ES2307662T3 - Proteinas oxidadas y su actividad biologica y terapeutica, asi como su utilizacion en el diagnostico por medio de la inhibicion de la interaccion entre proteinas oxidadas y la cd36. - Google Patents

Abstract

Medicamento destinado a su utilización para la profilaxis de las trombosis, en particular en el caso de enfermedades inflamatorias, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.

Description

Proteínas oxidadas y su actividad biológica y terapéutica, así como su utilización en el diagnóstico por medio de la inhibición de la interacción entre proteínas oxidadas y la CD36.

El presente invento se refiere a sustancias de acuerdo con las reivindicaciones, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36 o que inhiben ciertas funciones de la CD36 que son inducidas mediante una interacción de la CD36 con proteínas oxidadas, y a su utilización como medicamentos para seres humanos y animales.

La modificación por oxidación de proteínas es considerada como una etapa crítica para la patogénesis de diversas enfermedades, que van desde la aterosclerosis (arteriosclerosis), pasando por enfermedades neurodegenerativas hasta llegar al propio proceso de envejecimiento (Holvoet y Collen, 1997 Curr Opin Lipidol, Witztum y Steinberg 1991, J Clin Invest 88, 1785-92, Smith MA y colaboradores, 1996, Nature, Oxidative damage in Alzheimers [Daño oxidativo en la enfermedad de Alzheimer], Stadtmann ER, Protein Oxidation and Aging [Oxidación de proteínas y envejecimiento], 1992, Science 257: 1220-24). Unas altas concentraciones de LDL (lipoproteínas de baja densidad) en la sangre se consideran como el factor de riesgo principal para el desarrollo de enfermedades vasculares arterioscleróticas (ateroscleróticas) (Brown MS, Goldstein IL, 1986, Science 232: 34-37).

Sin embargo, hoy en día existe una evidencia abrumadora para creer que no son las LDL propiamente dichas, sino sus formas oxidadas, las que constituyen el agente desencadenador (en inglés trigger) decisivo para las modificaciones patogénicas que conducen a la arteriosclerosis (Steinberg, D, Circulation 95: 1062-71, 1997). El documento de patente de los EE.UU. nº 5.756.067 describe que la medición del colesterol, de los triglicéridos y de las lipoproteínas como marcadores del riesgo para una aterosclerosis que se está desarrollando, no es todavía suficiente, puesto que aproximadamente la mitad de todas las enfermedades cardíacas debidas a una aterosclerosis se presenta en unos pacientes, que tienen unos valores normales de triglicéridos en plasma y unos valores normales de colesterol, y dado que la detección angiográfica de una aterosclerosis también se puede llevar a cabo en pacientes que tienen unos valores normales de lípidos. Por lo tanto, otros procesos, que no se han publicado todavía, deben de participar causalmente en la génesis de la arteriosclerosis.

La oxidación de los lípidos en las LDL, o bien in vitro p.ej. mediante una oxidación inducida por cobre, o bien in vivo, conduce a la formación de aldehídos reactivos (documento de solicitud de patente internacional WO 98/59248). La absorción de las LDL oxidadas (oxLDL) por macrófagos conduce a la formación de las denominadas células espumosas, un proceso, que es considerado como la etapa iniciadora en el desarrollo de la arteriosclerosis (documento WO 98/59248).

Se considera como responsable de este proceso a la oxidación de la porción lipídica en las LDL. Por lo tanto, para investigaciones acerca de la génesis de una arteriosclerosis las oxLDL se producen por parte de casi todos los científicos mediante una adición de CuSO_{4} o con dialdehído malónico, que es un producto final de la peroxídación de lípidos. La concentración de oxLDL en el plasma de pacientes con una enfermedad cardíaca coronaria primaria o con una enfermedad cardíaca coronaria asociada con un trasplante se correlaciona grandemente con el progreso de la enfermedad, mientras que en personas testigos sanas no se pudo medir ningún nivel aumentado de oxLDL (Holvoet y colaboradores, Circulation 98: 1.487-94, 1998). También las enfermedades renales crónicas y los rechazos de trasplantes se asocian con unos altos niveles de oxLDL (Holvoet, Collen Thromb Haemost 76(5): 663-9, 1996 +\cdotATVB 18(1) 100-7, 1998).

También la oxidación de la porción proteínica en las LDL puede provocar ciertas modificaciones fisiológicas/pato-
fisiológicas. Así una HOCl-oxLDL deslipidada conducía a la inducción del estallido por oxidación (en inglés oxidative burst) en macrófagos (Nguyen-Khoa y colaboradores, BBRC 263: 804-9, 1999) y una HOCI-oxLDL provocaba la agregación de trombocitos (Volf y colaboradores, ATVB 20(8): 2.011-18, 2000).

Ciertos agentes oxidantes reactivos son liberados en el cuerpo por fagocitos y desempeñan un cometido importante en el caso de la defensa contra agentes patógenos, en el caso de la vigilancia de tumores y en los casos de todos los procesos inflamatorios (Babior, NEJMed 298: 659-663, 1978, Weiss J, NEJMed 320: 365-376, 1989). Junto a los fagocitos "profesionales", tales como los granulocitos y los monocitos, también otras células, tales como p.ej. las células endoteliales o las células musculares lisas, pueden producir y entregar agentes oxidantes reactivos.

A estas sustancias oxidantes pertenecen O_{2}, un superóxido, peróxido de hidrógeno, peroxinitritos, radicales OH^{-}, ácido hipocloroso (HOCl), Cl_{2} gaseoso y cloroaminas. Todavía no se ha puesto en claro qué procesos participan detalladamente en la génesis por oxidación de estas sustancias. La ceruloplasmina, la 15-lipoxigenasa, la mieloperoxidasa (MPO) y la sintasa de óxido nítrico (NO-S) se encontraron en lesiones arterioscleróticas en animales y seres humanos, y podrían contribuir a la oxidación de las LDL (Carr y colaboradores, ATVB 20:1716-23, 2000). Una posible vía de oxidación implica a la MPO. La MPO, una enzima proteínica del hemo puede halogenar y peroxidar (Carr y colaboradores). El producto óptimamente descrito de la mieloperoxidasa es el ácido hipocloroso HOCl^{-} Cl^{-} + H_{2}O_{2} + H^{+} \rightarrow HOCl + H_{2}O_{2}. Las proteínas modificadas con un hipoclorito, en particular las HOCl-oxLDL, se encuentran en lesiones arterioscleróticas (Hazell y colaboradores 1996). Una modificación con HOCl de proteínas desempeña también un cierto cometido en los casos de otras enfermedades, tales como p.ej. enfermedades articulares inflamatorias (Davies y colaboradores, Free-Radical-Biol-Med 15(6): 637-43, 1993), trastornos de la coagulación (oxidación de trombomodulina) (Glaser y colaboradores, J Clin Invest 90(6): 2565-73, 1992), la destrucción de tejidos por medio de granulocitos en los casos de reacciones inflamatorias en general (Schraufstatter y colaboradores, J Clin Invest 85(2): 554-62, 1990), isquemias, daños por reperfusión (Samanta y colaboradores, Free Radic Res Cornmun 7(2): 73-82, 1989), una glomerulonefritis (Shah y colaboradores, J Clin Invest 79(1): 25-31, 1987) y una inmunoregulación (apoptosis de células NK (asesinas naturales) (Hansson y colaboradores, J Immunol 156(1): 42-7,1996).

La CD36, también llamada glicoproteína IIIb (GPIIIb) o glicoproteína IV (GP IV), es una glicoproteína principal de las plaquetas, de las células endoteliales, de los monocitos, de los eritroblastos, de las células epiteliales y de algunos linajes de células tumorales, tales como células de melanoma y células de osteosarcoma (Asch y colaboradores J. CIin. Invest. 79: 1054-1061 (1987), Knowles y colaboradores J. Immunol. 132, 2170-2173 (1984), Kieffer y colaboradores, Biochem. J. 262:835-842 (1989)). Ella pertenece a la familia de los receptores "depuradores" (en inglés "scavenger") de la clase B. Son miembros de esta familia la proteína membranal lisosómica integral LIMP-II (del inglés lysosomal integral membrane protein II, Vega y colaboradores 1991), la CLA-1 (CD36 and LIMP-1I analogous [CD36 y compuesto análogo a LIMP-II], Calvo y Vega 1993), la proteína FAT de la membrana de adipocitos (Abumrad y colaboradores 1993), la PAS IV procedente de células epiteliales de mama (Greenwalt y colaboradores 1990 y 1992) y la SR-B1 (Acton y colaboradores 1994).

La proteína FAT de los adipocitos participa en la fijación y en el transporte de ácidos grasos de cadena larga. La proteína PAS IV es una proteína membranal integral de células epiteliales mamarias lactantes y se concentra en el plasmalema apical. Con la secreción de triglicéridos, ella accede a la leche y es encontrada en la fracción MFGM (del inglés "milk-fat globule membrane" membrana de glóbulos de grasa de leche). La secuencia de la PAS IV es casi idéntica a la de CD36, pero existen ciertas diferencias en la glicosilación.

El SR-B1 es un receptor depurador para LDL (Acton y colaboradores 1994).

La CD36 se compone de una única cadena polipeptídica fuertemente glicosilada con un peso molecular aparente de 88.000 en los estados reducido y no reducido, y con un intervalo isoeléctrico comprendido entre 4,4 y 6,3 (McGregor y colaboradores 1980, Clemetson 1987). El hecho de que no se pueda determinar ningún punto isoeléctrico claramente definido, se debe al contenido variable de ácido siálico (McGregor y colaboradores 1981). La proporción de hidratos de carbono, de 26%, y una fuerte hidrofobia confieren a la CD36 una alta resistencia frente a la degradación por proteasas, siempre y cuando que la proteína se encuentre en la membrana (Greenwalt y colaboradores 1992). Esto da lugar a que la proteína esté protegida frente a "ataques" en unas regiones, en las que tienen lugar procesos inflamatorios. La CD36 tiene enlaces N- y O-glicosídicos. La secuencia de aminoácidos, derivada de un ADNc placentario para la CD36 (Oquendo y colaboradores 1989), muestra varias zonas hidrófobas y presuntamente dos zonas transmembranales.

Se han postulado algunas funciones para la CD36.

Así, ella se describió como receptor para un colágeno (Tandon y colaboradores 1989). Una CD36 purificada se fija a fibrillas de colágeno del tipo I, y los fragmentos Fab de un anticuerpo policlonal dirigido contra la CD36 inhiben la agregación inducida por un colágeno.

Los análisis de plaquetas, a las que les falta la CD36, muestran, no obstante, que la CD36 no es indispensablemente necesaria para la activación de plaquetas con un colágeno.

