ES2299186T3 - Ensayos, anticuerpos y patrones para detectar lipoproteinas de baja densidad oxidadas y modificadas con mda. - Google Patents
Ensayos, anticuerpos y patrones para detectar lipoproteinas de baja densidad oxidadas y modificadas con mda. Download PDFInfo
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Abstract
Un ensayo inmunológico para detectar y/o cuantificar LDL humana modificada con MDA (malonildialdehído) y OxLDL humana (LDL oxidada) en una muestra obtenida a partir de fluidos o tejidos corporales de un ser humano, comprendiendo dicho ensayo: (a) poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo que tiene una afinidad de al menos aproximadamente 5 x 10 8 M- 1 hacia la LDL humana modificada con MDA y la OxLDL; y (b) a continuación visualizar y/o cuantificar una reacción de ligación entre el primer anticuerpo y la LDL modificada con MDA y la OxLDL presentes en la muestra; en donde la LDL modificada con MDA y la OxLDL hacia las cuales el primer anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 5 x 10 8 M- 1 , contienen al menos 60 restos de lisina sustituidos por resto de apo B-100.
Description
Ensayos, anticuerpos y patrones para detectar
lipoproteínas de baja densidad oxidadas y modificadas con MDA.
La presente invención se refiere a ensayos, a
anticuerpos (particularmente anticuerpos monoclonales) y a patrones
para detectar (es decir, determinar la presencia y/o cuantificar la
cantidad) lipoproteínas de baja densidad oxidadas (OxLDL) y
lipoproteínas de baja densidad modificadas con malonildialdehído
(LDL modificada con MDA) en muestras, obteniéndose las muestras
típicamente a partir de fluidos o de tejidos corporales.
Las lipoproteínas son complejos con múltiples
componentes a base de proteínas y lípidos. Cada tipo de lipoproteína
tiene un peso molecular, un tamaño, una composición química, una
densidad y un papel físico característicos. La proteína y el lípido
se mantienen juntos por fuerzas no covalentes.
Las lipoproteínas se pueden clasificar basándose
en su densidad, tal y como se determina por ultracentrifugación.
Por tanto, se pueden distinguir cuatro clases de lipoproteínas:
lipoproteínas de alta densidad (HDL), lipoproteínas de densidad
intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y
lipoproteínas de densidad muy baja (VLDL).
Los componentes proteicos purificados de una
partícula de lipoproteína se denominan apolipoproteínas (apo). Cada
tipo de lipoproteína tiene una composición de apolipoproteínas
característica. En las LDL, la proteína apolipoproteína
predominante es apo B-100. apo B-100
es uno de los polipéptidos de cadena sencilla conocido más largo y
consiste en 4536 aminoácidos. De estos aminoácidos, los residuos o
los restos de lisina (existen 356 residuos o restos de lisina
tales) se pueden sustituir o modificar con aldehídos (p. ej.,
malonildialdehído).
La oxidación de los lípidos en las LDL (tanto
in vitro, p. ej., mediante oxidación inducida con cobre,
como in vivo) produce la formación de aldehídos reactivos que
pueden interaccionar entonces con los residuos o los restos de
lisina de apo B-100. El resultado de esta
sustitución o modificación de la lisina, es que la OxLDL resultante
que también es LDL modificada con MDA, ya no es reconocida por el
receptor de LDL en la superficie de los fibroblastos, sino por los
receptores fagocitarios en la superficie de los macrófagos. Al
menos 60 de las 356 lisinas (o residuos o restos de lisina) de apo
B-100, tienen que estar sustituidos para que sean
reconocidas por los receptores fagocitarios (véase el documento
número 1 de los documentos enumerados cerca del final de esta
solicitud). La absorción de estas OxLDL por los macrófagos, da como
resultado la generación de células espumosas que se considera una
etapa inicial en la aterosclerosis.
Las células endoteliales sometidas a estrés
oxidativo (p. ej., en pacientes con infarto agudo de miocardio) y
las plaquetas sanguíneas activadas, también producen aldehídos que
interaccionan con los restos de lisina en apo
B-100, dando como resultado la generación de LDL
modificada con aldehído que también es reconocida por los
receptores de los fagocitos. Sin embargo, los lípidos en esta LDL
modificada con aldehído no están oxidados. La actividad enzimática
en los macrófagos (p. ej., mieloperoxidasa) produce la oxidación del
lípido y de los restos proteicos de LDL. Todas estas rutas dan como
resultado una modificación del tipo de aldehído del resto proteico
de LDL.
Experimentos in vitro y experimentos en
modelos animales han sugerido que la OxLDL y/o la LDL modificada
con aldehído pueden contribuir a la evolución de la aterosclerosis,
induciendo la disfunción endotelial, la generación de células
espumosas, la proliferación de células del músculo liso y la
activación de las plaquetas (para una revisión, véase el documento
número 2). Una correlación positiva entre los niveles de anticuerpos
autoinmunes que reaccionan de forma cruzada con la LDL modificada
con aldehído y la evolución de las lesiones ateroscleróticas de la
carótida en pacientes, sugería que la OxLDL y/o la LDL modificada
con aldehído pueden contribuir a la evolución de la aterosclerosis
humana (véase el documento 3).
Sin embargo, la posibilidad de que los
anticuerpos autoinmunes se dirigieran contra otras proteínas
modificadas con aldehído, p. ej., la albúmina, no se podía excluir.
Por tanto, la contribución de la OxLDL y la LDL modificada con
aldehído (siendo o no el resultado de la oxidación del resto
lipídico) a la aterosclerosis humana, se podrá establecer cuando
estén a disposición ensayos que no sean agresivos y que sean
específicos para estas sustancias (es decir, que tengan alta
afinidad hacia esas sustancias antes que sobre otras
sustancias).
Debido a que los mecanismos subyacentes en la
oxidación de LDL pueden ser diferentes en distintas poblaciones de
pacientes (p. ej., pacientes con diabetes, pacientes con
insuficiencia renal crónica, pacientes con trasplante de corazón) y
debido a que al menos algunos de los mecanismos pueden ser
independientes de la oxidación de los lípidos, dichas pruebas deben
ser específicas de OxLDL y de LDL modificada con aldehído (p. ej.,
LDL modificada con MDA) y por ello basarse preferentemente en la
detección de los cambios conformacionales que tienen lugar
específicamente en el resto apo B-100 de LDL,
después de la sustitución de los residuos de lisina con el tipo de
aldehído. Dicho con otras palabras, existe una necesidad de tales
pruebas que no sean agresivas (es decir, ensayos) que sean
altamente específicas para los analitos de interés (es decir, LDL
modificada con MDA y OxLDL). También existe una necesidad de
anticuerpos que sean específicos para los analitos de interés.
También existe una necesidad de un patrón estable (p. ej., para
emplear como calibrador y/o testigo) para los ensayos.
\newpage
El documento de Solicitud de patente europea
publicada 0484863 A1 se refiere a anticuerpos monoclonales dirigidos
contra "LDL humana modificada con MDA" y "LDL modificada con
MDA de tipo reducido", mencionadas de este modo en la solicitud.
Los gráficos muestran las reactividades de diversos anticuerpos
monoclonales hacia esas sustancias y hacia LDL humana, así como los
resultados de los ensayos con esas sustancias.
Holvoet y col.,
"Malondialdehyde-Modified Low Density Lipoproteins
In Patients with Atherosclerotic Disease", J. Clin.
Invest. 1995; 95:2611-2619, describen el
anticuerpo monoclonal mAb-1H11 que se obtuvo contra
la LDL modificada con MDA y que se empleó para detectar el material
que reaccionaba de forma cruzada en el tejido ateromatoso humano y
en el plasma.
Palinski y col., "Antisera And Monoclonal
Antibodies Specific For Epitopes Generated During Oxidative
Modification Of Low Density Lipoprotein",
Arteriosclerosis 1990; 10(3): 325-335;
observan que un número creciente de observaciones, sugiere que la
modificación oxidativa de LDL tiene lugar in vivo y tiene un
papel importante en la aterogénesis. El artículo describe
anticuerpos policlonales y monoclonales que se desarrollaron
empleando LDL modificada con MDA, LDL oxidada con cobre y
4-hidroxinonenal-LDL. Los autores
indican que estos anticuerpos deben ser útiles para estudiar el
papel de las lipoproteínas modificadas por oxidación, así como de
otras proteínas modificadas por oxidación en la aterogénesis.
Se ha concebido ahora una invención que
satisface las necesidades descritas anteriormente y que tiene otras
características y ventajas que son evidentes para los expertos en la
técnica. La presente invención proporciona ensayos basados en
anticuerpos que son capaces de medir específicamente (cuantificar)
la OxLDL y la LDL modificada con aldehído o la LDL modificada con
MDA, en muestras, p. ej., muestras obtenidas a partir de fluidos
corporales (como plasma o suero) o de tejidos. La presente
invención también proporciona anticuerpos monoclonales útiles en
esos ensayos y líneas celulares (hibridomas) que producen esos
anticuerpos. La presente invención también proporciona un patrón
con almacenamiento estable, que se puede utilizar como calibrador y
como testigo en los ensayos. La obtención de dicho patrón es
necesaria para tener ensayos fiables y reproducibles y, por tanto,
útiles.
En general, en un aspecto la presente invención
se refiere a un ensayo inmunológico para detectar y/o cuantificar
LDL modificada con MDA y OxLDL en una muestra, comprendiendo dicho
ensayo:
- a)
- poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo que tenga alta afinidad hacia la LDL modificada con MDA y la OxLDL; y
- b)
- a continuación visualizar y/o cuantificar una reacción de ligación entre el primer anticuerpo y la LDL modificada con MDA y la OxLDL presentes en la muestra;
en donde la LDL modificada con MDA
y la OxLDL hacia las cuales tiene el primer anticuerpo una alta
afinidad, contienen al menos 60 restos de lisina sustituidos por
resto de apo
B-100.
Este ensayo puede ser, por ejemplo, un ensayo
competitivo, un ensayo de tipo sándwich, un ensayo
inmunohistoquímico, etc. Los "ensayos competitivos" son bien
conocidos y en esta invención se puede emplear cualquier ensayo
competitivo, con la condición de que esté dentro de las
limitaciones de la invención y que se puedan alcanzar los beneficios
de la invención. Los "ensayos de tipo sándwich" son bien
conocidos y en esta invención se puede emplear cualquier ensayo de
tipo sándwich, con la condición de que esté dentro de las
limitaciones de la invención y que se puedan alcanzar los
beneficios de la invención. Los "ensayos inmunohistoquímicos"
son bien conocidos y cualquier ensayo inmunohistoquímico se puede
emplear en esta invención con la condición de que esté dentro de las
limitaciones de la invención y que se puedan alcanzar las ventajas
de la invención.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un ensayo inmunológico de tipo sándwich para detectar y/o
cuantificar LDL modificada con MDA en una muestra en cuyo ensayo, un
primer anticuerpo que tiene una alta afinidad hacia la LDL
modificada con MDA, se une a un sustrato, comprendiendo dicho
ensayo:
- a)
- poner en contacto la muestra con el sustrato que está unido al primer anticuerpo, bajo condiciones de ligación, de modo que al menos algunas de las LDL modificadas con MDA en la muestra, se unan al primer anticuerpo;
- b)
- a continuación, retirar la muestra no unida del sustrato;
- c)
- a continuación, poner en contacto el sustrato con un segundo anticuerpo que tiene una alta afinidad hacia la LDL modificada con MDA; y
- d)
- a continuación, visualizar y/o cuantificar la LDL modificada con MDA que estaba presente en la muestra;
en donde la LDL modificada con MDA
hacia la cual el primer y el segundo anticuerpo tienen alta
afinidad, contiene al menos 60 restos de lisina sustituidos por
resto de apo
B-100.
Tal y como se emplea en esta memoria (incluyendo
las reivindicaciones), "alta afinidad" significa una constante
de afinidad (constante de asociación) de al menos aproximadamente 5
x 10^{8} M^{-1}, deseablemente al menos aproximadamente 1 x
10^{9} M^{-1}, preferentemente al menos aproximadamente 1 x
10^{10} M^{-1}, y lo más preferible al menos aproximadamente 1
x 10^{11} M^{-1}. Tal y como se emplea en esta memoria
(incluyendo las reivindicaciones), "baja afinidad" significa
una constante de afinidad (constante de asociación) inferior a
aproximadamente 1 x 10^{7} M^{-1}, de forma deseable inferior a
aproximadamente 1 x 10^{6} M^{-1} y preferentemente inferior a
aproximadamente 1 x 10^{5} M^{-1}. Las constantes de afinidad se
determinan de acuerdo con el método adecuado, descrito por Holvoet
y col. (4).
