JP4202128B2 - Ｗｉｓｐポリペプチドを用いる治療方法 - Google Patents

Ｗｉｓｐポリペプチドを用いる治療方法 Download PDF

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Description

【０００１】
（関連出願）
この出願は、出典明示によりその内容がここに取り込まれる２０００年１０月１６日に出願された仮出願番号第６０／２４１２２２号に基づく第１１９条（ｅ）項の優先権を主張する非仮出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、変性軟骨性疾患及び様々な免疫関連症状の治療においてＷＩＳＰポリペプチドを使用する方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）は、ＴＧＦ-βを含む多くの因子によって線維芽細胞において誘導される成長因子であり、形質転換された細胞の性質である付着依存性成長（ＡＩＧ）を誘導するＴＧＦ-βの能力に対して必須である。ＣＴＧＦは培養された内皮細胞の成長培地中に存在する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）二量体のタイプを同定する試みにおいて発見されたもので、ＰＤＧＦに免疫学的かつ生物学的に関連している。米国特許第５４０８０４０号を参照のこと。ＣＴＧＦはまた細胞に対して分裂促進的で化学走性であり、よってこのファミリーの成長因子は、ヒト組織の正常な発達、成長及び修復に所定の役割を担っているものと考えられている。
Ｃｙｒ６１のニワトリオルソログ、ＣＥＦ１０、ヒト、マウス、及びアフリカツメガエルＣＴＧＦ、及びヒト、ニワトリ、及びアフリカツメガエルＮｏｖを含む、ＣＴＧＦに関連した幾つかのタンパク質が単離され、クローニングされ、配列決定され、ＣＣＮ遺伝子ファミリーに属するものと特徴付けられている。Oemar及びLuescher, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17: 1483-1489 (1997)。Ｃｙｒ６１をコードしている遺伝子は血管形成、腫瘍成長及び血管新生を促進することが見出された。Babic等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6355-6360 (1998)。ｎｏｖ遺伝子は腎臓において本質的に胚形成期に発現され、正常な腎臓に対して、ｎｏｖ発現の変化が鳥類腎芽細胞腫とヒトウイルム腫瘍の双方で検出されている。Martinerie等, Oncogene, 9: 2729-2732 (1994)。Ｗｔ１はヒトｎｏｖ発現をダウンレギュレートし、このダウンレギュレーションが正常な及び腫瘍の腎形成におけるキーとなる要素を表しているかもしれない。Martinerie等, Oncogene, 12: 1479-1492 (1996)。そのＮ末端に保存配列とＩＧＦＢＰモチーフを含み、低親和性をもってＩＧＦｓに結合する分泌タンパク質をコードするＣＴＧＦ、ｎｏｖ及びｃｙｒ６１遺伝子が、低親和性ｍａｃ２５／ＩＧＦＢＰ-７（Yamanaka等, J. Biol. Chem., 272: 30729-30734 (1997)）及び高親和性ＩＧＦＢＰｓ１−６と共に、ＩＧＦＢＰスーパーファミリーのより多くのメンバーを表すと最近提案されている。この提案のＣＴＧＦはＩＧＦＢＰ-８と命名されている。Kim等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12981-12986 (1997)。
【０００４】
ＣＣＮファミリーの異なったメンバーは様々な可溶性又はマトリクス随伴巨大分子、特に硫酸化された複合糖質と相互作用する（Holt等, J. Biol. Chem., 265:2852-2855 (1990)）。この相互作用はヘパリン-アガロースでのアフィニティクロマトグラフィーによりＣｙｒ６１及びＣＴＧＦを精製するために使用された（Frazier等, J. Invest. Dermatol., 107:404-411 (1996); Kireeva等, Mol. Cell. Biol., 16:1326-1334 (1996)）。Ｃｙｒ６１は分泌されそのヘパリン硫酸に対する親和性のために細胞外マトリックスと細胞表面の双方に伴う（Yang等, Cell. Growth Diff., 2:351-357 (1991))。
最近、低転移性細胞に発現されるＥＬＭ１と命名されたタンパク質がマウスに見出された。Hashimoto等, J. Exp. Med., 187: 289-296 (1998)。以下に開示するＷＩＳＰ-１のマウス相同体であるｅｌｍ１遺伝子は、ＣＴＧＦの他のメンバー、Ｃｙｒ６１／Ｃｅｆ１０及び神経芽細胞腫過剰発現遺伝子ファミリーであり、インビボでのＫ-１７３５マウスメラノーマ細胞の腫瘍成長と転移を抑制する。以下に記載するＷＩＳＰ-２のラットのオルソログであるｒＣｏｐ-１に関する他の最近の文献は、細胞形質転換後のこの遺伝子の発現の消失を記載している。Zhang等, Mol. Cell. Biol., 18:6131-6141 (1998)。
【０００５】
（ｎｏｖを除く）ＣＣＮファミリーメンバーは、細胞増殖、分化、胚形成、及び創傷治癒を調節すると考えられている最初期成長応答性遺伝子である。CCN遺伝子ファミリーのメンバー間の配列相同性は若干高い；しかし、これらのタンパク質のインビトロでの機能は成長刺激（つまり、ヒトＣＴＧＦ）から成長阻害（つまり、ニワトリＮｏｖとおそらくｈＣＴＧＦも）までの範囲にわたる。更に、ＣＴＧＦに対するある種の分子ホモログは、線維形成の防止、ある種の癌に伴う高度に細胞性の過剰な結合組織ストローマ、及び例えば強皮症、ケロイド、好酸球性筋膜炎、結節性筋膜炎、及びデュピュイトラン痙縮のような様々な皮膚疾患を伴う線維性病巣の形成に有用であることが示されている。更に、ＣＴＧＦ発現は乳腺腫瘍の線維ストローマにおいて最近実証されており、癌ストローマの形成が創傷治癒のように類似の線維増殖性成長因子の誘導を含むことを示唆している。ヒトＣＨＧＦはまた進行したアテローム硬化型病巣において非常に高いレベルで発現されるが、正常な動脈では発現されず、アテローム性動脈硬化症においてある役割を果たしている可能性を示唆している。上掲のOemar及びLuescher。
【０００６】
Ｗｎｔは、そのメンバーが回虫、昆虫、軟骨魚、及び脊椎動物で見出されている大きな遺伝子ファミリーによってコードされる。Holland等, Dev. Suppl., 125-133 (1994)。Ｗｎｔは、多くの広範な種が複数の保存Ｗｎｔ遺伝子を有しているので、様々な発生及び生理学的過程において機能するものと考えられる。McMahon, Trends Genet., 8: 236-242 (1992); Nusse及びVarmus, Cell, 69: 1073-1087 (1992)。Ｗｎｔ遺伝子は幾つかの原始細胞型において活性な傍分泌又は自己分泌シグナルとして機能すると考えられる分泌糖タンパク質をコードしている。上掲のMcMahon (1992); 上掲のNusse及びVarmus (1992)。Ｗｎｔ成長因子ファミリーは、ｃＤＮＡクローニングによって、マウスにおいて同定された１０を越える遺伝子（Ｗｎｔ-１、-２、-３Ａ、-３Ｂ、-４、-５Ａ、-５Ｂ、-６、-７Ａ、-７Ｂ、-８Ａ、-８Ｂ、-１０Ｂ、-１１、-１２、及び-１３）（例えば、Gavin等, Genes Dev., 4: 2319-2332 (1990); Lee等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2268-2272 (1995); Christiansen等, Mech. Dev., 51: 341-350 (1995)を参照）及びヒトにおいて同定された少なくとも９つの遺伝子（Ｗｎｔ-１、-２、-３、-５Ａ、-７Ａ、-７Ｂ、-８Ｂ、-１０Ｂ、-１１）を含む。例えば、Vant Veer等, Mol. Cell. Biol., 4:2532-2534 (1984)を参照のこと。
【０００７】
Ｗｎｔ-１プロト癌遺伝子（ｉｎｔ-１）は、ウイルスＤＮＡ配列の挿入のためにマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）によって誘導される乳腺腫瘍から元々は同定された。Nusse及びVarmus, Cell 31: 99-109(1982)。成体マウスにおいて、Ｗｎｔ-１ｍＲＮＡの発現レベルは精子発生の後期段階において精巣にのみ検出される。Ｗｎｔ-１タンパク質は約４２ＫＤａであり、分泌のためのシグナル配列として機能しうるアミノ末端疎水性領域を含んでいる（上掲のNusse及びVarmus, 1992）。Ｗｎｔ-２／ｉｒｐの発現はマウス胎仔及び成体組織中で検出され、その分布はＷｎｔ-１の発現パターンとオーバーラップしない。Ｗｎｔ-３はマウス乳腺腫瘍形成に関連している。マウス胚でのＷｎｔ-３の発現は神経管と肢芽において検出されている。Ｗｎｔ-５ａ転写物は、９．５から１４．５日齢の発達中の前肢及び後肢において検出されており、最も高いレベルは肢の遠位端の外胚葉性頂に濃縮している。上掲のNusse及びVarmus (1992)。最近、Ｗｎｔ-ｘと呼ばれるＷｎｔ成長因子が、骨組織及び骨由来細胞でのＷｎｔ-ｘの発現の検出と共に記載されている（ＷＯ９５／１７４１６）。また記載されていることは、成熟骨芽細胞の維持におけるＷｎｔ-ｘの役割と、治療薬として又は骨関連疾病を治療するための他の治療薬の開発においてＷｎｔ-ｘ成長因子を使用することである。
【０００８】
Ｗｎｔは局所の細胞シグナル伝達に役割を担っている可能性がある。生化学的研究により、分泌されたＷｎｔタンパク質の多くが、培地に自由に拡散するよりむしろ細胞表面又は細胞外マトリックスに付随して見出されうることが示された。Papkoff及びSchryver, Mol. Cell. Biol., 10: 2723-2730 (1990)；Bradley及びBrown, EMBO J., 9: 1569-1575 (1990)。
Ｗｎｔ遺伝子における突然変異の研究は、成長調節及び組織パターニングにおけるＷｎｔの役割を示した。ショウジョウバエにおいて、無羽（ｗｇ）はＷｎｔ関連遺伝子をコードし（Rijsewik等, Cell, 50: 649-657 (1987)）、及びｗｇ変異は胚外胚葉、神経形成、及び成虫原基成長のパターンを変えた。Morata及びLawerence, Dev. Biol., 56: 227-240 (1977); Baker, Dev. Biol., 125: 96-108 (1988); Klingensmith及びNusse, Dev. Biol., 166: 396-414 (1994)。線虫においては、ｌｉｎ-４４が非対称的細胞分裂に必要なＷｎｔ相同体をコードする。Herman及びHorvitz, Development, 120: 1035-1047 (1994)。マウスにおけるノックアウト突然変異は、Ｗｎｔが脳の発達（McMahon及びBradley, Cell, 62: 1073-1085 (1990); Thomas及びCappechi, Nature, 346: 847-850 (1990)）、及び腎臓（Stark等, Nature, 372: 679-683 (1994)）、尾芽（Takada等, Genes Dev., 8: 174-189 (1994)）、及び肢芽についての胚原基の成長に必須であることを示した。Parr及びMcMahon, Nature, 374: 350-353 (1995)。乳腺におけるＷｎｔの過剰発現は、乳腺過形成（上掲のMcMahon (1992); 上掲のNusse及びVarmus (1992)）、及び早熟性肺胞発達をもたらす。Bradbury等, Dev. Biol., 170: 553-563 (1995)。
【０００９】
Ｗｎｔ-５ａ及びＷｎｔ-５ｂは７−８日齢のマウス胚の後及び側部中胚葉及び胚外中胚葉において発現される。上掲のGavin等, (1990)。これらの胚性ドメインは多能の造血前駆体及びＨＳＣが誘導されるＡＧＭ領域及び卵黄嚢組織に寄与する。Dzierzak及びMedvinsky, Trends Genet., 11: 359-366 (1995); Zon等, Gluckman及びCoulombel編, Colloque, INSERM, 235: 17-22 (1995)、１９９５年４月３−６日にフランス、パリにてのJoint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failureで紹介；Kanatsu及びNishikawa, Development, 122: 823-830 (1996)。Ｗｎｔ-５ａ、Ｗｎｔ-１０ｂ、及び他のＷｎｔは肢芽において検出され、Ｗｎｔ-７ｂに対して示されたように初期の骨の微環境の発達と様式における可能な役割を示している。上掲のGavin等(1990)；Christiansen等, Devel., 51: 341-350 (1995);上掲のParr及びMcMahon (1995)。