Nuestras investigaciones conjuntas con colegas del grupo de trabajo de J.J. Sixma (Utrecht) no mostraron ninguna diferencia en la adhesión de plaquetas deficientes en CD36 y de plaquetas testigos en colágenos de los tipos I o III bovinos o humanos en el sistema estático y bajo la influencia de unas velocidades de cizalladura pequeñas, medianas y altas en la cámara de perfusión, en el caso de la utilización de sangre heparinizada, y en el caso de unas concentraciones fisiológicas de Ca^{2+} (Saelman y colaboradores 1994).

Las plaquetas deficientes en CD36 se agregan de una manera normal con un colágeno de Horm, que es una mezcla colágenos equinos de los tipos I y III, y con colágenos humanos y bovinos de los tipos I y III purificados (Kehrel y colaboradores 1991 y 1993). La secreción de los gránulos-á y de los gránulos densos, inducida por un colágeno del tipo I o III no se diferencia en los casos de plaquetas deficientes en CD36 y de plaquetas testigos (Kehrel y colaboradores 1993). Daniel y colaboradores mostraron que la transferencia de señales después de una activación con un colágeno del tipo I transcurre de igual manera en las plaquetas deficientes en CD36 y en las plaquetas testigos (Daniel y colaboradores 1993).

La CD36 es un receptor para la trombospondina-1 (TSP-1) (Asch y colaboradores 1987, McGregor y colaboradores 1989). En trombocitos en reposo la CD36 está fosforilada en la treonina (en la posición 92). Una desfosforilación hace posible la fijación de trombospondina (Asch, Science 1993). Una CD36 purificada se fija específicamente a una trombospondina. Esta fijación es dependiente de Ca^{2+} y no puede ser inhibida por péptidos RGD. El anticuerpo monoclonal OKM5, que está dirigido contra la CD36, inhibe la fijación de trombospondina a plaquetas activadas con trombina (Asch y colaboradores 1989). Leung y colaboradores describen que en la CD36 dos regiones peptídicas influyen sobre la fijación de trombospondina. El péptido 139-155 refuerza la agregación de plaquetas en un plasma rico en plaquetas, que había sido inducida por ADP o un colágeno. El péptido 93-110, por el contrario, inhibe parcialmente la agregación inducida por un colágeno y bloquea también la fijación de la CD36 a trombospondina inmovilizada. Este péptido no puede fijar por sí sólo a una trombospondina, pero sí en presencia del péptido 139-155 (Leung y colaboradores 1992, Pearce y colaboradores 1993). La secuencia SVTCG de una trombospondina se fija con una alta afinidad a la CD36 (Li y colaboradores 1993). Silverstein y colaboradores (1992) demostraron la importancia de la CD36 para la fijación de trombospondina por medio de experimentos con células de melanoma transfectadas en el mismo sentido (= en inglés "sense") y en antisentido (en inglés "antisense"). El sitio de fijación sobre la CD36 para una trombospondina está situado entre los aminoácidos 93-120 (Frieda y colaboradores 1995).

La CD36 es descrita también como mediadora en la fijación entre plaquetas, células endoteliales, monocitos o células de melanoma C32, por una parte, y eritrocitos infestados con el parásito de la malaria Plasmodium falciparum, por otra parte (Barnwell y colaboradores 1989). La fijación de eritrocitos infectados a células endoteliales de capilares, también llamada secuestro, tiene una importancia decisiva para el desenlace frecuentemente mortal de la malaria tropical, cuando el secuestro tiene lugar en el cerebro (malaria cerebral).

Los eritrocitos infectados se fijan a la CD36 purificada, inmovilizada (Ockenhouse y colaboradores 1989). Las células COS, en las que se había expresado el ADNc para la CD36, adquieren la capacidad de fijar eritrocitos infectados por la malaria (Oquendo y colaboradores 1989). Con ayuda de anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra el anticuerpo monoclonal contra la CD36, OKM5, se encontró un partícipe en la fijación sobre eritrocitos infectados, a saber la secuestrina (Ockenhouse y colaboradores). Por medio del contacto con eritrocitos infectados se activan plaquetas y monocitos (Ockenhouse y colaboradores 1989). Unas plaquetas deficientes en CD36 no mostraron en las manos de Tandon y colaboradores (1991) ninguna capacidad de fijación para eritrocitos infectados. Nosotros habíamos observado por el contrario que la fijación es perturbada solamente en presencia de EDTA. En presencia de Ca^{2+} y Mg^{2+}, nosotros pudimos observar claramente una formación de rosetas de eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum y de plaquetas deficientes en CD36 (Kronenberg y colaboradores 1992). Junto a la CD36 se han descrito todavía otros mediadores en la fijación para eritrocitos infectados con malaria, entre ellos una trombospondina, que necesita para esta función cationes divalentes (Berendt y colaboradores 1989, Roberts y colaboradores 1985). Una trombospondina podría mediar en la fijación, observada por nosotros, de plaquetas deficientes en CD36 a eritrocitos infectados. La fijación de eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum a la CD36 es inhibida por los péptidos 145-171 y 156-184 de la CD36 (Baruch y colaboradores 1999). También se ha discutido frecuentemente un cometido de la CD36 en el caso de la transferencia de señales (Shattil y Brugge 1991). En el caso de la inmunoprecipitación de CD36 desde plaquetas en reposo, las tirosina-cinasas de las familias de genes src pp60^{fyn}, pp62yes y pp54/58^{lyn}, son precipitadas conjuntamente, lo que apunta a una íntima asociación con la CD36 (Huang y colaboradores 1991). La importancia de este descubrimiento no ha sido todavía puesta en claro. Algunos anticuerpos contra la CD36 activan a plaquetas y monocitos (Aiken y colaboradores 1990, Schüepp y colaboradores 1991). El anticuerpo de IgM, NL07, activa a plaquetas con ayuda del sistema del complemento (Alessio y colaboradores 1993). Como otra función adicional de la CD36 se describe un cometido en la púrpura trombótica trombocitopénica (TTP) (Lian y colaboradores 1991). Una proteína (p37), que se presenta en el plasma de pacientes con TTP, aglutina a plaquetas, de manera mediada por la CD36. La importancia de este hallazgo es desconocida hasta ahora. El péptido VTCG de la trombospondina inhibe la síntesis de bifosfato de fosfatidilinositol (3,4) en plaquetas activadas con trombina. La CD36 es uno de los receptores de trombospondina, que median en una activación tardía de la PI-3-cinasa y de la fosfolipasa C (Trumel, Payrastre, Mazarguil, Chap, Plantavid, notificación personal).

La CD36 participa en el transporte de ácidos grasos de cadena larga en células de tejidos musculares.

Una sobreexpresión de la CD36 en células musculares de ratones transgénicos conducía a una absorción celular acrecentada de ácidos grasos, acrecentaba la oxidación de ácidos grasos por medio de músculos contráctiles y reducía la concentración de triglicéridos y de ácidos grasos libres en el plasma. Los ratones tenían un peso corporal más pequeño, en particular una proporción más pequeña de grasa corporal, que sus parientes testigos.

Una falta de CD36 en los seres humanos conduce a la pérdida de la absorción de ácidos grasos de cadena larga, que es la fuente principal de energía para el músculo cardíaco (miocardio), en las células del músculo cardíaco, y consecuentemente a una aparición aumentada de cardiomiopatías hipertróficas congénitas (Fuse y colaboradores 1998). También los ratones deficientes en CD36 muestran un transporte defectuoso de ácidos grasos en las células y un metabolismo perturbado de las lipoproteínas (Febbraio y colaboradores 1999).

La CD36 media en la agregación de plaquetas mediada por el ácido araquidónico (Dutta-Roy y colaboradores 1996) y se fija a fosfolípidos cargados negativamente en membranas celulares (Ryeom y colaboradores 1996). En particular la fosfatidilserina (PS) y el fosfatidilinositol (PI) se fijan específicamente para la CD36 con una alta afinidad (Rigotti y colaboradores 1995). Dado que las células apoptóticas exponen fosfatidilserinas junto a su superficie, a través de la CD36 se puede mediar en un contacto con células fagocitóticas (Fadok y colaboradores 1898, Alberts y colaboradores 1998). La fosfatidilserina se fija presuntamente a la secuencia 162-183 de la CD36 (Yamaguchi y colaboradores 2000). La CD36 se fija al hemisuccinato de colesterilo y a través de esta reacción puede ser purificada fácilmente (Kronenberg y colaboradores 1998).

La función principal de la CD36 es ciertamente su cometido como receptor para las LDL oxidadas. Este cometido fue descrito por primera vez por Endemann y colaboradores en 1993. Unos experimentos de transfección con un clon de ADNc, que codifica la CD36, en el linaje de células THP similares a macrófagos humanos, condujeron a una capacidad de fijación, conseguida de manera nueva, de la célula para LDL oxidadas con Cu^{2+}. El anticuerpo monoclonal OKM5 específico para la CD36 inhibe en un 54% la fijación de las Cu^{2+}-oxLDL a plaquetas. El sitio de fijación para las Cu^{2+}-oxLDL está situado en la región 155-183 de la secuencia de CD36 (Puente y colaboradores 1996). Nicholson y colaboradores describen que las Cu^{2+}-oxLDL se fijan a la CD36 presuntamente a través de su porción lipídica (Nicholson y colaboradores 1995). Los macrófagos de donantes de sangre, a los que les falta la CD36 en los monocitos, tienen, en comparación con testigos, una absorción manifiestamente reducida (-40%) de las oxLDL (Nozaki y colaboradores 1995).

La vitamina E (alfa-tocoferol) inhibe la absorción de las Cu^{2+}-oxLDL en células musculares lisas de la aorta, al inhibir ella a la CD36 (Ricciarelli y colaboradores 2000). La fijación de las oxLDL a la CD36 de ratón es tomada a su cargo parcialmente por fosfolípidos oxidados, que están asociados con las porciones lípidica y proteínica (Boullier y colaboradores 2000). Recientemente se ha comprobado que la CD36 no sólo es el receptor para las Cu^{2+}-oxLDL, sino también para las NO_{2}-LDL, y que la CD36 es responsable de la formación de células esponjosas mediada por las NO_{2}-LDL (Podrez y colaboradores 2000).

Esta fijación es inhibida competitivamente por productos de la oxidación lipídica de 1-palmitoíl-2-araquidonil-sn-glicero-3-fosfocolina. Los autores especulan, por lo tanto, de que la peroxidación de lípidos, catalizada por la mieloperoxidasa, sirve para marcar objetivos de ataque que contienen fosfolípidos, para la fagocitosis por medio de células que contienen CD36. En consonancia con su cometido como receptor para las oxLDL, la CD36 es encontrada en macrófagos cargados con lípidos en calvas arterioscleróticas (Nakata y colaboradores 1999), y las células musculares lisas pueden transformarse in vivo en células esponjosas mediante expresión de CD36 (Ohya y colaboradores
2000).

