CN102099470A - 用于诊断动脉硬化的多肽标记、用该标记等检测动脉硬化的方法以及用于诊断动脉硬化的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明目的在于提供一种能够进一步提高动脉硬化病变检测精确度的用于诊断动脉硬化的多肽标记、用于诊断动脉硬化的基因标记、抗体、用于检测动脉硬化标记基因的探针、用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片，以及动脉硬化的检测方法，并且还提供了用于诊断动脉硬化的试剂盒。具体地说，本发明提供用于诊断动脉硬化的多肽标记包括如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35所示的氨基酸序列所表示的多肽、或其部分氨基酸序列所示的多肽，编码上述多肽标记的基因，检测该基因的探针，具有该探针的DNA微阵列或DNA芯片，以所述多肽作为抗原的抗体以及包括上述任一种的试剂盒，此外，本发明还提供使用上述这些检测动脉硬化的方法。

Description

用于诊断动脉硬化的多肽标记、用该标记等检测动脉硬化的方法以及用于诊断动脉硬化的试剂盒

技术领域

本发明涉及用于诊断动脉硬化的多肽标记、用于诊断动脉硬化的基因标记、抗体、用于检测动脉硬化标记基因的探针、用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片以及动脉硬化的检测方法，并且还涉及用于诊断动脉硬化的试剂盒。

本申请基于2008年8月15日在日本提出申请的特愿2008-209210号日本专利申请主张优先权，在此引用其内容。

背景技术

动脉硬化多发生于大动脉、冠状动脉、脑动脉或颈动脉，是引起心肌梗塞、脑梗塞等的主要原因。现在，普遍认为在占死亡原因首位的缺血性心脏病、脑血管堵塞等缺血性脏器疾病的发病原因中，粥状动脉硬化(动脉粥样硬化)的存在非常重要。动脉硬化病变的病理形态学特征在于蓄积了胆固醇酯的细胞(泡沫化细胞)在内皮下堆积而成的脂肪条纹；还在于普遍认为是平滑肌细胞、巨噬细胞、T细胞等的浸润、细胞坏死以及脂肪蓄积的、呈进行状态的纤维硬化斑块(fibrous plaque)。蓄积了脂肪的部位显示出结构脆弱性，以血流动力学的力为诱因使硬化斑块破裂，由于组织因子与凝血因子之间的反应从而急剧形成血栓。现在已经明确了冠状动脉处硬化斑块破裂引起血栓性堵塞与急性心肌梗塞、不稳定型心绞痛、心脏猝死等所谓的急性冠状动脉综合征(ACS)的发病有着密切关系(非专利文献1)。

由于动脉硬化在没有自觉症状的同时缓慢发展，会突发心肌梗塞、脑梗塞、心绞痛等，因此必须要早期发现。对动脉硬化病变的诊断，一直以来广泛采用超声波检查、血管造影检查、MRI(核磁共振成像装置)等图像检查、心电图、脑电图等，但为了使动脉硬化病变的诊断能够用来早期发现动脉硬化，优选用生物化学检查的方法。

众所周知，在用生物化学检查诊断动脉硬化病变中，对血清或血浆中的LDL(低密度脂蛋白)、脂蛋白(Lp-α)、残余蛋白、氧化LDL等血管壁脂质蓄积有关的动脉硬化诱因性脂蛋白进行测定。尤其是近年来，对血液中与动脉硬化有关的物质的测定倍受关注，有报道称有用的是CRP(C反应性蛋白)、衣原体抗体效价的测定。

作为上述通过测定动脉硬化诱因的脂蛋白来诊断动脉硬化病变的方法，已知有如下所示的方法。例如，对于LDL的测定方法有：用免疫学方法测定与存在于血清或血浆中的氧化LDL形成复合体的乳铁蛋白、髓过氧化物酶或粒细胞弹性蛋白酶等源自血清或血浆中的嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞等炎症细胞的成分的方法(专利文献1)；采用免疫学检测方法，所述免疫学检测方法使用由氧化LDL受体的细胞外区域与免疫球蛋白重链恒定区的一部分构成的融合多肽(专利文献2)；使用对氧化LDL与α1抗胰蛋白酶复合体可特异性识别的抗人乙醛修饰-α1抗胰蛋白酶单克隆抗体的方法(专利文献3、4)；对血浆中的LDL的氧化变性度用由V-70等偶氮化合物构成的氧化剂进行测定的方法等(专利文献5)。

并且，对于测定脂蛋白来诊断动脉硬化病变的方法还公开有：测定变性血液中的脂蛋白残粒(RLP)的方法(专利文献6)；检测人体软骨GP39-L多肽基因的表达，对风湿病、动脉硬化病变进行诊断的方法(专利文献7)；测定血液中的载脂蛋白B100，对动脉硬化病变进行诊断的方法(专利文献8)；使用针对人磷脂转移蛋白(PLTP)的单克隆抗体测定PLTP的方法(专利文献9)；以及使用载脂蛋白A-I抗体作为用于诊断动脉硬化的标记的方法(专利文献10)等。