Ｗｎｔ／Ｗｇシグナル伝達経路は、生物体の生物学的発達において重要な役割を果たし、幾つかのヒト癌に関連している。またこの経路は腫瘍抑制遺伝子ＡＰＣも含んでいる。ＡＰＣ遺伝子における突然変異は、ヒト結腸直腸癌の散発性及び遺伝形態の発達と関連している。Ｗｎｔ／Ｗｇシグナルは細胞中でのβ-カテニン／アルマジロの蓄積を導き、βカテニン及びリンパエンハンサー結合因子／Ｔ細胞因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）ＨＭＧｂｏｘ転写因子ファミリーのメンバーからなる二連転写複合体の形成がなされる。この複合体は核に転位し、そこでショウジョウバエの波形縁のウルトラバイソラックス(Ultrabithorax)遺伝子のような、Ｗｎｔ／Ｗｇシグナルの下流の遺伝子の発現を活性化できる。
Ｗｎｔに関するレビューには、Cadigan及びNusse, Genes & Dev., 11: 3286-3305 (1997)を参照のこと。
【００１０】
Pennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)は、Ｗｎｔ-１によって形質転換されたマウス乳腺上皮細胞株Ｃ５７ＭＧにおいてアップレギュレートされる二つの遺伝子ＷＩＳＰ-１及びＷＩＳＰ-２、及び第３の関連する遺伝子ＷＩＳＰ-３のクローニングと特徴付けを記載している。Pennica等は、これらのＷＩＳＰ遺伝子がＷｎｔ-１シグナル伝達の下流にあり、大腸癌でのＷＩＳＰ発現の異常なレベルが大腸腫瘍形成においてある役割を担っている可能性があると報告している。ＷＩＳＰ-１は最近β-カテニン調節遺伝子として同定されており、その発癌性活性の特徴付けは、ＷＩＳＰ-１がβ-カテニン媒介腫瘍形成に寄与しているかもしれないことを実証した（Xu等, Gene & Develop., 14:585-595 (2000)）。正常なラット腎臓細胞（ＮＲＫ-４９Ｆ）中でのＷＩＳＰ-１過剰発現は形態変換、加速された細胞成長及び亢進された飽和密度を誘導した。また、これらの細胞はヌードマウスに注入されると直ぐに腫瘍を形成し、ＷＩＳＰ-１が腫瘍形成にある種の役割を担っている可能性があることを示唆している（上掲のXu等, 2000）。
Hurvitz等, Nature Genetics, 23:94-97 (1999)は、無関係の個人におけるＷＩＳＰ３の９つの異なった変異が常染色体性劣性骨格疾患である進行性疑性リウマチ様異形成症（ＰＰＤ）を伴うことが見出された。ヒト滑膜細胞、関節軟骨細胞、及び骨髄由来間葉前駆細胞においてＲＴ-ＰＣＲによるＷＩＳＰ３の発現がHurvitz等によって観察された。
【００１１】
１９９８年５月２２日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９８／２１２３６は、成長因子スーパーファミリーの２６ｋＤメンバーをコードしているヒト結合組織成長因子遺伝子-３（ＣＴＧＦ-３）を開示している。ＷＯ９８／２１２３６は、ＣＴＧＦ-３アミノ酸配列はヒト骨芽細胞ｃＤＮＡクローンから推定され、ＣＴＧＦ-３が卵巣、精巣、心臓、肺、骨格筋、副腎髄質、副腎皮質、胸腺、前立腺、小腸及び大腸のような複数の組織で発現されたことを開示している。
幾人かの研究者は腫瘍におけるプロテオグリカン組成の変化を文献化している。特に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの顕著な生産は様々な悪性腫瘍におけるよく認識された現象である。また、プロテオグリカンを含むデルマタン硫酸であるデコリンの発現は、ヒト癌腫の悪性とよく相関していることが示された（Adany等, J. Biol. Chem., 265:11389-11396 (1990); Hunzlemann等, J. Invest. Dermatol., 104:509-513 (1995)）。最近、デコリンが幾つかの癌腫の成長を抑制することが実証された（Santra 1997）。腫瘍形成性発達におけるデコリンの機能は十分には理解されていないが、腫瘍周囲ストローマ中でのデコリンの発現が侵入新生細胞への宿主結合組織細胞の局所的応答を反映させていると提案された（Stander等, Gene Therapy, 5:1187-1194 (1999)）。
【００１２】
結合組織成長因子／システインリッチ６１／腎性芽細胞腫過剰発現（ＣＮＮ）ファミリーの様々なメンバー及びその各性質と活性の最近のレビューのためには、Brigstock, Endocrine Reviews, 20:189-206 (1999)を参照のこと。
変性軟骨疾患は、広義には、患部の痛み、硬化又は運動能力減退により認識される結合組織の変性又は代謝系の異常により特徴づけられる疾患の群を表す。これらの疾患の原因は、例えば病理的であるか又は外傷や怪我によるものであり得る。
骨関節炎（ＯＡ）は、骨関節症又は変形性関節疾患としても知られ、典型的には関節構造に影響する局所的な変性過程の繰り返しによるものであり、痛みや機能の減退を生じる。ＯＡはしばしば関節の破壊を加速しうる局所的な炎症因子を伴う。ＯＡは、プロテオグリカン（ＰＧ）及びコラーゲンの早期喪失を伴った、軟骨の滑らかな関節表面の破壊に、裂け目の形成とフィブリル化が続き、最後には軟骨の全層喪失により特徴づけられる。ＯＡの症状は、罹患した関節の、特に使用後の局部的な痛みを伴う。病気の進行に従って、症状は、持続的な痛みの感覚、局所的な不快、及び罹患した関節の奇形等の美容的な変化へと進行しうる。
【００１３】
ＯＡの局部的な性質に対して、リウマチ様関節炎（ＲＡ）は滑膜、関節の間隙周辺の組織に発症するような全身性炎症疾患である。ＲＡは、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる慢性自己免疫疾患であり、典型的には、小及び大可動関節に影響を及ぼし、進行性の破壊を引き起こす。疾病が進行すると、ＲＡの症状は、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節の形成、さらに早期死亡を含む。ＲＡ及びＯＡの原因又は起源は明らかに異なるが、軟骨破壊に関連するサイトカイン及び酵素は同様のようである。
ペプチド成長因子は、軟骨成長及び軟骨細胞挙動（即ち、分化、移動、分裂、及びマトリクス合成又は分解）の重要な制御因子であると考えられている。F.S.Chen等、Am J. Orthop. 26:396-406 (1997)。軟骨修復を刺激することが既に提唱されていた成長因子には、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１）、Osborn, J. Orthop. Res. 7:35-42 (1989)；Florini & Roberts, J. Gerontol. 35:23-30 (1980)；塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Toolan等、J. Biomec. Mat. Res. 41:244-50 (1998)；Sah等、Arch. Biochem. Biophys. 308:137-47 (1994)；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、Sato & Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87 (1984)；Chin等、Arthritis Rheum. 34:314-24 (1991)及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、Hill & Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4:45-68 (1992)；Guerne等、J. Cell Physiol. 158:476-84 (1994)；Van der Kraan等、Ann. Rheum. Dis. 51:643-47 (1992)が含まれる。
【００１４】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１）は、培養におけるマトリックス合成と細胞増殖の両方を促進し、K. Osborn. J. Orthop. Res. 7: 35-42(1989)、ＩＧＦ-１の不適切な部分は骨関節炎の進行の病因的役割を有しうることである。R.D. Coutts,等, Instructional Course Lect. 47: 487-94, Amer. Acad. Orthop. Surg. Rosemont, IL(1997)。変形関節炎の患者の血清のＩＧＦ-１濃度がコントロールグループよりも低いことが示唆された研究もあるが、他に違いの見られなかった研究もある。にもかかわらず、血清のＩＧＦ-１レベルとＩＧＦ-１に対する軟骨細胞の反応性はともに、年齢に従い減少する。J. R. Florini & S.B. Roberts, J. Gerontrol. 35:23-30(1980)。従って、ＩＧＦ-１の低下した利用性並びにＩＧＦ-１に対する減少した軟骨細胞反応性は、軟骨の恒常性を助長し、年齢の上昇と共に退化させうる。
ＩＧＦ-１は、変形関節炎の抑制治療に提案されている。実際に、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（軟骨細胞分解活性阻害剤）と組み合わせたＩＧＦ-１の関節内投与は、組織学的状態の改善をもたらし、分解酵素（中性メタロプロテイナーゼ及びコラゲナーゼ）を正常レベルに近づけ、メタロプロテイナーゼ及びマトリックスコラーゲンの組織阻害剤となる。R.A. Rogachefsky, 等, Ann. NY Acad. Sci. 732: 889-95(1994)。単独で又は軟骨再生を促進する他の成長因子をアジュバンドとしたＩＧＦ-１の使用は、ＷＯ９１／１９５１０、ＷＯ９２／１３５６５、ＵＳ５４４４０４７、及びＥＰ４３４６５２に記載されている。
【００１５】
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、成長因子の大きな形質転換成長因子β（ＴＧＦ-β）ファミリーのメンバーである。インビトロ及びインビボの研究において、ＢＭＰが間葉細胞の軟骨細胞への分化を促進することが示されている。K. Sato & M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87 (1984)。さらに骨格成長因子及び軟骨誘導成長因子はＢＭＰと相乗効果があり、これらの成長因子とＢＭＰ及び成長ホルモンの組み合わせは間葉細胞の分化を開始させる。分化した細胞の後の増殖は他の因子により促進される。D.J. Hill & A Logan, Prog. Growth fac. Res. 4: 45-68(1992)。
形質転換成長因子β（ＴＧＦ-β）は、骨芽細胞、軟骨細胞、血小板、活性化リンパ球、及び他の細胞により産生される。R.D. Coutts等, 上掲。ＴＧＦ-βは、標的細胞、用量及び細胞培養条件によって、マトリックス合成及び細胞増殖の促進及び抑制の両方の特性を有す。P. Guerne等, J. Cell Physiol. 158:476-84(1994); H. Van Beuningen等, Ann. Rheum. Dis. 52: 185-91(1993); P. Van der Kraan等, Ann. Rheum. Dis. 51:643-47(1992)。さらに、ＩＧＦ-１と同様に、ＴＧＦ-βの反応性は年齢と共に減少する。P.Guerne等, J. Cell Physiol. 158: 476-84(1994)。しかしながら、ＴＧＦ-βは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ-１を含む他の成長因子よりも軟骨細胞増殖をより効果的に促進し（Guerne等, 上掲）、軟骨細胞によるプロテオグリカン産生を促進する。ＴＧＦ-βはまた、軟骨細胞の異化作用を促進するサイトカインの影響を抑制調節するVan der Kraan等, 上掲。インビボで、ＴＧＦ-βは、間葉細胞の軟骨細胞への分化と増殖を誘発し、ウサギの関節軟骨で部分的肥厚の欠陥の修復を促進する。E.B. Hunziker & L.Rosenberg, Trans. Osthopaed. Res Soc.19:236(1994)。
【００１６】
研究者の中には軟骨又は軟骨細胞組織を修復する特定の成長因子の使用を中心に扱うものもいれば、他に、軟骨破壊を促進及び／又はマトリックス合成を阻害する分子の活性を抑制することを考えるものもいる。このような分子の１つには、関節内にあるいくつかの組織に不利に作用するサイトカインＩＬ-１αがあり、滑膜炎の発生、及び上方制御マトリックス金属プロテイナーゼ及びプロスタグランジン発現に関連する。V. Baragi等、J. Clin. Invest. 96:2454-60 (1995)；V.M. Baragi等、Osteoarthritis Cartilage 5:275-82 (1997)；C.H. Evans及びP.D. Robbins, J. Keukoc. Biol. 64:55-61 (1998)；C.H. Evans等、J. Rheumatol. 24:2061-63 (1997)；R. Kang等、Biochem. Soc. Trans. 25:533-37 (1997)；R. Kang等、Osteoarthritis Cartilage 5:139-43 (1997)。ＩＬ-１αに拮抗する手段の一つは、可溶性ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＩＬ-１のそのレセプターへの結合を抑制する天然発生タンパク質での処理によって、軟骨のＩＬ-１の直接的及び間接的な作用を妨げるものである。哺乳動物において、ただ１つのプロテアーゼ、つまりインターロイキン１β-コンバターゼ（ＩＣＥ）は、成熟した活性ＩＬ-１αを特異的に生成することができる。ＩＣＥの阻害は、ＩＬ-１αの生成を阻害することが示されており、関節炎の変性を遅延させうる（Martel-PElletier J.等 Front. Biosci. 4: d694-703）。溶解性ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１α）、軟骨細胞との相互作用からＩＬ-１を防御することによりＩＬ-１の影響を阻害することができる天然発生タンパク質は、関節炎の動物モデルにおいて効果的であることも示されており、関節炎の発生又が進行を防止するその能力について最近ヒトで試験されている。他のサイトカイン、例えばＩＬ-１β、腫瘍壊死因子α、インターフェロンγ、ＩＬ-６及びＩＬ-８は、滑膜繊維芽細胞様細胞、軟骨細胞及び／又はマクロファージの活性の増加に関連している。これらのサイトカインの抑制は炎症及び軟骨破壊を防止するのに有益な処理となりうる。実際に、ＴＮＦ-α活性を抑制する分子は、リウマチ様関節炎を有する患者の関節で有益に作用することが示されている。
