CN112250750B - 与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有亲和力的变体sh2结构域 - Google Patents

与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有亲和力的变体sh2结构域 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的应用技术领域，涉及与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域。本发明提供了一种与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域，包含选自SEQ ID NOs:3、4、5或6的氨基酸序列。本发明将残基取代已被引入SH2结构域的pTyr‑结合区域，阐述了对含pTyr肽的结合亲和性增强的有利取代。不同的取代组合表现了对亲和性增强的不同程度的影响。这些变体SH2结构域在体外与含pTyr蛋白的结合分析中，表现出其强度远高于野生型SH2结构域。

Description

与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有亲和力的变体SH2结构域
技术领域
本发明属于蛋白酪氨酸激酶（PTKs）的应用技术领域，涉及与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域，具体涉及使用该变体用于治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法，例如免疫学的和肿瘤学的失调，涉及使用该变体用于诊断蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法，涉及使用该变体用于检测、追踪或监控细胞中的酪氨酸磷酸化事件的方法，涉及使用该变体用于富集或纯化含有磷酸酪氨酸的肽或蛋白的方法，以及涉及含有该变体的药物组合物。
背景技术
蛋白酪氨酸激酶及其底物在多种细胞进程中起重要作用，例如增殖、分化和凋亡。磷酸酪氨酸（还称为pTyr或pY）信号网中的异常激酶激活和伴随的改变是多种癌症的标志。细胞用来翻译pTyr介导的信号的主要机制依赖于特异性结合酪氨酸磷酸化蛋白的模块化蛋白结构域。Fyn同源区2（SH2）结构域是这些模块化结构域中最普遍的，并在PTK信号途径中起核心作用。不同的pTyr位点使用不同的含SH2结构域的蛋白，后者反过来激活不同的信号途径。
PTKs包括受体酪氨酸激酶，包括表皮生长因子激酶家族成员。在多种恶性和非恶性增殖性疾病中已经显示出增强的PTKs活性。此外，PTKs在调节免疫系统细胞中起作用是已知的。
PTKs是用于癌症治疗的重要药物靶点。目前的抗癌药主要基于小分子激酶抑制剂或人源化抗体。这些药物经常表现出对一组相关激酶的广谱特异性。
抑制PTK信号的替代想法是通过遮盖PTK底物的磷酸酪氨酸来阻断下游信号。虽然磷酸酪氨酸特异性抗体对含pTyr多肽具有高亲和性，但是它们不能在细胞内使用。
含SH2结构域的蛋白在PTK信号下游起作用，且为信号集合点。SH2结构域含有约100个氨基酸。当分离的SH2结构域在细胞中递送或表达时，其能够与结合pTyr位点的内生性信号蛋白竞争。
发明内容
本发明的目的在于增强SH2结构域与含pTyr肽的结合亲和性。本发明利用SH2结构域中已引入残基取代的pTyr-结合区域，阐述了对含pTyr肽的结合亲和性增强的有利取代。不同的取代组合表现了对亲和性增强的不同程度的影响，并且所产生的变体SH2结构域组（panel）显示了亲和性梯度。这些亲和性增强的变体在体外结合分析中和在哺乳动物细胞系中表现出比野生型对照SH2结构域更紧密的与含pTyr的蛋白的结合。因此，变体结构域在生理环境中和在体外条件下都起作用。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
在本发明的一个实施方式中，变体SH2结构域包括在亲代SH2结构域的8个氨基酸位点的预定义区域中具有至少一个氨基酸取代的亲代SH2结构域，该取代增强了变体SH2结构域相对于亲代SH2结构域而言对含pTyr肽的亲和性。
在本发明的一个实施方式中，当所述亲代SH2结构域与SEQ ID NO:1对齐时，亲代SH2结构域的8个氨基酸的预定义的区域对应于SEQ ID NO:1的Lys19(位点1)、Glu41(位点2)、Thr42(位点3)、Thr43(位点4)、Ala46(位点5)、Ser48(位点6)、Lys63(位点7)和Lys66(位点8)。
