DE69738503T2

DE69738503T2 - Versuchsanordnungen, antikörper und standards für den nachweis von oxidierten und mda-modifizierten lipoproteinen geringer dichte

Info

Publication number: DE69738503T2
Application number: DE69738503T
Authority: DE
Inventors: Paul Noel Holvoet; Desire Jose Collen
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 1997-06-20
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2017-07-02
Also published as: ATE385575T1; NZ502369A; JP2002512695A; EP1021728B8; ES2299186T3; CA2294355C; DE69738503D1; CA2294355A1; AU3442397A; WO1998059248A1; EP1021728B1; EP1021728A1; JP4233120B2

Description

Hintergrund
Diese Erfindung betrifft Tests, Antikörper (insbesondere monoklonale Antikörper) und Standards für die Detektion (d. h. Bestimmung der Gegenwart und/oder Quantifizierung der Menge) von oxidiertem Lipoprotein geringer Dichte (OxLDL) und Malondialdehydmodifiziertem Lipoprotein geringer Dichte (MDA-modifiziertem LDL) in Proben, wobei die Proben typischerweise von Körperflüssigkeiten oder Geweben stammen.
Lipoproteine sind Multikomponentenkomplexe aus Protein und Lipiden. Jede Art von Lipoprotein weist ein charakteristisches Molekulargewicht, Größe, chemische Zusammensetzung, Dichte und physische Rolle auf. Das Protein und das Lipid werden durch nicht-kovalente Kräfte zusammengehalten.
Lipoproteine können basierend auf ihrer Dichte, die durch Ultrazentrifugation bestimmt wird, klassifiziert werden. Daher können vier Klassen von Lipoproteinen unterschieden werden: Lipoproteine hoher Dichte (HDL), Lipoproteine mittlerer Dichte (IDL), Lipoproteine geringer Dichte (LDL) und Lipoproteine sehr geringer Dichte (VLDL).
Die gereinigten Proteinkomponenten eines Lipoproteinteilchens werden Apolipoproteine (Apo) genannt. Jede Art von Lipoprotein weist eine charakteristische Apolipoprotein-Zusammensetzung auf. In LDL ist das prominente Apolipoprotein-Protein Apo B-100. Apo B-100 ist eines der längsten bekannten Einzelkettenpolypeptide und besteht aus 4536 Aminosäuren. Von diesen Aminosäuren können die Lysinreste oder -gruppen (es gibt 356 solcher Lysinreste oder -gruppen) durch Aldehyde (z. B. Malondialdehyd) substituiert oder modifiziert werden.
Die Oxidation der Lipide in LDL (ob in vitro, z. B. durch Kupfer-induzierte Oxidation, oder in vivo) führt zu der Erzeugung reaktiver Aldehyde, die dann mit den Lysinresten oder -gruppen von Apo-B-100 Wechselwirken können. Das Ergebnis dieser Lysinsubstitution oder -modifikation besteht darin, dass das erhaltene OxLDL, das ebenfalls MDA-modifiziertes LDL ist, nicht mehr durch den LDL-Rezeptor an der Oberfläche von Fibroblasten erkannt wird, sondern durch Scavenger-Rezeptoren an der Oberfläche von Makrophagen. Mindestens 60 der 356 Lysine (oder Lysinreste oder -gruppen) von Apo-B-100 müssen substituiert werden, um durch die Scavenger-Rezeptoren erkannt zu werden (siehe Dokument Nr. 1 der Dokumente, die in der Nähe des Endes dieser Anmeldung aufgeführt sind). Die Aufnahme von solchem OxLDL durch Makrophagen führt zur Schaumzellerzeugung, die als Anfangsschritt bei der Arteriosklerose betrachtet wird.
Endothelzellen unter oxidativem Stress (z. B. bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt) und aktivierte Blutplättchen erzeugen ebenfalls Aldehyde, die mit den Lysingruppen in Apo-B-100 Wechselwirken, was zu der Erzeugung von Aldehyd-modifiziertem LDL führt, das ebenfalls durch die Scavenger-Rezeptoren erkannt wird. Die Lipide in diesem Aldehyd-modifizierten LDL sind jedoch nicht oxidiert. Die enzymatische Aktivität in Makrophagen (z. B. Myeloperoxidase) führt zu der Oxidation sowohl der Lipid- als auch der Proteingruppen von LDL. All diese Wege führen zu einer Aldehydtyp-Modifizierung der Proteingruppe von LDL.
In vitro Experimente und Experimente in Tiermodellen haben nahegelegt, dass OxLDL und/oder Aldehyd-modifiziertes LDL zu dem Fortschreiten von Arteriosklerose beitragen könnten, indem sie eine Endotheldysfunktion, Schaumzellerzeugung, Proliferation glatter Muskelzellen und Plättchenaktivierung hervorrufen (siehe Dokument Nr. 2 für einen Überblick). Eine positive Korrelation zwischen den Gehalten von Autoimmunantikörpern, die mit Aldehyd-modifiziertem LDL kreuzreagieren, und der Progression von arteriosklerotischen Karotisläsionen in Patienten deuteten darauf hin, dass OxLDL und/oder Aldehyd-modifiziertes LDL zur Progression menschlicher Arteriosklerose beitragen könnten (siehe Dokument 3).
Die Möglichkeit, dass Autoimmunantikörper gegen andere Aldehyd-modifizierte Proteine, z. B. Albumin, gerichtet sein könnten, konnte nicht ausgeschlossen werden. Daher könnte der Beitrag von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL (ob von der Oxidation der Lipidgruppe stammend oder nicht) zu menschlicher Arteriosklerose festgestellt werden, wenn nicht-invasive Tests, die für diese Substanzen spezifisch sind (d. h. eine hohe Affinität für jene Substanzen bevorzugt gegenüber anderen Substanzen) verfügbar werden.
Da die grundlegenden Mechanismen der Oxidation von LDL in unterschiedlichen Patientenpopulationen (z. B. bei Diabetespatienten, Patienten mit chronischem Nierenversagen, Patienten mit Herztransplantat) unterschiedlich sein können, und da mindestens einige der Mechanismen unabhängig von Lipidoxidation sein können, sollten solche Tests sowohl für OxLDL als auch für Aldehyd-modifiziertes LDL (z. B. MDA-modifiziertes LDL) spezifisch sein und daher bevorzugt auf der Detektion von Konformationsänderungen basieren, die spezifisch in der Apo-B-100-Gruppe von LDL als Folge der Aldehyd-Typ-Substitution von Lysinresten auftreten. In anderen Worten gibt es einen Bedarf für solche nicht-invasive Tests (d. h. Assays), die für die Analyten von Interesse (d. h. MDA-modifiziertes LDL und OxLDL) hochspezifisch sind. Es besteht ebenfalls ein Bedarf für Antikörper, die für die Analyten von Interesse spezifisch sind. Es besteht ebenfalls ein Bedarf für einen stabilen Standard (z. B. um als Kalibrator und/oder Kontrolle verwendet zu werden) für die Tests.
Die veröffentlichte Anmeldung EP 0 484 863 A1 betrifft monoklonale Antikörper gegen „menschliches MDA-modifiziertes LDL" und „MDA-modifiziertes LDL vom reduzierten Typ", wie die Anmeldung sie bezeichnet. Diagramme zeigen Reaktivitäten unterschiedlicher monoklonaler Antikörper gegenüber jenen Substanzen und gegenüber menschlichem LDL sowie die Ergebnisse von Tests für jene Substanzen.
Holvoet et al., „Malondialdehyde-Modified Low Density Lipoproteins In Patients With Atherosclerotic Disease,", J. Clin. Invest. 1995; 95:2611–2619 diskutiert einen monoklonalen Antikörper mAb-1H11, der gegen MDA-modifiziertes LDL gezüchtet wurde, und der verwendet wurde, um kreuzreagierendes Material in menschlichem atheromatösem Gewebe und in Plasma zu detektieren.
Palinski et al., „Antisera And Monoclonal Antibodies Specific For Epitopes Generated During Oxidative Modification Of Low Density Lipoprotein," Arteriosclerosis 1990; 10(3): 325–335 stellt fest, dass eine steigende Zahl von Beobachtungen nahelegt, dass eine oxidative Modifikation von LDL in vivo auftritt und eine wichtige Rolle bei der Atherogenese spielt. Der Artikel berichtet über polyklonale und monoklonale Antikörper, die unter Verwendung von MDA-modifiziertem LDL, Kupfer-oxidiertem LDL und 4-Hydroxynonenal-LDL entwickelt wurden. Die Autoren weisen darauf hin, dass diese Antikörper sich bei der Untersuchung der Rolle von oxidativ modifizierten Lipoproteinen sowie anderen oxidativ modifizierten Proteinen in der Atherogenese als nützlich erweisen sollten.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Erfindung, welche den oben beschriebenen Bedürfnissen genügt und andere Merkmale und Vorteile aufweist, die sich dem Fachmann offenbaren, ist nun entwickelt worden. Diese Erfindung stellt Antikörper-basierte Tests bereit, die spezifisch sowohl OxLDL als auch Aldehyd-modifiziertes LDL oder MDA-modifiziertes LDL in Proben quantitativ bestimmen (quantifizieren) können, z. B. in Proben, die aus Körperflüssigkeiten (wie Plasma oder Serum) oder Geweben stammen. Diese Erfindung stellt außerdem monoklonale Antikörper bereit, die in jenen Tests nützlich sind, und Zelllinien (Hybridome), welche jene Antikörper herstellen. Diese Erfindung stellt außerdem einen lagerstabilen Standard bereit, der als Kalibrator verwendet werden kann und als Kontrolle für die Tests. Eine solchen Standard zu haben, ist notwendig, um zuverlässige und reproduzierbare und daher nützliche Tests zu haben.
Allgemein betrifft ein Aspekt dieser Erfindung einen immunologischen Test für die Detektion und/oder Quantifizierung von MDA-modifiziertem LDL und OxLDL in einer Probe, wobei der Test umfasst:

a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem ersten Antikörper, der eine hohe Affinität für MDA-modifiziertes LDL und OxLDL aufweist; und
b) danach Visualisieren und/oder Quantifizieren einer Bindungsreaktion zwischen dem ersten Antikörper und dem in der Probe vorhandenen MDA-modifizierten LDL und OxLDL;

Jener Test kann z. B. ein kompetitiver (konkurrierender) Test, ein Sandwichtest, ein immunohistochemischer Test usw. sein. „Kompetitive Tests" sind wohlbekannt, und jeder kompetitive Test kann in dieser Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass er innerhalb der Grenzen der Erfindung liegt und dass die Vorteile der Erfindung erreicht werden können. „Sandwichtests" sind wohlbekannt, und jeder Sandwichtest kann in dieser Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass er innerhalb der Grenzen der Erfindung liegt und dass die Vorteile der Erfindung erreicht werden können. „Immunohistochemische Tests" sind wohlbekannt, und jeder immunohistochemische Test kann in dieser Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, dass er innerhalb der Grenzen der Erfindung liegt und dass die Vorteile der Erfindung erreicht werden können.
In einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung einen immunologischen Sandwichtest für die Detektion und/oder Quantifizierung von MDA-modifiziertem LDL in einer Probe, wobei in dem Test ein erster Antikörper, der eine hohe Affinität für MDA-modifiziertes LDL aufweist, an ein Substrat gebunden ist, wobei der Test umfasst:

(a) In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Substrat, das an sich gebunden den ersten Antikörper unter Bindungsbedingungen aufweist, so dass mindestens einige jeglicher MDA-modifizierter LDL in der Probe an den ersten Antikörper binden;
(b) danach Entfernen der ungebundenen Probe von dem Substrat;
(c) danach In-Kontakt-Bringen des Substrats mit einem zweiten Antikörper, der eine hohe Affinität für MDA-modifiziertes LDL aufweist; und
(d) danach Visualisieren und/oder Quantifizieren des MDA-modifizierten LDL, das in der Probe vorhanden war;

Der Begriff „hohe Affinität", wie er hier (einschließlich der Ansprüche) verwendet wird, bedeutet eine Affinitätskonstante (Assoziierungskonstante) von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1, wünschenswerterweise mindestens 1 × 10⁹ M^–1, bevorzugt mindestens ungefähr 1 × 10¹⁰ M^–1 und am stärksten bevorzugt von mindestens ungefähr 1 × 10¹¹ M^–1. Der Begriff „niedrige Affinität", wie er hier (einschließlich der Ansprüche) verwendet wird, bedeutet eine Affinitätskonstante (Assoziierungskonstante) von weniger als ungefähr 1 × 10⁷ M^–1, wünschenswerterweise weniger als ungefähr 1 × 10⁶ m^–1 und bevorzugt weniger als ungefähr 1 × 10⁵ M^–1. Affinitätskonstanten werden gemäß dem geeigneten Verfahren, das in Holvoet et al. (4) beschrieben ist, bestimmt.
Die Antikörper, die in dieser Erfindung verwendet werden können, binden mit MDA-modifiziertem LDL und/oder OxLDL, dessen Apo-B-100-Reste mindestens 60, wünschenswerterweise mindestens ungefähr 90, stärker wünschenswerterweise mindestens ungefähr 120, bevorzugt mindestens ungefähr 180, stärker bevorzugt mindestens 210 und am stärksten bevorzugt mindestens ungefähr 240 substituierte Lysinreste pro Apo-B-100-Rest aufweisen. Der Bereich der Lysin-Substitution wird im Allgemeinen von 60 bis ungefähr 240, und bevorzugt von ungefähr 120 bis ungefähr 240 substituierte Lysinreste pro Apo-B-100-Rest reichen.
Jeder neue monoklonale Antikörper ist hochspezifisch für ein Konformationsepitop, das vorhanden ist, wenn mindestens ungefähr 60, bevorzugt mindestens ungefähr 120 Lysinreste substituiert sind, und können dadurch unterschiedliche Markierungssubstanzen oder Indikationen, die Arteriosklerose betreffen, unterscheiden. Antikörper, die Epitope erkennen, die vorhanden sind, wenn weniger als ungefähr 60 Lysine substituiert oder modifiziert sind, sind weniger spezifisch, aber dennoch nützlich (z. B. können sie als der sekundäre Antikörper in einem Sandwich-ELISA verwendet werden).