Los anticuerpos que se pueden utilizar en esta
invención se unirán con la LDL modificada con MDA y/o la OxLDL
cuyos restos de apo B-100 contienen al menos 60, de
forma deseable al menos aproximadamente 90, más deseablemente al
menos aproximadamente 120, preferentemente al menos aproximadamente
180, más preferentemente al menos aproximadamente 210 y lo más
preferible al menos aproximadamente 240 residuos de lisina
sustituidos por resto de apo B-100. El intervalo de
la sustitución de lisinas será generalmente desde 60 hasta
aproximadamente 240 y preferentemente desde aproximadamente 120
hasta aproximadamente 240 restos de lisina sustituidos por resto de
apo B-100.
Cada nuevo anticuerpo monoclonal es altamente
específico de un epítopo conformacional que está presente cuando se
sustituyen al menos aproximadamente 60, preferentemente al menos
aproximadamente 120 residuos de lisina y en virtud de lo cual puede
distinguir varios marcadores o indicaciones relacionadas con la
aterosclerosis. Los anticuerpos que reconocen epítopos presentes
cuando se sustituyen o se modifican menos de aproximadamente 60
lisinas, son menos específicos pero continúan siendo útiles (p. ej.,
se pueden emplear como anticuerpo secundario en un ELISA de tipo
sándwich).
Los anticuerpos preferidos empleados en esta
memoria, son los anticuerpos monoclonales mAb-4E6,
mAb-1H11 y mAb-8A2. Sus constantes
de afinidad hacia LDL natural, LDL modificada con MDA y OxLDL son
las siguientes:
En aún otro aspecto, la presente invención se
refiere (a) al anticuerpo monoclonal mAb-4E6
producido por el hibridoma Hyb4E6, depositado ante la BCCM con el
número de entrada en el depósito LMBP 1660 CB, el 24 de abril de
1997 o una fecha anaHyb8A2, depositado ante la BCCM con el número de
entrada en el depósito LMBP 1661 CB el 24 de abril de 1997, o una
fecha cercana, (c) el hibridoma Hyb4E6, depositado ante la BCCM con
el número de entrada en el depósito LMBP 1660 CB, el 24 de abril de
1997 o una fecha cercana, (b) el hibridoma Hyb8A2, depositado ante
la BCCM con el número de entrada en el depósito LMBP 1661 CB, el 24
de abril de 1997, o una fecha cercana.
Los anticuerpos empleados en los ensayos de esta
invención son preferentemente esos dos (es decir,
mAb-4E6 y mAb-8A2) así como
mAb-1H11. La línea celular para el anticuerpo
mAb-1H11 es producida por el hibridoma Hyb1H11 que
se depositó ante la BCCM con el número de entrada en el depósito
LMBP 1659 CB, el 24 de abril de 1997, o una fecha cercana.
La BCCM es la "Belgian Coordinated Collections
of Microorganisms", autorizada por el Tratado de Budapest del 28
de Abril de 1977 sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito
de Microorganismos a Efectos de Procedimientos de Patentes. Su
dirección es c/o The University of Gent, K. Ledeganckstraat 35,
B-9000 Gent, Bélgica.
El ensayo puede ser de un tipo que sea bien
conocido, tal como un análisis de inmunoabsorción ligado a una
enzima (ELISA). Por ejemplo, en el caso de un ELISA de tipo
sándwich, el mAb-4E6 (para LDL modificada con MDA y
OxLDL) o mAb-1H11 (para LDL modificada con MDA) se
puede unir a un sustrato sólido y ponerse en contacto a
continuación con una muestra que se va a someter a ensayo. Después
de retirar la muestra, la unión entre el anticuerpo específico y la
OxLDL y/o la LDL modificada con MDA, capturada fuera de la muestra,
se puede visualizar y/o cuantificar por medios de detección. Los
medios de detección pueden ser un anticuerpo secundario marcado y
menos específico que reconoce una parte diferente del resto de apo
B-100 del analito capturado (p. ej.,
mAb-8A2).
En el caso de un ELISA competitivo, un sustrato
sólido revestido con OxLDL o LDL modificada con MDA, se puede poner
en contacto durante un periodo de tiempo predeterminado, con el
anticuerpo monoclonal mAb-4E6 y una muestra que se
piensa o se sabe que contiene OxLDL y/o LDL modificada con MDA,
después de este periodo de tiempo, el anticuerpo no unido y la
muestra se retiran y se visualiza y/o se cuantifica la reacción de
ligación entre el anticuerpo y la OxLDL y/o la LDL modificada con
MDA unida al sustrato. La cuantificación en un ELISA competitivo es
indirecta porque no se mide la unión entre el anticuerpo y el
analito en la muestra, sino que se mide la cantidad de anticuerpo
que se une a la cantidad conocida de OxLDL o LDL modificada con MDA
que está revistiendo el sustrato. Cuanto más anticuerpo se una a la
cantidad conocida de OxLDL o de LDL modificada con MDA que reviste
el sustrato, menos analito había en la muestra.
En aún otro aspecto, la presente invención se
refiere a una LDL modificada con MDA que contiene un patrón
estable, cuyo grado de sustitución de sus restos de lisina
permanecerá esencialmente constante a lo largo de periodos de
tiempo normales, durante el almacenamiento normal de materiales
biológicos, preparándose la LDL modificada con MDA de dicho patrón,
poniendo en contacto (incubando) malonildialdehído con LDL con una
relación molar predeterminada de malonildialdehído frente al resto
de apo B-100 de la LDL.
"A lo largo de periodos de tiempo normales
durante el almacenamiento normal de materiales biológicos", tal
y como se emplea en esta memoria se refiere a los periodos de tiempo
y a las condiciones bajo las cuales se almacenan típicamente los
materiales biológicos que se van a emplear en los ensayos y en otras
actividades de laboratorio. Esas condiciones incluirán típicamente
una baja temperatura y en los casos en que sea adecuado,
congelamiento, tanto con o sin liofilización. Dependiendo del
material biológico en particular, si el material se almacena a la
temperatura adecuada y otras condiciones (p. ej., falta de vibración
u otro movimiento, humedad adecuada), el material puede ser estable
durante al menos tres meses, deseablemente durante más de un año,
preferentemente durante más de dos años y lo más preferible durante
más de tres años.
El patrón contiene preferentemente un agente que
reduce la capacidad de cualquier ion metálico presente, de
catalizar la oxidación de la LDL (p. ej., un agente quelante, tal
como EDTA) y/o uno o varios antioxidantes (p. ej., BHT y/o la
vitamina E). Preferentemente, se emplea el agente que reduce la
capacidad de cualquier ion metálico presente, de catalizar la
oxidación de la LDL, y el antioxidante. Se ha observado
sorprendentemente que cuando se emplea un anticuerpo que es
específico de OxLDL y de LDL modificada con MDA, se puede emplear
el patrón estable durante el almacenamiento de esta invención (que
contiene LDL modificada con MDA y no contiene OxLDL). Esto elimina
la necesidad de intentar formular, almacenar y emplear un patrón
estable que contenga OxLDL. OxLDL puede continuar oxidando bajo
condiciones típicas de almacenamiento, haciendo más difícil el uso
como patrón, de una composición que contiene OxLDL, o casi
imposible. El EDTA se empleará típicamente en concentraciones de
0,5 a 5 mM, preferentemente en concentraciones de 0,5 a 2 mM. BHT se
empleará típicamente en concentraciones de 5 a 50 \muM,
preferentemente en concentraciones de 10 a 20 \muM. La vitamina E
se empleará típicamente en concentraciones de 5 a 50 \muM,
preferentemente en concentraciones de 10 a 20 \muM. El patrón
también puede contener agentes antiplaquetarios e inhibidores de la
coagulación.
Se ha observado que la LDL que se ha modificado
con tratamiento con MDA es muy estable. Dicha LDL modificada con
MDA (que no está oxidada, es decir, su resto lipídico no está
oxidado) se podría añadir a muestras de plasma de referencia y esas
muestras se podrían congelar y descongelar sin un incremento del
grado de sustitución de lisina. Ya que el número total de residuos
de lisina en todas las moléculas de apo B-100 es
idéntico, una relación molar constante de MDA/apo
B-100 en la mezcla de reacción, dará como resultado
un número idéntico de lisinas sustituidas en la LDL modificada con
MDA. Por el contrario, por ejemplo, la oxidación de la LDL mediada
con iones metálicos, dará finalmente como resultado un grado
variable de sustitución de lisinas, porque depende de la
sensibilidad a la oxidación de la preparación de LDL, que depende
ella misma de la composición de ácidos grasos y del contenido en
antioxidante, los cuales son muy variables incluso en individuos
testigos sanos.
Tal y como se ha descrito anteriormente,
empleando esta invención se ha establecido una correlación entre la
oxidación de LDL y el grado de aterosclerosis posterior al
trasplante en pacientes con trasplante de corazón. La relación
entre la lesión endotelial y la modificación de LDL se estableció en
pacientes con insuficiencia renal crónica que tienen un alto riesgo
de contraer la enfermedad del corazón aterosclerótica. También se
observó que la lesión endotelial es una etapa inicial en la
aterosclerosis.
Basándose en las características de la LDL
modificada por oxidación, procedente del plasma de pacientes con
trasplante de corazón y con insuficiencia renal crónica, se concluyó
que la modificación con aldehídos mediada con células,
independiente de la oxidación de lípidos, estaba implicada al menos
parcialmente. Este descubrimiento apoyaba adicionalmente la
hipótesis de que un ensayo para la LDL modificada por oxidación
tiene que detectar la OxLDL y la LDL modificada con aldehído.
En aún otro aspecto, la invención se refiere a
un equipo de reactivos para realizar un ensayo de tipo sándwich
para determinar OxLDL o LDL modificada con MDA o ambas en una
muestra, comprendiendo dicho equipo de reactivos un sustrato al
cual se une un primer anticuerpo que tiene una alta afinidad hacia
OxLDL o LDL modificada con MDA, o hacia ambas, teniendo la OxLDL y
la LDL modificada con MDA, al menos 60 restos de lisina sustituida
cada una, por resto de apo B-100, y un anticuerpo
marcado que tiene una alta afinidad hacia OxLDL que se une al
primer anticuerpo durante el ensayo o hacia LDL modificada con MDA
que se une al primer anticuerpo durante el ensayo, o hacia ambas
que se une al primer anticuerpo durante el ensayo. El equipo de
reactivos comprende además preferentemente una sustancia reactiva
para la reacción con el anticuerpo marcado (p. ej., una enzima)
para proporcionar una señal de la presencia del anticuerpo marcado.
Preferentemente el equipo de reactivos también comprende los
patrones estables, p. ej., en forma de calibradores estables y/o
testigos estables. Por tanto, p. ej., el anticuerpo unido puede ser
mAb-4E6 o mAb-1H11 y el anticuerpo
marcado puede ser mAb-8A2.
Los dibujos acompañantes se proporcionan a modo
de complemento para describir adicionalmente la invención, estos
dibujos son los siguientes:
La Figura 1 ilustra la correlación entre las
cantidades de LDL modificada con MDA y oxidada en lesiones
coronarias en conejos hiperlipidémicos con Watanabe hereditario (A)
y en cerdos miniatura (B).
La Figura 2 ilustra la acumulación de OxLDL y
LDL modificada con MDA en las arterias coronarias de explantes
cardiacos de pacientes con enfermedad del corazón isquémica pero no
en pacientes con cardiomiopatía dilatada.
La Figura 3 ilustra la inhibición de la unión de
mAb-4E6 con OxLDL inmovilizada con LDL natural,
OxLDL y LDL modificada con MDA en solución.
La Figura 4 ilustra una curva patrón típica,
obtenida con LDL modificada con MDA en un ELISA de tipo
sándwich.
sándwich.