La ausencia de CD36 parece constituir una protección contra la arteriosclerosis. Así, los ratones, a los que les falta la proteína ApoE, desarrollan calvas arterioscleróticas en el caso de una dieta correspondiente. Si a estos ratones se les desactiva adicionalmente el gen de CD36, los ratones desarrollan, en las mismas condiciones que sus parientes testigos que contienen CD36, un 76% menos de lesiones arterioscleróticas en el árbol aórtico bajo una dieta rica en grasas y un 45% menos de calvas en el seno aórtico bajo una dieta normal.

Los macrófagos de ratones doblemente desactivados con CD36 y ApoE internalizaban más de un 60% menos de LDL oxidadas con cobre y de NO_{2}-LDL (Febbraio y colaboradores 2000).

Un bloqueo de las funciones trombóticas y arterioscleróticas de la CD36, acompañado de una simultánea ausencia de influencia sobre la importante absorción mediada por CD36 de ácidos grasos de cadena larga en la célula, constituiría un paso importante para combatir enfermedades vasculares.

El problema planteado por esta misión es resuelto mediante el presente invento. Dentro del marco del presente invento se comprobó que ciertas funciones celulares, que provocan las oxLDL a través de la CD36, pueden ser provocadas también por otras sustancias. Sorprendentemente, en el caso de estas otras sustancias se trata de proteínas oxidadas, que no necesitan tener ninguna porción lipídica. En el cuerpo las proteínas se oxidan en el caso de la defensa contra infecciones, o respectivamente en calvas arterioscleróticas, o en el caso de inflamaciones agudas y crónicas.

A continuación, se expondrán a modo de ejemplo algunas reacciones, que son provocadas no sólo por las oxLDL, sino también por otras proteínas oxidadas, a través de la CD36:

(1)

Activación de trombocitos

\rightarrow

por una parte, trombosis, infarto cardíaco, apoplejía, pero por otra parte también restañamiento de la sangre (hemostasis)

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(2)

Perjuicio de células endoteliales

\rightarrow

isquemia, reacciones inflamatorias, formación de edemas, trastorno de la liberación de prostaciclina

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(3)

Activación de leucocitos, p.ej.

a)

adhesión aumentada de leucocitos a células endoteliales

b)

fomento de la transmigración de leucocitos a través del endotelio y de los epitelios

c)

albergamiento (en inglés "homing") de leucocitos en calvas arterioscleróticas

d)

cebadura (en inglés "priming") y provocación del estallido por oxidación en fagocitos

e)

expresión del factor tisular en monocitos, en particular un refuerzo de la reacción provocada por lipopolisacáridos (LPS)

\rightarrow

daños causados por reacciones inflamatorias, trombosis, etc.

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(4)

Activación de células musculares lisas (SMC's)

a)

proliferación de SMC's

b)

espesamiento de la íntima en calvas arterioscleróticas

\rightarrow

reoclusión después de una operación quirúrgica de derivación, de la colocación de una prótesis endovascular (stent), de una PTCA (angioplastia coronaria transluminar percutánea); y de una progresión de la arteriosclerosis

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(5)

Estimulación de la liberación de renina desde células yuxta-glomerulares

\rightarrow

hipertensión dependiente de renina en el caso de enfermedades renales

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(6)

Formación de células espumosas a través de una estimulación de la absorción de LDL incubadas conjuntamente mediante una macropinocitosis

\rightarrow

desarrollo/refuerzo de la arteriosclerosis

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(7)

Apoptosis de células vasculares en el centro de lesiones arterioscleróticas

\rightarrow

necrosis, ruptura de calvas

\vskip1.000000\baselineskip

(8)

Estimulación de la expresión de metaloproteinasas de matriz en células endoteliales

\rightarrow

estimulación de la ruptura de calvas arterioscleróticas.

Junto a esto, en este invento se ha comprobado que la IDAAT (antitrombina activada por la defensa inmunológica, del inglés "immune defense activated antithrombin", véase la solicitud de patente alemana nº DE 100.45.047.4) se fija no sólo a la GP120 de VIH y a la CD4, sino también a otras proteínas oxidadas. La GP120 de VIH contiene una secuencia homóloga a la de CD36 (Crombie y colaboradores 1998).

En este invento se comprobó también, que no sólo la IDAAT, sino también otras proteínas oxidadas, dan lugar a la fijación de una trombospondina a células tales como trombocitos, monocitos, células endoteliales y células T. Por tanto se ha de suponer imperativamente que las proteínas oxidadas inducen en general reacciones celulares mediadas por trombospondina, tales como la inhibición de la angiogénesis, la defensa contra infecciones por VIH, la regulación de procesos inflamatorios mediante p.ej. una regulación en sentido descendente (en inglés "downregulation") de IL-12 en monocitos y una regulación en sentido ascendente (en inglés "upregulation") de IL-10. De esta manera, también las propias proteínas oxidadas pueden tener un efecto aprovechable terapéuticamente en determinados procesos patológicos.

Por lo demás, en el marco de este invento se comprobó que las funciones celulares patológicas provocadas por las proteínas oxidadas pueden ser inhibidas por unas sustancias de acuerdo con las reivindicaciones, que inhiben la interacción entre la CD36 y las proteínas oxidadas, o que pueden competir con la TSP fijada a la CD36.

Como ejemplos de tales sustancias se han de describir aquí la trombospondina-1 soluble y los clones 37, 13 y 7 de anticuerpos monoclonales contra la CD36, producidos por nosotros, los autores de este invento.

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Ejemplos 1. Aislamiento de trombospondina-1 humana

El aislamiento de trombospondina-1 humana a partir de trombocitos se efectuó tal como se ha descrito en la cita de Kehrel y colaboradores 1991. A la descripción de Kehrel y colaboradores 1991, se hace referencia expresa por la presente. Sin embargo, desviándose de ella, las plaquetas eran activadas con trombina, y el EDTA en el tampón de lavado se reemplazaba por citrato de Na (0,08 M). Adicionalmente, al tampón de agregación y a todos los tampones para las siguientes etapas de purificación se les añadió Ca^{2+} en una concentración de 2 mM.

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2. Cultivo de hibridoma para la producción de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la CD36 se produjeron ampliamente según las instrucciones de Peters y Baumgartner (1990).

Ratones hembras Balb/c con una edad de 8-12 semanas se inmunizaron con la CD36 purificada (50 \mug/refuerzo (en inglés boost)). Para la inmunización se usó el esquema largo de inmunización (durante 4 meses) de acuerdo con Baumgartner y colaboradores 1990. Aproximadamente 14 días antes del plazo de fusión planeado, se extrajo sangre de los animales y se determinaron los títulos de IgM y de IgG contra la CD36 en el suero de los ratones. Cuando el título de IgG se diferenciaba manifiestamente del testigo todavía en el caso de una dilución de 1:100.000, entonces las células esplénicas se fusionaron con células del Ag 8.653. Las células del Ag 8.653 se seleccionaron con 8-azaguanina 0,13 M en el medio de cultivo. Se extrajeron y prepararon linfocitos a partir del bazo y se fusionaron con el Ag 8.653. Las células fusionadas (1x10^{6} células esplénicas/ml) se incubaron directamente después de la fusión durante 24 horas en un medio de selección (medio de cultivo con adición de hipoxantina, 27,2 \mug/ml, y de azaserina (50 \mug/ml) en una botella de cultivo de células (con una capacidad de 75 ml). En este caso, los macrófagos procedentes del bazo se adhieren a la superficie de material sintético y ya no perturban al cultivo propiamente dicho de los hibridomas en una placa de 96 pocillos.

Las etapas de clonación se llevaron a cabo mediante el procedimiento de dilución (en inglés "limited-dilution-cloning") con una probabilidad de siembra de 0,5 células por pocillo de la placa de 96 pocillos de acuerdo con Würzner 1990. Los materiales sobrenadantes de hibridomas se ensayaron en el procedimiento ELISA en cuanto a la producción de IgG o respectivamente de IgM. Los materiales sobrenadantes de cultivos celulares que eran positivos para IgG, se ensayaron con varios procedimientos en cuanto a su especificidad frente a la CD36:

Se obtuvieron 19 clones específicos para la CD36, que no reaccionaban con plaquetas deficientes en CD36 (descripción: Kehrel y colaboradores 1993, Saelman y colaboradores 1994, Kehrel y colaboradores 1995), pero que mostraban una manifiesta fijación a plaquetas testigos. Este hecho se confirmó tanto mediante citometría de flujo de paso así como también con el procedimiento de borrones -puntos de transferencia (en inglés "dot-blot") y mediante una inmunoprecipitación. Todos los anticuerpos reconocieron a la CD36 purificada. Tres de estos clones (los clones 37, 13 y 7) inhibían la reacción de proteínas oxidadas con células humanas (véase más abajo).

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Aislamiento de la CD36

El aislamiento de la CD36 se efectuó tal como ha sido descrito por nuestro grupo de trabajo (Kronenberg y colaboradores 1998), mediante separación de fases de las proteínas membranales con Triton X-114 y por una subsiguiente cromatografía por afinidad en hemisuccinato de colesterilo - agarosa.

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Ejemplos de la preparación de proteínas oxidadas

348 \mug de una proteína (fibrinógeno usual en el comercio, albúmina humana, albúmina de suero bovino (BSA) o antitrombina) se incubaron con 832 \mug de NaOCl (hipoclorito de sodio) en 1 ml de una solución salina tamponada con fosfato (PBS) con adición de EDTA (0,1 mM) durante 10 minutos sobre hielo. La proteína y el agente oxidante se separaron inmediatamente después del final de la reacción mediante una filtración en gel a 4ºC a través de Sepharose G25-Coarse (columna PD-10, de Amersham Pharmacia).

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Ejemplos del efecto del invento

1.

Las proteínas oxidadas (ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) se fijan específicamente al dominio homólogo a CD36 de la proteína GP120 de VIH (véase la Figura 1). La interacción entre las proteínas oxidadas y la GP120 de VIH se determinó mediante la técnica de resonancia de plasmones en el sistema BIACORE 2000.

2.

Las proteínas oxidadas activan a los trombocitos. Esta activación es inhibida por unas sustancias que inhiben la interacción de CD36 con proteínas oxidadas, o que compiten con una trombospondina fijada a CD36,

a)

Las proteínas oxidadas (ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) refuerzan de un modo dependiente de la dosis la adhesión de trombocitos a proteínas de adhesión, tales como trombospondina, vitronectina, fibrinógeno, fibrina, fibronectina y colágeno (véase la Figura 2a).