Die bevorzugten Antikörper, die hier verwendet werden, sind monoklonale Antikörper mAb-4E6, mAb-1h11 und mAb-8A2. Deren Affinitätskonstanten für natives LDL, MDA-modifiziertes LDL und OxLDL sind wie folgt:

Antikörper	Natives LDL	MDA-modifiziertes LDL	OxLDL
mAb-4E6	weniger als 1 × 10⁶	3 × 10¹⁰	2 × 10¹⁰
mAb-1H11	weniger als 1 × 10⁶	3 × 10¹⁰	weniger als 1 × 10⁶
mAb-8A2	5 × 10⁹	1 × 10¹⁰	1 × 10¹⁰

In noch einem weiteren Aspekt betrifft diese Erfindung (a) den monoklonalen Antikörper mAb-4E6, hergestellt von dem Hybridom Hyb4E6, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1660 CB an dem oder um den 24. April 1997, (b) den monoklonalen Antikörper mAb-8A2, hergestellt von dem Hybridom Hyb8A2, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1661 CB an dem oder um den 24. April 1997, (c) das Hybridom Hyb4E6, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1660 CB an dem oder um den 24. April 1997, und (d) das Hybridom Hyb8A2, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1661 CB an dem oder um den 24. April 1997.
Die Antikörper, die in den Tests dieser Erfindung verwendet werden, sind bevorzugt jene zwei (d. h. mAb-4E6 und mAb-8A2) sowie mAb-1H11. Die Zelllinie für den Antikörper mAb-1H11 wird durch das Hybridom Hyb1H11 hergestellt, das bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1659 CM an dem oder um den 24. April 1997 hinterlegt wurde.
Die BCCM ist die Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (belgische koordinierte Sammlungen von Mikroorganismen), autorisiert durch den „Budapester Vertrag vom 28. April 1977 über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentverfahrens". Ihre Adresse ist c/o The University of Gent, K. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgien.
Der Assay kann von einer wohlbekannten Art sein, wie etwa ein heterologer Enzym-Immunassay (ELISA). Zum Beispiel können im Fall eines Sandwich-ELISA mAb-4E6 (für MDA-modifiziertes LDL und OxLDL) oder mAb-1H11 (für MDA-modifiziertes LDL) an ein festes Substrat gebunden werden und anschließend mit einer zu testenden Probe in Kontakt gebracht werden. Nach Entfernen der Probe kann eine Bindung zwischen dem spezifischen Antikörper und OxLDL und/oder MDA-modifiziertem LDL, das aus der Probe eingefangen wurde, visualisiert und/oder quantifiziert werden durch Detektionsmittel. Detektionsmittel kann ein markierter, weniger spezifischer sekundärer Antikörper sein, der einen anderen Teil des Apo-B-100-Rests des eingefangenen Analyten erkennt (z. B. mAb-8A2).
Im Falle eines kompetitiven ELISA kann ein festes Substrat, das mit OxLDL oder MDA-modifizierten LDL beschichtet ist, für einen vorgegebenen Zeitraum mit dem monoklonalen Antikörper mAb-4E6 und einer Probe, von der man annimmt oder weiß, dass sie OxLDL und/oder MDA-modifiziertes LDL enthält, in Kontakt gebracht werden, und nach diesem Zeitraum werden ungebundene Antikörper und Probe entfernt, und eine Bindungsreaktion zwischen Antikörper und OxLDL und/oder MDA-modifiziertem LDL, die an das Substrat gebunden sind, wird visualisiert und/oder quantifiziert.
Die Quantifizierung in einem kompetitiven ELISA ist indirekt, da nicht die Bindung zwischen dem Antikörper und dem Analyten in der Probe gemessen wird, sondern stattdessen die Menge an Antikörper, die an die bekannte Menge von OxLDL oder MDA-modifiziertem LDL bindet, das auf das Substrat aufgetragen (daran gebunden) ist, gemessen wird. Je mehr Antikörper an die bekannte Menge von OxLDL oder MDA-modifiziertem LDL, das auf das Substrat aufgetragen ist, gebunden ist, desto weniger Analyt war in der Probe.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft diese Erfindung einen stabilen Standard, der MDA-modifiziertes LDL enthält, dessen Substitutionsgrad seiner Lysinreste über normale Zeiträume während normaler Lagerung für biologische Materialien im Wesentlichen konstant bleibt, wobei das MDA-modifizierte LDL dieses Standards hergestellt wird durch In-Kontakt-Bringen (Inkubieren) von Malondialdehyd mit LDL in einem vorgegebenen Molverhältnis von Malondialdehyd zu dem Apo-B-100-Rest des LDL.
„Über normale Zeiträume während normaler Lagerung für biologische Materialien", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Zeiträume und Bedingungen, unter denen biologische Materialien für die Verwendung in Tests und anderer Laborarbeit typischerweise gelagert werden. Diese Bedingungen umfassen typischerweise niedrige Temperaturen und in angemessenen Fällen Einfrieren, entweder mit oder ohne Lyophilisierung. Abhängig von dem bestimmten biologischen Material kann das Material, wenn das Material unter der angemessenen Temperatur und weiteren Bedingungen (z. B. fehlende Vibration oder andere Bewegung, geeignete Luftfeuchtigkeit) gelagert wird, für mindestens drei Monate, wünschenswerterweise für über ein Jahr, bevorzugt für über zwei Jahre und am stärksten bevorzugt für über drei Jahre stabil sein.
Der Standard enthält bevorzugt ein Mittel, das die Fähigkeit jeglicher vorhandener Metallionen zum Katalysieren der Oxidation des LDL verringert (z. B. ein Chelatisierungsmittel, wie etwa EDTA) und/oder ein oder mehrere Antioxidantien (z. B. BHT und/oder Vitamin E). Bevorzugt werden sowohl das Mittel, das die Fähigkeit jeglicher vorhandener Metallionen zum Katalysieren der Oxidation des LDL verringert, als auch das Antioxidans verwendet. Es ist überraschenderweise herausgefunden worden, dass, wenn ein Antikörper verwendet wird, der sowohl für OxLDL als auch MDA-modifiziertes LDL spezifisch ist, der lagerstabile Standard dieser Erfindung (der MDA-modifiziertes LDL und nicht OxLDL enthält) verwendet werden kann. Daher ist es nicht notwendig zu versuchen, einen stabilen Standard, der OxLDL enthält, zu formulieren, zu lagern und zu verwenden. OxLDL kann unter typischen Lagerbedingungen weiterhin oxidieren, was die Verwendung einer Zusammensetzung, die OxLDL enthält, als Standard schwierig macht, wenn nicht sogar beinahe unmöglich. EDTA wird typischerweise in Konzentrationen von 0,5 bis 5 mM, bevorzugt in Konzentrationen von 0,5 bis 2 mM verwendet. BHT wird typischerweise in Konzentrationen von 5 bis 50 μmol, bevorzugt in Konzentrationen von 10 bis 20 μmol verwendet. Vitamin E wird typischerweise in Konzentrationen von 5 bis 50 μmol, bevorzugt in Konzentrationen von 10 bis 20 μmol verwendet. Der Standard kann ebenfalls Antiplättchenmittel und Koagulationsinhibitoren enthalten.
Es ist herausgefunden worden, dass LDL, das durch Behandlung mit MDA modifiziert worden ist, hochstabil ist. Solches MDA-modifiziertes LDL (das nicht oxidiert ist, d. h. seine Lipidgruppe ist nicht oxidiert) könnte zu Referenzplasmaproben gegeben werden, und jene Proben könnten gefroren und aufgetaut werden, ohne den Grad der Lysin-Substitution zu steigern. Da die Gesamtzahl der Lysinreste in allen Apo-B-100-Molekülen identisch ist, führt ein konstantes MDA/Apo-B-100-Molverhältnis in der Reaktionsmischung zu einer identischen Zahl substituierter Lysine in dem MDA-modifizierten LDL. Im Gegensatz dazu fuhrt z. B. eine Metallionen-vermittelte Oxidation von LDL letztendlich zu einem variablen Grad an Lysin-Substitution, da er von der Oxidationsempfindlichkeit des LDL-Präparats abhängt, die an sich von der Fettsäurezusammensetzung und dem Antioxidansgehalt abhängt, die selbst bei gesunden Kontrollindividuen hochvariabel sind.
Wie unten beschrieben wird, wurde eine Korrelation zwischen der Oxidation von LDL und dem Grad von Posttransplantat-Arteriosklerose bei Herztransplantatpatienten unter Verwendung dieser Erfindung festgestellt. Die Beziehung zwischen Endothelschädi gung und der Modifizierung von LDL wurde bei Patienten mit chronischem Nierenversagen festgestellt, die ein hohes Risiko für arteriosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen tragen. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Endothelschädigung ein Anfangsschritt bei der Arteriosklerose ist.
Gestützt auf die Eigenschaften des oxidativ modifizierten LDL aus dem Plasma von Patienten mit Herztransplantat und chronischem Nierenversagen wurde geschlossen, dass Zell-vermittelte Aldehydmodifikation unabhängig von Lipidoxidation mindestens teilweise beteiligt war. Diese Erkenntnis unterstützte zusätzlich die Hypothese, dass ein Test für oxidativ modifiziertes LDL sowohl OxLDL als auch Aldehyd-modifiziertes LDL detektieren muss.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Kit zum Durchführen eines Sandwichtests für die Bestimmung von OxLDL oder MDA-modifiziertem LDL oder beiden in einer Probe, wobei das Kit ein Substrat umfasst, auf dem ein erster Antikörper gebunden ist, der eine hohe Affinität für OxLDL oder MDA-modifiziertes LDL oder beide aufweist, wobei das OxLDL und MDA-modifizierte LDL jeweils mindestens 60 substituierte Lysinreste pro Apo-B-100-Rest aufweisen, und einen markierten Antikörper, der eine hohe Affinität für OxLDL aufweist, das an den ersten Antikörper während des Tests gebunden wird, oder für MDA-modifiziertes LDL, das an den ersten Antikörper während des Tests gebunden wird, oder für beide, die während des Tests an den ersten Antikörper gebunden werden. Bevorzugt umfasst das Kit weiterhin eine reaktive Substanz zur Reaktion mit dem markierten Antikörper (z. B. ein Enzym), um eine Anzeige der Gegenwart des markierten Antikörpers zu ergeben. Bevorzugt umfasst das Kit außerdem die stabilen Standards, z. B. in der Form von stabilen Kalibratoren und/oder stabilen Kontrollen. Somit kann der gebundene Antikörper z. B. mAb-4E6 oder mAb-1H11 sein, und der markierte Antikörper kann mAb-8A2 sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die begleitenden Zeichnungen sind vorgesehen, um weiter bei der Beschreibung der Erfindung zu helfen, wobei die Zeichnungen wie folgt sind:
1 zeigt die Korrelation zwischen Mengen von oxidiertem und MDA-modifiziertem LDL in Watanabe-Kaninchen mit vererblicher Hyperlipidämie (A) und bei Zwergschweinen (B).
2 zeigt die Akkumulation von OxLDL und MDA-modifiziertem LDL in Koronararterien von Kardialexplantaten von ischämischer Herzkrankheit, aber nicht von dilatierten Kardiomyopathiepatienten.
3 zeigt die Inhibierung der Bindung von mAb-4E6 an immobilisiertes OxLDL durch natives LDL, OxLDL und MDA-modifiziertes LDL in Lösung.
4 zeigt eine typische Standardkurve, die mit MDA-modifiziertem LDL in einem Sandwich-ELISA erhalten wurde.
5 zeigt die Gehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL in Posttransplantatplasmaproben von Herztransplantatpatienten mit unterschiedlichen Graden von angiographisch beurteilter Koronararterienstenose.
6 zeigt die Korrelation zwischen Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL und Titern von spezifischen Autoantikörpern.
7 zeigt die Korrelation zwischen Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL und von von-Willebrand-Faktor-Antigen.
Diese Zeichnungen sind nur zum Zwecke der Veranschaulichung vorgesehen und sollten nicht verwendet werden, um die Erfindung unangemessen einzuschränken.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung wird weiter in Verbindung mit den folgenden Beispielen beschrieben, die der Veranschaulichung dienen und nicht für eine unangemessene Einschränkung der Erfindung verwendet werden sollten.
Beispiele
Beispiel 1
Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern, die für OxLDL und für Aldehydmodifiziertes LDL spezifisch sind
Balb/c-Mäuse wurden durch intravenöse und intraperitoneale Injektion von entweder OxLDL oder MDA-modifiziertem LDL immunisiert. OxLDL wurde durch in vitro Inkubation von LDL (Apo-B-100-Endkonzentration 700 μg/ml) mit Kupferchlorid (Endkonzentration 640 μmol) für 16 Stunden bei 37°C erhalten. MDA-modifiziertes LDL wurde durch Inkubation von LDL (Apo-B-100-Endkonzentration 700 μg/ml) mit einer 0,25 M MDA-Lösung für 3 Stunden bei 37°C hergestellt. Die Zahlen substituierter Lysine, die in dem TBARS-Test gemessen wurden, betrugen typischerweise 210 pro Apo-B-100-Molekül für OxLDL und 240 für MDA-modifiziertes LDL. Hybridome wurden durch die PEG-induzierte Fusion von Milzlymphozyten erhalten, die aus immunisierten Mäusen mit P3-X63/Ag-6.5.3 Myelomzellen gemäß Standardtechniken (4) stammten. Das Screening nach Hybridomen, die spezifische Antikörper produzieren, wurde mit ELISA unter Verwendung von Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit Malondialdehydmodifiziertem LDL oder Kupfer-oxidiertem LDL beschichtet waren. 308 Hybridome wurden nach Immunisierung von Mäusen mit entweder OxLDL (211) oder MDA-modifiziertem LDL (97) erhalten. Hyb4E6 produzierte Antikörper, die sowohl für Malondialdehyd-modifiziertes und Kupfer-oxidiertes LDL spezifisch waren (mAb-4E6), und Hyb1H11 produzierte Antikörper, die nur für Malondialdehyd-modifiziertes LDL spezifisch waren (mAb-1H11). Die IgG-Fraktion der Antikörper wurde durch Affinitätschromatographie auf Protein-A-Sepharose gereinigt, und die Affinität der gereinigten IgGs wurde in einem Festphasenradioimmuntest und/oder in ELISA bestimmt. Die K_a-Werte des monoklonalen Antikörpers mAb-4E6 waren < 10⁶ M^–1 für natives LDL und > 10⁹ M^–1 für Malondialdehyd-modifiziertes LDL und Kupfer-oxidiertes LDL. Die K_a-Werte für den monoklonalen Antikörper mAb-1H11 waren < 10⁶ M^–1 sowohl für LDL als auch OxLDL und > 10⁹ M^–1 für Malondialdehyd-modifiziertes LDL. Die K_a-Werte für den monoklonalen Antikörper mAb-8A2, der nach Immunisierung der Mäuse mit LDL erhalten wurde, waren > 10⁹ M^–1 für alle LDL-Formen. Lipidentfernung aus MDA-modifiziertem LDL und OxLDL führte zu einem Verlust der Immunreaktivität von mAb-4E6, was darauf hindeutet, dass dieser gegen ein Konformationsepitop in der Proteingruppe von oxidativ modifiziertem LDL gerichtet ist.
Beispiel 2
Verwendung von mAb-4E6 für die Quantifizierung von OxLDL und MDA-modifiziertem LDL in Koronarläsionen von Watanabe-Kaninchen mit vererblicher Hyperlipidämie und Zwergschweinen auf einer Cholesterin-reichen Diät
Koronararterien wurden aus 2 und 5 Monate alten Watanabe-Kaninchen mit vererblicher Hyperlipidämie (n = 30) auf normalem Futter oder von Miniaturschweinen (n = 26) erhalten, die mit einer Diät ernährt wurden, die angereichert war hinsichtlich Cholesterin (4%), gesättigtem Fett (14% Rindertalg) und Gallenextrakt (1%) für 6 bis 24 Wochen.
