MXPA01008306A

MXPA01008306A - Inhibidores para uso en hemostasis y funcion inmune

Info

Publication number: MXPA01008306A
Application number: MXPA/A/2001/008306A
Authority: MX
Inventors: Paul O Sheppard; Paul D Bishop; Gerald W Lasser
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 2001-08-16
Publication date: 2002-05-09

Abstract

La presente invención se refiere a mo1éculas de polinucleótidos y polipéptidos para usarse como inhibidores en la hemostasis y la función inmune. Tales inhibidores son miembros de la familia de proteínas que portan un dominio similar al colágeno y un dominio globular. Los inhibidores sonútiles para promover el flujo sanguíneo en la vasculatura reduciendo la actividad trombogénica y la actividad del complemento. Los inhibidores también sonútiles para pacificar las superficies de colágeno y modular la curación de heridas.

Description

INHIBIDORES PARA USO EN HEMOSTASIS Y FUNCIÓN INMUNE . Antecedentes de la Invención. La lesión en los vasos sanguíneos coloca en movimiento una serie de eventos para reparar el daño y controlar la liberación de la sangre de los vasos. Este proceso se conoce como hemostasis. Las plaquetas juegan un papel temprano en la hemostasis formando trombos o tapones para reparar temporalmente el vaso dañado. Las plaquetas normalmente no interactúan con el endotelio que cubre las paredes del vaso, pero las lesiones a los vasos sanguíneos, a través de un accidente o durante procedimientos quirúrgicos, pueden romper las células endoteliales. Dependiendo de la extensión de la lesión, varios elementos tales como colágenos, laminilla elástica o células del músculo liso con colágenos fibrilares asociados, se exponen al flujo sanguíneo. Cuando el subendotelio se expone después de una lesión a los vasos, las plaquetas que se mueven en el flujo sanguíneo local interactúan con la matriz expuesta del endotelio que contiene el colágeno y se disminuyen. La interacción adicional entre los receptores en la superficie "de la REF: 131994 plaqueta y la capa expuesta de colágeno conduce a un enlace de plaquetas y a la activación resultante en la detención del flujo sanguíneo local. Las plaquetas enlazadas se activan y forman agregados con las plaquetas en el flujo sanguíneo que pasa a través de la formación de los puentes fibrinógeno-interplaquetas (Moroi y Jung, Frontiers in Bioscience 3:719-28, 1998; Barnes et al., Atherosclerosis XI, Jacotot et al., eds., Elsevier Science, pp . 299-306, 1998 y Barnes et al., Curr. Opin. Hematol. 5:314-20, 1998) . La respuesta hemostática se gradúa y depende del grado de lesión del vaso sanguíneo, los constituyentes específicos de los vasos sanguíneos expuestos y las condiciones de flujo sanguíneo en el área lesionada (Rand et al., Thrombosis and Haemos t asis 78:445-50, 1997) . La exposición de la matriz del subendotelio (colágeno tipo VI y factor de von Willebrand) , tal como durante la lesión vascular moderada, promueve un bajo grado de adhesión y agregación en áreas con condiciones de bajo flujo sanguíneo. Las lesiones que resultan en un mayor grado de trauma vascular y exposición de los constituyentes vasculares adicionales, tal como la laminilla interna elástica y los microfibrilos asociados a la elastina, estimularán la formación de agregados de plaquetas más fuertes. El trauma vascular severo, que expone a los colágenos de fibrilo, provoca una respuesta trombótica de plaquetas, lo que protege a la víctima de una pérdida excesiva de sangre (Rand et al . , ibid . ) . Los inhibidores de la hemostasis serían útiles para incrementar el flujo sanguíneo que sigue a una lesión vascular y calmar las superficies de colágeno . El factor del complemento Clq consiste de seis copias de tres polipéptidos relacionados (cadenas A, B y C), con cada polipéptido con alrededor de 225 aminoácidos de longitud, con un dominio cercano de colágeno en la terminal amino y una región globular en la terminal carboxi. Se forman seis regiones de triple hélice por los dominios de colágeno en las cadenas seis A, seis B y seis C, formando una región central y seis tallos. Se forma una porción de cabeza globular por la asociación del dominio globular de la terminal carboxi de una cadena A, una B y una C. El Clq se compone por lo tanto, de seis cabezas globulares enlazadas por medio de seis tallos similares al colágeno a una región central de fibrilos. Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991. Esta configuración se refiere a menudo como ramo de flores. El Acrp30 tiene una estructura similar de ramo formada de un tipo simple de cadena de polipéptido . El Clq se ha encontrado que estimula los mecanismos de defensa así como que dispara la generación de especies tóxicas de oxígeno que pueden provocar un daño a los tejidos (Tenner Behring Inst. Mitt. 93:241-53, 1993) . Los sitios de enlace de Clq se encuentran en las plaquetas. Adicionalmente el complemento y el Clq juegan un papel en la inflamación. La activación del complemento se inicia por el enlace del Clq a las inmunoglobulinas . Los inhibidores del Clq y de la trayectoria del complemento, serían útiles para aplicaciones ant i-inflamatorias , la inhibición de la activación del complemento y la actividad trombótica. La presente invención proporciona tales polipéptidos para estos y otros usos que deben ser aparentes para aquellos hábiles en el arte, a partir de las enseñanzas de aquí.

Breve Descripción de la Invención. Dentro de un aspecto, la invención proporciona un método para promover el flujo sanguíneo dentro de la vasculatura de un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos; en un vehículo farmacéuticamente aceptable; en donde la proteína relacionada con el complemento de adipocitos reduce t rombogénicamente y complementa la actividad dentro de la vasculatura. Dentro de una modalidad preferida, la proteína relacionada con el complemento de adipocitos comprende un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos un 75% idéntica en la secuencia de aminoácidos a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO.:2, en donde la secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa ó Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido, y una porción globular carboxi terminal. Dentro de una modalidad relacionada, el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos un 90% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 22-281 de la SEQ ID N0.:2. Dentro de otra modalidad, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es al menos el 90% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO . : 2. Dentro de todavía otra modalidad, cualquier diferencia entre el polipéptido y la SEQ ID NO.:2 se debe a las sustituciones conservadoras de aminoácido. Dentro de otra modalidad, el dominio de colágeno consiste de 13 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 1 repetición Gly-Xaa-Pro. Dentro de todavía otra modalidad, el dominio globular consiste de diez láminas beta. Dentro de una modalidad relacionada, las láminas beta se asocian con residuos de aminoácidos correspondientes al 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, y 269-274 de la SEQ ID NO.:2. Dentro de todavía otra modalidad, el polipéptido comprende los residuos 1-281 de la SEQ ID NO.:2 ó los residuos 1-281 de la SEQ ID NO.:44. La invención también proporciona el polipéptido en complejo a un segundo polipéptido para formar un oligómero. Dentro de una modalidad, los polipéptidos se hacen complejos por enlaces bisulfuro intermoleculares. Dentro de otra modalidad, el oligómero es un trímero. Dentro de todavía otra modalidad, el oligómero es un hexámero. Dentro de todavía otra modalidad, el multímero es un decaoct amero . Dentro de otra modalidad, el polipéptido reduce la actividad trombogénica y del complemento inhibiendo la trayectoria del complemento y por la inhibición de la adhesión, activación o agregación de la plaqueta mediada por colágeno. Dentro de otra modalidad, el polipéptido se administra antes de, durante o después de una lesión vascular aguda en el mamífero. Dentro de todavía otra modalidad, la lesión se debe a una reconstrucción vascular. Dentro de una modalidad relacionada, la reconstrucción vascular comprende angioplastia, injerto conectado en directo a la arteria coronaria, endarterectomí a , reparación microvascular o anastomosis de un injerto vascular. Dentro de otra modalidad relacionada, la lesión se debe a un trauma, infarto o aneurisma. Dentro de otro aspecto, la invención proporciona un método para calmar los tejidos de colágeno dañados dentro de un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos; por lo cual la proteína convierte al tejido de colágeno dañado inerte hacia la activación del complemento, activación trombótica o activación inmune. Dentro de una modalidad, los tejidos de colágeno dañados se deben a una lesión asociada con isquemia y reperfusión. Dentro de otra modalidad, la lesión comprende trauma con lesión isquémica, estrangulación intestinal, o lesión asociada con el pre- y post-establecimiento del flujo sanguíneo. Dentro de todavía otra modalidad, el polipéptido se administra a un mamífero que sufre de isquemia y recesión cardiopulmonar conectada en directo, infarto al miocardio, o vasoespamo post-trauma. Dentro de una modalidad relacionada, el vasoespasmo post-trauma comprende infarto, angioplastia transluminal percutánea, endarterectomía , trauma vascular accidental o trauma vascular inducido por cirugía. Dentro de todavía otro aspecto, la invención suministra un método para calmar la superficie de un biomaterial protésico para usarse en conjunto con un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína relacionada con un complemento de adipocitos, por lo cual el polipéptido hace inerte la superficie del biomaterial protésico hacia la activación del complemento, actividad trombótica o actividad inmune. Dentro de una modalidad, la superficie del biomaterial protésico se recubre con colágeno o fragmentos de colágeno, gelatinas, fibrina o fibronectina. Dentro de otro aspecto de la invención, se proporciona un método para mediar la reparación de heridas dentro de un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína relacionada con un complemento de adipocitos, por lo cual el polipéptido aumenta la progresión en la cicatrización de heridas. Breve descripción de los dibujos La figura 1 ilustra una alineación múltiple de un polipéptido zsig37 de la presente invención y HUMUPST2_1 (Maeda y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm. 221(2) : 286-9, (1996); C1QA_HUMAN (Sellar y colaboradores, Biochem. J. 274: 481-90, 1991, Reid, Biochem. J. 179: 367-71, 1979, y Reid y colaboradores, Biochem . J . 203 : 559-69, 1982); HP25_TAMÁS (Takamatsu y colaboradores, Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 y Kondo & Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, ~1992); HP27_TAMÁS (Takamatsu et al. y Kondo & Kondo referencias de arriba); y CERL_RAT (Wada & Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9: 71-7, 1991) . La figura 2 es una matriz que muestra la identidad del porcentaje de aminoácidos en una comparación de las 6 proteínas mostradas en la alineación múltiple de la figura 1. La figura 3a muestra el enlace zsig37-FITC al colágeno de tipo VI. La figura 3b muestra la competencia del zsig37 sin etiquetar con el zsig37 etiquetado con FITC enlazado al colágeno de tipo VI. La figura 4 muestra el enlace del complemento Clg-FITC al zsig37. La figura 5 muestra la inhibición de la actividad del complemento humano por zsig37. La figura 6 muestra el porcentaje de la agregación de plaquetas por el colágeno en presencia de zsig37. La figura 7 muestra la proliferación de fibroblastos SK5 en presencia de zsig37. Descripción Detallada de la Invención Antes de establecer en detalle la invención, puede ser de ayuda el entendimiento de la misma al definir los siguientes términos.

El término "etiqueta de afinidad" se usa aquí para denotar un segmento de péptido que se puede colocar a un polipéptido, para proporcionar la purificación o detección del polipéptido o proporcionar sitios para la colocación del polipéptido a un substrato. En particular, cualquier péptido o proteína para la cual está disponible un anticuerpo u otro agente específico de enlace se puede usar como, etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de pol ihist idinas , proteína A (Nilsson y colaboradores, EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson y colaboradores, Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutation S transferasa (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), péptido Flag™, substancia P (Hopp y colaboradores, Biotechnology 6:1204-10, 1988; disponible de Kodak Co., New Haven, CT), péptido de enlace de estreptavidina, u otro epitope antigénico o dominio de enlace. Ver en general Ford y colaboradores, Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Las etiquetas de afinidad que codifican ADNs, están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .

El término "complementos de una molécula de polinucleótidos" es una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia base complementaria y una orientación inversa en comparación a una secuencia de referencias. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3' . El término "secuencia degenerada de nucleótidos" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación a una molécula de referencia de polinucleótido que codifica un polipéptido) . Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (esto es, tripletes GAU y GAC codifican cada uno el Asp) . El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido separado de su lugar genético natural y está así libre de otras secuencias de codificación extrañas o indeseables, y está en una forma apropiada para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas preparados por ingeniería genética. Tales moléculas aisladas son aquellas que se separan de su medio natural e incluyen cADN y clones genómicos. Las moléculas aisladas de ADN de la presente invención, están libres de otros genes con los cuales se asocian ordinariamente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se presentan naturalmente tales como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para alguien con habilidad ordinaria en el arte (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316: 774-78, 1985) . Un polipéptido o proteína "aislada" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición diferente a su medio ambiente natural, tal como separada de la sangre y tejidos animales. En una forma preferida, el polipéptido aislado está substancialmente libre de otros polipéptidos, particularmente de otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere suministrar los polipéptidos en una forma altamente purificada, esto es, más de 95% de pureza, más preferiblemente más del 99% de pureza. Cuando se usa en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas alternativamente glicosiladas o derivadas. El término "ortólogo", denota un polipéptido o proteína obtenida de una especie que es la contra parte funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias en secuencias entre los ortólogos son el resultado de la formación de especies. El término "polinucleótido", denota un polímero de hebra simple o doble de base desoxiribonucleót ido o ribonucleót ido que se leen desde la terminación 5' a la 3' . Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizarse i n vi t ro , o prepararse de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan como pares base (bp abreviado), nucleótidos (nt), o kilobases (kb) . En donde lo permite el contexto, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son de hebra simple o hebra doble. Cuando el término se aplica a moléculas de hebra doble, se usan para denotar la longitud total y se entenderá que son equivalentes al término "pares base". Se reconocerá por aquellos hábiles en el arte, que las dos hebras de un polinucleótido de hebra doble pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de la misma se pueden escalonar como resultado del desdoblamiento enzimático; así todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido de doble hebra puede no aparearse. Tales terminaciones no apareadas no excederán en general 20 nt de longitud. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces péptidos, ya sea producido natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de alrededor de 10 residuos de aminoácidos, se refieren comúnmente como péptidos . Las "sondas y/o cebadores" como se usan aquí, pueden ser ARN o ADN. El ADN puede ser cADN o ADN genómico. Las sondas y cebadores de polinucleótidos son ADN o ARN de hebra simple o doble, generalmente oligonucleótidos sintéticos, pero se pueden generar de cADN clonado o de secuencias genómicas o de sus complementos. Las sondas analíticas serán generalmente de al menos 20 nucleótidos de longitud, aunque se pueden usar sondas más cortas de alguna manera (14-17 nucleótidos) . Los cebadores PCR tienen al menos 5 nucleótidos de longitud, preferiblemente 15 o más nt, más preferiblemente 20-30 nt . Se pueden utilizar polinucleótidos cortos cuando una región pequeña del gen se toma como objetivo para análisis. Para un análisis grueso de genes, una sonda de polinucleótidos puede comprender un exón completo o más. Las sondas se pueden etiquetar para proporcionar una señal detectable, tal como con una enzima, biotina, un radionúclido, fluoróforo, agente quimioluminiscente, partícula paramagnét ica y similares, las cuales están comercialmente disponibles de muchas fuentes tales como Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, y Amersham Corp., Arlington Heights, IL, usando técnicas que son bien conocidas en el arte. Los pesos moleculares y longitudes de los polímeros determinados por métodos analíticos no precisos (por ejemplo electroforesis de gel) se entenderán que son valores aproximados. Cuando tal valor se expresa como "alrededor" de X o "aproximadamente" X, el valor declarado de X se entenderá que es preciso a un +_ 10%. La presente invención se basó en parte en el descubrimiento de que un homólogo novedoso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, inhibe la activación de plaquetas mediada por colágeno y la trayectoria del complemento incluyendo el Clq. Esta proteína fue designada como zsig37 y se describe completamente en la solicitud de patente PCT ubicada y asignada comúnmente WO 99/04000. La secuencia de nucleótidos de zsig37 (SEQ ID NO:l) codifica un polipéptido (SEQ ID NO:2) que tiene una secuencia de señal de terminal amino, una región adyacente de terminal N sin homología, un dominio truncado de colágeno compuesto de repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro y una porción globular de terminal carboxi. La secuencia novedosa de polinucleótido también contiene una región larga no traducida 3' . La estructura general del polipéptido establecido arriba se comparte por Acrp30 y HUMUPST2_1, excepto que el dominio similar al colágeno de cada una de estas proteínas es más largo que aquel de los polipéptidos zsig37. También, la secuencia HUMUPST2_1 de ADN se caracteriza por una región larga no traducida 3' . Más aun, el Acrp30 y todas las secuencias alineadas en la figura 1 con excepción de CERL_RAT, comparten un residuo conservado de cisteína en la posición 187 del polipéptido zsig37 como se muestra en la figura 1 y la secuencia ID NO: 2. También, los polipéptidos zsig37 de la presente invención, incluyen un sitio de glicosilación ligado en N supuesto en el aminoácido 93 (Asn) de la secuencia ID NO: 2. El análisis de la distribución de tejidos de mARN correspondiente al zsig37, mostró que la expresión fue mayor en el corazón y la placenta, con señales relativamente de menor intensidad en riñon, ovario, glándula adrenal y músculo esquelético y señales menores en una amplia variedad de otros tejidos presentes en el manchado Northern. La relación del homólogo con la proteína Acrp30 relacionada con el complemento de adipocito (secuencia ID NO: 3) y la proteína apMl segregada de adipocitos (HUMUPST2_1 en figuras 1 y 2) se estableció para el zsig37. Se identificó también la homología de alguna manera más distante para la cadena Clq hasta el componente del complemento, dos factores observados en el estado activo de marmotas hibernantes siberianas (HP25_TAMAS y HP27_TAMAS) y una proteína de cerebro de rata (CERL_RAT) , como se muestra en la figura 1 y 2. La secuencia de nucleótidos de zsig37 se describe en SEQ ID NO: 1, y su secuencia deducida de aminoácidos se describe en SEQ ID NO: 2. Una secuencia degenerada de nucleótidos que codifica al polipéptido de la SEQ ID NO: 2, se suministra en la SEQ ID NO: 23. Como se describe generalmente arriba, el polipéptido zsig37 incluye una señal de secuencia, que va desde el aminoácido 1 (Met) al residuo de aminoácido 21 (Gly) . Una secuencia alternativa de señal va desde el aminoácido 1 (Met) al aminoácido 25 (Ser) . El polipéptido maduro por lo tanto está en el intervalo desde el aminoácido 22 (Leu) o 26 (Arg) al aminoácido 281 (Pro) . Dentro del polipéptido maduro, se encuentra una región con terminal N de homología no conocida, en el intervalo entre el residuo de aminoácido 22 (Leu) y 98 (Lys) . Además, un dominio truncado de colágeno se encuentra entre el aminoácido 99 (Gly) y 140 (Arg) . En el dominio truncado de colágeno, se observan repeticiones Gly-Xaa-Pro perfectas 1 y Gly-Xaa-Xaa imperfectas 13. En contraste, la Acrp30 contiene 22 repeticiones perfectas o imperfectas. El polipéptido zsig37 también incluye un dominio globular de terminal carboxi, que va desde alrededor del aminoácido 141 (Cys) al 281 (Pro) . El polipéptido zsig37, HUMUPST2_1 y Acrp30, parecen ser homólogos con el dominio de colágeno y en el dominio globular, pero no en la porción de terminal N del polipéptido maduro. El dominio globular Clq de ACRP30, se ha determinado que tiene una topología de 10 hebras beta "rollo de gelatina" (Shapiro and Scherer, Curr. Biol. 8:335-8, 1998) que muestran una homología significativa estructural con la familia TNF y la secuencia zsig37 como se representa por la SEQ ID NO: 2, contiene todas las hebras 10 beta de esta estructura (residuos de aminoácidos 147-151, 170-172, 178-181, 185-188, 191-203, 207-214, 219-225, 227-238, 244-250, y 269-274 de SEQ ID NO: 2) . Estas hebras se han designado "A'', "A''', B' 'B' "C "n D'' '' , " E ' ' , " F ' ' , " G ' ' y "H" respectivamente. La zsig37 tiene dos circuitos receptores de enlace en los residuos de aminoácido 152-180 y 213-226. Los residuos de aminoácido 191 (Gly), 193 (Tyr), 238 (Leu) y 272 (Gly), parecen conservarse a través de la super familia incluyendo CD40, TNFa, TNFß, ACRP30 y zsig37. Otro aspecto de la presente invención incluye el uso de fragmentos de polipéptidos zsig37 como inhibidores de la hemostasis y funciones inmunes. Los fragmentos preferidos incluyen el dominio similar al colágeno de los polipéptidos zsig37, que van desde el aminoácido 99 (Gly) al aminoácido 140 (Arg) de la SEQ ID NO: 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar a colágeno capaz de dimerización u oligomerización. Otros fragmentos preferidos incluyen el dominio globular de los polipéptidos zsig37, que van desde el aminoácido 140 (Arg) o 141 (Cys) al 281 (Pro) de la SEQ ID NO: 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio similar al globular o una porción activa del dominio similar al globular. Otro fragmento de polipéptido zsig37 de la presente invención, incluye el dominio similar al colágeno y el dominio globular que va desde el residuo de aminoácido 99 (Gly) al 281 (Pro) de la SEQ ID NO: 2. Estos fragmentos son particularmente útiles en la inhibición de la activación de plaquetas mediada por colágeno y la inhibición del complemento y el Clq. La presente invención también suministra el uso de proteínas de fusión zsig37. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la presente invención abarcan (1) un polipéptido seleccionado del grupo que comprende: (a) moléculas de polipéptidos que comprenden una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2, desde el residuo de aminoácido 1 (Met), 22 (Leu) o 26 (Arg) hasta el residuo de aminoácido 281 (Pro); (b) moléculas de polipéptido que van desde el aminoácido 99 (Gly) al aminoácido 140 (Arg) de la SEQ ID NO: 2, una porción del polipéptido de zsig37 contiene el dominio similar al colágeno o una porción del dominio similar al colágeno capaz de la dimerización u oligomerización; (c) moléculas de polipéptido que van desde el aminoácido 140 (Arg) al 141 (Cys) al 281 (Pro) de la SEQ ID NO: 2, una porción del polipéptido de zsig37 contiene el dominio similar al globular o una porción activa del dominio similar al globular; o (d) moléculas de polipéptidos que van desde el aminoácido 99 (Gly) al 281 (Pro), una porción del polipéptido zsig37 incluye el dominio similar al colágeno y el dominio globular; y (2) otro polipéptido. El otro polipéptido puede ser un dominio globular alternativo o adicional, un dominio similar al colágeno alternativo o adicional, un péptido de señal para facilitar la secreción de la proteína de fusión o similares.