【００１７】
軟骨マトリックスの分解は、プロテアーゼによるマトリックス分子（プロテオグリカン及びコラーゲン）の切断によると考えられている（Woessner JF Jr.,「Proteases of the extacellular matrix」, in Mow, V., Ratcliffe, A. (eds): Structure and Function of Articular Cartilage. Boca Raton, FL, CRC Press, 1994 及びSmith R.L., Front. In Biosci. 4:d704-712参照）。マトリックス分解に関係する重要な酵素は、まだはっきりと分かっていないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び「アグリカナーゼ」は関節破壊に重要な役割を有するようである。さらに、プロテイナーゼのセリン及びシステインファイリーのメンバー（例えば、カテプシン及びウロキナーゼ又はプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ及びｔＰＡ））もまた関与しているようである。プラスミン、ウロキナーゼ プラスミノーゲン活性因子（ｕＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、メタロプロテイナーゼの活性化の経緯において重要な役割を果たしうる。カテプシンＢ、Ｌ及びＳに近い関係にあるグループはマトリックス分解に関係することが証明され、これらのカテプシンはＯＡにおいて若干増加する。ＩＬ-１、ＴＮＦ-α及びＬＩＦを含む多くのサイトカインは、軟骨細胞でのＭＭＰ発現を誘発する。ＭＭＰの誘発は、ＴＧＦ-β及びＩＬ-４により、少なくともウサギにおいてはＦＧＦ及びＰＤＧＦにより拮抗することができる。動物研究で示されるように、これらのプロテアーゼ（ＭＭＰ及びアグリカナーゼ）の阻害剤は、生体内で障害から関節組織を少なくとも部分的に保護しうる。
酸化窒素（ＮＯ）は関節破壊において重要な役割を果たす。Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)。ＩＬ-１等のサイトカインで刺激された場合以外にＮＯを生成しない正常な軟骨と異なり、骨関節炎関節から得られる軟骨は、更なる刺激がないにもかかわらず培地において３日間にわたって大量の酸化窒素を生成する。さらに、ＮＯ生成の抑制は、ＩＬ-１媒介軟骨破壊及び軟骨細胞の死、並びに動物モデルにおいて骨関節炎の進行を防ぐことが証明されている。
【００１８】
（発明の概要）
出願人は、驚いたことに、ＷＩＳＰポリペプチドが軟骨細胞の分化又は増殖の刺激能又は亢進能のような有用な活性を持っており、よってＷＩＳＰポリペプチドは軟骨性疾患及び／又は傷害の結果として損傷した軟骨を含む、軟骨の治療、修復又は保護に有用であり得ることを見出した。
一実施態様では、本発明は、軟骨性疾患の結果として損傷した軟骨の治療方法において、上記軟骨を有効量のＷＩＳＰポリペプチドに接触させることを含む方法に関する。本発明における使用することが考えられるＷＩＳＰポリペプチドには、限定されるものではないが、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２及びＷＩＳＰ-３ポリペプチド並びにそれらの変異体が含まれ、これらは以下に更に説明される。場合によっては、軟骨は関節軟骨であり、用いられるＷＩＳＰポリペプチドの量は治療的に有効な量である。好適な実施態様では、軟骨性疾患は変形性関節症又はリウマチ様関節炎である。本方法は、例えば治療的に有効な量のＷＩＳＰポリペプチドを哺乳動物に投与することによって、インビボで、あるいは上記軟骨組織を培養中に有効量のＷＩＳＰポリペプチドに接触させた後、治療した軟骨組織を哺乳動物中に移植することによってエクスビボで、実施されうる。また本方法は、ＷＩＳＰポリペプチドを治療薬として単独で用いるか、あるいは有効量の軟骨薬もしくはその他の治療法と併用することによって、実施されうる。例えば、ＷＩＳＰポリペプチドはあらゆる標準的な軟骨外科技術と併用することができる。ＷＩＳＰポリペプチドは標準的な軟骨外科技術の前に、その後に、及び／又はそれと同時に投与されうる。
【００１９】
更なる実施態様では、本発明は、傷害によって損傷した軟骨を治療し、又は初期のもしくは持続する損傷を防止する方法において、上記軟骨を有効量のＷＩＳＰポリペプチドに接触させることを含む方法に関する。より詳細には、治療される傷害は、マイクロダメージ又は鈍的外傷、軟骨骨折、骨軟骨骨折、腱、半月板、もしくは靱帯の損傷である。特定の観点では、傷害は過剰な機械的ストレスあるいはスポーツ損傷又は肥満から生じる他のバイオメカニカルな不安定性の結果のものでありうる。あるいは、本発明は、骨折を治療し又は修復を容易にする方法において、骨の損傷領域を有効量のＷＩＳＰポリペプチドに接触させることを含む方法に関する。
他の実施態様では、本発明は、軟骨細胞又は軟骨細胞前駆体細胞を有効量のＷＩＳＰポリペプチドに接触させることによって軟骨細胞又は軟骨細胞前駆体細胞の分化を亢進し、刺激し又は促進する方法に関する。
他の実施態様では、本発明は、適切な包装体中にＷＩＳＰポリペプチドと担体、賦形剤及び／又は安定剤（例えばバッファー）を含有する、キット又は製造物品に関する。キット又は物品は、好ましくは、軟骨性疾患の結果として損傷した軟骨を治療するために、又は初期のもしくは持続する損傷を防止するためにＷＩＳＰポリペプチドを用いるという指示書を含む。あるいは、キットは軟骨性疾患を治療するためにＷＩＳＰポリペプチドを用いるという指示書を含みうる。
【００２０】
本発明のより特定の実施態様には、哺乳動物の軟骨細胞又は組織を治療する方法において、変性軟骨性疾患により損傷した（又は傷害により損傷した）哺乳動物軟骨細胞又は組織を有効量のＷＩＳＰポリペプチドに接触させることを含み、上記ＷＩＳＰポリペプチドが：
ａ）配列番号：３のアミノ酸２３から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
ｂ）配列番号：３のアミノ酸１から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
ｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
ｄ）ａ）又はｂ）のポリペプチドの生物学的に活性な断片；
ｅ）配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
ｆ）配列番号：１０のアミノ酸１から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
ｇ）ｅ）又はｆ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
ｈ）ｅ）又はｆ）のポリペプチドの生物学的に活性な断片；
ｉ）配列番号：９のアミノ酸３４から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
ｊ）配列番号：９のアミノ酸１から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
ｋ）配列番号：８のアミノ酸１６から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
ｌ）配列番号：８のアミノ酸１から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
ｍ）ｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有するＷＩＳＰ-３ポリペプチド；及び
ｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドの生物学的に活性な断片；
からなる群から選択されるポリペプチドである、方法が含まれる。
【００２１】
場合によっては、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドはａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有し、該ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する。あるいは、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドはａ）又はｂ）のＷＩＳＰ-１ポリペプチドの生物学的に活性な断片であり、該生物学的に活性な断片は軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する。場合によっては、ＷＩＳＰ-２ポリペプチドはｅ）又はｆ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有し、該ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する。あるいは、ＷＩＳＰ-２ポリペプチドはｅ）又はｆ）のＷＩＳＰ-２ポリペプチドの生物学的に活性な断片であり、該生物学的に活性な断片は軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する。場合によっては、ＷＩＳＰ-３ポリペプチドはｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有し、該ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する。あるいは、ＷＩＳＰ-３ポリペプチドはｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のＷＩＳＰ-３ポリペプチドの生物学的に活性な断片であり、該生物学的に活性な断片は軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する。上で言及したＷＩＳＰポリペプチドは一又は複数のポリエチレングリコール分子に結合されていてもよい。場合によっては、ＷＩＳＰポリペプチドはエピトープタグ又は免疫グロブリン分子に結合されていてもよい。本方法において、軟骨は関節軟骨であり得、また変性軟骨性疾患はリウマチ様関節炎又は変形性関節症であり得る。
【００２２】
（発明の詳細な記載）
Ｉ．定義
「ＷＩＳＰポリペプチド」という用語は、天然配列ヒト及びマウスＷＩＳＰタンパク質及びその遺伝子が少なくともＷｎｔ-１によって誘導されるここに記載される変異体を意味する。この用語には、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３並びにそれらの変異体が含まれる。このようなＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３タンパク質は更に以下に記載され、１９９９年５月６日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９９／２１９９８及びPennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)に記載されている。
ここで使用される、用語「ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」「ＷＩＳＰ-１相同体」及びそれらの文法上の変化形は、天然配列ＷＩＳＰ-１タンパク質及びそれらの変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源のような様々な供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって、あるいはこれらの類似の技術の任意の組み合わせによって調製してもよい。
ここで使用される、用語「ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」「ＷＩＳＰ-２相同体」、「ＰＲＯ２６１」及び「ＰＲＯ２６１ポリペプチド」並びにそれらの文法上の変化形は、天然配列ＷＩＳＰ-２タンパク質及びそれらの変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源のような様々な供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって、あるいはこれらの類似の技術の任意の組み合わせによって調製してもよい。