La Figura 5 ilustra los niveles de OxLDL y de
LDL modificada con aldehído en muestras de plasma posteriores al
trasplante, de pacientes con trasplante de corazón con diferentes
grados de estenosis de la arteria coronaria, determinada
angiográficamente.
La Figura 6 ilustra la correlación entre los
niveles en plasma de OxLDL y LDL modificada con aldehído y los
títulos de los autoanticuerpos específicos.
La Figura 7 ilustra la correlación entre los
niveles en plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído y el
antígeno del factor von Willebrand.
Estos dibujos se proporcionan sólo para fines
ilustrativos y no se deben utilizar para limitar excesivamente la
invención.
La presente invención se describe adicionalmente
junto con los siguientes ejemplos que tienen un fin ilustrativo y
que no deben utilizarse para limitar excesivamente la invención.
Se inmunizaron ratones Balb/c mediante inyección
intravenosa e intraperitoneal de OxLDL y de LDL modificada con MDA.
La OxLDL se obtuvo por incubación in vitro de LDL
(concentración final de apo B-100 700 \mug/ml)
con cloruro de cobre (concentración final 640 \muM) durante 16 h a
37ºC. La LDL modificada con MDA se preparó por incubación de LDL
(concentración final de apo B-100 700 \mug/ml) con
una solución de MDA 0,25 M durante 3 h a 37ºC. El número de lisinas
sustituidas, medido en el ensayo TBARS, era típicamente 210 por
molécula de apo B-100 para OxLDL y 240 para LDL
modificada con MDA. Los hibridomas se obtuvieron mediante fusión
inducida con PEG de linfocitos de bazo, obtenidos a partir de
ratones inmunizados con células de mieloma
P3-X63/Ag-6.5.3, de acuerdo con
técnicas convencionales (4). El escrutinio de los hibridomas que
producían anticuerpos específicos, se realizó con ELISA empleando
placas de microtitulación revestidas con LDL modificada con
malonildialdehído o con LDL oxidada con cobre. Se obtuvieron 308
hibridomas después de inmunizar los ratones con OxLDL (211) o con
LDL modificada con MDA (97). Hyb4E6 producía anticuerpos específicos
para LDL modificada con malonildialdehído y oxidada con cobre
(mAb-4E6) y Hyb1H11 producía anticuerpos específicos
sólo para LDL modificada con malonilaldehído
(mAb-1H11). La fracción de IgG de los anticuerpos se
purificó mediante cromatografía de afinidad sobre proteína
Sefarosa-A y la afinidad de las IgGs purificadas se
determinó en un radioinmunoensayo en fase sólida y/o con ELISA. Los
valores de la K_{a} del anticuerpo monoclonal
mAb-4E6 eran <10^{6} M^{-1} para la LDL
natural y >10^{9} M^{-1} para la LDL modificada con
malonildialdehído y la LDL oxidada con cobre. Los valores de
K_{a} para el anticuerpo monoclonal mAb-1H11 eran
<10^{6} M^{-1} para LDL y OxLDL y >10^{9} M^{-1} para
la LDL modificada con malonildialdehído. Los valores de K_{a} para
el anticuerpo monoclonal mAb-8A2, obtenido después
de inmunizar los ratones con LDL, eran >10^{9} M^{-1} para
todas las formas de LDL. La deslipidación de LDL modificada con MDA
y de OxLDL, daba como resultado la pérdida de inmunorreactividad de
mAb-4E6, sugiriendo que se dirige contra un epítopo
conformacional en el resto proteico de la LDL modificada por
oxidación.
Las arterias coronarias se obtuvieron a partir
de conejos hiperlipidémicos con Watanabe hereditario, de 2 y 5
meses de edad (n = 30), con alimentación normal o a partir de cerdos
miniatura (n = 26) que se habían alimentado con una dieta
enriquecida en colesterol (4%), grasas saturadas (14% de sebo de
vaca) y extracto de bilis (1%) durante 6 a 24 semanas.
Los especimenes arteriales se sumergieron
después de extirparlos durante 30 minutos en PBS (pH 7,4) que
contenía 4% de sacarosa, vitamina E 20 \muM e hidroxitolueno
butilado 10 \muM, como antioxidantes y EDTA 1 mM, se congelaron
rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Secciones
congeladas de 7 \muM se tiñeron con hematoxilina y eosina y con
rojo de Oil Red 0, o se realizó una inmunotinción tal y como se
describe a continuación. Los parámetros morfométricos de las
lesiones ateroscleróticas se midieron con planimetría, empleando un
analizador de imagen a color de Leica 2 Quantimet (Cambridge, GB).
Se midió el área dentro de la lámina elástica externa, de la lámina
elástica interna y el lumen. La media se definió como el área entre
la lámina elástica interna y externa. La capa íntima se definió como
el área dentro de la lámina elástica interna sin ocupar por el
lumen del vaso.
Las lipoproteínas oxidadas que contenían apo
B-100 se detectaron con el anticuerpo monoclonal
específico mAb-4E6, con los anticuerpos de IgG de
conejo anti-ratón conjugados con fosfatasa alcalina
y el sistema de sustrato de fucsina y fosfatasa alcalina (Dako,
Carpintería, CA) y la absorbancia se midió en el analizador de
imágenes a color. La especificidad de la inmunotinción se confirmó
por inhibición de la tinción con un exceso de LDL oxidada con cobre
pero no con LDL natural o con albúmina modificada con
malonildialdehído. La tinción se localizó junto con el anticuerpo
monoclonal mAb-13F6, específico de apo
B-100. La absorbancia (aproximadamente 10%) medida
con un exceso de LDL oxidada con cobre, se supuso que representaba
la tinción del ruido de fondo.
La Figura 1 ilustra la correlación entre los
niveles de lipoproteínas que contienen apo B-100
oxidada, es decir, OxLDL y LDL modificada con MDA, en las lesiones
y el área media de la capa íntima de las lesiones coronarias en
conejos hiperlipidémicos con Watanabe (A) y en cerdos miniatura (B).
Esos datos muestran por tanto una correlación entre la acumulación
de OxLDL y LDL modificada con MDA y la evolución de las lesiones
ateroscleróticas coronarias en 2 modelos de animales diferentes. En
los conejos con Watanabe, la evolución de las lesiones es debida al
incremento del colesterol LDL asociado con una deficiencia
hereditaria en el receptor de LDL, mientras que la evolución en los
cerdos miniatura es debida a un incremento en el colesterol LDL
inducido por la dieta.
Este ejemplo es un ejemplo típico del uso del
anticuerpo mAb-4E6 altamente específico, en la
inmunohistoquímica aplicada a lesiones ateroscleróticas humanas. En
una forma similar, se pueden realizar experimentos
correspondientes, en los cuales los expertos en la técnica pueden
adaptar ciertas condiciones, empleando su conocimiento común en el
campo.
Los especimenes de arteria coronaria, obtenidos
en el momento del trasplante, de pacientes con enfermedad del
corazón isquémica (n = 7) o cardiomiopatía dilatada (n = 7), fueron
tratados tal y como se ha descrito anteriormente (documento 7). Los
especimenes se extirparon en los 30 minutos posteriores a la
extirpación del corazón, se recogieron en PBS (pH 7,4) que contenía
4% de sacarosa, vitamina E 20 \muM e hidroxitolueno butilado 10
\muM como antioxidantes y EDTA 1 mM, y se almacenaron a -80ºC. Se
cortaron secciones congeladas de 7 \mum de espesor y se tiñeron
con hematoxilina y eosina. Se analizaron seis de ocho secciones a
una distancia de 84 \mum para cada espécimen, para asegurar unos
resultados representativos. Los portaobjetos por duplicado se
revelaron con los anticuerpos monoclonales mAb-4E6,
específicos de LDL oxidada, PG-M1, específico de
macrófagos humanos, o 1A4, específico de la
\alpha-actina del músculo liso humano (ambos
procedentes de Dako Sa, Glostrup, Dinamarca). La especificidad de la
unión de mAb-4E6 se confirmó por su inhibición con
OxLDL pero no con LDL natural.
Segmentos de la arteria coronaria de 7
individuos con cardiomiopatía dilatada, no contenían antes del
trasplante lesiones ateroscleróticas y el anticuerpo monoclonal no
detectó OxLDL y/o LDL modificada con aldehído en esos segmentos.
Todos los segmentos de arteria coronaria de 7 pacientes con
enfermedad del corazón isquémica previa al trasplante, contenían
lesiones ateroscleróticas que contenían OxLDL y/o LDL modificada
con aldehído (Figura 2). Esta información es suficiente para afirmar
que el anticuerpo detecta OxLDL en lesiones ateroscleróticas de
forma altamente específica.
OxLDL se asoció con células espumosas de
macrófagos (preferentemente en lesiones con <50% de estenosis)
con células espumosas de músculo liso y con el núcleo lipídico
necrótico (preferentemente en lesiones con >50% de estenosis).
Los macrófagos y las células del músculo liso se identificaron
mediante inmunotinción con anticuerpos monoclonales específicos
(5). Estos datos apoyaban la hipótesis de que la oxidación de LDL
puede estar asociada con el desarrollo de enfermedad coronaria
isquémica. El anticuerpo monoclonal mAb-4E6 de la
presente invención que detectaba el material inmunorreactivo en las
secciones de tejido, se empleó adicionalmente en ELISA (compárese
con el Ejemplo 4).
Las micrografías luminosas (a, c, e; x 40) y las
micrografías por contraste de fase (b, d, f; x 400) son de los
especimenes representativos de arteria coronaria descendente
anterior izquierda, de un paciente con cardiomiopatía dilatada
(hombre; 40 años de edad) (a, b) y de un paciente con enfermedad
del corazón isquémica (hombre; 57 años de edad)
(c-f). Las secciones del tejido se inmunotiñeron con
el anticuerpo monoclonal mAb-4E6. La LDL oxidada no
se detectaba en la neoíntima del primer paciente (a, b), pero era
mostrable en placas del segundo paciente. La LDL oxidada estaba
asociada con células espumosas de macrófagos que se infiltraban en
las áreas del hombro de placas fibrosas (c, d) y con células
espumosas del músculo liso en casquetes fibrosos (e, f).
De acuerdo con la invención, se estableció un
ELISA para la cuantificación de OxLDL y LDL modificada con aldehído
en plasma. Se basaba en la inhibición de la unión de
mAb-4E6 a los pocillos de las placas de
microtitulación revestidas con LDL oxidada con cobre. Este
anticuerpo se obtuvo tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1.
La OxLDL convencional y la LDL modificada con
aldehído y las muestras de plasma se diluyeron en PBS que contenía
EDTA 1 mM, vitamina E 20 \muM, hidroxitolueno butilado 10 \muM,
dipiridamol 20 \muM y teofilina 15 mM, para evitar la oxidación
in vitro de LDL y la activación de las plaquetas. Volúmenes
iguales de solución de mAb-4E6 purificada y diluida
(concentración final 7,5 ng/ml) y solución patrón diluida (LDL
oxidada con cobre añadida como ligando competitivo hasta obtener
una concentración final en el intervalo desde 50 hasta 500 ng/ml)
se mezclaron y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. A
continuación se añadieron partes alícuotas de 200 \mul de las
mezclas, a los pocillos revestido con LDL modificada con MDA o con
OxLDL.
Las muestras se incubaron durante 2 h a
temperatura ambiente. Después de lavar, los pocillos se incubaron
durante 1 h con IgG de conejo conjugada con peroxidasa de rábano
picante, producida contra inmunoglobulinas de ratón y se lavaron de
nuevo. La reacción de la peroxidasa se realizó tal y como se ha
descrito anteriormente (5) y se leyó la absorbancia (A) a 492
nm.
Los testigos sin ligando competitivo y los
blancos sin anticuerpo se incluyeron de forma rutinaria. El
porcentaje de inhibición de la unión de mAb-4E6 con
el ligando inmovilizado se calculó como:
\frac{A^{492
nm} \ del \ testigo - A^{492 nm} \ de \ la \ muestra}{A^{492 nm} \
del \ testigo - A^{492 nm} \ del \
blanco}
y las curvas patrón se obtuvieron
realizando un gráfico del porcentaje de inhibición frente a la
concentración del ligando
competitivo.