Arterienproben wurden innerhalb von 30 Minuten nach Entfernung in PBS (pH 7,4), das 4% Saccharose, 20 μmol Vitamin E und 10 μmol butyliertes Hydroxytoluol als Antioxidantien und 1 mmol EDTA enthielt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Gefrorene 7-μmol-Abschnitte wurden mit Hämatoxilin und Eosin und mit Ölrot 0 gefärbt, oder, wie unten beschrieben, immungefärbt. Morphometrische Parameter von arteriosklerotischen Läsionen wurden durch Planimetrie unter Verwendung des Leica 2 Quantimet Farbbildanalysators (Cambridge, UK) gemessen. Die Fläche innerhalb der äußeren elastischen Lamina, die innere klastische Lamina und das Lumen wurden gemessen. Die Media wurde als die Fläche zwischen der inneren und äußeren klastischen Lamina gemessen. Intima wurde als die Fläche innerhalb der inneren elastischen Lamina definiert, die nicht durch das Gefäßlumen belegt war.
Oxidierte Apo-B-100-enthaltende Lipoproteine wurden mit dem spezifischen monoklonalen Antikörper mAb-4E6, Alkalische-Phosphatase-konjugierten Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörpern und dem Fuchsin-alkalisches-Phosphat-Substratsystem (Dako, Carpinteria, CA) detektiert, und die Absorbanz wurde in dem Farbbildanalysator gemessen. Die Spezifität der Immunfärbung wurde durch Inhibierung der Färbung mit einem Überschuss an Kupfer-oxidiertem LDL, aber nicht mit nativem LDL oder mit Malondialdehyd-modifiziertem Albumin bestätigt. Die Färbung co-lokalisierte mit dem monoklonalen Antikörper mAb-13F6, der für Apo-B-100 spezifisch ist. Die Absorbanz (ungefähr 10%), die mit überschüssigem Kupfer-oxidiertem LDL gemessen wurde, wurde als Darstellung der Hintergrundfärbung angenommen.
1 zeigt die Korrelation zwischen den Gehalten von oxidierten Apo-B-100-enthaltenden Lipoproteinen, d. h. OxLDL und MDA-modifiziertem LDL, in den Läsionen und der mittleren Intimafläche von Koronarläsionen in Watanabe-Kaninchen mit Hyperlipidämie (A) und in Zwergschweinen (B). Diese Daten zeigen somit eine Korrelation zwischen der Akkumulation von OxLDL und MDA-modifiziertem LDL und der Progression von koronaren arteriosklerotischen Läsionen an zwei unterschiedlichen Tiermodellen. Bei Watanabe-Kaninchen ist die Progression der Läsionen auf das Ansteigen von LDL-Cholesterin, das mit dem vererblichen LDL-Rezeptor mangel verknüpft ist, zurückzuführen, während die Progression bei den Zwergschweinen auf einen Diät-induzierten Anstieg von LDL-Cholesterin zurückzuführen ist.
Beispiel 3
Immunhistochemie
1. Einleitung
Dieses Beispiel ist ein typisches Beispiel für die Verwendung des hochspezifischen Antikörpers mAb-4E6 in Immunhistochemie, angewendet auf menschliche arteriosklerotische Läsionen. Auf eine ähnliche Weise können entsprechende Experimente durchge führt werden, für die bestimmte Bedingungen durch einen Fachmann unter Verwendung seines Allgemeinwissens in dem Gebiet angepasst werden können.
2. Material und Verfahren
Koronararterienproben, die zum Zeitpunkt der Transplantation von Patienten mit ischämischer Herzerkrankung (n = 7) oder dilatierter Kardiomyopathie (n = 7) erhalten wurden, wurden behandelt, wie zuvor beschrieben (Dokument 7). Die Proben wurden innerhalb von 30 Minuten nach Entfernen des Herzens in PBS (pH 7,4) gesammelt, das 4 % Saccharose, 20 μmol Vitamin E und 10 μmol butyliertes Hydroxytoluol als Antioxidantien und 1 mmol EDTA enthielt, und wurden bei –80°C gelagert. Gefrorene 7 μm dicke Abschnitte wurden abgeschnitten und mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt. 6 bis 8 Abschnitte in einem Abstand von 84 μm wurden für jede Probe analysiert, um repräsentative Ergebnisse sicherzustellen. Doppelte Objektträger wurden mit monoklonalen Antikörpern mAb-4E6, spezifisch für oxidiertes LDL, PG-M1, spezifisch für humane Makrophagen, oder 1A4, spezifisch für humanes Glattmuskel-α-Actin (beide von Dako SA, Glostrup, Dänemark) entwickelt. Die Spezifität der Bindung von mAb-4E6 wurde durch seine Inhibierung mit OxLDL, aber nicht mit nativem LDL, bestätigt.
3. Ergebnisse
Koronararterienabschnitte von 7 Individuen mit Prätransplantat-dilatierter-Kardiomyopathie enthielten keine arteriosklerotischen Läsionen, und die monoklonalen Antikörper detektierten kein OxLDL und/oder Aldehyd-modifiziertes LDL in diesen Abschnitten. Koronararterienabschnitte von 7 Patienten mit Prätransplantat-ischämischer Herzerkrankung enthielten alle arteriosklerotische Läsionen, die OxLDL und/oder Aldehydmodifiziertes LDL enthielten (2). Diese Information ist ausreichend, um auszusagen, dass der Antikörper OxLDL in arteriosklerotischen Läsionen auf eine hochspezifische Weise detektiert.
OxLDL wurde mit Makrophagen-Schaumzellen (bevorzugt in Läsionen mit < 50% Stenose), mit Glattmuskel-Schaumzellen und mit dem nekrotischen Lipidkern (bevorzugt in Läsionen mit > 50% Stenose) assoziiert. Makrophagen und glatte Muskelzellen wurden durch Immunfärbung mit spezifischen monoklonalen Antikörpern identifiziert (5). Diese Daten unterstützten die Hypothese, dass die Oxidation von LDL mit der Entwicklung von ischämischer Koronararterienerkrankung assoziiert sein kann. Der monoklonale Antikörper mAb-4E6 dieser Erfindung, der das immunreaktive Material in den Gewebeabschnitten detektierte, wurde dann weiter in ELISA verwendet (vgl. Beispiel 4).
4. Legende zu 2
Lichtmikrophotographien (a, c, e; × 40) und Phasenkontrastmikrophotographien (b, d, f; × 400) von repräsentativen linken vorderen absteigenden Koronararterienproben eines Patienten mit dilatierter Kardiomyopathie (männlich; Alter 40 Jahre) (a, b) und eines Patienten mit ischämischer Herzerkrankung (männlich; Alter 57 Jahre) (c–f). Gewebeabschnitte wurden mit dem monoklonalen Antikörper mAb-4E6 immungefärbt. Oxidiertes LDL war in der Neointima des ersten Patienten (a, b) nicht detektierbar, aber in Plaques des zweiten Patienten nachweisbar. Das oxidierte LDL war mit Makrophagen-Schaumzellen assoziiert, die bei den Schulterbereichen von fibrösen Plaques infiltrierten (c, d), und mit Glattmuskel-Schaumzellen in fibrösen Kappen (e, f).
Beispiel 4
Kompetitiver ELISA
1. Einleitung
Gemäß der Erfindung wurde ein ELISA für die Quantifizierung von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL in Plasma etabliert. Er basierte auf der Inhibierung der Bindung von mAb-4E6 an die Wände von Mikrotiterplatten, die mit Kupfer-oxidiertem LDL beschichtet waren. Dieser Antikörper wurde wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten.
2. Material und Verfahren
Standard-OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL und Plasmaproben wurden in PBS verdünnt, das 1 mmol EDTA, 20 μmol Vitamin E, 10 μmol butyliertes Hydroxytoluol, 20 μmol Dipyridamol und 15 mmol Theophyllin enthielt, um in vitro LDL-Oxidation und Plättchenaktivierung zu verhindern. Gleiche Volumina von verdünnter gereinigter mAb-4E6-Lösung (Endkonzentration 7,5 ng/ml) und von verdünnter Standardlösung (Kupfer-oxidiertes LDL, das als konkurrierender Ligand zugegeben wurde bei einer Endkonzentration, die von 50 bis 500 ng/ml reichte) wurden gemischt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 200 μl Aliquote der Mischungen zu Vertiefungen zugegeben, die mit MDA-modifiziertem LDL oder OxLDL beschichtet waren.
Proben wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen für 1 Stunde mit Meerrettichperoxidase inkubiert, die mit Kaninchen-IgG konjugiert war, das gegen Mäuse-Immunglobuline gezüchtet wurde, und erneut gewaschen. Die Peroxidase-Reaktion wurde durchgeführt, wie früher beschrieben (5), und die Absorbanz (A) wurde bei 492 nm abgelesen.
Kontrollen ohne konkurrierenden Ligand und Blindproben ohne Antikörper wurden routinemäßig eingeschlossen. Die prozentuale Inhibierung der Bindung von mAb-4E6 an den immobilisierten Liganden wurde berechnet als:
und Standardkurven wurden erhalten, indem der Prozentsatz der Inhibierung in Abhängigkeit von der Konzentration des konkurrierenden Liganden aufgetragen wurde.
Die untere Detektionsgrenze betrug 0,020 mg/dl in unverdünntem menschlichen Plasma. Intra- und Intertest-Variationskoeffizienten betrugen 10 bzw. 12%. Standard-OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL und Plasmaproben wurden in PBS, das Antioxidantien und Antiplättchenmittel enthielt, wie oben beschrieben verdünnt.
3. Ergebnisse
Die Spezifität von mAb-4E6 für OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL ist in 3 gezeigt. 50% Inhibierung der Bindung von mAb-4E6 an immobilisiertes OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL wurden mit 0,025 mg/dl Kupfer-oxidiertem LDL bzw. 25 mg/dl nativem LDL erhalten. Der C₅₀-Wert, d. h. die Konzentration, die erforderlich ist, um 50% Inhibierung der Antikörperbindung zu erhalten, stieg von 2,5 mg/dl für MDA-modifiziertes LDL mit 60 substituierten Lysinresten pro Apo-B-100-Molekül auf 0,025 mg/dl für MDA-modifiziertes LDL mit 240 substituierten Lysinresten pro Apo-B-100-Molekül (3). Kupferoxidation führte zu einer Fragmentierung des Apo-B-100-Rests, hob jedoch die Bindung von mAb-4E6 nicht auf (3). 50 fach höhere Molkonzentrationen von MDA-modifiziertem Albumin waren erforderlich, um 50% Inhibierung zu erreichen (nicht gezeigt), während bis zu 1000 fach höhere Mokonzentrationen von MDA-modifiziertem Lysin die mAb-4E6-Bindung nicht beeinträchtigten. OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL, isoliert aus Patientenplasma, wiesen dieselbe Reaktivität auf wie MDA-modifiziertes LDL mit 120 substituierten Lysinen und wie Kupferoxidiertes LDL mit 210 substituierten Lysinen. Intra- und Intertest-Variationskoeffizienten betrugen 10 bzw. 12%. Wenn Kupfer-oxidiertes LDL zu menschlichem Plasma mit Endkonzentrationen von 0,25 bzw. 2 mg/dl zugegeben wurde, betrug die Ausbeute 95 bzw. 105%.
4. Legende zu 3
Wechselwirkung von mAb-4E6 mit konkurrierenden Liganden in Lösung. Kupferoxidiertes LDL (1 μg/ml) war das als Beschichtung aufgetragene Antigen. mAb-4E6 wurde in Abwesenheit und in Anwesenheit von konkurrierenden Liganden zugegeben: Kupferoxidiertes LDL (∇), MDA-modifiziertes LDL mit 240 (∎), 120 (♢), 90 (O) bzw. 60 (•) blockierten oder substituierten oder modifizierten Lysinen pro Apo-B-100, natives LDL (
) und OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL (♦), die aus dem Plasma von Patienten mit schwerem chronischen Nierenversagen isoliert worden waren. Die Ergebnisse sind als B/B₀ ausgedrückt, wobei B₀ die Menge an mAb-4E6 ist, die in Abwesenheit des konkurrierenden Liganden gebunden ist, und B die Menge, die in Anwesenheit des konkurrierenden Liganden gebunden ist.
Beispiel 5
Sandwich-ELISA
1. Einleitung
Erfindungsgemäß wurde ein ELISA vom Sandwichtyp für die Quantifizierung von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL in Plasma etabliert. Er basierte auf der Bindung von immunreaktivem Material an die Vertiefungen von Mikrotiterplatten, die mit dem monoklonalen Antikörper mAb-4E6 beschichtet sind, und der Detektion von gebundenem immunreaktiven Material mit der Verwendung des monoklonalen Antikörpers mAb-8A2, der mit Peroxidase markiert ist. Diese Version des ELISA ist besser für die Verwendung im klinischen Laboratorium geeignet, da sie die Notwendigkeit zur Herstellung von Standardlösungen von in vitro oxidiertem und/oder Aldehyd-modifiziertem LDL überwindet, die nur bei –4°C für einen beschränkten Zeitraum, typischerweise 2 Wochen, aufbewahrt werden können. MDA-modifiziertes LDL kann zu dem Referenzplasma zugegeben werden, und jene Standardpräparate können bei –80° C für bis zu 1 Jahr gelagert werden (siehe oben).
2. Materialien und Verfahren
Standardpräparate und Plasmaproben wurden in PBS, das Antioxidantien und Antiplättchenmittel enthielt, wie oben beschrieben verdünnt, 180 μl Aliquote von 80 fach verdünntem Plasma und von Standardlösungen, die zwischen 10 und 0,001 nmol Malondialdehyd-modifiziertes LDL enthielten, wurden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten gebracht, die mit mAb-4E6 (200 μl einer 4 μl/ml IgG-Lösung) beschichtet waren, und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen wurden die Vertiefungen für 1 Stunde mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem mAb-8A2, IgG (IgG-Endkonzentration 65 ng/ml) inkubiert und erneut gewaschen. Die Peroxidasereaktion wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die bei 492 nm gemessene Absorbanz korreliert mit dem Log-Wert der Aldehyd-modifiziertes-LDL-Konzentration in dem Bereich zwischen 1,5 nmol und 0,3 nmol.
3. Legende zu 4
Standardkurven für den Sandwich-ELISA mAb-4E6 war der beschichtete Antikörper. MDA-modifiziertes LDL war der Ligand. Gebundenes MDA-modifiziertes LDL wurde mit mAb-8A2 detektiert, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war. MDA-modifiziertes LDL wurde zu 8 unterschiedlichen Plasmaproben bis zu einer Endkonzentration von 100 nmol zugegeben und weiter in Puffer auf Endkonzentrationen verdünnt, die von 2 bis 0,2 nmol reichten.
Beispiel 6
Verwendung des ELISA bei der Diagnose von Posttransplantat-Koronararterienerkrankung
1. Einleitung
Der ELISA dieser Erfindung wurde verwendet, um den Zusammenhang zwischen Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL und Posttransplantat-Koronararterienerkrankung zu untersuchen.
2. Materialien und Verfahren
2.1 Patienten
Die Posttransplantat-Studiengruppe enthielt 47 Patienten, die wegen dilatierter Kardiomyopathie transplantiert waren, und 60 Patienten, die wegen ischämischer Herzerkrankung behandelt wurden. Die klinischen Eigenschaften dieser Patienten sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Zur Zeit der Entnahme der Blutprobe, zwischen 12 und 84 Monaten nach der Operation, befanden sich alle Patienten in einem stabilen Herzzustand ohne Anzeichen von akuter Abstoßung. Von 14 Patienten (7 dilatierte Kardiomyopathie- und 7 ischämische Herzerkrankungspatienten) wurden Koronararterien von Kardialexplantaten isoliert und durch Immunhistochemie (wie in Beispiel 3 gezeigt) untersucht. Angemessene Informationen über Rauchgewohnheiten waren für 92 der 107 Patienten verfügbar (16 Raucher und 76 Nichtraucher). Es gab keine angemessenen Informationen über die Rauchgewohnheiten von Spender. Blutproben von 53 nicht-rauchenden Kontrollpersonen (25 Männer/28 Frauen; Alter: 52±1,3 Jahre) ohne eine Krankengeschichte arteriosklerotischer Herz-Kreislauf-Erkrankung wurden erhalten. Die Kontrollen wurden hinsichtlich Alter, Geschlecht und Gehalten an LDL-Cholesterin angepasst. Sie wurden aus dem Labor- und Klinikpersonal ausgewählt.
2.2 Koronarangiographie
Jährliche Routine-Koronarangiogramme waren für alle Posttransplantatpatienten zur Zeit der Blutentnahme verfügbar. Koronararterienerkrankung wurde unabhängig durch zwei Angiographen beurteilt, denen die OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalte nicht bekannt waren, und wurde visuell wie folgt eingeteilt:

– Grad 0: normale Koronararterien
– Grad I: kleinere Abnormalitäten mit < 50% Stenose von primären oder sekundären Zweigen und normaler linksventrikulärer Funktion
– Grad II: ≥ 50% Stenose der primären oder sekundären Verzweigungen oder distale Beteiligung mit beeinträchtigter linksventrikulärer Funktion.

Es ist wohlbekannt, dass Angiographie systematisch das Ausmaß von Koronarintimaverdickung bei Herztransplantatempfängern unterschätzt. Diese Studie versucht deshalb nicht, die Koronararterienerkrankung bei unseren Patienten genau zu quantifizieren. Die Unterteilung in die oben definierten Gruppen beruht auf angiographischen Daten, die leicht unterscheidbar sind und von denen gezeigt wurde, dass sie mit histopathologischen Erkenntnissen korrelieren. Von 107 Patienten wiesen 46 Patienten ein normales Koronarangiogramm 3 Jahre vorher auf, und die Entwicklung einer angiographischen Koronararterienerkrankung innerhalb eines dreijährigen Nachsorgezeitraums wurde bei all diesen Patienten beurteilt. Das Referenznormalkoronarangiogramm war das erste postoperative Angiogramm bei 18 Patienten, das zweite bei 14 Patienten und das dritte bei 14 Patienten.
Die Studie wurde durch das institutionelle Beurteilungsgremium genehmigt, und die Studienteilnehmer erteilten ihre informierte Zustimmung.
2.3 Blutprobenentnahme
Venöse Blutproben von Patienten und Kontrollpersonen wurden auf 0,1 Vol. von 0,1 M Citrat, das 1 mmol EDTA, 20 μmol Vitamin E, 10 μmol butyliertes Hydroxytoluol, 20 μmol Dipyridamol und 15 mmol Theophyllin zum Verhindern von in vitro LDL-Oxidation und Plättchenaktivierung enthielt, gesammelt. Die Blutproben wurden bei 3000 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur innerhalb von 1 Stunde nach der Sammlung zentrifugiert und bei –20° C gelagert, bis die Tests durchgeführt wurden.
2.4 Lipoproteine: Isolierung und Modifizierung
LDL wurde aus vereinigten Seren von nüchternen normolipidämischen Spender durch Dichtegradient-Ultrazentrifugation isoliert (Dokument 6). Standardpräparate von MDA-modifiziertem und Kupfer-oxidiertem LDL wurden wie anderswo beschrieben hergestellt (7, 8) und wurden als Testkontrollen verwendet. Apo-B-100-Moleküle von in vitro MDA-modifiziertem LDL (7) und von Kupfer-oxidiertem LDL (8) enthielten im Durchschnitt 244 bzw. 210 substituierte Lysine (von insgesamt 356) (5, 9). Während das Ausmaß der Lysin-Substitution in in vitro MDA-modifiziertem LDL und Kupfer-oxidiertem LDL sehr ähnlich ist, ist die Lipidgruppe der Ersteren nicht oxidiert. Die Spezifität des monoklonalen Antikörpers mAb-4E6 für sowohl MDA-modifiziertes LDL als auch Kupfer-oxidiertes LDL deutet darauf hin, dass sie nur von dem Ausmaß der Protein-(Lysin)-Modifikation abhängt. Alle Lipoprotein-Konzentrationen wurden daher bezogen auf Protein ausgedrückt. OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL, die aus dem Plasma von Patienten isoliert wurden, wurden wie zuvor beschrieben charakterisiert (5, 9).
2.5 Tests
Cholesterin und Triglyceride wurden durch enzymatische Verfahren gemessen (Boehringer Mannheim, Meylon, Frankreich). Die Typisierung des Haupthistokompatibilitätskomplexklasse-I-(HLA-B)- und -klasse-II-(HLA-DR)-Antigens wurde durch die Mikrolymphozytotoxizitätstechnik durchgeführt.
Der ELISA der Erfindung wurde verwendet, um OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL zu detektieren.
2.6 Statistische Analyse
Kontrollen und Patienten wurden durch den ANOVA-Test verglichen, gefolgt von nicht-parametrischem Mann-Whitney- oder Dunnet's-Mehrfachvergleichstest an logarithmisch transformierten Werten im Instat V2.05a Statistikprogramm (Graph Pad Software, San Diego, CA). Nicht-quantitative Parameter wurden durch Chi-Quadratanalyse verglichen. OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalte, die in drei Aliquoten derselben Plasmaproben gemessen wurden, wurden im Friedman-nichtparametrisch-wiederholte-Messungen-Test verglichen. Logistische Regressionsanalyse, unter Verwendung der SAS-Software (SAS Institute Inc., USA), wurde durchgeführt, um die Korrelation zwischen angiographisch beurteilter Koronararterienstenose (als abhängige Variable) und Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL, Alter und Geschlecht von Empfängern, Alter und Geschlecht von Spender, Prätransplantatgeschichte der ischämischen Herzerkrankung oder dilatierter Kardiomyopathie, Dauer der Ischämie, Länge der Nachsorge, Zahl der Abstoßungen, Zahl der HLA-Unausgeglichenheiten, Zytomegalievirusinfektion, Hypertonie (Anti-Hypertonie-Behandlung), Diabetes, Behandlung mit Lipid-senkenden Arzneimitteln (Statinen oder Fibraten) und Serumgehalten von LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin und Triglyceriden als unabhängige Variablen durchgeführt. p-Werte von weniger als 0,05 wurden als Anzeige statistischer Signifikanz betrachtet. Logistische Regressionsanalyse wurde ebenfalls durchgeführt, um die Korrelation zwischen Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL und der Entwicklung von Koronararterienstenose während eines 3-Jahre-Nachsorgezeitraums zu beurteilen.
3. Ergebnisse
Die Korrelation zwischen OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL und Koronararterienstenose wurde bei 47 Patienten beurteilt, die wegen dilatierter Kardiomyopathie transplantiert wurden, und bei 60 Patienten, die wegen ischämischer Herzerkrankung behandelt wurden. Eine Analyse der klinischen Daten für die zwei Gruppen von Herztransplantatpatienten (Tabelle 1) zeigte keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Alters und Geschlechts der Empfänger, Alters und Geschlechts der Spender, Dauer der Ischämie des Spenderherzens, Zahl der Abstoßungsepisoden, Zahl der HLA-Unausgeglichenheiten, Häufigkeit von Zytomegalievirusinfektionen, Hypertonie oder Diabetes, und Grad der Koronararterienstenose. Patienten, die wegen ischämischer Herzer krankung transplantiert wurden, wurden länger begleitet und empfingen häufiger Lipidsenkende Arzneimittel (Tabelle 1).
Eine Analyse der Labordaten (Tabelle 2) enthüllte keine signifikanten Unterschiede der Serumgehalte von Triglyceriden, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin zwischen Gruppen von Patienten oder zwischen Patienten und Kontrollen. Es wurden jedoch signifikante Unterschiede zwischen den Gehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL beobachtet. Die mittleren Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL betrugen 1,3 ± 0,14 mg/dl bei dilatierten Kardiomyopathiepatienten (p < 0,001 gegenüber Kontrollen) und 1,7 ± 0,13 mg/dl bei ischämischen Herzerkrankungspatienten (p < 0,001 gegenüber Kontrollen und < 0,01 gegenüber dilatierten Kardiomyopathiepatienten) (Tabelle 2). Die Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL bei Kontrollpersonen, die hinsichtlich des Alters, Geschlechts und der Serumgehalte von Triglyceriden, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin angepasst waren, betrugen 0,60 ± 0,034 mg/dl (n = 52; p < 0,001 gegenüber sowohl transplantierten dilatierten Kardiomyopathie- und ischämischen Herzerkrankungspatienten).
Die Gehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL waren in Proben, die für 24 Stunden bis 4 Monate nach der Sammlung gelagert wurden, nicht anders, und bis zu vier Tau- und Gefrierzyklen verursachten keine Zunahme von OxLDL- und Aldehydmodifiziertes-LDL-Gehalten. Diese Erkenntnisse zeigten, dass die Zugabe von EDTA, Antioxidantien und Antiplättchenmitteln die in vitro Oxidation von LDL angemessen verhinderte. In einer Teilmenge von 87 aufeinanderfolgenden Plasmaproben wurden die Gehalte von OxLDL und/oder Aldehyd-modifiziertem LDL in drei getrennten Aliquoten an drei unterschiedlichen Tagen gemessen. Die Gehalte betrugen 1,30 ± 0,074 mg/dl, 1,48 ± 0,101 mg/dl bzw. 1,46 ± 0,090 mg/dl. Der Friedman-nicht-parametrischewiederholte-Messungen-Test zeigte keine signifikanten Unterschiede.
Die mittleren OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalte betrugen 1,2 ± 0,053 mg/dl (n = 79) bei Posttransplantat-Proben von Patienten mit angiographisch normalen Koronararterien (Grad 0), 2,1 ± 0,30 mg/dl bei Patienten mit Grad-I-Koronararterienstenose (n = 18; p < 0,001 gegenüber Grad 0) und 3,2 ± 0,45 mg/dl bei Patienten mit Grad-II-Koronararterienstenose (n = 10; p < 0,001 gegenüber Grad 0 und p < 0,05 gegenüber Grad I) (5). Die Serumgehalte von LDL-Cholesterin, Triglyceriden und HDL-Cholesterin waren bei Patienten mit höherem Grad von Koronararterienstenose sehr ähnlich. Die Gehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL bei Plasmaproben von Patienten, die wegen dilatierter Kardiomyopathie oder ischämischer Herzerkrankung transplantiert waren, mit demselben Grad von Koronararterienstenose, waren ähnlich: 1,1 ± 0,072 und 1,4 ± 0,079 mg/dl für Grad-0-Patienten und 2,6 ± 0,60 und 2,4 ± 0,29 mg/dl für Patienten mit höherem Grad von Koronararterienstenose. Die Zahl der Patienten mit erhöhten Gehalten an OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL (> 1 mg/dl, d. h. mittlerer Gehalt der Kontrollen + 2 SD) betrug 43 (von 60) bei der Untergruppe von Patienten mit Prätransplantat-ischämischer Herzerkrankung und 21 (von 47) bei der Untergruppe von Patienten mit Prätransplantat-dilatierter Kardiomyopathie. 42 von 79 Patienten mit angiographisch normalen Koronararterien wiesen erhöhte Gehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL auf. Erhöhte Gehalte wurden bei 12 (von 18) Patienten mit Grad-I- und bei allen Patienten mit Grad-II-Stenose detektiert (p = 0,0046 für Tendenz).
Um eine weitere Charakterisierung des immunreaktiven Materials zu erlauben, das in dem ELISA detektiert wurde, wurden LDL-Fraktionen aus dem Plasma aller 10 Patienten mit Grad-II-Koronararterienstenose isoliert (18). Diese Fraktionen hielten 85 ± 10% (Mittelwert ± SD) des immunreaktiven Materials zurück, während kein immunreaktives Material in die Serumalbumin-Position wanderte. OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL wurden aus isolierten LDL-Fraktionen durch Ionenaustauscherchromatographie auf einer Mono-Q-Sepharosesäule mit einer Ausbeute von 75% isoliert. Die Zahl von substituierten Lysinen pro Apo-B-100-Molekül betrug 130 ± 10 für OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL, verglichen mit 5 ± 1 (p < 0,001) für natives LDL. Die jeweiligen Cholesterin/Protein-Verhältnisse betrugen 3,3 ± 0,54 und 1,8 ± 0,36 (p < 0,001). Die Gehalte an Arachidonat und Linoleat in OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL, die aus dem Plasma dieser Patienten isoliert wurden, waren 75 und 80% niedriger als diese in nativem LDL, das aus denselben Plasmaproben isoliert wurde. Die Inhibierungskurven, die mit OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL erhalten wurden, die aus dem Plasma von Herztransplantatpatienten isoliert wurden, waren mit diesen überlagerbar, die mit in vitro oxidiertem LDL mit demselben Grad an Proteinmodifikation (120 substituierte Lysine pro Apo-B-100-Molekül) erhalten wurden (3).
Das Protein/Antigen-Verhältnis und ihre relative Reaktivität in dem ELISA von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL, die aus dem Plasma dieser Patienten isoliert wurden, waren diesen aus Kupfer-oxidierten oder MDA-modifizierten Standard-LDL-Präparaten ähnlich.
Logistische Regressionsanalyse (Tabelle 3) identifizierte 3 Parameter, die signifikant und unabhängig mit Posttransplantat-Koronararterienstenose korrelierten, einschließlich Gehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL, Länge der Nachsorge und Spenderalter.
Im Gegensatz dazu trugen Prätransplantat-Geschichte von dilatierter Kardiomyopathie oder von ischämischer Herzerkrankung, Alter und Geschlecht von Empfängern, Geschlecht von Spender, Dauer der Ischämie des Spenderherzens, Grad der HLA-Unausgeglichenheit, Zahl der Abstoßungen, Hypertonie, Diabetes und Serumgehalte von LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin und Triglyceriden bei den Empfängern nicht signifikant zu den individuellen Variationen des Grades der Koronararterienstenose bei (Tabelle 3).
Die Serumgehalte von LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin und Triglyceriden bei Patienten waren diesen bei Kontrollen ähnlich (Tabelle 2), so dass es unwahrscheinlich war dass ein höherer Grad von Koronararterienstenose von diesen Variablen in dieser Studiengruppe abhing. 56 der 107 Transplantatpatienten erhielten Lipid-senkende Arzneimittel (46 mit Statinen und 10 mit Fibraten) (Tabelle 1), aber die Behandlung mit diesen Arzneimitteln war nicht mit der Häufigkeit von angiographischer Transplantat-Vasku lopathie korreliert (Tabelle 3). 75 (von 107) Patienten wurden mit Calcium-Kanalblockern behandelt. Die Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL bei diesen Patienten (1,53 ± 0,11 mg/dl) waren diesen in nicht-behandelten Patienten (1,74 ± mg/dl) sehr ähnlich, und eine Behandlung mit diesen Arzneimitteln war nicht mit dem Grad von Koronararterienstenose korreliert.
Die Entwicklung der Koronararterienerkrankung wurde bei 12 von 46 Herztransplantationspatienten während eines 3-Jahre-Nachsorgezeitraums beobachtet. Es gab keine Unterschiede beim Alter und Geschlecht von Empfängern, Alter und Geschlecht von Spender, Dauer der Ischämie, Ausmaß der HLA-Unausgeglichenheit, Häufigkeit von Zytomegalievirusinfektionen, Hypertonie und Diabetes (Tabelle 4), noch bei den Serumgehalten von Triglyceriden, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin (Tabelle 5) zwischen Patienten ohne und mit Entwicklung von Koronararterienerkrankung. Die Gehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL waren jedoch bei Patienten mit Entwicklung von Koronararterienerkrankung signifikant erhöht (Tabelle 5).
Eine logistische Regressionsanalyse zeigte, dass Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL (Chi-Quadrat-Wert = 7,1; p = 0,0076) und Alter des Spenders (Chi-Quadrat-Wert = 4,4; p = 0,035) die Entwicklung der Koronararterienerkrankung bei diesen Patienten vorhersagten. Drei dieser Patienten entwickelten eine Koronararterienerkrankung in dem ersten Jahr, drei in dem zweiten und sechs in dem dritten Jahr. Die Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL betrugen 3,9 ± 0,6 mg/dl, 2,0 ± 0,37 mg/dl bzw. 1,2 ± 0,33 mg/dl. Obwohl eine statistische Analyse keine Korrelation mit Geschlecht, Hypertonie und Zytomegalievirusinfektion zeigte, waren 8 dieser 12 Patienten männlich, hyperton und wiesen eine Zytomegalievirusinfektion auf.
4. Diskussion
Dies zeigt:

1) dass Herzexplantate von Patienten mit ischämischer Herzerkrankung, aber nicht mit dilatierter Kardiomyopathie oxidiertes LDL in Makrophagen und in Glattmuskelzellen in atheromatösen Plaques enthalten;
2) dass Posttransplantat-Koronararterienerkrankung mit erhöhten Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL sowohl bei Patienten, die wegen dilatierter Kardiomyopathie oder wegen ischämischer Herzerkrankung transplantiert wurden, assoziiert ist, und
3) dass erhöhte Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL mit der Entwicklung von Koronararterienstenose korrelieren.

OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalte in Plasmaproben von Herztransplantatpatienten ohne angiographisch detektierbare Koronararterienläsionen waren zweifach höher als in Plasmaproben von Kontrollpersonen ohne eine Geschichte von arteriosklerotischer Herz-Kreislauf-Erkrankung, die hinsichtlich des Alters, Geschlechts und Plasmagehalten von LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin und Triglyceriden angepasst waren. Eine weitere 2,7 fache Zunahme wurde bei Posttransplantat-Plasmaproben von Patienten mit ausgeprägter Koronararterienstenose beobachtet. Diese Daten deuten darauf hin, dass erhöhte Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL ein Indikator von Posttransplantat-Koronararterienstenose sein können. Erhöhte Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL korrelierten mit dem Ausmaß von Koronararterienstenose und ebenfalls mit seinem Voranschreiten, was darauf hindeutet, dass OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL eine pathogene Rolle bei dem beschleunigten Voranschreiten von Koronararterienerkrankung bei Herztransplantatpatienten spielen kann.
Es ist darauf hingewiesen worden, dass Posttransplantat-Arteriosklerose aus einer „Antwort auf Verletzung" des Endothels resultiert (10). Der Grad der ischämischen Verletzung bei Endomyokardialbiopsien wurde tatsächlich als ein starker Vorhersager der Entwicklung beschleunigter Arteriosklerose festgestellt (11–13). Eine Endothel verletzung kann durch zelluläre Hypersensitivität-Immunantworten vom verzögerten Typ hervorgerufen werden, die durch Klasse-II-Histokompatibilitäts-(HLA)-Antigene auf dem Koronararterienendothel (14), durch Zytomegalievirusinfektion (15, 16), durch Cyclosporin (17) und durch OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL (18), die synergistisch mit Cyclosporin wirken können (19) ausgelöst werden. In der vorliegenden Studie korrelierte der Grad der Histoinkompatibilität zwischen Paaren von Spender und Empfängern, die Zahl der Abstoßungsepisoden oder Zytomegalievirusinfektion nicht mit dem Grad der Koronararterienstenose, während OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL signifikant und unabhängig mit der Posttransplantat-Koronararterienerkrankung korrelierten. Der beobachtete Zusammenhang zwischen dem Alter des Spenders und dem Auftreten der Koronararterienerkrankung befindet sich in Übereinstimmung mit vorherigen Erkenntnissen, dass Koronararteriosklerose im Spenderherz für eine beschleunigte Posttransplantat-Koronararterienstenose prädisponiert (20).
Es wurde gezeigt, dass OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL in Koronararterien in Herzexplantaten von ischämischen Herzerkrankungspatienten darauf hindeuten, dass OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL, die in der arteriellen Wand akkumulieren, zu dem Fortschreiten der Koronararterienstenose beitragen können. Das Cholesterin/Protein-Verhältnis in OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL war jenem in LDL, das aus arteriosklerotischen Läsionen extrahiert wurde, wie zuvor beschrieben (21, 22), sehr ähnlich. Eine mögliche Erklärung besteht darin, dass mindestens ein Teil des OxLDL und Aldehyd-modifizierten LDL aus der Arterienwand freigesetzt wird. Zuvor haben wir gezeigt, dass eine Plaqueruptur bei akuten Myokardialinfarktpatienten mit der Freisetzung von oxidativ modifiziertem LDL assoziiert ist (5).
In vitro Daten deuten darauf hin, dass OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL mit Atherogenese durch eine Abfolge von Ereignissen verknüpft sein könnten (zusammengefasst in 2, 23). Endothelzellen, die OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL ausgesetzt sind, schütten Adhäsionsmoleküle, Chemolockstoffproteine und Kolonie-stimulierende Faktoren aus, welche die Infiltration, Proliferation und Akkumulation von Monozyten/Makrophagen in der arteriellen Wand erhöhen. Die Aufnahme von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL durch infiltrierte Makrophagen kann zu der Erzeugung von Schaumzellen führen, die Sauerstoffradikale erzeugen, und somit weiter zur Oxidation von LDL beitragen. Es ist gezeigt worden, dass OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL die Migration von aortalen Endothelzellen in vitro inhibieren, was darauf hindeutet, dass OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL die Heilungsantwort des Endothels nach der Verletzung einschränken kann und dass basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor die Arteriosklerose-assoziierte Beeinträchtigung von menschlichen Koronarangiogenese-ähnlichen Antworten in vitro umkehrt (24, 25). OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL können ebenfalls zu schnell voranschreitender Koronararteriosklerose beitragen, indem sie Plättchenadhäsion hervorrufen durch Verringern der Antikoagulanz- und fibrinolytischen Kapazitäten von aktiviertem Endothel und durch Beeinträchtigung von Vasodilation und das Hervorrufen von Scherbeanspruchung (2, 23).
Erhöhte intrazelluläre Gehalte von Ferritin (26) oder von Alpha-Tocopherol-Analoga (27) verringerten den Grad von Endothelschädigung, die durch OxLDL und Aldehydmodifiziertes LDL hervorgerufen wurde, in vitro, während Antioxidantien gegen das Voranschreiten von Arteriosklerose bei Versuchstieren schützen (in Dokument 28 zusammengefasst).
Zusammengefasst zeigt das vorliegende Beispiel, dass Posttransplantat-Arteriosklerose mit den Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL korreliert.
5. Legende zu 5
Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL und angiographisch beurteilter Grad von Koronararterienstenose. Grad 0: normale Koronararterien; Grad I: kleinere Abnormalitäten mit < 50% Stenose von primären oder sekundären Verzweigungen und normaler linksventrikulärer Funktion; und Grad II: ≥ 50% Stenose von primären oder sekundären Verzweigungen oder distale Verschlüsse mit beeinträchtigter linksventrikulärer Funktion.
Beispiel 7
Verwendung des ELISA bei Patienten mit Nierenversagen
1. Material und Verfahren
1.1 Studienteilnehmer
Die Patientenpopulation bestand aus 20 Patienten mit mildem chronischen Nierenversagen (MCRF) und 77 Patienten mit schwerem chronischen Nierenversagen: 21 mit konservativer Behandlung einschließlich Diät- und Antihypertoniebehandlung (SCRF) und 56 mit Vier-Stunden-, dreimal pro Woche, Hämodialyseplan (HEMO) für 66 Monate (95% CI, 50–82 Monate). Allen Hämodialysepatienten wurde ein orales Polyvitaminpräparat (Ol-Amin, La Meuse, Belgien) nach Hämodialyse gegeben, das nur Spurenmengen von antioxidativen Bestandteilen enthielt (d. h. 5 mg Vitamin E und 100 mg Vitamin C). Kontrollpersonen und nicht-dialysierte Patienten erhielten keine routinemäßigen Verschreibungen von Vitaminergänzungen. Die hohe Häufigkeit von arteriosklerotischen Erkrankungen bei diesen Patienten (Tabelle 6) befindet sich in Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Daten (29, 30). Die Diagnose von arteriosklerotischer Herzerkrankung, cerebrovaskulärer Erkrankung und peripherer Vaskulärerkrankung erfolgte nach Beurteilung der Patientenakten hinsichtlich einer Geschichte von Myokardinfarkt, instabiler Angina oder Anti-Angina-Behandlung, cerebrovaskulären Vorfällen, vorübergehenden ischämischen Anfällen oder Ereignissen, die periphere Vaskulärerkrankungen betrafen, wie etwa ischämische Ulzera, Amputation oder Bypassoperation. Angiogramme waren nur für einige Patienten verfügbar. Zum Zeitpunkt der Blutentnahme und an den folgenden Tagen wies kein Patient Anzeichen einer instabilen arteriosklerotischen Erkrankung auf. Eine Gruppe von 27 gesunden Freiwilligen (Tabelle 6) ohne eine Geschichte von Nierenerkrankung oder arteriosklerotischer Vaskulärerkrankung diente als Kontrollgruppe. Patienten, die Lipid-senkende Arzneimittel erhielten, waren ausgeschlossen. Die Studien war durch das institutionelle Auf sichtsgremium genehmigt, und die Studienteilnehmer gaben ihre informierte Zustimmung ab.
1.2 Blutproben
Venöse Blutproben von Patienten und Kontrollpersonen wurden auf 0,1 Vol. von 0,1 M Citrat gesammelt, das 1 mmol EDTA, 20 μmol Vitamin E, 10 μmol butyliertes Hydroxytoluol, 20 μmol Dipyridamol und 15 mmol Theophyllin enthielt, um in vitro LDL-Oxidation bzw. in vitro Plättchenaktivierung zu verhindern. Blutproben wurden bei 3000 g für 15 Minuten bei Raumtemperatur innerhalb 1 Stunde nach der Sammlung zentrifugiert und bei –20° C gelagert, bis die Tests durchgeführt wurden.
1.3 Tests
Die Titer von Autoantikörpern gegen OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL und natives LDL wurden gemäß Salonen et al. (3) gemessen, wie im Einzelnen andernorts beschrieben (5). vWF-Antigengehalte wurden in einem ELISA vom Sandwich-Typ, basierend auf einem polyklonalen Kaninchen-antihumanem-vWF-Antiserum (Dako, Glostrup, Dänemark), Meerrettichperoxidase-konjugiertem Kaninchen-antihumanem-vWF-IgG (Dako) und o-Phenylendiamin gemessen. Plasmagehalte von Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin und Triglyceriden wurden unter Verwendung von enzymatischen Standardtests (Boehringer Mannheim, Meylon, Frankreich) bestimmt. Die LDL-Cholesteringehalte wurden unter Verwendung der Friedewald-Formel berechnet. Für die Patienten, die sich nicht in Hämodialyse befanden, wurden die Creatinin-Clearanceraten aus Plasmacreatinin-Gehalten unter Verwendung der Cockcroft- und Gault-Formel berechnet (31).
1.4 Statistische Analyse
Kontrollpersonen und Patienten wurden durch den ANOVA-Test, gefolgt von Dunnett's-Mehrfachvergleichstest in dem Instat-V2.05a-Statistikprogramm (Graph Pad Software, San Diego, CA) verglichen. Korrelationskoeffizienten wurden gemäß Spearman berechnet. Mehrfachregressionsanalyse, unter Verwendung der SAS-Software (SAS Institute Inc., USA), wurde durchgeführt, um die Beziehung zwischen OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL als abhängige Variable und Alter, Geschlecht, Hypertonie (Antihypertoniebehandlung), Gehalten von Triglyceriden, HDL-Cholesterin, LDL-Cholesterin und Creatinin-Clearancerate (Marker des Grads von Nierenversagen) und Gehalten von vWF (Marker für Endothelschädigung) als unabhängige Variablen zu untersuchen.
2. Ergebnisse
Die mittleren Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL bei Kontrollpersonen betrugen 0,59 mg/dl (95% CI, 0,52–0,66 mg/dl; n = 27) und waren bei MCRF-Patienten 2,7 fach höher (p < 0,01, wie bestimmt durch Dunnett's-Mehrfachvergleichstest), 3,1 fach höher bei SCRF-Patienten (p < 0,001) und 5,4 fach höher bei HEMO-Patienten (p < 0,001) (Tabelle 7). OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalte waren invers mit den Creatinin-Clearanceraten korreliert (r = –0,65; p < 0,001; n = 73). HEMO-Patienten waren in dieser Analyse nicht eingeschlossen, da ihre Plasmacreatinin-Clearance nicht angemessen bestimmt werden kann.
Bei einer Reihe von 14 hämodialysierten Patienten wurde festgestellt, dass die Gehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL in frischen und frisch gefrorenen Plasmaproben sehr ähnlich waren. Drei Gefrier- und Auftauzyklen verursachten keinen Anstieg von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL, was anzeigt, dass die Zugabe von Antioxidantien und Antiplättchenmitteln eine in vitro Oxidation verhinderte.
Plasmaproben wurden aus 14 hämodialysierten Patienten an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor dem Beginn der Dialyseprozedur erhalten. Die Gehalte an OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL in diesen Proben waren ähnlich: 3,4 ± 0,25 mg/dl, 3,2 ± 0,21 mg/dl bzw. 3,5 ± 0,28 mg/dl. Weiterhin wurden Plasmaproben während (nach 2 Stunden) und am Ende (nach 4 Stunden) der Hämodialyse erhalten. Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL betrugen 4,0 ± 0,60 mg/dl und 4,7 ± 0,70 mg/dl (p = NS gegenüber vorher), verglichen mit 3,4 ± 0,25 mg/dl vor dem Beginn der Dialyseprozedur. Somit rief die Hämodialyseprozedur keinen signifikanten Anstieg der OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalte hervor.
Angemessene Informationen über Rauchgewohnheiten waren nur für Kontrollpersonen (27 Nichtraucher) und für HEMO-Patienten (12 Raucher und 45 Nichtraucher) verfügbar. Die Gehalte an OxLDL und Aldehyd-modifizierten LDL waren bei rauchenden HEMO-Patienten etwas höher (3,6 mg/dl; 95% CI, 2,1–5,6 mg/dl) als bei nicht-rauchenden HEMO-Patienten (3,0 mg/dl; 95% CI, 2,5–3,6 mg/dl; p = NS). Die Plasmagehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDE bei hämodialysierten Patienten mit einer Geschichte von instabiler arteriosklerotischer Kardiovaskulärerkrankung betrugen 3,5 ± 0,40 mg/dl (n = 30), verglichen mit 2,8 ± 0,60 mg/dl (n = 26, p = NS) bei hämodialysierten Patienten ohne eine Geschichte von instabiler arteriosklerotischer Kardiovaskulärerkrankung.