本发明提供了一种与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域，包含选自SEQ ID NOs: 3、4、5或6的氨基酸序列。
在本发明的变体SH2结构域的另一个实施方式中，亲代SH2结构域是真核的(eukaryotic)。
本发明还提供了一种编码所述的变体SH2结构域的分离的DNA序列。
本发明还提供了一种含有所述的DNA序列的载体。
在另一个实施方式中，本发明还提供了上述实施方式的变体SH2结构域在评估样品中是否存在含pTyr肽中的用途。
在一个实施方式中，本发明提供了评估样品中是否存在含pTyr肽的方法，该方法包括(a)用所述样品接触本发明的变体SH2结构域，从而如果样品中存在含pTyr肽，会形成含pTyr肽/变体SH2结构域复合物；和(b)检测复合物的形成，从而检测样品中是否存在含pTyr肽。
在一个实施方式中，本发明涉及一种用于从样品中分离含pTyr肽的方法，其特征在于该方法包括：(a)用所述样品接触本发明的变体SH2结构域，从而如果样品中存在含pTyr肽，会形成含pTyr肽/变体SH2结构域复合物；和(b)从复合物中释放该含pTyr肽，从而从样品中分离含pTyr肽。在前述方法的一个方面，该方法进一步包括通过检测所释放的含pTyr肽的量来测定含pTyr肽在样品中的浓度。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种测定含pTyr肽在样品中的浓度的方法，该方法包括：(a)将本发明的变体SH2结构域固定在树脂上，(b)将样品流经具有结合的变体SH2结构域的树脂，(c)通过添加去除变体SH2结构域结合含pTyr肽的能力的溶剂，释放结合到树脂上的任何含pTyr肽，从而产生洗脱组份，和(d)测定在洗脱组份中存在的含pTyr肽的浓度。
在本发明的各方面，含pTyr肽的浓度通过高效液相色谱(HPLC)进行确定。
在本发明的各方面，变体SH2结构域被结合至亲和性柱或侧流试纸条。
在另一个实施方式中，本发明提供了本发明的变体SH2结构域在体外或体内的肽或蛋白中结合或检测pTyr残基的用途。
本发明提供了一种制造相对于亲代SH2结构域而言具有增强的含pTyr肽结合亲和性的变体SH2结构域的方法，该方法包括取代亲代SH2结构域的8个氨基酸位点的预定义区域中至少一个氨基酸残基，当所述亲代SH2结构域与SEQ ID NO:1对齐时，亲代SH2结构域的8个氨基酸的预定义区域对应于SEQ ID NO:1的Lys19(位点1) 、Glu41(位点2)、Thr42(位点3)、Thr43(位点4)、Ala46(位点5)、Ser48(位点6)、Lys63(位点7)和Lys66(位点8)。
本发明还提供一种多肽，该多肽包含多个SH2结构域，该多个SH2结构域的至少一个为所述的变体SH2结构域。
本发明的有益效果是：
（1）本申请通过对Fyn SH2结构域与含磷酸化酪氨酸多肽的复合物（Proteindatabank ID：2MRK）进行计算分析，定义复合物结合表面位点为两者的氨基酸侧链距离为6埃的氨基酸所在位点，从与获得位于Fyn SH2结构域上的 8个氨基酸位点，其对应的理论文库为208，即2.6×1010，与噬菌体展示技术构建的实际文库的库容（~1010）相近，能够全面地筛选到强亲和力的突变体。
（2）本发明的变体SH2可用于分离含pTyr的分子，例如肽，包括多肽和蛋白，用于检测样品中含pTyr分子的浓度，或仅仅检测样品中是否存在含pTyr的分子。本发明的变体SH2结构域还可用于其它应用，例如治疗、诊断或作为试剂用于研究目的。
（3）本发明的策略可包括在亲代SH2结构域蛋白序列上生成单一或多个氨基酸残基取代，取代被应用到SH2结构域上预定义的8个氨基酸位点处。SH2结构域可被用作标准。例如，作为标准，这些位点可在人Fyn SH2结构域氨基酸序列上定义，如图1所示。
（4）基于本发明，在人类的临床或诊断应用中，变体SH2结构域的用途优选的一个角度是从人SH2结构域作为亲代SH2结构域进行设计，以最小化向体内补充变体SH2结构域所可能导致的免疫应答的可能性。
附图说明
根据本文给出的发明详述和伴随的附图，将更全面地理解本发明，这些发明详述和附图仅以说明的方式给出，而不限制预期的发明范围。
图1显示了围绕着pTyr的8个残基位点的位置和用于定义这些位点的序列比对。
图2列举了用于本发明的噬菌体展示筛选实验的含pTyr的合成肽；这些肽在其N端生物素化，在其C端酰胺化。
图3是显示根据本发明的一个实施方式获得的人Fyn SH2结构域的4个变体的8个位点的残基的表格；从野生型取代的残基为8个阴影覆盖残基位点。
