JP2001249128A - 動脈硬化症またはアルツハイマー病の診断用キット - Google Patents
動脈硬化症またはアルツハイマー病の診断用キットInfo
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- JP2001249128A JP2001249128A JP2000060737A JP2000060737A JP2001249128A JP 2001249128 A JP2001249128 A JP 2001249128A JP 2000060737 A JP2000060737 A JP 2000060737A JP 2000060737 A JP2000060737 A JP 2000060737A JP 2001249128 A JP2001249128 A JP 2001249128A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 動脈硬化症、アルツハイマー症の発症・進展
に共通して深く関わる物質を明らかにし、これら疾患の
新規な診断法を提供する。 【解決手段】 血液中のLp(a)とα2-マクログロブリン/
インターロイキン6との複合体を測定対象にし、抗ヒト
α2-マクログロブリン抗体および、抗ヒトＬや（ａ）抗
体を用いて免疫学的方法により測定することからなる動
脈硬化症またはアルツハイマー病を診断する方法およ
び、その診断用キット。
に共通して深く関わる物質を明らかにし、これら疾患の
新規な診断法を提供する。 【解決手段】 血液中のLp(a)とα2-マクログロブリン/
インターロイキン6との複合体を測定対象にし、抗ヒト
α2-マクログロブリン抗体および、抗ヒトＬや（ａ）抗
体を用いて免疫学的方法により測定することからなる動
脈硬化症またはアルツハイマー病を診断する方法およ
び、その診断用キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血液中のLp(a)とα2-
マクログロブリン(α2M)/インターロイキン6(IL6)との
複合体を測定することにより、動脈硬化症およびアルツ
ハイマー病を診断するキットに関するものである。
マクログロブリン(α2M)/インターロイキン6(IL6)との
複合体を測定することにより、動脈硬化症およびアルツ
ハイマー病を診断するキットに関するものである。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】Lp(a)は1963年にBerg
（Berg K. Acta Pathol Microbiol Scand, 59: 369-38
2, 1963）によって発見されたリポ蛋白で、動脈硬化発
症・進展の危険因子とされてきた。即ち、動脈硬化性疾
患の範疇である虚血性心疾患、脳血管障害、末梢動脈硬
化症、家族性高コレステロール血症などで高値を示す。
また、Lp(a)は急性相反応物質の一つであって、炎症な
どの急性相反応によって血中濃度が増加することはよく
知られている。しかし、プロスペクティブな疫学調査で
は、多くの報告があるが、その半数は疾患群と健常群と
の間で有意差を認めないなど、動脈硬化症＝高Lp(a)血
症とは考えられず、なんらかの機序によってLp(a)濃度
が上昇することが虚血性心疾患などの発症を規制してい
ることが推測されている状況にある（野間昭夫. 動脈硬
化, 24: 369-374, 1996）。
（Berg K. Acta Pathol Microbiol Scand, 59: 369-38
2, 1963）によって発見されたリポ蛋白で、動脈硬化発
症・進展の危険因子とされてきた。即ち、動脈硬化性疾
患の範疇である虚血性心疾患、脳血管障害、末梢動脈硬
化症、家族性高コレステロール血症などで高値を示す。
また、Lp(a)は急性相反応物質の一つであって、炎症な
どの急性相反応によって血中濃度が増加することはよく
知られている。しかし、プロスペクティブな疫学調査で
は、多くの報告があるが、その半数は疾患群と健常群と
の間で有意差を認めないなど、動脈硬化症＝高Lp(a)血
症とは考えられず、なんらかの機序によってLp(a)濃度
が上昇することが虚血性心疾患などの発症を規制してい
ることが推測されている状況にある（野間昭夫. 動脈硬
化, 24: 369-374, 1996）。
【０００３】一方、α2M/LDL受容体関連蛋白（α2M/LR