【００２３】
ここで使用される、用語「ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」「ＷＩＳＰ-３相同体」及びそれらの文法上の変化形は、天然配列ＷＩＳＰ-３タンパク質及びそれらの変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源のような様々な供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって、あるいはこれらの類似の技術の任意の組み合わせによって調製してもよい。
「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」は、天然由来のＷＩＳＰ-１ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」という用語には、特に、ここに開示されるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌型、自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシングがなされた形態又はスプライス変異体)及びＷＩＳＰ-１ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が包含される。本発明の一実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない、それぞれここに記載した配列番号：３のアミノ酸２３から３６７（１９９９年５月６日に公開のＷＯ９９／２１９９８に示された図３Ａ及び３Ｂ（配列番号：３）において過去にまた提供）又はここに記載した配列番号：３のアミノ酸１から３６７（ＷＯ９９／２１９９８に示された図３Ａ及び３Ｂ（配列番号：４）において過去に提供）を含有する成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドである。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドはここに記載した配列番号：３のアミノ酸２３から３６７又はアミノ酸１から３６７の近接配列を含む。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドはＡＴＣＣ寄託番号第２０９５３３号のコード化ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２４】
本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ここに記載した配列番号：３のアミノ酸２３から３６７又は１から３６７を含有する全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、１８４番の位置のバリン残基又は２０２番の位置のアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基にそれぞれ変化したもので、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。本発明の他の実施態様では、ここに記載した配列番号：３のアミノ酸２３から３６７又は１から３６７を含有する全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、１８４番の位置のバリン残基及び２０２番の位置のアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基にそれぞれ変化したもので、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。本発明の他の実施態様では、それぞれここに記載した配列番号：４のアミノ酸２３から３６７（ＷＯ９９／２１９９８に示された図１（配列番号：１１）において過去に提供）、又はここに記載した配列番号：４のアミノ酸１から３６７（ＷＯ９９／２１９９８に示された図１（配列番号：１２）において過去に提供）を含有する成熟又は全長天然配列マウスＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。
本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ＷＯ９９／２１９９８に示された配列番号：２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９を含む、ヒトＷＩＳＰ-１スプライス又は他の天然配列変異体の一つを含むヌクレオチド配列によってコードされるものであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。
【００２５】
「天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」又は「天然配列ＰＲＯ２６１ポリペプチド」は、天然由来のＷＩＳＰ-２ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」という用語には、特に、ここに開示されるＷＩＳＰ-２ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌型、自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシングがなされた形態又はスプライス変異体)及びＷＩＳＰ-２ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が包含される。本発明の一実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、ここに記載した配列番号：１０のアミノ酸１から２５０とアミノ酸１から２５０を含む、ここに記載した配列番号：１０のアミノ酸１−２４から２５０までを（ＷＯ９９／２１９９８に示された図４（配列番号：１５、１６、及び５６−７７）において過去にまた提供）含有する成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドはここに記載した配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０又はアミノ酸１から２５０の近接配列を含む。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドはＡＴＣＣ寄託番号第２０９３９１号のコード化ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-２は、ＷＯ９９／２１９９８に示された図２のアミノ酸２４から２５１とアミノ酸１から２５１（それぞれ配列番号：１９及び２０）を含む、ＷＯ９９／２１９９８に示された図２のアミノ酸１−２４から２５１までを（配列番号：１９、２０、及び７８−９９）含有する成熟又は全長天然配列マウスＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない。
【００２６】
「天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」は、天然由来のＷＩＳＰ-３ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」という用語には、特に、ここに開示されるＷＩＳＰ-３ポリペプチドの自然に生じる切断又は他の型、自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシングがなされた形態又はスプライス変異体)及びＷＩＳＰ-３ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が包含される。本発明の一実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、ここに記載した配列番号：９のアミノ酸３４から３７２（ＷＯ９９／２１９９８の図６Ａ及び６Ｂ（配列番号：３２）において過去に提供）又はここに記載した配列番号：９のアミノ酸１から３７２（ＷＯ９９／２１９９８に示された図６Ａ及び６Ｂ（配列番号：３３）において過去に提供）をそれぞれ含む成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない。本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、ここに記載した配列番号：８のアミノ酸１６から３５４（ＷＯ９９／２１９９８に示された図７Ａ及び７Ｂ（配列番号：３６）において過去に提供）又はここに記載した配列番号：８のアミノ酸１から３５４（ＷＯ９９／２１９９８に示された図７Ａ及び７Ｂ（配列番号：３７）において過去に提供）をそれぞれ含む成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドはここに記載した配列番号：９のアミノ酸３４から３７２又はアミノ酸１から３７２の近接配列を含む。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドはここに記載した配列番号：８のアミノ酸１６から３５４又はアミノ酸１から３５４の近接配列を含む。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドはＡＴＣＣ寄託番号第２０９７０７号のコード化ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２７】
「ＷＩＳＰ-１変異体」という用語は、配列番号：３のアミノ酸２３から３６７の推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-１と、及び／又は配列番号：３のアミノ酸１から３６７の推定アミノ酸配列を有するヒト全長ＷＩＳＰ-１と、及び／又はＷＯ９９／２１９９８に示された図１（配列番号：１１）に示された推定アミノ酸配列を有するマウス成熟ＷＩＳＰ-１及び／又はＷＯ９９／２１９９８の図１（配列番号：１２）に示された推定アミノ酸配列を有するマウス全長ＷＩＳＰ-２と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するものとして以下に定義するような活性なＷＩＳＰ-１ポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、配列番号：３の全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に対して一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失され（すなわち、断片）たＷＩＳＰ-１ポリペプチドで、他の種の変異体を含むものが含まれるが、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは除かれる。
【００２８】
「ＷＩＳＰ-２変異体」又は「ＰＲＯ２６１変異体」という用語は、配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０の推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-２と、及び／又は配列番号：１０のアミノ酸１から２５０の推定アミノ酸配列を有するヒト全長ＷＩＳＰ-２と、及び／又はＷＯ９９／２１９９８の図２（配列番号：１９）に示された推定アミノ酸配列を有するマウス成熟ＷＩＳＰ-１及び／又はＷＯ９９／２１９９８の図２（配列番号：２０）に示された推定アミノ酸配列を有するマウス全長ＷＩＳＰ-２と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するものとして以下に定義するような活性なＷＩＳＰ-２ポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、配列番号：１０の全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に対して一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失され（すなわち、断片）たＷＩＳＰ-２ポリペプチドで、他の種の変異体を含むものが含まれるが、天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは除かれる。
【００２９】
「ＷＩＳＰ-３変異体」という用語は、配列番号：９のアミノ酸３４から３７２の推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-３と、及び／又は配列番号：９のアミノ酸１から３７２の推定アミノ酸配列を有するヒト全長ＷＩＳＰ-３と、及び／又は配列番号：８のアミノ酸１６から３５４の推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-３と、及び／又は配列番号：８のアミノ酸１から３５４の推定アミノ酸配列を有するヒト全長ＷＩＳＰ-３と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するものとして以下に定義するような活性なＷＩＳＰ-３ポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、配列番号：９又は配列番号：８の全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に対して一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失され（すなわち、断片）たＷＩＳＰ-２ポリペプチドで、他の種の変異体を含むものが含まれるが、天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは除かれる。