El límite inferior de la detección era 0,020
mg/dl en plasma humano sin diluir. Los coeficientes de variación
dentro del ensayo y entre los ensayos eran 10 y 12%,
respectivamente. La OxLDL patrón y la LDL modificada con aldehído y
las muestras de plasma se diluyeron en PBS que contenía agentes
antioxidantes y antiplaquetarios, tal y como se ha descrito
anteriormente.
La especificidad de mAb-4E6
hacia OxLDL y LDL modificada con aldehído se ilustra en la Figura 3.
El 50% de inhibición de la ligación de mAb-4E6 con
OxLDL inmovilizada y la LDL modificada con aldehído se obtuvo con
0,025 mg/dl de LDL oxidada con cobre y 25 mg/dl de LDL natural,
respectivamente. El valor de C_{50}, es decir, la concentración
necesaria para obtener 50% de inhibición de la unión del anticuerpo,
se incrementaba desde 2,5 mg/dl para la LDL modificada con MDA con
60 residuos de lisina sustituidos por molécula de apo
B-100, frente a 0,025 mg/dl para la LDL modificada
con MDA con 240 residuos de lisina sustituidos por molécula de apo
B-100 (Figura 3). La oxidación con cobre daba como
resultado la fragmentación del resto de apo B-100
pero no invalidaba la unión de mAb-4E6 (Figura 3).
Concentraciones molares 50 veces superiores de albúmina modificada
con MDA, eran necesarias para obtener 50% de inhibición (no se
muestra), mientras que concentraciones molares hasta 1.000 veces
superiores de lisina modificada con MDA, no afectaban a la unión de
mAb-4E6. OxLDL y LDL modificada con aldehído
aisladas a partir de plasma de pacientes, tenían la misma
reactividad que la LDL modificada con MDA con 120 lisinas
sustituidas y que LDL oxidada con cobre con 210 lisinas sustituidas.
Los coeficientes de variación dentro de los ensayos y entre los
ensayos eran 10 y 12%, respectivamente. Cuando se añadió LDL
oxidada con cobre al plasma humano, con una concentración final de
0,25 y 2 mg/dl, respectivamente, las recuperaciones eran 95 y 105%,
respectivamente.
Interacción de mAb-4E6 con
ligandos competitivos en solución. LDL oxidada con cobre (1
\mug/ml) era el antígeno extendido en placas. El
mAb-4E6 se añadió en ausencia y en presencia de
ligandos competitivos: LDL oxidada con cobre (\triangledown), LDL
modificada con MDA con 240 (\ding{110}), 120 (\Diamond), 90
(\bigcirc) y 60 (\ding{108}) lisinas bloqueadas o sustituidas o
modificadas por cada apo B-100, respectivamente, LDL
natural (\ding{115}) y OxLDL y LDL modificada con aldehído
(\ding{117}) aisladas a partir del plasma de pacientes con
insuficiencia renal crónica grave. Los resultados se expresan con
B/B_{0}, en donde B_{0} es la cantidad de
mAb-4E6 unida en ausencia de ligando competitivo y
B la cantidad unida en presencia de ligando competitivo.
De acuerdo con la invención, se estableció un
ELISA de tipo sándwich para cuantificar OxLDL y LDL modificada con
aldehído en plasma. Se basaba en la unión de un material
inmunorreactivo a los pocillos de las placas de microtitulación
revestidas con el anticuerpo monoclonal mAb-4E6 y la
detección del material inmunorreactivo unido, empleando el
anticuerpo monoclonal mAb-8A2 marcado con
peroxidasa. Esta versión del ELISA es más adecuada para emplear en
el laboratorio clínico ya que supera la necesidad de preparar
soluciones patrón in vitro de LDL oxidada y/o de LDL
modificada con aldehído que sólo se pueden mantener a -4ºC durante
un periodo limitado de tiempo, típicamente 2 semanas. La LDL
modificada con MDA se puede añadir al plasma de referencia y estas
preparaciones patrón se pueden almacenar a -80ºC hasta 1 año (véase
más arriba).
Las preparaciones convencionales y las muestras
de plasma se diluyeron en PBS que contenía antioxidantes y agentes
antiplaquetarios, tal y como se ha descrito anteriormente, se
aplicaron 180 \mul de partes alícuotas de plasma diluido 80 veces
y de soluciones patrón que contenían entre 10 y 0,01 nM de LDL
modificada con malonildialdehído, a los pocillos de las placas de
microtitulación revestidas con mAb-4E6 (200 \mul
de una solución de IgG de 4 \mug/ml) y se incubaron durante 2 h a
temperatura ambiente. Después de lavar, los pocillos se incubaron
durante 1 h con IgG, mAb-8A2 conjugado con
peroxidasa de rábano picante (concentración final de IgG 65 ng/ml)
y se lavaron de nuevo. La reacción de la peroxidasa se realizó tal y
como se ha descrito anteriormente. La absorbancia medida a 492 nm
se correlaciona con el valor logarítmico de la concentración de LDL
modificada con aldehído, en el intervalo entre 1,5 nM y 0,3 nM.
Curvas patrón para el ELISA tipo sándwich.
mAb-4E6 era el anticuerpo extendido en las placas.
LDL modificada con MDA era el ligando. LDL modificada con MDA unida
se detectó con mAb-8A2 conjugado con peroxidasa de
rábano picante. La LDL modificada con MDA se añadió a 8 muestras
diferentes de plasma, hasta tener una concentración final de 100 nM
y se diluyeron posteriormente en tampón hasta obtener
concentraciones finales en el intervalo de 2 hasta 0,2 nM.
El ELISA de la presente invención se empleó para
estudiar la asociación entre los niveles en plasma de OxLDL y de
LDL modificada con aldehído y la enfermedad coronaria posterior a un
trasplante.
El grupo de estudio posterior al trasplante
contenía 47 pacientes trasplantados debido a cardiomiopatía
dilatada y 60 pacientes tratados debido a la enfermedad del corazón
isquémica. Las características clínicas de estos pacientes se
resumen en la Tabla 1. En el momento de la recogida de muestras de
sangre, de 12 a 84 meses después de la intervención quirúrgica,
todos los pacientes estaban en estado cardiaco estable sin indicios
de rechazo agudo. Se aislaron las arterias coronarias de 14
pacientes (7 pacientes con cardiomiopatía dilatada y 7 pacientes
con enfermedad del corazón isquémica), a partir de explantes
cardiacos y se estudiaron inmunohistoquímicamente (tal y como se
mostraba en el Ejemplo 3). Una información suficiente sobre los
hábitos fumadores estaba disponible para 92 de los 107 pacientes (16
fumadores y 76 no fumadores). No había información suficiente sobre
los hábitos fumadores de los donantes. Se obtuvieron muestras de
sangre de 53 testigos no fumadores (25 hombres/28 mujeres; edad: 52
\pm 1,3 años) sin antecedentes de enfermedad cardiovascular
aterosclerótica,. Los testigos se emparejaron según la edad, el sexo
y los niveles de colesterol LDL. Se seleccionaron a partir de la
plantilla del laboratorio y de la clínica.
Los angiogramas coronarios anuales de rutina
estaban disponibles para todos los pacientes que ya estuvieran
trasplantados en el momento de la toma de muestras de sangre. La
enfermedad coronaria se determinó independientemente mediante dos
angiografías que eran independientes de los niveles de OxLDL y de
LDL modificada con aldehído, y que se clasificaron visualmente del
modo siguiente:
- -
- grado 0: arterias coronarias normales
- -
- grado I: anormalidades menores con <50% de estenosis de las ramificaciones primarias o secundarias y función ventricular izquierda normal
- -
- grado II: \geq 50% de la estenosis de las ramificaciones primarias o secundarias, o implicación distal con función ventricular izquierda dañada.
Es conocido que la angiografía infraestima
sistemáticamente el grado de engrosamiento de la capa íntima
coronaria, en receptores de un trasplante de corazón. Este estudio,
por tanto, no pretende cuantificar detalladamente la enfermedad
coronaria en nuestros pacientes. Más bien, la subdivisión en los
grupos definidos anteriormente depende de los datos angiográficos
que se distinguen fácilmente y que han mostrado tener una
correlación con los descubrimientos histopatológicos. De los 107
pacientes, 46 pacientes tenían un angiograma coronario normal, 3
años antes y un desarrollo de la enfermedad coronaria, angiográfica
durante los 3 años siguientes al periodo de seguimiento, se
determinó en todos estos pacientes. El angiograma coronario normal
de referencia era el primer angiograma posterior a la operación en
18 pacientes, el segundo en 14 pacientes y el tercero en 14
pacientes.
El estudio fue aprobado por el "Institutional
Review Board" y las personas participantes en el estudio
proporcionaron una autorización por escrito.
Las muestras de sangre venosa procedente de
pacientes y de testigos, se recogieron con un volumen de 0,1 de
citrato 0,1 M que contenía EDTA 1 mM, vitamina E 20 \muM,
hidroxitolueno butilado 10 \muM, dipiridamol 20 \muM y
teofilina 15 mM, para evitar la oxidación in vitro de LDL y
la activación de plaquetas. Las muestras de sangre se centrifugaron
a 3.000 g durante 15 min a temperatura ambiente en la hora
siguiente a la recogida y se almacenaron a -20ºC hasta realizar el
ensayo.
Las LDL se aislaron a partir del suero reunido
de donantes normolipidémicos en ayunas, mediante
ultracentrifugación en gradiente de densidad (documento 6). Las
preparaciones convencionales de LDL modificada con MDA y de LDL
oxidada con cobre se prepararon tal y como se describe en otro lugar
(7, 8) y se emplearon como testigos del ensayo. Las moléculas de
apo B-100 de las LDL modificadas con MDA in
vitro (7) y de las LDL oxidadas con cobre (8) contenían un
promedio de 244 y de 210 lisinas sustituidas (de un total de 356),
respectivamente (5, 9). Mientras que el grado de sustitución de
lisinas en las LDL modificadas con MDA in vitro y en las LDL
oxidadas con cobre es muy similar, el resto lipídico de las
anteriores no está oxidado. La especificidad del anticuerpo
monoclonal mAb-4E6 para las LDL modificadas con MDA
y las LDL oxidadas con cobre, sugiere que depende sólo del grado de
modificación de la proteína (lisina). Todas las concentraciones de
lipoproteína se expresaron por tanto en términos de proteína. La
OxLDL y la LDL modificada con aldehído aisladas a partir del plasma
de pacientes, se caracterizaron tal y como se ha descrito
previamente (5, 9).
El colesterol y los triglicéridos se midieron
por métodos enzimáticos (Boehringer Mannheim, Meylon, Francia). La
tipificación de los antígenos de la clase I (HLA-B)
y de la clase II (HLA-DR) del complejo principal de
histocompatibilidad, se realizó por la técnica de
microlinfocitotoxicidad.
El ELISA de la invención se empleó para detectar
la OxLDL y la LDL modificada con aldehído.
Los testigos y los pacientes se compararon con
el ensayo de ANOVA, seguido de la prueba de comparación múltiple no
paramétrica de Mann-Whitney o Dunnet, sobre valores
transformados logarítmicamente, utilizando el programa estadístico
Instat V2.05a (Graph Pad Software, San Diego, California). Los
parámetros no cuantitativos se compararon por el análisis de la
Ji-cuadrado. Los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído medidos en 3 partes alícuotas de las mismas
muestras de plasma, se compararon con una prueba de mediciones
repetidas no paramétricas de Friedman. El análisis de la regresión
logística que empleaba el programa informático SAS (SAS Institute
Inc., EE.UU.) se utilizó para evaluar la correlación entre la
estenosis coronaria determinada por angiografía (como una variable
dependiente) y los niveles en plasma de OxLDL y de LDL modificada
con aldehído, la edad y el sexo de los receptores, la edad y el sexo
de los donantes, antecedentes previos al trasplante de enfermedad
del corazón isquémica o de cardiomiopatía dilatada, duración de la
isquemia, duración del seguimiento, número de rechazos, número de
incompatibilidades del HLA, infección con citomegalovirus,
hipertensión (tratamiento con antihipertensores), diabetes,
tratamiento con fármacos hipolipemiantes (estatinas o fibratos) y
niveles en suero de colesterol LDL, colesterol HDL y triglicéridos
como variables independientes. Los valores de p inferiores a 0,05
se consideraron que indicaban que eran estadísticamente
significativos. Los análisis de regresión logística también se
realizaron para evaluar la correlación entre los niveles en plasma
de OxLDL y de LDL modificada con aldehído y el desarrollo de la
estenosis coronaria durante un periodo de seguimiento de 3
años.