LDL-Fraktionen wurden aus dem Plasma von 10 Kontrollpersonen, von 10 MCRF-Patienten, von 10 SCRF-Patienten und von 10 HEMO-Patienten durch Gelfiltration auf einer Superose 6HR 10/30 Säule isoliert, wie zuvor beschrieben (5). 75 ± 6% (Mittelwert ± SD), 80 ± 4%, 83 ± 6% und 79 ± 5% des immunreaktiven Materials wurden in den LDL-Fraktionen wiedergewonnen. Kein immunreaktives Material wanderte in die Serumalbuminposition. Die mit den jeweiligen LDL-Fraktionen erhaltenen Inhibierungskurven waren parallel zu jenen, die mit in vitro Kupfer-oxidierten oder MDA-modifizierten Standard-LDL-Präparaten erhalten wurden. OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL wurden aus isolierten LDL-Fraktionen von 10 SCRF-Patienten durch Ionenaustauschchromatographie auf einer Mono-Q-Sepharosesäule mit einer Ausbeute von 75% isoliert. Ihre physikochemischen Eigenschaften sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Die Gehalte von Arachidonat von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL, das aus diesen Patienten isoliert wurde, waren mit 75% reduziert, während seine Linoleat-Gehalte mit 80% reduziert waren. 37% der Lysinreste von OxLDL waren mit Aldehyden substituiert. Die Inhibierungskurven, die mit OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL erhalten wurden, die aus dem Plasma von Patienten mit chronischem Nierenversagen isoliert wurden, waren parallel zu denen, die mit OxLDL und Aldehyd-modifziertem LDL erhalten wurden, das durch in vitro Oxidation von LDL erhalten wurde, das aus dem Plasma von Kontrollpersonen isoliert wurde (3). Das Protein/Antigen-Verhältnis und die relative Reaktivität in dem ELISA von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL, das aus dem Plasma dieser Patienten isoliert wurde, waren ähnlich denen von Kupfer-oxidierten oder MDA-modifizierten Standard-LDL-Präparaten (Tabelle 8).
Die Titer von Autoantikörpern gegen OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL betrugen 4,2 (95% CI, 4,0–4,4) bei Kontrollpersonen, waren ähnlich bei MCRF- und SCRF-Patienten, jedoch bei HEMO-Patienten signifikant erhöht (p < 0,001) (Tabelle 7). Die Autoantikörpertiter korrelierten mit Gehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL bei SCRF-Patienten (r = 0,44; p = 0,047) und bei HEMO-Patienten (r = 0,37; p = 0,0055) (6). Keine zirkulierenden Autoantikörper gegen natives LDL konnten entdeckt werden.
Die Gehalte von vWF betrugen 100% bei Kontrollpersonen (95% CI, 90–110%), und waren 1,5 fach höher bei MCRF-Patienten (p = NS gegenüber Kontrollpersonen), 1,6 fach höher bei SCRF-Patienten (p < 0,01) und 2,1 fach höher (p < 0,001) bei HEMO-Patienten (Tabelle 7). Die Pegel von vWF waren bei rauchenden HEMO-Patienten nicht signifikant höher (250%; 95%, 150–340%; n = 12) als bei nicht-rauchenden HEMO-Patienten (220%; 95% CI, 190–260%; n = 45). Die Gehalte von vWF korrelierten mit den Gehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL bei MCRF-Patienten (r = 0,59; p < 0,0057), bei SCRF-Patienten (r = 0,69; p = 0,0006) und bei HEMO-Patienten (r = 0,62; p < 0,0001) (7). Im Gegensatz dazu korrelierten die Gehalte von vWF nicht mit LDL-Cholesteringehalten oder mit dem Körpergewicht.
Mehrfachregressionsanalyse zeigte, dass der Grad des Nierenversagens (F = 14; p = 0,0004) und der Grad der Endothelschädigung (F = 26; p = 0,0001), aber nicht Alter, Geschlecht, Hypertonie, Triglyceridgehalte, HDL-Cholesterin- oder LDL-Cholesteringehalte, einen signifikanten Bruchteil der Variationen von OxLDL und Aldehyd-modi fizierten LDL-Gehalten ausmachte (Tabelle 9). Selbst wenn nur Personen ohne Zeichen von ischämischer arteriosklerotischer Erkrankung (n = 53) in das Modell eingeschlossen wurden (R²-Wert = 0,68) trugen nur der Grad des Nierenversagens (F = 21; p = 0,0001) und der Grad der Endothelschädigung (F = 14; p = 0,0006) signifikant zu den Variationen von OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalten bei. Keine anderen Variablen trugen signifikant zu diesen Variationen nach dem Ausschluss von Personen ohne Anzeichen von ischämischer arteriosklerotischer Erkrankung bei. Wenn nur Personen mit Anzeichen von ischämischer arteriosklerotischer Erkrankung (n = 15) eingeschlossen wurden, trug nur der Grad der Endothelschädigung (F = 6,2; p = 0,047; R²-Wert = 0,65) zu den Variationen der OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalte bei. Der Ausschluss von diabetischen Patienten veränderte die Daten ebenfalls nicht signifikant. Nach dem Ausschluss des Grads des Nierenversagens als unabhängige Variable zeigte eine mehrfache Regressionsanalyse, dass Hämodialyse (F = 5,6; p = 0,021; n = 77), LDL-Cholesteringehalte (F = 7,1; p = 0,0095) und Endothelschädigung (F = 35; p = 0,0001) einen signifikanten Bruchteil der Veränderung der OxLDL- und Aldehydmodifiziertes-LDL-Gehalte bei Patienten mit schwerem chronischen Nierenversagen ausmachten (Tabelle 10).
3. Diskussion
In vitro Arbeit und experimentelle Tierdaten deuten darauf hin, dass oxidiertes LDL (OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL) zu dem Voranschreiten von Arteriosklerose beitragen können (in Dokument 2 zusammengefasst), und OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL sind in menschlichen arteriosklerotischen Plaques gezeigt worden (5). Der Immuntest dieser Erfindung identifiziert OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL (MDA-modifiziertes LDL) mit ≥ 60 substituierten Lysinen pro Apo-B-100-Molekül, was die Substitutionsschwelle darstellt, die für die Scavenger-Rezeptor-vermittelte Aufnahme erforderlich ist (1). Gesteigerte Gehalte von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL sind durch ELISA in dem Plasma von Patienten mit chronischem Nierenversagen gemessen worden.
Insgesamt sind 80% des immunreaktiven Materials, das aus dem Plasma von Patienten isoliert wurde, in den LDL-Fraktionen wiedergewonnen worden, die durch Gelfiltration getrennt wurden. Kein immunreaktives Material wanderte in die Albuminposition. Inhibierungskurven, die mit dem isolierten OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL erhalten wurden, waren parallel zu denen von in vitro Kupfer-oxidierten oder MDA-modifizierten LDL-Standardpräparaten, und das Protein/Antigen-Verhältnis und der C₅₀-Wert des isolierten OxLDL und Aldehyd-modifizierten LDL waren identisch mit denen von Standard-OxLDL- und Aldehyd-modifizierten LDL-Präparaten. Diese Daten deuteten darauf hin, dass eine gesteigerte Immunreaktivität von OxLDL- und Aldehyd-modifizierten LDL-Fraktionen im Plasma dieser Patienten mit den Antikörpern dieser Erfindung tatsächlich von dem höheren Grad der Proteinmodifikation abhing, und nicht von Veränderungen in der Lipidzusammensetzung, wie es zuvor mit anderen Antikörpern beobachtet wurde (32). Die gesteigerte elektrophoretische Mobilität, die gesteigerte Lysin-Modifikation, das gesteigerte Cholesterin/Protein-Verhältnis, die verringerten Arachidonsäure- und Linoleat-Gehalte waren sehr ähnlich denen von modifiziertem LDL, das aus arteriosklerotischen Läsionen extrahiert wurde (21, 22). OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL riefen Schaumzellenerzeugung hervor, was darauf hindeutet, dass OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL nicht „minimal verändertes" LDL waren.
Mehrfache Regressionsanalyse zeigte, dass chronisches Nierenversagen und Endothelschädigung signifikant zu der Variation bei OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalten beitrugen, selbst wenn Patienten mit Anzeichen von ischämischer arteriosklerotischer Erkrankung ausgeschlossen wurden. Tatsächlich konnten 79,6% und 82,4% der Variationen bei OxLDL- und Aldehyd-modifiziertes-LDL-Gehalten in diesen Modellen erklärt werden. Keine Patienten wiesen Anzeichen von instabiler arteriosklerotischer Erkrankung zur Zeit der Blutentnahme, noch an den folgenden Tagen auf, und der Ausschluss von Patienten mit einer Geschichte von ischämischer arteriosklerotischer Erkrankung beeinträchtigte nicht den Beitrag des Grades des Nierenversagens und der Endothelschädigung zu den Variationen bei OxLDL- und Aldehyd-modifiziertem LDL.
LDL-Cholesteringehalte bei Kontrollpersonen und Patienten waren sehr ähnlich, und LDL-Cholesteringehalte trugen nicht zu den Variationen bei OxLDL- und Aldehydmodifiziertes-LDL-Gehalten bei. Sutherland et al. (33) zeigten, dass die Verzögerung der Bildung konjugierter Diene, die ein Maß für die Empfindlichkeit von LDL gegenüber in vitro Oxidation ist, bei Patienten mit chronischem Nierenversagen und bei angepassten Kontrollpersonen ähnlich war. Die maximale Rate und der Grad der LDL-Oxidation war sogar bei Patienten mit Nierenerkrankung niedriger als bei Kontrollpersonen wegen der niedrigeren Gehalte von Linolsäure und höheren Gehalte von Oleinsäure. Weiterhin zeigten Schulz et al. (34), dass trotz der Tatsache, dass Hämodialyse eine Leukozytenaktivierung verursacht, die in vitro LDL-Oxidationsverzögerung bei Nierenpatienten und bei gesunden Kontrollpersonen ähnlich war. Es wurde geschlossen, dass die antioxidative Verteidigung von Lipoproteinen bei Nierenversagen und während der Dialyse bewahrt wurde.
In experimentellen Modellen hat sich gezeigt, dass Antioxidantien, wie etwa Probucol und Vitamin E, gegen glomerale Schädigung schützen (35, 36) und atherogene Prozesse verlangsamen (28). Renale Vasokonstriktion, die durch Cholesterinfütterung verursacht wurde, wurde durch Probucol oder durch einen Thromboxan-Antagonisten korrigiert (35). Galle et al. (38) zeigten, dass die Inhibierung von Endothel-abhängiger Dilation, die durch oxidiertes Lipoprotein hervorgerufen wurde, durch Lipoproteine hoher Dichte verhindert werden konnte, die bei hämodialysierten Patienten signifikant verringert sind. Außerdem könnten Mineralien, wie Selen, und Nährstoffe, wie das Coenzym Q10, die Erzeugung freier Radikale und somit oxidativen Stress verringern. Folsäure, Vitamin B12 und Vitamin B6 können bei der Verhinderung von Hyperhomocysteinämie essentiell sein, die zu Endothelschädigung (39) und zur Oxidation von LDL (40) in diesen Patienten beitragen kann. Eine an einfach ungesättigten Fettsäuren (Oleinsäure, widerstandsfähig gegen Oxidation) reiche Diät verringerte den Grad von Endothelschädigung bei Diabetespatienten (41). Daher ist es möglich, dass Diät- oder pharmakologische Mittel OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL und den von-Willebrand-Faktor bei chronischem Nierenversagen verringern können und die erhöhte verallgemeinerte Arteriosklerose bei solchen Patienten lindern können.
Nach Anpassung für den Grad des Nierenversagens zeigte eine mehrfache Regressionsanalyse, dass sowohl LDL-Cholesteringehalte als auch Endothelschädigung stark zu den Variationen bei OxLDL- und Aldehyd-modifiertes-LDL-Gehalten bei Patienten mit schwerem chronischen Nierenversagen beitrugen.
Hämodialyse resultiert in Plättchen- und Leukozytenaktivierung (42, 43), die Sauerstoffradikale und Aldehyde erzeugt, die ebenfalls zur Oxidation von LDL beitragen können. OxLDL und Aldehyd-modifiziertes LDL können dann zu Thrombogenese und Atherogenese durch das Stimulieren von Plättchen beitragen (44). Wegen der recht beschränkten Zahl von Patienten konnte eine Untergruppenanalyse zur weiteren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Hämodialyse, Oxidation von LDL und ischämischer arteriosklerotischer Erkrankung nicht durchgeführt werden (45).
4. Legende zu den 6 und 7
6. Korrelation zwischen Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL (Log-Werte) und Titern von Autoantikörpern (Log-Werte): Regressionslinie für Patienten mit schwerem chronischem Nierenversagen, entweder mit konservativer Behandlung (
; ---) (r = 0,44; p = 0,047) oder mit Hämodialyse (∎; –––) (r = 0,37; p = 0,0055). Keine signifikante Korrelation wurde bei Kontrollpersonen und bei Patienten mit mildem chronischem Nierenversagen beobachtet.
7. Korrelation zwischen Plasmagehalten von OxLDL und Aldehyd-modifiziertem LDL (Log-Werte) und von von-Willebrand-Faktor-Antigen (Log-Werte): Regressionslinie für Patienten mit mildem chronischen Nierenversagen (•; -.-.-) (r = 0,59; p = 0,0057) oder für Patienten mit schwerem chronischen Nierenversagen, entweder mit konservativer Behandlung (
, ---) (r = 0,69; p = 0,0006) oder mit Hämodialyse (∎; ––– ) (r = 0,62; p < 0,00001). Keine signifikante Korrelation wurde bei Kontrollpersonen beobachtet.
Beispiel 8
Herstellung eines Referenzstandards zur Verwendung in immunologischen Tests
1. Einleitung
Erfindungsgemäß wurde herausgefunden, dass LDL, das durch Behandlung mit Malondialdehyd (MDA) modifiziert ist, hochstabil ist. Weiterhin ist der Modifikationsgrad hochreproduzierbar. LDL, das mit MDA in einem bestimmten Verhältnis modifiziert ist, weist eine identische Zahl von substituierten Lysinen auf und kann daher als Referenzprobe in immunologischen Tests verwendet werden. Dieses Beispiel zeigt die Herstellung des Standards.
2. Material und Verfahren
MDA-modifiziertes LDL wurde zu Kontrollplasma (das Antioxidantien und Antiplättchenverbindungen und Antikoagulantien enthielt) bis zu einer Endkonzentration von 100 nmol MDA-modifiziertes Apo-B-100 gegeben. Aliquote wurden bei –80° C eingefroren. An 6 Tagen wurden Aliquote aufgetaut, auf Endkonzentrationen verdünnt, die von 10 bis 0,1 nmol MDA-modifiziertes Apo-B-100 reichten, und in ELISA analysiert (4 Verdünnungskurven pro Tag).
3. Ergebnisse
Die Intertest-Variationskoeffizienten von 10 aufeinanderfolgenden Sandwich-ELISAs dieser Erfindung unter Verwendung von 10 aufeinanderfolgenden unabhängigen MDA-modifiziertes LDL-Standardpräparaten dieser Erfindung sind in Tabelle 11 zusammengefasst.
Diese Daten zeigen, dass für Konzentrationen von MDA-modifiziertem LDL, die von 10 bis 0,01 nmol reichen, die Intertest-Variation von 7,6 bis 16,9% reichte.
Abkürzungen