图4显示了荧光偏振值（FP）检测实验中的Kd值的分析结果，该FP实验测定Fyn SH2结构域和图2中列举的肽之间相互作用亲和性的溶液；野生型和其它已经报道的变体（参考变体1、参考变体2源自文献Kaneko, T., et al. (2012). "Superbinder SH2 domainsact as antagonists of cell signaling." Science signaling 5(243): ra68。它们的Kd值也进行了测量并作为参照）。
图5显示了通过FP实验测定的野生型或变体Fyn SH2结构域与FITC-GGEPQpYEEIPIYL肽(SEQ ID NO:7)的结合曲线和Kd值。图5(A)显示了野生型Fyn SH2结构域与多肽的结合。图5(B)显示了T4V/S6A/K8L变体Fyn SH2结构域与多肽的结合。图5(C)显示了在T4V/K8L变体SH2结构域和多肽之间的结合。图5(D)显示了T3S/T4R/S6A/K8L变体FynSH2结构域与多肽的结合。图5(E)显示了T3S/T4S/S6A/K8L变体Fyn SH2结构域与多肽的结合。图5(F)显示了在T3S/T4W/A5G变体SH2结构域和多肽之间的结合。图5(G)显示了在T4W/A5G变体SH2结构域和多肽之间的结合。
图6显示了通过FP实验测定的野生型或变体Fyn SH2结构域与FITC-GGpYGGL肽(SEQ ID NO:8)的结合曲线和Kd值。图6(A)显示了野生型Fyn SH2结构域与多肽的结合。图6(B)显示了T4V/S6A/K8L变体Fyn SH2结构域与多肽的结合。图6(C)显示了在T4V/K8L变体SH2结构域和多肽之间的结合。图6(D)显示了T3S/T4R/S6A/K8L变体Fyn SH2结构域与多肽的结合。图6(E)显示了T3S/T4S/S6A/K8L变体Fyn SH2结构域与多肽的结合。图6(F)显示了在T3S/T4W/A5G变体SH2结构域和多肽之间的结合。图6(G)显示了在T4W/A5G变体SH2结构域和多肽之间的结合。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
一、定义：
除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的相同含义。同样的，除了在权利要求中，除非另有说明，否则“或”的使用包括了“和”，反之亦然。非限制性术语不会被解释为限制性的，除非有明确表述或上下文清楚地显示了相反含义(例如“包括”、“具有”和“包含”一般表示“无限制地包括”)。在权利要求中包含的单数形式例如“一”、“一个”和“该”包括了复数指向，除非另有明确说明。
“含pTyr多肽”指含有pTyr的氨基酸序列分子。
术语"亲代SH2结构域"包括任何真核SH2结构域或多肽，其中该多肽具有与源自含有SH2结构域的人蛋白的SH2结构域至少约60％序列同一性。如此，术语“亲代SH2”结构域还包括人工制备的序列和病毒SH2结构域。例如，可以基于一种或多种哺乳动物SH2结构域序列产生或制备人工SH2结构域序列作为亲代SH2结构域，其将代表一种典型的SH2结构域序列，但是与任何哺乳动物SH2都不相同。
术语"片段"指具有比本文所示氨基酸残基序列的肽更短的氨基酸残基序列的任何受试肽。
视具体情况，术语“分离的肽”或“分离的DNA”可被定义为肽或DNA分子，其基本上与可能是天然伴随着所述肽或DNA的其它细胞组分分离。该术语包括（没有限制）重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。
术语“配体”表示结合另一分子或目标的分子。
本文使用的术语“肽”或“多肽”定义为氨基酸残基的链，通常具有定义的序列。本文使用的“肽”与“多肽”、“肽”和“蛋白”互相包括。
术语“变体SH2结构域”、“SH2变体”、“SH2单体”、"SH2结构变体"无差别地被用于指为了本发明的亲和性增强而引入取代的亲代SH2结构域。本发明适用于亲代SH2结构域的变体SH2结构域，以及含有位点1和位点8之间区域（该位点如下定义）的亲代SH2结构域片段的变体。在人类的临床或诊断应用中，变体SH2结构域的用途优选的是从人SH2结构域作为亲代SH2结构域进行设计，以最小化向体内补充变体SH2结构域所可能导致的免疫应答的可能性。
二、残基取代：
本发明的变体SH2可包括三个残基取代。例如，取代在位点3、4和5的组合(SEQ IDNO:5)，只要其能导致SH2变体具有增强的pTyr结合。
为了亲和性进一步增强，可以优选在变体SH2结构域中进行四个取代。例如，取代在位点3、4、6和8的组合(SEQ ID NO:3)，只要其能导致SH2变体具有增强的pTyr结合。
三、变体SH2结构域构建和检测：
