ES2312455T3 - Peptidos y su utilizacion en ensayos para enfermedades cardiovasculares. - Google Patents
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Abstract
Péptido que está constituido por de 20 a 40 aminoácidos y que comprende la SEC ID nº 2.
Description
Péptidos y su utilización en ensayos para
enfermedades cardiovasculares.
La presente invención se refiere a la
preparación de péptidos para su utilización en ensayos para evaluar
el riesgo de cardiopatías coronarias y otras enfermedades
cardiovasculares.
La cardiopatía coronaria (CHD) es la causa de
muerte principal en los países europeos. En la mayor parte de los
casos, la causa básica de CHD es la aterosclerosis. Actualmente, el
riesgo de aterosclerosis se evalúa midiendo la cantidad de
colesterol total, lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína
de alta densidad (HDL). Sin embargo, estas pruebas no predicen la
enfermedad en aproximadamente un tercio de los pacientes; véase
Yla-Herttuala, Current Opinion Lipidol. (1998) 9:
337-344. Por tanto existe una necesidad de
desarrollar un mejor ensayo para predecir el riesgo de CHD.
La lipoproteína de baja densidad oxidada (oxLDL)
ha demostrado ser un factor de riesgo en la aterosclerosis, pero no
ha sido posible medir la oxLDL directamente en plasma debido a que
su semivida en circulación es corta. Por tanto, los estudios
recientes se han centrado en diferentes mediciones indirectas para
definir el grado de la oxidación de LDL.
La xLDL desempeña un importante papel en la
aterogénesis. Se ha detectado en lesiones ateroscleróticas, que es
citotóxica para diversos tipos de células y quimiotáctica para los
monocitos de la sangre. Además, la oxLDL es inmunogénica, y las
lesiones ateroscleróticas contienen inmunoglobulinas que reconocen a
oxLDL; los autoanticuerpos contra oxLDL están presentes en sueros
de conejo y humano. El mejor modo para analizar oxLDL parece ser la
medición de autoanticuerpos contra oxLDL, tal como sugiere
Yla-Herttuala, supra.
La apolipoproteína B-100
(apoB-100) es el constituyente proteico principal en
LDL. Las secuencias de aminoácidos y el ADNc humano se notifican
por Chen et al., J. Biol. Chem. (1986) 261:
12912-12921.
Durante la oxidación de LDL, puede modificarse
tanto la parte lipídica como la proteica de la partícula. El
malondialdehído (MDA) y el 4-hidroxinonenal
(4-HNE) son los principales aldehídos reactivos
formados durante la oxidación de LDL, tal como se da a conocer por
Esterbauer et al., Free Radical Biol. Med. (1992)
13:341-390 o por Viita et al., Life Sciences
(1999) 65: 783-793, cada uno puede reaccionar
adicionalmente con residuos de lisina de apoB-100.
Estos epítopos específicos de oxidación poco caracterizados se
reconocen por los autoanticuerpos. Más recientemente, se ha
sugerido por Palinski et al., J. Clin. Invest. (1996) 98:
800-814, que los fosfolípidos oxidados son epítopos
para los autoanticuerpos. Además, se ha informado de que individuos
sanos producen anticuerpos frente a lisofosfatidilcolina, que es un
componente principal de oxLDL.
Los autoanticuerpos anti-oxLDL
pueden predecir la evolución de aterosclerosis carotídea,
aterosclerosis coronaria e infarto de miocardio. Se han descubierto
también niveles elevados de autoanticuerpos en lupus eritematoso
sistémico (SLE), preeclampsia, periaortitis crónica, diabetes
mellitus no insulinodependiente y en disfunción endotelial.
Mironova et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular
Biology (1996) 16: 222-229, notifica de un EIA
competitivo en el que se pone en contacto el suero que contiene
anticuerpos frente a Ox-LDL con
Ox-LDL inmovilizada.
Los autoanticuerpos contra oxLDL se han medido
utilizando inmunoensayos muy diferentes (EIA o RIA), y no se
dispone para la normalización de los ensayos de ningún material de
referencia o procedimiento patrón. Se ha purificado LDL utilizada
en pruebas anteriores a partir de plasma humano y se oxida
normalmente mediante incubación con iones de cobre o mediante
conjugación con MDA. La LDL oxidada con cobre contiene una mezcla de
epítopos específicos de oxidación y por tanto el proceso de
oxidación debe normalizarse cuidadosamente para producir antígeno
homogéneo. Los antígenos a base de LDL plasmática humana son también
intrínsecamente inestables y no son adecuados para la producción de
kits de pruebas comerciales. Por tanto, existe una necesidad de
producir un ensayo para detectar la CHD que pueda normalizarse y
que utilice de reactivos que sean estables y proporcionen
resultados reproducibles.