【００３０】
ここに同定されるポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ここで同定されたＷＩＳＰ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００３１】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ及び０．１ＳＤＳでの洗浄；又は（４）１０％デキストラン硫酸、２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）のバッファー及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによるものである。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【００３２】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＷＩＳＰの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３３】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３４】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＷＩＳＰポリペプチド及びここで記載されるＷＩＳＰ変異体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３５】
本発明のＷＩＳＰポリペプチド又はＷＩＳＰ変異体において「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＷＩＳＰポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持する本発明のタンパク質の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＷＩＳＰポリペプチドによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味する。同様に、「免疫学的」活性とは、本発明の天然又は天然発生ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対する抗体の生成における、抗原として働く能力を意味する。
【００３６】
ここでのＷＩＳＰポリペプチド又はＷＩＳＰ変異体における「生物学的活性」は、軟骨の再生及び／又は破壊防止を促進する、あるいは軟骨細胞の分化又は増殖（すなわち、成熟した軟骨細胞への前駆体細胞の分化）を増強又は促進するこのような分子の能力に関して使用される。場合によっては、軟骨は関節軟骨であり、軟骨の再生及び／又は破壊は外傷又は軟骨疾患に関する。例えば、生物学的活性は、関節軟骨からのプロテオグリカン（ＰＧ）放出の抑制、関節軟骨でのＰＧ合成の増加、ＮＯの生成の抑制等により定量されうる。
用語「軟骨疾患」は、疾病又は外傷に因るものを含む、影響した体の部分の痛みの症状、硬直及び／又は動作の制限により更に明らかになる疾患の総称を意味する。「軟骨疾患」の範囲に含まれるのは、「変性軟骨疾患」−少なくとも部分的な、体の結合組織の変性又は代謝異常に特徴づけられ、関節又は筋肉、滑液包（滑膜）、腱及び繊維組織を含む関連構造のみならず、成長板も含む疾患の総称である。一実施態様では、該用語は、滑らかな関節軟骨表面の破壊及び軟骨マトリックスの変性により特徴づけられる「関節軟骨疾患」を含む。更なる病態には、酸化窒素の生成、マトリックス合成の抑制又は減少を含む。
【００３７】
「関節軟骨疾患」の範囲内には、骨関節炎（ＯＡ）及びリウマチ様関節炎（ＲＡ）が含まれる。ＯＡは、関節マージンにおける明白な骨拡張に比例した局在化した軟骨の非対称性破壊によって特徴付けられる。典型的に、ＯＡは、手の指節間関節、第一腕掌骨関節、股関節、膝、脊椎及びミッドフット（midfoot）の幾つかの関節に影響を及ぼすが、足首、肘、及び肩などの大関節は容赦される傾向にある。ＯＡは、しばしば、血色素症、アルカプトン尿症などの代謝病、発育性臼蓋形成不全（先天性股関節脱臼）、肢長不一致などの発育異常とも関連し、痛風、敗血性関節炎及び神経障害性関節炎などの外傷性及び炎症性関節炎を含む。また、ＯＡはスポーツ外傷又は肥満により生じるような広範な生体力学不安定の後に現れうる。
【００３８】
リウマチ様関節炎は（ＲＡ）、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる全身性、慢性、自己免疫疾患で、典型的には、小及び大可動関節などに影響を及ぼす。ＲＡが進行すると、その症状には、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節、さらに早期死亡が含まれる。ＲＡの症状はしばしば、青年期に現れ、脈管炎、皮膚及び筋肉の萎縮、皮下小結節、リンパ節症、脾腫、白血球減少症及び慢性貧血が含まれる。
さらに、「変性軟骨疾患」という用語は、全身性紅斑性狼瘡及び痛風、アミロイドーシス又はフェルティ症候群を含み得る。さらに、該用語は、乾癬性関節炎、急性炎症（例えば、エルシニア関節炎、ピロリン酸関節炎、痛風関節炎（arthritis urica）、敗血性関節炎）、外傷関連関節炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病)、多発性硬化症、糖尿病（例えば、インスリン依存性及びインスリン非依存性）、肥満症、巨細胞関節炎及びシェーグレン症候群を網羅する。
【００３９】
本発明の方法によって治療されるものの少なくとも幾つかの他の免疫性及び炎症性疾患の例には、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症誘発性筋疾患、（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、自己免疫炎症性疾患、（例えば、アレルギー性筋痛性脳脊髄炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、甲状腺中毒症、強皮症、全身性紅斑狼瘡、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、限局性腸炎、末梢回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、末端性回腸炎)自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血）及び同種移植の拒絶反応、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患（糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び抹消神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症 、特発性脱髄性多発神経障害又はGuillain-Barre症候群、及び慢性炎症誘発性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病)、グルテン感受性腸疾患、及びフィップル疾患、水泡性皮膚疾患を含む自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びジンマシン、肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主の疾患を含む、移植関連疾患を含む考案に従って治療することができる。感染性疾患には、ウイルス性疾患、例えばエイズ（ＨＩＶ感染）、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ型肝炎、ヘルペス等、細菌性感染症、真菌性感染症、原生動物感染症、寄生虫感染症、及び呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等、及びアレルギー疾患、例えばアナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル、湿疹、じんま疹及び食物アレルギー等が含まれる。
【００４０】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変化の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指し、標的である病理学的状態又は疾患を予防、又は抑制（減少）することが目的である。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。免疫関連疾患の治療では、治療薬は直接的に疾患の病理成分の応答の大きさを低下又は増加させうるし、或いは疾患を他の治療剤による治療、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等に対してより敏感にしうる。
用語「有効量」とは、損傷した軟骨の検出可能な改善又は修復あるいは軟骨マトリックスの単離した試料における持続した又は誘発された軟骨変性からの測定可能な保護の何れかを引き起こす、誘発する又は結果的に生じる（例えば、マトリックス内プロテオグリカンの保持、マトリクスからのプロテオグリカン放出の抑制、プロテオグリカン合成の促進）、ＷＩＳＰポリペプチドの最小濃度である。更に、「治療的有効量」とは、少なくとも外傷又は軟骨疾患から生じる症状を和らげる（例えば、損傷した関節軟骨の検出可能な改善又は修復の何れかを引き起こす、誘発する又は結果的に生じる、あるいは軟骨変性の持続又は発生からの測定可能な保護を引き起こす、誘発する又は結果的に生じること、関節可動域の改善、痛みの減少）のに有効な、哺乳動物に投与するＷＩＳＰポリペプチドの最小濃度（量）である。
【００４１】
「軟骨剤」は、成長因子、サイトカイン、小分子、抗体、ＲＮＡ片又はＤＮＡ片、ウィルス粒子、ペプチド、又は化学物質であってもよく、軟骨に有利な効果をもたらし、ペプチド成長因子、異化アンタゴニスト及び骨-、滑膜-又は抗炎症因子を含みうる。あるいは、「軟骨剤」はペプチド成長因子-例えば線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ-１、ＦＧＦ-２、．．．ＦＧＦ-２１、等々）、ＩＧＦ'ｓ（Ｉ及びＩＩ）、ＴＧＦ-βｓ（１-３）、ＢＭＰｓ（１-７）、又は例えば増殖、分化、移動、付着、又は軟骨細胞によるマトリックス産生を変化させることによって軟骨の本質的な修復反応を促進することができる、ＥＧＦ、ＨＢ-ＥＧＦ、ＴＧＦ-β等の上皮成長因子ファミリーのメンバーの任意のものであり得る。あるいは、「軟骨剤」は軟骨の異化作用に拮抗する因子（例えば、ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＮＯ阻害剤、ＩＬ１-β転換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＬＩＦ、ＩＦＮγの活性、ＴＮＦ-α活性を阻害する因子、テトラサイクリン及びその変異体、アポトーシスの阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、アグリカナーゼ阻害剤、カテプシン及びウロキナーゼ又は組織プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ及びｔＰＡ）等のセリン及びシステインプロテイナーゼの阻害剤）であり得る。あるいはまた、軟骨剤は下にある骨（即ち、骨因子、例えば、二リン酸エステル又はオステオプロテグリン）又は周囲の滑膜（即ち、滑膜因子）に影響することにより軟骨に直接作用する因子又は抗炎症因子（例えば、抗ＴＮＦ-α（Remicade(登録商標)等の抗ＴＮＦα抗体、並びにEnbrel(登録商標)等のＴＮＦレセプター免疫アドヘシンを含む）、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ-４、ＩＬ-１０、ＩＬ-１３、ＮＳＡＩＤｓ）を含む。軟骨剤の概説としては、例えばMartel-Pelletier等, Front. Biosci. 4: d694-703(1999); Hering , T.M., Front. Biosci. 4: d743-761(1999)を参照のこと。
【００４２】
「慢性」投与とは、急性の様式とは異なり、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持するために連続的な様式で薬剤を投与することを指す。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ用、又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ハムスターなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の更なる治療薬と「組合わせた」投与には、いずれかの順番による同時的（併用の）及び継続的な投与が含まれる。