También son útiles dentro de los métodos de la invención los agonistas y antagonistas del zsig37. Los métodos de identificación de antagonistas se conocen en el arte. Por ejemplo, los antagonistas del polipéptido de zsig37 se pueden identificar al proporcionar células con respuestas al polipéptido de zsig37, cultivando una primera porción de las células en presencia del polipéptido de zsig37, cultivando una segunda porción de las células en presencia del polipéptido de zsig37 y un compuesto de prueba, y detectando una disminución en una respuesta celular de la segunda porción de las células en comparación con la primera porción de la célula. Además de aquellos ensayos aquí descritos, las muestras se pueden probar para la inhibición de la actividad zsig37 dentro de una variedad de ensayos diseñados para medir el enlace del receptor o la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes del zsig37. Por ejemplo, las líneas de célula de respuesta a zsig37 se pueden transfectar con un constructo de gen reportero que tiene respuesta a una trayectoria celular estimulada por zsig37. Los constructos de gen reportero de este tipo se conocen en el arte, y comprenderán generalmente un elemento de respuesta zsig37-ADN que se une operativamente a un gen que codifica una proteína ensayable tal como la luciferasa. Los elementos de respuesta al ADN pueden incluir pero no se limitan a, elementos de respuesta cíclica AMP (CRE), elementos de respuesta de hormonas (HRE), elementos de respuesta de insulina (IRE) (Nasrin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990) y elementos de respuesta al suero (SRE) (Shaw et al. Cell 56: 563-72, 1989) . Los elementos de respuesta cíclicos AMP, se revisan en Roestler y colaboradores, J. Biol. Chem. 263 (19) : 9063-6, 1988 y Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8) : 1087-94, 1990. Los elementos de respuesta de hormonas se revisan en Beato, Cell 56:335-44; 1989. Los compuestos candidatos, soluciones, mezclas o extractos se prueban para su capacidad de inhibir la actividad de la zsig37 en las células objetivo como se tiene evidencia por una disminución en la estimulación de zsig37 de la expresión del gen reportero. Ensayos de este tipo, detectarán compuestos que bloquean directamente el enlace de zsig37 a los receptores de la superficie de la célula, así como compuestos que bloquean procesos en la trayectoria celular posterior al enlace ligando-receptor. En la alternativa, los compuestos u otras muestras se pueden probar para bloqueo directo de enlaces zsig37 al receptor, usando zsig37 etiquetado con una etiqueta detectable (por ejemplo 125I, biotina, peroxidasa de rábano gigante, FITC, y similares) . Dentro de los ensayos de este tipo, la capacidad de una muestra de prueba para inhibir el enlace de la zsig37 etiquetada al receptor, es indicativa de una actividad inhibitoria, la cual se puede confirmar a través de ensayos secundarios. Los receptores usados dentro de los ensayos de enlace pueden ser receptores celulares o receptores inmovilizados, aislados. También son útiles dentro de los métodos de la invención, anticuerpos que se enlazan específicamente a los epítopes, péptidos o polipéptidos del polipéptido de zsig37. Los métodos para la preparación de anticuerpos monoclonales y policlonales son bien conocidos en el arte (ver por ejemplo Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Aplications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982) . Como sería evidente para alguien con habilidad ordinaria en el arte, se pueden generar los anticuerpos policlonales a partir de la inoculación de una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratón, hámsteres, conejillos de indias y ratas así como animales transgénicos tales como ovejas, vacas, cabras o cerdos transgénicos. Los anticuerpos también se pueden expresar en levadura y hongos en formas modificadas así como en células de mamíferos e insectos . El polipéptido de zsig37 o un fragmento del mismo, sirve como un antígeno (inmunógeno) para inocular un animal o producir una respuesta inmune. Los antígenos apropiados incluirían al polipéptido de zsig37 codificado por la SEQ ID NO: 2 del residuo de aminoácido 22-281 de la SEQ ID NO: 2, desde el residuo de aminoácido 26-281 de la SEQ ID NO:2, o un fragmento del residuo de aminoácidos contiguo 9-281 del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido de zsig37, se puede incrementar a través del uso de un adyuvante, tal como alumbre (hidróxido de aluminio) o un adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión tales como fusiones de la zsig37 o una porción de la misma con un polipéptido de inmunoglobulina o con una etiqueta de afinidad. El inmunógeno de polipéptido puede ser una molécula de longitud completa o una porción de la misma. Si la porción del polipéptido es "similar a un hapteno", tal porción p ede unirse o ligarse ventajosamente a un portador macromolecular (tal como la hemocianina de lapa de concha con orificio (KLH), albúmina de suero de bovino (BSA) o toxoide tetánico) para inmunización. Como se usa aquí, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos pcliclonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales, y fragmentos de enlace a antigenos tales como F(ab')2 y fragmentos proteolít icos de Fab. También se incluyen los anticuerpos o fragmentos intactos preparados por ingeniería genérica, tales como anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena simple y similares, así como péptidos y polipá-pt idos sintéticos de enlace de antígenos. Los anticuerpos no humanos se pueden humanizar al injertar solamente los CDRs no humanos sobre la estructura humana y regiones constantes, o al incorporar los dominios de variables no humanos (opcionalmente "encubriéndolos" con una superficie similar a la humana al remplazar los residuos expuestos, en donde el resultado es un anticuerpo "chapeado") . En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los dominios de la estructura de la región variable humana para aumentar las características apropiadas de enlace. A través de la humanización de anticuerpos, se puede incrementar la vida media biológica y se reduce el potencial de reacciones inmunes adversas al administrarse a humanos. Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos útiles aquí, incluyen la exposición i n vi t ro de linfocitos a la proteína o péptidos zsig37, y la selección de colecciones de despliegue de anticuerpos en vectores de fagos o similares (por ejemplo, a través del uso de proteínas o péptidos zsig37 inmovilizados o etiquetados ) .

Los anticuerpos se definen para ser específicamente de enlaces si: 1) muestran un nivel de umbral de actividad de enlace, y/o 2) no tienen reacciones cruzadas de manera significativa con las moléculas relacionadas de polipéptidos. Primero, los anticuerpos de aquí se enlazan específicamente si se enlazan a un polipéptido, péptido o epítope zsig37 con una afinidad de enlace (ka) de 106 mol-1 o mayor, preferiblemente 107 mol -i mayor, más preferiblemente 10 mol -i mayor, y mucho más preferiblemente 109 mol"1 o mayor. La afinidad de enlace de un anticuerpo se puede determinar fácilmente por alguien con habilidad ordinaria en el arte, por ejemplo, por un análisis (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949) . Segundo, los anticuerpos se enlazan específicamente si no tienen reacciones cruzadas de manera significativa con los polipéptidos relacionados. Los anticuerpos no tienen reacciones cruzadas significativamente con las moléculas relacionadas de polipéptidos por ejemplo, si detectan al polipéptido de zsig37 pero no a los polipéptidos conocidos relacionados usando un análisis normal de manchado Western (Ausubel y colaboradores, ibid.) . Ejemplos de polipéptidos conocidos relacionados incluyen otros miembros de una familia de proteínas tal como Acrp30 (SEQ ID NO:3), los polipéptidos mostrados en la alineación de la figura 1 y similares. Pueden también incluir si se desea, ortólogos y polipéptidos mutantes humanos de zsig37. Más aun, los anticuerpos se pueden "proteger contra" polipéptidos conocidos relacionados para aislar una población que se enlaza específicamente a los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos que aparecen a los polipéptidos de zsig37 humana, se adsorben a los polipéptidos relacionados adheridos a la matriz insoluble; los anticuerpos específicos a los polipéptidos de zsig37 humana, fluirán a través de la matriz bajo las condiciones apropiadas de amortiguamiento. Dicha protección permite el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales que no hacen reacciones cruzadas para los polipéptidos cercanamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995) . La protección y aislamiento de los anticuerpos específicos es bien conocida en el arte (ver, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff y colaboradores, Adv . In Immunol . 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd . , 1996; Benjamín y colaboradores, Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984) . Ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelect rofores is concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipit ación , ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), manchado de punto o ensayo de manchado Western, ensayo de inhibición o competencia, y ensayo intercalado . El efecto de los polipéptidos, fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas de la zsig37 sobre la hemostasis, en particular la adhesión de plaquetas y la activación que conduce a la agregación de plaquetas, se puede determinar al usar los métodos y ensayos aquí suministrados y aquellos conocidos en el arte. El colágeno es un inductor potente de la agregación de plaquetas. Esto presenta riesgos a los pacientes que se recuperan de lesiones vasculares. Los inhibidores de la agregación de plaquetas inducida por colágeno serían útiles para tales propósitos. La zsig37 se encontró que se enlaza a la fibronectina y a los colágenos de tipo I, II, III, V y VI. En particular, la zsig37 se enlaza a dominios específicos en el colágeno 6 en una forma dependiente de la concentración. La zsig37 también se encontró que inhibe la activación de plaquetas mediada por colágeno. La inhibición inducida por la zsig37 fue selectiva a la activación de colágeno, la zsig37 no tuvo efecto en las plaquetas activadas por activadores conocidos de plaquetas ADP o trombina. Estos resultados se describen en mayor detalle abajo en la sección de ejemplos. Se anticipa que los polipéptidos, fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas de la zsig37, serán útiles para bloquear el enlace de plaquetas a superficies recubiertas con colágeno y reducir la agregación asociada de plaquetas inducida por colágenos. El Clq, es un componente de la trayectoria del complemento y se ha encontrado que estimula los mecanismos de defensa así como activa la generación de especies tóxicas de oxígeno que pueden causar daño a los tejidos (Tenner, Behring Inst, Mitt. 93:241-53, 1993) . Los sitios de "enlace de Clq, se encuentran en las plaquetas. El Clq, independiente de un patrón inmune de enlace, se ha encontrado que inhibe la agregación de plaquetas pero no la adhesión de plaquetas o el cambio de forma. La región de terminación amino del Clq, comparte homología con el colágeno (Peerschke y Ghebrehiwet, J. Immunol. 145: 2984-88, 1990) . La zsig37 se enlaza al Clq dei complemento en una forma dependiente de la concentración. Se encontró que la zsig37 es efectiva al inhibir la trayectoria del complemento incluyendo el Clq con ericrocitos de ovejas sensibilizados y nc sensib ili zados . Los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, ago istas o antagonistas de la zsig37 de la presente invención, se pueden usar en métodos para promover el flujo sanguíneo dentro de la vasculatura de un mamífero al reducir el numero de plaquetas que se adhieren y se activar, y el tamaño de los agregados de plaquetas. Tales métodos comprenderían la administración de una cantidad terapéuticamen e efectiva de polipéptidos, fragmentos, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la zsig37 a un mamífero que necesita de tal tratamiento, p-or lo cual la zsig37 reduce la actividad trombogénica y de complementos dentro de la vasculatura del mamífero. Como se describe abajo, los polipéptidos de zsig37 inhiben la activación de plaquetas mediadas por colágeno e inactivan la fibronectina y los colágenos de tipo I, II, III, V y VI a través del enlace. La administración de Zsig37 reduce la actividad trombogénica en el sitio de la lesión vascular al reducir las formas de adhesión de plaquetas, activación y agregación. La zsig37 también inhibe la trayectoria del complemento y el Clq como se describe abajo, reduciendo así la actividad de complemento dentro de la vasculatura. Los polipéptidos, fragmentos, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la zsig37, usados en tales métodos se pueden administrar antes de, durante o después de una lesión vascular aguda en el mamífero. En un método preferido, la lesión vascular se debe a la reconstrucción vascular, incluyendo pero no limitándose a angioplastia, endarterectomia , injerto de conexión directa de arterias coronarias, reparación micro vascular o anastomosis de un injerto vascular. También se contemplan las lesiones vasculares debidas a trauma, infarto o aneurisma. En otros métodos preferidos, la lesión vascular se debe a una ruptura de placas, degradación de la vasculatura, complicaciones asociadas con la diabetes y arterieesclerosis. La ruptura de placas en la arteria coronaria induce al ataque al corazón y en la arteria cerebral induce a la apoplejía. El uso de los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la zsig37 en tales métodos, también serían útiles para disminuir trastornos completos del sistema de la vasculatura asociados con el sistema inmune, tales como coagulación intravascular diseminada (DIC) y SIDs. Adicionalmente, la actividad inhibidora del complemento sería útil para tratar trastornos inmunes no vasculares tales como la arterieesclerosis . Se ha encontrado una correlación entre la presencia del Clq en el miocardio isquémico localizado y la acumulación de leucocitos que sigue a la oclusión y reperfusión coronaria. La liberación de componentes celulares que sigue al daño a tejidos, impulsa la activación del complemento lo cual resulta en productos tóxicos de oxígeno que pueden ser la causa principal del daño al miocardio (Rossen y colaboradores, Circ . Res . 62:572-84, 1998 y Tenner, ibid.) . El bloqueo de la trayectoria del complemento se encontró que protege el miocardio isquémico del daño por reperfusión (Buerke y colaboradores, J. Pharm. Exp. Therp. 286:429-38, 1998) . La inhibición del complemento y la actividad de enlace de Clq de los polipéptidos zsig37, sería útil para tales propósitos . El colágeno y las capacidades de enlace Clq de la zsig37, serían útiles para pacificar los tejidos dañados de colágeno que evitan la adhesión de plaquetas, activación o agregación, y la activación de los procesos inflamatorios que conduce a la liberación de productos tóxicos de oxígeno. Al aparecer el tejido expuesto inerte hacia procesos tales como la actividad del complemento, actividad trombótica y activación inmune, los polipéptidos, fragmentos, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la zsig37 serían útiles en la reducción de los efectos perjudiciales de la isquemia y reperfusión. En particular tales daños incluirían isquemia con lesión traumática, estrangulación intestinal y lesión asociada con el pre y post establecimiento del flujo sanguíneo. La zsig37 sería útil en el tratamiento de isquemia cardiopulmonar de conexión directa y recesión, infarto al miocardio, y vasoespasmo posterior al trauma, tal como apoplejía o angioplastia percutánea transluminal así como trauma vascular inducido por cirugía o accidental . Los polipéptidos, fragmentos, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la zsig37 serían también útiles para calmar biomateriales protésicos y equipo quirúrgico para obtener la superficie de los materiales inerte hacia la activación del complemento, actividad trombótica o actividad inmune. Tales materiales incluyen pero no se limitan a, biomateriales recubiertos con fragmentos de colágeno o colágeno, biomateriales recubiertos con gelatina, biomateriales recubiertos con fibrina, biomateriales recubiertos con fibronectina, biomateriales recubiertos con heparina., apositos recubiertos con gel y colágeno, injertos arteriales, válvulas sintéticas del corazón, órganos artificiales y cualquier aplicación de prótesis expuesta a sangre que enlazará a la zsig37 a más de 1 x 108. El recubrimiento de tales materiales se puede hacer usando métodos conocidos en el arte, ver por ejemplo Rubens, Patente US No. 5,272,074. El complemento y el Clq juegan un papel en la inflamación. La activación del complemento se inicia al enlazar el Clq a las inmunoglobulinas (Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12:933-41, 1993; Ward y Ghetie, Therap. Immunol. 2:77-94, 1995) . Los inhibidores del Clq y el complemento serían útiles como agentes antiinflamatorios. Tal aplicación se puede hacer para evitar la infección. Adicionalmente, tales inhibidores se pueden administrar a un individuo que padece de inflamación mediada por la activación del complemento y enlazada a complejos inmunes al Clq. Los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la zsig37, serían útiles en los métodos para mediar la reparación de heridas, aumentando el progreso en la cicatrización de heridas al superar la cicatrización dañada de heridas. El progreso en la cicatrización de heridas incluiría por ejemplo, elementos tales como una reducción en la inflamación, reclutamiento de fibroblastos, retracción de la herida y reducción de la infección .