\vskip1.000000\baselineskip
La correlación entre OxLDL y LDL modificada con
aldehído y la estenosis coronaria se evaluó en 47 pacientes
trasplantados debido a cardiomiopatía dilatada y en 60 pacientes
tratados por enfermedad del corazón isquémica. El análisis de los
datos clínicos para los dos grupos de pacientes con trasplante de
corazón (Tabla 1) no reveló diferencias significativas en la edad y
el sexo de los receptores, la edad y el sexo de los donantes, la
duración de la isquemia del corazón del donante, el número de
episodios de rechazo, el número de incompatibilidades del HLA, la
frecuencia de infecciones con citomegalovirus, la hipertensión o la
diabetes y el grado de estenosis coronaria. Los pacientes
trasplantados debido a enfermedad del corazón isquémica tuvieron un
seguimiento más largo y recibieron más frecuentemente fármacos
hipolipemiantes (Tabla 1).
El análisis de los datos de laboratorio (Tabla
2) no reveló diferencias significativas en los niveles en suero de
triglicéridos, colesterol HDL y colesterol LDL entre grupos de
pacientes o entre pacientes y testigos. Sin embargo, se observaron
diferencias significativas en los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído. Los niveles promedio en plasma de OxLDL y
de LDL modificada con aldehído eran 1,3 \pm 0,14 mg/dl en
pacientes con cardiomiopatía dilatada (p < 0,001 frente a
testigos) y 1,7 \pm 0,13 mg/dl en pacientes con enfermedad del
corazón isquémica (p < 0,001 frente a testigos y < 0,01 frente
a pacientes con cardiomiopatía dilatada) (Tabla 2). Los niveles en
plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído en personas
testigo, emparejadas por la edad, el sexo y los niveles en suero de
triglicéridos, colesterol HDL y colesterol LDL eran 0,60 \pm
0,034 mg/dl (n = 53; p > 0,001 frente a pacientes trasplantados
con cardiomiopatía dilatada y pacientes con enfermedad del corazón
isquémica).
Los niveles de OxLDL y de LDL modificada con
aldehído no eran diferentes en las muestras que se almacenaban
durante 24 h hasta 4 meses después de la recogida, y ciclos de hasta
cuatro congelamientos y descongelamientos no causaban un incremento
de los niveles de OxLDL y de LDL modificada con aldehído. Estos
descubrimientos indicaban que la adición de EDTA, de agentes
antioxidantes y antiplaquetarios evitaban adecuadamente la oxidación
in vitro de LDL. En un subgrupo de 87 muestras de plasma
consecutivas, se midieron los niveles de OxLDL y/o de LDL
modificada con aldehído en 3 partes alícuotas separadas, 3 días
diferentes. Los niveles eran 1,30 \pm 0,074 mg/dl; 1,48 \pm
0,101 mg/dl y 1,46 \pm 0,090 mg/dl, respectivamente. La prueba de
Friedman con mediciones repetidas y no paramétricas, no reveló
diferencias significativas.
Los niveles promedio de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído eran 1,2 \pm 0,053 mg/dl (n = 79) en
muestras posteriores al trasplante, de pacientes con arterias
coronarias angiográficamente normales (grado 0), 2,1 \pm 0,30
mg/dl en pacientes con estenosis de la arteria coronaria de grado I
(n = 18; p < 0,001 frente al grado 0) y 3,2 \pm 0,45 mg/dl en
pacientes con estenosis de la arteria coronaria de grado II (n = 10;
p < 0,001 frente al grado 0 y p < 0,05 frente al grado I)
(Figura 5). Los niveles en suero de colesterol LDL, triglicéridos y
colesterol HDL eran muy similares en los pacientes con mayor grado
estenosis de la arteria coronaria. Los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído en las muestras de plasma de pacientes
trasplantados debido a cardiomiopatía dilatada o a enfermedad del
corazón isquémica, con el mismo grado de estenosis de la arteria
coronaria, eran similares: 1,1 \pm 0,072 y 1,4 \pm 0,079 mg/dl
para pacientes con grado 0, y 2,6 \pm 0,60 y 2,4 \pm 0,29 mg/dl
para pacientes con mayor grado de estenosis arterial coronaria. El
número de pacientes con niveles elevados de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído (> 1 mg/dl, es decir, niveles promedio
de los testigos + 2 DE) era 43 (de los 60) en la subpoblación de
pacientes con enfermedad del corazón isquémica previa al trasplante
y 21 (de los 47) en la subpoblación de pacientes con cardiomiopatía
dilatada previa al trasplante. Cuarenta y cuatro de los 79 pacientes
con arterias coronarias angiográficamente normales, tenían niveles
elevados de OxLDL y de LDL modificada con aldehído. Los niveles
elevados se detectaron en 12 (de los 18) pacientes con grado I y en
todos los pacientes con estenosis de grado II (p = 0,0046 para la
tendencia).
Para permitir una mejor caracterización del
material inmunorreactivo detectado con el ELISA, se aislaron
fracciones de LDL del plasma de los 10 pacientes con grado II de
estenosis arterial coronaria (18). Estas fracciones retenían 85
\pm 10% (media \pm DE) del material inmunorreactivo, mientras
que el material no inmunorreactivo migraba en la posición de la
seroalbúmina. La OxLDL y la LDL modificada con aldehído se aislaron
a partir de fracciones de LDL mediante cromatografía de intercambio
iónico sobre una columna de Sefarosa Q, con una recuperación del
75%. El número de lisinas sustituidas por molécula de apo
B-100 era 130 \pm 10 para OxLDL y LDL modificada
con aldehído, comparado con 5 \pm 1 (p < 0,001) para LDL
natural. Las proporciones respectivas de colesterol/proteína, eran
3,3 \pm 0,54 y 1,8 \pm 0,36 (p < 0,001). Los niveles de
araquidonato y de linoleato en la OxLDL y en la LDL modificada con
aldehído, aisladas a partir del plasma de estos pacientes, eran 75
y 80% menores que los de la LDL natural aislada a partir de las
mismas muestras de plasma. Las curvas de inhibición obtenidas con
OxLDL y con LDL modificada con aldehído aisladas a partir del plasma
de pacientes con trasplante de corazón, eran superponibles a las
obtenidas con LDL oxidada in vitro, con el mismo grado de
modificación proteica (120 lisinas sustituidas por molécula de apo
B-100) (Figura 3).
La proporción proteína/antígeno y la reactividad
relativa en el ELISA de la OxLDL y de la LDL modificada con
aldehído, aisladas a partir del plasma de estos pacientes, eran
similares a las de las preparaciones convencionales de LDL oxidada
con cobre o de LDL modificada con MDA.
Los análisis de la regresión logística (Tabla 3)
identificaron 3 parámetros que estaban correlacionados significativa
e independientemente con la estenosis arterial coronaria posterior
al trasplante, que incluían los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído, la duración del seguimiento y la edad del
donante.
Por el contrario, antecedentes previos al
trasplante, de cardiomiopatía dilatada o de enfermedad del corazón
isquémica, la edad y el sexo de los receptores, el sexo de los
donantes, la duración de la isquemia del corazón del donante, el
grado de incompatibilidad del HLA, el número de rechazos, la
hipertensión, la diabetes y los niveles en suero del colesterol
LDL, colesterol HDL y triglicéridos en los receptores, no
contribuyeron significativamente a las variaciones individuales en
el grado de la estenosis arterial coronaria (Tabla 3).
Los niveles en suero del colesterol LDL, el
colesterol HDL y los triglicéridos en los pacientes, eran similares
a los de los testigos (Tabla 2), de modo que cuanto mayor era el
grado de estenosis arterial coronaria, era menos probable que
dependieran de estas variables en este grupo de estudio. Cincuenta y
seis de los 107 pacientes trasplantados, recibieron fármacos
hipolipemiantes (46 con estatinas y 10 con fibratos) (Tabla 1), pero
el tratamiento con estos fármacos no estaba correlacionado con la
incidencia de la vasculopatía del injerto angiográficamente (Tabla
3). Setenta y cinco (de los 107) pacientes se trataron con
bloqueadores de los canales de calcio. Los niveles en plasma de
OxLDL y de LDL modificada con aldehído en estos pacientes (1,53
\pm 0,11 mg/dl) eran muy similares a los de pacientes sin
tratamiento (1,74 \pm mg/dl) y el tratamiento con estos fármacos
no estaba correlacionado con el grado de estenosis arterial
coronaria.
El desarrollo de la enfermedad arterial
coronaria se observó en 12 de los 46 pacientes con trasplante de
corazón, durante un periodo de seguimiento de 3 años. No había
diferencias en la edad y en el sexo de los receptores, la edad y el
sexo de los donantes, la duración de la isquemia, el grado de
incompatibilidad del HLA, la frecuencia de las infecciones con
citomegalovirus, la hipertensión y la diabetes (Tabla 4), ni en los
niveles en suero de triglicéridos, colesterol HDL y colesterol LDL
(Tabla 5) entre los pacientes con y sin desarrollo de la enfermedad
arterial coronaria. Sin embargo, los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído eran significativamente elevados en los
pacientes con desarrollo de enfermedad arterial coronaria (Tabla
5).
Los análisis de la regresión logística revelaron
que los niveles en plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído
(valor de Ji-cuadrado = 7,1; p = 0,0076) y la edad
del donante (valor de Ji-cuadrado = 4,4; p = 0,035)
preveían el desarrollo de enfermedad arterial coronaria en estos
pacientes. Tres de estos pacientes desarrollaban la enfermedad
arterial coronaria en el primer año, 3 en el segundo y 6 en el
tercer año. Los niveles en plasma de OxLDL y de LDL modificada con
aldehído eran 3,9 \pm 0,6 mg/dl, 2,0 \pm 0,37 mg/dl y 1,2 \pm
0,33 mg/dl, respectivamente. Aunque los análisis estadísticos no
mostraban una correlación con el sexo, la hipertensión y la
infección con citomegalovirus, 8 de 12 de estos pacientes eran
hombres, hipertensos y tenían infección con citomegalovirus.
\vskip1.000000\baselineskip
Esto demuestra:
- 1)
- que los explantes cardiacos de pacientes con enfermedad del corazón isquémica, pero sin cardiomiopatía dilatada, contienen LDL oxidada en los macrófagos y en las células del músculo liso en placas ateromatosas;
- 2)
- que la enfermedad coronaria posterior al trasplante está asociada con unos niveles incrementados en plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído, tanto en pacientes trasplantados debido a cardiomiopatía dilatada como a enfermedad del corazón isquémica, y
- 3)
- que los niveles incrementados en plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído se correlacionan con el desarrollo de estenosis arterial coronaria.
\newpage
Los niveles de OxLDL y de LDL modificada con
aldehído en las muestras de plasma de pacientes con trasplante de
corazón, sin lesiones arteriales coronarias detectables por
angiografía, eran dos veces superior a los de las muestras de plasma
de testigos sin antecedentes de enfermedad cardiovascular
aterosclerótica, los cuales se emparejaron por la edad, el sexo y
los niveles en plasma de colesterol LDL, colesterol HDL y
triglicéridos. Un incremento de 2,7 veces se observó en muestras de
plasma posteriores al trasplante, de pacientes con estenosis
arterial coronaria pronunciada. Estos datos sugieren que niveles
elevados en plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído, pueden
ser un indicador de estenosis arterial coronaria posterior al
trasplante. Niveles incrementados en plasma de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído, se correlacionaban con el grado de
estenosis arterial coronaria y también con su evolución, sugiriendo
que la OxLDL y la LDL modificada con aldehído pueden tener una
función patógena en la evolución acelerada de la enfermedad
coronaria en pacientes con trasplante de corazón.
