 대하여, 29 위치의 Gly를 Ala로 치환하는 변이를 도입하는 것의 유용성은 널리 인지되어 있다. 실제로, 1987년에 이 「G29A」의 변이가 공개되고나서, 이후에 개발된 개변 단백질 A에 관한 선행 기술에 있어서도, 이 「G29A」의 변이가 도입되고 있다(특허문헌 2, 특허문헌 4, 특허문헌 6).

Z 도메인의 또 하나의 특징으로서는, 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 결합능이 약해져 있는 것을 들 수 있다(비특허문헌 5). 이 특징에 의해, 결합한 항체를 산으로 해리하는 공정에 있어서, 항체가 해리되기 쉽다고 하는 이점이 있다(비특허문헌 1, 특허문헌 7). 항체가 해리되기 쉬우면, 보다 적은 용량의 용출액으로 보다 고농도의 항체 함유 용출액을 회수 가능하게 할 수 있다. 최근, 항체 의약 제조에 있어서, 1배치당의 세포 배양액량이 10,000리터를 초과하게 되고, 항체 발현 수준은 지난 수년간 10g/L까지의 향상이 실현되고 있다(비특허문헌 6). 하류가 되는 정제 공정도, 필연적으로 그 처리 스케일의 증대에 대한 대응이 요구되고 있어, 적은 용량의 용출액으로 보다 고농도의 항체 함유 용출액을 회수 가능하게 하는 기술 개량에 대해 기대가 매우 크다.

Z 도메인 이외에, 개변 단백질 A·리간드로서, 단백질 A의 C 도메인을 베이스로 한 연구가 진행되고 있다(특허문헌 4). 이들 리간드는, 야생형 C 도메인이 원래 갖고 있는 높은 알칼리 내성을 살리는 것을 특징으로 하고 있고, B 도메인을 베이스로 해서 제조된 Z 도메인을 대신하는 새로운 베이스·도메인으로서 주목받고 있다. 그러나, C 도메인에 관해서 검증한 결과, C 도메인에 결합한 항체를 산으로 해리하는 공정에 있어서, 항체가 해리되기 어렵다는 결점이 있는 것이 판명되었다. 비특허문헌 2나 특허문헌 4에 있어서, C 도메인이 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 결합능이 강한 것이 개시되어 있고, 이 특징이, 항체가 산으로 해리되기 어려운 원인이 되고 있다고 추측되었다. 이 결점을 개선하기 위해서, 29 위치의 Gly를 Ala로 치환하는 변이를 도입한 C 도메인을 사용하여, 항체 산 해리 특성을 검증한 결과, 야생형의 C 도메인에 비하면 항체가 해리되기 쉬워지는 경향을 보였지만, 아직 불충분하였다.

이와 같이, 현재, 단백질 A의 면역 글로불린 결합성 도메인으로부터 항체가 해리되기 쉬운 변이라고 하는 것은, 「G29A」만이 공지이다. 전술한 바와 같이, 「G29A」는 항체가 해리되기 쉽다는 점 이외에도 이점을 갖고 있고, 29 위치 이외의 위치로의 변이에 의한 기술 개량이 기대되고 있다. 그러나, 29 위치 이외의 위치로의 변이에 의해 항체가 더욱 해리되기 쉬워졌다고 하는 보고는 이루어져 있지 않다.

미국 특허 제6399750호 공보 일본 특허 출원 공개 제2007-252368호 공보 미국 특허 제5143844호 공보 일본 특허 출원 공개 제2006-304633호 공보 유럽 특허 제1123389호 공보 국제 공개 제03/080655호 공보 미국 공개 제2006/0194950호 공보

Hober S.외 저, 「J.Chromatogr．B」 2007년, 848권, 40-47페이지 Low D.외 저, 「J.Chromatogr．B」, 2007년, 848권, 48-63페이지 Roque A.C.A.외 저, 「J.Chromatogr．A」, 2007년, 1160권, 44-55페이지 Nilsson B.외 저, 「Protein Engineering」, 1987년, 1권, 107-113페이지 Jansson B.외 저, 「FEMS Immunology and Medical Microbiology」, 1998년, 20권, 69-78페이지 이나가와 순이치 외 저, 「분리 기술」, 2008년, 38권, 201-207페이지

29 위치 이외의 아미노산으로의 변이 도입에 의해, 기존의 개변형 단백질 A 리간드보다 우수한 항체 산 해리 특성을 갖는 신규 개변 단백질 A 리간드를 창출하는 것이, 본 발명이 해결하려고 하는 과제이다.

본 발명자들은, 29 위치 이외의 위치로의 아미노산 치환 변이를 갖는 수많은 재조합 단백질 변이체를 분자 설계하고, 단백질 공학적 방법 및 유전자 공학적 방법을 사용하여 상기 변이체를 형질 전환 세포로부터 취득하고, 상기 변이체의 활성을 비교 검토함으로써, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 서열 번호 1 내지 5에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인으로부터 선택되는 적어도 1개의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열에 있어서, A, B 및 C 도메인의 31 내지 37 위치의 아미노산 잔기, E 도메인의 29 내지 35 위치의 아미노산 잔기, 또는 D 도메인의 34 내지 40 위치의 아미노산 잔기에, 적어도 1개의 아미노산 치환 변이를 도입한 아미노산 서열을 갖는 단백질이며, 변이 도입 전의 단백질과 비교하여 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 친화성이 저하되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질에 관한 것이다.

변이 도입 전의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열이, 서열 번호 1 내지 5에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 6 내지 10에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인에서 유래하는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.

변이 도입 전의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열이, 서열 번호 5에 기재된 단백질 A의 C 도메인의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10에 기재된 단백질 A의 C 도메인에서 유래하는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.

변이 도입 전의 아미노산 잔기에 있어서, 각 도메인에 있어서의 C 도메인의 33 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Ser, 각 도메인에 있어서의 C 도메인의 35 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Lys, 각 도메인에 있어서의 C 도메인의 36 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asp, 또는 각 도메인에 있어서의 C 도메인의 37 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asp인 것이 바람직하다.

도입되는 아미노산 치환 변이가 C 도메인의 33 위치에 대응하는 Ser을 Glu, Leu 또는 Thr로 치환하는 변이, C 도메인의 35 위치에 대응하는 Lys를 Arg로 치환하는 변이, C 도메인의 36 위치에 대응하는 Asp를 Arg 또는 Ile로 치환하는 변이, 또는 C 도메인의 37 위치에 대응하는 Asp를 Glu로 치환하는 변이인 것이 바람직하다.

도입되는 아미노산 치환 변이가 C 도메인의 33 위치에 대응하는 Ser을 Glu로 치환하는 변이인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 2개 이상 연결시킨 복수 도메인을 포함하는 단백질에 관한 것이다.

연결시키는 단백질이 종류가 상이한 단백질이고, 연결시키는 단백질의 수가 2 내지 5개인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 DNA에 관한 것이다.

상기 DNA에 있어서, 연결되어 있는 도메인을 구성하는 염기 서열의 서열 동일성이 90% 이하인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 DNA를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 벡터에서 숙주를 형질 전환시켜 얻어지는 형질 전환체에 관한 것이다.

상기 형질 전환체에 있어서, 숙주가 그램 양성균인 것이 바람직하다.

그램 양성균이 브레비바실러스(Brevibacillus)속 세균인 것이 바람직하고, 브레비바실러스속 세균이 브레비바실러스·초시넨시스(Brevibacillus choshinensis)인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 형질 전환체 또는 상기 DNA를 사용한 무세포 단백질 합성계를 사용하는, 상기 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

상기 제조 방법에 있어서, 형질 전환체의 세포 내 및/또는 페리플라즘(periplasm) 영역 내에 단백질을 축적하는 것, 및/또는 형질 전환체의 세포 밖으로 단백질을 분비하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 친화성 리간드로 해서, 수불용성 기재로 이루어지는 담체에 고정화한 것을 특징으로 하는 친화성 분리 매트릭스에 관한 것이다.

수불용성 기재는 합성 고분자 또는 다당류를 포함하는 것이 바람직하고, 다당류는 셀룰로오스인 것이 바람직하다.

상기 친화성 분리 매트릭스는 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질에 결합하는 것이 바람직하고, 면역 글로불린 G 또는 면역 글로불린 G 유도체에 결합하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질의 분리에 있어서의, 상기 친화성 분리 매트릭스의 용도에 관한 것이다. 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질의 분리는 면역 글로불린의 Fab 영역만으로 이루어지는 단백질의 분리 회수를 목적으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 단백질은 우수한 항체 산 해리 특성을 나타낸다. 상기 단백질을 담체에 고정화한 친화성 분리 매트릭스를 사용함으로써, 항체의 분리 정제를 개선하는 것이 가능해진다. 본 발명의 단백질은 모든 도메인에서 보존되어 있는 아미노산 부위에 변이가 도입되므로, 본 발명의 단백질 및 친화성 분리 매트릭스는 E, D, A, B 및 C 도메인 중 어느 하나의 도메인을 사용한 경우라도, 공통해서 상술한 효과를 갖는다.

도 1은 스타필로코커스(Staphylococcus)의 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인의 서열 비교표.
도 2는 본 발명의 실시예 10 및 비교예 3에 따른, Biacore 측정에 있어서의, 각종 GST 융합 C 도메인 변이체의 모노클로널 IgG-Fab(VH3형)에의 결합 센서그램(sensorgram).
도 3은 본 발명의 실시예 12에 따른, 친화성 분리 매트릭스(4)의 항체에 대한 5% dBC에 관한 그래프.
도 4는 본 발명의 실시예 13 및 비교예 1에 따른, 친화성 분리 매트릭스(1)를 사용한 항체 정제 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일을 도시한 도면.
도 5는 본 발명의 실시예 13 및 비교예 2에 따른, 친화성 분리 매트릭스(2)를 사용한 항체 정제 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일을 도시한 도면.
도 6은 본 발명의 실시예 13 및 비교예 1에 따른, 친화성 분리 매트릭스(3)를 사용한 항체 정제 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일을 도시한 도면.
도 7은 본 발명의 실시예 13에 따른, 친화성 분리 매트릭스(4)를 사용한 항체 정제 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일을 도시한 도면.

본 발명의 단백질은, 서열 번호 1 내지 5에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인으로부터 선택되는 적어도 1개의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열에 있어서, 모든 도메인에서 보존되어 있는, A, B 및 C 도메인의 31 내지 37 위치의 아미노산, E 도메인의 29 내지 35 위치의 아미노산, 또는 D 도메인의 34 내지 40 위치의 아미노산에 대하여, 적어도 1개의 아미노산 치환 변이를 도입한 아미노산 서열을 가지며, 상기 변이를 도입하기 전의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 비해 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 친화성이 저하되어 있고, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 것을 특징으로 한다.

단백질 A는 면역 글로불린 결합성 도메인, 즉 면역 글로불린 결합성 단백질이 5개 연결된 형태로 구성되는 단백질이다. 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인은, 면역 글로불린의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 영역에 결합할 수 있는 면역 글로불린 결합성 도메인이고, 어떠한 도메인도 면역 글로불린의 Fc 영역, Fab 영역, 및 Fab 영역 중 특히 Fv 영역의, 각각의 영역에 대하여 결합하는 활성을 갖는다. 또한, 본 발명에 있어서 단백질 A의 유래는 특별히 한정되지 않지만, 스타필로코커스(Staphylococcus)에 유래하는 단백질 A인 것이 바람직하다.

「단백질」이라고 하는 용어는, 폴리펩티드 구조를 갖는 모든 분자를 포함하는 것으로서, 단편화된, 또는 펩티드 결합에 의해 연결된 폴리펩티드 사슬도 「단백질」이라고 하는 용어에 포함된다. 또한, 「도메인」이란 단백질의 고차 구조상의 단위이며, 수십 내지 수백의 아미노산 잔기 서열로 구성되고, 어떠한 물리 화학적 또는 생물 화학적인 기능을 발현하기에 충분한 단백질의 단위를 말한다.

도메인에서 유래하는 아미노산 서열은 변이를 도입하기 전의 아미노산 서열을 가리키고, 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 어느 하나의 야생형 아미노산 서열에만 한정되는 것은 아니고, 아미노산의 치환, 삽입, 결실 및 화학 수식에 의해 부분적으로 개변된 아미노산 서열이어도, Fc 영역에 대한 결합능을 갖고 있는 단백질인 한 이에 포함된다. 도메인에서 유래한 아미노산 서열로서, 예를 들어 서열 번호 1 내지 5에 기재된 스타필로코커스의 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인을 구성하는 아미노산 서열을 들 수 있고, 또한 서열 번호 6 내지 10에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인을 구성하는 아미노산 서열을 들 수 있다. 또한, 서열 번호 6 내지 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질은, 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인(서열 번호 1 내지 5)에 대하여, C 도메인의 29 위치에 대응하는 Gly를 Ala로 치환하는 변이를 도입한 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 또한, B 도메인에 A1V와 G29A라고 하는 변이를 도입한 Z 도메인도 Fc 영역에 대한 결합능을 갖고 있으므로, 도메인에서 유래하는 아미노산 서열에 해당한다. 예를 들어, 변이를 도입하기 전의 아미노산 서열은, 화학 안정성이 높은 도메인 또는 그의 변이체인 것이 바람직하다.

아미노산 치환 변이를 도입하는 단백질은, 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 어느 하나의 야생형 아미노산 서열과, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산의 서열 동일성을 갖고, Fc 영역에 대한 결합능을 갖는다.