并且，关于诊断动脉硬化病变的其他方法还有：使用钠依存性胆汁酸转运蛋白的抗体，对高血脂、动脉硬化病变进行诊断的方法(专利文献11)；将第VII凝固因子活性蛋白酶(FSAP)作为动脉粥样硬化的危险因子进行测定、诊断的方法(专利文献12)；检测源自血管内皮细胞、平滑肌细胞的晚期糖尿病性肾病样分子(ESDN)及其基因的表达来进行动脉硬化的检查(专利文献13)；利用抗人肝性甘油三酯脂酶抗体的方法(专利文献14)；将血浆试样中的血清素浓度作为标记来对动脉硬化病变进行诊断的方法(专利文献15、16)等。

进一步地，关于诊断动脉硬化病变的其他方法还公开有：以在细胞因子/生长因子的TGF-家族一员的DPP的信号传导中所必须的MAD的亚型sMAD3多肽作为靶标，对慢性肾功能衰竭、动脉粥样硬化进行诊断的方法(专利文献17)；将血液中的Lp-α与α2-巨球蛋白/白细胞介素6的复合体作为测定对象，使用其抗体通过免疫学方法进行测定的方法(专利文献18)；使用针对对氧磷酶的单克隆抗体的方法(专利文献19)；对饱和长链脂肪酸进行测定来检测动脉硬化的方法(专利文献20)；使用RC-9蛋白及其抗体，对动脉粥样硬化进行诊断的方法(专利文献21)等。

如上所述，虽然公开了多种关于对动脉硬化病变进行诊断的生物化学检查方法，但这些检测标记几乎都是风险标记。为了对动脉硬化病变进行更本质的特异性诊断，人们希望进一步开发出能够对该病变进行特异性检测的标记。

因此，在专利文献22中公开了一种用于诊断动脉硬化的多肽标记，作为用于特异性检测动脉硬化病变的标记，以及用于诊断动脉硬化的基因标记、与所述用于诊断动脉硬化的多肽标记进行特异性结合的抗体、检测用于诊断动脉硬化的基因标记的探针以及动脉硬化病变的检测方法。

专利文献

专利文献1：特开2002-48790号公报

专利文献2：特开2002-17353号公报

专利文献3：特开2000-184885号公报

专利文献4：特开平10-142226号公报

专利文献5：特开平9-203736号公报

专利文献6：特开2002-181820号公报

专利文献7：特开2002-142781号公报

专利文献8：特开2002-55106号公报

专利文献9：特开平11-346782号公报

专利文献10：特开平8-160042号公报

专利文献11：特开2003-310281号公报

专利文献12：特开2003-304873号公报

专利文献13：特开2003-189872号公报

专利文献14：特开2002-308900号公报

专利文献15：特开2002-277461号公报

专利文献16：特开2002-131313号公报

专利文献17：特开2002-238589号公报

专利文献18：特开2001-249128号公报

专利文献19：特开2000-333674号公报

专利文献20：特开2000-206113号公报

专利文献21：特表2000-503764号公报

专利文献22：特开2005-168498号公报

非专利文献

非专利文献1：N.Eng.J.Med.，326，242-250，1992.

非专利文献2：Journal of Biological Chemistry，272，556，1997.

发明内容

基于专利文献22的技术，能够通过简单的操作对动脉硬化病变进行检测，也能够对动脉硬化的早期发现有所期待，但仍不够充分。因此希望有一种使用较多的用于诊断动脉硬化的多肽标记及用于诊断动脉硬化的基因标记的、精确度更高的检测动脉硬化病变的方法。

因此，本发明的目的在于提供一种能够进一步提高动脉硬化病变的检测精度的用于诊断动脉硬化的多肽标记、用于诊断动脉硬化的基因标记、抗体、用于检测动脉硬化标记基因的探针、用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片及动脉硬化的检测方法，以及用于诊断动脉硬化的试剂盒。

本发明人为了进一步找到能够特异性检测动脉硬化病变的用于诊断动脉硬化的标记，对在患有动脉硬化性病变的患者血清中表达的蛋白质进行了深入研究。结果发现了能够特异性检测动脉硬化病变的新的用于诊断动脉硬化的多肽标记，进而完成了本发明。

作为详细的研究方法，对在医院及合作机构中住院治疗的患有动脉硬化性病变的患者，在得到本人或家属的同意后，对患者的血清进行如下筛选。得到的cDNA克隆决定了转入质粒pBluescriptll中的碱基序列。然后在质粒pGEX中进行重组后导入到大肠杆菌，通过IPTG(isopropyl β-D-thiogalactoside)使蛋白质大量表达，制备蛋白质提取液。然后，将该蛋白质提取液固化到96孔板上，用LISA法对动脉硬化患者群和健康人群进行抗体血清水平检测，根据其测定值对显著差异进行观察，结果发现对本发明标记的13个克隆，在患者群和健康人群之间均存在着显著差异。并且，通过蛋白质印迹(Western blot)法对蛋白质提取液与多数患者血清之间的反应进行了调查。结果发现，本发明标记的5个克隆与动脉硬化患者的血清呈阳性反应，可用作动脉硬化性病变的存在或不稳定性斑块的特异性标记。并且，利用这些克隆的抗原性或基因探针，开发出了检测动脉硬化的方法，进而可制成使用该检测方法的诊断试剂盒。