蛋白分子可被设计为含有多个SH2结构域，其中至少一个是变体SH2结构域。
本发明的变体SH2结构域可通过使用本领域技术人员已知的重组DNA技术进行制备。编码本发明选择的肽的核酸序列可以利用已知的方式被引入合适的表达载体(即重组表达载体)。
本发明的变体SH2结构域可标记标签以利于其在多种分析中的检测。这些标签可包括但不限于放射性标记、细胞毒素标记和荧光标记。本发明的SH2单体可与载体一起提供。所述肽可以共价或非共价偶联至固相载体。所述肽可直接或间接用标签标记，所述标签选自但不限于生物素、荧光素、酶、辣根过氧化物酶。
四、治疗用途
本发明的变体SH2抑制蛋白酪氨酸激酶的作用，可以用于蛋白酪氨酸激酶相关失调(例如免疫学的和肿瘤学的失调)的治疗，包括预防和治疗。
从而，本发明提供了治疗蛋白酪氨酸激酶相关的失调的方法，包括对需要其的受试者给予对其有效量的变体SH2。在本方法中可以与发明的化合物一起应用其它治疗剂。
五、诊断
根据本发明的另一实施方式，提供了一种用于诊断受试者中蛋白酪氨酸激酶相关失调的方法。
在一个实施方式中，受试者的样品可接触本发明的SH2变体以检测样品中磷酸化的蛋白。样品中磷酸化蛋白数量相对于正常对照样品中磷酸化蛋白数量的增加可指示蛋白激酶相关的失调。
组织样品可包括组织裂解物、血液和其它体液。可通过使用本发明的SH2变体测试组织样品的激酶活性以检测组织样品中磷酸化的蛋白。也可通过使用荧光标记的SH2变体以在组织切片上造影磷酸化的蛋白；使用基于ELISA的SH2变体组合目标蛋白特异性抗体以分析其在正常和疾病组织(或细胞)中的磷酸化等来测试组织的组织学(histology)。
另一应用是体内造影。用造影标签标记的SH2变体被用于肿瘤、PET、MRI等的体内造影。以异常激酶活化为特征的癌组织可表现出相对于正常组织而言增强的蛋白磷酸化，其可使用基于SH2变体的造影工具进行检测和造影。
为了检测样品中的SH2变体，本发明的变体SH2结构域可优选的用探针分子标记。
pTyr阳性细胞的检测可通过探针进行。探针可至少包括一个包含SH2变体的肽和一个造影组分。可选的，该探针可用可检测标记物进行标记，其可允许检测pTyr阳性细胞的位置。本发明的探针可允许跟随pTyr阳性细胞的移动和发展。
探针的造影组分一般可包含标签。标记的方法是本领域技术人员熟知的。优选的标签可以是适于体内造影使用的那些分子。SH2单体探针可在检测前进行可检测的标记。可选的，可以使用可结合杂交产物的可检测标签。这些可检测标签可包括但不限于具有可检测的物理或化学性质且在免疫分析领域已经良好开发的任何材料。用于本发明的标签可以是通过显微镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的任何组合物。
在另一个实施方式中，还可以制备和使用识别本发明的任何变体SH2的单克隆抗体(mab)以检测样品中是否存在变体SH2。
具有对pTyr超高亲和性的本发明的SH2变体可被用作抗-pTyr抗体的替代品，且可被用于使用抗-pTyr抗体的研究领域，例如，如蛋白质印迹、IF、蛋白质组学(磷酸蛋白/肽的富集)，等等。
六、含pTyr的目标的纯化、存在和浓缩方法：
使用本发明的变体SH2多肽作为配体用于对样品中具有pTyr的分子目标进行分离、纯化、检测存在和/或测定浓度。
1、用于对样品中具有pTyr的分子目标进行检测存在和/或测定浓度的方法，包括：(a)使样品接触本发明的变体SH2肽(“SH2配体”)，从而如果样品中存在目标则形成目标/SH2配体复合物；和(b)通过检测形成的目标/SH2配体复合物的量测定样品中含pTyr的目标的浓度。
2、用于在样品中分离含pTyr的目标的方法，包括：(a)使样品接触本发明的SH2配体，从而如果样品中存在目标则形成含pTyr的目标/SH2配体复合物；和(b)从复合物中释放含pTyr的目标，从而分离该含pTyr的目标。然后可通过检测含pTyr的目标的释放量来测定样品中目标的浓度。
3、可将SH2配体固定在树脂上，例如亲和性柱上，可能包括液体例如体液和提取物的样品可以流过该树脂。可使用不含目标的溶液洗涤树脂。可以通过添加能去除SH2配体与目标结合的能力的溶剂释放结合至SH2配体的含pTyr的目标，从而产生洗脱组分。可通过任何合适的方法测定洗脱组分中存在的目标的存在和/或浓度，例如，荧光法、高效液相色谱(HPLC)法等。该方法也可用于从样品分离含pTyr的目标。也可将SH2配体结合到侧流试纸条上。
实施例1、通过噬菌体展示技术鉴定变体SH2结构域
人Fyn SH2结构域上8个位点的氨基酸残基被随机替换为20种天然氨基酸之一，来鉴定结合含pTyr肽的变体SH2结构域。