La capacidad de las células de tumor para enlazarse al colágeno puede contribuir a la metástasis de tumores. Los inhibidores de enlace de colágeno son también útiles para mediar las interacciones adhesivas y la distribución metaestática de tumores (Noes ke- Jungbul t y colaboradores, patente US No. 5,723,312) . La zsig37 se encontró que induce la vasodilatación en anillos de aorta contraídos por norepineferina usando los procedimientos de Dainty y colaboradores, J. Pharmacol. 100: 767, 1990 y Rhee y colaboradores, Neurotox. 16:179, 1995, como se describe abajo con mayor detalle. La adhesión de plaquetas, activación y agregación se puede evaluar usando los métodos aquí descritos o conocidos en el arte, tales como el ensayo de agregación de plaquetas (Chiang y colaboradores, Thrombosis Res . 3_7_: 605-12 , 1985) y ensayos de adhesión de plaquetas (Peerschke y Ghebrehiwet, J. Immunol . 144:221-25, 1990) La inhibición del Clq y la trayectoria del complemento se pueden determinar usando métodos descritos aquí o conocidos en el arte tales como los descritos en Suba y Csako, J. Immunol. 117: 304-9, 1976. Los ensayos para la adhesión de plaquetas al colágeno y la inhibición de la agregación de plaquetas inducida por colágeno se puede medir usando los métodos descritos en Keller y colaboradores, J. Biol. Chem. 268:5450-6, 1993; Waxman y Connolly, J. Biol. Chem. 268:5445-9, 1993; Noeske- Jungblut y colaboradores, J. Biol. Chem. 269:5050-3 o 1994 Deckmyn y colaboradores, Bood 85:712-9, 1995. Diversos modelos in vi t ro e in vi vo están disponibles para evaluar los efectos de los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas y antagonistas de la zsig37 en lesiones por isquemia y reperfusión. Ver por ejemplo, Shandelya y colaboradores, Circulation 88:2812-26, 1993; Weisman y colaboradores, Science 249:146-151, 1991; Buerke y colaboradores, Circulation 91:393-402, 1995; Horstick y colaboradores, Circulation 91:393-402, 1995; Horstick y colaboradores, Circulation 95:701-8, 1997 y Burke y colaboradores, J. Phar. Exp. Therp. 286:429-38, 1998. Un ensayo de agregación de plaquetas en hámsteres ex vi vo , se describe por Deckmyn y colaboradores, ibid. Los tiempos de sangrado en hámsteres y babuinos se pueden medir después de la inyección de los polipépt idos de zsig37 usando el modelo descrito por Deckmyn y colaboradores, ibid. La formación de trombos en respuesta a la administración de proteínas de la presente invención, se puede medir usando el modelo de trombosis de la vena femoral del hámster que se proporciona por Deckmyn y colaboradores, ibid. Los cambios en la adhesión de plaquetas bajo las condiciones de flujo que siguen a la administración de la zsig37, se pueden medir usando el método descrito en Harsfalvi y colaboradores, Blood 85:705-11, 1995. La inhibición del complemento y la cicatrización de heridas por los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas del zsig37, se pueden ensayar solas o en combinación con otros inhibidores conocidos de la activación y agregación de plaquetas inducidas por colágeno tales como paldipina, moubatina o calina, por e j emplo . Los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la zsig37, se pueden evaluar usando los métodos aquí descritos o conocidos en el arte tal como la cicatrización de capas de la piel en cerdos (Lynch y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7696-700, 1987) y heridas de la piel de espesor completo en ratones diabéticos genéticamente (Greenhalgh y colaboradores, Am . J. Pathol. 136: 1235-46, 1990), por ejemplo. Los polipéptidos de la presente invención se puede ensayar solos o en combinación con otros inhibidores del complemento conocidos como se describió arriba. Además, los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de la zsig37 se pueden utilizar terapéuticamente para aplicaciones antimicrobianas. Por ejemplo, el componente del complemento Clq juega un papel en la defensa del huésped contra agentes infecciosos tales como bacterias y viruses. El Clq se conoce que muestra diversas funciones especializadas. Por ejemplo, el Clq dispara la cascada del complemento por medio de la interacción con el anticuerpo de enlace o la proteína reactiva-C (CRP) . También, el Clq interactúa directamente con ciertas bacterias, viruses de ARN, micoplasma, cristales de ácido úrico, el componente del lípido A de la endotoxina bacteriana y membranas de ciertos organismos intracelulares. El enlace del Clq al receptor Clq se cree que promueve la fagocitosis. El Clq también parece que aumenta el aspecto de la formación de anticuerpos del sistema de defensa del huésped. Ver por ejemplo Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12(11) : 933-41, 1993. Así, las moléculas solubles similares al Clq pueden ser útiles como agentes antimicrobianos, promoviendo la lisis o fagocitosis de agentes infecciosos. Los dominios de colágeno extracelulares positivamente cargados de triple hélice del Clq y el receptor secuestrador de macrófagos se determinaron que juegan un papel en el enlace de ligandos y demostraron tener una amplia especificidad de enlace para los polianiones (Acton y colaboradores, J. Biol. Chem. 268:3530-37, 1993) . El factor de crecimiento de lisofosfolípidos (ácido lisofosfat ídico , LPA) y otros aniones mitogénicos se localizan en el sitio de los tejidos dañados y ayudan en la reparación de las heridas. El LPA ejerce muchos efectos biológicos incluyendo la activación de plaquetas y la sobreregulación de la configuración de la matriz. Se piensa que el LPA hace sinergia con otros factores de coagulación de la sangre y media la cicatrización de heridas.

Los dominios de colágeno de proteínas tales como el Clq y el receptor secuestrador de macrófagos se conoce que enlazan los fosfolípidos ácidos tales como el LPA. Una región de nonámeros del dominio de colágeno del zsig37, residuos de aminoácidos 127-135 de la SEQ ID N0:2, comparte una homología de secuencia con el dominio de colágeno encontrado en Clq y en el receptor secuestrador de macrófagos. La interacción de los polipéptidos, fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas de la zsig37 con aniones mitogénicos tales como el LPA, se puede determinar usando los ensayos conocidos en el arte, ver por ejemplo Acton y colaboradores, ibid. La inhibición de los procesos inflamatorios por los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención, sería útil en evitar la infección en el sitio de la herida. Para el uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención se pueden formular con portadores farmacéuticamente aceptables para administración parenteral, oral, nasal, rectal, tópica y transdermal o similares, según los métodos convencionales. Preferiblemente la administración se hace en o cerca del sitio de la lesión vascular. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína zsig37 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden además incluir uno o más excipientes, conservadores, solubilizadores, agentes amortiguadores, albúmina para evitar la pérdida de proteína en la superficies del vial, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en el arte y se describen por ejemplo en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co . , Easton PA, 19th ed., 1995. Las dosis terapéuticas se determinarán generalmente por el médico según los estándares aceptados, tomando en cuenta la naturaleza y severidad de la condición a ser tratada, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de la habilidad ordinaria en el arte. Como se usa aquí, una "cantidad farmacéuticamente efectiva" de un polipéptido, fragmento, proteína de fusión, agonista o antagonista de la zsig37, es una cantidad suficiente para inducir un resultado biológico deseado. El resultado puede ser el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un polipéptido de zsig37 es aquella que suministra un alivio subjetivo de los síntomas o una mejora objetivamente identificable como se observa por el médico u otro observador calificado. Tal cantidad efectiva del polipéptido de zsig37 proporcionaría por ejemplo, la inhibición de la activación de plaquetas activadas por colágeno y la trayectoria del complemento, incluyendo Clq, incrementar el flujo sanguíneo localizado dentro de la vasculatura de un paciente y/o la reducción en los efectos perjudiciales de la isquemia y la reperfusión. Las cantidades efectivas de polipéptidos de zsig37 pueden variar ampliamente dependiendo de la enfermedad o el síntoma a tratarse. La cantidad del polipéptido a administrarse y su concentración en las formulaciones, depende del vehículo seleccionado, vía de administración, la potencia del polipéptido particular, la condición clínica del paciente, los efectos laterales y la estabilidad del compuesto en la formulación. Así, el médico empleará la preparación apropiada que contiene la concentración apropiada en la formulación, así como la cantidad de formulación administrada dependiendo de la experiencia clínica con el paciente en cuestión o con pacientes similares. Tales cantidades dependerán en parte, de la condición particular a tratarse edad, peso y salud general del paciente, y otros factores evidentes para aquellos hábiles en el arte. Típicamente, una dosis estará en el intervalo de 0.01-100 mg/kg del sujeto. En aplicaciones tales como catéteres de globo, el intervalo típico de dosis sería de 0.05-5 mg/kg del sujeto. Las dosis para compuestos específicos se pueden determinar a partir de estudios i n vi t ro o ex vi vo en combinación con estudios sobre animales experimentales. Las concentraciones de compuestos encontradas como efectivas i n vi t ro o ex vi vo , proporcionan una guía para estudios animales en donde las dosis se calculan para suministrar concentraciones similares en el sitio de acción. La invención se ilustra además por los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 Extensión de la secuencia EST Los polinucleótidos que codifican polipéptidos zsig37 novedosos de la presente invención, se identificaron inicialmente al seleccionar un EST de una base de datos EST, haciendo una predicción de una secuencia de proteína en que se basan, y buscando las bases de datos de secuencias conocidas para la proteína segregada que es más homologa con la proteína predecible basada en el EST. Los Est, que codifican potencialmente proteínas que tienen una homología biológicamente interesante para las proteínas segregadas conocidas, se identificaron para estudio adicional. Se descubrió una secuencia simple de EST y se predijo que fuera homologa con la proteína específica de adipocitos. Ver por ejemplo, Scherer et al., J. Biol. Chem. 270(45) : 26746-9, 1995. Para identificar el cADN correspondiente, se usó un clon que se consideraba probable que contendría la secuencia completa de codificación para la formación de secuencias.

Usando un estuche Invitrogen S.N.A.P.™ Miníprep (Invitrogen, Corp., San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante, se prepararon 5 ml de cultivo durante la noche en LB + 50 µg/ml de ampicilina. La plantilla se formó en secuencias sobre un formador de secuencias de ADN ABIPRISM ™ modelo 377 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct . ) usando el Estuche de Reacción Rápida para Formación de Secuencias en Ciclo y Terminador Colorante ABI PRISM™ (Perkin-Elmer Corp.) según las instrucciones del fabricante. Se usaron los oligonucleótidos ZC695 (SEQ ID NO: 5), ZC694 (SEQ ID NO: 6) a los promotores SP6 y T7 sobre el vector que contenía el clon como cebadores de la formación de secuencia. Se usaron los oligonucleótidos ZC13210 (SEQ ID NO: 7), ZC13588 (SEQ ID NO: 8), ZC13532 (SEQ ID NO: 9), ZC13641 (SEQ ID NO 10) , ZC13586 (SEQ ID NO 11) , ZC13651 (SEQ ID NO 12) , ZC13622 (SEQ ID NO 13) , ZC13625 (SEQ ID NO 14) , ZC13650 (SEQ ID NO 15) , ZC13589 (SEQ ID NO 16) , ZC13624 (SEQ ID NO 17) , ZC13531 (SEQ ID NO: 18), ZC13587 (SEQ ID NO: 19), y ZC13623 (SEQ IS NO: 20) para completar la secuencia del clon. Las reacciones de formación de secuencia se llevaron a cabo en un sistema de ciclo de temperatura Hybaid OmniGene (National Labnet Co . , Woodbridge, NY) . El programa de cómputo para análisis de secuencia SEQUENCHER™ 3.0 (Gene Codes corporation, Ann Arbor, MI) se usó para el análisis de los datos. La secuencia resultante de 2769 bp se describe en SEQ ID NO: 1. La comparación de la secuencia de EST originalmente derivada con la secuencia representada en SEQ ID NO: 1 mostró que había una ambigüedad en el par base (un residuo desconocido " N ' ' ) y ninguna inserción de pares base, lo que resultó en la identificación de leucina en la resolución de la ambigüedad y cambios en la estructura cero entre las secuencias reducidas de aminoácidos . Ejemplo 2 Distribución de tejidos Se llevaron a cabo pruebas Northern usando manchados de tejidos humanos múltiples de Clontech (Palo Alto, CA) . Se etiquetó radiactivamente una sonda de ADN de 30 bases (ZC12447; SEQ ID NO: 4) a la terminación 5' de la secuencia de nucleótidos de la proteína madura mostrada en la SEQ ID NO: 1 con 32P usando cinasa de polinucleótido T4 y solución amortiguadora de reacción posterior (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) según las especificaciones del fabricante. La sonda se purificó usando una columna de empuje NUCTRAP (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . Se usó una solución EXPRESSHYB (Clontech, Palo Alto, CA) para la pre-hibridación y como una solución de hibridación para los manchados Northern. La hibridación tuvo lugar durante la noche a 50°C, y los manchados se lavaron después en 2X SSC y 0.1% SDS a RT, seguido por un lavado en IX SSC y 0.1% SDS a 68°C (alrededor de 5°C menos que el punto de fusión) se observó un tamaño de transcripto a aproximadamente 2.8 kb . La intensidad de señal fue más alta para el corazón y la placenta, con señales relativamente menos intensas en riñon, ovario, glándula adrenal, y músculo esquelético y señales menores en una amplia variedad de otros tejidos presentes en el manchado Northern. El análisis adicional del manchado Northern se hizo usando un manchado Northern de tejido de intestino. El manchado se preparó usando mARN de una línea de célula de adenocarcinoma colorectal humano SW480 (Clontech, Palo Alto, CA), tejido humano del intestino delgado, (Clontech) tejido humano del estómago (Clontech), línea de células del músculo liso del intestino humano (Hism; ATCC No. CRL-1692; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD) , línea de célula del colon humano normal (FHC; ATCC No. CRL- 1831; American Type Culture Collection) y línea de célula del intestino delgado fetal normal humano (FHs74 Int.; ATCC No. CCL241; American Type Culture Collection) . Los ARN totales se aislaron de Hism, FHC y FHs74 Int. por el método del guanidio ácido ( Cheomczynski et al., Anal . Biochem. 162:156-9, 1987) . Se seleccionaron los poliA+ ARN al hacer la elución total del ARN a través de una columna que retiene los poliA+ ARN (Aviv et al., Proc . Nat . Acad. Sci. 6_9:1408-12, 1972) . 2 µg de poliA+ ARN de cada muestra se separaron en un gel de agarosa al 1.5% en formaldehido 2.2 M y solución amortiguadora de fosfato. Los ARN se transfirieron sobre una membrana de Nytran (Schleicher and Schuell, Keene, NH) en SSC 20X durante la noche. El manchado se trató en un Stratalinker UV 2400 (Stratagene, La Jolla, CA) a 0.12 Joules. El manchado se horneó a 80°C durante una hora. Se amplificó el cADN de longitud completa (mostrado en la SEQ ID NO: 1) por PCR y se radioet iquetó con 32P dCTP usando un estuche peletizador Rediprime (Amersham, Arlington Heights, IL) según las especificaciones del fabricante. El manchado se hibridizó en EXPRESSHYB (Clontech) a 56°C durante la noche. El manchado se lavó a temperatura ambiente en SSC 2X y SDS 0.1%, después SSC 2X y SDS 0.1% a 65°C, y finalmente a 65°C en SSC 0. IX y SDS 0.1%. Los resultados mostraron que la zsig37 hibridizó a todos los tejidos excepto a la línea de células HISM del músculo liso intestinal humano. Ejemplo 3 Mapeo cromosomal del gen zsig37 El gen zsig37 se mapeó para el cromosoma humano 17, región 17q25.2, por PCR usando el grupo número 2 de mapeo híbrido de células somáticas de roedor/humano NIGMS (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of Medical Research) . El grupo consiste de ADN aislado de 24 híbridos de células somáticas de roedor /humano cada una reteniendo un cromosoma humano específico y los ADN de origen. Para el mapeo del gen zsig37, se establecieron reacciones de 20 µl en una placa de microtitulación de 96 pozos (Stratagene, La Jolla, CA) y se usó un ciclizador térmico "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene) cada una de las 27 reacciones de PCR consistieron de 2 µl de una solución amortiguadora de reacción KlenTaq PCR 10X (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) , 1.6 µl de mezclas dNTP (2.5 mM cada uno, PERKIN- ELMER, Foster City, CA) , 1 µl de cebador de sentido (SEQ ID NO: 21), 1 µl de cebador antisentido (SEQ ID NO: 22), 2 µl de Rediload (Research Genetics, Inc.), 0.4 µl de una mezcla de polimerasa Advantage KlenTaq 50X (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de ADN de un clon híbrido individual o control y ddH20 para un volumen total de 20 µl. Las reacciones se esparcieron con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del ciclizador de PCR fueron como sigue: un ciclo inicial de 5 minutos de desnaturalización a 95°C, 35 ciclos de un minuto de desnaturalización a 95°C, 1 minuto de cocimiento a 60°C y 1.5 de extensión a 72°C, seguido por un ciclo final de extensión de 7 minutos a 72°C. Las reacciones se separaron por electroforesis sobre un gel de agarosa NuSieve GTG al 3% (FMC Bioproducts, Rockland, ME) . Ejemplo 4 Creación de los vectores de expresión de mamíferos z sig37NEE/pZ P9 y zsig37CEE/pZ P-9 Se prepararon dos vectores de expresión para el polipéptido zsig37, zsig37NEE/pZ P9 y zsig37CEE/pZP9, en donde los constructos se diseñaron para expresar un polipéptido de zsig37 que tiene una terminal C o N en la etiqueta Glu-Glu. zsig37NEE/pZP9 Un fragmento de ADN de 800 pares base de zsig37 generado por PCR, se creó usando ZC15040 (SEQ ID NO: 24) y ZC15033 (SEQ ID NO: 25) como cebadores PCR y la plantilla descrita en el ejemplo 1 anterior. La reacción de PCR se incubó a 94°C durante 3 minutos, y después corrió durante 5 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 30°C durante 20 segundos y 72°C durante 1 minuto, seguido por 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 64°C durante 20 segundos y 72°C durante 1 minuto. Siguió una extensión de 5 minutos a 72°C. El producto de PCR resultante se corrió en un gel de agarosa de TBE al 0.9% con una solución amortiguadora IX de TBE. Se cortó una banda del tamaño predecible y el ADN se purificó del gel con una resina Qiaex II® (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ADN se digirió con las enzimas de restricción Bam Hl y Xba I, seguido por extracción y precipitación. El fragmento cortado de ADN de zsig37NEE/pZ P9 y zsig37 digerido por restricción, se subclonó dentro del plásmido NEE/pZP9 que había sido cortado con las enzimas de restricción Ban Hl y Xba I. El vector de expresión zsig37NEE/pZP9 incorpora al líder de TPA y coloca la etiqueta Glu-Glu (SEQ ID NO: 26) a la terminal N de la secuencia de polinucleótido que codifica al polipéptido de zsig37. El plásmido NEE/pZP9 (depositado en la American Type Culture Collecion, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, ATCC No. 98668) es un vector de expresión mamífero que contiene una cinta de expresión que tiene el promotor de metalotioneína-1 de ratón, un péptido líder de TPA seguido por una secuencia que codifica la etiqueta Glu-Glu (SEQ ID NO: 26), sitios de restricción múltiple para la inserción de secuencias codificadoras y un terminador de la hormona de crecimiento humano. El plásmido también contiene un origen de replicación E . col i , una unidad de expresión marcadora seleccionable de mamífero que tiene un promotor SV40, un enriquecedor y origen de replicación, un gen DHFR y un terminador SV40. zsig37CEE/pZP9 Un fragmento de ADN de 866 pares base de zsig37 generado por PCR, se creó según el procedimiento arriba establecido usando ZC15721 (SEQ ID NO: 27) y ZC15035 (SEQ ID NO: 28) como cebadores de PCR. El fragmento purificado de PCR se digirió con las enzimas de restricción Eco Rl y Bam Hl, se purificó por gel usando una resina Qiaex II como se describe arriba. El ADN del zsig37 digerido por restricción y cortado, se subclonó dentro del plásmido CEE/pZP9 que había sido cortado con Eco Rl y Bam Hl. El vector de expresión zsig37CEE/pZP9 usa el péptido de señal natural zsig37 y el epítope Glu-Glu (SEQ ID NO: 26) se coloca en la terminación C como una ayuda para la purificación. El plásmido CEE/pZP9 (depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, ATCC No. 98668) es un vector de expresión mamífero que contiene una cinta de expresión que tiene el promotor de metalot ioneína- 1 de ratón, sitios múltiples de restricción para la inserción de secuencias de codificación, una secuencia que codifica la etiqueta Glu-Glu (SEQ ID NO: 26), un codon de detención y un terminador de la hormona de crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E . col i , una unidad de expresión de marcador seleccionable mamífero que tiene un promotor SV40, enriquecedor y origen de replicación, un gen DHFR y el terminador SV40. Para los constructos etiquetados como N y C, se ligaron alrededor de 30 ng de los insertos digeridos por restricción y 50 ng de los vectores correspondientes a temperatura ambiente durante 4 horas. Se electroforaron independientemente un microlitro de cada reacción de ligación dentro de las células competentes DH10B (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) según la instrucción del fabricante y se formaron en placas sobre placas LB que contenían 50 mg/ml de ampicilina y se incubaron durante la noche. Las colonias se tamizaron por PCR como se describe arriba. Para los tamizados zsig37NEE/pZ P9 y zsig37CEE/pZP9 los cebadores fueron • ZC13006 (SEQ ID NO: 29) y ZC13007 (SEQ ID NO: 20) . La reacción PCR se incubó a 94°C durante 2.5 minutos y después se corrió durante 25 ciclos de 94°C durante 10 segundos, 58°C para 20 segundos y 72°C para 1 minuto. Una extensión de 5 minutos a 72°C siguió. La secuencia de inserción de clones positivos, 1013 bp para zsig37NEE y un fragmento de 950 bp para el zsig37CEE se verificó por análisis de secuencia. Se hizo una preparación de plásmidos a gran escala usando un estuche de preparación QUIAGEN® Maxi (Qiagen) según las instrucciones del fabricante . Ejemplo 5 Transfección y expresión de los polipéptidos zsig37NEE y CEE Se formaron en placas células BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) en platos de cultivo de tejidos de 10 cm y se dejaron crecer hasta aproximadamente 50 a 70% de confluencia durante la noche a 37°C, 5% de C02, en medio de DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL de alta Glucosa, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% de suero bovino fetal, (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina 2 µM (JRH Biosciences, Lenexa, KS), piruvato de sodio 1 µM (Gibco BRL) ) . Las células se transfectaron después con el plásmido zsig37NEE/pZP9 (etiqueta Glu-Glu de la terminal N) o zsig37CEE/pZP9 (etiqueta Glu-Glu de la terminal C) , usando lipofectamina™ (Gibco BRL) , en una formulación de medios libres de suero (SF) (DMEM, Gibco/BRL de alta Glucosa, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 2 mM, transferrina 10 ug/ml, insulina 5 µg/ml, fetuina 10 µg/ml y selenio 2 ng/ml) . Dieciséis microgramos de zsig37NEE/pZP9 y 16 µg de zsig37CEE/pZP9 se diluyeron separadamente dentro de tubos de 15 ml hasta un volumen final total de 640 µl de medios SF. En tubos separados, se mezclaron 35 µl de Lipofectamina™ (Gibco BRL) con 605 µl de medio SF. La mezcla de lipofectamina™ se agregó a la mezcla de ADN y se dejó incubar aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Cinco mililitros de los medios SF se agregaron a la mezcla de AD : Lipofectamina™ . Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medios SF, se aspiraron, y se agregó la mezcla de ADN : Lipofectamina . Las células se incubaron a 37 C durante cinco horas, después 6.4 ml de DMEM/FBS 10% 1% de PSN se agregaron a la placa. La placa se incubó a 37°C durante la noche y se reemplazó la mezcla de ADN: lipofectamina con medios frescos FBS/DMEM al día siguiente. Al segundo día posterior a la transfección, las células se dividieron dentro de los medios de se ección (ESTEP #1 con 1 µM de MTX) en placas de 150 mm a 1:50, 1:100 y 1:200. Las placas se volvieron a alimentar al 5° día después de la transfección con medios frescos de selección. Colonias de Tamizado Aproximadamente 10-12 días posteriores a la transfección, se escogió un plato de cultivo de 150 mm de colonias resistentes al metotrexato de cada transfección, los medios se aspiraron, las placas se lavaron con medios ESTEP 2 libres de suero 10 ml (668.7 g/50 L DMEM (Gibco), ácido pirúvico 5.5 g/50 L, sal de sodio al 96%, (Mallinckrodt), NaHC03 185.0 g/50 L (Mallinkrodt ) , 5.0 mg/ml, insulina 25 ml/50 L, transferrina 10.0 mg/ml y 25 ml/ 50 L) , los medios de lavado se aspiraron y reemplazaron con 5 ml de ESTEP 2 libre de suero. Se colocó después sobre las células una malla de teflón estéril (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) pre-enj uagada en ESTEP 2 libre de suero. Un filtro estéril de nitrocelulosa pre-enj uagado en ESTEP 2 libre de suero, se colocó después sobre la malla. Las marcas de orientación sobre la microcelulosa se transfirieron al plato de cultivo. Las placas se incubaron después durante 5 o 6 horas a 37°C en un incubador al 5% del C02. Después de la incubación, se separó el filtro y los medios se aspiraron y reemplazaron con medios de DMEM/FBS 5%, IX PSN (Gibco BRL) . El filtro de colocó después en una bolsa sellable que contenía solución amortiguadora 50 ml (25 mM Tris, 25 mM glicina, 5 mM ß-mercapt oet anoi ) y se incubó en un baño de agua a 65°C durante 10 minutos. Los filtros se bloquearon en una solución amortiguadora Western A/ leche seca sin grasa al 10% (Western A: 50 mM tris pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.05% NP-40, 150 mM NaCl y 0.25% gelatina) durante 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador rotatorio. El filtro se incubó después con un conjugado de ant icuerpo-HRP anti Glu-Glu a una dilución de 1:1000 en una solución amortiguadora Western A/leche seca sin grasa al 2.5% (Western A: 50 mM Tris. pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.05% NP-40, 150 mM NaCl y 0.25% gelatina) durante la noche a 4°C en un agitador rotatorio. El filtro se lavó después 3 veces a temperatura ambiente en PBS más Tween 20 al 0.1%, 5-15 minutos por lavada. El filtro se reveló con reactivo' ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) según las instrucciones del fabricante y se expuso a película (Hyperfilm ECL, Amersham) durante aproximadamente 5 minutos. La película se alineó con la placa que contenía las colonias. Usando la película como guía, se seleccionaron las colonias apropiadas. Se enjuagaron discos de colonización de 3 mM estériles ( PGC Scientific., Corp., Frederick, MD) en tripsina y se colocaron en las colonias. Se transfirieron doce colonias por cada constructo dentro de 200 µl de medio de selección en una placa de 96 pozos. Se llevaron a cabo una serie de siete diluciones de dos veces por cada colonia. Las células crecieron durante una semana 37°C tiempo en el cual se seleccionaron los pozos que recibieron la dilución más baja de célula que estaba en la densidad óptima, y se trataron con tripsina y se transfirieron a una placa de 12 pozos que contenía los medios de selección. El plato de cultivo de 150 mm también se trató con tripsina y las células restantes se acumularon y sometieron a un análisis Western y a prueba de micoplasma. El acumulado se congeló para almacenamiento. Los clones se expandieron directamente desde la placa de 12 pozos dentro de dos matraces T-75.