\quad

Este refuerzo de la adhesión es inhibido por la trombospondina-1 soluble (véase la Figura 2b). Este refuerzo de la adhesión es inhibido por los clones 37, 13 y 7 de anticuerpos monoclonales contra la CD36 (véanse las Figuras 2c/d, mientras que el péptido VCTG, que inhibe la fijación de trombospondina a la CD36, no tiene ninguna influencia (véase la Figura 2e). El anticuerpo comercial contra la CD36 FA6/152 no muestra ningún efecto inhibidor (véase la Figura 2f).

b)

Las proteínas oxidadas (ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) inducen en presencia de trombospondina-1 (10 \mug/ml) la fijación de fibrinógeno a trombocitos de un modo dependiente de la dosis (véase la Figura 3a). Esta activación es inhibida por la trombospondina-1 soluble en una concentración de > 20 \mug/ml (véase la Figura 3b).

\quad

Esta activación es inhibida por clones 37, 13 y 7 de anticuerpos monoclonales contra la CD36 (véanse las Figuras 3c-e).

c)

Las proteínas oxidadas (ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) inducen la agregación de las plaquetas en presencia de trombospondina-1 (10 \mug/ml) (véase la Figura 4a). Esta agregación es inhibida por los clones 37, 13 y 7 de anticuerpos monoclonales contra la CD36, de un modo dependiente de la dosis (véase la Figura 4b).

d)

Las proteínas oxidadas (ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) provocan en presencia de trombospondina-1 (10 \mug/ml) el estado procoagulante de las plaquetas (véanse las Figuras 5a-c) y conducen a la formación de micropartículas (véase la Figura 5d). Esta activación es inhibida por la trombospondina-1 soluble en unas concentraciones de \geq 20 \mug/ml (véase la Figura 5e).

\quad

Esta activación es inhibida por los los clones 37, 13 y 7 de anticuerpos monoclonales de un modo dependiente de la dosis (véanse las Figuras 5f y g).

3.

Las proteínas oxidadas (ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) activan a los monocitos. Esta activación es inhibida por sustancias tales como p.ej. una trombospondina soluble o anticuerpos monoclonales dirigidos contra la CD36, que inhiben la interacción entre la CD36 y las proteínas oxidadas o que compiten con una trombospondina fijada a la CD36, de un modo dependiente de la dosis.

a)

Las proteínas oxidadas (p.ej. ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) inducen una señal de Ca^{2+} en monocitos (véase la Figura 6).

b)

Las proteínas oxidadas (p.ej. ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) inducen en PMNL (leucocitos polimorfonucleares) el estallido por oxidación (véase la Figura 7).

c)

Las proteínas oxidadas (p.ej. ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) inducen una transmigración aumentada de monocitos, PMNL y linfocitos a través de una monocapa endotelial (véase la Figura 8a). Esta reacción es inhibida por unas sustancias que inhiben la fijación de la CD36 a las proteínas oxidadas, tales como una trombospondina soluble o anticuerpos monoclonales contra la CD36, clones 37, 13 y 7 (véase la Figura 8b).

4.

Las proteínas oxidadas (p.ej. ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) participan causalmente en la génesis de la arteriosclerosis.

a)

Las proteínas oxidadas (ox-fibrinógeno, ox-antitrombina III, ox-BSA, ox-albúmina humana) inducen un albergamiento de macrófagos en calvas arterioscleróticas. El albergamiento se llevó a cabo de acuerdo con Patel y colaboradores 1998. En el caso de ratones C57BL/6 se estimuló la migración de monocitos/macrófagos dentro del peritoneo mediante una inyección intraperitoneal de un tioglicolato. Después de 4 días, se lavó el peritoneo y se obtuvieron macrófagos peritoneales activados. En las muestras se lisaron los eritrocitos. Los macrófagos se recogieron en un medio RPMI 1640 y se transfirieron a placas de cultivo de células, a fin de hacerles posible la adhesión. Unas microesferas marcadas por fluorescencia (2 \mum yellow-green fluorescent latex microspheres = microesferas de látex fluorescentes de amarillo-verde, de Molecular Probes) fueron opsonadas, para la mejor absorción por los fagocitos, durante 30 minutos con un suero de ratón al 50% y luego se añadieron a los macrófagos sembrados en una placa. Los macrófagos adherentes fagocitaron a las microesferas. Las células y las microesferas no adheridas se separaron de la placa mediante lavado. Los macrófagos marcados se desprendieron de la placa sobre hielo y se resuspendieron en la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, del inglés "Hanks balanced salt solution"). A ratones deficientes en ApoE con una edad de 50 semanas se les inyectaron por vía intraperitoneal, en cada caso 3 veces, cada vez 50 \mug de una proteína oxidada, aquí antitrombina III oxidada, o respectivamente un placebo (sólo HBSS); 6 horas antes de la inyección por vía intravenosa de macrófagos marcados, 2 horas después de una inyección de macrófagos y 10 horas después de una inyección de macrófagos. Se suspendieron 10x10^{6} macrófagos en 0,2 hasta 0,3 ml de HBSS y se inyectaron en la vena caudal. A las 24 horas después de la inyección de los macrófagos, se sacrificaron los animales. La base del corazón y la aorta ascendente se embebieron en OCT, se almacenaron a -80ºC y se produjeron unas secciones criogénicas con un grosor de 7 \mum. Se recontaron los macrófagos marcados por fluorescencia de 140 secciones en serie por ratón, de una zona que comprende 1 mm de la aorta ascendente en el plano del seno de Valsalva. En comparación con ratones testigos ApoE^{-/-} tratados con el placebo, la migración de macrófagos marcados en las calvas arterioscleróticas aumentó en ratones tratados con la antitrombina III oxidada desde 100 \pm 15% (n = 14) hasta 156 \pm 9,2% (n = 5) de una manera significativa (p = 0,008) (ensayo de Welch alternativo). Puesto que esta inmigración está vinculada causalmente con la génesis, el progreso y el peligro de ruptura de las calvas arterioscleróticas, este resultado ilustra la peligrosidad de las proteínas oxidadas en lo que se refiere a la arteriosclerosis (Figura 9).

b)

Las sustancias que inhiben la interacción entre la CD36 y las proteínas oxidadas o que compiten con una trombospondina fijada a la CD36, impiden o reducen el efecto pro-arteriosclerótico de las proteínas oxidadas. Una trombospondina soluble inhibe la adhesión de macrófagos a células endoteliales modificadas de manera arteriosclerótica. Este hecho constituye la premisa para la inmigración de macrófagos en calvas arterioscleróticas. Se estimularon células endoteliales inmortalizadas murinas durante 6 horas con las \beta-VLDL (50 \mug de proteína/ml) procedente del plasma de ratones deficientes en ApoE y luego se superfundieron con 2x10^{5} monocitos/macrófagos peritoneales por ml, con una velocidad de cizalladura de 400 s^{-1}, en una cámara de flujo de paso. Las \beta-VLDL inducían un aumento relativo significativo de los leucocitos rodantes en un 224 \pm 44% en comparación con el testigo. La adición de 10 \mug/ml de una trombospondina soluble inhibía por completo este aumento de la adhesión e inhibía adicionalmente de una manera parcial la adhesión básica de los macrófagos al endotelio (75 \pm 37% de adhesión en comparación con el testigo n = 4-7; p < 0,01) (véase la Figura 10a). La adhesión permanente de los macrófagos, inducida manifiestamente por las \beta-VLDL, después de un período de tiempo de lavado durante 5 minutos, fue reducida asimismo por la trombospondina-1 (100 \pm 21% del testigo frente a 300 \pm 119% de las \beta-VLDL frente a 157 \pm 70% de las \beta-VLDL + TSP-1; n = 4-7; p > 0,01) (Figura 10b).

5.

La trombospondina-1 soluble inhibe a reacciones inflamatorias in vivo. En la oreja de ratones Balb/c se provocó una reacción de Arthus mediante una inyección local de anti-BSA en el momento 0 y mediante una inyección simultánea de BSA acoplada con FITC en el peritoneo. A animales testigos (testigos negativos) se les inyectó sólo FITC (fluoresceína-5-isotiocianato) (sin BSA) en el peritoneo. Después de aproximadamente 6 horas, se mostró una reacción inflamatoria pronunciada manifiestamente con un hinchamiento de la oreja (edema), una incorporación de FITC, una inmigración de PMNL y unas penetraciones de sangre petequial en el tejido en el caso de los animales tratados con anti-BSA y con BSA-FITC. A 18 ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal adicionalmente en el momento 0 y después de 0 + 3 horas, en cada caso 50 \mug de trombospondina-1 en un tampón (PBS). 16 ratones testigos recibieron sólo PBS en el momento 0 + 3 horas. Mediante una trombospondina se impidió casi totalmente la reacción de Arthus. Los ratones tratados con trombospondina mostraron unas incorporaciones de FITC significativamente más pequeñas, unos grosores de las orejas significativamente más pequeños (menos edemas) y casi ninguna petequia en comparación con los animales testigos tratados con PBS (véanse las Figuras 11a-c).

6.

Ejemplos de la cuantificación de las proteínas oxidadas.

\quad

Producción de anticuerpos monoclonales, que reconocen a epítopos modificados directa o indirectamente por procesos de oxidación en proteínas o péptidos:

\quad

La albúmina humana, la antitrombina III y el fibrinógeno se oxidaron, tal como se ha descrito en esta comunicación del invento, con HOCl y con ellas se inmunizaron hembras de ratones Balb/c con una edad de 8-12 semanas. La producción y el cultivo de los hibridomas se efectuaron según procedimientos clásicos. Los materiales sobrenadantes de hibridomas se ensayaron en cuanto a la producción de IgG o respectivamente IgM. Los materiales sobrenadantes de los cultivos de células, que eran positivos para IgG, se ensayaron en cuanto a una reacción positiva con una proteína oxidada, en el caso de una reacción simultáneamente negativa con la proteína de partida no modificada. Los clones, que producían anticuerpos dirigidos contra la proteína oxidada (ox-albúmina humana, ox-antitrombina III, ox-fibrinógeno) y que simultáneamente no reaccionaban con una proteína madre no oxidada, se ensayaron en cuanto a una reacción cruzada con otras proteínas oxidadas y otros péptidos oxidados.

\quad

La cuantificación de las proteínas oxidadas con ayuda de anticuerpos monoclonales se llevó a cabo tal como se ha descrito más arriba:

\quad

Tal cuantificación se puede realizar fácilmente con procedimientos tales como ELISA, RIA, citometría cuantitativa de flujo de paso sobre superficies de células y con procedimientos rutinarios similares.

\quad

p.ej.: Cuantificación de albúmina humana oxidada con ayuda de un ELISA.

