CN117384271A - 与含赖氨酸甲基化修饰肽具有高亲和力的变体Chromo结构域 - Google Patents
与含赖氨酸甲基化修饰肽具有高亲和力的变体Chromo结构域 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种与含赖氨酸甲基化修饰肽(含Kme肽)具有高亲和力的变体Chromo结构域。本发明通过对野生型Cbx1Chromo结构域的特定区域内引入单个或多个氨基酸取代，获得了对含Kme肽的亲和性显著增强的变体Chromo结构域，利用所述变体Chromo结构域可以有效地对含Kme肽进行富集，可用于检测含Kme肽以及检测含Kme肽的浓度。此外，本发明所述变体Chromo结构域还可用作抗‑Kme抗体的替代品，用于使用抗‑Kme抗体的研究中，例如蛋白质印迹、免疫荧光、蛋白质组学、甲基化蛋白/肽的富集等。
Description
技术领域
本发明属于赖氨酸甲基化修饰检测技术领域。更具体地，涉及与含赖氨酸甲基化修饰肽具有高亲和力的变体Chromo结构域。
背景技术
蛋白质的赖氨酸甲基化修饰(Kme)是一种关键的翻译后修饰，可以调节蛋白质的稳定性、蛋白质功能以及蛋白质之间的相互作用等，在细胞的生理及致病过程中发挥不可或缺的调节作用。赖氨酸甲基化修饰是由赖氨酸甲基转移酶(KMT)和赖氨酸脱甲基酶(KDM)调节的，包括单、双和三甲基赖氨酸修饰(Kme1、2和3)三种类型。现有研究发现，除组蛋白外，大量的转录因子也被甲基化，在体外和体内干扰转录因子赖氨酸甲基化可以抑制癌细胞的增殖，从而逆转肿瘤的发展。而实现这一目的的前提是对含Kme的关键转录因子或相关蛋白进行准确的检测与研究。由于含Kme肽与其他修饰肽相比具有丰度低，动态范围广，质谱检测易受非修饰肽影响等特点。因此，开发可用于高效富集含Kme肽的产品及方法，对蛋白质赖氨酸甲基化修饰的研究具有重要意义。
目前虽已经有商业化的抗体可以富集含Kme肽，但其对含Kme2和Kme3修饰肽的富集效果不太理想。除利用抗体对含Kme肽进行富集外，也有研究利用赖氨酸甲基化修饰肽的理化性质进行富集，或利用野生型Chromo结构域对赖氨酸甲基化修饰肽进行富集。例如，利用Cbx1 Chromo domain和L3MBTL1 MBT结构域对含Kme肽进行富集(Albanese,K.I.,etal.,Engineered Reader Proteins for Enhanced Detection of Methylated Lysine onHistones.ACS Chem Biol,2020.15(1):p.103-111.Carlson,S.M.,et al.,Proteome-wideenrichment of proteins modified by lysine methylation.Nature protocols,2014.9(1):p.37-50.)，但其富集效果并不理想，制约了赖氨酸甲基化修饰研究及相关应用的发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有赖氨酸甲基化修饰富集鉴定方法鉴定到的修饰位点数量有限的缺陷和不足，提供一种与含赖氨酸甲基化修饰肽具有高亲和力的变体Chromo结构域。
本发明的第一个目的是提供一种与含赖氨酸甲基化修饰肽具有高亲和力的变体Chromo结构域。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述变体Chromo结构域的DNA序列。
本发明的第三个目的是提供一种含有所述DNA序列的载体。
本发明的第四个目的是提供一种含有所述变体Chromo结构域的多肽。
本发明的第五个目的是提供所述变体Chromo结构域在检测含赖氨酸甲基化修饰肽或用于制备检测含赖氨酸甲基化修饰肽的产品中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述变体Chromo结构域在检测含赖氨酸甲基化修饰肽的浓度或用于制备检测含赖氨酸甲基化修饰肽的浓度的产品中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种检测含赖氨酸甲基化修饰肽的方法。
本发明的第八个目的是提供一种分离含赖氨酸甲基化修饰肽的方法。
本发明的第九个目的是提供一种检测含赖氨酸甲基化修饰肽的浓度的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明通过对野生型Cbx1 Chromo结构域的特定区域内引入单个或多个氨基酸取代，获得了对与含赖氨酸甲基化修饰肽具有高亲和力的变体Chromo结构域。
具体地，所述野生型Cbx1 Chromo结构域的特定区域为编码Met1和Ser80之间的野生型Cbx1 Chromo结构域，其对应氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