Se ha sugerido que la aterosclerosis posterior
al trasplante es el resultado de una "respuesta a una lesión"
del endotelio (10). El grado de lesión isquémica en las biopsias
endomiocárdicas se encontró que era efectivamente un diagnosticador
potente del desarrollo de aterosclerosis acelerada
(11-13). La lesión endotelial se puede inducir
mediante respuestas inmunes celulares de hipersensibilidad de tipo
retardado, producidas por antígenos de histocompatibilidad (HLA) de
la clase II sobre el endotelio de la arteria coronaria (14),
mediante la infección con citomegalovirus (15, 16), mediante
ciclosporina (17) y mediante OxLDL y LDL modificada con aldehído
(18) que pueden actuar sinérgicamente con ciclosporina (19). En el
presente estudio, el grado de histoincompatibilidad entre las
parejas de donantes y receptores, el número de episodios de rechazo
o de infección con citomegalovirus, no se correlacionaba con el
grado de estenosis en la arteria coronaria, mientras que la OxLDL y
la LDL modificada con aldehído estaban correlacionadas de modo
significativo e independiente con la enfermedad coronaria posterior
al trasplante. La asociación observada entre la edad del donante y
la aparición de la enfermedad coronaria, está de acuerdo con los
descubrimientos previos de que la aterosclerosis coronaria en el
corazón del donante, predispone una estenosis acelerada en la
arteria coronaria después del trasplante (20).
La OxLDL y la LDL modificada con aldehído se
observaron en arterias coronarias en explantes cardiacos de
pacientes con la enfermedad del corazón isquémica, sugiriendo que
la OxLDL y la LDL modificada con aldehído que se acumulan en la
pared arterial, pueden contribuir a la evolución de la estenosis de
la arteria coronaria. La proporción de colesterol/proteína en OxLDL
y en LDL modificada con aldehído era muy similar a la de LDL
extraída de lesiones ateroscleróticas, tal y como se ha descrito
previamente (21, 22). Una posible explicación es que al menos parte
de la OxLDL y de la LDL modificada con aldehído, se libera de la
pared arterial. Previamente, hemos observado que la ruptura de
placas en pacientes con infarto agudo de miocardio está asociada con
la liberación de LDL modificada por oxidación (5).
Los datos in vitro sugieren que la OxLDL
y la LDL modificada con aldehído pueden estar ligadas a la
aterogenosis mediante una secuencia de acontecimientos (revisado en
2, 23). Las células endoteliales expuestas a OxLDL y a LDL
modificada con aldehído secretan moléculas de adhesión, proteínas
quimiotácticas y factores estimulantes de colonias que potencian la
infiltración, la proliferación y la acumulación de
monocitos/macrófagos en la pared arterial. La absorción de OxLDL y
de LDL modificada con aldehído por los macrófagos infiltrados puede
dar como resultado la generación de células espumosas que producen
radicales de oxígeno y que contribuyen por tanto a la oxidación de
LDL. Se ha observado que OxLDL y LDL modificada con aldehído inhiben
la migración de células endoteliales aórticas in vitro,
sugiriendo que la OxLDL y la LDL modificada con aldehído pueden
limitar la respuesta curativa del endotelio después de la lesión y
que el factor de crecimiento de fibroblastos básico invierte la
alteración, asociada con la aterosclerosis, de las respuestas
similares a la angiogénesis coronaria humana in vitro (24,
25). La OxLDL y la LDL modificada con aldehído también pueden
contribuir a una evolución acelerada de la aterosclerosis
coronaria, induciendo la adhesión de plaquetas, disminuyendo las
capacidades anticoagulantes y fibrinolíticas del endotelio activado
y alterando la vasodilatación y la inducción de la tensión de
cizallamiento (2, 23).
Niveles intracelulares incrementados de
ferritina (26) o de análogos de alfa-tocoferol (27)
disminuyen el grado de lesión endotelial producida por OxLDL y LDL
modificada con aldehído, in vitro, mientras que los
antioxidantes protegen contra la evolución de la aterosclerosis en
animales experimentales (revisado en el documento 28).
Resumiendo, el ejemplo presente muestra que la
aterosclerosis posterior al trasplante se correlaciona con los
niveles en plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído.
\vskip1.000000\baselineskip
Niveles en plasma de OxLDL y de LDL modificada
con aldehído y el grado de estenosis de la arteria coronaria,
determinado por angiografía. Grado 0: arterias coronarias normales;
grado I: anormalidades menores con <50% de estenosis de las
ramificaciones primarias o secundarias y función ventricular
izquierda normal; grado II: \geq 50% de estenosis de las
ramificaciones primarias o secundarias, o oclusiones distales con
función ventricular izquierda dañada.
La población de pacientes consistía en 20
pacientes con insuficiencia renal crónica leve (MCRF) y 77 pacientes
con insuficiencia renal crónica grave: 21 con tratamiento
conservador que incluía tratamiento alimenticio y antihipertensor
(SCRF), y 56 con una programación de hemodiálisis de 4 horas, tres
veces a la semana (HEMO) durante 66 meses (95% de CI,
50-82 meses). A todos los pacientes con hemodiálisis
se les suministró una preparación oral de polivitaminas
(Ol-Amine, La Meuse, Bélgica) después de la
hemodiálisis, que contenía sólo cantidades en miligramos de
compuestos antioxidantes (es decir, 5 mg de vitamina E y 100 mg de
vitamina C). Los testigos y los pacientes no dializados no
recibieron prescripciones de rutina de suplementos vitamínicos. La
alta frecuencia de enfermedad aterosclerótica en estos pacientes
(Tabla 6) coincide con datos publicados previamente (29, 30). El
diagnóstico de la enfermedad del corazón aterosclerótica, la
enfermedad cerebrovascular y la enfermedad vascular periférica, se
realizó después de revisar los datos de los pacientes con
antecedentes de infarto de miocardio, angina inestable o
tratamiento anti-angina, ictus, ataque isquémico
transitorio o eventos relacionados con la enfermedad vascular
periférica, tales como úlcera isquémica, amputación o anastomosis
quirúrgica. Los angiogramas estaban disponibles sólo para pocos
pacientes. Ningún paciente tenía indicios de enfermedad
aterosclerótica inestable en el momento de la toma de muestras
sanguíneas ni en los días siguientes. Un grupo de 27 voluntarios
sanos (Tabla 6) sin antecedentes de enfermedad renal o de enfermedad
vascular aterosclerótica, servían como testigos. Los pacientes que
recibieron fármacos hipolipemiantes, fueron excluidos. El estudio
estaba aprobado por el "Institutional Review Board" y las
personas objetos del estudio dieron su autorización por escrito.
Las muestras de sangre venosa de pacientes y
testigos se recogieron en un vol. 0,1 de citrato 0,1 M que contenía
EDTA 1 mM, vitamina E 20 \muM, hidroxitolueno butilado 10 \muM
dipiridamol 20 \muM y teofilina 15 mM para evitar la oxidación de
LDL in vitro y la activación de plaquetas in vitro,
respectivamente. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3.000 g
durante 15 min a temperatura ambiente, en la hora posterior a la
recogida y se almacenaron a -20ºC hasta que se realizaron los
ensayos.
Los títulos de los autoanticuerpos contra OxLDL
y LDL modificada con aldehído y LDL natural se midieron según
Salonen y col. (3), tal y como se describe con más detalle en otro
lugar (5). Los niveles de antígeno vWF se midieron en un ensayo
ELISA de tipo sándwich, basándose en el antisuero policlonal de vWF
de conejo anti-humano (Dako, Glostrup, Dinamarca),
la IgG de vWF de conejo anti-humana conjugada con
peroxidasa de rábano picante (Dako) y
o-fenilendiamina. Los niveles en plasma del
colesterol total, del colesterol HDL y de los triglicéridos se
determinaron empleando ensayos enzimáticos convencionales
(Boehringer Mannheim, Meylon, Francia). Los niveles de colesterol
LDL se calcularon empleando la fórmula de Friedewald. Para los
pacientes que no tenían hemodiálisis, las tasas de aclaramiento de
la creatinina se calcularon a partir de los niveles de creatinina en
plasma, empleando la fórmula de Cockcroft y Gault (31).
Los testigos y los pacientes se compararon con
la prueba de ANOVA, seguida de la prueba de comparación múltiple de
Dunnett, en el programa estadístico Instat V2.05a (Graph Pad
Software, San Diego, CA). Los coeficientes de correlación se
calcularon de acuerdo con Spearman. El análisis de la regresión
múltiple, que empleaba el programa SAS (SAS Institute Inc., EE.UU.)
se realizó para estudiar la relación entre OxLDL y LDL modificada
con aldehído como variables dependientes, y la edad, el sexo, la
hipertensión (tratamiento antihipertensor), los niveles de
triglicéridos, el colesterol HDL, el colesterol LDL y las tasas de
aclaramiento de la creatinina (marcador del grado de insuficiencia
renal) y los niveles de vWF (marcador de la lesión endotelial) como
variables independientes.
Los niveles promedio en plasma de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído en los testigos eran 0,59 mg/dl (CI 95%,
0,52-0,66 mg/dl; n = 27) y eran 2,7 veces superiores
en pacientes con MCRF (p < 0,01 tal y como se determinó con la
prueba de comparación múltiple de Dunnett), 3,1 veces superiores en
pacientes con SCRF (p < 0,001) y 5,4 veces superiores en
pacientes con HEMO (p < 0,001) (Tabla 7). Los niveles de OxLDL y
de LDL modificada con aldehído estaban inversamente correlacionados
con las tasas de aclaramiento de creatinina (r = -0,65; p <
0,001; n = 73). Los pacientes con HEMO no estaban incluidos en este
análisis debido a que no se pudo determinar convenientemente el
aclaramiento de la creatinina en plasma.
En una serie de 14 pacientes hemodializados, los
niveles de OxLDL y de LDL modificada con aldehído eran muy
similares en las muestras de plasma de nuevo aporte y en muestras
congeladas recientemente. Ciclos de 3 congelamientos y
descongelamientos no causaban un incremento de la OxLDL ni de la LDL
modificada con aldehído, indicando que la adición de agentes
antioxidantes y antiplaquetarios evitaban la oxidación in
vitro.
Las muestras de plasma se obtuvieron a partir de
14 pacientes hemodializados en 3 días consecutivos, antes de
comenzar con el proceso de diálisis. Los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído en estas muestras eran muy similares: 3,4
\pm 0,25 mg/dl, 3,2 \pm 0,21 mg/dl y 3,5 \pm 0,28 mg/dl,
respectivamente. Además, las muestras de plasma se obtuvieron
durante (después de 2 horas) y al final (después de 4 horas) de la
hemodiálisis. Los niveles en plasma de OxLDL y de LDL modificada
con aldehído eran 4,0 \pm 0,60 mg/dl y 4,7 \pm 0,70 mg/dl (p =
NS frente a antes) comparados con 3,4 \pm 0,25 mg/dl antes del
inicio del proceso de diálisis. Por tanto, el proceso de
hemodiálisis no inducía un incremento significativo de los niveles
de OxLDL y de LDL modificada con aldehído.
Una información adecuada sobre los hábitos
fumadores estaba disponible sólo para los testigos (27 no fumadores)
y para los pacientes con HEMO (12 fumadores y 45 no fumadores). Los
niveles de OxLDL y de LDL modificada con aldehído eran algo
superiores en los pacientes fumadores con HEMO (3,6 mg/dl; CI 95%,
2,1-5,6 mg/dl) a los de los pacientes no fumadores
con HEMO (3,0 mg/dl; CI 95%, 2,5-3,6 mg/dl; p = NS).
Los niveles en plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído en
pacientes hemodializados con antecedentes de enfermedad
cardiovascular aterosclerótica inestable, eran 3,5 \pm 0,40 mg/dl
(n = 30) comparados con 2,8 \pm 0,60 mg/dl (n = 26, p = NS) en
pacientes hemodializados sin antecedentes de enfermedad
cardiovascular aterosclerótica inestable.
Las fracciones de LDL se aislaron a partir del
plasma de 10 testigos, 10 pacientes con MCRF, 10 pacientes con SCRF
y 10 pacientes con HEMO, mediante filtración en gel en una columna
de Superosa 6HR 10/30, tal y como se ha descrito previamente (5).
75 \pm 6% (media \pm DE), 80 \pm 4%, 83 \pm 6% y 79 \pm 5%
del material inmunorreactivo, se recuperó en las fracciones de LDL.