\quad

Un anticuerpo policlonal, procedente de un conejo, dirigido contra albúmina humana (producción - procedimiento rutinario) se fijó como anticuerpo captador al fondo de una placa para ELISA (Nunc-Maxisorb). La placa se lavó a fondo con un PBS de pH 7,4, Tween 20 al 0,5%, y los sitios situados sobre la superficie del plástico se bloquearon con BSA al 3% durante 1 hora a la temperatura ambiente (TA). La placa se lavó de nuevo y a continuación se incubó durante 1 hora a la TA con plasmas, sueros, materiales sobrenadantes de productos de sangre (p.ej. concentrados de trombocitos, concentrados de eritrocitos, FFP), todos ellos diluidos diversamente, o con unas soluciones tamponadoras, a los/las que se les había añadido ox-albúmina humana en una cantidad definida. El material de las muestras y respectivamente las soluciones patrón se retiraron, la placa se lavó a fondo y se incubó con el anticuerpo monoclonal antes descrito, que reconoce a la albúmina humana oxidada y que había sido marcado con biotina, en una dilución de 1:15.000 en PBS, 1% de NGS (suero normal de cabra, del inglés "normal goat serum"). La placa se lavó de nuevo múltiples veces, y se incubó con estreptavidina - peroxidasa (durante 1 hora, a la TA). Después de haber lavado nuevamente la placa, ésta se mezcló con una solución del substrato (100 \mul/pocillo) (20 mg de orto-fenil-diamina, 5% de H_{2}O_{2} en un tampón a base de 12,15 ml de ácido cítrico 0,1 M y 12,85 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M más 25 ml de H_{2}O destilada). La extinción a 405 nm, medida en un fotómetro para ELISA, refleja la cantidad de albúmina humana oxidada. La reacción se interrumpió con 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 4 N y se midió la extinción a 490 nm.

\quad

La albúmina humana oxidada con HOCl en la muestra de medición se cuantificó a través de una serie de calibración. En el caso de un fibrinógeno modificado con HOCl y de una antitrombina III modificada con HOCl se procedió de una manera análoga.

7.

Ejemplo de la determinación del estado de activación del receptor para proteínas oxidadas, CD36.

\quad

Producción de anticuerpos policlonales dirigidos contra la CD36 fosforilada en la treonina (92).

\quad

Los péptidos (de 15 AS = aminoácidos) (1) Lys, Gin, Arg, Gly, Pro, Tyr, Thr, Tyr, Arg, Val, Arg, Phe, Leu, Ala, Lys y (2) Lys, Gin, Arg, Gly, Pro, Tyr, \underline{fosfoThr}, Tyr, Arg, Val, Arg, Phe, Leu, Ala, Lys (como en el péptido (1), pero fosforilado en la treonina) se sintetizaron y se acoplaron con KLH (hemocianina de lapa de bocallave, del inglés Keyhole Limpet Hemocyanin). Los anticuerpos policlonales procedentes de un conejo se produjeron con estos péptidos acoplados, según procedimientos clásicos. Para esto se inmunizaron básicamente conejos (de Nueva Zelanda, blancos) s.c. (por vía subcutánea) con 250 \mug del péptido 1-KLH o respectivamente del péptido 2-KLH más la adición de un adyuvante de Freund completo y se reforzaron ("geboostert") 3 veces con 250 \mug del péptido 1-KLH o respectivamente del péptido 2-KLH con la adición de Alu-Gel-S (1,3% de hidróxido de aluminio en agua, de SIGMA). A los animales se les extrajo sangre de la vena de oreja, se produjo un suero y éste se ensayó en cuanto a anticuerpos dirigidos contra los péptidos utilizados para la inmunización. El anticuerpo dirigido contra el péptido de CD36 fosforilado se absorbió de modo cruzado en una columna de afinidad con el péptido de CD36 no fosforilado, de tal manera que la mezcla obtenida de anticuerpos sólo contenía anticuerpos, que reconocen específicamente a una CD36 fosforilada, no activada (AK CD36P). (La producción de anticuerpos monoclonales específicos dirigidos contra una CD36 fosforilada en la treonina/desfosforilada es posible con estos péptidos de una manera análoga a la producción descrita del anticuerpo anti-proteína de CD36).

\quad

Ambos antisueros policlonales reaccionaron con la CD36 sobre la superficie de las plaquetas en la citometría de flujo de paso. Mientras que el anticuerpo "CD36P" dirigido contra una CD36 fosforilada reconoce a la CD36 preferentemente en trombocitos no activados, el anticuerpo "CD36 total" reconoce a la CD36 no fosforilada y a una CD36 fosforilada. En el caso de una activación de los trombocitos, la CD36 es desfosforilada y la capacidad de fijación para anticuerpos "CD36P" disminuye (véase la Figura 12). Mediante una citometría cuantitativa de flujo de paso con ambos anticuerpos es posible un cálculo de la proporción de CD36 activada.

8.

El organismo de pacientes con diabetes del tipo I es especialmente sensible para proteínas oxidadas:

\quad

p.ej.: Los trombocitos de pacientes con diabetes del tipo I reaccionan frente a una proteína oxidada como agonista más sensiblemente que los trombocitos de voluntarios testigos sanos. La fijación de fibrinógeno dependiente de la activación puede ser provocada en trombocitos de enfermos diabéticos con unas concentraciones de proteína oxidada, menores que en trombocitos de voluntarios testigos (véase la Figura 13).

9.

Las proteínas oxidadas impiden una infección con VIH (virus de inmunodeficiencia humana).

\quad

Las proteínas oxidadas (se ensayaron ox-antitrombina III y ox-albúmina humana) se fijan con una alta afinidad tanto a la GP120 de VIH, como también a su receptor CD4.

\quad

p.ej.: La fijación de antitrombina III oxidada y de albúmina humana oxidada a la GP120 de VIH y a la CD4 se detectó en el sistema BIACORE 2000. Tampón de elución: Tris 25 mM; NaCl 100 mM de pH 7,4; CaCl_{2} 1 mM; MgCl_{2} 1 mM; Surfactant P-20 al 0,005%.

\quad

Proteína GP-120 de VIH: c = 100 \mug/ml, 200 \mul.

\quad

Tampón de almacenamiento: Tris/HCl, NaCl de pH 7,6.

\quad

Proteína CD4: c = 63 \mug/ml, 318 \mul.

\quad

Tampón de almacenamiento: Tris 10 mM; NaCl 300 mM de pH 8.

\quad

Proteína ox-antitrombina III: c = 1 mg/ml, 120 \mul.

\quad

Proteína ox-albúmina humana: c = 1 mg/ml, 120 \mul.

\quad

Chip C1 (de BIACORE AB).

\quad

Estuche de acoplamiento con aminas (de BIACORE AB).

\quad

La GP120 de VIH y la CD4 se inmovilizaron sobre la superficie del sensor C1. En este caso, se utilizaron como tampón de acoplamiento 10 mM de NaAc de pH 4.

\quad

Condiciones de acoplamiento: GP120 de VIH: 20 \mul; 10 \mug/ml de GP120 en 10 mM de NaAc de pH 4; cantidad inmovilizada: 1.158 UR, 300 pg.

\quad

CD4: 30 \mul; 6,3 \mug/ml de CD4 en 10 mM de NaAc de pH 4; cantidad inmovilizada: 568 UR, 148 pg.

\quad

La superficie del chip se saturó con BSA y se investigó la fijación de las proteínas oxidadas. Para ello se inyectaron p.ej. 50 \mul de antitrombina III oxidada en diferentes concentraciones con una velocidad de flujo de 20 \mul/min. Las soluciones de proteínas se diluyeron con el tampón de carga. Con una concentración creciente de antitrombina III oxidada aumentan las señales resultantes.

\quad

La Figura 14 es el gráfico superpuesto (en inglés Overlay-Plot) de 12 sensogramas, que muestran la fijación de antitrombina III oxidada a una CD4 inmovilizada y la disociación.

\quad

La evaluación cuantitativa dio para la fijación.

a)

de antitrombina III oxidada a la GP120 de VIH:

\quad

K_{on} (1/Ms): 6,38 x 10^{5}

\quad

K_{off} (1/s): 4,44 X 10^{-4}

\quad

y una K_{D}[M] de 7,01 x 10^{-10} y

b)

de antitrombina III oxidada a la CD4:

\quad

K_{on} (1/Ms): 7,13 x 10^{5}

\quad

K_{off} (1/s)': 1,12 X 10^{-3}

\quad

y una K_{D}[M] de 1,63 x 10^{-9},

c)

la antitrombina III no modificada no se fijaba ni a la GP120 de VIH ni a la CD4. La albúmina humana oxidada se fijaba con una afinidad para la GP120 de VIH y para la CD4 todavía más alta que la antitrombina III oxidada. La albúmina humana no oxidada no se fijaba ni a la GP120 de VIH ni a la CD4. La proteína oxidada inhibe la infección con VIH-1 de células monocitarias procedentes de sangre periférica (PBMC).

\quad

Unas PBMC activadas con PHA se incubaron en común con un suero humano negativo 1:100 (testigo negativo), con anticuerpos específicos para el bucle V3 neutralizante (testigo positivo), con una proteína oxidada (150 \mug/ml) y con un material aislado primario de VIH-1 de CCR5-tropical (903) procedente de un paciente, y después de 5 días se investigó la producción de virus mediante un P24-ELISA. Para ello se recogieron PBMC activadas con PHA de nueva aportación en un medio RPMI 1640 más FKS al 20% más 100 U/ml de IL-2 en una concentración celular de 2x10^{6} células/ml, y se distribuyeron en cada caso con 200.000 células/pocillo/100 \mul sobre una placa de fondo plano de 96 pocillos.

\quad

Las sustancias que se han de ensayar en cuanto a una inhibición,

\quad

testigo positivo: anticuerpo anti-bucle V3 neutralizante (1:100)

\quad

un testigo negativo: suero humano negativo 1:100

\quad

verum: proteína oxidada (150 \mug/ml)

\quad

se añadieron a las células en un medio RPMI y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC/con 5% de CO_{2}. A continuación se añadió el virus VIH-1 a las tandas: en cada caso 10 \mul/pocillo de un material sobrenadante de un material aislado primario 903 de VIH-1 (CCR5-tropical) con 20.000 TCID_{50} (dosis infecciosa de 50 % para el cultivo de tejidos)/ml \cong 1.000 TCID_{50}/ml en el pocillo. Estas tandas se incubaron durante una noche a 37ºC/con 5% de CO_{2}. Al día siguiente se lavaron las células 3 tres veces con RPMI 1640 y se añadió un medio de cultivo nuevo. Al quinto día después de la infección se llevaron a cabo las investigaciones con el P24-ELISA.