人Fyn SH2结构域所有氨基酸残基数根据UniProt数据库条目（entry）FYN_HUMAN的全长同种型。将编码Ala139和Gly249之间（其氨基酸序列见SEQ ID NO:1）的野生型FynSH2结构域的基因亚克隆入pDEST15载体(Invitrogen Canada Inc.)。通过QuikChange II定点突变试剂盒(Qiagen Inc.)将SEQ ID NO:1中的三个半胱氨酸残基替换为丝氨酸残基。该突变产生了SEQ ID NO:2所示的蛋白序列。
将SEQ ID NO:2所示蛋白质的编码基因融合至编码M13噬菌体主外壳蛋白的基因。通过对与pTyr结合的SH2 domain区域的8个位点进行突变，形成多样性文库，用于高亲和力突变体的筛选。
用Kunkel方法在如下详述的预定义的8个氨基酸位点上进行同时随机化（具体方法参见：Sidhu等，2000，Method Enzymol .Vol.328，pp.333）。8个位点对应于原子结构中围绕着pTyr的8个氨基酸残基。这些位点可连续编号为位点1至位点8。这8个位点对应于野生型全长人Fyn SH2的残基、Lys157(位点1)、Glu179(位点2)、Thr180(位点3)、Thr181(位点4)、Ala184(位点5)、Ser186(位点6)、Lys201(位点7)和Lys204(位点8)（图1）。在SEQ ID NO:1中，这8个位点如下：Lys19(位点1)、Glu41(位点2)、Thr42(位点3)、Thr43(位点4)、Ala46(位点5)、Ser48(位点6)、Lys63(位点7)和Lys66(位点8)。
突变产生了Fyn SH2结构域库，其在8个位点上含有随机取代的氨基酸残基。使用了噬菌体展示方法来在M13噬菌体表面上展示这些引入取代的Fyn SH2结构域。针对图2所列举的MidT-pTyr324的合成肽进行噬菌体筛选。通过高通量测序以鉴定结合至肽的变体SH2结构域的序列。相应的，获得了4种变体Fyn SH2结构域。每种变体SH2结构域中8个位点的残基列于图3。在每种变体中，至少一个位点含有对野生型残基的氨基酸取代。
实施例2、变体Fyn SH2结构域与含pTyr肽在体外的增强结合
对野生型Fyn SH2结构域引入单一或多个取代，并测定了由这些取代的引入而产生的亲和性增强程度。使用该野生型构建体作为模板，通过定点突变方法构建了3个变体Fyn SH2结构域。
在以下的描述中，使用位点编号具体指明被取代的残基。例如，T8V表示对野生型构建体进行位点8的Thr取代为Val。T4V/S6A表示组合的2个取代，对野生型构建体进行位点4的Thr取代为Val和位点6的Ser取代为Ala。将3个变体SH2结构域的位点1和位点8间的氨基酸序列列在序列表部分。通过对野生型构建体(SEQ ID NO:1)进行取代，构建了以下变体Fyn SH2结构域：T3S/T4R/S6A/K8L(SEQ ID NO:3)、T3S/T4S/S6A/K8L(SEQ ID NO:4)、T3S/T4W/A5G(SEQ ID NO:5) 、T4W/A5G(SEQ ID NO:6)。
合成了含有pTyr的荧光（FITC，异硫氰酸荧光素）标记的一系列肽进行结合分析（图2）。在LB培养基(EMD Chemicals)中培养大肠杆菌BL21(DE3)菌株过表达来生产出每种变体和野生型SH2结构域。通过1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，细胞培养物在18℃下培育20小时。在含20mM磷酸钠、0.1M NaCl、20mM咪唑、1mg/ml溶菌酶和1％Triton-X 100，调节pH7.8的缓冲溶液中，离心收集细胞，并在冰上破碎。用Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen Inc.)按照制造商的说明进行亲和纯化。纯化的材料用TBS（tris bufferedsaline，三乙醇胺缓冲盐水溶液，pH7.4）溶解。
在FITC标记的含有pTyr肽段浓度（15nM）恒定的情况下滴定梯度浓度的突变体结构域蛋白，测定所有浓度的荧光偏振值（FP，单位mP）。
用GraphPad Prism软件通过假设单一位点结合模型(GraphPad Software)计算Kd值。测定的8个SH2结构域（包括野生型）和2个肽之间相互作用的Kd值列于图4。与两条多肽的相应结合曲线分别见图5和图6。图4中参考变体1和参考变体2源自文献Kaneko, T., etal. (2012). "Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling."Science signaling 5(243): ra68。Kd值越小，表示结合力越强。变体1的结合能力明显好于现有的参考变体。