C₅₀

Konzentration, die erforderlich ist, um 50% Inhibierung der Antikörperbindung zu erhalten

MDA:

Malondialdehyd

HEMO:

Patienten mit schwerem chronischen Nierenversagen mit Erhaltungshämodialyse

MCRF:

Patienten mit mildem chronischen Nierenversagen

SCRF:

Patienten mit schwerem chronischen Nierenversagen mit konservativer Behandlung

OxLDL:

Oxidierte Lipoproteine geringer Dichte.

Tabelle 3: Logistische Regressionsanalyse des Zusammenhangs zwischen klinischen Labordaten und dem Grad von Koronararterienstenose bei Herztransplantatpatienten.

Unabhängige Variable	Chi-Quadrat-Wert	p-Wert
Oxidiertes LDL	18	0,0001
Länge der Nachsorge	11	0,0008
Alter des Spenders	3,9	0,047
Alter des Empfängers	0,12	0,73
Geschlecht des Empfängers	1,8	0,18
Geschlecht des Spenders	0,025	0,88
Geschichte von Prätransplantat-dilatierter Kardiomyopathie (n = 47) oder ischämischer Herzerkrankung (n = 60)	0,0018	0,97
Dauer der Ischämie	0,25	0,62
Nr. der HLA-Nichtübereinstimmungen	1,6	0,20
Nr. der Abstoßungsepisoden	3,0	0,081
Zytomegalievirusinfektion	0,17	0,47
Hypertonie	1,9	0,16
Diabetes	0,0016	0,97
Behandlung mit Lipid-senkenden Arzneimitteln
Statine	1,1	0,30
Fibrate	0,12	0,73
Behandlung mit Calcium-Kanalblockern	0,16	0,49
Serum-Triglyceride	0,18	0,67
Serum-HDL-Cholesterin	0,25	0,61
Serum-LDL-Cholesterin	0,044	0,83

Der Datensatz enthielt 107 Patienten. Ursprüngliche Herzerkrankung war dilatierte Kardiomyopathie bei 47 und ischämische Herzerkrankung bei 60 Patienten. Koronararterienstenose wurde angiographisch beurteilt. Alle quantitativen Parameter wurden logarithmisch transformiert, um eine Normalverteilung für die lineare Regression zu erhalten. Chi-Quadrat-Werte wurden nach Anpassung hinsichtlich aller anderen Variablen erhalten.

Eigenschaften	Herztransplantatpatienten
Eigenschaften	Ohne Voranschreiten (n = 34)	Mit Voranschreiten (n = 12)	p-Wert
Alter des Empfängers (Jahre)	58 ± 1,4	60 ± 1,4	**NS
Geschlecht des Empfängers (M/F)	21/14	11/1	*NS
Alter des Spenders (Jahre)	25 ± 1,3	32 ± 3,8	**NS
Geschlecht des Spenders (M/F)	27/7	10/2	*NS
Dauer der Ischämie (Minuten)	130 ± 6,7	140 ± 11	**NS
Nr. der HLA-Nichtübereinstimmungen
DR	1,2 ± 0,13	1,5 ± 0,15	**NS
B + DR	2,8 ± 0,21	3,2 ± 0,24	**NS
Zytomegalievirusinfektion	24	11	*NS
Hypertonie	21	10	*NS
Diabetes	1	2	*NS

Daten stellen Mittelwert ± SEM oder Zahl der Patienten dar. *p-Werte durch Chi-Quadrat-Analyse bestimmt. **p-Werte durch Dunnett's-Mehrfachvergleichstest bestimmt. NS = nicht signifikant.

Eigenschaften	Herztransplantationspatienten
Eigenschaften	Ohne Voranschreiten (n = 34)	Mit Voranschreiten (n = 12)	p-Wert
Serumtriglyceride (mg/dl)	130 ± 8,6	150 ± 14	NS
HDL-Cholesterin (mg/dl)	50 ± 2,7	49 ± 4,9	NS
LDL-Cholesterin (mg/dl)	110 ± 3,6	105 ± 8,7	NS
Oxidiertes LDL (mg/dl)	1,2 ± 0,069	2,6 ± 0,33	0,0005

Daten stellen Mittelwert ± SEM dar. P-Werte durch Dunnett's-Mehrfachregressionsvergleichstest bestimmt. NS = nicht signifikant.

Eigenschaften	Kontroll-Personen (n = 27)	Mildes chronisches Nierenversagen (n = 20)	Schweres chronisches Nierenversagen
Eigenschaften	Kontroll-Personen (n = 27)	Mildes chronisches Nierenversagen (n = 20)	Nicht dialysiert (n = 21)	Hämodia lysiert (n = 56)
Männer/Frauen	12/15	11/9	7/14	33/23
Alter (Jahre)	54 (50–58)*	52 (44–60)*	55 (49–62)*	61 (58–65)*
Körpergewicht (kg)	72 (69–76)*	73 (67–79)*	59 (53–65)*	65 (61–68)*
Creatinin-Clearance	110 (110–	34 (29–39)*	8,4 (7–10)*	nd
(ml/min)	120)*
Primärnierenerkrankung:
Glomerulonephritis	-	4	3	11
Autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung	-	2	6	10
Diabetes	-	1	4	6
Reflux-Nephropathie	-	1	2	2
Chronische interstitielle Nephritis	-	2	2	9
Hypertone Nephropathie	-	2	0	2
Andere¹	-	6	1	9
Unbekannt	-	2	3	7
Hypertonie	1	16	19	18
Arteriosklerotische Herzerkrankung	-	6	7	24
Cerebrovaskuläre Vorfälle	-	0	3	9
Periphere Vaskulärerkrankung	-	2	1	13

*Daten stellen Mittelwert und 95-%-Konfidenzintervalle (zwischen Klammern) dar.
¹Einschließlich: vererbliche Nephropathie, Sarkoidose, renale Tuberkulose, thrombotische thrombozytopenische Purpura, Myelom, traumatischer Verlust, kongenitale Harnwegsabnormalitäten.
nd: Creatinin-Clearancerate kann nicht angemessen bestimmt werden.

	Natives LDL	OxLDL
Protein/Antigen-Verhältnis	> 100	1,1
Reaktivität mit mAb-4E6 (C₅₀ mg/dl)	25	0,02
Relative elektrophoretische Mobilität	1	1,7
Malondialdehyd (mol/mol Protein)	3	68
Substituierte Lysine pro apo-B-100	5	130
Cholesterin/Protein-Verhältnis	1,8	3,3
Freies Cholesterin/Cholesterinester-Verhältnis	0,38	0,36
Phospholipid/Protein-Verhältnis	1,7	1,6
Fettsäuren (%)
16:0	14	37
18:1	19	50
18:2	55	10
20:4	12	3

Daten stellen Mittelwerte von 10 LDL-Präparaten von Patienten mit chronischem Nierenversagen dar. Natives LDL und OxLDL von Patienten wurden durch Ionenaustauschchromatographie getrennt.

Variable	F-Wert	p-Wert
Alter	1,2	0,28
Geschlecht	1,4	0,25
Hypertonie	1,1	0,31
Triglyceride	1,5	0,23
HDL-Cholesterin	1,7	0,20
LDL-Cholesterin	0,99	0,32
Nierenversagen	14	0,0004

Der Datensatz enthielt 27 Kontrollpersonen, 20 MCRF-Patienten und 21 SCRF-Patienten. F-Werte wurden nach Anpassung hinsichtlich der anderen Variablen erhalten. Cockcroft-Creatinin-Clearanceraten wurden als quantitativer Parameter für den Grad des Nierenversagens verwendet. Alle linearen Variablen wurden logarithmisch transformiert, um Normalität für eine lineare Regressionsanalyse zu erhalten. Der mehrfache R²-Wert des mehrfachen Regressionsmodells betrug 0,634.

Variable	F-Wert	p-Wert
Alter	0,31	0,58
Geschlecht	0,19	0,66
Hypertonie	0,01	0,95
HDL-Cholesterin	0,02	0,89
Triglyceride	3,7	0,060
Hämodialyse	5,6	0,021
LDL-Cholesterin	7,1	0,0095

Der Datensatz enthielt 21 SCRF- und 56 HEMO-Patienten. Alle linearen Variablen wurden logarithmisch transformiert, um Normalität für eine lineare Regressionsanalyse zu erhalten. Der mehrfache R²-Wert des mehrfachen Regressionsmodells betrug 0,56.

Konzentration (nmol)	Intertest-Variationskoeffizienten (%)
10	9,6
5	7,6
2,5	8,4
1,25	13,2
0,62	12,0
0,31	13,0
0,16	12,3
0,08	15,5
0,04	16,9
0,02	13,6
0,01	11,4