\quad

P24-ELISA:

\quad

Los anticuerpos anti P24 utilizados (11-G7 [de Niedrig, Berlín, Alemania] y D7320 [de Biochrom] reconocen a la proteína P24 de la variante 903 de material aislado primario que se utilizaba. Las placas de ELISA Maxi-Sorb (de Nunc) se revistieron con estos anticuerpos durante una noche. El material sobrenadante de virus procedente del ensayo de inhibición se desactivó con 1% de Triton X-100. El material sobrenadante de virus desactivado y los anticuerpos de detección conjugados con la fosfatasa alcalina (BC1071-Ap [de Aalto], después de un lavado con PBS de los pocillos revestidos, se transfirieron en común a los pocillos, y allí se incubaron durante 5 horas a 37ºC. Los pocillos se lavaron de nuevo con PBS, el substrato disuelto para la fosfatasa alcalina, fosfato de para-nitrofenilo (de Sigma), se añadió a los pocillos y se midió el desarrollo de color después de 20 minutos a 405 nm en el fotómetro de ELISA, Los valores paralelos en el P24-ELISA utilizado oscilaban en hasta 0,02 unidades de densidad óptica (Do) en torno a un valor medio común. Mientras que la Do a 405 nm para el testigo negativo \cong ninguna inhibición estaba situada en 0,8, el anticuerpo neutralizante (el testigo positivo) reducía la Do a 0,12. 150 \mug/ml de proteína oxidada reducían la oD a 0,10. Mediante adición de proteínas oxidadas se podía inhibir eficazmente la infección con VIH-1 de las PMBCs.

10.

Las proteínas oxidadas inducen la fijación de TSP a células

\quad

Las proteínas oxidadas (aquí se utilizaron como ejemplo ox-albúmina humana, ox-antitrombina III y ox-fibrinógeno) inducen de una manera específica y dependiente de la dosis la fijación de TSP-1 a células que contienen CD36 (véanse las Figuras 15a-d).

Los objetos del presente invento se desprenden de las reivindicaciones de patente.

En una forma de realización preferida del invento, los medicamentos contienen los anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a CD36, estando contenidos, de nuevo de una manera especialmente preferida, anticuerpos monoclonales, inclusive fragmentos de anticuerpos tales como los F(ab)_{2}, F(ab), o la región de reconocimiento de anticuerpos.

En otra forma de realización preferida, el medicamento contiene unas proteínas, que inhiben la fijación de la CD36 a proteínas oxidadas, o que compiten con una trombospondina fijada a la CD36, tratándose de una trombospondina soluble.

Por otra parte, es objeto del presente invento el medicamento conforme al invento para su utilización en la profilaxis de trombosis, en particular en enfermedades inflamatorias, en el apoyo de una terapia antitrombótica, en la evitación de un rechazo de un trasplante, en la evitación de una arteriosclerosis debida a un trasplante, en la evitación del desarrollo y de la progresión de enfermedades arterioscleróticas (ateroscleróticas), en el tratamiento de reacciones inflamatorias crónicas, en la evitación de una reoclusión vascular temprana después de una operación quirúrgica de derivación (en inglés bypass), de la colocación de una prótesis endovascular (stent), de una PTCA, o de otras, en la evitación de una reestenosis vascular después de una operación quirúrgica de derivación, de la colocación de una prótesis endovascular (stent), de una PTCA, o de otras, en la evitación de daños por reperfusión, tales como, pero no estando restringido a, una isquemia del miocardio, un trasplante de órgano, una apoplejía, una enfermedad por oclusión periférica, después de intervenciones quirúrgicas o/y fallos de múltiples órganos después de una reanimación satisfactoria, en la evitación de daños vasculares, en particular en el caso de pacientes con diabetes mellitus, en la evitación de una inhibición de la proliferación del endotelio y de una angiogénesis, provocadas por proteínas oxidadas a través de CD36 y TSP-1, así como en el apoyo de la cicatrización de heridas.

De nuevo un objeto adicional del presente invento es un procedimiento para la cuantificación de proteínas oxidadas (en particular de ox-antitrombina III, ox-albúmina humana u ox-fibrinógeno), en cada caso individualmente o todas ellas juntas, para realizar el control de la calidad de productos de sangre.

Los medicamentos conformes al invento también están caracterizados porque pueden contener otras sustancias coadyuvantes o/y de vehículo farmacéuticamente aceptables. Los medicamentos conformes al invento se adecuan de manera preferida para la administración por vía local, intradérmica, superficial, intraperitoneal, intravenosa, oral o intramuscular, o se pueden administrar a través de vesículas. Además, se prefiere que los medicamentos conformes al invento contengan otras sustancias, tales como p.ej. antibióticos, agentes inmunosupresores o partícipes en interacciones de proteínas oxidadas en el cuerpo. Mediante la adición de tales sustancias pueden ser fomentados y apoyados adicionalmente los efectos del medicamento conforme al invento.

Las proteínas o los péptidos oxidadas/os dentro del marco del presente invento se producen de acuerdo con el presente invento de manera preferida por reacción con HOCl o peroxinitritos.

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Leyendas acerca de las figuras

Figura 1

Las proteínas oxidadas se fijan a un dominio homólogo de la CD36 en la proteína G120 de VIH-1

1) Gráfico superpuesto de 12 sensogramas, que muestran la fijación de antitrombina III a la GP120 de VIH inmovilizada y la disociación de antitrombina III oxidada. La GP120 de VIH es inmovilizada (300 pg); la concentración de antitrombina III oxidada se hizo variar (desde abajo hacia arriba: 0 nM; 1 nM; 5,1 nM; 10,2 nM; 17 nM; 20,4 nM; 23 nM; 34 nM; 40,8 nM; 51 nM; 85 nM; 119 nM). Con una concentración creciente de AT III oxidada aumenta la señal resultante.

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Figura 2

Las proteínas oxidadas actúan de modo hemostático/protrombótico - - - Aumento de la adhesión de trombocitos/inhibi- ción de esta reacción

2a) Las proteínas oxidadas aumentan la adhesión de las plaquetas a colágeno del tipo I. La adhesión de los trombocitos se llevó a cabo de acuerdo con Santoro y colaboradores 1994. Una placa de cultivo de células de 96 pocillos se revistió con colágeno del tipo I (25 \mug/ml; 100 \mul/pocillo) durante una noche a 4ºC y las placas se bloquearon con BSA. Unos trombocitos humanos se purificaron con respecto de proteínas plasmáticas mediante una filtración a través de un gel en un tampón de HEPES -Tyrode de pH 7,4, con una adición de 2 mM de Mg^{2+}, 1 mM de Mn^{2+}, 0,9% de glucosa y 0,35% de BSA. 100 \mul de plaquetas filtradas a través de un gel (300.000/\mul) se incubaron en los pocillos, con y sin proteínas oxidadas, durante 1 hora a la TA dentro de una cámara húmeda. Los trombocitos no adheridos se separaron por lavado a fondo. El número de las plaquetas adheridas se determinó mediante una lisis de las plaquetas con Triton X-100 y una detección de la enzima lisosómica hexosaminidasa. Para la calibración del ensayo de adhesión, se añadió a la placa de microtitulación una serie de calibración con un número creciente conocido de plaquetas, y se determinó la extinción del substrato reaccionado p-nitrofenil-N-acetil-\beta-D-glucosaminida en relación con el número de las plaquetas. La antitrombina III oxidada aumentaba la adhesión de los trombocitos de un modo dependiente de la dosis.

2b) Se emplearon trombocitos en el ensayo de adhesión arriba descrito y se activaron con 50 \mug/ml de ATIII oxidada. La adición de una trombospondina purificada, soluble inhibía de un modo dependiente de la dosis la adhesión de los trombocitos, que se había aumentado mediante la ATIII oxidada.

2c) Se emplearon trombocitos en el ensayo de adhesión arriba descrito y se activaron con ATIII oxidada. Los anticuerpos monoclonales, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36, tales como los clones 37, 13 y 7, inhiben el efecto de la ATIII oxidada. Todos los experimentos acerca de la influencia de anticuerpos sobre funciones de los trombocitos, se llevaron a cabo en presencia de concentraciones saturadoras, completamente bloqueadoras, de fragmentos Fab de un anticuerpo dirigido contra el receptor de FcRIIA (clon IV.3), a fin de excluir los efectos del receptor de Fc.

2d) Este efecto es dependiente de la dosis.

2e) La inhibición de la adhesión de trombocitos mediante trombospondina-1 soluble no es mediada directamente a través de su sitio de fijación a la CD36 (péptido VTCG). El VTCG no muestra ninguna influencia sobre el aumento de la adhesión de trombocitos por proteínas oxidadas (aquí ATIII oxidada).

2f) Los anticuerpos dirigidos contra la CD36, que no inhiben la fijación de CD36 a proteínas oxidadas, tales como el clon FA6/152, no provocan por el contrario ninguna inhibición significativa. Todos los experimentos acerca de la influencia de anticuerpos sobre las funciones de los trombocitos se llevaron a cabo en presencia de concentraciones saturadoras, completamente bloqueadoras, de fragmentos Fab de un anticuerpo dirigido contra el receptor de FcRIIA (clon IV.3), a fin de excluir los efectos del receptor de Fc.

Figura 3

Las proteínas oxidadas actúan de modo hemostático/protrombótico - - - Aumento de la fijación de fibrinógeno a trombocitos/inhibición de esta reacción

A unas plaquetas filtradas a través de un gel (50.000/\mul) en un tampón de HEPES-Tyrode-BSA se les añadieron fibrinógeno conjugado con FITC y 10 \mug/ml de una trombospondina. Una parte de las muestras se mezcló con proteínas oxidadas en concentraciones crecientes. Después de una incubación durante 30 minutos a la TA, se determinó la fijación de fibrinógeno en el citómetro de flujo de paso.

3a) Las proteínas oxidadas (aquí, como ejemplo, fibrinógeno oxidado, albúmina humana oxidada y antitrombina III oxidada) refuerzan la fijación del fibrinógeno a los trombocitos.

3b) La trombospondina-1 soluble inhibe de un modo dependiente de la dosis la fijación de fibrinógeno provocada por una proteína oxidada.

3c) Los anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36, inhiben de un modo dependiente de la dosis la fijación de fibrinógeno a trombocitos, inducida por proteínas oxidadas

proteína oxidada: ATIII oxidada;

anticuerpo: AK anti CD36, clon 37.

3d) proteína oxidada: fibrinógeno oxidado;

anticuerpo: AK anti CD36, clon 37.

3e) proteína oxidada; albúmina humana oxidada

anticuerpo: AK anti CD36, clon 37.

Todos los experimentos acerca de la influencia de anticuerpos sobre las funciones de los trombocitos se llevaron a cabo en presencia de concentraciones saturadoras, completamente bloqueadoras, de fragmentos Fab de un anticuerpo dirigido contra el receptor de FcRIIA (clon IV.3), a fin de excluir los efectos del receptor de Fc.