更具体地，所述对含Kme肽的亲和性显著增强的变体Chromo结构域是对SEQ IDNO.1所示野生型结构域构建体中的8个氨基酸位点进行取代得到；所述8个氨基酸位点对应于野生型全长人Cbx1 Chromo结构域的残基的Glu19(位点1)、Glu20(位点2)、Tyr21(位点3)、Trp42(位点4)、Phe45(位点5)、Asp49(位点6)、Thr51(位点7)和Glu53(位点8)。
作为一种实施方案，本发明通过对SEQ ID NO.1所示结构域构建体中的8个氨基酸位点进行取代，得到的一种对含Kme肽的亲和性显著增强的变体Chromo结构域如变体Chromo结构域1～5任一所示。
其中，变体Chromo结构域1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；变体Chromo结构域2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；变体Chromo结构域3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；变体Chromo结构域4的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；变体Chromo结构域5的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的变体Chromo结构域可通过使用本领域技术人员已知的重组DNA技术进行制备。例如，利用合适的方式，将编码本发明所述变体Chromo结构域的DNA序列引入合适的表达载体(即重组表达载体)，通过诱导表达获得。因此，本发明申请保护编码所述变体Chromo结构域的DNA序列。
本发明还申请保护含有编码所述变体Chromo结构域的DNA序列的载体。
本发明还提供了一种多肽，其包含多个Chromo结构域，所述多个Chromo结构域中包含至少一个本发明所述的变体Chromo结构域。
由于本发明所述变体Chromo结构域对含赖氨酸甲基化修饰肽(含Kme肽)具有高亲和性，在此基础上，通过在所述变体Chromo结构域上标记标签，即可实现对含Kme肽的检测。因此，本发明还申请保护所述变体Chromo结构域在检测含Kme肽或在制备检测含Kme肽的产品中的应用。所述可标记变体Chromo结构域的标签包括但不限于放射性标记、细胞毒素标记或荧光标记。
本发明还申请保护所述变体Chromo结构域在检测含Kme肽的浓度或在制备检测含Kme肽的浓度的产品中的应用。
本发明还申请保护所述变体Chromo结构域在体外或体内的肽或蛋白中结合或检测赖氨酸甲基化修饰残基的应用。
本发明还申请保护所述变体Chromo结构域在制备用于结合或检测体外或体内的肽或蛋白中的赖氨酸甲基化修饰残基的产品中的应用。
本发明所述变体Chromo结构域还可与载体一起提供，其可以通过共价或非共价偶联至固相载体，并可直接或间接用标签标记，所述标签选自但不限于生物素、荧光素、酶、辣根过氧化物酶。
具体地，本发明所述检测含Kme肽和检测含Kme肽的浓度的产品包含结合至亲和性柱或结合在侧流试纸条上的变体Chromo结构域，所述变体Chromo结构域为变体Chromo结构域1～5任一所示。
本发明还提供了一种检测含Kme肽的方法，将样品接触本发明任一所述变体Chromo结构域，如果样品中存在含Kem的肽，则会形成含Kem肽/变体Chromo结构域复合物，检测是否有复合物形成即可检测含Kem肽是否存在。
本发明还提供了一种分离含Kme肽的方法，将样品接触本发明任一所述变体Chromo结构域，如果样品中存在含Kme肽，则会形成含Kme肽/变体Chromo结构域复合物，从复合物中释放含Kme肽，即可对含Kme肽进行分离。
进一步地，在分离含Kme肽的基础上，可通过检测所释放的含Kme肽的数量来检测含Kme肽在样品中的浓度。
具体地，本发明所述检测样品中所含Kme肽的浓度的方法包括以下步骤：
S1.将本发明的变体Chromo结构域固定在树脂上；
S2.将样品流经步骤S1所述树脂；
S3.通过添加去除变体Chromo结构域结合含Kme肽的能力的溶剂，释放结合到树脂上的任何含Kme肽，从而产生洗脱组份；
S4.测定洗脱组份中存在的含Kme肽的浓度。
所述含Kme肽的浓度可通过高效液相色谱(HPLC)进行确定。
本发明所述变体Chromo结构域或还可用于制备治疗蛋白赖氨酸甲基转移酶失调(例如免疫学的和肿瘤学的失调)的药物，通过抑制赖氨酸甲基转移酶的作用进行治疗。
本发明上述检测含Kme肽在样品中的浓度的方案的一种临床应用，比如可以用于检测受试者体内蛋白赖氨酸甲基转移酶是否失调，具体方法是通过将受试者的组织样品接触本发明所述变体Chromo结构域以检测样品中含赖氨酸甲基化修饰的蛋白的量或浓度，若样品中含赖氨酸甲基化修饰蛋白的数量较正常对照样品中增加，即可指示赖氨酸甲基转移酶失调。