即、本发明包括以下所示的用于诊断动脉硬化的多肽标记、用于诊断动脉硬化的基因标记、抗体、用于检测动脉硬化标记基因的探针、用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片及动脉硬化的检测方法，以及用于诊断动脉硬化的试剂盒。

(1)一种用于诊断动脉硬化的多肽标记，其包括如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35所示的氨基酸序列所表示的多肽、或其部分氨基酸序列所表示的多肽。

(2)一种用于诊断动脉硬化的基因标记，其包括编码(1)中所述的用于诊断动脉硬化的多肽标记的氨基酸序列或其部分氨基酸序列的碱基序列所示的基因。

(3)一种用于诊断动脉硬化的基因标记，其包括如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列所表示的基因、或其部分碱基序列表示的基因。

(4)一种以(1)中所述的多肽为抗原、与该多肽特异性结合的抗体。

(5)一种用于检测动脉硬化标记基因的探针，其具有在严格的条件下全部或部分与(2)或(3)所述基因杂交的DNA。

(6)上述(5)所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针，其具有全部或部分针对(3)所述基因的反义DNA。

(7)用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片，其是在基片上固定(5)所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针和/或6)所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针。

(8)使用(4)所述的抗体，对与该抗体进行特异性结合的动脉硬化标记多肽在待测样品中的表达进行检测的动脉硬化检测方法。

(9)使用(1)所述的用于诊断动脉硬化的多肽标记，对与该用于诊断动脉硬化的多肽标记进行特异性结合的抗体在待测血液中的表达进行检测的动脉硬化检测方法。

(10)使用(5)或(6)所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针，对与该用于检测动脉硬化标记基因的探针杂交的基因在待测细胞中的表达进行检测的动脉硬化检测方法。

(11)基于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列构建引物，使用该引物进行PCR反应，对动脉硬化标记基因的表达进行检测的动脉硬化检测方法。

(12)一种用于诊断动脉硬化的试剂盒，其包括选自(5)或(6)所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针、(7)所述的用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片及(4)所述的抗体中的至少一种以上。

(13)一种用于诊断动脉硬化的试剂盒，其具有用于诊断动脉硬化的多肽标记，所述多肽标记包括如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35所示的氨基酸序列所表示的多肽、或其部分氨基酸序列表示的多肽。

通过将本发明的用于诊断动脉硬化的多肽标记、用于诊断动脉硬化的基因标记、抗体、用于检测动脉硬化标记基因的探针、用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片及动脉硬化的检测方法、以及用于诊断动脉硬化的试剂盒应用于检测动脉硬化病变中，能够进行更高精确度地检测。

附图说明

图1为本实施例中用蛋白质印迹法表示动脉硬化标记基因表达的示意图。

具体实施方式

本发明的用于诊断动脉硬化的多肽标记及用于诊断动脉硬化的基因标记，由于其在动脉硬化病变中特异性表达，从而能够用于动脉硬化的检测。作为本发明的用于诊断动脉硬化的多肽标记的多肽，其具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29所示的氨基酸序列或其部分氨基酸序列。

在此，部分氨基酸序列是指选自上述序列表中各序列号所示的氨基酸序列中的部分序列，所述序列由4个以上氨基酸构成，优选为5个以上，更优选为6个以上，进一步优选为7个以上。

本发明中所述多肽的氨基酸序列信息是在平成20年(2008年)7月31日的NCBI基因数据库中，能够以下述登录号：XM_001129783(SEQ ID NO：1)、NM_006088(SEQ ID NO：3)、NM_014878(SEQID NO：5)、NM_207514(SEQ ID NO：7)、NM_001128847(SEQ IDNO：9)、NM_001017408(SEQ ID NO：11)、NM_015089(SEQ IDNO：13)、NM_133337(SEQ ID NO：15)、NM_022406(SEQ ID NO：17)、NM_001402(SEQ ID NO：19)、NM_005349(SEQ ID NO：21)、NM_005406(SEQ ID NO：23)、NM_016436(SEQ ID NO：25)、NM_032408(SEQ ID NO：27)、NM_014377(SEQ ID NO：29)得到。

并且，本发明的用于诊断动脉硬化的基因标记包括对具有所述氨基酸序列及其部分氨基酸序列的多肽进行编码的碱基序列所示的基因。该用于诊断动脉硬化的基因标记的基因只要具有能够表达所述多肽的碱基序列即可。

作为本发明的用于诊断动脉硬化的基因标记的基因，例如为以下所示的克隆基因，例如具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列或其部分碱基序列的基因。上述各种基因信息(碱基序列信息)在NCBI基因数据库中，能够通过以下所述的各登录号获得。