모든 도메인에서 보존되어 있는 아미노산 잔기는, E, D, A, B 및 C 도메인의 아미노산 서열을 비교했을 때에, 동일한 위치에 존재하는 동일한 아미노산 잔기를 의미한다. 도 1의 서열 비교표에 나타내는 바와 같이, A, B 및 C 도메인의 26 내지 39 위치, E 도메인의 24 내지 37 위치, D 도메인의 29 내지 42 위치의 아미노산 잔기는 모든 도메인에 있어서 보존되어 있다. 모든 도메인에서 보존되어 있는 구체적인 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 A, B 및 C 도메인의 31 내지 37 위치의 아미노산, E 도메인의 29 내지 35 위치의 아미노산, 또는 D 도메인의 34 내지 40 위치의 아미노산을 들 수 있다. 또한, C 도메인의 33 위치에 대응하는 Ser, C 도메인의 35 위치에 대응하는 Lys, C 도메인의 36 위치에 대응하는 Asp, 및 C 도메인의 37 위치에 대응하는 Asp인 것이 바람직하다. 특히, C 도메인의 33 위치에 대응하는 Ser인 것이 보다 바람직하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 「대응한다」란, 도 1에 도시하는 바와 같이 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인을 나열했을 때에, 종렬로 동일한 위치로 되는 것을 말한다.

일반적으로, 아미노산 서열이 고도로 보존되어 있는 영역은 단백질의 기능에 중요한 영역인 경우가 많고, 그러한 영역에 변이를 도입하면 단백질의 기능이 상실되는 경우가 많다. 그러나, 상기한 영역에 있어서는 아미노산 서열이 고도로 보존되어 있음에도 불구하고, 변이를 도입해도, 면역 글로불린의 Fc 영역에 대한 결합능에 큰 영향을 미치지 않고, 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 결합능만을 대폭으로 저하시킬 수 있다.

또한, 변이를 도입하기 전의 아미노산 서열이, 화학 안정성이 높은 도메인 또는 그의 변이체인 경우, 도메인을 구성하는 아미노산이 60 아미노산 정도로 적기 때문에, 새롭게 변이를 도입함으로써 화학 안정성이 저하되는 경우가 많은 것은 공지의 사실이다. 예를 들어, C 도메인의 30 위치에 대한 Phe를 Ala로 치환한 변이체는, 알칼리에 대한 화학 안정성이 크게 저하된다(문헌 [Linhult M. 외, PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics, 2004년, 55권, 407-416]). 그러나, 본 발명에 있어서의 아미노산 변이는 원래 갖는 화학 안정성을 유지한 채로 상술한 효과를 발휘하는 것이 가능하다.

아미노산 치환 변이는 원래의 아미노산을 제거하고, 그 위치에 종류가 상이한 다른 아미노산을 추가하는 변이를 의미한다. 추가되는 다른 아미노산은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 천연의 단백질 구성 아미노산, 단백질 비구성 아미노산, 비천연 아미노산을 들 수 있다. 이 중에서도, 유전자 공학적 생산의 관점으로부터, 천연 아미노산을 적절하게 사용할 수 있다. 천연 아미노산으로서는, 예를 들어 Ala, Phe, Val, Trp, Leu, Pro, Ile, Met, Gly, Asn, Ser, Gln, Thr, Tyr, Cys, Lys, His, Asp, Glu 및 Arg를 들 수 있고, 특히 Glu 또는 Arg인 것이 바람직하다. 아미노산 치환 변이의 수는, 변이를 포함하는 단백질의, 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 친화성이 저하되고, 면역 글로불린 전체에 대한 친화성이 유지되어 있으면 특별히 한정되지 않지만, 변이 도입 전의 단백질의 입체 구조의 유지라고 하는 관점으로부터는, 4개 이하인 것이 바람직하고, 2개 이하인 것이 보다 바람직하다.

또한, 아미노산을 치환하는 변이의 표기에 대해서, 치환 위치의 번호 앞에, 야생형 또는 비변이형의 아미노산을 붙이고, 치환 위치의 번호 뒤에, 변이한 아미노산을 붙여서 표기한다. 예를 들어, 29 위치의 Gly를 Ala로 치환하는 변이는 G29A라고 기재한다.

아미노산 치환 변이를, 상술한 모든 도메인에서 보존되어 있는 아미노산 부위에 도입하는 경우, 도입예로서는, 예를 들어 C 도메인의 33 위치에 대응하는 Ser을 Glu, Leu 또는 Thr로 치환하는 변이, C 도메인의 35 위치에 대응하는 Lys를 Arg로 치환하는 변이, C 도메인의 36 위치에 대응하는 Asp를 Arg 또는 Ile로 치환하는 변이, 및 C 도메인의 37 위치에 대응하는 Asp를 Glu로 치환하는 변이를 들 수 있다. 특히, C 도메인의 33 위치에 대응하는 Ser을 Glu로 치환하는 변이인 것이 바람직하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

아미노산 치환 변이를 도입해서 얻어지는 단백질은, 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인 중 어느 하나의 야생형 아미노산 서열과, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 아미노산의 서열 동일성을 갖고, Fc 영역에 대한 결합능을 갖는다.

본 발명의 단백질은 아미노산 치환 변이가 도입된 단일의 도메인만으로 이루어지는 단백질이어도 되지만, 상기한 단백질을 2개 이상 연결시켜 복수 도메인을 포함하는 단백질로 할 수도 있다.

복수 도메인을 포함하는 단백질인 경우, 연결되는 단백질은 동종의 도메인에서 유래하는 단백질(호모다이머, 호모트라이머 등의 호모폴리머)이어도 되고, 종류가 상이한 도메인에서 유래하는 단백질(헤테로다이머, 헤테로트라이머 등의 헤테로폴리머)이어도 된다. 연결되는 단백질의 수는 2개 이상인 것이 바람직하고, 2 내지 10개인 것이 보다 바람직하고, 2 내지 5개인 것이 더욱 바람직하다.

복수 도메인을 포함하는 단백질에 있어서, 단량체 단백질끼리, 단(單) 도메인끼리의 연결 방법으로서는, 링커가 되는 아미노산 잔기를 개재시키지 않고 연결하는 방법, 또는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기로 연결하는 방법을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 연결되는 아미노산 잔기 수에 특별히 제한은 없다. 연결 양식 및 연결 수는, 단량체 단백질의 3차원 입체 구조를 불안정화시키지 않는 것이면, 특별히 한정되지 않는다.

또한, 상기 단백질, 또는 상기 복수 도메인을 포함하는 단백질을 1개의 구성 성분으로 해서, 기능이 상이한 다른 단백질과 융합되어 있는 융합 단백질도, 본 발명의 단백질에 포함된다. 융합 단백질의 예로서는, 알부민이나 GST(글루타티온S-트랜스퍼라아제), MBP(말토오스 결합 단백질)가 융합된 단백질을 예로서 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. GST, MBP와의 융합 단백질로서 발현함으로써, 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있다. 또한, DNA 앱타머 등의 핵산, 항생 물질 등의 약물, PEG(폴리에틸렌글리콜) 등의 고분자가 융합되어 있는 경우도, 본 발명과 동일한 효과를 발휘하는 것이면, 본 발명의 단백질에 포함된다.

본 발명은 상술한 단백질을 코딩하는 DNA에 관한 것이기도 하다. DNA는 그것을 구성하는 염기 서열을 번역한 아미노산 서열이 본 발명의 단백질을 구성하는 것이면 된다. 그러한 염기 서열은, 통상 사용되는 공지의 방법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(이하, PCR이라고 약기함)법을 이용해서 취득할 수 있다. 또한, 공지의 화학 합성법으로 합성하는 것도 가능하며, 또한 DNA 라이브러리로부터 얻을 수도 있다. 당해 염기 서열은, 코돈이 축중 코돈으로 치환되어 있어도 되고, 번역되었을 때에 동일한 아미노산을 코딩하고 있는 한, 본래의 염기 서열과 동일할 필요성은 없다.

본 발명의 DNA는, 야생형 또는 변이형의 단백질 A의 도메인을 코딩하는 종래 공지의 DNA에 대하여, 부위 특이적으로 변이를 도입함으로써 얻어진다. 부위 특이적인 변이의 도입은 이하와 같이 재조합 DNA 기술, PCR법 등을 사용하여 행할 수 있다.

재조합 DNA 기술에 의한 변이의 도입은, 예를 들어 본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자 중에, 변이 도입을 희망하는 목적 부위의 양측에 적당한 제한 효소 인식 서열이 존재하는 경우에, 그들 제한 효소 인식 서열 부분을 상기 제한 효소로 절단하고, 변이 도입을 희망하는 부위를 포함하는 영역을 제거한 후, 화학 합성 등에 의해 원하는 부위에만 변이 도입한 DNA 단편을 삽입하는 카세트 변이법에 의해 행할 수 있다.

또한, PCR에 의한 부위 특이적 변이의 도입은, 예를 들어 단백질을 코딩하는 이중쇄 플라스미드를 주형으로 해서, + 및 - 사슬에 상보적인 변이를 포함하는 2종의 합성 올리고 프라이머를 사용하여 PCR을 행하는 더블 프라이머법에 의해 행할 수 있다.

또한, 복수 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA는, 본 발명의 단량체 단백질(1개의 도메인)을 코딩하는 DNA를, 의도하는 수만큼 직렬로 연결함으로써 제작할 수 있다. 예를 들어, 복수 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA의 연결 방법은, DNA 서열에 적당한 제한 효소 부위를 도입하고, 제한 효소로 단편화한 2중쇄 DNA를 DNA 리가아제로 연결할 수 있다. 제한 효소 부위는 1종류라도 되지만, 복수의 서로 다른 종류의 제한 효소 부위를 도입할 수도 있다. 또는, 복수 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA는, 단백질 A를 코딩하는 DNA(예를 들어, 국제 공개 제06/004067호 공보)에 상기한 변이 도입법을 적용함으로써 제작하는 것도 가능하다. 여기서, 복수 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA에 있어서, 각각의 단량체 단백질을 코딩하는 염기 서열이 동일한 경우에는 숙주에서 상동 재조합을 유발할 가능성이 있으므로, 연결되어 있는 단량체 단백질을 코딩하는 DNA의 염기 서열간의 서열 동일성이 90% 이하, 보다 바람직하게는 85% 이하인 것이 바람직하다.

본 발명의 벡터는, 전술한 단백질 또는 복수 도메인을 포함하는 단백질을 코딩하는 염기 서열, 및 그 염기 서열에 작동 가능하게 연결된, 숙주에서 기능할 수 있는 프로모터를 포함한다. 보통은, 전술한 단백질을 코딩하는 DNA를, 벡터에 연결 또는 삽입함으로써 얻을 수 있다.

유전자를 삽입하기 위한 벡터는, 숙주 중에서 자율 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 플라스미드 DNA나 파지 DNA를 벡터로서 사용할 수 있다. 유전자를 삽입하기 위한 벡터는, 예를 들어 대장균을 숙주로서 사용하는 경우에는, pQE계 벡터(키아겐사제), pET계 벡터(머크사제) 및 pGEX계 벡터(GE 헬스케어·재팬(주)제)의 벡터 등을 들 수 있다. 브레비바실러스속 세균을 숙주로서 사용하는 경우에는, 예를 들어 고초균 벡터로서 공지인 pUB110 또는 pHY500(일본 특허 출원 공개 (평) 2-31682호 공보), pNY700(일본 특허 출원 공개 (평) 4-278091호 공보), pNU211R2L5(일본 특허 출원 공개 (평) 7-170984호 공보), pHT210(일본 특허 출원 공개 (평) 6-133782호 공보) 또는 대장균과 브레비바실러스속 세균의 셔틀벡터인 pNCMO2(일본 특허 출원 공개 제2002-238569호 공보) 등을 사용할 수 있다.

벡터로 숙주를 형질 전환함으로써, 형질 전환체를 얻을 수 있다. 숙주로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 저렴하게 대량 생산하는 데 있어서는, 대장균, 고초균, 브레비바실러스속, 스타필로코커스속, 스트렙토코커스속, 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 코리네박테리움속(Corynebacterium) 등의 박테리아(진정 세균)를 적절하게 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 고초균, 브레비바실러스속, 스타필로코커스속, 스트렙토코커스속, 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 코리네박테리움속(Corynebacterium) 등의 그램 양성균이 좋다. 더욱 바람직하게는, 단백질 A의 대량 생산으로의 적응예(국제 공개 제06/004067호 공보)가 공지된, 브레비바실러스속 세균이 좋다.

브레비바실러스속 세균으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 (브레비바실러스 아그리(Brevibacillus agri), 브레비바실러스 보르스텔렌시스(B. borstelensis), 브레비바실러스 브레비스(B. brevis), 브레비바실러스 센트로스포러스(B. centrosporus), 브레비바실러스 초시넨시스(B. choshinensis), 브레비바실러스 포르모서스(B. formosus), 브레비바실러스 이보카투스(B. invocatus), 브레비바실러스 라테로스포러스(B. laterosporus), 브레비바실러스 림노필러스(B. limnophilus), 브레비바실러스 파라브레비스(B. parabrevis), 브레비바실러스 레우스제리(B. reuszeri), 브레비바실러스 테르모러베르(B.thermoruber)를 들 수 있다. 바람직하게는, 브레비바실러스·브레비스 47주(JCM6285), 브레비바실러스·브레비스 47K주(FERM BP-2308), 브레비바실러스·브레비스 47-5Q주(JCM8970), 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31주(FERM BP-1087) 및 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31-OK주(FERM BP-4573)를 들 수 있다. 생산량의 향상 등의 목적에 따라, 상기 브레비바실러스속 세균의 프로테아제 결손주, 고발현주 또는 아포 형성능 결실주와 같은 변이주(또는, 유도주)를 사용해도 된다. 구체적으로 예를 들면, 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31 유래의 프로테아제 변이주인 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31-OK(일본 특허 출원 공개 (평) 6-296485호 공보)나, 아포 형성능을 갖지 않는 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31-SP3(국제 공개 제05/045005호 공보)을 사용할 수 있다.