Un matraz se dejó continuar con el crecimiento de células, el segundo matraz se hizo crecer en ESTEP 2 libre de suero que se cosechó del análisis del manchado Western. Los clones de cada uno de los constructos de expresión, basados en el análisis de manchado Western se seleccionaron, acumularon y transfirieron a un cultivo de gran escala. Ejemplo 7 Expresión de mamíferos a gran escala del zsig37CEE Un matraz T-162, que contenía células confluentes que expresaban el zsig37CEE y una que contenía zsig37NEE obtenidas del procedimiento de expresión arriba descrito, se expandieron en cuatro matraces T-162 cada uno. Uno de los cuatro matraces resultantes se usó para congelar 4 crioviales, y los otros tres matraces se usaron para generar una fábrica de células Nunc. Las células de los tres matraces t-162 de zsig37CEE y zsig37NEE se usaron para sembrar independientemente dos fábricas de células Nunc (10 capas, disponible comercialmente de VWR) . Brevemente, las células de los matraces t-162 arriba descritas se separaron usando tripsina, acumularon y agregaron a medios ESTEP 1 de 1.5 litros (668.7 g/50 L de DMEM (Gibco), 5.5 g/50 L de ácido pirúvico, sal de sodio al 96% (Mallinckrodt), 185.0 g/50 L de NaHC03 (Mallinkrodt ) , 5.0 mg/ml y 25 ml/50 L insulina (JRH Biosciences) , 10.0 mg/ml y 25 ml/50 L transferina (JRH Biosciences), 2.5 L/50 L de suero de bovino fetal (caracterizado) (Hyclone), 1 µM de MTX, con el pH ajustado a 7.05 +/- 0.05) precalentado a 37°C. Los medios que contenían las células se vaciaron después dentro de las fábricas de células Nunc por medio de un embudo. Las fábricas de células se colocaron en un incubador a 37°C/5.0% C02. En la confluencia de 80-100%, se llevó a cabo una prueba de contaminación visual (cambio de color rojo fenol) sobre los contenidos de las fábricas de células Nunc. Ya que no se observó contaminación, se vació el sobrenadante de las fábricas confluentes dentro de un recipiente pequeño de cosecha muestreado y descargado. Las células adherentes de lavaron entonces una vez con PBS 400 ml . Para separar las células de las fábricas, se agregaron 100 ml de tripsina a cada una y se separaron y las células se incubaron después durante 5 a 10 minutos en tripsina residual. Las células se recolectaron siguiendo dos lavados de 200 ml con medios ESTEP 1. A cada una de las 10 botellas que contenían los medios ESTEP 1 (1.5 litros cada una a 37°C), se agregaron 40 mililitros de células recolectadas. Se usó después una botella de 1.5 litros para llenar una fábrica Nunc. Cada fábrica de célula se colocó en un incubador a 37°C/5.0% de C02. Al 80-90% de confluencia, se llevó a cabo una prueba de contaminación visual (cambio de color rojo fenol) en las fábricas de células Nunc. Ya que no se observó contaminación, el sobrenadante de las fábricas confluentes se vació en un recipiente pequeño de cosecha, muestreado y descargado. Las células se lavaron después una vez con PBS 400 ml , 1.5 litros de medios ESTEP 2 (668.7g/50 L de DMEM (Gibco), 5.5 g/50 L de ácido pirúvico, sal de sodio al 96% (Mallinckrodt), 185.0 g/50 L de NaHC03 (Mallinkrodt), 5.0 mg/ml, 25 mg/50 L de insulina, 10.0 mg/ml y 25 ml/50 L transferrina) se agregaron a cada fábrica de células Nunc. Las fábricas de células se incubaron a 37°C /5.0% de C02. Se llevó a cabo una prueba de contaminación visual a aproximadamente 48 horas (cambio de color rojo fenol) sobre las fábricas de células Nunc. El sobrenadante de cada fábrica se vació dentro de recipientes pequeños de cosecha. Se vaciaron medios frescos libres de suero (1.5 litros) dentro de cada fábrica de células Nunc y las fábricas se incubaron a 37°C/5.0% de C02. Se transfirió un ml de la cosecha de sobrenadante para cada constructo a un portaobjetos de microscopio y se sometió a un análisis microscópico para contaminación. Los contenidos de los recipientes pequeños de cosecha para cada constructo se acumularon y se filtraron inmediatamente. Una segunda cosecha se llevó a cabo después substancialmente como se describe arriba a las 48 horas y las fábricas de células se descargaron posteriormente. Un aparato de un tren de filtro ensamblado asépticamente, se usó para la filtración aséptica del sobrenadante de la cosecha (medios acondicionados). El ensamble fue como sigue. La tubería flexible se sujetó con cable a un filtro Opti-Cap (Millipore Corp., Bedford, MA) y un filtro Gelman Supercap 50 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) . El filtro Supercap 50 se colocó también a un recipiente estéril con tapa localizado en un domo; la tubería flexible localizada corriente arriba del filtro MiTlipore Opti-cap se insertó sobre una bomba peristáltica; y el extremo libre de la tubería flexible se colocó en un recipiente grande de cosecha. La bomba peristáltica se operó entre 200 y 300 rpm hasta que todos los medios acondicionados pasaron a través de un filtro final de 0.22 µm dentro de un recipiente estéril de recolección. El filtrado se colocó en un cuarto frío a 4°C pendiente de purificación. Los medios se concentraron 10X con un concentrador Millipore de corte a 5 kDA (Millipore Corp., Bedford, MA) según la instrucción del fabricante y se sometió a un análisis de manchado Western usando un anticuerpo de etiqueta antilFLAG (Kodak) . Zsig37CEE: 5 matraces T-162 = 0.12 mg/L, 38 kDa; 1 Fábrica, FBS = 0.12 mg/L, 38 kDa; 10 Fábricas, FBS = 0.12 mg/L, 38 kDa; 10 Fábricas (#1), SF = 1.2 mg/L, 38 kDa; y 10 Fábricas (#2) SF = 3.56 mg/L, 38 kDa Zsig37NEE: 5 matraces T-162 0.137 mg/L, 35 kDa; 1 Fábrica, FBS = 0.137 mg/L, 35 kDa; 10 Fábricas, FBS 0.137 mg/L, 35 kDa; Fábricas (#1), SF = 1.37 mg/L, 35 kDa; y 10 Fábricas (#2) SF = 4.11 mg/L, 35 kDa.