P）は、中枢神経系では神経細胞と一部のグリア細胞に
発現していることが知られている。α2M/LRPの主要なリ
ガンドであるアポリポ蛋白E、α2M、その他のプロテア
ーゼインヒビターとプロテアーゼの複合体などは、いず
れも中枢神経系で生成され、とくにアルツハイマー病脳
ではその生成が亢進していることが知られている（秋山
治彦, 他. 蛋白質 核酸酵素, 41: 1470-1475, 199
6）。また、アルツハイマー病患者脳では老人斑へのα2
Mの沈着が報告されている（Bauer, J. ET al. FHBS Let
t, 285: 111-114, 1991）。
P）は、中枢神経系では神経細胞と一部のグリア細胞に
発現していることが知られている。α2M/LRPの主要なリ
ガンドであるアポリポ蛋白E、α2M、その他のプロテア
ーゼインヒビターとプロテアーゼの複合体などは、いず
れも中枢神経系で生成され、とくにアルツハイマー病脳
ではその生成が亢進していることが知られている（秋山
治彦, 他. 蛋白質 核酸酵素, 41: 1470-1475, 199
6）。また、アルツハイマー病患者脳では老人斑へのα2
Mの沈着が報告されている（Bauer, J. ET al. FHBS Let
t, 285: 111-114, 1991）。
【０００４】最近の疫学調査ではアルツハイマー病の発
症の背景には動脈硬化症があることが指摘されており
（Kalaria, RN. Pharmacol ＆Ther. 72: 193, 1996）、
リポ蛋白の酸化変性やアポ蛋白Eの表現型と動脈硬化症
やアルツハイマー病の発症との関連が注目されている
（Prem Kumar, DRD. et al. Am J Pathol. 148: 2083,
1996）。現時点で考えうる可能性としては、活性酸素に
よりVLDLが酸化修飾されてヘパリン結合能を失い、難溶
性の沈澱を形成することによって脂質過酸化物が血管や
神経組織に蓄積し、細胞を傷害することが予想されてい
る（中村和行, 他. Jpn J Electroph. 42: 27, 199
8）。最近の一般的な考え方として、動脈硬化症の発症
・進展に関わる原因物質として酸化LDLがクローズアッ
プされているが、動脈硬化症とアルツハイマー病の発症
・進展に共通する関与物質はいまだに不明である。した
がって、本研究は、動脈硬化症、アルツハイマー症の発
症・進展に共通して深く関わる物質を明らかにし、これ
ら疾患の新規な診断法を提供することを課題とする。
症の背景には動脈硬化症があることが指摘されており
（Kalaria, RN. Pharmacol ＆Ther. 72: 193, 1996）、
リポ蛋白の酸化変性やアポ蛋白Eの表現型と動脈硬化症
やアルツハイマー病の発症との関連が注目されている
（Prem Kumar, DRD. et al. Am J Pathol. 148: 2083,
1996）。現時点で考えうる可能性としては、活性酸素に
よりVLDLが酸化修飾されてヘパリン結合能を失い、難溶
性の沈澱を形成することによって脂質過酸化物が血管や
神経組織に蓄積し、細胞を傷害することが予想されてい
る（中村和行, 他. Jpn J Electroph. 42: 27, 199
8）。最近の一般的な考え方として、動脈硬化症の発症
・進展に関わる原因物質として酸化LDLがクローズアッ
プされているが、動脈硬化症とアルツハイマー病の発症
・進展に共通する関与物質はいまだに不明である。した
がって、本研究は、動脈硬化症、アルツハイマー症の発
症・進展に共通して深く関わる物質を明らかにし、これ
ら疾患の新規な診断法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は上述の動脈硬化
症およびアルツハイマー病の診断システムの新規開発が
急務であるという要望に応える目的でなされたものであ
り、更に詳細には、上述の技術背景に鑑み鋭意研究を進
めた結果、本発明は血液中にLp(a)/（α2M-IL6）複合体
が存在する事実を発見することによりなされたものであ
る。
症およびアルツハイマー病の診断システムの新規開発が
急務であるという要望に応える目的でなされたものであ
り、更に詳細には、上述の技術背景に鑑み鋭意研究を進
めた結果、本発明は血液中にLp(a)/（α2M-IL6）複合体
が存在する事実を発見することによりなされたものであ
る。
【０００６】以下、本発明を詳しく説明する。アポ(a)
遺伝子はプラスミノーゲン遺伝子、プラスミノーゲン関
連遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子などとともにプラスミ
ノーゲン・アポ(a)遺伝子ファミリーに属しており、第6
染色体長腕のバンド26-27に隣接して存在することが知
られている。また、5´領域において Wade（Wade DP, e
t al. Proc Natl Acd Sci USA, 90: 1369, 1993）ら
は、この領域中の数カ所にIL6に反応する部位が存在す
ることを確認している。
遺伝子はプラスミノーゲン遺伝子、プラスミノーゲン関
連遺伝子、肝細胞増殖因子遺伝子などとともにプラスミ
ノーゲン・アポ(a)遺伝子ファミリーに属しており、第6
染色体長腕のバンド26-27に隣接して存在することが知
られている。また、5´領域において Wade（Wade DP, e
t al. Proc Natl Acd Sci USA, 90: 1369, 1993）ら
は、この領域中の数カ所にIL6に反応する部位が存在す
ることを確認している。
【０００７】一方、IL6は血液中のα2Mと安定した複合
体を形成して存在することが知られており、これらの諸
事実から本発明は、血液中においてLp(a)/(α2M/IL6）
複合体の存在を予測し、研究を重ねた結果、Lp(a)/(α2
M/IL6）複合体の存在を発見した。このLp(a)/(α2M/IL
6）複合体は、Lp(a)（易酸化性で動脈硬化症惹起性リポ
蛋白）、α2M（この複合体中のα2MはLDL受容体関連蛋
白受容体：LRPのリガンドとなり得る）、IL6（炎症に関
与する蛋白）で構成されていることから、上述の動脈硬
化症発症・進展およびアルツハイマー病発症に関与する
共通因子であるといえる。
体を形成して存在することが知られており、これらの諸
事実から本発明は、血液中においてLp(a)/(α2M/IL6）
複合体の存在を予測し、研究を重ねた結果、Lp(a)/(α2
M/IL6）複合体の存在を発見した。このLp(a)/(α2M/IL
6）複合体は、Lp(a)（易酸化性で動脈硬化症惹起性リポ
蛋白）、α2M（この複合体中のα2MはLDL受容体関連蛋
白受容体：LRPのリガンドとなり得る）、IL6（炎症に関
与する蛋白）で構成されていることから、上述の動脈硬
化症発症・進展およびアルツハイマー病発症に関与する
共通因子であるといえる。
【０００８】なお典型的には、本発明は、抗ヒトα2マ
クログロブリン抗体を固相抗体として用い、Lp(a)/(α2
M/IL6）と反応させた後に、酵素をはじめとする標識物
質をラベルした抗ヒトLp(a)抗体、もしくは抗ヒトアポB
抗体を反応させて、血液中のLp(a)/(α2M/IL6）複合体
を検出する方法である。この場合、血液中のリポ蛋白を
超遠心法や化学物質を用いた沈澱法で分画したものを試
料とすることが可能である。また、この検出の臨床応用
としては、動脈硬化症やアルツハイマー病の早期診断に
好適である。
クログロブリン抗体を固相抗体として用い、Lp(a)/(α2
M/IL6）と反応させた後に、酵素をはじめとする標識物
質をラベルした抗ヒトLp(a)抗体、もしくは抗ヒトアポB
抗体を反応させて、血液中のLp(a)/(α2M/IL6）複合体
を検出する方法である。この場合、血液中のリポ蛋白を
超遠心法や化学物質を用いた沈澱法で分画したものを試
料とすることが可能である。また、この検出の臨床応用
としては、動脈硬化症やアルツハイマー病の早期診断に
好適である。
【０００９】
【実施例】以下、本発明について具体的に説明する。 ［ELISAによる血液中のLp(a)/(α2M/IL6）複合体の検出
法］ A. 試料の調製 1. デキストラン硫酸液（0.05M CaCl2）1.5mlに、血清5
0μlを添加し、混和後室温に30分間放置する。 2. 3000rpmで15分間遠心し、上清をデカントで捨てる。 3. 250μlの2.5% NaCl液で沈澱を溶解する。この溶解液
をELISAのサンプルとする。
法］ A. 試料の調製 1. デキストラン硫酸液（0.05M CaCl2）1.5mlに、血清5
0μlを添加し、混和後室温に30分間放置する。 2. 3000rpmで15分間遠心し、上清をデカントで捨てる。 3. 250μlの2.5% NaCl液で沈澱を溶解する。この溶解液
をELISAのサンプルとする。
【００１０】B. ELISAの操作手順 1. 抗ヒトα2マクログロブリンポリクローナル抗体を0.