숙주 세포로의 벡터의 도입 방법으로서는, 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법, 전기 영동법, 스페로플라스트(Spheroplast)법, 아세트산 리튬법, 아그로박테리움(Agrobacterium) 감염법, 입자총법 또는 폴리에틸렌글리콜법 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 얻어진 유전자의 기능을 숙주에서 발현하는 방법으로서는, 본 발명에서 얻어진 유전자를 게놈(염색체)에 삽입시키는 방법 등도 들 수 있다.

상기한 형질 전환체, 또는 DNA를 사용한 무세포 단백질 합성계에 의해, 단백질을 제조할 수 있다.

형질 전환체를 사용하여 단백질을 제조하는 경우, 형질 전환 세포를 배지에서 배양하고, 배양균체 중(균체 페리플라즘 영역 중도 포함함) 또는 배양액 중(균체 밖)에 본 발명의 단백질을 생성 축적시키는 것에 의해 제조할 수 있고, 상기 배양물로부터 원하는 단백질을 채취할 수 있다.

형질 전환 세포를 사용하여 단백질을 제조하는 경우에는, 형질 전환체의 세포 내 및/또는 페리플라즘 영역 내에 단백질을 축적하는 것도 가능하다. 이 경우, 세포 내에 축적하면, 발현 단백질의 산화를 방지할 수 있고, 배지 성분과의 부반응도 없다는 점에서 유리하며, 페리플라즘 영역 내에 축적하면, 세포 내 프로테아제에 의한 분해를 억제할 수 있다는 점에서 유리하다. 한편, 단백질을 제조하는 경우에, 형질 전환체의 세포 밖에 단백질을 분비하는 것도 가능하다. 이 경우, 균체 파쇄나 추출의 공정이 불필요하게 되기 때문에, 제조 비용이 저감되는 점에서 유리하다.

본 발명의 형질 전환 세포를 배지에서 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행해진다. 얻어진 형질 전환체의 배양에 사용하는 배지는 상기 단백질을 고효율, 고수량으로 생산할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없다. 구체적으로는, 글루코오스, 자당, 글리세롤, 폴리펩톤, 육류 엑기스, 효모 엑기스, 카자미노산 등의 탄소원이나 질소원을 사용할 수 있다. 그 밖에, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 마그네슘염, 망간염, 아연염, 철염 등의 무기염류가 필요에 따라서 첨가된다. 영양 요구성의 숙주 세포를 사용하는 경우에는, 생육에 요구되는 영양 물질을 첨가할 수 있다. 또한, 필요하다면 페니실린, 에리트로마이신, 클로램페니콜, 네오마이신 등의 항생 물질이 첨가되어도 된다.

또한, 균체 내외에 존재하는 숙주 유래의 프로테아제에 의한 해당 목적 단백질의 분해, 저분자화를 억제하기 위해서, 공지의 각종 프로테아제 저해제, 즉 페닐메탄 술포닐 플루오라이드(PMSF), 벤즈아미딘, 4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드(AEBSF), 안티파인, 키모스타틴, 류펩틴, 펩스타틴 A, 포스포아미돈, 아프로티닌, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및/또는 그 밖에 시판되고 있는 프로테아제 저해제를 적당한 농도로 첨가해도 된다.

또한, 본 발명의 단백질을 정확하게 폴딩시키기 위해서, 예를 들어 GroEL/ES, Hsp70/DnaK, Hsp90, Hsp104/ClpB 등의 분자 셰프론을 이용해도 된다. 이 경우, 예를 들어 공발현 또는 융합 단백질화 등의 방법으로, 본 발명의 단백질과 공존시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질의 정확한 폴딩을 목적으로 하는 경우에는, 정확한 폴딩을 조장하는 첨가제를 배지 중에 첨가하는 방법, 및 저온에서 배양하는 등의 방법도 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

대장균을 숙주로 해서 얻어진 형질 전환 세포를 배양하는 배지로서는, LB 배지(트립톤 1%, 효모 엑기스 0.5%, NaCl 1%) 또는 2xYT 배지(트립톤 1.6%, 효모 엑기스 1.0%, NaCl 0.5%) 등을 들 수 있다.

브레비바실러스속 세균을 숙주로 해서 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, TM 배지(펜톤 1%, 육류 엑기스 0.5%, 효모 엑기스 0.2%, 글루코오스 1%, pH7.0) 또는 2SL 배지(펩톤 4%, 효모 엑기스 0.5%, 글루코오스 2%, pH7.2) 등을 들 수 있다.

또한, 배양 온도는, 15 내지 42℃, 바람직하게는 20 내지 37℃이고, 통기 교반 조건에서 호기적으로 수 시간 내지 수일 배양함으로써 본 발명의 단백질을, 배양 세포내(페리플라즘 영역 내를 포함함) 또는 배양 용액(세포 밖)에 축적시켜서 회수한다. 경우에 따라서는, 통기를 차단하여 혐기적으로 배양해도 된다.

재조합 단백질이 분비 생산되는 경우에는, 배양 종료 후에, 원심 분리, 여과 등의 일반적인 분리 방법으로, 배양 세포와 분비 생산된 단백질을 포함하는 상청을 분리함으로써 생산된 재조합 단백질을 회수할 수 있다.

또한, 배양 세포내(페리플라즘 영역 내를 포함함)에 축적되는 경우에도, 예를 들어 배양액으로부터 원심 분리, 여과 등의 방법에 의해 균체를 채취하고, 다음으로 이 균체를 초음파 파쇄법, 프렌치 프레스법 등에 의해 파쇄하고/하거나 계면 활성제 등을 첨가해서 가용화함으로써, 세포 내에 축적 생산된 단백질을 회수할 수 있다.

본 발명의 단백질을 무세포 단백질 합성계에 의해 제조하는 경우, 무세포 단백질 합성계로는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 원핵세포 유래, 식물세포 유래, 고등동물 세포 유래의 합성계 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질의 정제는 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절하게 조합함으로써 행할 수 있다.

얻어진 정제 물질이 목적 단백질인지의 확인은 통상의 방법, 예를 들어 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, N 말단 아미노산 서열 분석, 웨스턴 블로팅 등에 의해 행할 수 있다.

상기한 방법에 의해 생산한 단백질을, 수불용성의 기재로 이루어지는 담체에 친화성 리간드로서 고정화하여 친화성 분리 매트릭스를 제조할 수 있다. 여기서, 「친화성 리간드」란, 항원과 항체의 결합으로 대표되는, 특이적인 분자간의 친화력에 기초하여 어떤 분자의 집합으로부터 목적하는 분자를 선택적으로 포집(결합)하는 물질(관능기)을 가리키는 용어이며, 본 발명에 있어서는 면역 글로불린에 대하여 특이적으로 결합하는 단백질을 가리킨다. 본 명세서에 있어서는, 단순히 「리간드」라고 표기한 경우도 「친화성 리간드」와 동의이다.

본 발명에 사용되는 수불용성의 기재로 이루어지는 담체로서는, 유리 비즈, 실리카 겔 등의 무기 담체, 가교 폴리비닐알코올, 가교 폴리아크릴레이트, 가교 폴리아크릴아미드, 가교 폴리스티렌 등의 합성 고분자나, 결정성 셀룰로오스, 가교 셀룰로오스, 가교 아가로오스, 가교 덱스트란 등의 다당류를 포함하는 유기 담체, 나아가서는 이들의 조합에 의해 얻어지는 유기-유기, 유기-무기 등의 복합 담체 등을 들 수 있다.

시판품으로서는, 다공질 셀룰로오스 겔인 GCL2000, 알릴 덱스트란과 메틸렌 비스 아크릴아미드를 공유 결합으로 가교한 Sephacryl S-1000, 메타크릴레이트계의 담체인 Toyopearl, 아가로오스계의 가교 담체인 Sepharose CL4B 및 셀룰로오스계의 가교 담체인 Cellufine 등을 예시할 수 있다. 단, 본 발명에 있어서의 수불용성 담체는 예시된 이들 담체로만 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 사용하는 수불용성 담체는, 본 친화성 분리 매트릭스의 사용 목적 및 방법을 고려해 보았을 때, 표면적이 큰 것이 바람직하고, 적당한 크기의 세공을 다수 갖는 다공질인 것이 바람직하다. 담체의 형태로서는, 비즈상, 모노 리스상, 섬유상, 막상(중공사를 포함함) 등 어느 것도 가능하고, 임의의 형태를 선택할 수 있다.

리간드의 고정화 방법에 대해서는, 예를 들어 리간드에 존재하는 아미노기, 카르복실기 또는 티올기를 이용한 종래의 커플링법으로 담체에 결합시켜도 된다. 커플링법으로서는, 담체를 브롬화시안, 에피클로로히드린, 디글리시딜 에테르, 토실클로라이드, 트레실클로라이드, 히드라진 및 과요오드산 나트륨 등과 반응시켜서 담체를 활성화하고(또는 담체 표면에 반응성 관능기를 도입하고), 리간드로서 고정화하는 화합물과 커플링 반응을 행하여 고정화하는 방법, 또한 담체와, 리간드로서 고정화하는 화합물이 존재하는 계에 카르보디이미드와 같은 축합 시약 또는 글루타르알데히드와 같이 분자 중에 복수의 관능기를 갖는 시약을 가해서 축합, 가교하는 것에 의한 고정화 방법을 들 수 있다.

또한, 리간드와 담체 사이에 복수의 원자로 이루어지는 스페이서 분자를 도입해도 되고, 담체에 리간드를 직접 고정화시켜도 된다. 따라서, 고정화를 위해, 본 발명의 단백질에 대하여, 화학 수식해도 되고, 고정화에 유용한 아미노산 잔기를 첨가해도 된다. 고정화에 유용한 아미노산으로서는, 측쇄에 고정화의 화학 반응에 유용한 관능기를 갖고 있는 아미노산을 들 수 있고, 예를 들어 측쇄에 아미노기를 포함하는 Lys나, 측쇄에 티올기를 포함하는 Cys를 들 수 있다. 본 발명의 본질은, 본 발명에 있어서 단백질에 부여한 효과가, 상기 단백질을 리간드로서 고정화한 매트릭스에 있어서도 마찬가지로 부여되는 것에 있고, 고정화를 위해 어떻게 수식·개변해도, 본 발명의 범위에 포함된다.

친화성 분리 매트릭스는, 본 발명의 단백질을 고정화해서 얻어지므로, 본 발명의 단백질 자체의 활성에 기초하여, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질에 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 및 친화성 분리 매트릭스를 이용하여, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질을 친화성 칼럼·크로마토그래피 정제법에 의해 분리 정제하는 것이 가능해진다. 「면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질」이란, 단백질 A가 결합하는 Fc 영역측의 부위를 포함하는 단백질이다. 단, 단백질 A가 결합될 수 있으면, Fc 영역을 완전하게 포함하는 단백질일 필요는 없다.

면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질로서는, 면역 글로불린 G 또는 면역 글로불린 G 유도체를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질의 구체예로서, VH3 서브 패밀리에 속하는 IgG를 들 수 있고, 특히 VH3 서브 패밀리에 속하는 인간 IgG(모노클로널 항체)를 들 수 있다. 본 발명의 단백질 및 친화성 분리 매트릭스는, VH3 서브 패밀리에 속하는 IgG의 Fab 영역에 대한 친화성이, 변이를 도입하기 전의 단백질에 비해서 저하되어 있는 것이 바람직하고, 동시에 서브 타입이 1, 2 및 4인 IgG의 Fc 영역에 친화성을 갖는 것이 바람직하다. 인간의 VH 생식세포 유전자의 대략 절반이 VH3 서브 패밀리에 속하고, 실제로 VH3 서브 패밀리에 속하는 IgG 항체를 포함하는 의약이 시판중·개발중이다. 또한, 항체 정제에 있어서 친화성 분리 매트릭스에 사용되는 리간드에 VH3 서브 패밀리에 속하는 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 결합능이 남아있는 것이 항체의 산해리 특성에 악영향을 주는 것은, 이미 문헌 등에 의해 공지된 정보라고 할 수 있다(문헌 [Ghose S. 외, Biotechnology and bioengineering, 2005년, 92권, 6호]). 따라서, 본 발명의 단백질 및 친화성 분리 매트릭스는 VH3 서브 패밀리에 속하는 인간 IgG의 Fab 영역에 대한 결합능이 저감되어 있는 것이 바람직하다.

상기 「면역 글로불린 G 유도체」란, 예를 들어 인간 면역 글로불린 G의 일부의 도메인을 타생물종의 면역 글로불린 G의 도메인으로 치환해서 융합시킨 키메라형 면역 글로불린 G나, 인간 면역 글로불린 G의 CDR(Complementarity Determinig Regions) 부분을 타생물종 항체의 CDR 부분으로 치환해서 융합시킨 인간형화 면역 글로불린 G, Fc 영역의 당쇄에 분자 개변을 가한 면역 글로불린 G, 인간 면역 글로불린 G의 Fv 영역과 Fc 영역을 융합시킨 인공면역 글로불린 G 등의, 단백질 A가 결합할 수 있는 개변형 인공 단백질을 총칭하는 명칭이다.

또한, 결합하는 영역을 Fab 영역(특히 Fv 영역) 및 Fc 영역으로서 넓게 정의했지만, 항체의 입체 구조는 이미 기지이므로, 본 발명의 단백질 및 친화성 분리 매트릭스가 결합하는 대상으로 되는 단백질은, 단백질 공학적으로 단백질 A가 결합하는 영역의 입체 구조를 유지한 후에, Fab 영역이나 Fc 영역에 한층 더한 개변(단편화 등)이 실시된 것이어도 된다.