Ejemplo 7 Purificación de zsig37NEE y zsig37CEE A menos que se señale de otra manera, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4°C. Se usó el siguiente procedimiento para purificar etiquetas Glu-Glu (EE) de zsig37 que contenían la terminal C o la terminal N. Se filtraron de forma estéril secuencialmente un total de 25 litros de medio acondicionado para células de riñon de hámster recién nacido (BHK) y a través de un filtro de cápsula Millipore (Bedford, MA) OptiCap 0.5 mM de 4 pulgadas y un Gelman Supercap 50 0.2 mM (Ann Arbor, MI) . El material se concentró después hasta alrededor de 1.3 litros usando un concentrador de flujo tangencial Millipore ProFlux A30 acoplado con una membrana de corte Amicon de 3000 kDA S10Y3 (Bedford, MA) . El material concentrado se filtró de forma estéril nuevamente con el filtro Gelman como se describe arriba. Se agregó una mezcla de inhibidores de proteasa a los medios concentrados acondicionados hasta concentraciones finales de ~^ácido et ilendiamint et racét ico de 2.5 mM (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0.001 mM leupeptina ( Boehringer-Mannheim, Indianapolis , IN), 0.001 mM pepstanina (Boehringer-Mannheim) y 0.4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim) . Una muestra de 25 mL de sefarosa anti-EE, preparada como se describe abajo, se agregó a la muestra para adsorción de lote y la mezcla se agitó suavemente en un aparato de cultivo de rodillo Wheaton (Millville, NJ) durante 18 horas a 4°C. La mezcla se vació después dentro de una Econo-Column de 5.0 x 20.0 cm (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA) y el gel se lavó en 30 volúmenes de columna de solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) . La fracción de flujo de paso no retenida se descargó. Una vez que la absorbancia del efluente a 280 nM fue menor que 0.05, se redujo el flujo a través de la columna hasta cero y el gel anti-EE de sefarosa se lavó intermitentemente con dos volúmenes de columna de PBS que contenían 0.4 mg/ml de péptido EE (AnaSpec, San José, CA) . El péptido usado tiene la secuencia Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp , SEQ ID NO: 31. Después de 1 hora a 4°C, se reasumió el flujo y la proteína eluida se recolectó. Esta fracción se refiere como la elución de péptido. El gel de sefarosa anti-EE se lavó después con 2.0 volúmenes de columna y glicina 0.1 M pH 2.5, y el lavado de glicina se recolectó separadamente. El pH de la fracción eluida con glicina se ajustó a 7.0 por la adición de un volumen pequeño de PBS 10X y se almacenó a 4°C para análisis posterior si se requería . La elución de péptido se concentró a 5 ml usando un concentrador de membrana de corte de peso molecular de 15,000 (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante. La elución del péptido concentrado se separó de los péptidos libres por cromatografía sobre una columna Sephadex G-50 de 1.5 x 50 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en PBS a un flujo de 1.0 ml/min usando un HPLC BioCap Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) . Se recolectaron fracciones de dos mililitros y se observó la absorbancia a 280 nM . Se recolectó el primer pico de material que se absorbe a 280 nM y eluye cerca del volumen hueco de la columna. Esta fracción fue de zsig37 NEE o zsig37 CEE puros. El material puro se concentró como se describe arriba, se analizó por SDS-PAGE y el ma"ñchado Western con anticuerpos anti-EE y las muestras se tomaron para análisis de aminoácidos y formación de secuencias en la terminal N. El resto de la muestra se formó en alícuotas y se almacenó a 80°C según los procedimientos estándar. La electroforesis del zsig37 NEE sobre geles SDS-PAGE en ausencia de agentes reductores, mostró una banda principal teñida de azul Coomassie de peso molecular aparente de 39,000 y diversos componentes menores de pesos moleculares entre 60,000 y 116,000. Todas las bandas mostraron una reactividad cruzada con anticuerpos anti-EE sobre los manchados Western. En presencia de un agente reductor, la única banda observada fue la proteína de 39,000 kDa, y su intensidad al teñido de azul Coomassie se incrementó. Esta banda también mostró una reactividad cruzada con el anticuerpo anti-EE sobre los manchados Western. Para el zsig37 CEE, la electroforesis en geles de SDS-PAGE en ausencia de agentes reductores mostró una banda mayor teñida con azul Coomassie de peso molecular aparente de 39,000 y diversos componentes menores de pesos moleculares entre 60,000 y 116,000. En los manchados Western, solamente las bandas de pesos moleculares aparentes de 150,000, 116,000 y 60,000 mostraron una reactividad cruzada con el anticuerpo anti-EE. En presencia de agentes reductores, solamente la banda teñida con azul Coomassie a 39.000 kDa se observó y este material mostró una reactividad cruzada con el anticuerpo anti-EE en los manchados Western. Bajo estas condiciones, se observó también una pequeña cantidad de material con reacción cruzada a 150,000 kDa. Preparación de la anti-EE sefarosa Un volumen de lecho de 100 ml de proteína G-Sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ) se lavó tres veces con 100 ml de PBS conteniendo 0.2% de azida de sodio usando una unidad de filtro de Nalgene de 5600 ml y 0.45 micrones. El gel se lavó con 6 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8.2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO), y se agregó un volumen igual de solución de anticuerpo EE que contenía 900 mg de anticuerpo. Después de una incubación durante la noche a 4°C, el anticuerpo no enlazado se separó por lavado de la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM como se describe arriba. La resina se volvió a suspender en 2 volúmenes de TEA, se transfirió a un recipiente apropiado y se agregó dimetilpimilimidato-2HCl (Pierce, Rockford,~~ IL), disuelto en TEA hasta una concentración final de 36 mg/ml de gel. El gel se balanceó a temperatura ambiente durante 45 minutos y el líquido se separó usando la unidad de filtro como se describe arriba. Los sitios no específicos sobre el gel se bloquearon después al incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM en TEA 200 mMM . El gel se lavó con 5 volúmenes de PBS que contenían azida de sodio al 0.2% y se almacenaron en esta solución a 4°C. Ejemplo 8 Ensayos de adhesión y proliferación La capacidad del zsig37 para estimular la adhesión y distribución de las células TF-1 se ensayo como sigue. Una serie de diluciones se prepararon del zsig37 etiquetado Glu-Glu en terminal C, a partir de 10 hasta 0.0625 µg/ml, en PBS o solución amortiguadora de recubrimiento ELISA (0.1 M NaC03)y cada uno se formó en placas en una placa de 96 pozos (Costar, Pleasanton, CA) a 100 µl/pozo. Las placas se incubaron a 37°C, 5% C02 durante 2 horas. Las placas se lavaron después 3X con RPMI/PBS al 10% (RPMl 1640, 2 mM de L-glutamina, 110 µg/ml de piruvato de sodio, PSN y 10% de suero de bovino fetal inactivado por calor y se dejaron bloquear durante 15 minutos. Las células TF-1 (derivadas de células de leucemia mieloide aguda) se volvieron a suspender en RPMI/FBS al % y se pusieron en placas a 10,000 células/pozo dentro de placas de 96 pozos recubiertas con zsig37CEE a un volumen final de 120 µl/pozo. La placa se incubó a 37°C bajo C02 al 5% durante 2 horas. Las placas se lavaron después 3X con PBS y se agregaron 200 µl/pozo de medio de crecimiento (RPMI/FBS al 10%, GM-CSF 5 ng/ml) . Las células se inspeccionaron microscópicamente antes y después del lavado. Se usó también un ensayo de incorporación de colorante para medir cuantitativamente el número de células adherentes basado en un cambio color imét rico y en un incremento en la señal fluorescente. Se agregó azul de Alamar™ (AccuMed, Chicago, IL) a las placas de 96 pozos y se incubaron las células a 37°C durante la noche bajo C02 al 5%. Las placas se barrieron después usando un fluorómetro con longitud de onda de excitación de 544 nm y longitud de onda de emisión de 590 nm . Resultaron más células adherentes en las placas recubiertas por zs ig37CEE-PBS que sobre las placas recubiertas con NaC03 0.1 M y zsig37CEE. La adición del zsig37 soluble no bloquea la adhesión de células al zsig37 enlazado. Se hizo un segundo ensayo usando TF-1, DA-1 (una línea de célula dependiente del IL-3 derivada de un ganglio linfático de un ratón con un linfoma de célula B por el sobrecrecimiento en medios IL-3 (suministrado por el Doctor, Kenneth Kaushansky, University of Washington, Seattle, WA) ) , pre-B (p53-/- células de médula de ratón, dependientes del IL-7, B220+, Thyl bajo, Sca-1+), y las líneas de células A7BaF-3 como se describen arriba a 5,000 células /pozo . Las células BHK se formaron también en placas a 500 células /pozo . La zsig37 permitió el crecimiento de las células A7-BaF-3 e inhibió ligeramente el crecimiento de las células DA-1. Ejemplo 9 Secuencia del ortólogo de ratón Los polinucleótidos novedosos que codifican polipéptido humanos zsig37 de la presente invención, se usaron para tamizar una base de datos de EST de ratón para secuencias homologas de ratón. Se descubrió una secuencia simple de EST y se predijo para la secuencia humana zsig37~. Para identificar el cADN correspondiente, se usó un clon considerado que probablemente contiene la secuencia completa de codificación para la formación de secuencias. Utilizando un estuche Invitrogen S.N.A.P.™ Miniprep (Invitrogen Corp.) según las instrucciones del fabricante, se preparó un cultivo de 5 ml durante la noche en LB + 50 µg/ml de ampicilina. La plantilla se formó en secuencias en un formador de secuencias de ADN modelo 377 ABIPRISM™ (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) usando el Estuche de Reacción Rápida para Formación de Secuencias en Ciclo y Terminador Colorante, grande ABIPRISM™ (Perkin-Elmer Corp.) según las instrucciones del fabricante. Se usaron los oligonucleótidos ZC694 (SEQ ID NO: 6), ZC6768 (SEQ ID NO 32) , ZC18297 (SEQ ID NO 33) , ZC18298 (SEQ ID NO 34) , ZC18402 (SEQ ID NO 35) , ZC18403 (SEQ ID NO 36) , ZC18456 (SEQ ID NO 37) , ZC18457 (SEQ ID NO 38) , ZC18560 (SEQ ID NO 39) , ZC18561 (SEQ ID NO: 40), ZC18687 (SEQ ID NO: 41) y ZC18688 (SEQ ID NO: 42) para completar la secuencia del clon. Las reacciones de formación de secuencia se llevaron a cabo en un sistema de ciclo de temperatura Hybaid OmniGene (National Labnet Co., Woodbridge, NY) . Se usó un paquete de cómputo para análisis de secuencia SEQUENCHER™ 3.1 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) para análisis de datos. La secuencia resultante de 2559 pares base se describe en la SEQ ID NO: 43 y la secuencia deducida de aminoácidos en la SEQ ID NO: 44. La alineación con la secuencia de nucleótidos humanos zsig37 (SEQ ID NO: 1) mostró un 77% de identidad en el nivel de nucleótido. La secuencia supuesta de aminoácidos (SEQ ID NO: 44) tiene 77% de identidad con la secuencia de polipéptidos humanos (SEQ ID NO: 2) . Ejemplo 10 Ensayos basados en células Los polipéptidos zsig37 se ensayaron en un ensayo de alta producción i n vi t ro , para identificar substancias que activan selectivamente las respuestas celulares en líneas de células inmortalizadas de osteoblastos. Se usó en el ensayo una línea de célula madura de osteoblastos derivada de ratones (deficientes) p53-/-, CCC4, que se transfecta con un plásmido que contiene un elemento de respuesta inducible a suero (SER) que impulsa la expresión de la luciferasa. Estas células también expresan receptores endógenos PTH, PDGF y bFGF. La estimulación del SER y así la expresión de la luciferasa en la célula CCC4, indica que la entidad química es probable que estimule la mitogénesis en osteoblastos. Las líneas CCC4 se trataron con tripsina y ajustaron a 5 x 104 células/ml en un medio de placas (alfa-MEM, 1% de suero de bovino fetal inactivado térmico, piruvato de Na lmM y L-glutamato 2 mM) y se formaron en placas (200 ul/pozo) dentro de placas de microtitulación blancas opacas Dynatech Microlite (Dynatech, Chantilly, VA) y se incubaron durante la noche a 37°C, y 5% de C02. El medio de crecimiento se aspiró después y reemplazó con 50 ul/pozo de medio de ensayo (F-12 HAM, albúmina de suero de bovino 0.5%, HEPES 20 mM, piruvato de sodio 1 mM y L-glutamato 2 mM) . Las diluciones en serie del zsig37 se hicieron en el medio de ensayo (0.29-1000 ng/ml de concentración final de ensayo) y se agregaron a los pozos. Las muestras de zsig37 se ensayaron por triplicado. Los controles de suero (negativo) y bFGF (positivo) se usaron también. La concentración final de bFGF fue de 3 ng/ml. Se ensayaron los controles por cuadruplicado. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37°C, 5% de C02. El medio de ensayo se aspiró después~~y las placas se enjuagaron una vez con PBS. A cada pozo se le agregaron después 25 µl de solución amortiguadora de lisis (reactivo de ensayo de luciferasa, E1501, Promega Corp., Madison, Wl) . Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 50 microlitros /pozo de substrato de luciferasa (reactivo de ensayo de luciferasa, E1501, Promega Corp.) y se detectó la actividad de la luciferasa usando un LUMINOSKAN® Labsystems a 2 segundos /pozo seguido de un retraso de 1 segundo. La señal promedio basal (no inducida) se restó de todas las lecturas que se expresan en la tabla 5 como un porcentaje de la inducción máxima producida por 3 ng/ml de bFGF. El zsig37 estimula la expresión de la luciferasa en este ensayo indicando que estimula los osteoblastos. El zsig37 estimula a 73 hasta 75% máximo a 1000 ng/ml. Se llevó a cabo un ensayo de contraparte de imitación del factor de crecimiento para determinar si el zsig37 actúa como una imitación del factor de crecimiento, particularmente los ligandos del receptor de tirosina cinasa PDGF, PDGF, bFGF y EGF (insulina-R negativo) . Una línea de célula clonal derivada del ratón Suizo 3T3, que se transfecta con un plásmido que contiene un elemento de respuesta inducible al suero (SER) impulsando la expresión de la luciferasa, se usa en el ensayo. Estas células también expresan receptores endógenos PMA, EGF y bFGF. La estimulación del SRE y así, la expresión de la luciferasa en las células de 3T3 del ratón Suizo, indican que la entidad química es probablemente imitación de la actividad del factor de crecimiento PDGF, bFGF y EGF. Las células Suizas 3T3, se trataron con tripsina y se ajustaron a 5 x 104 células/ml en el medio de placas, se pusieron en placas y se incubaron como se describió arriba. El medio de crecimiento se aspiró después y se reemplazó con medio de ensayo a 50 ul/pozo (F-12 HAM, albúmina de suero de bovino al 0.5%, HEPES 20 mM). Las diluciones en serie de zsig37 se hicieron en el medio de ensayo (concentración final de ensayo 0.29-1000 ng/ml) y se agregaron a los pozos. Las muestras de Zsig37 se ensayaron por triplicado. Un control de suero (negativo) y bFGF (positivo) para promover la proliferación de células se usó también. La concentración final de bFGF fue de 3 ng/ml. Los controles se ensayaron por cuadruplicado. Las placas se incubaron durante 5 horas a 37°C, 5% de C02. El medio de ensayo se aspiró después y las placas se enjuagaron una vez con PBS. A cada pozo se agregó entonces 25 µl de solución amortiguadora de lisis (Reactivo de Ensayo de Luciferasa, E1501, Promega Corp. Madison, Wl) . Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron cuarenta microlitros/pozo de substrato de luciferasa (Reactivo de Ensayo de Luciferasa, E1501, Promega Corp.) y se detectó la actividad de la luciferasa usando un LUMINOSKAN® de Labsystems a 2 segundos /pozo seguido de un retraso de 1 segundo. La señal promedio basal (no inducida) se restó de todas las lecturas que se expresan como un porcentaje de la inducción máxima producida por 3 ng/ml de bFGF. Un tratamiento de cinco horas de esta línea de célula con bFGF, DDGF, EGF o PMA conduce a una inducción de 25-50 veces de la expresión de luciferasa-SRE . El Zsig37 no parece estimular la expresión de luciferasa en este ensayo. El Zsig37 estimula a 0.2 hasta 0.1% máximo a 1000 ng/ml.

Ejemplo 10 Administración in vivo de zsig37 por medio de entrega adenoviral. Veinticuatro ratones macho y 24 hembras C57B16/J, de aproximadamente 12 semanas de edad (Jackson Labs, Bar Harbor, ME), se pesaron, se midió la temperatura del cuerpo y se observó la ingesta de alimento diariamente durante cuatro días antes de la inyección (días -4 hasta -1) . Al día 0, los ratones se dividieron en tres grupos y recibieron 0.1 ml de virus (AdV-vacío 1.8x1011 partículas de virus/0.1 ml ó partículas de virus AdV-zsig37-CEE 5x1011/0.1 ml ) por inyección en la vena intravenosa de la cola, o sin inyección en absoluto. La inyección debía resultar en infección del hígado del huésped y la expresión de un gen entregado viralmente debiera empezar dentro de las 24 horas y continuar durante 1 a 4 semanas. Se probaron tres grupos de ratones. El grupo 1, sin tratar, n=8 cada macho y hembra. El grupo 2, AdV-vacío (virus vacío), n=8 cada macho y hembra. El grupo 3, AdV-zsig37 CEE, n=8 cada macho y hembra. Las temperaturas corporales de los animales, pesos y el peso del alimento ingerido se observó durante las tres semanas. No se encontró diferencia entre los grupos. Al día 21, los ratones hembra se les aplicó la eutanasia y se sacrificaron por dislocación cervical, y al día 22 se hizo lo mismo con los machos. A los animales se les extrajo la sangre y los tejidos se cosecharon para necropsia. El grupo estándar de química de suero se hizo al momento del sacrificio. El hígado, riñon y los parámetros metabólicos estaban todos dentro de rangos normales. Había, sin embargo, una diferencia entre el grupo de tratamiento con zsig37 y el grupo tratado con virus vacío. Los animales con zsig37 tuvieron un índice promedio lipémico superior que los controles vacíos de virus. La diferencia no fue importante, sin embargo se garantizó investigación posterior. Se ensayaron los ácidos grasos libres totales en el suero restante de cada animal. Una diferencia estadísticamente significativa en los niveles de suero de ácido graso libre, se observó entre los ratones macho (p=0.0379) que recibían el virus vacío y aquellos que recibían el virus que codifica el zsig37; los ratones de zsig37 tuvieron niveles superiores. Se observó también una diferencia, aunque no estadísticamente significativa, en las hembras (p=0.03357). Se pesaron el hígado, bazo, riñon, timo, corazón y cerebro después de la separación. No se encontró diferencia entre los grupos de tratamiento. El análisis histopatológico de estos tejidos y la médula espinal, reveló que no había diferencia entre los grupos de tratamiento. Para confirmar los resultados anteriores, se hizo un segundo tamiz como arríba con las siguientes modificaciones. Tres grupos; a) sin tratar y en ayuno, b) con AdV-null y en ayuno, c) con AdV-zsig37-CEE y en ayuno, conteniendo 20 C57B16/J, 10 machos y 10 hembras, se probaron. Los ratones se dejaron en ayuno durante la noche y se recolectaron 10 µl de suero para establecer un nivel basal para los siguientes parámetros: glucosa en ayuno, TP, fosfatasa alcalina, colesterol, triglicéridos, ácidos grasos libres e insulina. Los pesos corporales se tomaron tres veces a la semana. En el día O, se inyectaron los ratones dentro de la vena de la cola lateral con 0.1 ml de la solución apropiada de virus. Se recolectó la sangre en el día 17 siguiendo un ayuno durante la noche. Después de 3 semanas, se sacrificaron los ratones y se recolectó toda la sangre. Se mezcló una porción de la sangre con EDTA para observar el CBC y el resto se volvió a ensayar y tamizar como se describió arriba. Se recolectaron los órganos y se guardó el esqueleto para histopatología. Ej emplo 11. Vasodilatación de los Anillos de la Aorta. El efecto del zsig37 en la vasodilatación de los anillos de la aorta se midió según los procedimientos de (Dainty y colaboradores, J.

Pharmacol. 100:767, 1990 y Rhee y colaboradores, Neurotox. 16: 179, 1995). Brevemente, los anillos de la aorta de 4 mm de longitud se tomaron de ratas Sprague Dawley de 4 meses de edad y se colocaron en una solución modificada de Krebs (118.5 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 1.2 mM MgS04*7H20, 1.2 mM KH2P04, 2.5 mM CaC12*2H20, 24.8 mM NaHC03 y 10 mM de glucosa) . Los anillos se colocaron después a un transductor de fuerza isométrica (Radnoti Inc., Monrovia, CA) y los datos se registraron con una plataforma de fisiología Ponemah (Gould Instrument Systems, Inc., Valley View, OH) y se colocaron en un baño de tejido de 10 ml oxigenado (95% de 02, 5% de C02) de solución modificada de Krebs. Los tejidos se ajustaron a una tensión de descanso de 1 gramo y se dejaron estabilizar durante una hora antes de la prueba. Los anillos se probaron por adiciones de 5µl de norepinefrina 1X10"7 M (Sigma Co., San Luis, MO) hasta una concentración final de alrededor de 1X10"9 M y carbacol, un agonista de acetilcolina muscarínico (Sigma Co.) a una concentración final de 2X1"7 M, para probar la integridad de los anillos. Después de cada prueba, se lavaron los anillos tres veces con solución amortiguadora fresca, 5 minutos entre los lavados y se dejaron descansar una hora. Para probar la vasodilatación , se contrajeron los anillos hasta dos gramos y se dejaron estabilizar durante quince minutos. Se agregó después zsig37 a l, 2 ó 3 de les 4 baños, sin lavado, y se registró la tensión en los anillos y se comparó con los anillos de control. Los anillos se probaron después para contracción con norepinefrina como se describió arriba. Los anillos se probaron a 323, 162, y 81 ng/ml de zsig37 pero no se pudo determinar una respuesta de dosis. Con objeto de evaluar la importancia estadística de los datos, se hizo una prueba de contingencia en todos los zsig37 y anillos de control usando dilatación como una determinante. De 10 de los 12 anillos probados con zsig37 vasodilatado lo hicieron 2 de los 7 controles. El valor P exacto de Fisher es 0.045. Se concluye que el zsig37 induce la vasodilatación en anillos de la aorta contraídos por norepinefrina . Ej emplo 12. Enlace de la zsig37 a proteínas de matriz. Se usó una prueba ELISA (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) para medir el enlace del zsig37 a diversas proteínas de matriz y complementar el Clq. Las proteínas de matriz usadas fueron colágeno de bovino tipo I (Becton Dickinson, Lincon Park, NJ) laminina, vitronectina, f ibrimect ina, colágeno humano de los tipos II, III, IV, V, VI (Chemicon International, Temecula, CA) . Se usó el BSA V (Sigma Co.) como un control negativo. Justo antes del uso, se diluyeron las proteínas en 2 X PBS (solución salina amortiguada con fosfato, Sigma Co.) hasta 100 µg/ml y se ajustaron a un pH de 7.2 con NaOH 0.1 N. Cada muestra de proteína se formó en placas por cuadruplicado (100 µl/pozo) dentro de una placa de 96 pozos. La placa se dejó secar durante la noche en un domo de flujo laminar y se lavó tres veces con 400 µl de BSA 5 mg/ml en PBS IX y se manchó en seco. El zsig37 se etiquetó con FITC según la instrucción del fabricante (Pierce, Rockford, IL) . Dentro de cada pozo se agregaron 100 µl de 1.8 µg/ml de zsig37-FITC en BSA al 5%, PBS. Las placas se incubaron durante 1.5 horas a temperatura ambiente y se lavaron después 3 veces con BSA al 5%, PBS. A cada uno de los pozos se le agregaron después 100 µl de biotina de ratón anti-FITC 1:400 (Sigma Co.). La placa se incubó 1.5 horas a temperatura ambiente y se lavó 3 veces con BSA al 5%, PBS. La placa se incubó después con 100 µl de estreptavidina/HRP 1:1000 (Amersham, Piscataway, NJ) durante 1 hora, y se lavó 3 veces con BSA al 5%, PBS. La placa se reveló después usando Supersignal® Ultra (pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de reaccionar durante 1 minuto, el líquido sobrante se separó de la placa al invertir la placa y dejándola seca con pequeños golpes. Esta placa se expuso a una película de rayos X (Kodak, Rochester, Nueva York) . Los resultados de este tamiz indican que solamente la fibronectina y los colágenos _I_, II, III, V y VI se enlazan significativamente a la zsig37-FITC. Tal enlace no se observó con laminina, vitronectina, colágeno IV o el control BSA. Ej emplo 13. Especificidad del enlace zsig37 al colágeno tipo VI . El ensayo ELISA para enlazar como se describe en el Ejemplo 12, se modificó para evaluar cuantitativamente el enlace. El zsig37/FITC, en el intervalo de 0.4 hasta 4 µg/ml, se enlazó a 10 µg del colágeno tipo VI (Chemicon International) como se describe arriba. La luminiscencia del reactivo Supersignal® se leyó en un lector de placas Wallac 1420 (Wallac, Gaithersburg MD) y la intensidad usada como una medida cuantitativa del zsig37-FITC enlazado a la placa ELISA. El enlace del zsig37 al colágeno tipo VI ajusta una curva de enlace típica hiperbólica (Figura 3a) . El zsig37-FITC enlazado formado en placas a 0.4 µg/ml se puede descartar del colágeno por la adición de zsig37 sin etiquetar en el intervalo de 0.8 hasta 8 µg/ml (Figura 3b) . Estos datos indicarían que el enlace es específico para los dominios en el colágeno de tipo VI y depende de la concentración.