即，作为用于诊断动脉硬化的基因标记的基因，举例有“克隆名：S19A3；SEQ ID NO：2；登录号：XM_001129783；基因名：(预测)与LIM类似和衰老结构域1(LOC729260)；对基因的说明：与LIMS1基因类似。LIMS1是包含5个LIM结构域或双锌指结构的结合蛋白。并且LIMS1可以起到以整合蛋白作为媒介的细胞结合或伸展的作用。”、“克隆名：TS27A2；SEQ ID NO：4；登录号：NM_006088；基因名：β-微管蛋白2C基因(TUBB2C)；对基因的说明：构成微管的蛋白质。”、“克隆名：S21B1；SEQ ID NO：6；登录号：NM_014878；基因名：KIAA0020(KIAA0020)；对基因的说明：有编码次要组织相容性抗原的报道。”、“克隆名：S25E1；SEQ ID NO：8；登录号：NM_207514；基因名：FDCP8同源基因差异表达(小鼠)(DEF8)；对基因的说明：功能不详”、“克隆名：TS12D2；SEQ ID NO：10；登录号：NM_001128847；基因名：SWI/SNF相关的、基质联合的、染色质的肌动蛋白依赖调节基因，a亚家族，成员4(SMARCA4)；对基因的说明：不详”、“克隆名：S36C3；SEQ ID NO：12；登录号：NM_001017408；基因名：高尔基(golgi)相关的PDZ结构和卷曲螺旋模体(GOPC)；对基因的说明：与低分子量GTP结合蛋白Rho的效应物Rhotekin结合。此外，有报道称Rhotekin和GOPC的结合受到Rho依赖性控制。”、“克隆名：N48B1；SEQ ID NO：14；登录号：NM_015089；基因名：p53基因相关的帕金样细胞质蛋白(PARC)；对基因的说明：与细胞分裂的从中期到后期的转移有关。与泛素依赖性蛋白分解有关。”、“克隆名：S28D1；SEQ ID NO：16；登录号：NM_133337；基因名：fer-1-like 3，myoferlin(线虫)(FER1L3)；对基因的说明：与骨骼肌蛋白dysferlin类似的II型膜蛋白。暗示了具有C2结构域的该基因可能与细胞膜或核膜的再生、修复有关。”、“克隆名：TS27H1；SEQ ID NO：18；登录号：NM_022406；基因名：透视修复在中国仓鼠细胞补充缺陷修复4(XRCC4)；对基因的说明：由该基因所指导的蛋白质与DNA连接酶IV及DNA依赖性蛋白激酶一同起到基于非同源性末端连接(NHEJ)的DNA双链修复和V(D)J重组完成的作用。非同源性末端连接途径是正常增殖和抑制肿瘤所必须的。”、“克隆名：PA105；SEQ ID NO：20；登录号：NM_031229；基因名：含有蛋白1的RanBP型和C3HC4型锌指蛋白(RBCK1)；对基因的说明：功能不详。与大鼠UIP28/UbcM4相互作用蛋白的氨基酸序列类似。”、“克隆名：S16D2；SEQ ID NO：22；登录号：NM_005349；基因名：免疫球蛋白κ链J区的重组信号结合蛋白(RBPJ)；对基因的说明：不详”、“克隆名：S27D3；SEQ ID NO：24；登录号：NM_005406；基因名：Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)；对基因的说明：是被低分子量GTP结合蛋白Rho活化的丝氨酸-苏氨酸激酶。不只与细胞收缩有关，还与形态控制、移动、基因表达控制等生理功能有关。”、“克隆名：S36E1；SEQ ID NO：26；登录号：NM_016436；基因名：PHD锌指蛋白20(PHF20)；对基因的说明：与DNA依赖性转录控制有关。”、“克隆名：S39D6；SEQ IDNO：28；登录号：NM 032408；基因名：与锌指结构域相邻的溴区结构域，1B(BAZ1B)；对基因的说明：是具有与转录的染色质依赖性控制有关的溴结构域的蛋白质的一种。”、“克隆名：TS27B2；SEQID NO：30；登录号：NM_014377；基因名：zuotin相关因子1(ZRF1)；对基因的说明：是细胞周期中的M期磷酸化蛋白质的一种。起到作为分子伴侣的作用。”、“克隆名：PA202；SEQ ID NO：32；登录号：NM_003692；基因名：具有EGF样和两个卵泡抑素样结构域1的跨膜蛋白(TMEFF1)；对基因的说明：有报道指出在非洲爪蟾上通过与Nodal辅助受体的Criptp相结合来阻碍信号的传导。”、“克隆名：PA213；SEQ ID NO：34；登录号：NM_006807；基因名：染色盒同源物1(果蝇HP1β同源物)(CBX1)；对基因的说明：定位于异染色质上，因此可介导基因沉默。”、“克隆名：PA234；SEQ ID NO：36；登录号：BC030642；基因名：PARK2共调控(PACRG)；对基因的说明：是与帕金森病相关的基因。有报道指出其由泛素-蛋白酶体系控制。”

并且，部分碱基序列是指上述序列表中各序列号所示的碱基序列中的部分序列，所述序列含有12个以上碱基、优选为15个以上、更优选为18个以上、进一步优选为20个以上。(以下相同。)

作为用于诊断动脉硬化的基因标记的基因汇总到表1中。

表1

并且，本发明的抗体以作为所述用于诊断动脉硬化的多肽标记的多肽为抗原，为与该多肽特异性结合的抗体。该抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。上述抗体可根据使用所述多肽作为抗原的常规方法来制备。