Figura 4

Las proteínas oxidadas actúan de modo hemostático/protrombótico - - - Inducción de la agregación de los trombocitos/inhibición en esta reacción

4a) Las proteínas oxidadas inducen la agregación de los trombocitos. La agregación de los trombocitos se llevó a cabo de acuerdo con Born 1962. A unas plaquetas filtradas a través de un gel (200.000/\mul) en un tampón de HEPES-Tyrode de pH 7,4, con 100 \mug/ml de fibrinógeno, se les añadió con pipeta TSP-1 (25 \mug/ml) en una cubeta de agregación. La TSP-1 soluble no provocaba por sí sola ninguna agregación. La administración simultánea de proteínas oxidadas (en el presente caso fibrinógeno oxidado o antitrombina III oxidada) conducía a una fuerte formación de agregados.

La trombospondina soluble inhibía en altas concentraciones > 50 \mug/ml la agregación provocada por las proteínas oxidadas.

4b) Los anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36, inhiben de un modo dependiente de la dosis la agregación de plaquetas inducida por proteínas oxidadas. Todos los experimentos acerca de la influencia de anticuerpos sobre las funciones de los trombocitos, se llevaron a cabo en presencia de concentraciones saturadoras, completamente bloqueadoras, de fragmentos Fab de un anticuerpo dirigido contra el receptor de FcRIIA (clon IV.3, a fin de excluir los efectos del receptor de Fc.

Figura 5

Las proteínas oxidadas actúan de modo hemostático/protrombótico - - - Inducción del estado procoagulante de los trombocitos y de la formación de micropartículas/inhibición de esta reacción

5a) Las proteínas oxidadas (aquí, como ejemplo, fibrinógeno oxidado) inducen una fijación del factor V/Va a trombocitos. La fijación del factor V/Va se llevó a cabo tal como fue descrito por nosotros en la cita de Dörmann y colaboradores 1998.

5b) Las proteínas oxidadas (aquí, como ejemplo, fibrinógeno oxidado) inducen la fijación del factor X/Xa a trombocitos. La fijación del factor X/Xa se llevó a cabo tal como fue descrito por nosotros en la cita de Dörmann y colaboradores 1998.

5c) Las proteínas oxidadas (aquí, como ejemplo, fibrinógeno oxidado) inducen el movimiento en vaivén (denominado flip-flop) de los fosfolípidos en la membrana y, por consiguiente, la fijación de anexina V a trombocitos. La fijación de anexina V se llevó a cabo tal como fue descrito por nosotros en la cita de Dörmann y colaboradores 1998.

5d) Las proteínas oxidadas (aquí, como ejemplo, fibrinógeno oxidado) inducen la formación de micropartículas de trombocitos. Unas plaquetas filtradas a través de un gel (50.000/\mul) se incubaron con una proteína oxidada durante 30 minutos a la TA mediando una ligera basculación. Después de esto, las plaquetas y las micropartículas resultantes a partir de las plaquetas se incubaron durante 30 minutos con el anticuerpo anti GPIX-PE y se midió el número de las micropartículas resultantes en relación con 5.000 partículas recontadas en el citómetro de flujo de paso.

5e) Una trombospondina soluble inhibe la formación de micropartículas provocada por proteínas oxidadas. En este Ejemplo de ensayo se indujo la formación de micropartículas a partir de trombocitos mediante albúmina humana oxidada. Unas plaquetas filtradas a través de un gel en un tampón de Hepes-Tyrode de pH 7,4, se activaron cada vez con 50 \mug/ml de albúmina humana oxidada durante 1 h a la TA. La suspensión de plaquetas se mezcló, antes de la activación, con TSP soluble en las concentraciones indicadas. La formación de micropartículas se analizó tal como se ha descrito en 5d). La trombospondina soluble inhibe la formación de micropartículas de un modo dependiente de la dosis.

5f) El clon 37 de AK anti CD36 inhibe la formación del estado procoagulante de las plaquetas, inducida por la proteína oxidada. La formación de anexina V, como indicadora de la formación de una superficie de membrana procoagulante de los trombocitos, se midió tal como se ha descrito dentro de 5c). La incubación previa de las plaquetas con anticuerpos anti CD36 (durante 30 min, a la TA), que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36, inhibía la subsiguiente activación de estas plaquetas por medio de proteínas oxidadas (aquí, como ejemplo, fibrinógeno oxidado). Todos los experimentos acerca de la influencia de anticuerpos sobre las funciones de los trombocitos se llevaron a cabo en presencia de concentraciones saturadoras, completamente bloqueadoras, de fragmentos Fab de un anticuerpo dirigido contra el receptor de FcRIIA (clon IV.3), a fin de excluir los efectos del receptor de Fc.

5g) El AK 37 anti CD36 inhibe la formación de micropartículas que ha sido provocada por proteínas oxidadas. La formación de micropartículas se determinó tal como se ha descrito dentro de 5d). La incubación previa de las plaquetas con anticuerpos anti CD36 (durante 30 min, a la TA), que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36, antes de la activación con proteínas oxidadas (aquí, como ejemplo, fibrinógeno oxidado), inhibe la formación de micropartículas.

Figura 6

Las proteínas oxidadas activan a leucocitos - - - señal de Ca^{2+}

Las proteínas oxidadas (aquí se muestra antitrombina III oxidada) inducen una señal de Ca^{2+} en monocitos. Las mediciones de Ca^{2+} se llevaron a cabo de acuerdo con Sozzani y colaboradores 1993. Unos monocitos elutriados (5x10^{6}/ml) se lavaron a la TA con un tampón de HEPES-Tyrode de pH 7,4, y a continuación se marcaron durante 15 minutos con 1 \muM de Fura2/AM a 37ºC, se lavaron dos veces con un tampón de HEPES-Tyrode sin Ca^{2+} y luego se recogieron en un tampón de HEPES-Tyrode con 1 mM de Ca^{2+}. La señal de Ca^{2+}, inducida por proteínas oxidadas y por sustancias eficaces como testigos positivos y negativos, se determinaron fluorimétricamente en el aparato de Hitachi F-2000. La antitrombina III oxidada (100 \mug/ml) activa a los monocitos y provoca una manifiesta señal de Ca^{2+}.

Figura 7

Las proteínas oxidadas activan a leucocitos - - - estallido por oxidación

Las proteínas oxidadas refuerzan de un modo dependiente de la dosis el efecto activador del péptido fMLF sobre el estallido por oxidación de los PMNL e incluso también lo provocan como agonistas independientes y autónomos. La inducción del estallido por oxidación se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante con el ensayo Phagotest/de estallido de la entidad Orpegen (Heidelberg, Alemania) en el citómetro de flujo de paso, incubándose, sin embargo, en primer lugar los PMNL con el substrato DHR123 y a continuación activándose los PMNL. La antitrombina III oxidada aumentaba en este caso el efecto activador de la fLMF y provocaba por sí misma una reacción de estallido por oxidación.

Figura 8

Las proteínas oxidadas activan a leucocitos - - - transmigración a través del endotelio/inhibición de esta reacción

8a) En cámaras de cultivo de células "Transwell" (de Costar, Bodenheim, Alemania) se colocó en cada caso un elemento de inserción "Transwell" revestido con una membrana microporosa de policarbonato por cada una de las 24 cavidades. La membrana de policarbonato, que tenía un tamaño de poros de 5 \mum, se revistió con fibronectina y sobre ella se cultivaron células endoteliales microvascularas humanas (HMEC-1) hasta llegar a la confluencia. Unos monocitos humanos (200 \mul con 2x10^{7} células/ml en un DMEM procedente de la sangre periférica), aislados mediante una centrifugación en gradiente de densidades, se incubaron a 37ºC, con 7% de CO_{2} con la monocapa de HMEC-1. Como medida de la velocidad de transmigración se determinó el número de monocitos en el compartimiento "Transwell" inferior situado debajo del elemento de inserción "Transwell". A fin de investigar la influencia de diferentes proteínas oxidadas, de una trombospondina o de anticuerpos anti CD36, las sustancias a ensayar se añadieron al medio en la cámara "Transwell" superior, o las células endoteliales se incubaron previamente durante 10 minutos con las sustancias a ensayar y se lavaron. Después de una duración de la transmigración de 4-7 horas, los elementos de inserción se retiraron con precaución, la placa de cultivo de células se colocó sobre hielo durante 30 minutos a fin de desprender los monocitos adheridos y se recontó el número de los monocitos transmigrados. La proteína oxidada (aquí ATIII oxidada) favorecía la transmigración de monocitos a través de una monocapa de HMEC-1, mientras que la proteína de partida no oxidada no mostraba esta reacción (duración de la transmigración 4 h).

8b) Mediante una incubación previa de la capa endotelial durante 10 minutos con TSP-1 o respectivamente mediante adición de TSP-1 al medio de cultivo durante el ensayo de transmigración, se pudo inhibir significativamente la transmigración de los monocitos (duración de la transmigración 7 h).

Figura 9

Las proteínas oxidadas inducen unos procesos que favorecen a la arteriosclerosis

La antitrombina III oxidada aumentó el albergamiento de macrófagos en calvas arterioscleróticas. La realización del ensayo se describió de una manera detallada en la descripción del Ejemplo.

Figura 10

La trombospondina inhibe procesos arterioscleróticos

La trombospondina inhibe la adhesión de macrófagos a células endoteliales modificadas arterioscleróticamente. La realización del ensayo se explica detalladamente en la descripción del Ejemplo.

10a) La trombospondina-1 inhibe la adhesión transitoria, caracterizada por una rodadura de macrófagos, a un endotelio modificado arterioscleróticamente.

10b) La trombospondina inhibe la adhesión estable y permanente de macrófagos a un endotelio modificado arterioscleróticamente.

Figura 11

La trombospondina inhibe procesos inflamatorios in vivo

La trombospondina-1 soluble inhibe la reacción de Arthus en las orejas de ratones Balb/c.

11a) Un ratón tratado dos veces en los momentos 0 y 0 + 3 horas en cada caso con 50 \mug de TSP-1 por vía i.p. (intraperitoneal) - - - reacción de Arthus impedida en la oreja izquierda.

11b) Un ratón tratado dos veces en los momentos 0 y 0 + 3 horas con el tampón testigo por vía i.p. intraperito-
neal - - - reacción de Arthus en la oreja izquierda.

11c) BSA-FITC incorporada en las orejas como medida de la reacción de Arthus en ratones tratados con TSP-1 y con el tampón testigo - - - reacción de Arthus en la oreja izquierda.