所述组织样品包括组织裂解物、血液或其它体液。
此外，也可通过使用荧光标记的变体Chromo结构域在组织切片上造影含赖氨酸甲基化修饰的蛋白；或使用基于ELISA的变体Chromo结构域组合目标蛋白特异性抗体以分析其在正常和疾病组织(或细胞)中的甲基化修饰等。
以异常赖氨酸甲基转移酶催化为特征的癌组织相对于正常组织具有更强的赖氨酸甲基化修饰，可使用基于Chromo变体的造影工具进行检测和造影，用造影标签标记的变体Chromo结构域可被用于肿瘤、PET、MRI等的体内造影。
为了检测样品中的变体Chromo结构域，本发明的变体Chromo结构域可优先选用探针分子标记。
Kme阳性细胞的检测可通过探针进行，探针至少包括一个包含变体Chromo结构域的肽和一个造影组分。具体地，该探针可用可检测标记物进行标记，其可允许检测Kme阳性细胞的位置。
本发明的探针可允许跟随Kme阳性细胞的移动和发展。
探针的造影组分一般可包含标签，标记的方法是本领域技术人员熟知的。
具体地，标签可以是适于体内造影使用的那些分子。
Chromo单体探针可在检测前进行可检测的标记，可选的，可以使用可结合杂交产物的可检测标签，这些可检测标签可包括但不限于具有可检测的物理或化学性质且在免疫分析领域已经良好开发的任何材料。
用于本发明的标签可以是通过显微镜、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的任何组合物。
本发明所述变体Chromo结构域还可用于制备可识别本发明任一所述变体Chromo结构域的单克隆抗体(mab)，利用所述抗体检测样品中是否存在变体Chromo结构域。
本发明所述对含Kme肽具有超高亲和性变体Chromo结构域还可用作抗-Kme抗体的替代品，被用于使用抗-Kme抗体的研究领域。例如蛋白质印迹、免疫荧光和蛋白质组学(甲基化修饰蛋白/肽的富集)等等。
本发明具有以下有益效果：
本发明所述变体Chromo结构域可以有效地对含Kme肽进行富集，可用于检测含Kme肽以及检测含Kme肽的浓度。
此外，本发明所述变体Chromo结构域还可被用作抗-Kme抗体的替代品，用于使用抗-Kme抗体的研究中，例如蛋白质印迹、免疫荧光、蛋白质组学、甲基化蛋白/肽的富集等。
附图说明
图1为野生型Cbx1 Chromo结构域的Met1和Ser80之间的序列及二级结构示意图。
图2为使用Biacore T200测定野生型Cbx1 Chromo结构域和变体Chromo结构域与H3K9me3肽的结合曲线和Kd值；图中的A为野生型Cbx1 Chromo结构域的结合曲线；图中的B为变体Chromo结构域1的结合曲线；图中的C为变体Chromo结构域2的结合曲线；图中的D为变体Chromo结构域3的结合曲线；图中的E为变体Chromo结构域4的结合曲线；图中的F为变体Chromo结构域5的结合曲线。
图3为变体Chromo结构域2与不同的赖氨酸甲基化修饰肽及其对应的非修饰肽结合的ELISA实验结果。
图4为变体Chromo结构域2富集H3K9me3多肽前后的谱图比较结果；图中的A为富集前H3K9me3多肽溶液的MALDI谱图；图中的B为富集后H3K9me3多肽溶液的MALDI谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
定义：
除非另有说明，否则本发明所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的相同含义。同样的，除了在权利要求中，除非另有说明，否则“或”的使用包括了“和”，反之亦然。非限制性术语不会被解释为限制性的，除非有明确表述或上下文清楚地显示了相反含义(例如“包括”、“具有”和“包含”一般表示“无限制地包括”)。在权利要求中包含的单数形式例如“一”、“一个”和“该”包括了复数指向，除非另有明确说明。
“含Kme肽”指含赖氨酸甲基化修饰肽，即含有甲基化修饰赖氨酸的氨基酸序列分子。
术语"亲代Chromo结构域"包括任何真核Chromo结构域或多肽，其中该多肽具有与源自含有Chromo结构域的人蛋白的Chromo结构域至少约60％序列同一性。如此，术语“亲代Chromo”结构域还包括人工制备的序列。例如，可以基于一种或多种哺乳动物Chromo结构域序列产生或制备人工Chromo结构域序列作为亲代Chromo结构域，其将代表一种典型的Chromo结构域序列，但是与任何哺乳动物Chromo结构域都不相同。
术语"片段"指具有比本发明所示氨基酸残基序列的肽更短的氨基酸残基序列的任何受试肽。
视具体情况，术语“分离的肽”或“分离的DNA”可被定义为肽或DNA分子，其基本上与可能是天然伴随着所述肽或DNA的其它细胞组分分离。该术语包括(没有限制)重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。