La presente invención se basa en la
consideración de que los péptidos constituidos por de 20 a 40
aminoácidos y que comprenden la SEC ID nº: 2 son estables y pueden
utilizarse como antígenos en un inmunoensayo para detectar la CHD,
y presentan afinidad por la lipoproteína de baja densidad
oxidada.
Según un aspecto de la invención, se utiliza un
péptido de la invención en un inmunoensayo para determinar la
presencia y, opcionalmente, la cantidad de anticuerpos, en una
muestra, que presentan afinidad por la lipoproteína de baja
densidad oxidada.
Según un segundo aspecto, un procedimiento para
medir la cantidad de autoanticuerpos frente a lipoproteína de baja
densidad oxidada en una muestra, comprende:
- (i)
- poner en contacto la muestra con péptidos inmovilizados tal como se definió anteriormente, en condiciones que permiten a los anticuerpos unirse a los péptidos; y
- (ii)
- determinar la cantidad de unión.
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La cantidad de unión puede medirse directamente
y se correlacionará con la cantidad de LDL oxidada en una muestra.
La cantidad de anticuerpos puede expresarse como la proporción de la
unión de anticuerpos entre LDL oxidada y LDL nativa.
La utilización de los péptidos de la presente
invención garantiza que el inmunoensayo utiliza un antígeno estable
que proporciona resultados reproducibles.
Según un tercer aspecto, un kit para medir
autoanticuerpos frente a LDL oxidada, comprende una unidad de
múltiples recipientes que presenta:
- (i)
- una composición que comprende péptidos tal como se definió anteriormente; y
- (ii)
- reactivos necesarios para llevar a cabo un ensayo de inmunoabsorción.
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La presente invención proporciona reactivos que
pueden sintetizarse fácilmente sin la necesidad de aislar proteínas
a partir de la sangre de un paciente. Los péptidos no presentan la
semivida corta asociada a las proteínas utilizadas en ensayos
convencionales para detectar la CHD y por tanto pueden fabricarse
comercialmente para su utilización en kits de diagnóstico.
La presente invención se basa en la producción
de péptidos que se obtienen preferentemente de la proteína
apoB-100, o que presentan preferentemente una
secuencia de aminoácidos que forma una estructura similar a la de
los epítopos sobre la proteína apoB-100. Por tanto,
los péptidos pueden experimentar interacción específica con
autoanticuerpos que presentan afinidad por LDL oxidada. La expresión
"interacción específica" se refiere al reconocimiento de los
autoanticuerpos por el péptido (antígeno). Los péptidos pueden
provocar la unión de anticuerpos con una constante de afinidad
superior a 10^{5} l/mol, preferentemente superior a 10^{7}
l/mol y de manera más preferida superior a
10^{8} l/mol.
10^{8} l/mol.
En principio, puede utilizarse cualquier
secuencia peptídica aproximadamente superior a 20 aminoácidos en la
presente invención siempre que actúe como un ligando para los
autoanticuerpos. El péptido puede derivarse de una fuente natural
de apoB-100 o puede ser un péptido sintético basado
en la secuencia proteica conocida para apoB-100.
Los procedimientos para aislar péptidos a partir de
apoB-100 o para sintetizar péptidos, resultarán
evidentes para el experto en la materia.
El tamaño de los péptidos es suficiente para el
reconocimiento por los autoanticuerpos. Los péptidos de la presente
invención son de 20-40 aminoácidos de tamaño,
preferentemente de 20-30 aminoácidos y comprenden la
SEC ID nº: 2.
Los péptidos de la presente invención pueden
utilizarse en un ensayo de diagnóstico junto con otros reactivos
que pueden provocar una reacción de anticuerpos. Por ejemplo, la
fosfatidiletanolamina puede derivatizarse con MDA y, cuando se
utiliza con los péptidos de la invención, puede actuar como un
epítopo para algunos autoanticuerpos.
El nuevo ensayo EIA basado en péptidos podría
utilizarse como un kit de prueba para la evaluación y seguimiento
de pacientes con enfermedades cardiovasculares y varios otros
trastornos, tales como periaortitis, preeclampsia, diabetes no
insulinodependiente y disfunción endotelial.
Cuando se utiliza en el inmunoensayo, resulta
preferido que los péptidos estén inmovilizados sobre un soporte
sólido, ya que esto permite llevar a cabo fácilmente las etapas de
lavado posteriores. Los procedimientos para llevar a cabo los
inmunoensayos resultarán evidentes para el experto en la
materia.