Ej emplo 14. Enlace del zsig37 al Clq de complemento. El zsig37-FITC a 0.2 µg/ml mostró enlazarse al Clq del complemento (Sigma Co.) a 0.1 hasta 10 µg/ml por el método descrito arriba en el Ejemplo 13, (Figura 4) . La cantidad de enlace depende de la concentración y es saturable. Ejemplo 15. Inhibición del complemento por zsig37. Los ensayos de complemento se llevaron a cabo en placas de 96 pozos de fondo redondo. La solución amortiguadora Veronal de gelatina que contenía magnesio y calcio (141 mM NaCl, 1.8 mM barbitol de sodio, 3.1 mM ácido barbitúrico, 0.1% gelatina de bovino, 0.5 mM MgC12 y 0.15 mM CaC12), se usó para todas las diluciones de suero e inhibidor así como para las suspensiones de eritrocitos. Se agregaron cincuenta microlitros de suero de complemento humano estandarizado (Sigma Co.), diluido 1/37.5 (para una dilución final de 1/150) a cada pozo. El inhibidor se agregó por triplicado, 50 µl/pozo. El suero y el inhibidor se incubaron durante treinta minutos a temperatura ambiente. El ensayo se inició por la adición de 100 µl de 2 X 108/ml de eritrocitos no sensibilizados de oveja (Colorado Serum Co., Denver, CO), eritrocitos sensibilizados de oveja (sensibilizados usando el protocolo del fabricante de Hemolisina ( BioWhittaker Inc., Wal kersville , MD) y eritrocitos de conejo que contenían EGTA 16 mM , y Mg+ + 4 mM . La serie de dilución del suero humano de 1/50 hasta 1/400 se formó también en placas como un control de actividad. Los eritrocitos, lisados con agua destilada y diluidos hasta 700, 75, 50, 25, y 12.5 por ciento de lisis, se usaron para cuantificar el porcentaje de lisis del complemento. La placa se selló y se incubó a 37°C durante 1 hora con mezclado cada 15 minutos. La reacción se detuvo por la adición de EDTA 220 mM, 20 µl/pozo y las placas se centrifugaron a 1500 X G durante 10 minutos. Cien microlitros del sobrenadante se separaron de cada pozo y se transfirieron a una placa de 96 pozos de fondo plano para análisis. La placa se leyó a 415 nM y se calculó el porcentaje de lisis. El zsig37 fue efectivo para inhibir la trayectoria clásica con eritrocitos de oveja sensibilizados y no sensibilizados (Figura 5) . No hubo inhibición aparente de la trayectoria alternativa probada con eritrocitos de conejo y EGTA. El mecanismo de inhibición es indeterminado debido a que el Clq enlaza al zsig37, Cl es el objetivo más probable. Ejemplo 16. Inhibición por el zsig37 de la activación de plaquetas por colágeno. Se retiró sangre de voluntarios saludables dentro de tubos que contenían citrato de sodio, mantenida a temperatura ambiente y usada dentro de cuatro horas de la obtención. Las sangre entera se anali «zó para activación de plaquetas usando un Lumi-Agregómet ro Chrono-Log 560A de sangre entera (Chrono-Log Corp., Haverton, PA) según las instrucciones del fabricante. Para cada punto de prueba, se agregaron 500 µl de sangre a un tubo de reacción que contenía una barra de agitación y 500 µl • de solución salina isotónica que contenía zsig37 a concentraciones desde 0 hasta 20 µg/ml. La mezcla se incubó durante cuatro minutos seguida por la activación de plaquetas iniciada por la adición de 5 µl de colágeno reticulado 1 mg/ml (Chrono-Log Corp.) a la mezcla de sangre/ zsig37. La inhibición de la activación por ADP (concentración final lOµM) t -combina (concentración final lU/ml) se probó de una forma similar . La inhibición de la activación de plaquetas mediada por colágeno por el zsig37, muestra una relación dependiente de la dosis entre 5 y 20 µg/ml (Figura 6a) . La inhibición es selectiva para la activación de colágeno y no tiene efecto sobre la activación estimulada por ADP o trombina (Figura 6b) . La activación por colágeno no se inhibió por otra proteína zsig37 relacionada con el complemento Clq (Solicitud de Patente US copendiente 09/140,804). Ej emplo 17. Estimulación del crecimiento del fibroblasto SK5 por el zsig37. Se colocó en placas fibronectina humana (25 ug/ml, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) dentro de placas de 96 pozos (Costar, Pleasanton, CA) a 100 µl/pozo y se dejó secar en un domo laminar durante la noche. Se colocaron en placas fibroblastos SK5 humanos en DMEM (Gibco) conteniendo suero de bovino fetal al 10% - de baja endotoxina (Hyclone, Logan, UT) a 5000 células/pozo dentro de las placas recubiertas con fibronectina e incubadas a 37°C, 5% de C02 durante 2 o 3 días. El número de células por placa se ajustó para alcanzar la no confluencia. Las células se lavaron después dos veces con DMEM libre de suero y alta glucosa (Gibco) y se privó el suero al hacer crecer en DMEM libre de suero y alta glucosa durante 24 horas. Se agregó zsig37 a los pozos por triplicado, en concentraciones de 312.2 ng/ml hasta 10,000 ng/ml en 100 µl de DMEM. Las células se incubaron después durante 48 horas a 37°C, 5% de C02. Se probó la proliferación de células al agregar 15 µl de solución colorante MTT (estuche CellTiter 96®, Promega) a cada pozo. La placa se incubó 4 horas a 37°C, 5% de C02 y la reacción se detuvo con una solución de solubilización/detención (estuche CellTiter 96®, Promega) según las instrucciones del fabricante. La placa se incubó durante 1 hora para solubilizar los cristales de formazan y la absorbancia se midió a 570 nm con una referencia a 650 nm usando un lector de placas ELISA. Los resultados (Figura 7) muestran un incremento dependiente de la dosis en el número de fibroblastos SK5 sobre el rango de concentraciones de zsig37 probadas. Estas concentraciones estuvieron dentro del intervalo de valores observados APRA los efectos mitogénicos de la cadena b de fibrinógeno (Gray, y colaboradores, Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, 684,1995 y Gray y colaboradores, J. Biol. Chem. 270, 26602, 1995) y para la adhesión de células de fibroblastos al Clq formado en placas (Bordin, y Ghebrehiwert , J. Immun. 145:2520, 1990) ambos de los cuales se cree que interactúan con la calret iculina de la superficie de la célula. Ejemplo 18. Producción de anti-suero de zsig37. Se prepararon anti-sueros policlonales de conejo al inmunizar dos conejos blancos hembras de Nueva Zelanda con zsig37-CEE purificado de células BHK. La proteína se conjugó a la proteína portadora de hemocianina de lapa de concha con orificio (KLH) con glutaraldehído. Se les dió a cada uno de los conejos una inyección inicial intraperitoneal (ip) de 200 µg de péptido en un adyuvante completo de Freund seguido de un disparo de inyecciones de 100 µg de péptido en adyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. De siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de disparo, se hicieron sangrar los animales y se recolectó el suero. Los animales se elevaron después y sangraron cada tres semanas. E j emplo 19. Detección del enlace de proteína zsig37 etiquetada con FITC en tejidos. El enlace de la proteína zsig37 etiquetada con FITC en tejidos se detectó como sigue: Tejidos humanos seccionados y alojados en parafina o embriones de ratón sobre portaobjetos, se obtuvieron de fuentes comerciales (i.e. DAKO Corporation, Carpintería, CA; BioGenex, San Ramón, CA; Novagen, Madison, Wl; y Biomeda, Foster City, CA) o en laboratorios. Las secciones de tejido humano incluyen glándulas adrenales, cerebro, corazón, intestino delgado, intestino grueso, riñon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata, vaso, estómago, testículos, tiroides y útero. Las secciones de embrión de ratón fueron de la etapa de 16 días . Las secciones de tejidos se desparafinaron usando condiciones normales de 3 x 5 minutos en xileno, 4 minutos en etanol al 100% (EtOH), 3 minutos en etanol al 100%, y 2 minutos en EtOH al 95%. Las secciones de tejido se sometieron después a un proceso de recuperación de antígenos por 20 minutos a 94°C según las instrucciones de los fabricantes (DAKO Corporation), seguida por una digestión de 20 minutos en pepsina al 0.01%/HC1 0.2 N. Las secciones de tejidos se enjuagaron dos veces en dH20 y una vez en PBS/0.05% (Sigma, St . Louis, MO) , solución amortiguadora y después se bloquearon durante 45 minutos con 1 X PBS/BSA al 5%/leche seca no grasa al 5% (Carnation, Los Angeles, CA) . Esto siguió por una etapa de bloqueo de avidina/biot ina hecha según las instrucciones de los fabricantes (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) . Las secciones de tejido se lavaron 3 veces en PBS 1 X/solución amortiguadora Tween 20 al .05% y se incubaron después con la concentración apropiada de proteína zsig37 etiquetada con FITC en PBS/BSA al 5% durante 45/60 minutos. Después de lavar el tejido en secciones 3 veces en 1 X PBS/Tween 20 al 0.05%, se incubaron con una dilución 1:400 de anti FITC (mo) conjugado Mab de biotina (Sigma) durante 30-60 minutos, se lavaron 3 veces en PBS/Tween 20 al 0.05% y se incubaron después durante 30-60 minutos con una dilución 1:500 de es t reptavidina-FITC (NEN Life Science Products, Boston, MA) seguida de dos lavados en 1 X PBS/solución amortiguadora Tween 20 al 0.05% y un lavado en 1 X PBS sin Tween 20. Las secciones de tejido se montaron después con un medio ant idecolorante que contenía 05 µg/ml de yoduro de propidio como contra tinte. Se observó un enlace significativo a las paredes del vaso y a los tejidos de tipo conectivo fibroso fino tales como la matriz de colágeno en la mayoría de los tejidos humanos y secciones de embrión estudiadas. Ejemplo 20 Zsig37 en el modelo de lesión a la arteria carótida del conejo. Se administró la zsig37 en un modelo de lesión de arteria carótida de conejo modificado (Folts y colaboradores, Circulation 79:116-24, 1989 y Golino y colaboradores, Trombosis y Haemostasis 67:302-5, 1992) para determinar .el grado de protección ofrecida al evitar la oclusión vascular que sigue a una lesión por aplastamiento. 34 conejos machos blancos de Nueva Zelanda de aproximadamente 3-6 meses de edad (R&R Rabbitry, Stanwood, WA) se colocaron en dos grupos. Quince conejos recibieron dosis de zsig37 en el intervalo de 2-13.5 µg/kg y 19 conejos de control se inyectaron con PBS o cantidades equivalentes de PBS o Zsig39, otra proteína relacionada con el complemento de adipocitos ( WO99/10492 ) . Se anestesiaron los conejos con cetamina (50 mg/kg, IM) y se mantuvieron con anestesia por inhalación de halotano durante la duración del estudio. Se afeitó el pelo de las orejas y el cuello y se colocó un angiocatéter en la vena marginal en la oreja para soporte IV. Se hizo una incisión de línea media en el cuello y se tuvo acceso a la arteria carótida. Aproximadamente 5 centímetros de la arteria carótida común próxima a la bifurcación interna/externa se expusieron por medio de una disección ciega del tejido circundante y se cauterizó cualquier ramificación lateral visible. Se colocó una sonda de flujo distal (Transonic Systems, Inc., Ithaca NY) al sitio anticipado de la lesión y se estableció una línea base de flujos sanguíneos. Se aisló después una sección de 2.5-3.0 cm del vaso de circulación usando pinzas vasculares no traumáticas. Después de la separación de la sangre del segmento del vaso, se inyectaron .4 ml de zsig37 en cloruro de sodio al 0.9% o 0.04 ml de cloruro de sodio al .9% como control dentro del segmento de vaso vacío usando una aguja 30G. El vaso se dejó sin perturbar durante un tratamiento pre-lesión de 5 minutos. Se aplicó después una lesión por aplastamiento de 1.0 cm dentro del centro del segmento del vaso usando un hemostato protegido y se dejó sin perturbar durante 10 minutos. Las pinzas del vaso se separaron y se restableció el flujo sanguíneo. El flujo sanguíneo se observó continuamente durante 60 minutos, tiempo después del cual a los conejos se les aplicó la eutanasia y el vaso se cortó para análisis histológico. No se observó dependencia de la dosis a estas concentraciones. Un análisis meta de todas las dosis zsig37, resultó en un incremento importante en el tiempo abierto cuando se compara a los controles en una prueba t impar (P=.0019) . El porcentaje medio de tiempo abierto para los grupos combinados de los animales de control negativos, determinado de las observaciones de flujo sanguíneo, fue de 13.5% con un error estándar de +_1.7%. El porcentaje medio de tiempo abierto para los grupos combinados tratados con zsig37 de animales, determinado de las observaciones de flujo sanguíneo, fue de 37.2% con un error estándar de +10.3%.

En una segunda serie de experimentos, se usó zsig37 preparada por fluorescencia en el modelo de arteria carótida lesionada. Conejos machos blancos de Nueva Zelanda se anestesiaron como arriba. Por medio de una incisión en el cuello, se expuso la arteria carótida y aproximadamente 5 cm del vaso aislado del tejido consecutivo circundante. Se evacuó la sangre del segmento aislado y se aplicaron sujetadores vasculares no traumáticos. Se inyectaron aproximadamente .05 ml de la zsig37 preparada por fluorescencia (concentración 100 µg/ml) dentro del segmento aislado para llenar completamente el vaso usando una aguja 30G. Después de un periodo de exposición de 5 minutos, el vaso se lesionó y la exposición continuó por otros 110 minutos antes de que se separaran los sujetadores y se restableciera el flujo sanguíneo. Se aplicó la eutanasia a los animales como se describió arriba en al 1, 10, y 60 minutos posteriores al restablecimiento del flujo sanguíneo y se recolectaron los vasos y la formalina fijada para evaluación histológica. La zsig37 etiquetada se enlaza preferentemente a los receptores en el medio de los vasos lesionados. La zsig37 etiquetada no se enlaza a las áreas de los vasos que no fueron lesionadas. El tiempo del flujo sanguíneo previo a la recolección del vaso no afecta la cantidad de zsig37 que permanece enlazada al tejido, esto es, no hay diferencia en la cantidad de zsig37 etiquetada enlazada a los tejidos en un minuto contra el punto de tiempo de colección de 60 minutos. Esto puede indicar que la zsig37 se enlaza fuertemente al vaso lesionado y no se limpia al restablecerse el flujo sanguíneo. También se evaluó el efecto de la zsig37 sobre la dinámica de flujo sanguíneo que sigue a la lesión vascular en un modelo de estenosis/lesión por aplastamiento de la arteria iliaca de conejo. Se anestesiaron conejos machos adultos jóvenes blancos de Nueva Zelanda como se describió arriba. Por medio de una incisión abdominal, se expuso la bifurcación aorto-iliaca y cada iliaca se liberó de los tejidos circundantes y se ligaron las principales ramificaciones. Cada iliaca se instrumentó con una sonda de flujo de ultrasonido para observar el flujo de sangre a través del vaso. Con base a los datos de flujo de sangre, se seleccionó una iliaca para usarse para la lesión y la otra se cateterizó para entrega de la muestra de prueba. Se dividieron los conejos en grupos de dosis de 6 animales-grupo. Las dosis de muestra de prueba que contenían la zsig37 se incrementaron en incrementos logarítmicos medios desde 3-1000 µg/kg durante el periodo seleccionado de infusión. La infusión de las muestras de prueba se inició seguida por la creación de una estenosis crítica que redujo el flujo sanguíneo a través del vaso hasta aproximadamente 50%. Después de la creación de la estenosis y un periodo de estabilización de flujo sanguíneo, el vaso se lesionó al aplastar el vaso entre las mordazas de un sujetador de aguja uniforme. La infusión se continuó posterior a la lesión por un periodo establecido de tiempo de 10-20 minutos. El flujo se sangre a través del vaso lesionado se observó durante 60 minutos posterior a la lesión. Se les aplicó la eutanasia a los animales a la conclusión del periodo de estudio. La sección inferior de la aorta abdominal y de cada iliaca se recolectaron y se fijaron con formalina para evaluación histológica. Los parámetros de flujo de sangre determinados de las observaciones de flujo, incluyen post estenosis de flujo medio, flujo medio posterior a la lesión y el tiempo que permaneció el vaso abierto. Estos datos sugieren que hay una tendencia para la zsig37 para promover el tiempo aumentado de apertura con una dosis incrementada de hasta 300 µg/kg durante un periodo de 60 minutos . Ejemplo 21 Relajación de las contracciones del anillo de la aorta de rata inducida por serotonina. Ratas Sprague-Dawley machos, de aproximadamente 3 meses de edad se anestesiaron ligeramente con C02 y después se decapitaron. La aorta toráxica se separó después rápidamente y se colocó en una solución amortiguadora modificada de Kreb-Henseleit (NaCl, 118.2 mM; KCl, 4.6 mM ; CaCl2, 2.5 mM; MgS04, 1.2 mM; NaHC03, 24.8 mM; KH2P04, 1.2 mM; y glucosa, 10.0 mM) . De cada rata, se cortaron 4 secciones del anillo aórtico de 2-3 mm después de descargar el extremo áspero de la aorta. En algunos experimentos se descubrió el endotelio antes de cortar las secciones de anillo, al frotar el lumen de la aorta a lo largo de una aguja de calibre 21. El despoj amiento del endotelio se verificó por la adición de un análogo de acetilcolina, carbacol, antes de determinar las respuestas dependientes de la concentración de zsig27. En ausencia del endotelio, el carbacol no relaja los vasos de las secciones del anillo vascular obstruido. Se fijaron los anillos y se conectaron a transductores de fuerza de desplazamiento en baños orgánicos enchaquetados oxigenados en vidrio (95% 02, 5% C02), mantenidos a 30°C en una solución amortiguadora modificada de Krep-Henseleit pH 7.4. La tensión de reposo se estableció a 1 gm y se reajustó continuamente hasta 1 gm durante un periodo de incubación de 1 hora. Se agregó solución amortiguadora fresca oxigenada modificada de Krep-Heinseleit a los baños durante cada 15 minutos del periodo de incubación en reposo. Al término de la incubación por 1 hora, se contrajeron las secciones de anillo por la adición de 10 µM de serotonina. Después de que se había alcanzado la contracción máxima, aproximadamente 15-20 minutos después de la adición de la serotonina, se construyeron curvas de respuesta acumulativa de concentración para zsig37. Se agregó la zsig37 a los baños de 5 ml en volúmenes desde 5 hasta 150 µls, para concentraciones finales desde 1 ng/ml hasta 40 µg/ml. La viabilidad de las secciones de anillos se verificó al término de las respuestas de concentración por la adición de forscolina (2.5 µM) o nitroglicerina (22 µM) . La adición de zsig37 indujo una relajación de vasos dependiente de la concentración de las secciones aórticas de rata contraídas por serotonina con y sin un endotelio intacto. La relajación en respuesta de zsig37 se observó primero a concentraciones arriba de 100 ng/ml. La relajación se observó aproximadamente 30-60 segundos después de las adiciones de cada concentración de zsig37 al baño, y las respuestas de relajación se asentaron dentro de 3-5 minutos después de la adición de zsig37. El carácter de la respuesta de relajación a zsig37 indica que la relajación de vasos es un evento mediado por un segundo mensajero-receptor. Adicionalmente, la capacidad de la zsig37 para vasorelajar secciones aórticas descubiertas del endotelio, indica que la zsig37 actúa directamente sobre las células de músculo liso para producir una respuesta vaso reía j ante . Ejemplo 22 Identificación de las células que expresan el receptor de zsig37 usando una hibridación in situ.

Se aislaron tejidos humanos específicos y se tamizaron para la expresión de zsig37 por una hibridación in situ. Diversos tejidos humanos preparados, seccionados y sometidos a una hibridación in situ incluyen aorta, corazón, ganglio linfático, placenta, próstata, glándulas salivales, piel y testículos. Los tejidos se fijaron en formalina amortiguada al 10% (Surgipath, Richmond, IL), y se alojaron en un paraplasto X-tra (Oxford Scientific, St. Louis, MO), y se seccionaron 5 µm con un microtomo Reichart-Jung 2050 (Leica Instruments GMBH, Nussloch, Germany) . Se formaron secciones de los tejidos a 4 hasta 8 micrones. Los tejidos se prepararon usando un protocolo normal ("Desarrollo de una hibridación in situ nono-isopotica", Laboratory of Experimental Pathology, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Park Triagle, NC) . Brevemente, las secciones de tejido se desparafinaron con HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) y después se deshidrataron con etanol. Después se digirieron las secciones con proteinasa K (50 µg/ml) (Boehringer Mannheim, Indianápol is , IN) a 37°C durante 2 a 20 minutos. Esta etapa se siguió por la acetilación y rehidratación de los tejidos.