术语“配体”表示结合另一分子或目标的分子。
本文使用的术语“肽”或“多肽”定义为氨基酸残基的链，通常具有定义的序列。本文使用的“肽”与“多肽”、“肽”和“蛋白”互相包括。
术语“变体Chromo结构域”、“Chromo变体”、“Chromo单体”、"Chromo结构变体"无差别地被用于指为了本发明的亲和性增强而引入取代的亲代Chromo结构域。在人类的临床或诊断应用中，变体Chromo结构域的用途优选的是从人Chromo结构域作为亲代Chromo结构域进行设计，以最小化向体内补充变体Chromo结构域所可能导致的免疫应答的可能性。
实施例1
本发明通过将野生型人Cbx1 Chromo结构域上特定区域的氨基酸残基随机替换为20种天然氨基酸之一，来鉴定结合含Kme肽的变体Chromo结构域。
所述野生型Cbx1 Chromo结构域的所有氨基酸残基数与UniProt数据库条目(entry)CBX1_HUMAN的全长同种型。将编码Met1和Ser80之间的野生型Cbx1Chromo结构域(对应氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的基因亚克隆入pDEST15载体(Invitrogen CanadaInc.)。
将编码SEQ ID NO.1所示野生型Cbx1 Chromo结构域的基因融合至编码M13噬菌体主外壳蛋白的基因，通过对与Kme结合的Chromo domain区域的氨基酸位点进行突变，形成多样性文库，用于高亲和力突变体的筛选。
用Kunkel方法(参见：Sidhu等，2000，Method Enzymol.Vol.328，pp.333)在SEQ IDNO.1所示序列的8个氨基酸位点上进行同时随机化，8个位点对应于原子结构中围绕着Kme的8个氨基酸残基，这些位点可连续编号为位点1至位点8，如图1所示。这8个位点对应于野生型全长人Cbx1 Chromo结构域的残基的Glu19(位点1)、Glu20(位点2)、Tyr21(位点3)、Trp42(位点4)、Phe45(位点5)、Asp49(位点6)、Thr51(位点7)和Glu53(位点8)。
突变产生了Cbx1 Chromo结构域库，其在8个位点上含有随机取代的氨基酸残基，使用噬菌体展示方法来在M13噬菌体表面上展示这些引入取代的Cbx1Chromo结构域，并利用H3K9me3的合成肽(SEQ ID NO.7所示)进行噬菌体筛选，通过高通量测序以鉴定结合至H3K9me3的变体Chromo结构域的序列。本发明获得了5种对含赖氨酸甲基化修饰肽亲和性增强的变体Cbx1 Chromo结构域，所得变体Chromo结构域中8个位点的残基如表1所示。在每种变体中，至少含有一个对野生型Cbx1 Chromo结构域残基进行氨基酸取代的位点。
表1
实施例2
本发明以Cbx1 Chromo结构域的野生型构建体作为模板，通过定点突变方法对野生型Cbx1 Chromo结构域引入单一或多个取代，构建了5个变体Chromo结构域，并测定了由这些取代的引入而产生的变体Chromo结构域对含赖氨酸甲基化肽亲和性增强的程度。
在以下的描述中，使用位点编号具体指明被取代的残基。例如，E2W表示将野生型构建体位点2的Glu取代为Trp；E1K/E2W则表示组合的2个取代，即将野生型构建体位点1的Glu取代为Lys，以及将位点2的Glu取代为Trp。通过对野生型构建体(SEQ ID NO.1)进行取代，构建了以下变体Cbx1 Chromo结构域：E1K/E2W、E1G/E2W/Y3F、E2W、E2W/D6A/T7S和E1V/E2Y；5个变体Chromo结构域的位点1到位点8间的氨基酸序如下所示：
变体Chromo结构域1：E1K/E2W，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO.2)所示：Met GlyLys Lys Gln Asn Lys Lys Lys Val Glu Glu Val Leu Glu Glu Glu Glu Lys Trp TyrVal Val Glu Lys Val Leu Asp Arg Arg Val Val Lys Gly Lys Val Glu Tyr LeuLeuLys Trp Lys Gly Phe Ser Asp Glu Asp Asn Thr Trp Glu Pro Glu Glu Asn LeuAspCys Pro Asp Leu Ile Ala Glu Phe Leu Gln Ser Gln Lys Thr Ala His Glu ThrAsp LysSer