El material inmunorreactivo no migraba en la posición de la
seroalbúmina. Las curvas de inhibición obtenidas con las fracciones
respectivas de LDL eran paralelas a las obtenidas con preparaciones
de LDL convencionales in vitro, oxidadas con cobre o
modificadas con MDA. La OxLDL y la LDL modificada con aldehído se
aislaron a partir de fracciones de LDL aisladas de 10 pacientes con
SCRF mediante cromatografía de intercambio iónico, sobre una columna
de Sefarosa mono Q con una recuperación del 75%. Sus propiedades
fisicoquímicas se resumen en la Tabla 8. Los niveles de araquidonato
de OxLDL y de LDL modificada con aldehído, aislado a partir de
estos pacientes se redujeron en un 75%, mientras que sus niveles de
linoleato se redujeron en un 80%. Un 37% de los residuos de lisina
de OxLDL estaban sustituidos con aldehídos. Las curvas de
inhibición obtenidas con OxLDL y con LDL modificada con aldehído,
aisladas del plasma de pacientes con insuficiencia renal crónica,
eran paralelas a las obtenidas con OxLDL y LDL modificada con
aldehído que se había obtenido mediante oxidación in vitro de
LDL que se había aislado a partir del plasma de personas testigo
(Figura 3). La proporción de proteína/antígeno y la reactividad
relativa en el ELISA de OxLDL y de LDL modificada con aldehído
aislados a partir del plasma de estos pacientes, era similar a la
de las preparaciones de LDL convencional oxidada con cobre o
modificada con MDA (Tabla 8).
Los títulos de autoanticuerpos contra OxLDL y
LDL modificada con aldehído eran 4,2 (CI 95%,
4,0-4,4) en testigos, eran similares en pacientes
con MCRF y con SCRF, pero se incrementaba significativamente en
pacientes con HEMO (p < 0,001) (Tabla 7). Los títulos de
autoanticuerpos estaban correlacionados con los niveles de OxLDL y
de LDL modificada con aldehído en pacientes con SCRF (r = 0,44; p =
0,047) y en pacientes con HEMO (r = 0,37; p = 0,0055) (Figura 6).
No se pudieron detectar autoanticuerpos circulantes contra la LDL
natural.
Los niveles de vWF eran del 100% en los testigos
(CI 95%, 90-110 porciento) y eran 1,5 veces
superiores en pacientes con MCRF (p = NS frente a testigos), 1,6
veces superiores en pacientes con SCRF (p < 0,01) y 2,1 veces
superiores (p < 0,001) en pacientes con HEMO (Tabla 7). Los
niveles de vWF no eran significativamente superiores en pacientes
con HEMO fumadores (250 porciento; 95%, 150-340
porciento; n = 12) a los de pacientes con HEMO no fumadores (220
porciento; CI 95%, 190-260 porciento; n = 45). Los
niveles de vWF estaban correlacionados con los niveles de OxLDL y
de LDL modificada con aldehído en pacientes con MCRF (r = 0,59; p
< 0,0057), en pacientes con SCRF (r = 0,69; p = 0,0006) y en
pacientes con HEMO (r = 0,62; p < 0,0001) (Figura 7). Por el
contrario, los niveles de vWF no se correlacionaban con los niveles
de colesterol LDL o con el peso corporal.
El análisis de la regresión múltiple reveló que
el grado de insuficiencia renal (F = 14; p = 0,0004) y el grado de
lesión endotelial (F = 26; p = 0,0001) pero no la edad, el sexo, la
hipertensión, los niveles de triglicéridos, los niveles de
colesterol HDL o de colesterol LDL, justifican una fracción
significativa de las variaciones en los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído (Tabla 9). Incluso cuando sólo se incluían
individuos que no tenían indicios de la enfermedad aterosclerótica
isquémica (n = 53), en el modelo (R^{2}-valor =
0,68), únicamente el grado de la insuficiencia renal (F = 21; p=
0,0001) y el grado de la lesión endotelial (F = 14; p = 0,0006)
contribuían significativamente a las variaciones en los niveles de
OxLDL y LDL modificada con aldehído. Ninguna otra variable
contribuía significativamente a estas variaciones después de
excluir a las personas que no tenían indicios de enfermedad
aterosclerótica isquémica. Cuando sólo se incluían personas con
indicios de enfermedad aterosclerótica isquémica (n = 15), sólo
contribuía a las variaciones de los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído, el grado de lesión endotelial (F = 6,2; p
= 0,047; R^{2}-valor = 0,65). La exclusión de los
pacientes diabéticos no cambiaba significativamente los datos.
Después de excluir el grado de insuficiencia renal como una variable
independiente, el análisis de la regresión múltiple reveló que la
hemodiálisis (F = 5,6; p = 0,021; n = 77), los niveles de colesterol
LDL (F = 7,1; p = 0,0095) y la lesión endotelial (F = 35; p =
0,0001) justificaban una fracción significativa de la variación de
los niveles de OxLDL y de LDL modificada con aldehído en los
pacientes con insuficiencia renal crónica grave (Tabla 10).
El trabajo in vitro y los datos de
animales experimentales sugieren que la LDL oxidada (OxLDL y LDL
modificada con aldehído) puede contribuir a la evolución de la
aterosclerosis (revisado en el documento 2) y la OxLDL y la LDL
modificada con aldehído se han observado en las placas
ateroscleróticas humanas (5). El inmunoensayo de esta invención
identifica la OxLDL y la LDL modificada con aldehído (LDL modificada
con MDA) con \geq 60 lisinas sustituidas por molécula de apo
B-100, lo que representa el umbral de sustitución
requerida para la absorción mediada por el receptor fagocitario
(1). Unos niveles incrementados de OxLDL y de LDL modificada con
aldehído se han medido con ELISA en el plasma de pacientes con
insuficiencia renal crónica.
En general, 80 porciento del material
inmunorreactivo aislado a partir del plasma de pacientes, se
recuperó en las fracciones de LDL que se separaron por filtración
en gel. Ningún material inmunorreactivo migraba en la posición de
la albúmina. Las curvas de inhibición obtenidas con la OxLDL y la
LDL modificada con aldehído aisladas, eran paralelas a las de las
preparaciones convencionales de LDL oxidada con cobre o de LDL
modificada con MDA in vitro y la proporción
proteína/antígeno y el valor de la C_{50} de la OxLDL y la LDL
modificada con aldehído aisladas, eran idénticos a los de las
preparaciones convencionales de OxLDL y de LDL modificada con
aldehído. Estos datos sugieren que la inmunorreactividad
incrementada de las fracciones de OxLDL y de LDL modificada con
aldehído en el plasma de estos pacientes, con los anticuerpos de
esta invención, dependían aún más del grado superior de
modificación proteica y no de los cambios en la composición de
lípidos, tal y como se observó previamente con otros anticuerpos
(32). La movilidad electroforética incrementada, la modificación
incrementada de lisinas, la proporción incrementada de
colesterol/proteína, los niveles inferiores de ácido araquidónico y
de linoleato eran muy similares a los de la LDL modificada, extraída
a partir de lesiones ateroscleróticas (21, 22). La OxLDL y la LDL
modificada con aldehído inducían la generación de células espumosas,
sugiriendo que OxLDL y LDL modificada con aldehído no eran LDL
"mínimamente modificadas".
El análisis de la regresión múltiple reveló que
la insuficiencia renal crónica y la lesión endotelial contribuían
significativamente a la variación de los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído, incluso cuando se excluían los pacientes
que tenían indicios de enfermedad isquémica aterosclerótica. Aún
más, 79,6% y 82,4% de las variaciones en los niveles de OxLDL y de
LDL modificada con aldehído se podían aclarar con estos modelos.
Ningún paciente tenía indicios de enfermedad aterosclerótica
inestable en el momento de la toma de muestras sanguíneas, ni en
los días sucesivos y la exclusión de los pacientes con antecedentes
de enfermedad aterosclerótica isquémica, no afectó a la
participación del grado de insuficiencia renal y de la lesión
endotelial a las variaciones en OxLDL y en LDL modificada con
aldehído.
Los niveles de colesterol LDL en los testigos y
en los pacientes eran muy similares y los niveles de colesterol LDL
no contribuyeron en las variaciones de los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído. Sutherland y col., (33) mostraban que el
tiempo de demora para la formación del dieno conjugado, que es una
medida de la sensibilidad de LDL para la oxidación in vitro,
era similar en pacientes con insuficiencia renal crónica y en
testigos compatibles. La tasa máxima y el grado de oxidación de LDL
eran incluso menores en pacientes con insuficiencia renal que en
los testigos, debido a los niveles inferiores de ácido linoleico y a
niveles superiores de ácido oleico. Además, Schulz y col. (34)
mostraron que a pesar del hecho de que la hemodiálisis produce la
activación de leucocitos, el tiempo de demora para la oxidación de
LDL in vitro era similar en pacientes con insuficiencia
renal y en testigos sanos. Se llegó a la conclusión de que la
defensa antioxidativa de las lipoproteínas se conservaba en la
insuficiencia renal y durante la diálisis.
En modelos experimentales, se observó que
antioxidantes tales como el probucol y la vitamina E protegían
contra la lesión glomerular (35, 36) y retrasaban los procesos
aterogénicos (28). La vasoconstricción renal causada por una
alimentación con colesterol se corrigió con probucol o con un
antagonista de tromboxano (35). Galle y col. (38) mostraron que la
inhibición de la dilatación dependiente del endotelio, inducida con
lipoproteína oxidada, se podía evitar con lipoproteínas de alta
densidad que están reducidas significativamente en pacientes
hemodializados. Además, minerales tales como selenio y nutrientes
tales como la coenzima Q10, pueden disminuir la generación de
radicales libres y, por tanto, el estrés oxidativo. El ácido fólico,
la vitamina B12 y la vitamina B6 pueden ser esenciales en la
prevención de la hiperhomocisteinemia que puede contribuir a la
lesión endotelial (39) y a la oxidación de LDL (40) en estos
pacientes. Una dieta rica en ácidos grasos monosaturados (ácido
oleico, resistente a la oxidación) reducía el grado de lesión
endotelial en pacientes con diabetes (41). Por tanto, es posible
que medios alimenticios o farmacológicos puedan reducir la OxLDL y
la LDL modificada con aldehído y el factor de von Willebrand en la
insuficiencia renal crónica y aliviar la aterosclerosis generalizada
elevada en estos pacientes.
Después de ajustar en función del grado de
insuficiencia renal, el análisis de la regresión múltiple reveló
que los niveles de colesterol LDL y de lesión endotelial contribuían
fuertemente a las variaciones de los niveles de OxLDL y de LDL
modificada con aldehído en pacientes con insuficiencia renal crónica
grave.
La hemodiálisis da como resultado una activación
de las plaquetas y los leucocitos (42, 43), lo que genera radicales
de oxígeno y aldehídos que también pueden contribuir a la oxidación
de LDL. La OxLDL y la LDL modificada con aldehído pueden contribuir
a continuación a la trombogénesis y a la aterogénesis estimulando
las plaquetas (44). Debido al número más bien limitado de
pacientes, no se pudo realizar un análisis por subgrupos para
estudiar más a fondo la interacción entre la hemodiálisis, la
oxidación de LDL y la enfermedad aterosclerótica isquémica
(45).
Figura 6. Correlación entre los niveles en
plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído (valores
logarítmicos) y los títulos de autoanticuerpos (valores
logarítmicos): línea de regresión para pacientes con insuficiencia
renal crónica grave, con tratamiento conservador (\ding{115}; - -
-) (r = 0,44; p = 0,047) o con hemodiálisis (\ding{110}; -------)
(r = 0,37; p = 0,0055). No se observó una correlación significativa
en los testigos y en los pacientes con insuficiencia renal crónica
leve.
Figura 7. Correlación entre los niveles en
plasma de OxLDL y de LDL modificada con aldehído (valores
logarítmicos) y el antígeno del factor de von Willebrand (valores
logarítmicos): línea de regresión para pacientes con insuficiencia
renal crónica leve (\ding{108}; -.-.-) (r = 0,59; p = 0,0057) o
para pacientes con insuficiencia renal crónica grave, con
tratamiento conservador (\ding{115}; - - -) (r = 0,69; p = 0,0006)
o con hemodiálisis (\ding{110}; -------) (r = 0,62; p <
0,00001). No se observó una correlación significativa en los
testigos.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la invención, se observó que LDL,
modificada con un tratamiento con malonildialdehído (MDA), es
altamente estable. Además, el grado de modificación es fácilmente
reproducible. La LDL modificada con MDA en una proporción
particular, tiene un número idéntico de lisinas sustituidas y se
puede emplear por tanto como una muestra de referencia en los
ensayos inmunológicos. Este ejemplo muestra la preparación del
patrón.