Los ejemplos siguientes ilustran la
invención.
Ejemplo
1
Se sometieron a prueba diversos péptidos nativos
y modificados, derivados de la secuencia de aminoácidos de
apoB-100 (Chen et al., supra;
documento WO 97/43311), como antígenos adecuados para su utilización
en EIA. Se modificaron los péptidos con MDA para producir epítopos
específicos de oxidación similares como en oxLDL. Se comparan los
resultados de EIA de péptidos con los resultados de EIA de oxLDL que
se optimizó utilizando LDL oxidada con cobre como antígeno; véase
Närvänen et al., Free Radical Biology & Medicine (2001)
31: 769-777.
Se sintetizaron los péptidos utilizando la
tecnología de síntesis de péptidos en fase sólida y la química Fmoc
y se purificaron con HPLC utilizando una columna C_{18}. Se
identificaron los pesos moleculares de los péptidos sintetizados
utilizando un espectrómetro de masas MALDI-TOF. Las
secuencias peptídicas o bien derivadas de o bien no relacionadas
con la secuencia de aminoácidos de apoB-100 se
proporcionan en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se acopló MDA al péptido mediante las aminas
primarias de lisinas utilizando una modificación del procedimiento
de Palinski et al., Arteriosclerosis (1990) 10:
325-335. Se preparó MDA de manera reciente a partir
de malondialdehído-bis(dimetilacetal)
mediante hidrólisis ácida. Entonces se acoplaron 10 moles de MDA a 1
mol de péptido agitando la mezcla durante 3 horas a 37ºC. Se
verificó la eficacia del acoplamiento mediante la reacción de
ninhidrina que revela la presencia de aminas primarias.
Se recogieron muestras de suero y plasma para
las pruebas EIA de péptidos a partir de estudios en curso que
incluyen muestras de pacientes que se sospecha que padecen
cardiopatía coronaria y de controles sanos. Se almacenaron estas
muestras en alícuotas a -20ºC.
Se sometieron a prueba péptidos nativos y
modificados con MDA siempre en la misma placa. Se recubrió la mitad
de la placa con el péptido nativo (20 \mug/ml) y se recubrió la
otra mitad con el péptido modificado con MDA [(20 \mug/ml) 100
\mul/pocillo en 100 mmoles/l de tampón bicarbonato (pH 9,5)]. Se
incubaron las placas recubiertas durante la noche a temperatura
ambiente (TA) y entonces se lavaron con un lavador automático
(Wellwash 4 MK II, Labsystems Oy) tres veces con solución salina
tamponada con fosfato (PBS) que contenía el 0,05% de Tween 20. Se
bloquearon las placas con PBS que contenía el 1% de albúmina de
suero humana (HSA) (150 \mul/pocillo) durante 1 h a TA y se
lavaron tal como anteriormente. Se diluyeron las muestras de suero
1:20 en PBS que contenía el 0,2% de HSA y el 0,05% de Tween 20 y se
pipetearon 100 \mul/pocillo. Se incubaron las placas durante 2 h
a TA y se lavaron tal como anteriormente. Se añadió anticuerpo
anti-IgG humana conjugado con HRP (diluido 1:20000
en el tampón de muestra) (100 \mul) a cada pocillo y se incubaron
durante 1 h a TA. Tras el lavado, se desarrolló color añadiendo el
sustrato peroxidasa (tetrametilbencidina (TMB) como cromógeno, 100
\mul/pocillo) e incubando las placas durante 30 min. a
temperatura ambiente en la oscuridad. Se detuvo la reacción con 0,5
mol/l de H_{2}SO_{4} (100 \mul/pocillo) y se midieron las
absorbancias a 450 nm (lector de microplacas Multiskan, Labsystems
Oy). Los resultados se muestran en la tabla 2 y se expresan como la
medición de absorbancia obtenida para los péptidos nativos y los
modificados o como la proporción entre la unión de anticuerpos con
respecto a los péptidos nativos y los modificados tras sustraer el
control en blanco.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- A. Controles sanos (n=17).
- B. Pacientes (n=19).
Basándose en los valores de las proporciones, la
cantidad de autoanticuerpos era superior en las muestras de
pacientes que en los controles cuando se sometieron a prueba con el
EIA de péptidos y el EIA de oxLDL a base de LDL humana. Las
reacciones de autoanticuerpos que utilizan los antígenos (péptidos)
modificados y nativos son similares en el EIA de oxLDL y el EIA de
péptidos debido a que los antígenos modificados (oxLDL y MDAp63) se
reconocen mejor que los antígenos nativos (natLDL y natp63), es
decir, existe mayor especificidad por los antígenos modificados.