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛肿瘤研究院
上海亚联抗体医药有限公司
<120> 与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有高亲和力的变体SH2结构域
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> UNSURE
<223> FynSH2wt
<400> 1
Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Leu
1 5 10 15
Gly Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg
20 25 30
Gly Thr Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Ser
35 40 45
Leu Ser Ile Arg Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His
50 55 60
Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Asn Gly Gly Tyr Tyr Ile Thr Thr Arg
65 70 75 80
Ala Gln Phe Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Gln His Tyr Ser Glu Arg
85 90 95
Ala Ala Gly Leu Cys Cys Arg Leu Val Val Pro Cys His Lys Gly
100 105 110
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Synthetic construct: CyslessFynSH2Protein
<400> 2
Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Leu
1 5 10 15
Gly Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg
20 25 30
Gly Thr Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Ser
35 40 45
Leu Ser Ile Arg Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His
50 55 60
Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Asn Gly Gly Tyr Tyr Ile Thr Thr Arg
65 70 75 80
Ala Gln Phe Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Gln His Tyr Ser Glu Arg
85 90 95
Ala Ala Gly Leu Ser Ser Arg Leu Val Val Pro Ser His Lys Gly
100 105 110
<210> 3
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Synthetic construct: FynSH2_T3S/T4R/S6A/K8L
<400> 3
Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg Gly
1 5 10 15
Thr Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Ser Arg Lys Gly Ala Tyr Ser Ala
20 25 30
Ser Ile Arg Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His Tyr
35 40 45
Leu
<210> 4
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Synthetic construct: FynSH2_T3S/T4S/S6A/K8L
<400> 4
Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg Gly