Tres sondas i n s i t u generadas por PCR se designaron contra la secuencia humana de zsig37. Se designaron dos conjuntos de cebadores de oligonucleótidos para generar sondas para las regiones separadas del cADN de zsig37: (1) el oligonucleótido ZC23,689 (SEQ ID NO:45) y el ZC23,694 (SEQ ID NO:46) se usaron para generar una sonda de 414 bp para la zsig37; (2) la Zc23,703 (SEQ ID NO:47) y la ZC23,697 (SEQ ID NO:48) se usaron para generar una sonda de 896 bp para la zsig37; (3) la ZC24,441 (SEQ ID NO:49) y la ZC24,442 (SEQ ID NO:50) se usaron para generar una sonda de 290 bp para zsig37. El oligo antisentido para cada conjunto también contenía la secuencia de trabajo para el promotor de polimerasa de ARN T7 para permitir la trascripción simple de las sondas antisentido de ARN de estos productos. Se purificaron los productos de PCR por columnas giratorias Qiagen (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) seguida por una extracción de fenol/cloroformo y precipitación por etanol. Las sondas se etiquetaron posteriormente con digoxigenina (Boehringer) o biotina (Boehringer) usando un sistema de trascripción in vi t ro (Promega Corp., Madison, Wl) según las instrucciones del fabricante . Se llevó a cabo la hibridación i n s i t u con una sonda de zsig37 etiquetada con biotina o digoxigenina como se describe arriba. La sonda se agregó a los portaobjetos a una concentración de 1 a 5 pmol/ml durante 12 a 16 horas a 50-60°C. Los portaobjetos se lavaron posteriormente en SSC 2X y SSC 0.1X a 50-55°C. Se amplificaron las señales usando una amplificación de señal de tiramida (estuche indirecto i n s i t u de TSA, NEN, Boston, MA) y se visualizaron con un estuche de substrato Rojo Vector (Vector Laboratories, Burlingame, CA) según las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se contrat iñeron con hematoxilina (Vector Laboratories) . Se observaron señales positivas en la aorta humana, corazón, próstata, glándula salival y testículos. Las células que coloreaban positivo parecían ser células endoteliales de vasos de diámetro pequeño en la cercanía que rodea a la aorta, células mesoteliales que se superponen al epicardio, células acinar de la glándula salival y células mononucleares escalonadas, trofoblastos de la placenta, células epiteliales de la próstata y epitelio estratificado de túbulos seminíferos de los testículos. Ejemplo 23 Análisis SEC-MOLS de zsig37 La zsig37 contiene un dominio similar al colágeno de terminal N así como una región globular de terminal C que tienen homología con la familia del factor de necrosis de tumor y como tales proteínas, se espera que la zsig37 se multimerice. La zsig37 purificada analizada un espectrómetro de masas de trampa de ESI-ion (Finnigan Matt, San José, CA) indica la presencia de especies que se aproximan a trímeros y nonámeros, lo cual fue un resultado inesperado cuando se compara con otras proteínas homologas. El mapeo de péptidos de zsig37 usando LC-MS/MS sobre un espectrómetro de masas de trampa ESI-ion (Finnigan Matt) reveló que diversos residuos de cisteínas se modificaron con un grupo cisteinilo S- puede ser que la modificación de los residuos clave de cisteína en la proteína zsig37 durante la fermentación con cisteína libre en el medio, está evitando la asociación oligomérica adecuada de esta molécula.

Para aprender más, se hizo una comparación de la zsig37 reducida y no reducida usando una columna de exclusión de tamaño Biosep S-300 a 1 ml/minuto (7.8 x 3000 mm; Phenomenex, Torrance, CA) sobre un HPLC HP 1050 (Hewlett Packard, Heidleberg, Germany) . El HP 1050 se acopló a detectores del índice de refracción y dispersores de luz, miniDAWN y Optilab DSP (Waytt Technology, Santa Barbara, CA) para SEC-MOLS en línea. Un miligramo de la zsig37 recombinante (1.0 mg/ml) se agregó a TCEP a una relación 10:1 mol/mol de TCEP a zsig37 y se mantuvo a temperatura ambiente durante 70 minutos. 60 microlitros de la zsig37 reducida se inyectaron para análisis SEC-MOLS y el resto de la zsig37 reducida se preparó por diálisis en cintas Slide-Alyzer 0.5-3.0 ml, 10K MWCO (Pierce, Rockford, IL) con agitación contra PBS, pH 7.4 con tres cambios de solución amortiguadora como sigue: 1 litro de PBS a temperatura ambiente durante 4 horas, 1 litro de PBS a 4° durante la noche y 1 litro de PBS a temperatura ambiente durante 4 horas. Después de la diálisis, se dejo la oxidación continuar a 4°C. La oxidación se observó por análisis SEC-MOLS de alícuotas tomadas en tres puntos de tiempo T=0 horas T=24 horas y T=96 horas . Los valores de peso molecular se determinaron usando el método de LS-RI de dos detectores . El análisis de la zsig37 recombinante reducida preparada por diálisis, parece indicar inicialmente la formación de hexámeros y decaoctámeros como se detecta por SEC-MOLS que es más consistente con los estados oligoméricos observados en los homólogos. Estas formas fueron también activas en los ensayos i n vi t ro . Ejemplo 24 Enlace de la zsig37 a monocitos Se aislaron monocitos positivos CD14 de un producto de aféresis de sangre periférica congelado usando un método de selección positivo con perlas Miltenyi (Miltenyi Biotec Auburn, CA) . Las células purificadas fueron mayores que el 80% del CD14 positivo por medio de coloración FACS. Las células se volvieron a suspender a 1 x 106 células/ml en RPMl + 10% de suero de • bovino fetal (FBS) y se colocaron en platos de cultivo de tejido de 100 mm, 5 ml/placa. Se agrego interferón ? humano recombinante a 100 ng/ml y se incubaron las células a 5% de C02, 37°C durante 48 horas.

Se separaron las células de las placas por métodos no enzimáticos usando EDTA y raspado, concentradas por centrifugación, vueltas a suspender en una solución amortiguadora colorante FACS y formadas en alícuotas a 500,000 células/por tubo para coloración. Se obtuvieron células no activadas al llevar a cabo otra selección CD14 con el mismo producto de aféresis posterior a 48 horas en ? interferón. Las células se incubaron en concentraciones variables de zsig37 biotinilada seguida por estreptavidina PE. Todo el bloqueo con zsig37 "fría" se hizo sobre hielo durante 30 minutos. La proteína no enlazada se separó por lavado una vez en solución amortiguadora FACS. El enlace se cuantificó usando un instrumento calibrador FACS (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) y se expresó como una señal arriba del anticuerpo secundario solamente de control. Se verificó la activación de monocitos por aproximadamente un incremento 1 log en la expresión ICAM-1 en células tratadas con ? interferón . Se detectó el enlace a zsig37 en los monocitos activados y no activados con un incremento en el enlace de zsig37 observado en las células tratadas con ? interferon. El enlace se detectó abajo hasta 1.5 µg/ml, la concentración más baja probada. A 15 µg/ml, el enlace fue aproximadamente 4 veces incrementado en células activadas. Una reducción ligera (aproximadamente 10%) en el enlace se observa en las células activadas solamente cuando se pretratan con un exceso de 70 veces de zsig37 "fría". Los incrementos en el enlace de zsig37 en monocitos activados, sugiere la sobreregulación del enlace de monocitos de proteínas /receptores para zsig37 por citosinas inflamatorias. Esto podría resultar potencialmente en un involucramiento de la zsig37 en la fagocitosis de monocitos, exterminio microbiano y citotoxicidad celular. Después de dos días en cultivo, hay macrófagos presentes en el cultivo y la zsig37 puede enlazarse preferencialmente a este subconjunto de células. No hay buenos marcadores de macrófagos disponibles para determinar si esto sucede. La zsig37 también se enlaza a una línea de ratón de monocito/macrófago , RAW 264.7 (ATCC No. CRL-2278), indicando la especificidad del macrófago. De lo anterior, se apreciará que aunque se han descrito aquí modalidades específicas de la invención para propósitos de ilustración, se pueden hacer diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. De esta manera, la invención no se limita excepto que por las rei indicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