变体Chromo结构域2：E1G/E2W/Y3F，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO.3)所示：MetGly Lys Lys Gln Asn Lys Lys Lys Val Glu Glu Val Leu Glu Glu Glu Glu Gly TrpPhe Val Val Glu Lys Val Leu Asp Arg Arg Val Val Lys Gly Lys Val Glu TyrLeuLeu Lys Trp Lys Gly Phe Ser Asp Glu Asp Asn Thr Trp Glu Pro Glu Glu AsnLeuAsp Cys Pro Asp Leu Ile Ala Glu Phe Leu Gln Ser Gln Lys Thr Ala His GluThr Asp Lys Ser
变体Chromo结构域3：E2W，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO.4)所示：Met Gly LysLys Gln Asn Lys Lys Lys Val Glu Glu Val Leu Glu Glu Glu Glu Glu Trp Tyr ValVal Glu Lys Val Leu Asp Arg Arg Val Val Lys Gly Lys Val Glu Tyr Leu Leu LysTrp Lys Gly Phe Ser Asp Glu Asp Asn Thr Trp Glu Pro Glu Glu Asn Leu Asp CysPro Asp Leu Ile Ala Glu Phe Leu Gln Ser Gln Lys Thr Ala His Glu Thr Asp LysSer
变体Chromo结构域4：E2W/D6A/T7S，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO.5)所示：MetGly Lys Lys Gln Asn Lys Lys Lys Val Glu Glu Val Leu Glu Glu Glu Glu Glu TrpTyr Val Val Glu Lys Val Leu Asp Arg Arg Val Val Lys Gly Lys Val Glu Tyr LeuLeu Lys Trp Lys Gly Phe Ser Asp Glu Ala Asn Ser Trp Glu Pro Glu Glu Asn LeuAsp Cys Pro Asp Leu Ile Ala Glu Phe Leu Gln Ser Gln Lys Thr Ala His Glu ThrAsp Lys Ser
变体Chromo结构域5：E1V/E2Y，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO.6)所示：Met GlyLys Lys Gln Asn Lys Lys Lys Val Glu Glu Val Leu Glu Glu Glu Glu Val Tyr TyrVal Val Glu Lys Val Leu Asp Arg Arg Val Val Lys Gly Lys Val Glu Tyr Leu LeuLys Trp Lys Gly Phe Ser Asp Glu Ala Asn Ser Trp Glu Pro Glu Glu Asn Leu AspCys Pro Asp Leu Ile Ala Glu Phe Leu Gln Ser Gln Lys Thr Ala His Glu Thr AspLys Ser
为测定上述变体Chromo结构域的亲和性增强程度，本发明合成了表2所示含赖氨酸甲基化修饰肽，包括单甲基化、双甲基化和三甲基化修饰肽。
表2
注：“a”：6-氨基乙酸
本发明利用多肽H3K9me3对上述变体Chromo结构域进行了结合分析，具体方法如下：
在LB培养基(EMD Chemicals)中培养大肠杆菌BL21(DE3)菌株过表达来生产出每种变体和野生型Chromo结构域。通过1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，细胞培养物在18℃下培育20小时。在含20mM磷酸钠、0.1M NaCl、20mM咪唑、1mg/ml溶菌酶和1％ Triton-X 100，调节pH7.8的缓冲溶液中，离心收集细胞，并在冰上破碎。用Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen Inc.)按照制造商的说明进行亲和纯化。纯化的材料用TBS(tris bufferedsaline，三乙醇胺缓冲盐水溶液，pH7.4)溶解。
利用基于表面等离子共振技术(SPR)的Biacore T200，使用不同浓度的H3K9me3肽段，测定野生型和变体Chromo结构域与含Kme肽的亲和力KD(单位M)，结果如图2所示，图2中的A为野生型Cbx1 Chromo结构域的结合曲线；图2中的B为变体Chromo结构域1的结合曲线；图2中的C为变体Chromo结构域2的结合曲线；图2中的D为变体Chromo结构域3的结合曲线；图2中的E为变体Chromo结构域4的结合曲线；图2中的F为变体Chromo结构域5的结合曲线。