05M Tris-HCl, 0.15M NaCl pH8.0緩衝液に5μg/mlで溶
解し、マイクロプレートに100μl/wellで分注する。 2. 4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1%
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05% アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μl/w
ellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4℃
で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水250
μl/wellで3回洗浄する。 3. マイクロプレートに55mg/ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin 含有1% BSA溶液を100μl/we
ll分注し、これに試料あるいは標準液を50μl添加す
る。 4. 室温下 1.5時間反応させる。 5. 0.005% Tween 20溶液250μl/wellで5回洗浄する。
05M Tris-HCl, 0.15M NaCl pH8.0緩衝液に5μg/mlで溶
解し、マイクロプレートに100μl/wellで分注する。 2. 4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1%
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05% アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μl/w
ellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4℃
で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水250
μl/wellで3回洗浄する。 3. マイクロプレートに55mg/ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin 含有1% BSA溶液を100μl/we
ll分注し、これに試料あるいは標準液を50μl添加す
る。 4. 室温下 1.5時間反応させる。 5. 0.005% Tween 20溶液250μl/wellで5回洗浄する。
【００１１】6. ビオチン標識Fab´化抗ヒトLp(a)ポリ
クローナル抗体を1% BSA溶液で1.6μg/mlとし、100μl/
well分注する。 7. 室温下 1.5時間反応させる。 8. 5. と同様、0.005% Tween20溶液250μl/wellで5回洗
浄する。 9. HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1%
カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μl/well分注す
る。 10. 室温下 30分間反応させる。 11. 5. と同様、0.005% Tween20溶液250μl/wellで5回
洗浄する。 12. 発色試薬を100μl/well分注し、室温下 30分間反応
させる。 13. 1Mリン酸水溶液を100μl/well分注し、反応を停止
する。 14. 主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15. 人工的に調整したLp(a)/α2マクログロブリン複合
体により求めた検量線から試料中の複合体濃度を算出す
る。
クローナル抗体を1% BSA溶液で1.6μg/mlとし、100μl/
well分注する。 7. 室温下 1.5時間反応させる。 8. 5. と同様、0.005% Tween20溶液250μl/wellで5回洗
浄する。 9. HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1%
カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μl/well分注す
る。 10. 室温下 30分間反応させる。 11. 5. と同様、0.005% Tween20溶液250μl/wellで5回
洗浄する。 12. 発色試薬を100μl/well分注し、室温下 30分間反応
させる。 13. 1Mリン酸水溶液を100μl/well分注し、反応を停止
する。 14. 主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15. 人工的に調整したLp(a)/α2マクログロブリン複合
体により求めた検量線から試料中の複合体濃度を算出す
る。
【００１２】［冠動脈疾患における血中Lp(a)/(α2M/IL
6）複合体濃度］冠動脈造影検査により、1segmentに50%
以上の有意狭窄病変を有するものを動脈硬化症と定め、
これに基づき冠動脈硬化症と診断された患者、CAD
（＋）群（n=30）、健常者群、CAD（−）群（n=30）を
対象に、血中Lp(a)/(α2M/IL6）複合体を測定し、比較
検討したところ、CAD（＋）群が有意な高値を示した
（図1）。
6）複合体濃度］冠動脈造影検査により、1segmentに50%
以上の有意狭窄病変を有するものを動脈硬化症と定め、
これに基づき冠動脈硬化症と診断された患者、CAD
（＋）群（n=30）、健常者群、CAD（−）群（n=30）を