本发明的抗体也可通过标记物进行标记。标记物可使用酶、放射性同位素、荧光色素、生物素(biotin)、地高辛(digoxygenin)等。酶只要是满足转数(turnover number)大、与抗体结合的状态稳定、能够使基质特异性着色等条件即可，没有特别限制，例如，通常可使用用于EIA(酶联免疫检测法)的过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。此外还可使用酶抑制剂及辅酶等。上述酶和抗体的结合能够通过使用马来酰亚胺等交联剂的公知方法进行。

作为基质可以根据所使用的酶的种类，使用公知物质。例如，使用多肽作为酶时，作为基质可以使用3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯；使用碱性磷酸酶作为酶时，作为基质可以使用对硝基苯酚。

作为放射性同位素可使用¹²⁵I、³H等用于RIA(放射免疫检测法)中的常规放射性同位素。

作为荧光色素可使用异硫氰酸荧光素酯(FITC)及四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)等用于荧光抗体法中的常规荧光色素。

并且，在上述被标记的抗体中还可以结合锰、铁等金属。将上述金属结合抗体施用与人体，通过MRI等测定该金属，从而能够检测出结合了抗体的抗原肽(用于诊断动脉硬化的多肽标记)的存在。

并且，本发明的用于检测动脉硬化标记基因的探针具有在严格条件下全部或部分与作为所述用于诊断动脉硬化的基因标记的基因杂交的DNA。在此，本发明中的“严格条件”可以例举有：在含有50％甲酰胺、5×SSC、5×登哈特溶液(Denhardt氏溶液)、0.1M磷酸二氢钠(pH6.5)、0.5％SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子(denatured salmonsperm)DNA的缓冲液中在42℃温度下杂交，以及用含有1×SSC(0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠)、0.1％的SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液在42℃温度下进行洗涤处理(条件1)；或者在含有5×SSC、5×登哈特溶液、0.1M磷酸二氢钠(pH6.5)、0.5％SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA的缓冲液中在65℃温度下杂交，以及用含有0.1×SSC、0.1％的SDS的缓冲液在65℃温度下进行洗涤处理(条件2)，更优选为后者(条件2)。进而，作为影响杂交严格性的因素，除上述温度条件以外还有各种因素，本领域技术人员均能够对各种因素进行组合，实现与上述例举出的杂交严格性等同的严格性。

并且，本发明的用于检测动脉硬化标记基因的探针，举例有，具有全部或部分针对碱基序列如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所示的基因的反义DNA。即所述探针由具有与上述序列号所示的碱基序列互补的碱基序列、或其部分碱基序列的DNA构成。

上述用于检测动脉硬化标记基因的探针还可以赋予其适当的荧光标记等标记。

并且，本发明的用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片用于检测作为所述用于诊断动脉硬化的基因标记的基因的表达，以及基于该检测诊断动脉硬化病变，其是在基片上固定所述用于检测动脉硬化标记基因的探针而成的。被固定的用于检测动脉硬化标记基因的探针可以仅是上述中的一种，也可以是两种以上。

所述DNA微阵列或DNA芯片可通过常规方法制得。DNA微阵列是例如通过在基片上分别展开预先制备好的含有各种用于检测动脉硬化标记基因的探针的溶液后干燥得到的。此外，DNA芯片是例如通过在基片上用光刻法合成具有所希望的碱基序列的DNA而得到的。

下面对本发明的动脉硬化检测方法进行说明。

本发明的动脉硬化检测方法使用所述用于诊断动脉硬化的多肽标记，检测与该用于诊断动脉硬化的多肽标记特异性结合的抗体(动脉硬化标记抗体)在待测血液中的表达(以下称作“检测方法(1)”)。在取自患有动脉硬化病变的患者的待测血液中，由于作为用于诊断动脉硬化的多肽标记的表达能够诱导所述动脉硬化标记抗体，因此通过用于诊断动脉硬化的多肽标记来检测该动脉硬化标记抗体，能够检测出动脉硬化。

具体地说，检测方法(1)，例举为将取自受试者的血清与固化了的用于诊断动脉硬化的多肽标记接触，使血清中的抗体结合，除去未结合的蛋白，然后使与血清中的抗体特异性结合的标记化抗体(二级抗体)发生反应后，检测该标记化抗体的信号等。作为所述标记化抗体的标记物可使用例如酶、放射性同位素、荧光色素、生物素、地高辛等作为对本发明抗体进行标记的物质。

使用酶作为标记物时，加入因酶作用而分解显色的基质，通过光学方法测定该基质的分解量求出酶活性，将其换算成结合抗体量，通过与标准值进行比较能够计算出抗体量。或者加入因酶作用而发光的基质，能够用微弱发光测定装置(光度计)高灵敏度地进行测定。

使用放射性同位素作为标记物时，通过闪烁计数器等测定该放射性同位素所发出的放射量，能够计算出抗体量。使用荧光色素作为标记物时，通过具有荧光分光计的测定装置测定荧光量，能够计算出抗体量。