본 발명의 친화성 분리 매트릭스를 충전한 친화성 칼럼을 사용하여 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질을 정제하는 방법은, 이미 시판품으로서 존재하는 단백질 A 칼럼을 사용한 친화성 칼럼·크로마토그래피 정제법에 준한다(비특허문헌 3). 즉, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질을 함유하는 완충액을 중성이 되도록 조정한 후, 상기 용액을 본 발명의 친화성 분리 매트릭스를 충전한 친화성 칼럼에 통과시키고, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질을 흡착시킨다. 다음으로, 친화성 칼럼에 순수한 완충액을 적당량 통과시키고, 칼럼 내부를 세정한다. 이 시점에서는 원하는 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질은 칼럼 내의 본 발명의 친화성 분리 매트릭스에 흡착되어 있다. 다음으로, 적절한 pH에 조정한 산성 완충액(이 매트릭스로부터의 해리를 촉진하는 물질을 포함하는 경우도 있음)을 칼럼에 통액시키고, 원하는 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질을 용출함으로써, 고순도의 정제가 달성된다.

본 발명의 친화성 분리 매트릭스는, 리간드 화합물이나 담체의 기재를 완전하게 기능을 손상시키지 않을 정도의 적당한 강산성 또는 강알칼리성의 순수한 완충액(적당한 변성제 또는 유기 용제를 포함하는 용액의 경우도 있음)을 통과시켜 세정함으로써, 재이용이 가능하다.

본 발명의 단백질 및 그것을 사용한 친화성 분리 매트릭스는, 면역 글로불린에 대한 친화성을 갖고, 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 친화성은 저하된다고 하는 효과를 나타낸다. 일반적으로는, 단백질 A의 각각의 도메인은, Fab(Fv) 영역보다도 Fc 영역에 대하여 보다 강하게 결합한다(비특허문헌 3). 따라서, 단백질 A 및 각각의 도메인의 「면역 글로불린에 대한 친화성」은, 본질적으로는 Fc 영역에 대한 친화성을 가리키는 표현이며, Fab 영역에 대한 결합력만이 변화되어도 면역 글로불린에 대한 친화성의 강도는 크게 변화되지 않는다. 본 발명의 단백질은, 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인이 갖는 Fab 영역에의 2차적인 친화성이 저하되어 있어, 면역 글로불린과의 상호 작용에 있어서의 2차적인 결합의 영향을 배제할 수 있다고 하는 효과를 나타낸다. 한편, Fc 영역에 대한 친화성은 유지되어 있으므로, 면역 글로불린 전체에 대한 친화성은 유지되어 있다. 본 발명의 단백질이 갖는 면역 글로불린에 대한 친화성은, 인간 면역 글로불린 G 제제에 대한 친화성을 후술하는 Biacore 시스템에 의해 측정했을 때에, 친화 상수(KA)가 10⁶(M^-1) 이상인 것이 바람직하고, 10⁷(M^-1) 이상인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 단백질 및 친화성 분리 매트릭스의, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질에 대한 친화성은, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 원리를 사용한 Biacore 시스템(GE 헬스케어·재팬(주)제) 등의 바이오센서에 의해 시험할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

측정 조건으로서는, 단백질 A가 면역 글로불린의 Fc 영역에 결합했을 때의 결합 시그널을 검출할 수 있는 조건이면 되고, 온도 20 내지 40℃(일정 온도)이고, pH6 내지 8의 중성 조건에서 측정함으로써 간단하게 평가할 수 있다.

결합 상대의 면역 글로불린 분자는, Fab 영역에의 결합을 검출할 수 있으면 특별히 한정은 되지 않지만, Fc 영역을 포함하는 면역 글로불린 분자를 사용하면 Fc 영역에의 결합도 검출되므로, Fc 영역을 제외하도록 Fab 영역을 단편화한 면역 글로불린 분자(Fab 프래그먼트, Fv프래그먼트)를 사용하는 것이 바람직하다. 나아가서는, Fab 영역에의 단백질 A의 결합이 이미 확인되어 있는, VH3 서브 패밀리에 속하는 면역 글로불린의 Fab 프래그먼트가 보다 바람직하다.

친화성의 차이는, 동일한 측정 조건에서 동일한 면역 글로불린 분자에 대한 결합 반응 곡선을 얻어 해석했을 때에 얻어지는 결합 파라미터로, 변이를 도입하기 전의 단백질과 변이를 도입한 후의 단백질을 비교함으로써 당업자가 용이하게 검증할 수 있다. 여기서, 친화성의 차이를 비교하는 양자의 서열은, 변이 부위 이외의 서열은 동일할 필요가 있고, 예를 들어 변이 D36R의 효과를 평가하는 경우에, 변이를 도입하기 전의 단백질의 아미노산 서열이 B 도메인이고, 변이를 도입한 후의 단백질의 아미노산 서열이 C 도메인에 변이 D36R을 도입한 서열이면, 그 비교는 부적절하다.

결합 파라미터로서는, 예를 들어 친화 상수(KA)나 해리 상수(KD)를 사용할 수 있다(문헌 [나가타 외 저, 「생체 물질 상호 작용의 리얼타임 해석 실험법」, [슈프링거·페어라크 도쿄, 1998년, 41페이지]). 본 발명의 각 도메인의 변이체와 Fab의 친화 상수는, Biacore 시스템을 이용하여, 센서 칩에 VH3 서브 패밀리에 속하는 면역 글로불린의 Fab 프래그먼트를 고정화하여, 온도 25℃, pH7.4의 조건 하에서 각 도메인 변이체를 유로 첨가하는 실험계에서 구할 수 있다. 본 발명에 따른 변이를 도입한 서열을 갖는 단백질에 대해서, 이 단백질의 친화 상수(KA)가, 상기 변이를 도입하기 전의 서열을 갖는 단백질에 비해, 1/2 이하로 저하한 단백질을 적절하게 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 1/5 이하, 또한 보다 바람직하게는 1/10 이하로 저하한 단백질을 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 문헌에 따라서는 친화 상수는 결합 정수로 표기되는 경우도 있지만, 기본적으로 양자의 정의는 동일하다.

29 위치의 Gly를 Ala로 치환한 C 도메인 변이체의 Fab에 대한 KA가, 통상 1×10⁴ 내지 1×10⁵(M^-1)이므로, 29 위치의 Gly를 Ala로 치환한 변이 및 본 발명에 따른 변이를 도입한 C 도메인 변이체에 대해서, KA가 1×10⁴(M^-1) 미만으로 저하된 상기 변이체를 본 발명에 적절하게 사용할 수 있고, KA가 0.5×10⁴(M^-1) 이하인 상기 변이체를 보다 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 상기한 KA의 측정에 있어서는, 면역 글로불린 G를 파파인에 의해 Fab 프래그먼트와 Fc 프래그먼트로 단편화해서 얻은 Fab 또는 유전자 공학적인 방법에 의해 얻어진, 면역 글로불린 G의 Fab 영역만을 발현하는 생산계를 사용하여 제조한 Fab를 사용할 수 있다.

본 발명의 친화성 분리 매트릭스는, 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 결합능이 저하되고 있다고 하는 성질을 갖기 때문에, 항체를 산성 용액으로 용출하는 공정에 있어서, 항체를 해리하는 특성이 우수하다. 구체적으로는, 보다 중성측의 산성 용출 조건에 의한 용출을 가능하게 함으로써, 산성 조건하에서 항체에 대한 손상을 억제하는 효과가 얻어진다. 보다 중성측의 산성 용출 조건이란, 구체적으로는 통상의 산성 용출 조건인 pH2.0 내지 3.5 정도에 대하여, pH3.0 내지 5.0 정도의 보다 중성측의 산성 용출 조건을 말하며, 이 조건하에서 용출하면, 항체에 대한 손상이 작다(문헌 [Ghose S. 외, Biotechnology and bioengineering, 2005년, 92권, 6호]). 우수한 항체 산 해리 특성이란, 보다 중성측의 산성 용출 조건에서 해리되는, 항체를 산성 조건하에서 용출시켰을 때의 용출 피크·프로파일이 보다 급격하다고 하는 특성을 가리킨다. 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일이 보다 급격하게 됨으로써, 보다 적은 용량의 용출액으로 보다 고농도의 항체 함유 용출액을 회수 가능하게 할 수 있다.

또한, 본 발명의 친화성 분리 매트릭스를 사용함으로써, Fc 영역을 포함하는 분자와 Fab 영역만으로 이루어지는 분자를 포함하는 혼합물로부터, Fab 영역을, 통과 분획으로서 용이하게 분리 회수하는 것이 가능해진다.

<실시예>

이하에 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예에서 취득한 각종 단백질에 대해서, 「도메인을 나타내는 알파벳-도입한 변이(야생형에서는 wild)」의 형태로 표기한다. 예를 들어, 단백질 A의 야생형 C 도메인은 「C-wild」, 변이 G29A를 도입한 C 도메인 변이체는 「C-G29A」라고 하는 형태로 표기한다. 2종류의 변이를 동시에 도입한 변이체의 표기에 대해서는, 슬래시를 사용하여 병기한다. 예를 들어, 변이 G29A 및 변이 S33E를 도입한 C 도메인 변이체에 대해서는, 「C-G29A/S33E」라고 하는 형태로 표기한다. 또한, 단일 도메인을 복수 연결시킨 단백질에 대해서는, 피리어드(.)를 붙이고, 연결한 수에 「d」를 붙여서 병기한다. 예를 들어, 변이 G29A 및 변이 S33E를 도입한 C 도메인 변이체를 5 연결시킨 단백질은, 「C-G29A/S33E.5d」라고 표기한다.

[실시예 1]

C- G29A .5d를 코딩하는 DNA 의 제조

C-G29V를 5개 연결한 단백질의 아미노산 서열(C-G29V.5d, 서열 번호 11)로부터 역번역을 행하고, 이 단백질을 코딩하는 염기 서열을 설계하였다. 상기 단백질의 코돈 사용 빈도가, 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31주로 대량으로 발현하고 있는 세포 표층 단백질인 HＷP(문헌 [Ebisu S.저, 「J.Bacteriol.」, 1990년, 172호, 1312-1320페이지])의 코돈 사용 빈도에 근접하도록, 또한 5개의 각 도메인간에서의 염기 서열의 서열 동일성이 낮아지도록 고려하여, 코돈을 분배하였다. 또한, 5 연결 도메인을 코딩하는 서열의 5’측에 PstI 및 3’측에 XbaI의 제한 효소 인식 부위를 제작하였다. DNA 단편의 제작은 다카라 바이오사에 의뢰하였다. 제작한 DNA 단편의 서열을 서열 번호 12에 기재하였다.

제작한 C-G29V.5d를 코딩하는 DNA 단편을 PstI 및 XbaI(모두 다카라 바이오사제)로 소화시키고, 아가로오스 겔 전기영동으로 분획, 정제하였다. 한편, 브레비바실러스속 세균용의 플라스미드 벡터인 pNK3262를, PstI 및 XbaI에 의해 소화 후, 정제 회수하고, 알칼리 포스파타아제(다카라 바이오사제) 처리에 의해 탈인산화 처리를 행하였다. 양자를 혼합 후, Ligation High(도요보세키사제)를 사용하여 연결하여, C-G29V.5d 발현 플라스미드 벡터 pNK3262-C-G29V.5d를 구축하였다. 상기 조작에 의해 얻어진 플라스미드 벡터를 사용하여, 브레비바실러스·초시넨시스 FY-1주의 형질 전환을 행하였다. 형질 전환은 공지의 방법에 의한 전기 도입법으로 실시하였다(문헌 [「Biosci．Biotech．Biochem.」, 1997년, 61호, 202-203페이지]). 또한, 브레비바실러스·초시넨시스 FY-1주는, 브레비바실러스·초시넨시스 HPD31-OK주(일본 특허 출원 공개 (평) 6-296485호 공보)에 변이 처리를 해서 얻어진 Phe·Tyr 요구성 주이다.

제작한 플라스미드 pNK3262-C-G29V.5d로부터 C-G29V.5d를 코딩하는 유전자를 5분할하고, 각 도메인의 Val-29를 포함하도록 DNA 단편을 제조하였다. 각 도메인에 대해서 N말단측으로부터 순서대로 1 내지 5의 번호를 부여한다. 도메인 1은 PstI와 NarI, 도메인 2는 NarI와 HindIII, 도메인 3은 HindIII와 MluI, 도메인 4는 MluI와 BglII, 도메인 5는 BglII와 XbaI(NarI만 도요방적사제, 그 이외는 다카라 바이오사제)로 각각 소화시키고, 아가로스겔로 분획 정제하여, 각각의 DNA 단편을 취득하였다.

2종의 클로닝 벡터, pSL301(인비트로겐사제) 및 pUC19(다카라 바이오사제)를, 각각의 도메인을 코딩하는 DNA 단편에 사용한 것과 동일한 2종류의 제한 효소로 소화시키고, 상기한 DNA 단편과 혼합 후, Ligation High로 연결하고, 5분할한 DNA 단편을 갖는 플라스미드를 구축하였다. 각각의 플라스미드에 대해서, 도메인에 붙인 번호에 대응시켜, pUC19-V29-d1, pUC19-V29-d2, pSL301-V29-d3, pSL301-V29-d4, pSL301-V29-d5로 표기한다. 각각의 C-G29V.5d 코딩 영역의 DNA 단편의 서열(제한 효소 인식 부위 포함함)을 서열 번호 13 내지 17로 나타냈다.

pUC19-V29-d1, pUC19-V29-d2, pSL301-V29-d3, pSL301-V29-d4, pSL301-V29-d5를 주형으로 해서, 서열 번호 18 내지 27의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 퀵 체인지법을 실시하고, 각 도메인의 Val-29가 Ala로 치환된 C-G29A의 DNA 단편을 포함하는 플라스미드 pUC19-A29-d1, pUC19-A29-d2, pSL301-A29-d3, pSL301-A29-d4, pSL301-A29-d5를 제작하고, 5개의 단편을 순차 Ligation High에 의해 연결하여, C-G29A.5d(서열 번호 28)를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 29)을 갖는 발현 플라스미드 pNK3262-C-G29A.5d를 제조하고, FY-1 재조합균의 형질 전환을 실시하였다. 퀵 체인지법은, DNA 포리메라제의 Pfu Turbo 및 메틸화 DNA(주형 DNA) 절단 효소DpnI(모두 스트라타젠사제)를 사용하고, 스트라타젠사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 예를 들어, 서열 번호 13의 DNA 단편을 포함하는 플라스미드 pUC19-V29-d1에 대하여, 서열 번호 18 및 서열 번호 19의 2개의 합성 DNA 프라이머를 사용하여, 퀵 체인지법을 실시하고, 도메인 1의 Val-29가 Ala로 치환된 DNA 단편을 포함하는 플라스미드 pUC19-A29-d1을 제작하였다.