Los resultados para el EIA de péptidos son significativamente
mejores que para el EIA de oxLDL.
Para encontrar si los autoanticuerpos reaccionan
con el péptido, con MDA o ambos cuando se utilizan complejos de
péptido-MDA como antígeno, se recubrió una placa de
microtitulación con antígeno natp63, MDA y MDAp63 y se realizaron
los inmunoensayos. Se preparó el antígeno MDA como antígeno MDAp63
pero sin el péptido y se diluyó MDA para el recubrimiento del mismo
modo que MDAp63. La reacción de autoanticuerpos era superior con
MDAp63 que con natp63 y MDA, tanto en muestras control (0,533 \pm
0,077, 0,282 \pm 0,100 y 0,300 \pm 0,019, respectivamente,
media \pm DE n=23) y de pacientes (0,431 \pm 0,040, 0,222 \pm
0,041 y 0,338 \pm 0,000, respectivamente, n=16), lo que indica
que tanto el péptido como MDA son necesarios para el reconocimiento
óptimo.
Se calcularon los coeficientes de correlación de
Spearman entre los anticuerpos frente a natp63, MDA y MDAp63. Los
anticuerpos anti-MDA y anti-MDAp63
se correlacionaron en las muestras control y de pacientes (r=0,581
p=0,004 y r=0,582 p=0,018, respectivamente), pero los anticuerpos
anti-natp63 y anti-MDA no se
correlacionaron (r=0,297 p=0,169 y r=0,112 p=0,68,
respectivamente). Esto demuestra que diferentes anticuerpos
reaccionan con MDA y natp63 y es evidente que el complejo de
péptido-MDA es el antígeno óptimo.
Ejemplo
2
Se sometieron a prueba seis formas diferentes de
péptido p63, para encontrar cuál es la mejor modificación del
péptido para el EIA:
p63 lineal (p63)
p63 modificado con MDA
(p63-MDA)*.
p63 modificado con MDA y fosfatidiletanolamina
(p63-PEA-MDA)*
una forma lineal de p63, que contiene dos
aminoácidos extra (glicina y cisteína) en ambos extremos del péptido
(p244); véase la SEC ID nº 5
p244 cíclico (p244cyc)*
p63 cíclico modificado con MDA
(p244cyc-MDA)*
* estos péptidos modificados se proporcionan
únicamente a título comparativo.
Estos péptidos modificados se proporcionan
únicamente a título comparativo. La cantidad de autoanticuerpos fue
la más alta en muestras de pacientes cuando se utilizó el péptido
lineal p244 como antígeno (tabla 3). Los títulos de anticuerpos
frente al péptido cíclico 244cyc también fueron ligeramente
superiores a los títulos frente a p63-MDA. En este
estudio, los autoanticuerpos reaccionaron en la mayor parte con
péptidos sin lípidos.
Se sometió a prueba la especificidad de
diferentes antígenos mediante titulación de péptidos. La figura 1
muestra las curvas de titulación para 4 antígenos peptídicos
sometidos a prueba con una muestra de paciente. Además se sometió a
prueba la especificidad de anticuerpos frente a péptidos cíclicos y
lineales, p244cyc y p244, añadiendo cloruro de sodio 0,5 M al
diluyente de muestra. El título de las muestras de pacientes frente
a p244, p244cyc y p63-MDA era un 19%, 38% y un 47%
inferior (media de 20 muestras de pacientes), respectivamente,
cuando se añadió sal al diluyente de muestra. Parece que los
anticuerpos frente a p244 presentan la mejor especificidad.
Se sometió a prueba la especificidad del péptido
cíclico (p244cyc) y del correspondiente péptido lineal (p244) en
pruebas de inhibición añadiendo concentraciones crecientes de
péptidos al diluyente de muestra. Se inhibió el péptido P244cyc con
la mayor concentración de inhibidor (100 \mug/ml), siendo el
promedio el 61% de la unión de 8 muestras de pacientes (fig. 2A); 3
muestras se inhibieron en menos del 50%. Se inhibió P244 con la
mayor concentración de inhibidor (100 \mug/ml), siendo el promedio
el 70% de la unión de 24 muestras de pacientes (fig. 2B). 3
muestras se inhibieron menos del 50%. El péptido P244 pareció ser
más específico que el p244cyc. Finalmente, se confirmó que el
epítopo de p244 es similar a p63 mediante el recubrimiento de la
placa con p244 e inhibiendo la unión de muestras de pacientes con
p63. Se inhibió P63 con la mayor concentración de inhibidor (100
\mug/ml), siendo el promedio el 53% de la unión de 22 muestras de
pacientes (fig. 3). 9 muestras se inhibieron menos del 50%.