检测方法(1)中可以使用蛋白质印迹法。此外，还可以将用于诊断动脉硬化的多肽标记、待测血液中的抗体以及标记化抗体的结合体用公知的分离方法(色谱法、盐析法、乙醇沉淀法、酶法、同相分离法等)分离后，检测标记化抗体的信号。

并且，使用检测方法(1)对动脉硬化进行诊断时，在测试取自受试者的待测血液中是否存在动脉硬化标记抗体后，能够判定存在一种以上该动脉硬化标记抗体的受试者为患有动脉硬化病变的患者或动脉硬化病变高风险者。

此外，本发明的动脉硬化检测方法使用所述用于检测动脉硬化标记基因的探针，对与该用于检测动脉硬化标记基因的探针杂交的基因(动脉硬化标记基因)在待测细胞中的表达进行检测(以下称为“检测方法(2)”)。在取自患有动脉硬化的患者的待测细胞中，由于动脉硬化标记基因进行了表达，因此能够通过用于检测动脉硬化标记基因的探针来对该动脉硬化标记基因的表达进行检测，从而检测动脉硬化。

具体地说，检测方法(2)例举为制备具有上述碱基序列的、链长适合于杂化的用于检测动脉硬化标记基因的探针，赋予其适当的荧光标记等标记，然后使其与取自待测细胞的样品接触，进行杂交反应，对作为用于诊断动脉硬化的基因标记的基因的表达进行检测。

检测方法(2)除使用本发明的用于检测动脉硬化标记基因的探针之外，可以使用公知的检测方法，例如，可以使用Northern杂交法。并且，检测方法(2)中还可以使用上述任何一种用于检测动脉硬化标记基因的探针，可以是一种用于检测动脉硬化标记基因的探针，也可以是多种用于检测动脉硬化标记基因的探针。

并且，检测方法(2)中，该用于检测动脉硬化标记基因的探针还可以使用固定于基片上的DNA微阵列或DNA芯片。

并且，检测方法(2)中，为了扩增取自待测细胞的样品中的动脉硬化标记基因，还可以使用定量或半定量PCR(聚合酶链式反应)。作为该PCR可以使用RT-PCR(逆转录PCR)或实时RT-PCR方法。在进行该PCR时，使用的引物包括用于扩增动脉硬化标记基因的正向引物及反向引物。该引物可以根据SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列进行适当地构建。

如上所述，进行定量或半定量PCR扩增动脉硬化标记基因后，通过使用该样品对该动脉硬化标记基因的表达进行检测，能够提高检测灵敏度。

此外，使用检测方法(2)对动脉硬化进行诊断时，在检测出受试者的动脉硬化标记基因后，与用同样的方法对健康者进行检测的结果相比较，能够判定该检测量大于健康者的受试者为患有动脉硬化病变的患者或动脉硬化病变的高风险者。

此外，本发明的动脉硬化检测方法，使用以作为本发明的用于诊断动脉硬化的多肽标记的多肽为抗原的抗体，对与该抗体特异性结合的多肽(动脉硬化标记多肽)在待测样品中的表达进行检测(以下称作“检测方法(3)”)。在取自患有动脉硬化病变的患者的待测样品中，由于动脉硬化标记基因进行了表达，因此能够通过使用本发明的抗体来对动脉硬化标记多肽进行检测，从而检测动脉硬化。

检测方法(3)除使用本发明的抗体之外，可以使用公知的免疫学测定法。作为免疫学测定法，例举有蛋白质印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定)法、放射免疫检测法、荧光抗体法。

检测方法(3)中所使用的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。

检测方法(3)中使用荧光抗体法时，可以使用直接荧光抗体法，也可以使用间接荧光抗体法。直接荧光抗体是指对用于检测的抗体进行荧光标记，使该抗体与作为待测样品的样品细胞接触并结合，对体现了动脉硬化标记多肽的细胞进行标记的方法。

并且，在通过检测动脉硬化标记多肽的表达来检测动脉硬化时，除了如上所述使用本发明的抗体之外，可以使用TOF-MASS直接检测该动脉硬化标记多肽的方法或使用将与动脉硬化标记多肽相互作用的蛋白质固化于基片上的芯片的方法。

并且，使用检测方法(3)对动脉硬化进行诊断时，在测试取自受试者的待测样品中是否存在动脉硬化标记多肽后，能够判定存在一种以上该动脉硬化标记多肽的受试者为患有动脉硬化病变的患者或动脉硬化病变高风险者。

本发明的在检测动脉硬化病变中所使用的用于检测动脉硬化标记基因的探针、固定有该用于检测动脉硬化标记基因的探针的用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片以及本发明的用于检测动脉硬化标记多肽的抗体，能够制成用于诊断动脉硬化的试剂盒产品，所述用于诊断动脉硬化的试剂盒具有上述中的一种以上，能够检测和诊断动脉硬化。

并且，本发明的用于诊断动脉硬化的多肽标记，也能够制成用于诊断动脉硬化的试剂盒产品，所述用于诊断动脉硬化的试剂盒能够检测和诊断动脉硬化。

通过将以上说明的本发明的用于诊断动脉硬化的多肽标记、用于诊断动脉硬化的基因标记、抗体、用于检测动脉硬化标记基因的探针与专利文献22中公开的物质并用，能够进一步提高动脉硬化的检测精确度。