[실시예 2]

C- G29A / S33E .5d, C- G29A / D36R .5d 및 C- G29A / K35R / D37E .5d를 코딩하는 DNA 의 제조

실시예 1에서 제작한, C-G29A를 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 5종의 플라스미드, pUC19-A29-d1, pUC19-A29-d2, pSL301-A29-d3, pSL301-A29-d4, pSL301-A29-d5를 주형으로 해서, 서열 번호 30 내지 59의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 실시예 1과 마찬가지로, 퀵 체인지법을 이용한 방법으로, C-G29A/S33E, C-G29A/D36R 및 C-G29A/K35R/D37E의 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 제작하였다.

그리고, 각종 DNA 단편을 실시예 1에 기재된 방법으로 연결하고, C-G29A/S33E.5d(서열 번호 60)를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 61)을 갖는 발현 플라스미드 pNK3262-C-G29A/S33E.5d, C-G29A/D36R.5d(서열 번호 62)를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 63)을 갖는 발현 플라스미드 pNK3262-C-G29A/D36R.5d 및 C-G29A/K35R/D37E.5d(서열 번호 64)를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 65)을 갖는 발현 플라스미드 pNK3262-C-G29A/K35R/D37E.5d를 각각 제조하고, FY-1 재조합균의 형질 전환을 실시하였다. 또한, C-G29A를 코딩하는 DNA 단편의 연결 시에, 제한 효소HindIII를 이용하지만, HindIII의 인식 서열과 변이 도입 부위가 근접해 있으므로, 변이 미도입의 도메인 2를 코딩하는 DNA 단편과, 변이를 도입한 도메인 3을 코딩하는 DNA 단편을, HindIII 부위에서 연결한 플라스미드를 제조한 후에, 도메인 2를 코딩하는 영역에 해당하는 변이를 도입하였다. 또한, pNK3262-C-G29A/S33E.5d를 주형 플라스미드로 해서, 서열 번호 66 내지 67의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, C-G29A/S33E.4d(서열 번호 68)를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 69)을 PCR에 의해 증폭하였다. 이 DNA 단편을 PstI와 XbaI로 소화시키고, 동일한 효소로 소화한 벡터 pNK3262에 삽입하여, 발현 플라스미드 pNK3262-C-G29A/S33E.4d를 제조하고, FY-1 재조합균의 형질 전환을 실시하였다.

[실시예 3]

DNA 의 서열 확인

실시예 1 내지 2에서 얻어진, 각각의 발현 플라스미드 DNA 염기 서열의 확인은, DNA 시퀀서 3130xl Genetic Analyzer(어플라이드 바이오시스템스사제)을 사용해서 행하였다. BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit(어플라이드 바이오시스템스사제)를 사용하여, 부속의 프로토콜에 따라, 각각의 플라스미드 DNA의 시퀀싱 PCR 반응을 행하고, 그 시퀀싱 산물을 정제하고, 서열 해석에 사용하였다. 시퀀싱에 사용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열에 대해서는 생략한다.

[실시예 4]

발현 재조합균의 목적 단백질 발현

실시예 1 내지 2에 의해 얻어진, 각종 브레비바실러스·초시넨시스 FY-1 재조합균을, 60μg/mL의 네오마이신을 포함하는 5mL의 3YC 배지(폴리펩톤 3%, 효모 엑기스 0.2%, 글루코오스3%, 황산마그네슘 0.01%, 황산철 0.001%, 염화망간 0.001%, 염화아연 0.0001%)에서, 30℃에서 3일간의 진탕 배양을 행하였다.

배양물을 원심 처리해서 균체를 분리하고, 얻어진 배양 상청으로부터, SP Fast Flow 칼럼(GE 헬스케어·재팬(주)제)을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피로, 원하는 단백질을 정제(조(粗) 정제)하였다. 구체적으로는, 아세트산 나트륨을 최종 농도 50mM이 되도록 첨가하고, 또한 염산으로 pH4.0으로 조정한 배양 상청을, 양이온 교환용 완충액 A(50mM CH₃COOH-CH₃COONa, pH4.0)로 평형화한 SP Fast Flow 칼럼에 첨가하고, 양이온 교환용 완충액 A로 세정 후, 양이온 교환 완충액 A와 양이온 교환 완충액 B(50mM CH₃COOH-CH₃COONa, 1M NaCl, pH4.0)를 이용한 염 농도 구배로, 도중에 용출되는 목적 단백질을 분취하였다.

다음에, DEAE Fast Flow 칼럼(GE 헬스케어·재팬(주)제)을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피로, 원하는 단백질을 정제하였다. 구체적으로는, 분취한 목적 단백질 용액을 초순수에 투석하고, 음이온 교환용 완충액 A(50mM 트리스(Tris)-HCl, pH8.0)로 평형화한 DEAE Fast Flow 칼럼에 첨가하고, 음이온 교환용 완충액 A로 세정 후, 음이온 교환 완충액 A와 음이온 교환 완충액 B(50mM 트리스-HCl, 0.3M NaCl, pH8.0)를 이용한 염 농도 구배로, 도중에 용출되는 목적 단백질을 분취하였다. 분취한 목적 단백질 용액을 다시 초순수에 투석하고, 목적 단백질만을 포함하는 수용액을 최종 정제 샘플로 하였다.

또한, 상기한 칼럼을 사용한 크로마토그래피에 의한 단백질 정제는, AKTAprime plus 시스템(GE 헬스케어·재팬(주)제)을 이용해서 실시하였다.

[실시예 5]

취득한 단백질과 인간 면역 글로불린 G(인간 IgG)의 친화성의 해석 표면 플라즈몬 공명을 이용한 바이오센서 Biacore 3000(GE 헬스케어·재팬(주)제)을 사용하여, 실시예 4에서 취득한 각종 단백질의 면역 글로불린과의 친화성을 해석하였다. 본 실시예에서는, 인간 혈장으로부터 분획한 인간 면역 글로불린 G 제제(이후에는, 인간 IgG라고 기재함)를 이용하였다. 인간 IgG를 센서 칩에 고정화하고, 각종 단백질을 칩 상에 흘려서, 양자의 상호 작용을 검출하였다. 인간 IgG의 센서 칩 CM5에의 고정화는, N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 N-에틸-N’－(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC)를 사용한 아민 커플링법으로 행하고, 블로킹에는 에탄올아민을 사용하였다(센서 칩이나 고정화용 시약은, 모두 GE 헬스케어·재팬(주)제). 인간 IgG 용액은, 감마 가드(백스터사제)를 표준 완충액(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄, 150mM NaCl, pH7.4)에 1.0㎎/mL이 되도록 용해시켜서 제조하였다. 인간 IgG 용액을, 고정화용 완충액(10mM CH₃COOH-CH₃COONa, pH4.5)으로 100배로 희석하고, Biacore 3000 부속의 프로토콜에 따라, 인간 IgG를 센서 칩에 고정시켰다. 또한, 칩 상의 다른 플로우 셀에 대하여, EDC/NHS에 의해 활성화한 후에 에탄올아민을 고정화하는 처리를 행함으로써, 음성 대조군이 되는 레퍼런스 셀도 준비하였다. 각종 단백질은, 러닝 완충액(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄, 150mM NaCl, 0.005％ P-20, pH7.4)을 사용하여, 10 내지 1000nM의 범위에서 적절하게 제조하고(각각에 대해서, 서로 다른 단백질 농도의 용액을 3종류 제조), 각각의 단백질 용액을 유속 20μL/분으로 30초간 센서 칩에 첨가하였다. 측정 온도 25℃에서, 첨가시(결합상, 30초간) 및 첨가 종료 후(해리상, 60초간)의 결합 반응 곡선을 순차 관측하였다. 각각의 관측 종료 후에, 50mM NaOH(15초간)를 첨가해서 센서 칩을 재생하였다(센서 칩 상에 남은 첨가 단백질의 제거가 목적이며, 고정화한 인간 IgG의 결합 활성이 대략 완전하게 복귀되는 것을 확인하였다). 얻어진 결합 반응 곡선(레퍼런스 셀의 결합 반응 곡선을 뺀 결합 반응 곡선)에 대하여, 시스템 부속 소프트 BIA evaluation을 사용한 1:1의 결합 모델에 의한 보정 해석을 행하고, 결합 속도 상수(k_on), 해리 속도 상수(k_off), 친화 상수(K_A=k_on/k_off) 및 해리 상수(K_D=k_off/k_on)를 산출하였다.

표 1에 나타내는 바와 같이, 각종 단백질의 인간 IgG에 대한 결합 파라미터는, C-G29A.5d(비교예 1)와 동일한 정도이었다. 구체적으로는, 인간 IgG에 대한 친화 상수(KA)는 어떠한 단백질에 관해서도 5.0×10⁷M^-1 내지 5.0×10⁸M^-1의 범위에 수용되었다.

[실시예 6]

인간화 모노클로널 항체 유래 Fab 프래그먼트의 제조

본 발명에 있어서의 「Fab 영역에 대한 친화성」에 대해서는, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하지 않는 Fab 프래그먼트를 사용하여 조사하였다.

인간화 모노클로널 IgG 제제를 원료로 하여, 이것을 파파인에 의해, Fab 프래그먼트와 Fc 프래그먼트로 단편화하고, Fab 프래그먼트만을 분리 정제함으로써 제조하였다.

인간화 모노클로널 IgG 제제의 허셉틴(주가이세이야꾸사제)을, 파파인 소화용 완충액(0.1M AcOH-AcONa, 2mM EDTA, 1mM 시스테인, pH5.5)에 용해시키고, Papain Agarose from papaya latex 파파인 고정화 아가로오스, 시그마사제)을 첨가하고, 로테타로 혼화시키면서, 37℃에서 약 8시간 인큐베이트하였다. 파파인 고정화 아가로오스로 분리한 반응 용액(Fab 프래그먼트와 Fc 프래그먼트가 혼재)으로부터, Resource S 칼럼(GE 헬스케어·재팬(주)제)을 이용한 이온 교환크로마토그래피에 의해, Fab 프래그먼트(이후, 모노클로널 IgG-FaB라고 표기함)를 분리 정제하였다. 구체적으로는, 이온 교환용 완충액 A(50mM CH₃COOH-CH₃COONa, pH4.5)로, pH4.5가 되도록 희석한 반응 용액을, 이온 교환용 완충액 A으로 평형화한 Resource S 칼럼에 첨가하고, 이온 교환용 완충액 A로 세정 후, 이온 교환 완충액 A와 이온 교환 완충액 B(50mM CH₃COOH-CH₃COONa, 1M NaCl, pH4.5)를 이용한 염 농도 구배(칼럼에 10칼럼 부피분의 완충액을 통액시킬 때에, 완충액 B의 농도를 0%로부터 50%로 직선적으로 높여 감)로, 도중에 용출되는 모노클로널 IgG-Fab를 분취하였다.

분취한 모노클로널 IgG-Fab 용액을, Superdex 7510/300GL 칼럼(평형화 및 분리에는 표준 완충액을 사용)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피로 정제하고, 모노클로널 IgG-Fab 용액을 얻었다.

또한, 실시예 4와 마찬가지로, 크로마토그래피에 의한 단백질 정제는 AKTAprime plus 시스템을 이용해서 실시하였다.

[실시예 7]

취득한 각종 단백질의 모노클로널 IgG - Fab 와의 친화성의 해석

실시예 4에서 취득한 각종 단백질의 IgG-Fab와의 친화성의 해석에 관해서도, 실시예 5와 마찬가지로, Biacore 3000을 사용하여 실시하였다.

실시예 6에서 얻은 모노클로널 IgG-Fab를 센서 칩 CM5에 고정화하고, 실시예 4에서 얻은 각종 단백질을, 칩 상에 흘려서 상호 작용을 검출하였다. 레퍼런스 셀에는, 인간 혈청 알부민(시그마 알드리치사제)을 고정화하였다. 모노클로널 IgG-Fab 및 인간 혈청 알부민의 고정화 방법은, 실시예 5와 마찬가지이다.

측정하는 각종 단백질은, 러닝 완충액(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄, 150mM NaCl, 0.005％ P-20, pH7.4)을 사용하여, 각각에 대해서, 4μM, 8μM, 16μM, 32μM(경우에 따라 32μM은 미제조)의 서로 다른 단백질 농도의 용액을 제조하고, 각각의 단백질 용액을 유속 20μL/분으로 30초간 센서 칩에 첨가하였다. 측정 온도 25℃에서, 첨가시(결합상, 30초간) 및 첨가 종료 후(해리상, 60초간)의 결합 반응 곡선을 순차 관측하였다. 각각의 관측 종료 후에, 10mM NaOH를 30초간 첨가하여, 센서 칩을 재생하였다. 해석의 방법은 실시예 6과 마찬가지이다. 단, 해석시에 결합 파라미터의 1종인 R_max값은 상수로서 보정을 행하였다. R_max값은, 고정화한 분자 모두에 첨가한 분자가 결합했을 때의 시그널량이며, 동일한 분자(모노클로널 IgG-Fab)를 고정화한 본 실험계에서는 이 값이 크게 바뀌는 일은 있을 수 없다. 그러나, 결합 시그널이 매우 약한 경우에는, R_max가 극단적으로 작은 값이 되는 잘못된 보정이 이루어지기 때문에, R_max값을 상수로 한 보정을 행하였다. 표 2에 나타내는 바와 같이, 각종 단백질의 모노클로널 IgG-Fab에 대한 결합 파라미터는 C-G29A.5d(비교예 1)에 비해 유의적으로 낮았다. 구체적으로는, 모노클로널 IgG-Fab에 대한 친화 상수(KA)는 어떠한 단백질에 관해서도 C-G29A.5d에 비해 1/10 미만의 값을 나타내었다.