【００４３】
ここで用いられる「担体」は、製薬上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、使用用量及び濃度でそこに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性のものである。しばしば、生理学的に許容される担体の例は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICSTM(登録商標)、ヒアルロン酸（ＨＡ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００４４】
ＩＩ．本発明の方法及び組成物
本発明の方法によれば、変異体ＷＩＳＰポリペプチドは、変性軟骨疾患並びに種々の他の免疫及び免疫関連症状の治療に利用できる。このようなＷＩＳＰポリペプチドは、ここでＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３及びその変異体と称されるポリペプチド（並びにその誘導タンパク質、例えばエピトープタグ形態又はそのＩｇ-融合構築物）を含む。ＷＩＳＰポリペプチドはインビボ並びにエキソビボで使用されうる。任意には、ＷＩＳＰポリペプチドは、更に下記で詳細に説明される製薬組成物の形態で使用される。
本発明で考慮される変性軟骨疾患はリウマチ様関節炎は（ＲＡ）を含む。ＲＡは、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる全身性、慢性、自己免疫疾患で、典型的には、小及び大可動関節などに影響を及ぼす。ＲＡが進行すると、その症状には、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節、さらに早期死亡が含まれる。ＯＡとは対照的に、ＲＡの症状はしばしば、青年期に現れ、関節外症状はあらゆる臓器に影響があり、関節破壊が左右対称で、大及び小関節の両方に同様に生じる。関節外の症状は、関節脈管炎、皮膚及び筋肉の萎縮、皮下小結節、リンパ節症、脾腫、白血球減少症及び慢性貧血が含まれる。更に、ＲＡは、様々な疾患の発症と本質的に異質であり、患者の９０％において病気の経過中の血漿リウマチ因子の形成に関与する。典型的には、ＲＡを有する患者はまた、異常に活発な免疫系を持つ。ＲＡに罹っているかなり多くのヒトは、単球及びマクロファージ上のクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の増大された活性化に関連した遺伝的感受性を有する。これらの組織適合性複合体分子は、これらのクラスＩＩ分子のレセプターを担持する活性化Ｔ細胞に対する抗原の存在に関わる。ＲＡに対する遺伝的素因は、非常に重篤な症状を持つヒト患者における高度に保存された白血球抗原ＤＲのサブタイプＤｗ４、Ｄｗ１４及びＤｗ１５の罹患率によって支持される。
【００４５】
骨関節炎（ＯＡ）は、関節構造に影響を及ぼし、その結果痛み及び機能欠損を引き起こす局所的変成疾病である。ＯＡは２のタイプ：原発性及び二次性に分類される。原発性ＯＡとは、潜在的な因果関係が決定されない変成関節疾病の範囲を意味する。典型的に、原発性ＯＡによって影響を受ける関節は、手の指節間関節、第一腕掌骨関節、股関節、膝、脊椎及びミッドフット（midfoot）の幾つかの関節である。一次性ＯＡにおいて、足首、肘、及び肩などの大関節は容赦される傾向にある。これに対して、二次性ＯＡは決まった怪我又は外傷の結果として生じる。二次性ＯＡは、しばしば、血色素症、アルカプトン尿症などの代謝病、発育性臼蓋形成不全（先天性股関節脱臼）、肢長不一致などの発育異常と関連し、リウマチ様関節炎、痛風、敗血性関節炎及び神経障害性関節炎などの外傷性及び炎症性関節炎を含む。
ＯＡに関する最初の変性は、プロテオグリカンがマトリックスから失われるので、関節軟骨表面の擦り切れ及び線維化として現れる。連続した関節の使用で、表面の線維化が進行し、欠損が軟骨に更に深く入り込み、軟骨組織の一部が失われる。さらに、軟骨の下にある骨（軟骨下骨）が薄くなり、軟骨が失われるので、徐々に骨が露わになる。非対称な軟骨破壊によって醜い傷跡が生じうる。骨増殖体と呼ばれる骨小結節がしばしば軟骨表面の周辺に形成され、場合によっては隣接した浸食領域にまで広がる。これらの骨増殖体の表面が広がると、血管の増殖が生じ、繊維軟骨を含む組織栓の形成を生じる。
【００４６】
軟骨は無血管であるため、軟骨層に生じる損傷は軟骨下骨にまで進入ないが、僅かな内在する複製の潜在力を有する常在性の軟骨細胞の修復作業はなされなくなる。しかしながら、軟骨下骨に浸透した場合、その血管供給は３つの修復過程を生じさせる。この型の損傷に応答して合成される最適以下の軟骨は、その線維マトリックスのためにここで「繊維軟骨」と称されるが、これは、最適以下の生化学及び機能特性を有し、よって更に摩耗及び破壊されやすくなる。罹患又は損傷した関節では、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、アグリカナーゼ、及び他のプロテアーゼの増加した放出は、更なる軟骨の薄化及び欠損を引き起こす。インビトロ研究では、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＰＤＧＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮ-γ、ＴＧＦ-β、ＬＩＦ、ＩＬ-２及びＩＬ-６、ＩＬ-８等のサイトカインが滑膜繊維芽細胞様細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、及び／又は破骨細胞の活性の代わりをすることができることが示され、これらのサイトカインが生体内でのマトリックスの代謝回転を調節しうることが示唆された。
軟骨の機能特性はその生化学的組成により決定される。軟骨構造は軟骨の引張強度及び硬度に寄与するが、圧縮性（又は弾性）はそのプロテオグリカン成分による。健康な関節軟骨では、ＩＩ型コラーゲンが優性である（約９０−９５％含む）が、少量のＶ、ＶＩ、ＩＸ及びＸＩ型コラーゲンもまた存在する。軟骨プロテオグリカン（ＰＧ）は、架橋結合した硫酸化グリコサミノグリカンを有する、水力学的に大きい集合性ＰＧ、並びにデコリン、バイグリカン及びルミカン等の水力学的により小さい非集合性のＰＧを含む。
【００４７】
軟骨に対する傷害は、３つのカテゴリーに分けられる：（１）微細損傷又は鈍的外傷、（２）軟骨骨折、及び（３）骨軟骨骨折である。
軟骨細胞及び軟骨マトリクスに対する微細損傷は、単一の衝撃により、連続した鈍的外傷により、又は生体力学的に不安定な関節の連続使用によって引き起こされ得る。実際に、変性関節の初期段階に見られるような代謝性又は生化学的変化は、関節軟骨の反復した負荷に関わる動物モデルに複製されうる。Radin等, Clin. Orthop. Relat. Res. 131: 288-93(1978)。このような実施例は、関節炎の関節に見られる軟骨損失の明確なパターンに加えて、疾患における関節軟骨の整合性及び恒常性の欠損に生化学的負荷が関与する役割をはっきりさせる。Radine等, J Orthop Res. 2: 221-234(1984); Radin等, Semin Arthritis Rheum(補足2)21: 12-21(1991); Wei等, Acta Orthop Scand 69:351-357(1998)。軟骨細胞は、基礎的な割合ではプロテオグリカンによって軟骨マトリックスを補充することができるが、コラーゲン網への同時損傷は損失率を増加させ、不可逆性の変性を生じる。Buckwalter等, J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:192-201(1994)。
【００４８】
軟骨骨折は軟骨下板を破らずに関節表面が破壊されることに特徴づけられる。外傷部位で軟骨細胞壊死が生じると、続いて外傷に隣接する生軟骨細胞の分裂及び代謝活性が増加して線維組織による関節表面の壊裂のライニングを引き起こす。軟骨細胞活性の増加は一時的であり、新しいマトリックス成分の不十分な質と量で修復反応が起こる。
３つのタイプのうち最も重篤である骨軟骨骨折は、潮標（tidemark）又は下の軟骨下プレートをクロスリンクする傷害である。このタイプの傷害において、軟骨下脈管構造の存在により、血管組織で典型的に遭遇する３相の反応が引き起こされる：（１）壊死；（２）炎症；（３）修復である。最初、傷害は血液又は血の固まりで埋められる。生じたフィブリンの固まりは炎症反応を活性化し、血管形成修復組織となり、種々の細胞成分がトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質、及びインスリン様成長因子を含む、成長因子及びサイトカインを放出する。Buckwalter等、J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:191-201 (1994)。
【００４９】
骨軟骨骨折に関連する最初の修復反応は、前駆体の軟骨細胞への補充、増殖及び分化に特徴付けられる。間葉幹細胞はフィブリン網に堆積し、最終的には線維軟骨領域となる。F. Shapiro等, J. Bone. Joint Surg. 75: 532-53(1993); N. Mitchell及びN. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58:230-33(1976)。これらの幹細胞は、隣接した関節表面よりむしろ下にある骨髄からのものであると考えられ、軟骨細胞へと分化が進む。外傷の後６〜８週で、修復した組織はいくつかのＩ型コラーゲンと共に大部分がＩＩ型であるコラーゲン及びプロテオグリカンのマトリックスに軟骨細胞様細胞を含む。T. Furukawa等, J. Bone Joint Surg. 62: 79-89(1980); J. Cheung等, Arthritis Rheum. 23:211-19(1980); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72(1971)。しかしながら、この新しく堆積したマトリックスは退化し、軟骨組織はより多くの線維組織及び線維軟骨に置き換わり、コラーゲンの合成はＩＩ型からＩ型に変化する。H.S. Cheung等, J. Bone Joint Surg. 60: 1076-81(1978); D.Hamerman, 「Prospects for medical intervention in cartilage repair」, Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects, Eds. Woessner JF等, (1993); Shapiro等, J. Bone Joint Surg. 75: 532-53(1993); N. Mitchell & N. Shepard, J. Bone joint Surg. 58: 230-33(1976); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72(1971)。初期の変性の変化は、表面の線維化、プロテオグリカンの枯渇、軟骨細胞のクローニングと死、及び表面から深層への縦割れを含む。外傷の一年後には、修復した組織は繊維軟骨と硝子軟骨が混在し、大量のＩ型コラーゲンを有し、これは正常な関節軟骨で大した量で見られることはないものである。T. Furukawa等, J. Bone Joint Surg. 62: 79-89(1980)。
【００５０】
炎症は骨関節炎の初期現象ではないようだが、炎症が骨関節炎関節に生じる。外傷の後及び炎症の間に滑膜ライニングに浸潤する炎症細胞（例えば、単球、マクロファージ、及び好中球）はメタロプロテイナーゼ、並びに分解酵素の更なる放出を助長する能力のある異化サイトカインを産生する。炎症と関節破壊は関節炎の動物モデルの全てにおいて完全な相関は示さないが、炎症を抑制するＩＬ-４、ＩＬ-１０及びＩＬ-１３等の物質は関節炎の動物において軟骨及び骨の病状も減少させる（Martel-Pelletier J.等 Front. Biosci.4:d694-703）。炎症性サイトカインを抑制する物質の使用は、ＯＡ患者に発生する局所性滑膜炎に対抗することによりＯＡの進行を遅らせうる。
ＯＡは、骨の象牙質化を引き起こす関節軟骨の分解のみならず、この組織のいわゆる硬化を生じる軟骨下骨の広範な再造形も伴う。これらの骨の変化は、しばしば局所的な吸収の結果としての軟骨下嚢胞の形成を伴う。骨吸収を抑制する物質、即ちオステオプロテグリン又はビスホスホネートは、関節炎の動物モデルにおいて有望な結果を示した。Kong等, Nature 402:304-308 (1999)。
【００５１】
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産出であり、続いて、免疫媒介炎症が生じ、抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。しかし、Ｔリンパ球は組織ダメージに直接関与しないことが示されており、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性のものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【００５２】