Dokumente

1. Haberland MD, Fogelman AM, Edwards PA: Specificity of receptor-mediated recognition of malondialdehyde-modified low density lipoproteins. Proc Natl Acad Sci 1982; 79:1712–1716.
2. Holvoet P, Collen D: Oxidized lipoproteins in atherosclerosis and thrombosis. FASER J 1994;8:1279–8440.
3. Salonen JT, Ylä-Herttuala S, Yamamoto R, Butler S, Korpela H, Salonen R, Nyyssonen K, Palinski W, Witztum JL: Autoantibody against oxidized LDL and progression of carotid atherosclerosis. Lancet 339: 883–887, 1992.
4. Holvoet P, Perez G, Bernar H, Brouwers E, Vanloo B, Rosseneu M, Collen D: Stimulation with a monoclonal antibody (mAb4E4) of scavenger receptormediated uptake of chemically modified low density lipoproteins by THP-1 derived macrophages enhances foam cell generation. J Clin Invest 93: 89–98, 1994.
5. Holvoet P, Perez G, Zhao Z, Brouwers E, Bernar H, Collen D: Malondialdehyde-modified low density lipoproteins in patients with atherosclerotic disease. J Clin Invest 1995; 95:2611–2619.
6. Havel RJ, Eder HA, Bragdon JH: The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human sera. J Clin Invest 1955; 34:1345–1353.
7. Steinbrecher UP: Oxidation of low density lipoprotein results in derivatization of lysine residues of apolipoprotein B by lipid peroxide decomposition products. J Biol Chem 1987; 262:3603–3608.
8. Sparrow CP, Partharasathy S, Leake DS, Witztum JL, Steinberg D: Enzymatic modification of low density lipoprotein by purified lipoxygenase plus phospholipase-A₂ mimic cell-mediated oxidative modification. J Lipid Res 1988; 29: 745–753.
9. Holvoet P, Donck J, Landeloos M, Brouwers E, Luijtens K, Arnout J, Lesaffre E, Vanrenterghem Y, Collen D: Correlation between oxidized low density lipoproteins and von Willebrand factor in chronic renal failure. Thromb Haemostas 1996; 76:663–669.
10. Libby P, Salomon RN, Payne DD, Schoen FJ, Pober JS: Functions of vascular wall cells related to development of transplantation-associated coronary arteriosclerosis. Transplant Proc 1989; 21:3677–3684.
11. Hruban RH, Beschorner WE, Baumgartner WA, Augustine SM, Ren H, Reitz BA, Hutchins GM: Accelerated arteriosclerosis in heart transplant recipients is associated with a T-lymphocyte-mediated endothelialitis. Am J Pathol 1990; 137:871–882.
12. Rose EA, Smith CR, Petrossian GA, Barr ML, Reemtsma K: Humoral immune responses after cardiac transplantation: correlation with fatal rejection and graft atherosclerosis. Surgery 1989; 106:203–208.
13. Tanaka H, Sukhova GK, Swanson SJ, Cybulsky MI, Schoen FJ, Libby P: Endothelial and smooth muscle cells express leukocyte adhesion molecules heterogeneously during acute rejection of rabbit cardiac allografts. Am J Pathol 1994; 144:938–951.
14. Crisp SJ, Dunn MJ, Rose ML, Barbir M, Yacoub MH: Antiendothelial antibodies after heart transplantation: the accelerating factor in transplantassociated coronary artery disease? J Heart Lung Transplant 1994; 13:81–92.
15. Grattan MT, Moreno-Cabral CE, Starnes VA, Oyer PE, Stinson EB, Shumway NE: Cytomegalovirus infection is associated with cardiac allograft rejection and atherosclerosis. JAMA 1989; 261:3561–3566.
16. Koskinen P, Lemstrom K, Bruggeman C, Lautenschlager I, Hayry P: Acute cytomegalovirus infection induces a subendothelial inflammation (endothelialitis) in the allograft vascular wall. A possible linkage with enhanced allograft arteriosclerosis. Am J Pathol 1994; 144:41–50.
17. Cartier R, Dagenais F, Hollmann C, Cambron H, Buluran J: Chronic exposure to cyclosporin affects endothelial and smooth muscle reactivity in the rat aorta. Arm Thorac Surg 1994; 58:789–794.
18. Chin JH, Azhar S, Hoffman BB: Inactivation of endothelial derived relaxing factor by oxidized lipoproteins. J. Clin. Invest. 1992; 89:10–18.
19. Galle J, Schollmeyer P, Wanner C: Cyclosporin and oxidized low density lipoproteins synergistically potentiate vasoconstriction: influence of the endothelium. Eur Heart J 1993; 14(Suppl):111–117.
20. Tuzcu EM, Hobbs RE, Rincon G, Bott-Silverman C, De Franco AC, Robinson K, McCarthy PM, Stewart RW, Guyer S, Nissen SE: Occult and frequent transmission of atherosclerotic coronary disease with cardiac transplantation. Insights from intravascular ultrasound. Circulation 1995; 91:1706–1713.
21. Hoff HF, O'Neill: Lesion-derived low density lipoprotein and oxidized low density lipoprotein share a lability for aggregation, leading to enhanced macrophage degradation. Arterioscler Thromb 1991; 11:1209–1222.
22. Steinbrecher UP, Lougheed M: Scavenger receptor-independent stimulation of cholesterol esterification in macrophages by low density lipoprotein extracted from human aortic intima. Arterioscler Thromb 1992; 12:608–625 33. Steinberg D, Witztum JL: Lipoproteins and atherogenesis: current concepts. J Am Med Assoc 1990; 264:3047–3052.
23. Ross R: The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362:801–809.
24. Murugesan G, Chisolm GM, Fox PL: Oxidized low density lipoprotein inhibits the migration of aortic endothelial cells in vitro. J Cell Biol 1993; 120: 1011–1019.
25. Chef CH, Nguyen HH, Weilbaecher D, Luo S, Gotto AM Jr, Henry PD: Basic growth factor reverses atherosclerotic impairment of human coronary angiogenesis-like responses in vitro. Atherosclerosis 1995; 116: 261–268.
26. Juckett MB, Balla J, Balla G, Jessurun J, Jacob HS, Vercellotti GM: Ferritin protects endothelial cells from oxidized low density lipoprotein in vitro. Am J Pathol 1995; 147:782–789.
27. Mabile L, Fitoussi G, Periquet B, Schmitt A, Salvayre R, Negre-Salvayre A: Alpha-Tocopherol and trolox block the early intracellular events (TBARS and calcium rises) elicited by oxidized low density lipoproteins in cultured endothelial cells. Free Radic Biol Med 1995; 19:177–187.
28. Steinberg D: Clinical trials of antioxidants in atherosclerosis: are we doing the right thing? Lancet 1995; 346:36–38.
29. Degoulet P, Legrain M, Reach I, Aime F, Devries C, Rojas P, Jacobs C: Mortality risk factors in patients treated by chronic hemodialysis. Nephron 31: 103–110, 1982.
30. Neff MS, Eiser AR, Slifkin RF, Baum M. Baez A, Gupta S, Amarga E: Patients surviving 10 years of hemodialysis. Am J Med 74: 996–1004, 1983.
31. Cockcroft DW, Gault MH: Prediction of creatinine clearance from serum creatinine. Nephron 16: 31–41, 1976.
32. Reade V, Tailleux A, Reade R, Harduin P, Cachera C, Tacquet A, Fruchart JC, Fievet C: Expression of apolipoprotein B epitopes in low density lipoproteins of hemodialyzed patients. Kidney Int 44: 1360–1365, 1993.
33. Sutherland WH, Walker RJ, Ball MJ, Stapley SA, Robertson MC: Oxidation of low density lipoproteins from patients with renal failure or renal transplants. Kidney Int 48: 227–236, 1995.
34. Schulz T, Schiffl H, Scheithe R, Hrboticky N, Lorenz R: Preserved antioxidative defense of lipoproteins in renal failure and during hemodialysis. Am J Kidney Dis 25: 564–571, 1995.
35. Keane WF, Mulcahy WS, Kasiske BL, Kim Y, O'Donnell MP:, Hyperlipidemia and progressive renal disease. Kidney Int Suppl 39: S41–S48, 1991.
36. Trachtman H, Schwob N, Maesaka J, Valderrama E: Dietary supplementation ameliorates renal injury in chronic puromycin aminonucleoside nephropathy. J Am Soc Nephrol 5: 1811–1819, 1995.
37. Kaplan R, Aynedjian HS, Schlondorff D, Bank N: Renal vasoconstriction caused by short-term cholesterol feeding is corrected by thromboxane antagonist or probucol. J Clin Invest 86: 1707–1714, 1990.
38. Galle J, Bengen J, Schollmeyer P, Wanner C: Oxidized lipoprotein(a) inhibits endothelium-dependent dilation: prevention by high density lipoprotein. Eur J Pharmacol 265: 111–115, 1994.
39. Friedman JA, Dwyer JT: Hyperhomocysteinemia as a risk factor for cardiovascular disease in patients undergoing hemodialysis. Nutr Rev 53: 197–201, 1995.
40. McCully KS: Chemical pathology of homocysteine. I. Atherogenesis. Ann Clin Lab Sci 23: 477–493, 1993.
41. Rasmussen O, Thomsen C, Ingerslev J, Hermansen K: Decrease of von Willebrand factor levels after a highmonounsaturated fat diet in non-insulin-dependent diabetic subjects. Metabolism 43: 1406–1409, 1994.
42. Reverter JC, Escolar G, Sanz C, Cases A, Villamor N, Nieuwenhuis HK, Lopez J, Ordinas A: Platelet activation during hemodialysis measured through exposure of P-selectin: analysis by flow cytometric and ultrastructural techniques. J Lab Clin Med 124: 79–85, 1994.
43. Zwaginga JJ, Koomans HA, Sixma JJ, Rabelink TJ: Thrombus formation and platelet-vessel wall interaction in the nephrotic syndrome under flow conditions. J Clin Invest 93: 204–211, 1994.
44. Zhao B, Dierichs R, Harrachruprecht B, Winterhorff H: Oxidized LDL induces serotonin release from blood platelets. Am J Hematol 48: 285–287, 1995.
45. Pocock SJ: Subgroup analysis, in Pocock SJ (ed): Clinical trial. A practical approach. Wiley J & Sons, Chichester, 1993, p 211–218.

Claims

Immunologischer Test für die Detektion und/oder Quantifizierung von humanem MDA (Malondialdehyd)-modifiziertem LDL und humanem OxLDL (oxidiertem LDL) in einer Probe, die aus den Körperflüssigkeiten oder Geweben eines Menschen stammt, wobei der Test umfasst: (a) in-Kontakt-Bringen der Probe mit einem ersten Antikörper, der eine Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 für menschliches MDA-modifiziertes LDL und menschliches OxLDL aufweist; und (b) danach Visualisieren und/oder Quantifizieren einer Bindungsreaktion zwischen dem ersten Antikörper und dem in der Probe vorhandenen MDA-modifizierten LDL und OxLDL; wobei das MDA-modifizierte LDL und OxLDL, für die der erste Antikörper eine Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 aufweist, mindestens 60 substituierte Lysin-Reste pro Apo B-100-Rest enthalten.
Test gemäß Anspruch 1, wobei das MDA-modifizierte LDL und OxLDL, für die der erste Antikörper einer Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 aufweist, mindestens ungefähr 90 substituierte Lysin-Reste pro Apo B-100-Rest aufweisen.
Test gemäß Anspruch 1, wobei das MDA-modifizierte LDL und OxLDL, für die der erste Antikörper einer Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 aufweist, mindestens ungefähr 120 substituierte Lysin-Reste pro Apo B-100-Rest aufweisen.
Test gemäß Anspruch 1, wobei das MDA-modifizierte LDL und OxLDL, für die der erste Antikörper einer Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 aufweist, mindestens ungefähr 210 substituierte Lysin-Reste pro Apo B-100-Rest aufweisen.
Test gemäß Anspruch 1, wobei das MDA-modifizierte LDL und OxLDL, für die der erste Antikörper einer Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 aufweist, mindestens ungefähr 240 substituierte Lysin-Reste pro Apo B-100-Rest aufweisen.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, der ein konkurrierender Test ist.
Konkurrierender Test gemäß Anspruch 6, wobei MDA-modifiziertes LDL und/oder OxLDL an ein Substrat gebunden sind, mit dem Schritt des in-Kontakt-Bringens der Probe und des ersten Antikörpers mit dem Substrat, das an sich gebunden MDA-modifiziertes LDL und OxLDL aufweist.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, der ein Sandwich-Test ist, in welchem der erste Antikörper an ein Substrat gebunden ist, mit dem Schritt des in-Kontakt-Bringens der Probe mit dem Substrat, das an sich gebunden den ersten Antikörper aufweist.
Test gemäß Anspruch 8, in welchem ein zweiter Antikörper verwendet wird und der zweite Antikörper eine Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 für menschliches MDA-modifiziertes LDL und menschliches OxLDL aufweist.
Test gemäß Anspruch 9, in welchem der zweite Antikörper eine Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 für menschliches natives LDL aufweist.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, in welchem die Affinitätskonstante des ersten Antikörpers für MDA-modifiziertes LDL und für OxLDL mindestens ungefähr 1 × 10¹⁰ M^–1 beträgt.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, in welchem der erste Antiköper eine Affinität von weniger als ungefähr 1 × 10⁷ M^–1 für menschliches natives LDL aufweist.
Test gemäß Anspruch 12, in welchem die Affinitätskonstante des ersten Antikörpers für menschliches natives LDL weniger als ungefähr 1 × 10⁶ M^–1 beträgt.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, in welchem der erste Antikörper der monoklonale Antikörper mAb-4E6, hergestellt durch Hybridom Hyb4E6, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1660 CB an dem oder um den 24. April 1997, ist.
Test gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, in welchem die Affinitätskonstante des zweiten Antikörpers für MDA-modifiziertes LDL und für OxLDL mindestens ungefähr 1 × 10¹⁰ M^–1 beträgt.
Test gemäß Anspruch 15, in welchem die Affinitätskonstante des zweiten Antikörpers für menschliches natives LDL mindestens ungefähr 1 × 10⁹ M^–1 beträgt.
Test gemäß Anspruch 16, in welchem der zweite Antikörper der monoklonale Antikörper mAb-8A2, hergestellt durch Hydridom Hyb8A2, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1661 CB an dem oder um den 24. April 1997, ist.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, der ein immunohistochemischer Test ist, in dem die Probe eine Gewebeprobe ist und sie mit dem ersten Antikörper in Kontakt gebracht wird.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, in welchem die Probe von den Körperflüssigkeiten eines Menschen stammt.
Test gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, in welchem mindestens ein Antikörper in der Lage ist, 0,02 mg/dl von menschlichem MDA-modifiziertem LDL und menschlichem OxLDL in unverdünntem menschlichem Plasma zu detektieren.
Immunologischer Sandwich-Test für die Detektion und/oder Quantifizierung von menschlichem MDA-modifiziertem LDL in einer Probe, die aus den Körperflüssigkeiten oder Geweben eines Menschen stammt, wobei in dem Sandwich-Test ein erster Antikörper, der eine Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 für menschliches MDA-modifiziertes LDL aufweist, an ein Substrat gebunden ist, wobei der Test umfasst: (a) in-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Substrat, das an sich gebunden den ersten Antikörper unter Bindungsbedingungen aufweist, so dass mindestens einige von jeglichem menschlichen MDA-modifizierten LDL in der Probe an den ersten Antikörper binden; (b) danach Entfernen der ungebundenen Probe von dem Substrat; (c) danach in Kontaktbringen des Substrats mit einem zweiten Antikörper, der eine Affinität für menschliches MDA-modifiziertes LDL aufweist; und (d) danach Visualisieren und/oder Quantifizieren des MDA-modifizierten LDL, das in der Probe vorhanden war; wobei der erste Antikörper oder der zweite Antikörper eine Affinität von mindestens ungefähr 5 × 10⁸ M^–1 für menschliches MDA-modifiziertes LDL und menschliches OxLDL aufweist; und wobei das menschliche MDA-modifizierte LDL und menschliche OxLDL mindestens 60 substituierte Lysin-Reste pro Apo B-100-Rest enthalten.
Test gemäß Anspruch 21, in welchem der zweite Antikörper eine Affinität von mindestens ungefähr 1 × 10⁹ M^–1 für menschliches natives LDL aufweist.
Test gemäß Anspruch 21 oder 22, in welchem die Affinität des ersten Antikörpers für MDA-modifiziertes LDL mindestens ungefähr 1 × 10¹⁰ M^–1 beträgt.
Test gemäß Anspruch 21, in welchem der erste Antikörper der monoklonale Antikörper mAb-1H11, hergestellt durch Hybridom Hyb1H11, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1659 CB an dem oder um den 24. April 1997, ist.
Test gemäß Anspruch 21, in welchem der erste Antikörper der monoklonale Antikörper mAb-4E6, hergestellt durch Hybridom Hyb4E6, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1660 CB an dem oder um den 24. April 1997, ist.
Test gemäß Anspruch 21, in dem der zweite Antikörper der monoklonale Antikörper mAb-8A2, hergestellt durch Hybridom Hyb8A2, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1661 CB an dem oder um den 24. April 1997, ist.
Test gemäß einem der Ansprüche 21 bis 26, in welchem mindestens ein Antikörper fähig ist, 0,02 mg/dl von menschlichem MDA-modifiziertem LDL in unverdünntem menschlichem Plasma zu detektieren.
Monoklonaler Antikörper mAb-4E6, hergestellt durch Hybridom Hyb4E6, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungssuchnummer LMBP 1660 CB an dem oder um den 24. April 1997.
Hybridom Hyb4E6, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1660 CB an dem oder um den 24. April 1997.
Monoklonaler Antikörper mAb-8A2, hergestellt durch Hybridom Hyb8A2, hinterlegt bei der BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1661 CB an dem oder um den 24. April 1997.
Hybridom Hyb8A2, hinterlegt bei BCCM unter der Hinterlegungseingangsnummer LMBP 1661 CB an dem oder um den 24. April 1997.