[실시예 8]

단일 도메인형 각종 변이체 발현용 형질 전환 세포의 제조

실시예 7에서 평가한 변이 외에, 본 발명에 의해 발견된 그 밖의 변이에 대해서 효율적으로 평가하는 것을 목적으로, 단일 도메인 수준으로 각종 변이체를 제조하였다.

변이를 도입하는 단백질 서열로서, 단백질 A의 C 도메인에서 유래하는 아미노산 서열(서열 번호 10, C-G29A.1d)을 선택하였다. 서열 번호 70에 나타낸 C-G29A.1d를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 GST 융합 단백질 발현 벡터 pGEX-6P-1(GE 헬스케어·재팬(주)제)을 변이 도입의 주형 플라스미드로 하였다. 주형 플라스미드의 제조 방법은 공개 특허문헌(국제 공개 제2010/110288호 공보)의 기재에 준한다.

상기 2종류의 플라스미드를 주형으로 해서, 서열 번호 71 내지 80의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 퀵 체인지법으로 서열 번호 81 내지 85에 나타내는 각종 C 도메인 변이체(C-G29A/S33L.1d, C-G29A/S33T.1d, C-G29A/D36I.1d, C-G29A/D36R.1d, C-G29A/D37E.1d)를 코딩하는 각종 발현 플라스미드를 얻었다. 예를 들어, 서열 번호 70의 DNA 서열을 포함하는 발현 플라스미드(pGEX-6P-1-C-G29A.1d)를 주형으로 해서 서열 번호 71 내지 72의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 퀵 체인지법에 의해, 서열 번호 81에 나타내는 C 도메인 변이체(C-G29A/S33L.1d)가 얻어진다. 얻어진 발현 플라스미드에 대해서는, 실시예 3과 마찬가지의 방법으로 DNA 서열을 확인하였다. 또한, 얻어진 각종 발현 플라스미드를 사용하여, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로, 대장균 HB101주(다카라 바이오사제)의 형질 전환을 실시하였다.

[실시예 9]

단일 도메인형 각종 변이체의 발현·정제

실시예 8에서 얻어진 각각의 형질 전환 세포는, 각종 변이체를 GST 융합 단백질로서 발현한다. 이들 형질 전환 세포를 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 이들 배양액을 2×YT 배지(암피실린 함유)에 접종하고, 37℃에서 약 1시간 배양하였다. 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG(이소프로필1-티오-β-D-갈락시드)를 첨가하고, 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 종료 후, 원심으로 집균하고, EDTA(0.5mM)를 포함하는 PBS 완충액에 재현탁하였다. 초음파 파쇄로 세포를 파쇄하고, 원심 분리해서 상청화분(무세포 추출액)과 불용성화분으로 분획하였다. GST 융합 단백질을 포함하는 각각의 무세포 추출액으로부터, GST에 대하여 친화성이 있는 GSTrap FF 칼럼(GE 헬스케어·재팬(주)제)을 사용한 친화성 크로마토그래피로, GST 융합 단백질을 정제(조 정제)하였다. 각각의 무세포 추출액을 GSTrap FF 칼럼에 첨가하고, 표준 완충액(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄, 150mM NaCl, pH7.4)으로 칼럼을 세정, 계속해서 용출용 완충액(50mM 트리스-HCl, 20mM 글루타티온, pH8.0)으로 목적의 GST 융합 단백질을 용출하였다. 용출 화분을 한외여과에 의해 표준 완충액으로 치환한 용액을, 최종 정제 샘플로 하였다.

[실시예 10]

단일 도메인형 각종 변이체의 모노클로널 IgG - Fab 와의 친화성의 해석

실시예 9에서 얻어진 각종 단일 도메인형 변이체에 대해서, 실시예 7에 기재된 방법과 마찬가지로, 모노클로널 IgG-Fab와의 친화성을 Biacore로 측정하고, 각종 변이를 도입하는 것에 의한 IgG-Fab 결합능의 변화에 대해서 해석하였다. 단, 단백질 농도를 4μM(280㎚으로 동일한 흡광도를 나타내는 농도)으로 한 각종 단일 도메인형 변이체의 센서그램만 측정하였다.

얻어진 IgG-Fab 결합 센서그램을 도 2에 도시하였다. 각종 단백질의 모노클로널 IgG-Fab에 대한 결합 응답성은 C-G29A.1d(비교예 3)에 비해 유의적으로 낮고, 검출할 수 없는 수준까지 저하되어 있었다. 본 발명에 의해 얻어진 변이에 의해, Fab 결합력이 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 결합을 검출할 수 없는 수준까지 저하되었으므로, 친화 상수의 산출은 행하지 않았다.

[실시예 11]

C- G29A / S33E .5d의 알칼리 내성 평가

실시예 4에서 취득한 C-G29A/S33E.5d의 알칼리 내성에 대해서, 알칼리성 조건하에서 일정 시간 인큐베이트하는 처리를 행한 후의, 인간 IgG에 대한 결합량의 저하 정도(인간 IgG에 대한 잔존 결합 활성)를 비교함으로써 평가하였다.

C-G29A/S33E.5d에 대해서, 알칼리 처리 전후에 있어서의 인간 IgG에 대한 결합량을, Biacore 3000을 사용하여 측정하였다. 알칼리 처리에 관해서는, 26.2μM의 각종 단백질(10μL)에 대하여, 최종 농도가 0.5M이 되도록 0.625M NaOH를 일정량 첨가하고, 30℃에서 8시간 인큐베이팅하였다. 그 후, 0.5M HCl(미리 pH가 중성으로 복귀되는 것을 확인한 일정 용량)을 각종 처리 용액에 대하여 첨가함으로써 중화하고, 러닝 완충액(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄, 150mM NaCl, 0.005％ P-20, pH7.4)에 의해 2배 희석하고, 알칼리 처리 후의 C-G29A/S33E.5d 용액을 제조하였다.

알칼리 처리 전의 C-G29A/S33E.5d 용액은, 단백질 농도, 용액의 조성이 동일하게 되도록, 알칼리 처리시에 첨가하는 NaOH 용액 및 중화 처리시에 첨가하는 HCl 용액을, 미리 혼합시킨 용액을 26.2μM의 C-G29A/S33E.5d(10μL)에 대하여 첨가함으로써 제조하였다. 센서 칩의 준비(인간 IgG의 고정화 등), 측정시의 러닝 완충액, 측정 온도, 칩의 재생 처리에 관해서는, 실시예 7과 동일하다. 알칼리 처리전 및 처리 후의 C-G29A/S33E.5d 용액을 유속 20μL/분으로 150초간 센서 칩에 첨가하였다. 첨가시(결합상, 150초간) 및 첨가 종료 후(해리상, 210초간)의 결합 반응 곡선을 순차 관측하였다.

해석 방법은, 실시예 5와 마찬가지이지만, 얻어진 결합 파라미터의 해석에 대해서 보충한다. 금회의 해석 방법에서는, 알칼리 처리 전후에 단백질 농도는 동일하지만, 인간 IgG에 대하여 결합 활성이 있는 단백질 농도는 바뀐다. 그러나, 농도를 변수로 해서 보정하는 것은 어려우므로, 농도는 처리 전후에서 일정하게 해서 보정을 행하였다. 이때, IgG에 대하여 결합 활성이 있는 단백질 농도의 변화는, 최대 결합 용량을 나타내는 파라미터 R_max에 반영되므로, C-G29A/S33E.5d의 알칼리 처리 전의 R_max에 대한 알칼리 처리 후의 R_max의 상대값(잔존 IgG 결합 활성[％])을 산출하고, 비교함으로써, 알칼리 내성의 평가를 행하였다.

알칼리 처리 후의 잔존 IgG 결합 활성에 대해서, C-G29A.5d(비교예 1)가 85.4%이었던 것에 대해, C-G29A/S33E.5d가 85.5%이었다. 본 발명의 변이는, C-G29A가 우수한 알칼리 내성을 손상시키지 않고 효과를 발휘하는 것이 가능한 것을 확인하였다.

[실시예 12]

취득한 각종 단백질( 리간드 )이 고정화된 친화성 분리 매트릭스의 제조

친화성 분리 매트릭스(1): 메타크릴레이트계 폴리머 ·베이스

수불용성 기재로서, 시판 중인 활성화형 친화성 크로마토그래피용 충전제 「TOYOPEARL AF-Formyl-650M」(토소(주)제)을 사용하였다. 이 충전제는, 메타크릴레이트계 폴리머를 베이스로 하고, 단백성 리간드 고정화용의 포르밀기가 도입된 상태이다. 실시예 4에서 취득한 C-G29A/S33E.5d의 최종 정제 샘플을 리간드로서 고정화하고, 친화성 분리 매트릭스(1)를 제조하였다.

구체적으로는, 충전제 5mL을 글래스 필터 상에서, 구연산 완충액(0.25M 구연산 3나트륨 2수화물, pH9.0, NaOH를 사용하여 조정)으로 치환 후, 원침관 내에서 전량을 7.5mL로 하였다. 이것에 C-G29A/S33E.5d 함유 용액(64.6㎎/mL)을 0.64mL 첨가하고, 믹스로터(AZONE제 믹스로터 MR-31-336-05)로, 6℃에서 4시간 진동시켰다. 그 후, 2.4M 구연산 수용액으로 pH3으로 하고, 6℃에서 4시간 진동을 계속하였다. 계속해서, 5.5 중량％ 농도의 디메틸아민 보란 수용액(와코쥰야쿠 공업사제)을 2.8mL 첨가하고, 25℃, 18시간 진동시켰다. 이 담체를 글래스 필터상, RO수를 사용하여, 세정 여과액의 전기 전도도가 5μS/㎝ 이하가 될 때까지 세정하여, 친화성 분리 매트릭스를 제조하였다.

친화성 분리 매트릭스(2): 가교 아가로오스 ·베이스

수불용성 기재로서, 시판 중인 활성화형 프리팩 칼럼 「Hitrap NHS activated HP」 1mL(GE 헬스케어·재팬(주)제)을 사용하였다. 이 칼럼은, 가교 아가로오스를 베이스로 하고, 단백성 리간드 고정화용의 N-히드록시 숙신이미드(NHS)기가 도입된 상태이다. 대략 제품 매뉴얼에 따르는 형태로, 실시예 4에서 취득한 C-G29A/S33E.4d의 최종 정제 샘플을 리간드로서 고정화하고, 친화성 분리 매트릭스(2)를 제조하였다.

구체적으로는, 최종 정제 샘플을 커플링 완충액(0.2M 탄산나트륨, 0.5M NaCl, pH8.3)으로 최종 농도 약 6㎎/mL로 희석한 용액을 1mL 제조하였다. 빙욕으로 차게 한 1mM HCl을, 유속 1mL/분으로 2mL 분류하는 조작을 3회 행하고, 칼럼 중의 이소프로판올을 제거하였다. 그 후 바로, 앞서 제조한 샘플 희석 용액을 동일한 유속으로 1mL 첨가하고, 칼럼의 상하에 마개를 해서 25℃에서 30분간 정치함으로써, 취득한 단백질을 칼럼으로 고정화하였다. 그 후 마개를 개방하고, 커플링 완충액을 동일한 유속으로 3mL 흘려서, 미반응 단백질을 회수하였다. 그 후, 블로킹용 완충액(0.5M 에탄올 아민, 0.5M NaCl, pH8.3)을 2mL 흘리는 조작을 3회 실시하고, 세정용 완충액(0.1M 아세트산, 0.5M NaCl, pH4.0)을 2mL 흘리는 조작을 3회 실시하고, 최후에 표준 완충액(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄, 150mM NaCl, pH7.4)을 2mL 흘려서 친화성 분리 칼럼의 제작을 완료하였다.

친화성 분리 매트릭스(3): 셀룰로오스·베이스

수불용성 기재로서, 시판 중인 겔 여과용 충전제 「셀로파인 GCL-2000-m」(티소(주)제)을 사용하였다. 이 충전제는, 가교된 다공성 셀룰로오스를 베이스로 한다. 실시예 4에서 취득한 C-G29A/S33E.5d의 최종 정제 샘플을 리간드로서 고정화하고, 친화성 분리 매트릭스(3)를 제조하였다.

구체적으로는, 충전제 12mL을 글래스 필터(TOP사제17G-2) 상에서, 구연산 완충액(0.01M 구연산 3나트륨 2수화물-구연산 1수화물, pH3)으로 치환 후, 원침관 내에서 액량을 18mL로 하였다. 이것에 0.08g의 과요오드산 나트륨(와코쥰야쿠 공업사제)을 RO수에 용해시킨 수용액 6mL을 첨가하고, 믹스로터(AZONE제 믹스로터 MR-31-336-05)로, 6℃에서 약 30분간 진동시켰다. 글래스 필터 상에서, 10분량의 RO수로 세정하고, 포르밀기 함유 담체를 얻었다.