实施例

下面，通过实施例对本发明进行详细说明。但本发明并不限于以下的记载。

制备例

(样品的制备)

(1)以医院及研究合作机构中就诊的颈动脉狭窄症患者作为对象，以正常受试者为标准(空白)，从门诊病人中选择性别、年龄(±5岁)一致的患者。在门诊就诊时或在脑神经外科入院时进行如下操作：1)向家属解释研究目的及研究合作的自愿性等，签订知情同意书；2)对家族史、疾病史、饮酒及吸烟等生活方式、作息状态进行问诊；3)采血，将血清与血细胞成分分离并冷冻保存；进而，4)基于医生的诊疗病例，对临床重症度、治疗经过、血液检查结果等进行记载。对作为分析对象的患者血液，在进行血清分离后，在-80℃下冷冻保存直到研究开始。抗体及诊疗病例在编号匿名后使用。

(2)以血清为筛选对象，使用由来自于人体毛细血管内皮的cDNA文库构建的市售λZAP II噬菌体(STRATAGENE)。

(表达克隆法)

(3)基于表达克隆法的筛选是按照St John，T(Science，231，845-850，1986)等的方法实施的。

1)使上述(2)中的噬菌体感染大肠杆菌(XL1-Blue)，在NZYagar培养基(直径15cm、平皿(dish))上培养。

2)确认出现斑块后，将进行了IPTG处理的硝化纤维素膜覆盖到培养基上，使来自噬菌体的蛋白质在该硝化纤维素膜上表达转录(転写)。

3)将用1％BSA/PBS稀释了2000倍的患者血清与硝化纤维素膜一起培养过夜，使表达蛋白与血清中的抗体(血清IgG)反应。

4)洗涤后，使碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体作为二级抗体，与硝化纤维素膜反应。

5)使用NBT(四唑氮蓝)，BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐)作为显色试剂，鉴定出血清IgG识别克隆。

6)阳性克隆进行二次、三次筛选(直径10cm、平皿)，去除假阳性克隆。

7)将选择好的噬菌体通过ExAssist helper phage system(Stratagene，LaJolla，CA)转入pBlueScript。

8)使用Plasmid Miniprep kit(Sigma)纯化质粒。

9)通过序列发生器测定获得的克隆的碱基序列，进行与公开数据库的同源性检索，对基因进行鉴定后作为候选蛋白抗原。

(ELISA法)

(4)作为二次筛选的ELISA法。

1)将含有编码候选蛋白抗原的插入片段的pBluescript重组到用于蛋白表达、纯化的载体pGEX-4T(Amersham Bioscience)。根据得到的碱基序列信息选择适合于由pBluescript重组到pGEX-4T的限制性内切酶，通过BamH 1、Sal 1、Not 1、EcoR 1、Xho 1、Sma 1等限制性内切酶进行处理。

2)琼脂糖凝胶电泳后，使用纯化试剂盒GeneElute Minus EtBrSpin Columns(SIGMA)切出目标带，回收经过限制性内切酶处理的插入片段及pGEX-4T。

3)使用Ligation-Convenience Kit(NIPPON GENE)，将上述插入片段与pGEX-4T进行连接(Ligation)，制备含有插入片段的质粒。

4)当克隆没有适当的限制性内切酶时，通过PCR方法制备插入片段。预先制备具有限制性内切酶识别部位的引物，以动脉瘤组织中提取的RNA为模板进行逆转录PCR，制备cDNA，进而进行PCR，得到全长插入片段。以下用同样方法，通过限制性内切酶、连接试剂盒进行处理。

5)将得到的pGEX-4T重组体转化到改良成用于真核细胞蛋白表达的大肠杆菌感受态细胞BL21(NIPPON GENE)中。

6)用含有氨苄青霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导源自插入片段DNA的蛋白表达。

7)将大肠杆菌离心分离回收，经超声粉碎后，分离成可溶部分和不可溶部分。

8)当目标蛋白为不可溶部分的时候，使用尿素对其使其溶解。

9)使用谷胱甘肽-琼脂糖(Amersham Pharmacia)纯化抗原蛋白。

10)在96孔的EMISA板中以10μg/ml的浓度注入抗原蛋白，在4℃下保存过夜，使其固化。

11)PBS洗涤，用10％的牛胎儿血清PBS溶液封闭(blocking)后，将患者血清及对照血清(健康者的血清)稀释2000倍后，与固化的蛋白发生反应。

12)用PBS清洗后，加入HRP标记羊抗人IgG。

13)加入基质显色，用酶标仪测定OD490nm处的吸收。

(蛋白质印迹法)

(5)根据蛋白质印迹法的二次筛选

1)将用上述得到的含有候选蛋白抗原插入片段的pBluescript或pGEX-4T进行转入了的大肠杆菌(SOLR、JM109、BL21)，用2ml的LB氨苄青霉素(50μg/ml)培养一夜。