用GraphPad Prism软件通过假设单一位点结合模型(GraphPad Software)计算KD值，测定的6个Chromo结构域(包括野生型)和含Kme肽之间相互作用的KD值如表3所示。KD值越小，表示结合力越强。由图2和表3所示结果可知，本发明所述变体Chromo结构域结合含Km肽的能力明显强于野生型Cbx1Chromo结构域。
表3
实施例3
基于实施例2所得结果，选取与H3K9me3肽亲和力最强的变体Chromo结构域2，测定其是否为结合含Kme肽的泛抗体，利用表2所示含赖氨酸甲基化修饰肽，包括单甲基化、双甲基化和三甲基化修饰肽，通过蛋白ELISA方法检测变体Chromo结构域2和不同含Kme肽的结合情况，具体方法如下：
在高吸附性的96孔板底部包被变体Chromo结构域2，然后加入质量分数为2％的脱脂牛奶封闭96孔板上没有吸附变体Chromo结构域2的位置，然后在不同的孔分别加入表2所示的肽，室温孵育1h后，加入SA-HRP抗体，室温孵育30min后，加入TMB显色液进行颜色反应，在阴性对照(H3K9)显色前加入1M的磷酸终止显色，使用酶标仪测量OD450数值。
结果如图3所示，由图3可知，变体Chromo结构域2与多种序列不同的含Kme肽均存在相互作用；其中，变体Chromo结构域2与H3K9me1/2、H3K4me4、H3K27me2和DNA-PKcsK1150me1/2/3肽的相互作用较强，变体Chromo结构域2与H3K4me1、H3K18me2和DDX46K389me2/3肽的相互作用较弱，变体Chromo结构域2与表2中其他肽的信号接近阴性对照的则表示没有相互作用。
由上述结果可知，变体Chromo结构域2除与H3K9me3肽结合外，还可与其他多种含Kme肽具有相互作用，变体Chromo结构域2是结合含Kme肽的泛抗体。
实施例4
由于含Kme肽的丰度低，动态范围广，质谱检测时易受非修饰肽影响，因此，质谱检测前需通过富集实验提高含Kme肽的丰度。为检测变体Chromo结构域2对含Kme肽的富集效果，本发明利用H3K9me3肽(合成纯度为75％)进行了实验，富集实验方法具体如下：
利用His-tag和Ni离子之间的相互作用，把含有His-tag的变体2蛋白质(变体Chromo结构域2)偶联在Ni-NTA凝胶珠上，然后把凝胶珠加入到含有待富集的H3K9me3肽的PBS(pH7.2～7.4)溶液中，将上述富集体系放在微型层析管中，安好层析管的上下堵头，将层析管放在旋转混匀仪上，颠倒混匀孵育过夜。次日上午，打开层析管的上下堵头，让孵育液自然流下，加入8～10个柱体积的PBS(pH7.2～7.4)清洗凝胶珠，轻轻甩干层析管中的液体，加入200μL体积分数为0.5％的TFA/H2O溶液，洗脱蛋白结合的肽，重复洗脱3次，把洗脱液送去做MALDI-TOF检测。
结果如图4所示，图4中的A是未经富集的H3K9me3肽的谱图，丰度最高的峰是H3K9me3肽，除主峰外还有2条丰度较高的杂峰，公司合成报告的纯度为75％，峰图与纯度基本相符；图4中的B是富集后质谱检测得到的H3K9me3肽的谱图，其中只有一条丰度高的主峰，为H3K9me3肽，此外有两条丰度非常低的杂峰，质谱检测时影响不大。由图4中的A和B对比可知，利用变体Chromo结构域2进行富集后的效果显著，表明变体Chromo结构域2能较好地用于含Kme肽的富集。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种与含赖氨酸甲基化修饰肽具有高亲和力的变体Chromo结构域，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2～6任一所示。
2.一种编码权利要求1所述变体Chromo结构域的DNA序列。
3.一种含有权利要求2所述DNA序列的载体。
4.一种多肽，其特征在于，所述多肽包含多个Chromo结构域，所述多个Chromo结构域中的至少一个为权利要求1所述变体Chromo结构域。
5.权利要求1所述变体Chromo结构域在检测含赖氨酸甲基化修饰肽或在制备检测含赖氨酸甲基化修饰肽的产品中的应用。
6.权利要求1所述变体Chromo结构域在检测含赖氨酸甲基化修饰肽的浓度或在制备检测含赖氨酸甲基化修饰肽的浓度的产品中的应用。
7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述产品中包含结合至亲和性柱或结合在侧流试纸条上的变体Chromo结构域。
8.一种检测含赖氨酸甲基化修饰肽的方法，其特征在于，将样品接触权利要求1所述变体Chromo结构域，如果样品中存在含赖氨酸甲基化修饰肽，则会形成含赖氨酸甲基化修饰肽/变体Chromo结构域复合物，检测是否有复合物形成即可检测含赖氨酸甲基化修饰肽是否存在。