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞の反応が誘発されると仮定されている。
本発明で使用されるＷＩＳＰポリペプチドは、組換え発現技術を含む任意の適した方法によって調製され得る。組換え発現の技術は、当業者によく知られており、適切な材料と方法はＰＣＴ出願、WO99/21998に記載されている。任意には、ＷＩＳＰポリペプチドをＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母などの宿主細胞を用いて発現させる。ＷＩＳＰポリペプチドは完全長ポリペプチド（ここで定義される）、又はその変異体形態、並びにＷＩＳＰポリペプチドの他の変形（例えば免疫グロブリン、エピトープタグ、ロイシンジッパー又は他の非タンパク質様重合体と融合して又は結合して）を含みうる。
【００５３】
イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。ＷＩＳＰイムノアドヘシンは、全長ポリペプチドの他に細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列又はＥＣＤ配列フラグメントを含むレセプターの可溶性型のような、ＷＩＳＰの様々な形体を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＷＩＳＰと抗体又は抗体の特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、レセプターポリペプチドの可溶性型（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型）で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
他の実施態様において、ＷＩＳＰポリペプチドは、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、ポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなＷＩＳＰポリペプチドのペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合し、連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); WO94/10308；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をＷＩＳＰポリペプチドの５'末端又は３'末端の何れかに融合しうることは理解するであろう。
【００５４】
また、本発明のＷＩＳＰポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該レセプターポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のＷＩＳＰポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＷＩＳＰポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＷＩＳＰポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
【００５５】
本発明で使用され得るＷＩＳＰポリペプチドの治療的製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。このような治療的製剤は、凍結乾燥又は水溶性形態で在り得る。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリン又はヒアルロナンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はTWEEN（商標登録）、PLURONICS（商標登録）、及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００５６】
また、ＷＩＳＰポリペプチドは、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中にカプセル化することにより調製される。このような調製物は、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中にて投与され得る。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版 (又はさらに新しい版), Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
このようなポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＷＩＳＰポリペプチドの持続性又は徐放性投与が望まれる場合、マイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」 in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman. eds. , (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及びU.S. Pat No. 5,654,010参照。
【００５７】
持続性放出製剤の好適な例には、活性分子を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが含まれ、該マトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセルの成形物の形態である。徐放性マトリクスの例は、一又は複数のポリアンヒドリド（例えば、U.S.P.4,891,225；4,767,628）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及び乳酸−グリコール酸の共重合ポリエステル（米国特許出願第3,773,919号; 同第4,767,628号; 同第4,530,840号；Kulkarni等、Arch. Surg. 93:839 (1966)）、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドアクリル酸、ポリアクリル酸、エチレン-ビニルアセテート、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリアセチルニトリル、ポリフォスファゼン、及びポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリル酸)、又はポリ(ビニルアルコール)）のポリマー及びコポリマー、セルロース、アシル置換セルロースアセテート、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、塩化ポリビニル、フッ化ポリビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタミン酸共重合ポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。さらに、使用される非生物分解性ポリマーは、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、エチレンビニル酢酸、ポリエチレングリコール、セルロースアセテートブチレート、及びセルロースアセテートプロピオネートである。
【００５８】
あるいは、持続性放出製剤は、分解性生物材料で構成される。生物分解性ポリマーは、その生物適合性、特異的な分解に対する高い反応性、及び生物学的マトリクス中への活性薬物の取込み容易性により、魅力的な薬物剤形である。例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）は生物学的材料に対する膨潤性の重合性送達媒体としてクロスリンクされ、使用される。U.S.P. 4,957,744；Valle等、Polym. Mater. Sci Eng. 62:731-735 (1991)。また、ポリエチレングリコールで移植されたＨＡポリマーは、生物学的状態における長期間の保存に関連する望ましくない薬物漏出及び変性の両方を低下させる改善された送達マトリクスとしても調製されている。Kazuteru. M., J.Controlled Release 59:77-86 (1999)。使用される更なる生物分解性ポリマーは、ポリ（カプロラクトン）、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホジエステル）、ポリエステルアミド、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、分解性及び非毒性ポリウレタン、ポリヒドロキシブチル酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリアルキレンオキサル酸、ポリアルキレンコハク酸、ポリ（リンゴ酸）、キチン及びキトサンである。
【００５９】
あるいは、生物分解性ヒドロゲルは、生物学的材料及び薬物に対してコントロールされた放出送達媒体として使用される。マクロマーの適当な選択を通じて、膜は、広範囲の生物分子に適する透過性、孔サイズ及び分解速度の範囲を有して生産され得る。
あるいは、生物材料及び薬物に対する持続性放出送達系は、分散により構成される。分散は、懸濁液又はエマルジョンのいずれかにさらに分類される。生物学的材料に対する送達媒体という点において、懸濁液は液体培地中に分散（多少不均一に）された極微小固体粒子の混合物である。懸濁液の固体粒子は、数ナノメーターから数百ミクロンのサイズにおよび、微粒子、マイクロカプセル及びナノスフェアーを含む。一方、エマルジョンは、少量の乳化剤による懸濁液中に保持される２又は複数の混合できない液体の混合物である。乳化剤は、混合できない液体間に界面状のフィルムを形成し、また、表面活性物質又は界面活性剤としても知られている。エマルジョン形成は、水が連続相で油又は脂肪が分散されている水中油（ｏ／ｗ）、並びに油が連続相で水が分散されている水中油（ｗ／ｏ）の両方であり得る。適切な持続性放出の製剤化の一例は、WO97/25563中に開示される。さらに、生物学的材料と共に使用するためのエマルジョンには、複合エマルジョン、マイクロエマルジョン、ミクロドロプレット及びリポソームが含まれる。ミクロドロプレットは、内部に油層も持つ球状脂質層から構成される単層のリン脂質媒体である。例えば、U.S.P. 4,622,219及びU.S.P. 4,725,442。リポソームは、水溶液と水に不溶な極性脂質とを混合することにより調製されるリン脂質媒体である。
【００６０】
あるいは、ＷＩＳＰポリペプチドの持続性製剤は、乳酸-グリコール酸共重合ポリマー（ＰＬＧＡ）など、非常に高い生物適合性及び広範囲の生物分解性特性を発揮するポリマーを用いて開発される。ＰＬＧＡの分解産物である乳酸及びグリコール酸は、ヒトの身体から速やかにクリアにされる。さらに、該ポリマーの分解性はその分子量及び組成に依存して、月から年の範囲で調整することができる。さらなる情報については、Lewisによる「Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide polymer,」 in Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems M, Chasin and R. Langeer, editors(Marcel Dekker:New York, 1990), pp.1-41を参照のこと。
カプセル化されたポリペプチド又は徐放性製剤中のポリペプチドは、放出濃度及び温度において非毒性である「水溶性多価金属塩」と共にポリペプチドを製剤化することで得られる。「多価金属」の例には、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ2+，Ｍｇ2+，Ｚｎ2+，Ｆｅ2+，Ｆｅ3+，Ｃｕ2+，Ｓｎ2+，Ｓｎ4+，Ａｌ2+，及びＡｌ3+）が含まれる。上記多価金属カチオンと共に水溶性塩を形成するアニオンの例には、無機酸及び／又は有機酸によって形成されるものが含まれる。このような水溶性塩は水（２０℃）に少なくとも20 mg/ml、或いは100 mg/ml、或いは200 mg/mlの溶解度を持つ。
【００６１】
「水溶性多価金属塩」を形成するために用いられる適切な無機酸には、疎水性酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸、及びリン酸が含まれる。用いられる適切な有機酸には、脂肪族カルボン酸及び芳香族酸が含まれる。ここでの定義において脂肪酸とは、飽和又は不飽和Ｃ２−９のカルボン酸（例えば、脂肪族モノ-、ジ-、及びトリ-カルボン酸）として定義されてもよい。一般に、カプセル化されたポリペプチドの安定化を補助するために用いられる水溶性多価金属塩には、例えば、：（１）無機酸のハロゲン金属塩（例えば、塩化亜鉛、塩化カルシウム）、硫酸鉛、硝酸塩、リン酸塩、チオシアン酸塩；（２）脂肪族カルボン酸の金属塩、酢酸カルシウム、酢酸亜鉛、プロピオン酸カルシウム、グリコール酸亜鉛、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛及び酒石酸亜鉛：及び（３）安息香酸塩の芳香族カルボン酸金属塩、（例えば、安息香酸亜鉛）及びサリチル酸塩などが含まれる。