2)转移到20ml的LB氨苄青霉素后，经1小时培养，然后添加IPTG至终浓度为1mM，将该溶液和对照溶液(没有加入IPTG的溶液)进而培养3小时。

3)将培养液离心后，回收大肠杆菌，用SDS样品缓冲液溶解，作为蛋白质印迹的样品。

4)上述样本在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳后，用转录装置将蛋白转录到硝化纤维素膜上。

5)1％的脱脂乳进行封闭后，添加稀释了2000倍的患者血清作为一次抗体，培养一夜。

6)用PBST(20mM Tris-HCl，(pH7.6)，50mM NaCl，0.1％Tween-20)洗涤后，加入稀释3万倍的HRP标记羊抗人IgG抗体，反应20分钟。

7)用PBST洗涤后，用发光试剂lmmobilon Western(MILLIPORE)使其发光。

8)在胶片上曝光显像。

9)根据IPTG处理将检出带推定为抗原蛋白。通过测序确认用于诊断动脉硬化的基因标记

通过测序测定检测出的克隆基因(用于检测动脉硬化的基因标记)的碱基序列。将据此得到的碱基序列与公开的基因数据库中的碱基序列进行比对，结果得到的克隆基因与编码所述用于诊断动脉硬化的多肽进行的基因的碱基序列一致。

实施例1

根据ELISA法测定抗体效价

采用上述制备例的实验顺序，对检测出的18种中的13种克隆的候选用于诊断动脉硬化的基因标记，通过ELISA方法对抗体效价进行测定，确认了动脉硬化患者的血清抗体的升高。其测定结构如表2所示。

表2

实施例2

通过蛋白质印迹法确认动脉硬化标记基因的表达

在通过上述表达克隆法鉴定的标记候选基因中，对于除去实施例1中使用的基因外的5种克隆，通过蛋白质印迹法确认了动脉硬化标记基因的在动脉硬化患者中的表达。其检测结果(基于蛋白质印迹法的阳性信号：图中的箭头)如图1所示。图1(a)表示克隆名为S16D2(SEQ ID NO：22)的结果；图1(b)表示克隆名为S27D3(SEQ IDNO：24)的结果；图1(c)表示克隆名为S36E1(SEQ ID NO：26)的结果；图1(d)表示克隆名为S39D6(SEQ ID NO：28)的结果；图1(e)表示克隆名为TS27B2(SEQ ID NO：30)的结果。

如表2所示，由本实例筛选得到的13种候选用于诊断动脉硬化的基因标记，通过基于ELISA方法的测定可以看出患者血清的抗体效价与健康者血清的抗体效价之间存在差异，还可以看出其中的11种有显著差异。

并且，如图1所示，由本实施例筛选得到的5种候选用于诊断动脉硬化的基因标记，通过蛋白质印迹法确认了特异性反应阳性信号。

工业实用性

基于本发明的用于诊断动脉硬化的多肽标记、用于诊断动脉硬化的基因标记、抗体、用于检测动脉硬化标记基因的探针、用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片及动脉硬化的检测方法，以及用于检测动脉硬化的试剂盒，能够简便且高精确度地检测动脉硬化，因此能够很好地适应于动脉硬化的早期诊断等方面。

Claims (13)

1.一种用于诊断动脉硬化的多肽标记，其包括如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35所示的氨基酸序列所表示的多肽、或其部分氨基酸序列所表示的多肽。

2.一种用于诊断动脉硬化的基因标记，其包括用编码权利要求1所述氨基酸序列或其部分氨基酸序列的碱基序列表示的基因。

3.一种用于检测动脉硬化的基因标记，其包括如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列所表示的基因、或其部分碱基序列所表示的基因。

4.一种以权利要求1所述的多肽为抗原、与该多肽特异性结合的抗体。

5.一种用于检测动脉硬化标记基因的探针，其具有在严格条件下全部或部分与权利要求2或3所述的基因杂交的DNA探针。

6.如权利要求5所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针，其特征在于，其具有全部或部分针对权利要求3所述的基因的反义DNA。

7.用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片，其是在基片上固定权利要求5所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针和/或权利要求6所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针。

8.使用权利要求4所述抗体，对与该抗体进行特异性结合的动脉硬化标记多肽在待测样品中的表达进行检测的动脉硬化检测方法。

9.使用权利要求1所述的用于诊断动脉硬化的多肽标记，对与该用于诊断动脉硬化的多肽标记进行特异性结合的抗体在待测血液中的表达进行检测的动脉硬化检测方法。

10.使用如权利要求5或6所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针，对与该用于检测动脉硬化标记基因的探针杂交的基因在待测细胞中的表达进行检测的动脉硬化检测方法。

11.基于SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36所示的碱基序列构建引物，使用该引物进行PCR反应，对动脉硬化标记基因的表达进行检测的动脉硬化检测方法。

12.一种用于诊断动脉硬化的试剂盒，其包括选自权利要求5或6所述的用于检测动脉硬化标记基因的探针、权利要求7所述的用于检测动脉硬化标记基因的DNA微阵列或DNA芯片及权利要求4所述的抗体中的至少一种以上。

13.一种用于诊断动脉硬化的试剂盒，其具有用于诊断动脉硬化的多肽标记，所述多肽标记包括如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35所示的氨基酸序列所表示的多肽、或其部分氨基酸序列表示的多肽。

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