9.一种分离含赖氨酸甲基化修饰肽的方法，其特征在于，将样品接触权利要求1所述变体Chromo结构域，如果样品中存在含赖氨酸甲基化修饰肽，则会形成含赖氨酸甲基化修饰肽/变体Chromo结构域复合物，从复合物中释放含赖氨酸甲基化修饰肽，即可对含赖氨酸甲基化修饰肽进行分离。
10.一种检测含赖氨酸甲基化修饰肽的浓度的方法，其特征在于，在权利要求9所述方法的基础上，再通过检测所释放的含赖氨酸甲基化修饰肽的数量来检测含赖氨酸甲基化修饰肽在样品中的浓度。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001047975A1 (en) * | 1999-12-27 | 2001-07-05 | Shanghai Biowindow Gene Development Inc. | A novel polypeptide-protein 10 containing chromo domain and the polynucleotide encoding said polypeptide |
| CN1333223A (zh) * | 2000-07-07 | 2002-01-30 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——染色质聚集蛋白70和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US20050186569A1 (en) * | 2001-10-29 | 2005-08-25 | Becha Shanya D. | Nucleic acid-associated proteins |
| CN101273142A (zh) * | 2005-07-01 | 2008-09-24 | 肿瘤疗法科学股份有限公司 | 用于癌症治疗的调节smyd3转移酶的化合物的鉴定 |
| CN102099470A (zh) * | 2008-08-15 | 2011-06-15 | 藤仓化成株式会社 | 用于诊断动脉硬化的多肽标记、用该标记等检测动脉硬化的方法以及用于诊断动脉硬化的试剂盒 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001047975A1 (en) * | 1999-12-27 | 2001-07-05 | Shanghai Biowindow Gene Development Inc. | A novel polypeptide-protein 10 containing chromo domain and the polynucleotide encoding said polypeptide |
| CN1333223A (zh) * | 2000-07-07 | 2002-01-30 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——染色质聚集蛋白70和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US20050186569A1 (en) * | 2001-10-29 | 2005-08-25 | Becha Shanya D. | Nucleic acid-associated proteins |
| CN101273142A (zh) * | 2005-07-01 | 2008-09-24 | 肿瘤疗法科学股份有限公司 | 用于癌症治疗的调节smyd3转移酶的化合物的鉴定 |
| CN102099470A (zh) * | 2008-08-15 | 2011-06-15 | 藤仓化成株式会社 | 用于诊断动脉硬化的多肽标记、用该标记等检测动脉硬化的方法以及用于诊断动脉硬化的试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KATHERINE I. ALBANESE等: "Engineered Reader Proteins for Enhanced Detection of Methylated Lysine on Histones", 《ACS CHEM BIOL.》, vol. 15, no. 1, 17 January 2020 (2020-01-17), pages 103 - 111 * |
| 李韬等: "小麦赤霉病：从表型鉴定到抗性改良", 《科技导报》, vol. 34, no. 22, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 75 - 80 * |
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