La LDL modificada con MDA se añadió al plasma
del testigo (que contenía compuestos antioxidantes y
antiplaquetarios y anticoagulantes) hasta tener una concentración
final de apo B-100 modificada con MDA de 100 nM. Se
congelaron partes alícuotas a -80ºC. Al cabo de 6 días se
descongelaron las partes alícuotas, se diluyeron hasta obtener
concentraciones finales en el intervalo de 10 a 0,1 nM de apo
B-100 modificada con MDA y se analizaron con ELISA
(4 curvas de dilución por día).
4. Los coeficientes de variación entre 10
ensayos ELISA de tipo sándwich posteriores de esta invención, que
empleaban 10 preparaciones convencionales posteriores de LDL
modificada con MDA independientes, de esta invención, se resumen en
la Tabla 11.
Estos datos muestran que para las
concentraciones de LDL modificada con MDA en el intervalo de 10 y
0,01 nM, la variación entre los ensayos estaba en el intervalo de
7,6 a 16,9%.
\vskip1.000000\baselineskip
- C_{50}:
- concentración necesaria para obtener 50% de inhibición de la unión del anticuerpo
- MDA:
- malonildialdehído
- HEMO:
- pacientes con insuficiencia renal crónica grave en hemodiálisis de mantenimiento
- MCRF:
- pacientes con insuficiencia renal crónica leve
- SCRF:
- pacientes con insuficiencia renal crónica grave en tratamiento conservador
- OxLDL:
- lipoproteínas de baja densidad oxidadas.
El grupo de datos contenía 107 pacientes. La
enfermedad cardiaca original era en 47 pacientes la cardiomiopatía
dilatada y en 60 pacientes la enfermedad del corazón isquémica. La
estenosis arterial coronaria se determinó angiográficamente. Todos
los parámetros cuantitativos se transformaron logarítmicamente para
obtener una distribución normal de la regresión lineal. Los valores
de Ji-cuadrado se obtuvieron después de ajustar
todas las otras variables.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos representan la media \pm EEM o el
número de pacientes. * valores p determinados por la prueba de la
Ji-cuadrado. ** valores p determinados por la prueba
de comparación múltiple de Dunnett. NS: no significativo.
Los datos representan la media \pm EEM. Los
valores p se determinaron por la prueba de comparación múltiple de
Dunnett. NS: no significativo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los datos representan medias de diez
preparaciones de LDL de pacientes con insuficiencia renal crónica.
La LDL natural y la OxLDL de los pacientes se separaron mediante
cromatografía de intercambio iónico.
\vskip1.000000\baselineskip
El grupo de datos contenía 27 testigos, 20
pacientes con MCRF y 21 pacientes con SCRF. Los valores F se
obtuvieron después de ajustar las otras variables. Las tasas de
aclaramiento de creatinina según Cockcroft se emplearon como un
parámetro cuantitativo para el grado de insuficiencia renal. Todas
las variables lineales se transformaron logarítmicamente para
obtener normalidad en el análisis de la regresión lineal. El valor
R^{2} múltiple del modelo de regresión múltiple era 0,634.
\vskip1.000000\baselineskip
El grupo de datos contenía 21 pacientes con SCRF
y 56 pacientes con HEMO. Todas las variables lineales se
transformaron logarítmicamente para obtener normalidad en el
análisis de la regresión lineal. El valor R^{2} múltiple del
modelo de regresión múltiple era 0,56.
\vskip1.000000\baselineskip
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211-218.
Claims (31)
1. Un ensayo inmunológico para detectar y/o
cuantificar LDL humana modificada con MDA (malonildialdehído) y
OxLDL humana (LDL oxidada) en una muestra obtenida a partir de
fluidos o tejidos corporales de un ser humano, comprendiendo dicho
ensayo:
- (a)
- poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo que tiene una afinidad de al menos aproximadamente 5 x 10^{8} M^{-1} hacia la LDL humana modificada con MDA y la OxLDL; y
- (b)
- a continuación visualizar y/o cuantificar una reacción de ligación entre el primer anticuerpo y la LDL modificada con MDA y la OxLDL presentes en la muestra;
en donde la LDL modificada con MDA
y la OxLDL hacia las cuales el primer anticuerpo tiene una afinidad
de al menos aproximadamente 5 x 10^{8} M^{-1}, contienen al
menos 60 restos de lisina sustituidos por resto de apo
B-100.
2. El ensayo según la reivindicación 1, en el
que la LDL modificada con MDA y la OxLDL, hacia las cuales el
primer anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 5 x
10^{8} M^{-1}, contienen al menos aproximadamente 90 restos de
lisina sustituidos por resto de apo B-100.
3. El ensayo según la reivindicación 1, en el
que la LDL modificada con MDA y la OxLDL, hacia las cuales el
primer anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 5 x
10^{8} M^{-1}, contienen al menos aproximadamente 120 restos de
lisina sustituidos por resto de apo B-100.
4. El ensayo según la reivindicación 1, en el
que la LDL modificada con MDA y la OxLDL, hacia las cuales el
primer anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 5 x
10^{8} M^{-1}, contienen al menos aproximadamente 210 restos de
lisina sustituidos por resto de apo B-100.
5. El ensayo según la reivindicación 1, en el
que la LDL modificada con MDA y la OxLDL, hacia las cuales el
primer anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 5 x
10^{8} M^{-1}, contienen al menos aproximadamente 240 restos de
lisina sustituidos por resto de apo B-100.
6. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que es un ensayo competitivo.
7. El ensayo competitivo según la reivindicación
6, en el que la LDL modificada con MDA y/o la OxLDL se unen a un
sustrato que comprende poner en contacto la muestra y el primer
anticuerpo con el sustrato que se ha unido a la LDL modificada con
MDA y la OxLDL.
8. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que es un ensayo de tipo sándwich en el que
el primer anticuerpo se une a un sustrato, comprendiendo poner en
contacto la muestra con el sustrato al que se ha unido el primer
anticuerpo.
9. El ensayo según la reivindicación 8, en el
que se emplea un segundo anticuerpo y el segundo anticuerpo tiene
una afinidad de al menos aproximadamente 5 x 10^{8} M^{-1} hacia
la LDL modificada con MDA humana y la OxLDL humana.
10. El ensayo según la reivindicación 9, en el
que el segundo anticuerpo tiene una afinidad de al menos
aproximadamente 5 x 10^{8} M^{-1} hacia la LDL natural
humana.
11. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la constante de afinidad del
primer anticuerpo hacia la LDL modificada con MDA y la OxLDL es al
menos aproximadamente 1 x 10^{10} M^{-1}.
12. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que el primer anticuerpo tiene una
afinidad menor que aproximadamente 1 x 10^{7} M^{-1} hacia la
LDL natural humana.
13. El ensayo según la reivindicación 12, en el
que la constante de afinidad del primer anticuerpo hacia la LDL
natural humana es menor que aproximadamente 1 x 10^{6}
M^{-1}.
14. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que el primer anticuerpo es el
anticuerpo monoclonal mAb-4E6 producido por el
hibridoma Hyb4E6, depositado ante la BCCM, con el número de entrada
en el depósito LMBP 1660 CB, el 24 de abril de 1997 o una fecha
cercana.
15. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 10, en el que la constante de afinidad del
segundo anticuerpo hacia la LDL modificada con MDA y la OxLDL es al
menos aproximadamente 1 x 10^{10} M^{-1}.
16. El ensayo según la reivindicación 15, en el
que la constante de afinidad del segundo anticuerpo hacia la LDL
natural humana es al menos aproximadamente 1 x 10^{9}
M^{-1}.
17. El ensayo según la reivindicación 16, en el
que el segundo anticuerpo es el anticuerpo monoclonal
mAb-8A2, producido por el hibridoma Hyb8A2
depositado ante la BCCM con el número de entrada en el depósito LMBP
1661 CB, el 24 de abril de 1997 o una fecha cercana.
18. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, que es un ensayo inmunohistoquímico en el
que la muestra es una muestra de tejido y que se pone en contacto
con el primer anticuerpo.
19. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en el que la muestra se obtiene a partir de
fluidos corporales de un ser humano.
20. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en el que al menos un anticuerpo es capaz
de detectar 0,02 mg/dl de LDL humana modificada con MDA y OxLDL
humana, en plasma humano no diluido.
21. Un ensayo inmunológico de tipo sándwich para
detectar y/o cuantificar LDL humana modificada con MDA en una
muestra obtenida a partir de fluidos o tejidos corporales de un ser
humano, en cuyo ensayo de tipo sándwich, un primer anticuerpo que
tiene una afinidad hacia la LDL humana modificada con MDA, de al
menos aproximadamente 5 x 10^{8} M^{-1}, se une a un sustrato,
comprendiendo dicho ensayo:
- a)
- poner en contacto la muestra con el sustrato al que se ha unido el primer anticuerpo, bajo condiciones de ligación, de modo que al menos alguna de las LDL humanas modificadas con MDA en la muestra se una al primer anticuerpo;
- b)
- a continuación, retirar la muestra no unida del sustrato;
- c)
- a continuación, poner en contacto el sustrato con un segundo anticuerpo que tiene afinidad hacia la LDL humana modificada con MDA; y
- d)
- a continuación, visualizar y/o cuantificar la LDL modificada con MDA que estaba presente en la muestra;
en donde el primer anticuerpo o el
segundo anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 5
x 10^{8} M^{-1} hacia la LDL humana modificada con MDA y la
OxLDL humana;
y
en donde la LDL humana modificada con MDA y la
OxLDL humana contienen al menos 60 restos de lisina sustituidos por
resto de apo B-100.
22. El ensayo según la reivindicación 21, en el
que el segundo anticuerpo tiene una afinidad de al menos
aproximadamente 1 x 10^{9} M^{-1} hacia la LDL natural
humana.
23. El ensayo según la reivindicación 21 o 22,
en el que la afinidad del primer anticuerpo hacia la LDL modificada
con MDA es de al menos aproximadamente 1 x 10^{10} M^{-1}.
24. El ensayo según la reivindicación 21, en el
que el primer anticuerpo es al anticuerpo monoclonal
mAb-1H11, producido por el hibridoma Hyb1H11,
depositado ante la BCCM con el número de entrada en el depósito LMBP
1659 CB, el 24 de abril de 1997 o una fecha cercana.
25. El ensayo según la reivindicación 21, en el
que el primer anticuerpo es al anticuerpo monoclonal
mAb-4E6 producido por el hibridoma Hyb4E6,
depositado ante la BCCM con el número de entrada en el depósito LMBP
1660 CB, el 24 de abril de 1997 o una fecha cercana.
26. El ensayo según la reivindicación 21, en el
que el segundo anticuerpo es el anticuerpo monoclonal
mAb-8A2 producido por el hibridoma Hyb8A2,
depositado ante la BCCM con el número de entrada en el depósito LMBP
1661 CB, el 24 de abril de 1997 o una fecha cercana.
27. El ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 21 a 26, en el que al menos un anticuerpo es capaz
de detectar 0,02 mg/dl de LDL humana modificada con MDA en plasma
humano sin diluir.
28. El anticuerpo monoclonal
mAb-4E6 producido por el hibridoma Hyb4E6,
depositado ante la BCCM con el número de entrada en el depósito
LMBP 1660 CB, el 24 de abril de 1997 o una fecha cercana.
29. El hibridoma Hyb4E6, depositado ante la BCCM
con el número de entrada en el depósito LMBP 1660 CB, el 24 de
abril de 1997 o una fecha cercana.
30. El anticuerpo monoclonal
mAb-8A2 producido por el hibridoma Hyb8A2,
depositado ante la BCCM con el número de entrada en el depósito
LMBP 1661 CB, el 24 de abril de 1997 o una fecha cercana.
31. El hibridoma Hyb8A2, depositado ante la BCCM
con el número de entrada en el depósito LMBP 1661 CB, el 24 de
abril de 1997 o una fecha cercana.
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