対象に、血中Lp(a)/(α2M/IL6）複合体を測定し、比較
検討したところ、CAD（＋）群が有意な高値を示した
（図1）。
【図１】冠動脈硬化症における血中のLp(a)/(α2M/IL
6）濃度を図示したものである。
6）濃度を図示したものである。
Claims (5)
- 【請求項１】 Lp(a)とα2-マクログロブリン/インター
ロイキン6との複合体を測定対象にする動脈硬化症また
はアルツハイマー病を診断キット。 - 【請求項２】 Lp(a)中でアポ(a)遺伝子の5´領域中に
存在する数カ所のインターロイキン6反応部位に結合し
たα2-マクログロブリン/インターロイキン6複合体を測
定することによる請求項１に記載の診断用キット。 - 【請求項３】 酵素免疫法、イムノクロマト法、ラテッ
クス凝集法などの免疫学的方法により、血液中のLp(a)
とα2-マクログロブリン/インターロイキン6との複合体
を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の診
断用キット。 - 【請求項４】 デキストラン硫酸/Ca2＋沈澱法で得たVL
DL、LDL、Lp(a)画分を試料として、血液中のLp(a)とα2
-マクログロブリン/インターロイキン6との複合体を測
定することを特徴とする請求項１又は２又は３に記載の
診断用キット。 - 【請求項５】 抗ヒトα2-マクログロブリン抗体およ
び、抗ヒトLp(a)抗体を用いることを特徴とする請求項3
又は４に記載の診断用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000060737A JP2001249128A (ja) | 2000-03-06 | 2000-03-06 | 動脈硬化症またはアルツハイマー病の診断用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000060737A JP2001249128A (ja) | 2000-03-06 | 2000-03-06 | 動脈硬化症またはアルツハイマー病の診断用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001249128A true JP2001249128A (ja) | 2001-09-14 |
Family
ID=18580995
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000060737A Withdrawn JP2001249128A (ja) | 2000-03-06 | 2000-03-06 | 動脈硬化症またはアルツハイマー病の診断用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001249128A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010018870A1 (ja) | 2008-08-15 | 2010-02-18 | 藤倉化成株式会社 | 動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー、及び該マーカー等を用いる動脈硬化の検出方法、並びに動脈硬化診断用キット |
| JP2011209291A (ja) * | 2004-09-29 | 2011-10-20 | Proteome Sciences Plc | アルツハイマー病に関する方法及び組成物 |
-
2000
- 2000-03-06 JP JP2000060737A patent/JP2001249128A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011209291A (ja) * | 2004-09-29 | 2011-10-20 | Proteome Sciences Plc | アルツハイマー病に関する方法及び組成物 |
| WO2010018870A1 (ja) | 2008-08-15 | 2010-02-18 | 藤倉化成株式会社 | 動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー、及び該マーカー等を用いる動脈硬化の検出方法、並びに動脈硬化診断用キット |
| EP3021121A1 (en) | 2008-08-15 | 2016-05-18 | Fujikura Kasei Co., Ltd. | Polypeptide marker for diagnosis of arteriosclerosis, method for detection of arteriosclerosis by using the maker or the like, and kit for diagnosis of arteriosclerosis |
| US9366681B2 (en) | 2008-08-15 | 2016-06-14 | Fujikura Kasei Co., Ltd. | Polypeptide marker for diagnosis of arteriosclerosis, method for detection of arteriosclerosis by using the maker or the like, and kit for diagnosis of arteriosclerosis |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20070605 |