이 포르밀기 함유 담체 5mL을 글래스 필터 상에서, 구연산 완충액(0.25M 구연산 3나트륨 2수화물, pH8.0, NaOH를 사용하여 조정)으로 치환 후, 원침관 내에서 전량을 8.5mL로 하였다. C-G29A/S33E.5d 함유 용액(64.6㎎/mL)을 0.64mL 첨가하고, 0.4M NaOH로 pH12로 한 후, 믹스로터로, 6℃에서 4시간 진동시켰다. 그 후, 2.4M 구연산 수용액(구연산 1수화물)으로 pH3으로 하고, 6℃에서 4시간 진동을 계속하였다. 계속해서, 5.5 중량％ 농도의 디메틸아민 보란 수용액을 2.8mL 첨가하고, 25℃, 18시간 진동시켰다. 이 담체를 글래스 필터상, RO수를 사용하여, 세정 여과액의 전기 전도도가 5μS/㎝ 이하가 될 때까지 세정하여, 친화성 분리 매트릭스를 얻었다.

친화성 분리 매트릭스(4): 셀룰로오스·베이스-2

수불용성 기재로서, 결정성 고가교 셀룰로오스(티소(주)제, 미국 공개 제0062118호(일본 특허 출원 공개 제2009-242770)에 의해 얻어지는 겔)를 사용하였다. 실시예 4에서 취득한 C-G29A/S33E.5d의 최종 정제 샘플을 리간드로서 고정화하고, 친화성 분리 매트릭스(4)를 제조하였다.

구체적으로는, 겔 12mL을, 글래스 필터 상에서, 구연산 완충액(0.01M 구연산 3나트륨 2수화물-구연산 1수화물, pH3)으로 치환 후, 원침관 내에서 액량을 18mL로 하였다. 이것에 0.08g의 과요오드산 나트륨을 RO수에 용해시킨 수용액 6mL을 첨가하고, 믹스로터로, 6℃에서 약 30분간 진동시켰다.

이 포르밀기 함유 담체 5mL을 글래스 필터 상에서, 구연산 완충액(0.25M 구연산 3나트륨 2수화물, pH8.0, NaOH를 사용하여 조정)으로 치환 후, 원침관 내에서 전량을 8.5mL로 하였다. 이것에 실시예 4에서 취득한 C-G29A/S33E.5d 함유 용액(64.6㎎/mL)을 0.96mL 첨가하고, 0.4M NaOH로 pH12로 한 후, 믹스로터로 6℃에서 4시간 진동시켰다.

그 후, 2.4M 구연산 수용액(구연산 1수화물)으로 pH5로 하고, 6℃에서 4시간 진동을 계속하였다. 계속해서, 5.5 중량％ 농도의 디메틸아민 보란 수용액을 0.46mL 첨가하고, 25℃, 18시간 진동시켰다. 반응 후, 반응액의 275㎚ 부근의 흡수 극대의 흡광도를 측정한 결과, C-G29A/S33E.5d의 도입량은 11㎎/mL-gel이며, 리간드의 담체에의 고정화 수율은 90%이었다.

이 담체를 글래스 필터상, RO수를 사용하여, 세정 여과액의 전기 전도도가 5μS/㎝ 이하가 될 때까지 세정하고, 0.1M 구연산 수용액(구연산 1수화물), 수산화나트륨·황산나트륨 혼합 수용액(0.05M NaOH, 0.5M 황산나트륨), 구연산 완충액(0.5M 구연산 3나트륨 2수화물-구연산 1수화물, pH6)으로 순차 세정하였다. 최종적으로, RO수를 사용하여, 세정 여과액의 전기 전도도가 5μS/㎝ 이하가 될 때까지 세정하고, 친화성 분리 매트릭스를 얻었다.

또한, 본 친화성 분리 매트릭스(4)에 대해서는, 국제 공개 제2010/064437호에 기재된 바와 같이 측정하고, 항체에 대한 흡착 용량 및 리간드 누출량을 측정하였다. 접촉 시간 1.8분, 3분의 5% dBC가 각각 33, 41㎎/mL이며, 리간드 누출량은 용출 IgG에 대하여 30ppm이었다. 또한, 동일한 조건에서 측정한 시판의 고가교 아가로오스 담체 「MabSelect」(GE 헬스케어 바이오사이언스사제)의 5% dBC는, 각각 28, 37㎎/mL이었다. 도 3에, 5% dBC를 그래프로 해서 비교한 도면을 도시하였다. 또한, 리간드 누출량에 대해서는, 시판 중인 친화성 분리 매트릭스에 대해서 조사한 공지 문헌이 존재한다(문헌 [Hahn R.외 저, 「J.Chromatogr. A.」, 2006년, 1102권, 224-231페이지]). 이와 같이, 본 실시예에서 얻어진 친화성 분리 매트릭스(4)가, 항체 의약 정제 프로세스에 있어서 중요한 성능을 나타내는 파라미터에 관하여, 충분히 실용에 이바지하는 수준인 것을 알았다.

[실시예 13]

각종 친화성 분리 매트릭스의 항체 산 용출 특성의 평가

실시예 12에서 제조한 친화성 분리 매트릭스(1) 내지 (4)를, 빈 칼럼 Tricorn^TM 5/50 Column(GE 헬스케어·재팬(주)제)에 충전하고, 크로마토 시스템 AKTA prime plus(GE 헬스케어·재팬(주)제)에 접속하여, 항체 정제 크로마토그래피에 의한 항체 산 용출 특성 평가를 행하였다. 단, 친화성 분리 매트릭스(2)는 프리팩 칼럼이므로, 그대로 접속 가능하다. 모든 경우에 있어서, 칼럼 용량은 약 1mL로 된다. 이 친화성 분리 칼럼을 표준 완충액(20mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄, 150mM NaCl, pH7.4)으로 평형화시킨 후에, VH3 서브 패밀리에 속하는 인간화 모노클로널 IgG 제제의 허셉틴을 표준 완충액으로 1㎎/mL로 제조한 용액 500μL을, 유속 2mL/분으로 첨가하였다. 그 후, 표준 완충액을 동일한 유속으로 5mL 흘려서 세정한 후에, 용출 완충액(35mM CH₃COOH-CH₃COONa, pH3.5)을 동일한 유속으로 5mL 흘려서, 280㎚의 흡광도를 모니터링해서 얻어진 IgG 용출 피크의 크로마토그래피·프로파일을 확인하였다. 또한 연속해서, 5mL의 표준 완충액을 동일한 유속으로 흘린 후, 강세정액(0.5M CH₃COOH, 0.1M Na₂SO₄, pH2.5)을 동일한 유속으로 3mL 흘리고, 280㎚의 흡광도를 모니터링하여, 강제적으로 분리된 칼럼 잔존 IgG의 피크를 확인하였다. 또한, 친화성 분리 매트릭스(2)에 대해서만, 강세정액의 조성은, 20mM CH₃COONa-CH₃COOH, 1M NaCl(pH3.2)로 하였다.

친화성 분리 매트릭스(1) 내지 (3)에 대해서는, pH3.75로 조정한 용출 완충액을 사용한, 마찬가지의 항체 정제 크로마토그래피에 의한 항체 산 용출 특성 평가를 행하였다.

친화성 분리 매트릭스(1)의 항체 산 용출 특성

C-G29A/S33E.5d 및 C-G29A.5d(비교예 1)를 고정화한 각각의 친화성 분리 매트릭스(1)를 사용한, 항체 정제 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일을 겹친 도면을 도 4에 도시하였다. 위의 도면이 용출 pH3.5일 때의, 아래의 도면이 용출 pH3.75일 때의 용출 피크·프로파일이다. 도 4에 도시하는 바와 같이, C-G29A/S33E.5d를 고정화한 매트릭스의 용출 피크·프로파일은, C-G29A.5d의 경우에 비해, 명확하게 급격한 것을 확인할 수 있었다. 용출 pH3.75일 때의 용출 피크·프로파일보다, 변이 도입 전의 C-G29A.5d는 흡착한 IgG의 회수가 곤란하였던 것을, 변이 도입 후의 C-G29A/S33E.5d에서는 흡착한 IgG를 모두 회수할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명이 보다 중성에 가까운 산성 용액에서의 항체 회수율을 극적으로 향상시키는 것이 가능하다는 것을 나타낸 일례라고 생각된다.

친화성 분리 매트릭스(2)의 항체 산 용출 특성

C-G29A/S33E.4d 및 C-G29A.4d(비교예 2)를 고정화한 각각의 친화성 분리 매트릭스(2)를 사용한, 항체 정제 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일을 겹친 도면을, 도 5에 도시하였다. 친화성 분리 매트릭스(1)의 경우와 마찬가지로, C-G29A/S33E.4d를 고정화한 매트릭스의 용출 피크·프로파일은, C-G29A.4d의 경우에 비해, 명확하게 급격한 것을 확인할 수 있었다. 본 데이터에 의해, 본 발명의 단백질은, 베이스로 되는 수불용성 기재의 종류, 기재에의 리간드 고정화 방법 및 리간드로 되는 단백질의 도메인수에 의하지 않고, 효과를 발휘하는 것이 나타났다.

친화성 분리 매트릭스(3)의 항체 산 용출 특성

C-G29A/S33E.5d 및 C-G29A.5d(비교예 1)를 고정화한 각각의 친화성 분리 매트릭스(3) 사용한, 항체 정제 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일을 겹친 도면을, 도 6에 도시하였다. C-G29A/S33E.5d를 고정화한 매트릭스의 용출 피크·프로파일은, C-G29A.5d의 경우에 비해, 명확하게 급격한 것을 확인할 수 있었다. 본 데이터에 의해, 본 발명의 단백질은, 기재로서 항체 용출 특성(급격한 용출)이 우수한 기재와 조합하는 것에 의해서도, 더욱 우수한 효과가 발휘되는 것이 나타났다.

친화성 분리 매트릭스(4)의 항체 산 용출 특성

C-G29A/S33E.5d를 고정화한 친화성 분리 매트릭스(4)를 사용한, 항체 정제 크로마토그래피의 용출 피크·프로파일(용출 pH3.5)을 도 7에 도시하였다. 산업적으로는, 높은 항체 결합 용량을 나타내는 매트릭스에의 요구가 높고, 리간드 고정화량의 증가는, 항체 결합 용량의 향상에 유효하다. 본 데이터에 의해, 본 발명은, 단백질 고정화량이 높은 경우에 있어서도, 문제없이 그 효과를 발휘하는 것이 확인되었다.

[비교예 1]

C- G29A .5d의 제조·이용

실시예 1에서 얻어진 재조합균을 사용하여, 실시예 3 내지 5에 기재된 방법과 마찬가지의 방법으로 C-G29A.5d(서열 번호 28)를 제조하였다. 인간 IgG 및 모노클로널 IgG-Fab와의 친화성의 해석 방법에 대해서도, 실시예 5 및 실시예 7에 기재된 방법과 마찬가지이며, 해석 결과에 대해서는, 표 1 내지 2에 아울러 표기하였다.

또한, 알칼리 내성에 대해서도, 실시예 11에 기재된 방법으로 평가하였다. 게다가, 실시예 12의 친화성 분리 매트릭스(1), (3)의 제조에도, C-G29A.5d를 사용하고, 실시예 13과 마찬가지의 방법으로 항체 산 용출 특성을 평가하고, 그 결과를 도 4 및 도 6에 아울러 표기하였다. 또한, 친화성 분리 매트릭스(1), (3)의 제조에 있어서, 사용한 용액의 단백질 농도는 58.2㎎/mL이며, 사용한 양은 0.79mL이었다.

[비교예 2]

C- G29A .4d의 제조·이용

실시예 1에서 얻어진 발현 플라스미드 pNK3262-C-G29A.5d를 주형으로 하고, 서열 번호 66 내지 67의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로, C-G29A.4d의 발현 플라스미드 및 그 형질 전환 세포를 얻었다. 실시예 3 내지 5에 기재된 방법과 마찬가지의 방법으로, C-G29A.4d를 제조하였다. 게다가, 실시예 12의 친화성 분리 매트릭스(2)의 제조에도, C-G29A.4d를 사용하고, 실시예 13과 마찬가지의 방법으로 항체 산 용출 특성을 평가하고, 그 결과를 도 5에 아울러 표기하였다.

[비교예 3]

C- G29A .1d의 제조

실시예 8에서 사용한 주형 플라스미드를 포함하는 형질 전환 세포(HB101)를 사용하여, 실시예 9와 마찬가지의 방법으로 C-G29A.1d를 제조하고, 실시예 10과 마찬가지의 방법으로, 모노클로널 IgG-Fab와의 친화성을 해석하였다. 해석 결과에 대해서는 도 2에 아울러 표기하였다.