Figura 12

Unos trombocitos humanos filtrados a través de un gel se diluyeron hasta 50.000/\mul con un tampón de HEPES-Tyrode de pH 7,4, y se activaron a la temperatura ambiente. Para excluir los efectos de los receptores de Fc sobre las plaquetas por medio de anticuerpos, el experimento se llevó a cabo en presencia de concentraciones saturadoras, completamente bloqueadoras, de fragmentos Fab de un anticuerpo dirigido contra el receptor de FcRIIA (clon IV.3). Después de la activación, los trombocitos se fijaron con paraformaldehído al 0,1% en un tampón de HEPES-Tyrode de pH 7,4 durante 30 minutos y se lavaron. Los trombocitos fijados, en reposo y activados, se incubaron durante una noche con un "AK36P" anti CD36 o respectivamente con el "AK36 total" anti CD36 en concentraciones saturadoras, los trombocitos se lavaron y se incubaron con un anticuerpo secundario, marcado con FITC (IgG-FITC de cabra anti conejo, "reacción X (cruzada) mínima con IgG humana") durante 1 h a la TA. Los trombocitos se lavaron de nuevo y se cuantificó la fijación de los anticuerpos "AK36P" anti CD36 o respectivamente "AK36 totales" anti CD36 mediante la fluorescencia de FITC en el citómetro de flujo de paso (aparato FACScan de Becton Dickinson) (análogamente a Dörmann y colaboradores 1998).

Disminución de la fijación de "AK36P" anti CD36 a trombocitos mediante activación.

Figura 13

A unos pacientes con diabetes mellitus del tipo I y a voluntarios testigos se les extrajo sangre y ésta se sometió a anticoagulación con citrato. Se preparó un plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugación. El PRP de pacientes y de voluntarios testigos sanos se mezcló con fibrinógeno (150 \mug/ml), que había sido acoplado con FITC, y los trombocitos se activaron durante 30 minutos con una proteína oxidada (aquí albúmina humana oxidada) en concentraciones crecientes. La fijación de fibrinógeno se midió tal como se ha descrito anteriormente en detalle, en el citómetro de flujo de paso. La Figura muestra un ejemplo característico de las determinaciones de activabilidad, llevadas a cabo simultáneamente con un PRP de pacientes con diabetes mellitus del tipo I en comparación con testigos. Los trombocitos de pacientes con

\hbox{diabetes mellitus del tipo  I son
particularmente sensibles frente a la activación con proteínas
oxidadas.}

Figura 14

La interacción entre las proteínas oxidadas y el receptor CD4 de VIH se determinó, tal como se explica detalladamente en la descripción del Ejemplo, mediante una técnica de resonancia de plasmones en el sistema BIACORE 2000.

Gráfico superpuesto de 12 sensogramas, que muestran la fijación de antitrombina III oxidada a la CD4 inmovilizada y la disociación de antitrombina III oxidada. La CD4 es inmovilizada (148 pg); la concentración de antitrombina III oxidada se hizo variar (desde abajo hacia arriba; 0 nM; 1 nM; 5,1 nM; 10,2 nM; 17 nM; 20,4 nM; 23 nM; 34 nM; 40,8 nM; 51 nM; 85 nM; 119 nM). Con una concentración creciente de AT III oxidada aumenta la señal resultante.

Figura 15

15a) Una proteína oxidada media en la fijación de TSP-1 a trombocitos

Trombocitos humanos filtrados a través de un gel se diluyeron a 50.000/\mul con un tampón de HEPES-Tyrode de pH 7,4, y se les añadió trombospondina-1 purificada, conjugada con FITC (50 \mug/ml). Los trombocitos se incubaron durante 1 h a la TA con una proteína oxidada (aquí fibrinógeno oxidado) y se midió la fijación de TSP-1 a los trombocitos, en el citómetro de flujo de paso. Las proteínas oxidadas inducen la fijación de TSP-1 a trombocitos.

15b) Una proteína oxidada (aquí antitrombina III oxidada) induce la fijación de trombospondina a células endoteliales.

Unas células endoteliales microvasculares humanas (HMEC-1), se desprendieron según procedimientos clásicos desde la placa de cultivo de células, se aislaron y la suspensión se incubó durante 1 h a la TA con una proteína oxidada o respectivamente con una proteína oxidada más una adición de TSP-1. Las células se lavaron y la TSP-1 fijada se marcó con un mAK anti TSP-1 (clon P10), se acoplaron a ficoeritrina (PE), y se cuantificaron en el citómetro de flujo de paso.

La proteína oxidada induce la fijación de TSP-1 a células endoteliales.

15c) Mientras que sin la adición de TSP-1 purificada y sin la adición de antitrombina III oxidada, sólo aproximadamente un 1% de los monocitos elutriados se detectan en el citómetro de flujo de paso por medio de un anticuerpo (clon P10), que reconoce a la TSP-1 en la superficie de las células, el número aumenta hasta aproximadamente un 5% mediante la adición de TSP-1 purificada (10 \mug/ml). La adición de ATIII oxidada (sin la adición de TSP-1 exógena) media en la fijación de TSP-1 endógena a los monocitos. Aproximadamente un 18% de los monocitos fueron positivos para TSP-1. Mediante una administración simultánea de TSP-1 y de ATIII oxidada, casi todos los monocitos sanguíneos periféricos utilizados fueron fuertemente positivos para TSP-1.

15d) Una proteína oxidada induce la fijación de TSP-1 a células T. Unas células T humanas cultivadas (células de Jurkat) se incubaron durante 1 h a la TA con una proteína oxidada (aquí antitrombina III oxidada) o con una proteína oxidada más una adición de TSP-1 (25 \mug/ml). La TSP-1 fijada a las células T fue marcada por medio del anticuerpo monoclonal anti TSP conjugado con PE (clon P10) y se midió en el citómetro de flujo de paso. Las proteínas oxidadas inducían la fijación de la TSP presente endógenamente y de la añadida exógenamente a células T.

Figura 16

Esta Figura explica el mecanismo correspondiente al invento.

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83. Tandon N N, Ockenhouse C F, Greco N J, Jamieson G A: Adhesive functions of platelets lacking glycoprotein IV (CD36) [Funciones adhesivas de plaquetas que carecen de la glicoproteína IV (CD36)]. Blood 78: 2809-2813, 1991.

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85. Volf I, Bielek E, Moeslinger T, Koller F, Koller. E: Modification of protein moiety of human low density lipoprotein by hypochlorite generates strong platelet agonist [La modificación de un resto proteínico de una lipoproteína de baja densidad humana por un hipoclorito genera un fuerte agonista de plaquetas]. Arterioscler. Thrornb. Vasc. Biol, 20: 2011-2018, 2000.

86. Weiss S J: Tissue destruction by neutrophils [Destrucción de tejidos por neutrófilos]. N. Engl. J. Med. 320: 365-376, 1989.

87. Witztum J L, Steinberg D: Role of oxidized low density lipoprotein in. atherogenesis [Cometido de una lipoproteína de baja densidad oxidada en una aterogénesis]. J. Clin. Invest 88: 1.785-1.792, 1991.

88. Yamaguchi A, Yamamoto N, Akamatsu N, Saido T C, Kaneda M, Umeda M, Tanoue K: PS-liposome and ox-LDL bind to different sites of the immunodominant domain (155-183) of CD36: a study with GS95, a new anti-CD36 monoclonal antibody [Un PS-liposoma y una ox-LDL se fijan a diferentes sitios del dominio inmunodominante (155-183) de la CD36: un estudio con GS95, un nuevo anticuerpo monoclonal anti CD36] Thromb. Res. 97: 317-326, 2000.

Claims (19)

1. \global\parskip0.910000\baselineskip

   1. Medicamento destinado a su utilización para la profilaxis de las trombosis, en particular en el caso de enfermedades inflamatorias, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
2. 2. Medicamento destinado a su utilización para el apoyo de una terapia anti-trombótica, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
3. 3. Medicamento destinado a su utilización para la evitación de un rechazo de trasplante, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
4. 4. Medicamento destinado a su utilización para la evitación de una arteriosclerosis debida a un trasplante, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
5. 5. Medicamento destinado a su utilización para la evitación del desarrollo y de la progresión de enfermedades arterioscleróticas (ateroscleróticas), que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
6. 6. Medicamento destinado a su utilización para el tratamiento de reacciones inflamatorias crónicas, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
7. 7. Medicamento destinado a su utilización para la evitación de una reoclusión vascular temprana después de una operación quirúrgica de derivación, de la colocación de una prótesis endovascular (stent), de una PTCA o similares, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
8. 8. Medicamento destinado a su utilización para la evitación de una reestenosis vascular después de una operación quirúrgica de derivación, de la colocación de una prótesis endovascular (stent), de una PTCA o similares, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
9. 9. Medicamento destinado a su utilización para la evitación de daños por reperfusión, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
10. 10. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 9, estando los daños por reperfusión en conexión con una isquemia miocárdica, un trasplante de órganos, una apoplejía, una enfermedad de oclusión periférica, una intervención quirúrgica, fallos de órganos múltiples después de una revitalización satisfactoria.
11. 11. Medicamento destinado a su utilización para la evitación de daños vasculares, en particular en pacientes con diabetes mellitus, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
12. 12. Medicamento destinado a su utilización para el apoyo de la cicatrización de heridas, que contiene trombospondina soluble o anticuerpos, que inhiben la fijación de proteínas oxidadas a la CD36.
13. 13. Medicamento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque contiene anticuerpos monoclonales o fragmentos (F(ab)_{2}, F(ab), o la región de reconocimiento de antígenos) de los mismos.
14. 14. Medicamento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque contiene otras sustancias coadyuvantes y/o de vehículo farmacéuticamente aceptables.
15. 15. Medicamento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque ha sido formulado para la administración por vía local, intradérmica, superficial, intraperitoneal, intravenosa, oral o intramuscular para la administración a través de vesículas.
16. 16. Medicamento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque contiene otras sustancias tales como p.ej. antibióticos, agentes inmunosupresores o partícipes en la interacción de proteínas oxidadas en el cuerpo.
17. 17. Procedimiento para el control de la calidad de productos de sangre mediante cuantificación de proteínas oxidadas en estos productos de sangre, caracterizado porque la cantidad de proteínas oxidadas se comprueba con ayuda de anticuerpos monoclonales, que fijan a una proteína oxidada, pero que no reaccionan con una proteína no oxidada.
18. 18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque los anticuerpos monoclonales están dirigidos contra una ox-antitrombina III, una ox-albúmina humana o un ox-fibrinógeno, o contra estas proteínas en conjunto.
19. 19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, caracterizado porque los anticuerpos monoclonales se emplean para la cuantificación en un ensayo ELISA o RIA o en un procedimiento para la citometría cuantitativa de flujo de paso sobre superficies de células.