Como resumen de los resultados anteriores parece
que las muestras de pacientes se reconocen mejor por el péptido
p244. Por tanto, se modificó con MDA p244 modificado y se utilizaron
p244 y p244-MDA ambos como antígeno en el EIA. Los
títulos de las muestras de pacientes (media \pm DE) frente a p244
y p244-MDA fueron ligeramente superiores a los
títulos de muestras control (tabla 5).
Se analizaron 205 muestras de pacientes con
síntomas de CHD. Se sometieron a prueba los pacientes
angiográficamente y se clasificaron como enfermedad de 0, 1, 2 ó 3
vasos. Se utilizaron los péptidos p244 y p244-MDA
como antígeno en el EIA de péptidos, y se compararon los resultados
con el EIA de oxLDL a base de LDL humana.
Los títulos de autoanticuerpos frente a
p244-MDA fueron los más altos en los pacientes con
enfermedad de 3 vasos en comparación con la enfermedad de 0, 1 ó 2
vasos (ANOVA p=0,0268). Los títulos de autoanticuerpos contra oxLDL
a base de LDL humana (n=185) se correlacionaron con los títulos
frente a p244 (r=0,227 p=0,0019) y con los títulos frente a
p244-MDA (p=0,217 p=0,003). Se confirmó la
correlación cuando los títulos de autoanticuerpos frente a péptidos
p244 y p244-MDA se compararon con los títulos de
autoanticuerpos contra oxLDL a base de LDL humana clasificados para
cuatro grupos basándose en el título anti-oxLDL (1.
cuartil 0,072-0,22 (n=37), 2. cuartil
0,22-0,36 (n=44), 3. cuartil
0,36-0,63 (n=57) y 4. cuartil
0,63-2,757 (n=68)) (fig. 4). Además, se comparó la
cantidad de anticuerpos frente a p244 y p244-MDA con
los síntomas de angina de pecho clasificados según la clasificación
de cardiopatía de la New York Heart Association (NYHA)
(NYHA-1 n=5, NYHA-2 n=12,
NYHA-3 n=27 y NYHA-4 n=14). Se
descubrió que los títulos de anticuerpo aumentaron cuando los
síntomas de angina de pecho aumentaban (fig. 5). La suma total de
la estenosis coronaria en comparación con la clasificación de NYHA
(NYHA-1 n=14, NYHA-2 n=26,
NYHA-3 n=57 y NYHA-4 n=29) mostró
síntomas más graves con la evolución de la enfermedad coronaría
(fig. 6). Este resultado reveló que la suma total de la estenosis
coronaria examinada utilizando una angiografía coronaria está
correlacionada así como los anticuerpos con la gravedad de los
síntomas de la angina de pecho.
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Los valores son las absorbancias medias \pm DE
tras la sustracción del blanco.
Los valores son las absorbancias medias \pm DE
tras la sustracción del blanco.
<110> Ark Therapeutics Ltd.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS Y SU UTILIZACIÓN EN ENSAYOS
PARA ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> REP06363WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> aún sin conocer
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
18-07-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
oligopéptido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
oligopéptido
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
oligopéptido
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 35
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
oligopéptido
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial:
oligopéptido
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<400> 5
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Claims (6)
1. Péptido que está constituido por de 20 a 40
aminoácidos y que comprende la SEC ID nº 2.
2. Utilización de un péptido según la
reivindicación 1 en un inmunoensayo, para determinar la presencia y,
opcionalmente, la cantidad de autoanticuerpos en una muestra.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la
que el péptido interacciona con los autoanticuerpos con una afinidad
constante superior a 10^{5} l/mol.
4. Procedimiento para medir la cantidad de
autoanticuerpos para una lipoproteína de baja densidad oxidada en
una muestra, que comprende:
- (i)
- poner en contacto la muestra con un péptido inmovilizado según la reivindicación 1, en condiciones que permiten a los anticuerpos unirse a los péptidos; y
- (ii)
- determinar la cantidad de unión.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que la muestra es una muestra de suero o plasma de un
paciente.
6. Kit adecuado para medir autoanticuerpos
contra LDL oxidada, que comprende una unidad que incluye recipientes
que contienen respectivamente:
- (i)
- un péptido según la reivindicación 1; y
- (ii)
- los reactivos necesarios para llevar a cabo un ensayo de inmunoadsorbancia.
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