LISTADO DE SECUENCIA <110> ZymoGeneti cs . Inc . <120> INHIBIDORES PARA USARSE EN HEMOSTASIS Y FUNCIÓN INMUNE <130> 99-12 <160> 50 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 2769 <212> ADN <213> Homo sapien <220> <221> CDS <222> (171)... (1013) <400> 1 gaattcgaat tcctttgttt ccactgggac ggaatcggag ctctggaggc tgggctggcc 60 aagcgccccg aaggcccgat gcctgacggc tcatgcggcc tccttgtttg cagggcctgg 120 gcaaaaattt acactgagtc ccactcttcg ctccagggcc cggcaggaag atg ggc 176 Met Gly 1 tec cgt gga cag gga ctc ttg ctg gcg tac tgc ctg ctc ctt gcc ttt 224 Ser Arg Gly Gln Gly Leu Leu Leu Ala Tyr Cys Leu Leu Leu Ala Phe 5 10 15 gcc tet ggc ctg gtc ctg agt cgc gtg ccc cat gtc cag ggg gaa cag 272 Ala Ser Gly Leu Val Leu Ser Arg Val Pro His Val Gln Gly Glu Gln 20 25 30 cag gag tgg gag ggg act gag gag ctg ccg tec cct ccg gac cat gcc 320 Gln Glu Trp Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Ser Pro Pro Asp His Ala 35 40 45 50 gag agg gct gaa gaa caa cat gaa aaa tac agg ccc agt cag gac cag 368 Glu Arg Ala Glu Glu Gln His Glu Lys Tyr Arg Pro Ser Gln Asp Gln 55 60 65 ggg ctc cct gct tec cgg tgc ttg cgc tgc tgt gac cct ggt acc tec 416 Gly Leu Pro Ala Ser Arg Cys Leu Arg Cys Cys Asp Pro Gly Thr Ser 70 75 80 atg tac ccg gcg acc gcc gtg ccc cag ate aac ate act ate ttg 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tac ctg cae 800 Phe Ser Leu Asn Val His Thr Trp Asn Gln Lys Glu Thr Tyr Leu His 195 200 205 210 ate atg aag aac gag gag gag gtg gtg ate ttg ttc gcg cag gtg ggc 848 He Met Lys Asn Glu Glu Glu Val Val He Leu Phe Ala Gln Val Gly 215 220 225 gac cgc age ate atg caa age cag age ctg atg ctg gag ctg cga gag 896 Asp Arg Ser He Met Gln Ser Gln Ser Leu Met Leu Glu Leu Arg Glu 230 235 240 cag gac cag gtg tgg gta cgc ctc tac aag ggc gaa cgt gag aac gcc 944 Gln Asp Gln Val Trp Val Arg Leu Tyr Lys Gly Glu Arg Glu Asn Ala 245 250 255 ate ttc age gag gag ctg gac acc tac ate acc ttc agt ggc tac ctg 992 He Phe Ser Glu Glu Leu Asp Thr Tyr He Thr Phe Ser Gly Tyr Leu 260 265 270 gtc aag cae gcc acc gag ccc tagctggccg gccacctcct ttcctctcgc 1043 Val Lys His Ala Thr Glu Pro 275 280 caccttccac ccctgcgctg tgctgacccc agggctcagc accaggctga ccccaccgcc 1103 tcttccccga tccctggact ccgactccct ggctttggca ttcagtgaga cgccctgcac 1163 acacagaaag ccaaagcgat cggtgctccc agatcccgca gcctctggag agagctgacg 1223 gcagatgaaa tcaccagggc ggggcacccg cgagaaccct ctgggacctt ccgcggccct 1283 ctctgcacac ateetcaagt gaccccgcac ggcgagacgc gggtggcggc agggcgtccc 1343 agggtgcggc accgcggctc cagtccttgg aaataattag gcaaattcta aaggtctcaa 1403 aaggagcaaa gtaaaccgtg gaggacaaag aaaagggttg ttatttttgt ctttccagcc 1463 agcctgctgg ctcccaagag agaggccttt tcagttgaga ctctgcttaa gagaagatec 1523 aaagttaaag ctctggggtc aggggagggg ccgggggcag gaaactacct ctggcttaat 1583 tcttttaagc cacgtaggaa ctttcttgag ggataggtgg accctgacat ccctgtggcc 1643 ttgcccaagg gctctgctgg tctttctgag tcacagctgc gaggtgatgg gggctggggc 1703 cccaggcgtc agcctcccag agggacagct gagccccctg ccttggctcc aggttggtag 1763 aagcagccga agggctcctg acagtggcca gggacccctg ggtcccccag gcctgcagat 1823 gtttctatga ggggcagagc tcctggtaca tccatgtgtg gctctgctcc acccctgtgc 1883 caccccagag ccctgggggg tggtctccat gcctgccacc ctggcatcgg ctttctgtgc 1943 cgcctcccac acaaatcage cccagaaggc cccggggctt tggcttctgt tttttataaa 2003 acacctcaag cagcactgca gtctcccatc tcctcgtggg etaageatca ccgcttccac 2063 gtgtgttgtg ttggttggca gcaaggctga tccagacccc ttctgccccc actgccctca 2123 tccaggcctc tgaccagtag cctgagaggg gctttttcta ggcttcagag caggggagag 2183 ctggaagggg etagaaaget cccgcttgtc tgtttctcag gctcctgtga gcctcagtcc 2243 tgagaccaga gtcaagagga agtacacatc ccaatcaccc gtgtcaggat tcactctcag 2303 gagetgggtg gcaggagagg caatagcccc tgtggcaatt gcaggaccag ctggagcagg 2363 gttgcggtgt ctccgcggtg ctctcgccct gcccatggcc accccagact ctgatctcca 2423 ggaaccccat agcccctctc cacctcaccc catgttgatg cccagggtca ctcttgctac 2483 ccgctgggcc cccaaacccc cgctgcctct cttccttccc cccatccccc acctggtttt 2543 gactaatect gcttccctct ctgggcctgg ctgccgggat ctggggtccc taagtccctc 2603 tctttaaaga acttctgcgg gtcagactct gaagccgagt tgctgtgggc gtgcccggaa 2663 gcagagcgcc acactcgctg cttaagctcc cccagctctt tccagaaaac attaaactca 2723 gaattgtgtt ttcagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagggc ggccgc 2769 <210> 2 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 2 Met Gly Ser Arg Gly Gln Gly Leu Leu Leu Ala Tyr Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ser Gly Leu Val Leu Ser Arg Val Pro His Val Gln Gly 25 30 Glu Gln Gln Glu Trp Glu Gly Thr Glu Glu Leu Pro Ser Pro Pro Asp 40 45 His Ala Glu Arg Ala Glu Glu Gln His Glu Lys Tyr Arg Pro Ser Gln 50 55 60 Asp Gln Gly Leu Pro Ala Ser Arg Cys Leu Arg Cys Cys Asp Pro Gly 65 70 75 80 Thr Ser Met Tyr Pro Ala Thr Ala Val Pro Gln He Asn He Thr He 85 90 95 Leu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Leu Gln Gly Lys 100 105 110 Tyr Gly Lys Thr Gly Ser Ala Gly Ala Arg Gly His Thr Gly Pro Lys 115 120 125 Gly Gln Lys Gly Ser Met Gly Ala Pro Gly Glu Arg Cys Lys Ser His 130 135 140 Tyr Ala Ala Phe Ser Val Gly Arg Lys Lys Pro Met His Ser Asn His 145 150 155 160 Tyr Tyr Gln Thr Val He Phe Asp Thr Glu Phe Val Asn Leu Tyr Asp 165 170 175 His Phe Asn Met Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Tyr Val Pro Gly Leu 180 185 190 Tyr Phe Phe Ser Leu Asn Val His Thr Trp Asn Gln Lys Glu Thr Tyr 195 200 205 Leu His He Met Lys Asn Glu Glu Glu Val Val He Leu Phe Ala Gln 210 215 220 Val Gly Asp Arg Ser He Met Gln Ser Gln Ser Leu Met Leu Glu Leu 225 230 235 240 Arg Glu Gln Asp Gln Val Trp Val Arg Leu Tyr Lys Gly Glu Arg Glu 245 250 255 Asn Ala He Phe Ser Glu Glu Leu Asp Thr Tyr He Thr Phe Ser Gly 260 265 270 Tyr Leu Val Lys His Ala Thr Glu Pro 275 280 <210> 3 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 3 Met Leu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Phe Leu Leu He Leu Pro Ser His 1 5 10 15 Ala Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val 25 30 Pro Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly He Pro Gly 40 45 His Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr 50 55 60 Pro Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys 65 70 75 80 Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly 85 90 95 Phe Pro Gln Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala Ala Tyr 100 105 110 Met Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Arg Val Thr Val 115 120 125 Pro Asn Val Pro He Arg Phe Thr Lys He Phe Tyr Asn Gln Gln Asn 130 135 140 His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Asn He Pro Gly Leu 145 150 155 160 Tyr Tyr Phe Ser Tyr His He Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val 165 170 175 Ser Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Val Leu Phe Thr Tyr Asp Glp Tyr 180 185 190 Gln Glu Lys Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu 195 200 ' 205 Glu Val Gly Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Asp Gly Asp His 210 215 220 Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Val Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe 225 230 235 240 Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn 245 <210> 4 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleoti o ZC12447 <400> 4 atggggcacg cgactcagga ccaggccaga 0 <210> 5 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC695 <400> 5 gatttaggtg acactatag 9 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC694 <400> 6 taatacgact cactataggg 0 <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC13210 <400> 7 aagcaccggg aagcagggag 0 <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC13588 <400> 8 cgggcacgta gcagtagaac 0 <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC13532 <400> 9 gagagggctg aagaacaaca 0 <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleoti do ZC13641 <400> 10 aaggtggcga gaggaaagga 0 <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol i gonucleoti do ZC13586 <400> 11 tgttcaccgg caagttctac 0 <210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC13651 <400> 12 ctttgtcctc cacggtttac 0 <210> 13 <211> 20 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC13622 <400> 13 tttcctctcg ccaccttcca 0 <210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC13625 <400> 14 cttcggctgc ttctaaccaa c 1 <210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol i gonucleoti do ZC13650 <400> 15 gtaaaccgtg gaggacaaag 0 <210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleot.do ZC13859 <400> 16 gctgccaacc aacacaacca c 1 <210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC13624 <400> 17 gcaggattag tcaaaacc 8 <210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC13531 <400> 18 aacatggggt gaggtggaga 0 <210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonuc leotido ZC13587 <400> 19 tcctcgtggg ctaagcatca 0 <210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligopucleotido ZC13623 <400> 20 atctccagga accccatagc 0 <210> 21 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC14444 <400> 21 tctccaggaa ccccatag 18 <210> 22 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC14445 <400> 22 gcaggattag tcaaaacc 18 <210> 23 <211> 843 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Secuencia degenerada de nucleótidos que codi ican al polipéptido zsig37 <221> variación <222> (1)...(843) <223> Cada N es independientemente cualquier nucleótido. <400> 23 atgggnwsnm gnggncargg nytnytnytn gcntaytgyy tnytnytngc nttygcnwsn 60 ggnytngtny tnwsnmgngt nccncaygtn carggnaarc arcargartg ggarggnacn 120 gargarytnc cnwsnccncc ngaycaygcn garmgngcpg argarcarca ygaraartay 180 mgnccnwsnc argaycargg nytnccngcn wsnmgntgyy tnmgntgytg ygayccnggn 240 acnwsnatgt ayccngcnac ngcngtnccn carathaaya thacnathyt naarggngar 300 aarggngaym gnggngaymg nggnytncar ggnaartayg gnaaracngg nwsngcnggn 360 gcnmgnggnc ayacnggncc naarggncar aarggnwsna tgggngcncc nggngarmgn 420 tgyaarwsnc aytaygcngc nttywsngtn ggn gnaara arccnatgca ywsnaaycay 480 taytaycara cngtnathtt ygayacngar ttygtnaayy tntaygayca yttyaayatg 540 ttyacnggna arttytaytg ytaygtnccn ggnytntayt tyttywsnyt naaygtncay 600 acntggaayc araargarac ntayytncay athatgaara aygargarga rgtngtnath 660 ytnttygcnc argtnggnga ymgnwsnath atgcarwsnc arwsnytnat gytngarytn 720 mgngarcarg aycargtntg ggtnmgnytn tayaarggng argngaraa ygcnathtty 780 wsngargary tngayacnta yathacntty wsnggntayy tngtnaarca ygcnacngar 840 ccn 43 <210> 24 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC15040 <400> 24 actcattcta gactagggct cggt 24 <210> 25 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oliqonucleotido ZC15033 400> 25 atgaatggat ccctggtcct gagt 4 <210> 26 <211> 7 <212> PRT 213> Secuencia Artificial <220> <223> Péptido de etiqueta de afinidad Glu-Glu <400> 26 Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 27 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC15721 <400> 27 ctgtaggaat tcatgggctc ccgt 4 <210> 28 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC15035 <400> 28 attcatggat ccgggctcgg tggc 4 <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucl eotido ZC13006 <400> 29 ggctgtcctc taagcgtcac 0 <210> 30 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC13007 <400> 30 aggggtcaca gggatgcca 9 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido Gl u-Glu <400> 31 Gly Tyr Met Pro Val Asp 1 5 <210> 32 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC6768 <400> 32 gcaattaacc ctcactaaag ggaac d <210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC18297 <400> 33 tcctgaaagg cgagaaaggt g 1 <210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC18298 <400> 34 ttccctgagt ctgagctagg 0 <210> 35 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC18402 <400> 35 tccagagtga ctggggaagt g 1 <210> 36 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC18403 <400> 36 agtgacgagt tcgacaccta c 1 <210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC18456 <400> 37 tgtgttccca ttcctggaca c 21 <210> 38 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC18457 <400> 38 tccttccagc tggctggaaa g 21 <210> 39 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleoti do ZC18560 <400> 39 agaatgcagg gataggtcag 0 <210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> 01 igonucleoti o ZC18561 <400> 40 tcagaggatc ctgacagcag 0 <210> 41 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC18687 <400> 41 tggacacgtg agagggactt c 1 <210> 42 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oli onucleotido ZC18688 <400> 42 agcagtagaa cttcccagtg 0 <210> 43 <211> 2559 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (70)... (912) <223> ortólogo de ratón <400> 43 gaattcggat cctggaagag atgggattgt tataggcgga aagagagaaa cccagagaag 60 tccaggaag atg ggc tec tgt gca cag gga ttc atg ctg gga tgc tgc ctg 111 Met Gly Ser Cys Ala Gln Gly Phe Met Leu Gly Cys Cys Leu 1 5 10 ctg ctg gcc ate acc tgg ggc ccc ate ctg age ctt gtg cea cgc gtt 159 Leu Leu Ala He Thr Trp Gly Pro He Leu Ser Leu Val Pro Arg Val 15 20 25 30 cag gag gaa caa cag gag tgg gaa gag aca gag gag ctg cea tet cct 207 Gln Glu Glu Gln Gln Glu Trp Glu Glu Thr Glu Glu Leu Pro Ser Pro 35 40 45 ctg gat cct gtg aca agg cct gaa gaa aca cga gag aag tat age cct 255 Leu Asp Pro Val Thr Arg Pro Glu Glu Thr Arg Glu Lys Tyr Ser Pro 50 55 60 cgc cag ggt gag gac ctc ccc act tet cgg tgc tac cga tgc tgt gac 303 Arg Gln Gly Glu Asp Leu Pro Thr Ser Arg Cys Tyr Arg Cys Cys Asp 65 70 75 ccc age aca cct gta tac cag aca att cct cea ccc cag ate aac ate 351 Pro Ser Thr Pro Val Tyr Gln Thr He Pro Pro Pro Gln He Asn l e 80 85 90 acc ate ctg aaa ggc gag aaa ggt gac cga ggg gat cga ggc ctc cag 399 Thr He Leu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Leu Gln 95 100 105 110 ggg aag tac ggc aaa ata ggt tet aca ggt ccc agg ggc cat gtt ggc 447 Gly Lys Tyr Gly Lys He Gly Ser Thr Gly Pro Arg Gly His Val Gly 115 -120 125 ccc aaa ggg cag aag gga tec att gga gcc cct ggg aac cae tgc aag 495 Pro Lys Gly Gln Lys Gly Ser He Gly Ala Pro Gly Asn His Cys Lys 130 135 140 age cag tac gca gcc ttc tec gtg ggc cgg aag aag gct ttg cae age 543 Ser Gln Tyr Ala Ala Phe Ser Val Gly Arg Lys Lys Ala Leu His Ser 145 150 155 aac gac tac ttc cag ccc gtg gtc ttc gac acg gag ttt gtg aac ctc 591 Asn Asp Tyr Phe Gln Pro Val Val Phe Asp Thr Glu Phe Val Asn Leu 160 165 170 tac aaa cae ttc aat atg ttc act ggg aag ttc tac tgc tat gtg ccg 639 Tyr Lys H.s Phe Asn Met Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Tyr Val Pro 175 180 185 190 ggc ate tac ttc ttc age ctc aac gtg cae act tgg aac cag aag gag 687 Gly He Tyr Phe Phe Ser Leu Asn Val H.s Thr Trp Asn Gln Lys Giu 195 200 205 acg tac ctg cae ate atg aag aac gag gag gag gtg gtg ate ctg tat 735 Thr Tyr Leu H.s He Met Lys Asn Glu Glu Glu Val Val He Leu Tyr 210 215 220 gcg cag gtg age gac cgc age ate atg cag agt cag age ctg atg atg 783 Ala Gln Val Ser Asp Arg Ser He Met Gln Ser Gln Ser Leu Met Met 225 230 235 gag ctg cgg gag gag gat gag gtc tgg gtg cgt ctc ttc aag ggc gag 831 Glu Leu Arg Glu Glu Asp Glu Val Trp Val Arg Leu Phe Lys Gly Glu 240 245 250 cgt gag aac gcc att ttc agt gac gag ttc gac acc tac ate acc ttc 879 Arg Glu Asn Ala He Phe Ser Asp Glu Phe Asp Thr Tyr He Thr Phe 255 260 265 270 agt ggc tac ctg gtc aag cea gcc tet gag ccc tagtggacac tcctgtggag 932 Ser Gly Tyr Leu Val Lys Pro Ala Ser Glu Pro 275 280 cttttgtgga ctgctgacct ccttgcctgg caccctgacc tatccctgca ttctacagac 992 actggagtcc tgccccgggc tgaccccatt ttctctctgc tccatcctgg cttccttggc 1052 cttggcttcc aaagttttgg cttttgacaa gatgecettg gccactggga atcccaaagg 1112 atggtgcgat cccagatctg gctgctactc taageagaga gctgccggca gatgaaatca 1172 ttgggcgggg agcctgtgag gatattgggg ggectccagc tccttctgtg tacacagcct 1232 tagacgaccc tgtgctgtgt tgtcccgtgg ccacagggtg ttecagagea cagcccctgt 1292 gtgttcccat tcctggacac aagtaagcaa atatcatggg tttcttagga acgaagtcaa 1352 gcagaaaaga gaaagaaagg tggtgttagt tttggctttc cagccagctg gaaggaggga 1412 tggggagaga gagagagaga gagctatttg tattggggaa actgaggcat aggaaaaaca 1472 tgaatggcaa cagagtaget gcagtttgtg ggtttggaaa ccacatctga ettaacteta 1532 gatcacatat gagctttcct ggggacagea ggactgacct ccgagctctg ttgacatget 1592 atagccttgc ccaggggctg gtcaatcttt ctgagccaca ctagtaaaag ggttggagga 1652 gaacagcaag tgccccctgt ggttggctct gggctggtgg cagcatcctg cttgccccaa 1712 ctcacaggat cctgacagca gctgggaacc tcagggactc ctgcagcttt ctctgtaaga 1772 aataaagctc ctactatgtc ccagtacctc tctgctctgc tccacttccc cagtcactct 1832 ggaccccagg gtgggagggc tctcttgcct gttgggacat cagttcccct tcctccttct 1892 tggtgaatta accatggaag gaccagggct cggatttggg ttcccaaact gcccttcacc 1952 atecetagtg tcctgcttcc ttcccagttc agcatcctgt ctgggaactt gatactttaa 2012 cctgctagag cggatgagtc tgatagacct gcccagccct gacacagccc tagtcagctt 2072 atggacacgt gagagggact tcctttgaga cccagagctg gggtagagct ataaaaatct 2132 acctattccc gggtcaaccc caagtggtag aagaggacac aggctatccc gccctagctc 2192 agactcaggg aaggcctcag gcctgattgt ctgactgcag agagcctgtg ttctttcccc 2252 atctcacccc gtgttgatcc ccagggcctg ggccactgga tatctgcttt gtgecaacta 2312 ggccttgctt gctgcttcct ggtggccctt ggttaggatc cctctctttt ccttctggag 2372 ctcaatgtac gtatatgeca cctccgaagg ggcttctgct ggtcagactc tccaagccac 2432 ttccatgggt gtgcctacag cagaggctgc tgcctcctgt gctctaccct gctctttcca 2492 gaaaacatta aacttgccat ggcgattcac agcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagg 2552 gcggccg 2559 <210> 44 <211> 281 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Met Gly Ser Cys Ala Gln Gly Phe Met Leu Gly Cys Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ala He Thr Trp Gly Pro He Leu Ser Leu Val Pro Arg Val Gln Glu 25 30 Glu Gln Gln Glu Trp Glu Glu Thr Glu Glu Leu Pro Ser Pro Leu Asp 40 45 Pro Val Thr Arg Pro Glu Glu Thr Arg Glu Lys Tyr Ser Pro Arg Gln 50 55 60 Gly Glu Asp Leu Pro Thr Ser Arg Cys Tyr Arg Cys Cys Asp Pro Ser 65 70 75 80 Thr Pro Val Tyr Gln Thr lie Pro Pro Pro Gln lie Asn He Thr He 85 90 95 Leu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Arg Gly Asp Arg Gly Leu Gln Gly Lys 100 105 110 Tyr Gly Lys He Gly Ser Thr Gly Pro Arg Gly His Val Gly Prc Lys 115 120 125 Gly Gln Lys Gly Ser He Gly Ala Pro Gly Asn His Cys Lys Ser Gln 130 135 140 Tyr Ala Ala Phe Ser Val Gly Arg Lys Lys Ala Leu His Ser Asn ASP 145 150 155 160 Tyr Phe Gln Pro Val Val Phe Asp Thr Glu Phe Val Asn Leu Tyr Lys 165 170 175 His Phe Asn Met Phe Thr Gly Lys Phe Tyr Cys Tyr Val Pro Gly He 180 185 190 Tyr Phe Phe Ser Leu Asn Val His ~hr Trp Asp Gln Lys Glu Thr Tyr 195 200 205 Leu His He Met Lys Asn Glu Glu Glu Val Val He Leu Tyr Ala Gln 210 215 220 Val Ser Asp Arg Ser He Met Glp Ser Gln Ser Leu Met Met Glu Leu 225 23C 235 240 Arg Glu Glu Asp Glu Val Trp Val Arg Leu Phe Lys Gly Glu Arg Glu 245 250 255 Asn Ala He Phe Ser Asp Glu Phe Asp Tnr Tyr He Thr Phe Ser Gly 260 265 270 Tyr Leu Val Lys Pro Ala Ser Glu Pro 275 280 <210> 45 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC23.698 <400> 45 gaattcgaat tcctttgttt cea 23 <210> 46 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igonucleotido ZC23.694 <400> 46 taatacgact cactataggg aggaggtacc agggtcacag cag 43 <210> 47 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Ol igopucleotido ZC23.703 <400> 47 tctacgacca cttcaacatg 20 <210> 48 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC23.697 <400> 48 gtaattgttt attgtccaga tg l ?c2' <210> 49 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220>_ <223> Oligonucleotido 2C24.441 <400> 49 atgcattaac cctcactaaa ggggagaggg ctgaagaaca aca 3 <210> 50 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Oligonucleotido ZC24.442 <400> 50 taatacgact cactataggg aggggcggcg tagtggctct t 1

Claims

Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un método para promover el flujo de sangre dentro de la vasculatura de un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, en un vehículo farmacéuticamente aceptable por lo cual la proteína relacionada con el complemento de adipocitos reduce la actividad trombogénica y del complemento dentro de la vasculatura .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína relacionada con el complemento de adipocitos comprende un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica con la secuencia de aminoácido a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO : 2 , en donde la secuencia comprende: Repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro formando un dominio de colágeno en donde Xaa es cualquier aminoácido, y una porción globular de terminal carboxi.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 90% idéntica con la secuencia de aminoácido a los residuos 22-281 de la SEQ ID NO : 2.
4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 90% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO: 2.
5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque cualesquiera diferencias entre el polipéptido y la SEQ ' ID N0:2 se deben a substituciones conservadoras de aminoácidos.
6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dominio de colágeno consiste de 13 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y una repetición Gly-Xaa-Pro.
7. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el dominio globular consiste de 10 láminas beta.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las láminas beta se asocian con residuos de aminoácidos correspondientes a 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, y 269-274 de la SEQ ID N0:2.
9. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 1-281 de la SEQ ID N0:2 o residuos 1-281 de la SEQ ID NO:44.
10. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido forma un complejo con un segundo polipéptido para formar un oligómero.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque los polipéptidos forman complejos por enlaces bisulfuro intermoleculares.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el oligómero es un trímero.
13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el oligómero es un hexámero.
14. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el multímero es un decaoctámero (18mero) .
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido reduce la actividad trombogénica y del complemento por la inhibición de la trayectoria del complemento y la inhibición de la adhesión, activación o agregación de plaquetas mediada por colágeno.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido se administra antes de, durante o después de una lesión vascular aguda en el mamífero.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la lesión se debe a la reconstrucción vascular.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la reconstrucción vascular comprende angioplastia, injerto de conexión directa de la arteria coronaria, endarterectomia , reparación microvascular o anastomosis de un injerto vascular.
19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la lesión se debe a trauma, apoplejía o aneurisma.
20. Un método para calmar tejidos dañados de colágeno dentro de un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos con lo cual la proteína hace inerte al tejido dañado de colágeno hacia la activación del complemento, actividad trombótica o activación inmune.
21 El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la proteína relacionada con el complemento de adipocitos comprende un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO:2, en donde la secuencia comprende: Repeticiones Gly-Xaa-Xaa y Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno en donde Xaa es cualquier aminoácido y una porción globular de terminal carboxi.
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es al menos 90% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 22-281 de la SEQ ID NO:2.
23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 90% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO: 2.
24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque cualesquiera diferencias entre el polipéptido y la SEQ ID NO: 2 se deben a substituciones conservadoras de aminoácido.
25. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el dominio de colágeno consiste de 13 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y una repetición Gly-Xaa-Pro.
26. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el dominio globular consiste de 10 láminas beta.
27. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las láminas beta se asocian con residuos de aminoácido correspondientes a 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, y 269-274 de la SEQ ID NO:2.
28. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 1-281 de la SEQ ID NO:2 o residuos de 1-281 de la SEQ ID NO:44.
29. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el polipéptido forma un complejo con el segundo polipéptido para formar un oligómero.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque los polipéptidos forman complejos por enlaces intermoleculares de bisulfuro.
31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el oligómero es un trímero.
32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el oligómero es un hexámero.
33. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el multímero es un decaoctámero (ldmero) .
34. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los tejidos dañados de colágeno se deben a lesiones asociadas con isquemia y reperfusión.
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la lesión comprende isquemia de lesión de trauma, estrangulación intestinal o lesión asociada con el pre y post establecimiento de flujo sanguíneo.
36. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido se administra a un mamífero que padece de una isquemia cardiopulmonar de conexión directa y recesión, infarto al miocardio o vasoespasmo post-traumát ico .
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el vasoespasmo post-traumát ico comprende apoplejía, angioplastia percutánea transluminal, endarterectomía , trauma accidental vascular o trauma vascular inducido quirúrgico.
38. Un método para la pacificación de la superficie de un biomaterial protésico para su uso en asociación con un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína relacionada con el complemento de los adipocitos con lo cual el polipéptido hace inerte la superficie del biomaterial protésico hacia la activación del complemento, actividad trombótica o activación inmune.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la proteína relacionada con el complemento de adipocitos comprende un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO:2 en donde la secuencia comprende: Repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno en donde Xaa es cualquier aminoácido, una porción globular de terminal carboxi.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 90% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 22-281 de la SEQ ID NO:2.
41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 90% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO. : 2.
42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque cualquier diferencia entre el polipéptido y la SEQ ID NO.:2 se deben a las sustituciones conservadoras de aminoácido .
43. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el dominio de colágeno consiste de 13 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 1 repetición Gly-Xaa-Pro.
44. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el dominio globular consiste de diez láminas beta.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque las láminas beta se asocian con el aminoácido correspondiente a los residuos 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, y 269-274 de la SEQ ID NO . : 2.
46. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 1-281 de la SEQ ID NO.:2 ó los residuos 1-281 de la SEQ ID NO.:44.
47. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el polipéptido está en un complejo con un segundo polipéptido para formar un oligómero.
48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque los polipéptidos están en complejo por enlaces de bisulfuro intramoleculares.
49. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el oligómero es un trímero.
50. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el oligómero es un hexámero.
51. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el multímero es un decaoctámero (18mero) .
52. El método para pacificar la superficie de un biomaterial protésico de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la superficie del biomaterial prostático se recubre con colágeno o fragmentos de colágeno, gelatina, fibrina o fibronectina.
53. Un método para mediar la reparación de una herida dentro de un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos; en donde el polipéptido aumenta el progreso para la cicatrización de la herida.
54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la proteína relacionada con el complemento de adipocitos comprende un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 75% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuo 26-281 de la SEQ ID NO.:2, en donde la secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa ó Gly-Xaa-Pro que forman un dominio colágeno, en donde Xaa es cualquier aminoácido, y una porción globular carboxi-t erminal .
55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácido que es al menos 90% idéntica "en la secuencia de aminoácido a los residuo 22-281 de la SEQ ID NO. : 2.
56. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácido que es al menos 90% idéntica en la secuencia de aminoácido a los residuos 26-281 de la SEQ ID NO. : 2.
57. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque cualquier diferencia entre el polipéptido y la SEQ ID NO.:2 se debe a las sustituciones conservadoras de aminoácido .
58. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el dominio de colágeno consiste de 13 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 1 repetición Gly-Xaa-Pro.
59. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el dominio globular consiste de diez láminas beta.
60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque las láminas beta se asocian con los aminoácidos correspondientes a los residuos 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, y 269-274 de la SEQ ID NO.:2.
61. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el polipéptido comprende los residuos 1-281 de la SEQ ID NO.:2 ó los residuos 1-281 de la SEQ ID NO.:44.
62. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el polipéptido está en complejo con un segundo polipéptido para formar un oligómero.
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque los polipéptidos están en complejo por enlaces bisulfuro intermoleculares.
64. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el oligómero es un trímero.
65. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el oligómero es un hexámero.
66. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el multímero es un decaoctámero (18mero) .