1 5 10 15
Thr Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Ser Ser Lys Gly Ala Tyr Ser Ala
20 25 30
Ser Ile Arg Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His Tyr
35 40 45
Leu
<210> 5
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Synthetic construct: FynSH2_T3S/T4W/A5G
<400> 5
Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg Gly
1 5 10 15
Thr Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Ser Trp Lys Gly Gly Tyr Ser Leu
20 25 30
Ser Ile Arg Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His Tyr
35 40 45
Lys
<210> 6
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Synthetic construct: FynSH2_T4W/A5G
<400> 6
Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg Gly
1 5 10 15
Thr Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Thr Trp Lys Gly Gly Tyr Ser Leu
20 25 30
Ser Ile Arg Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His Tyr
35 40 45
Lys
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Synthetic peptide: biotin-ahx-ahx-GGEPQpYEEIPIYL peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 7
Gly Gly Glu Pro Gln Tyr Glu Glu Ile Pro Ile Tyr Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<223> Synthetic peptide: biotin-ahx-ahx-ahx-GGpYGG peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 8
Gly Gly Tyr Gly Gly
1 5

Claims (5)

1.一种与含酪氨酸磷酸化修饰肽具有亲和力的变体SH2结构域，其特征在于，所述变体SH2结构域包括在亲代SH2结构域的8个氨基酸位点的预定义区域中具有至少一个氨基酸取代的亲代SH2结构域；
当所述亲代SH2结构域与SEQ ID NO:1对齐时，亲代SH2结构域的8个氨基酸的预定义的区域对应于SEQ ID NO:1的Lys19、Glu41、Thr42、Thr43、Ala46、Ser48、Lys63和Lys66；
所述变体SH2结构域的氨基酸序列为SEQ ID NOs: 3、4、5或6的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的变体SH2结构域的分离的DNA。
3.一种含有权利要求2所述的DNA的载体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的变体SH2结构域用途，其特征在于，变体SH2结构域在制备用于评估样品中含pTyr肽的存在或测定样品中含pTyr肽的浓度的试剂的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，从样品中富集分离含pTyr肽的方法，该方法包括用该样品接触权利要求1-3任一项的变体SH2结构域，从而如果样品中存在含pTyr肽，会形成含pTyr肽/变体SH2结构域复合物和从复合物中释放该含pTyr肽，从而分离含pTyr肽。
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