SEQUENCE LISTING <110> KANEKA CORPORATION <120> PROTEIN CAPABLE OF BINDING SPECIFICALLY TO IMMUNOGLOBULIN, AND IMMUNOGLOBULIN-BINDING AFFINITY LIGAND <130> B100013WO01 <140> PCT/JP2011/057156 <141> 2011-03-24 <150> JP2010-068870 <151> 2010-03-24 <160> 85 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 56 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu 35 40 45 Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus 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gcatttattc aggagttgaa ggatg 25 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 39 catccttcaa ctcctgaata aatgc 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 40 caatccctga aaagagatcc atctg 25 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 41 cagatggatc tcttttcagg gattg 25 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 42 caaagcttga agagagaccc ttc 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 43 gaagggtctc tcttcaagct ttg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 44 gagcttgaaa cgtgatccat ctg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 45 cagatggatc acgtttcaag ctc 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 46 caatccctga aaagagatcc gag 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 47 ctcggatctc ttttcaggga ttg 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 48 gtctttgaag agagacccat cc 22 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 49 ggatgggtct ctcttcaaag ac 22 <210> 50 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 50 catccaatcc ctgcgtgatg aaccatctgt atcc 34 <210> 51 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 51 ggatacagat ggttcatcac gcagggattg gatg 34 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 52 cattcaaagc ttgcgcgatg agccttccgt tagc 34 <210> 53 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 53 gctaacggaa ggctcatcgc gcaagctttg aatg 34 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 54 atccagagct tgcgtgacga accatctgtc tcc 33 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 55 ggagacagat ggttcgtcac gcaagctctg gat 33 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 56 catccaatcc ctgcgcgatg agccgagcgt ttc 33 <210> 57 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 57 gaaacgctcg gctcatcgcg cagggattgg atg 33 <210> 58 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 58 attcagtctt tgcgtgatga accatccgta agc 33 <210> 59 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 59 gcttacggat ggttcatcac gcaaagactg aat 33 <210> 60 <211> 290 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 60 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 115 120 125 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 130 135 140 Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp 165 170 175 Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 180 185 190 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu 195 200 205 Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 210 215 220 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 225 230 235 240 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 245 250 255 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 260 265 270 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 275 280 285 Pro Lys 290 <210> 61 <211> 873 <212> DNA <213> DNA code <400> 61 gcagataaca aatttaacaa agaacaacaa aacgctttct acgaaatcct gcacttgcca 60 aaccttactg aagaacaacg taatgctttc atccaagagc tgaaagatga tccatctgta 120 tccaaagaaa ttttggcaga ggctaaaaaa cttaacgacg ctcaggcgcc taaggctgat 180 aacaaattca acaaagaaca acaaaacgct ttttatgaaa tccttcacct gccaaatctt 240 acagaagaac aacgcaacgc attcattcaa gagttgaagg atgacccttc cgttagcaaa 300 gagatcctgg ctgaagcaaa aaagttgaat gatgcgcaag caccaaaagc tgataataaa 360 ttcaacaaag aacaacaaaa tgcattctac gaaatcttgc accttcctaa cctgactgaa 420 gagcagcgta acgcttttat ccaggaattg aaagacgatc catctgtctc caaagaaatt 480 ctcgcagaag cgaagaaact gaacgatgct caagctccga aagcagacaa caaattcaat 540 aaggaacagc aaaacgcgtt ttatgaaatt ctgcatcttc caaacttgac agaggaacaa 600 cgcaatgctt tcatccaaga gctgaaagat gatccgagcg tttctaagga aatcttggct 660 gaagcaaaaa aactgaacga cgctcaagct ccaaaagcgg ataacaagtt taacaaagaa 720 caacaaaatg ctttctacga gatcttgcac cttccgaacc tgactgaaga acaacgtaac 780 gcatttattc aggagttgaa ggatgaccca tccgtaagca aagagatcct ggcagaagct 840 aaaaaattga atgatgcaca agctccaaaa taa 873 <210> 62 <211> 290 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 62 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Arg Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Arg Asp Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 115 120 125 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 130 135 140 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Arg Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp 165 170 175 Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 180 185 190 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 195 200 205 Lys Arg Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 210 215 220 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 225 230 235 240 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 245 250 255 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Arg Asp Pro Ser Val 260 265 270 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 275 280 285 Pro Lys 290 <210> 63 <211> 873 <212> DNA <213> DNA code <400> 63 gcagataaca aatttaacaa agaacaacaa aacgctttct acgaaatcct gcacttgcca 60 aaccttactg aagaacaacg taatgctttc atccaatccc tgaaaagaga tccatctgta 120 tccaaagaaa ttttggcaga ggctaaaaaa cttaacgacg ctcaggcgcc taaggctgat 180 aacaaattca acaaagaaca acaaaacgct ttttatgaaa tccttcacct gccaaatctt 240 acagaagaac aacgcaacgc attcattcaa agcttgaaga gagacccttc cgttagcaaa 300 gagatcctgg ctgaagcaaa aaagttgaat gatgcgcaag caccaaaagc tgataataaa 360 ttcaacaaag aacaacaaaa tgcattctac gaaatcttgc accttcctaa cctgactgaa 420 gagcagcgta acgcttttat ccagagcttg aaacgtgatc catctgtctc caaagaaatt 480 ctcgcagaag cgaagaaact gaacgatgct caagctccga aagcagacaa caaattcaat 540 aaggaacagc aaaacgcgtt ttatgaaatt ctgcatcttc caaacttgac agaggaacaa 600 cgcaatgctt tcatccaatc cctgaaaaga gatccgagcg tttctaagga aatcttggct 660 gaagcaaaaa aactgaacga cgctcaagct ccaaaagcgg ataacaagtt taacaaagaa 720 caacaaaatg ctttctacga gatcttgcac cttccgaacc tgactgaaga acaacgtaac 780 gcatttattc agtctttgaa gagagaccca tccgtaagca aagagatcct ggcagaagct 840 aaaaaattga atgatgcaca agctccaaaa taa 873 <210> 64 <211> 290 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 64 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Arg Asp Glu Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Glu Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 115 120 125 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 130 135 140 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Glu Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp 165 170 175 Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 180 185 190 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 195 200 205 Arg Asp Glu Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 210 215 220 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 225 230 235 240 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 245 250 255 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Glu Pro Ser Val 260 265 270 Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 275 280 285 Pro Lys 290 <210> 65 <211> 873 <212> DNA <213> DNA code <400> 65 gcagataaca aatttaacaa agaacaacaa aacgctttct acgaaatcct gcacttgcca 60 aaccttactg aagaacaacg taatgctttc atccaatccc tgcgtgatga accatctgta 120 tccaaagaaa ttttggcaga ggctaaaaaa cttaacgacg ctcaggcgcc taaggctgat 180 aacaaattca acaaagaaca acaaaacgct ttttatgaaa tccttcacct gccaaatctt 240 acagaagaac aacgcaacgc attcattcaa agcttgcgcg atgagccttc cgttagcaaa 300 gagatcctgg ctgaagcaaa aaagttgaat gatgcgcaag caccaaaagc tgataataaa 360 ttcaacaaag aacaacaaaa tgcattctac gaaatcttgc accttcctaa cctgactgaa 420 gagcagcgta acgcttttat ccagagcttg cgtgacgaac catctgtctc caaagaaatt 480 ctcgcagaag cgaagaaact gaacgatgct caagctccga aagcagacaa caaattcaat 540 aaggaacagc aaaacgcgtt ttatgaaatt ctgcatcttc caaacttgac agaggaacaa 600 cgcaatgctt tcatccaatc cctgcgcgat gagccgagcg tttctaagga aatcttggct 660 gaagcaaaaa aactgaacga cgctcaagct ccaaaagcgg ataacaagtt taacaaagaa 720 caacaaaatg ctttctacga gatcttgcac cttccgaacc tgactgaaga acaacgtaac 780 gcatttattc agtctttgcg tgatgaacca tccgtaagca aagagatcct ggcagaagct 840 aaaaaattga atgatgcaca agctccaaaa taa 873 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 66 ggcgcctact gcagataaca aattc 25 <210> 67 <211> 18 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 67 tctagattat tttggagc 18 <210> 68 <211> 232 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 68 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 115 120 125 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 130 135 140 Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 145 150 155 160 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp 165 170 175 Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 180 185 190 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu 195 200 205 Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 210 215 220 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 225 230 <210> 69 <211> 696 <212> DNA <213> DNA code <400> 69 gcagataaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcttttt atgaaatcct tcacctgcca 60 aatcttacag aagaacaacg caacgcattc attcaagagt tgaaggatga cccttccgtt 120 agcaaagaga tcctggctga agcaaaaaag ttgaatgatg cgcaagcacc aaaagctgat 180 aataaattca acaaagaaca acaaaatgca ttctacgaaa tcttgcacct tcctaacctg 240 actgaagagc agcgtaacgc ttttatccag gaattgaaag acgatccatc tgtctccaaa 300 gaaattctcg cagaagcgaa gaaactgaac gatgctcaag ctccgaaagc agacaacaaa 360 ttcaataagg aacagcaaaa cgcgttttat gaaattctgc atcttccaaa cttgacagag 420 gaacaacgca atgctttcat ccaagagctg aaagatgatc cgagcgtttc taaggaaatc 480 ttggctgaag caaaaaaact gaacgacgct caagctccaa aagcggataa caagtttaac 540 aaagaacaac aaaatgcttt ctacgagatc ttgcaccttc cgaacctgac tgaagaacaa 600 cgtaacgcat ttattcagga gttgaaggat gacccatccg taagcaaaga gatcctggca 660 gaagctaaaa aattgaatga tgcacaagct ccaaaa 696 <210> 70 <211> 174 <212> DNA <213> DNA code <400> 70 gctgacaaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatttt acatttacct 60 aacttaactg aagaacaacg taacgccttc atccaaagcc ttaaagacga tccttcagtg 120 agcaaagaaa ttttagcaga agctaaaaag ctaaacgatg ctcaagcacc aaaa 174 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 71 ccttcatcca actgcttaaa gacg 24 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 72 cgtctttaag cagttggatg aagg 24 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 73 ccttcatcca aacccttaaa gacg 24 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 74 cgtctttaag ggtttggatg aagg 24 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 75 caaagcctta aaattgatcc ttcag 25 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 76 ctgaaggatc aattttaagg ctttg 25 <210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 77 caaagcctta aacgtgatcc ttcag 25 <210> 78 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 78 ctgaaggatc acgtttaagg ctttg 25 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 79 gccttaaaga cgaaccttca gtg 23 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic oligonucleotide (DNA primer) <400> 80 cactgaaggt tcgtctttaa ggc 23 <210> 81 <211> 58 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 81 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Leu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 82 <211> 58 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 82 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Thr Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 83 <211> 58 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 83 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Ile Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 84 <211> 58 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 84 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Arg Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 85 <211> 58 <212> PRT <213> C-wild mutant <400> 85 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55

Claims (25)

1. 서열 번호 1 내지 5에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인으로부터 선택되는 적어도 1개의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열에 있어서,
   A, B 및 C 도메인의 31 내지 37 위치의 아미노산 잔기,
   E 도메인의 29 내지 35 위치의 아미노산 잔기, 또는
   D 도메인의 34 내지 40 위치의 아미노산 잔기
   에 적어도 1개의 아미노산 치환 변이를 도입한 아미노산 서열을 갖는 단백질이며,
   변이 도입 전의 단백질과 비교하여 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 친화성이 저하되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
2. 제1항에 있어서, 변이 도입 전의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열이
   서열 번호 1 내지 5에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인의 아미노산 서열, 또는
   서열 번호 6 내지 10에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인에서 유래하는 아미노산 서열인 단백질.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변이 도입 전의 도메인에서 유래하는 아미노산 서열이
   서열 번호 5에 기재된 단백질 A의 C 도메인의 아미노산 서열, 또는
   서열 번호 10에 기재된 단백질 A의 C 도메인에서 유래하는 아미노산 서열인 단백질.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 변이 도입 전의 아미노산 잔기에 있어서,
   각 도메인에 있어서의 C 도메인의 33 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Ser,
   각 도메인에 있어서의 C 도메인의 35 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Lys,
   각 도메인에 있어서의 C 도메인의 36 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asp, 또는
   각 도메인에 있어서의 C 도메인의 37 위치에 대응하는 아미노산 잔기가 Asp인 단백질.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 도입되는 아미노산 치환 변이가
   C 도메인의 33 위치에 대응하는 Ser을 Glu, Leu 또는 Thr로 치환하는 변이,
   C 도메인의 35 위치에 대응하는 Lys를 Arg로 치환하는 변이,
   C 도메인의 36 위치에 대응하는 Asp를 Arg 또는 Ile로 치환하는 변이, 또는
   C 도메인의 37 위치에 대응하는 Asp를 Glu로 치환하는 변이인 단백질.
6. 제5항에 있어서, 도입되는 아미노산 치환 변이가 C 도메인의 33 위치에 대응하는 Ser을 Glu로 치환하는 변이인 단백질.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단백질을 2개 이상 연결시킨 복수 도메인을 포함하는 단백질.
8. 제7항에 있어서, 연결시키는 단백질이 종류가 상이한 단백질인 단백질.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 연결시키는 단백질의 수가 2 내지 5개인 복수 도메인을 포함하는 단백질.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 DNA.
11. 제10항에 있어서, 연결되어 있는 도메인을 구성하는 염기 서열의 서열 동일성이 90% 이하인 것을 특징으로 하는 DNA.
12. 제10항 또는 제11항의 DNA를 포함하는 벡터.
13. 제12항의 벡터에서 숙주를 형질 전환시켜 얻어지는 형질 전환체.
14. 제13항에 있어서, 숙주가 그램 양성균인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
15. 제14항에 있어서, 그램 양성균이 브레비바실러스(Brevibacillus)속 세균인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
16. 제15항에 있어서, 브레비바실러스속 세균이 브레비바실러스·초시넨시스(Brevibacillus choshinensis)인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 형질 전환체 또는 제10항 또는 제11항의 DNA를 사용한 무세포 단백질 합성계를 사용하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질의 제조 방법.
18. 제17항에 있어서, 형질 전환체의 세포 내 및/또는 페리플라즘 영역 내에 단백질을 축적하는 것, 및/또는 형질 전환체의 세포 밖으로 단백질을 분비하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단백질을 친화성 리간드로 해서, 수불용성 기재로 이루어지는 담체에 고정화한 것을 특징으로 하는 친화성 분리 매트릭스.
20. 제19항에 있어서, 수불용성 기재가 합성 고분자 또는 다당류를 포함하는 것인 친화성 분리 매트릭스.
21. 제20항에 있어서, 다당류가 셀룰로오스인 친화성 분리 매트릭스.
22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 친화성 분리 매트릭스.
23. 제22항에 있어서, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질이 면역 글로불린 G 또는 면역 글로불린 G 유도체 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 친화성 분리 매트릭스.
24. 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질의 분리에 있어서의 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항의 친화성 분리 매트릭스의 용도.
25. 제24항에 있어서, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질의 분리가 면역 글로불린의 Fab 영역만으로 이루어지는 단백질의 분리 회수를 목적으로 하는 것인 친화성 분리 매트릭스의 용도.

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