インビボ投与に使用する処方のために、それらを無菌にする必要がある。処方は凍結乾燥及び再構成の前又は後に無菌の濾過膜を通して濾過することにより簡単に無菌にすることができる。ここでの治療用組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液バッグ又はバイアルに入れる。
【００６２】
インビボの哺乳動物治療のために、投与経路を既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路による注射又は注入、局所的投与、持続放出性又は徐放放出性の手段等の周知の方法に従う。任意には、活性化合物又は製剤を罹患した軟骨領域又は関節に直接注射する。また、本発明により考えられる治療は、遺伝子治療の形態をとりうる。
本発明で利用できる製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【００６３】
ＷＩＳＰポリペプチドのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約10ng/kgから100mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
また、ここで使用される製剤は、治療される特定の徴候に必要とされる一以上の活性化合物、互いに不利に影響しない相補的な活性を有する好適なものを含んでいてもよい。ＷＩＳＰポリペプチドは細胞傷害罪、サイトカイン又は成長阻害因子と組み合わせて投与されうる。このような分子は、意図する目的に効果的な量及び組合せで存在する。また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、本発明のポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明のＷＩＳＰポリペプチドを投与する。また他の薬剤、例えばデコリン又はバイグリカンのような薬剤をＷＩＳＰポリペプチドと組み合わせて投与することができる。また、同時投与又は連続投与も考えられる。
【００６４】
本方法はまた、あらゆる標準的な軟骨の外科的技術と組み合わせて行われうる。標準的な外科的技術は、軟骨シェービング、摩耗性軟骨形成術、レーザー修復、壊死組織切除、軟骨形成術、軟骨下骨侵入のある又はない微小破壊、自家骨軟骨移植、軟骨細胞同種移植、幹細胞自家移植、助軟骨移植、化学刺激、電気刺激、軟骨外自家移植、骨膜自家移植、軟骨足場再生(scaffollds)、シェル（骨関節）自家移植又は同種移植、又は骨切り術を含む、軟骨の治療的な操作に通常用いられる外科的手術である。これらの技術はFrenkel等, Front. Bioscience 4: d671-685(1999)により詳細に記載され、検討されている。
好ましい実施態様では、ＷＩＳＰポリペプチドは微小破壊手術と組み合わせて使用される。微小破壊手術の技術は当業者に公知であり、一般に哺乳動物の骨髄腔の外科的な穿孔を必要とする。次いで、フィブリン凝塊が形成され、哺乳動物体の欠損を補填する。続いて、繊維軟骨が形成する。
ＷＩＳＰポリペプチドは、軟骨又は軟骨細胞をエキソビボで処理するために使用することができると考えられる。このようなエキソビボ処理は、移植、特に自家移植に有用である。例えば、ＷＩＳＰポリペプチドによるこのような軟骨又は軟骨細胞を含む細胞又は組織の処理、任意には、上記のような一以上の他の治療は、レシピエント哺乳動物における移植前に、前駆体軟骨細胞の分化の誘発を軟骨組織の再生に利用することができる。
【００６５】
軟骨又は軟骨細胞を含む細胞又は組織を、まずドナー哺乳動物から得る。細胞又は組織は外科的に得られ、好ましくは無菌的に得られる。次いで、細胞又は組織をＷＩＳＰポリペプチドで、任意には上記のような一以上の他の治療と共に処理する。
次いで、処理した細胞又は組織はレシピエント哺乳動物に移植又は注入されうる。レシピエント哺乳動物はドナー哺乳動物と同じ個体であっても、又は他の異なる哺乳動物でもよい。
ここで記載される処理の進行又は効果は、熟練技術者に既知の従来からの技術及びアッセイにより簡単に監視することができる。
ここで記載されるＷＩＳＰポリペプチドの軟骨又は軟骨細胞における活性又は効果は、様々なインビトロ又はインビボのアッセイを用いて過度の実験なしに測定することができる。
【００６６】
あるアッセイにおいて、無傷の軟骨におけるＷＩＳＰポリペプチドの合成的及び予防的可能性を試験することができる。この目的ために、プロテオグリカン（ＰＧ）の合成及び分解、並びに一酸化窒素の放出が、処理した関節軟骨移植片において測定される。プロテオグリカンは、関節軟骨中二番目に大きな有機材料成分である（Kuettner, K.E.等、Articular Cartilage Biochemistry. Raven Press, New York, USA (1986), p.456；Muir, H., Biochem. Soc. Tran. 11:613-622 (1983)；Hardingham, T. E., Biochem . Soc. Trans. 9;489-497 (1981)）。プロテオグリカンは軟骨の物理的及び化学的性質を決定するのに役立つため、関節の分解の間に生じる軟骨ＰＧｓの減少は、圧縮されたこわばり及び弾性の喪失、水力の透過性の増大、増加した水分含量（膨張）、及びコラーゲンなど他の細胞外組織の変化を導く。従って、ＰＧの喪失は、変性軟骨性疾患の進行の初期段階であり、さらに関節の生体力学的及び生化学的安定性を混乱させる。関節軟骨のＰＧｓは、骨格成長及び疾病における有望な役割により、広く研究されてきた。Mow, V.C., & Ratcliffe, A. Biomaterials 13:67-97 (1992)。病気に罹った関節で増大するプロテオグリカンの分解は、ここで記述されるアッセイにおいて比色定量ＤＭＭＢアッセイを用いて外植片培地中でＰＧｓを定量することにより測定される。Farndale及びButtle, Biochem. Biophys. Acta 883:173-177 (1985)。プロテオグリカンへの３５Ｓ-硫酸塩の取り込みは、プロテオグリカン合成の指標として使用される。
【００６７】
インターロイキン-１α、ＩＬ-１βと変成軟骨性疾病が連関するという証拠は事実である。例えば、高レベルのインターロイキン-１α（ＩＬ-１α）（Pelletier JP等、「Cytokines and inflammation in cartilage degradation」 in Osteoarthritic Edition of Rheumatic Disease Clinics of North America, Eds. RW Moskowitz, Philadelphia, W.D. Saunders Company, 1993, p.545-568)及びＩＬ-１レセプター(Martel-Pelletier等、Arthritis Rheum. 35:530-540 (1992)が病気に罹った関節において見いだされており、ＩＬ-１αが軟骨マトリクスの分解を誘導し、新たなマトリクス分子の合成を阻害する。Baragi等、J. Clin. Invest. 96:2454-60 (1995)；Baragi等、Osteoarthritis Cartilage 5:275-82 (1997)；Evans等、J. Leukoc. Biol. 64:55-61 (1998)；Evans等、J. Rheumatol. 24:2061-63 (1997)；Kang等、Biochem. Soc. Trans. 25:533-37 (1997)；Kang等、Osteoarthritis Cartilage 5:139-43 (1997)。また、ＩＬ-１αと疾患との関連性のため、ＩＬ-１αの存在下においてＷＩＳＰポリペプチドをアッセイすることができる。軟骨にポジティブな影響を持つだけでなく、ＩＬ-１αの異化作用を妨害するＷＩＳＰポリペプチドの能力は、ＷＩＳＰポリペプチドによって示される保護的効果の強力な証拠である。さらに、異化現象がＩＬ-１αにより阻害され、また多くの他のサイトカインに誘発されるために、そしてＩＬ-１α活性の拮抗作用が変成軟骨関節炎の進行を抑えることが示されているため、このような活性はＷＩＳＰポリペプチドが関節炎の状態で生じる分解を阻害し得ることを示唆する。Arend, W.P.等、Ann. Rev. Immunol. 16：27-55（1998）。
【００６８】
一酸化窒素（ＮＯ）の生産は、ＩＬ-１などの異化作用的サイトカインにより軟骨中で誘発され得る。Palmer, RMJ等、Biochem. Biophys. Res. Commun. 193:398-405 (1993)。また、ＮＯは関節炎の状態で生じる関節破壊にも関与してきた。Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)。正常な（病気ではない又は負傷していない）軟骨とは異なり、インターロイキン-１又はリポ多糖類（ＬＰＳ）などの付加刺激の非存在下でも、骨関節炎の軟骨はエクスヴィボにおいて有意な量の一酸化窒素を生産する。インビボ動物モデルにより、酸化窒素生成の阻害は関節炎の進行を和らげることが示唆された。Pelletier, JP等, Arthritis Rheum. 7: 1275-86(1998); van de Loo等, Arthritis Rheum. 41: 634-46 (1998); Stichtenoth, D.O. 及びFrolich J. C., Br. J. Rheumatol. 37:246-57 (1998)。インビトロにおいて、一酸化窒素は軟骨細胞の機能に対し、コラーゲン及びプロテオグリカンの合成阻害、亢進されたアポトーシス及び細胞外マトリクスへの接着阻害を含む有害な影響を及ぼす。亜硝酸の濃度は、リウマチ様関節炎の患者の液よりも変成軟骨関節炎の患者の関節液中において高いことが示されている。Renoux等、Osteoarthritis Cartilage 4:175-179 (1996)。さらに、動物モデルは、一酸化窒素の生産の阻害は、関節炎の進行を抑えることを示唆する。Pelletier, J.P.等、Arthritis Rheum 7:1275-86 (1998)；van de Loo等、Arthritis Rheum. 41:634-46 (1998)；Stichtenoth, D.O.及びFrolich J.C. Br. J. Rheumatol. 37:246-57 (1998)。また、ＮＯは他の細胞にも影響を及ぼすため、関節中のＮＯの存在は、血管拡張及び透過率を増大させ、白血球によるサイトカインの放出を強化し、血管形成活性を刺激する。従って、軟骨によるＮＯの生産は、疾病の状態と相関し、ＮＯは、関節疾病の腐食性及び炎症性の成分の両方において役割を演じるようであるため、一酸化窒素の生産を減少させる因子は、変成軟骨疾患の治療に対して有益であると思われる。
【００６９】
ここで記述されるアッセイは、２,３-ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）が、定量可能な蛍光産物である１-(Ｈ)-ナフトトリアゾールを形成する酸性条件下で亜硝酸塩と反応する原理に基づいている。ＮＯは亜硝酸塩（ＮＯ２ -1）及び硝酸塩（ＮＯ３ -1）へと代謝されるため、亜硝酸塩の検出は軟骨組織で（たとえカウント値以下であっても）実際に生産されたＮＯを検出する手段の一つである。
この方法において、血清又は他の成長因子無しの培地で軟骨細胞の生存を促進、助長又は維持するためのＷＩＳＰポリペプチドの能力が試験される。関節軟骨細胞は、まず細胞外マトリックスの除去により作成され、単層で培養され、マトリックスが枯渇した時に軟骨疾患の後期ステージに近似すると思われる。アッセイは、黄テトラゾリウム塩ＭＴＴを切断して紫のホルマザン結晶を形成する生細胞の能力に基づいて培養される細胞の代謝活性を測定する非職分析アッセイである。この細胞性還元反応は、ピリジンヌクレオチド補助因子ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに関係する。Berridge, M.V. & Tan, A.S., Arch. Biochem. Biophys. 303: 474(1993)。可溶化した生成物は、ＥＬＩＳＡリーダーで分光光度的に定量される。
【００７０】
また、他のアッセイはマウスの膝蓋骨（膝頭）におけるプロテオグリカンの合成に対するＷＩＳＰポリペプチドの影響を調べる。本アッセイは無傷の軟骨（骨の下の存在するものも含める）、従って、インビボの軟骨環境に近い条件下のテスト因子を用いる。化合物は、インヴィトロにおいて膝蓋骨に添加されるか、又はエクスヴィボでの膝蓋骨におけるプロテオグリカンの合成を分析する前にインビボにて膝関節へインジェクトされるかのいずれかである。以前示されたように、インビボで処理された膝蓋骨はエクスヴィボでのＰＧ合成において明らかな変化を示す。（Van den Berg等、Rheum. Int. 1:165-9 (1982)；Vershure. P.J.等、Ann. Rheum. Dis. 53:455-460 (1994)；及びVan de Loo等、Arthrit. Heum. 38:164-172 (1995)。本モデルにおいて、各動物の対側の関節はコントロールとして使用できる。
これらの試験は、膝の骨関節炎（ＯＡ）を自然に生じるモルモットの系統、Dunkin Hartley (DH)からの関節軟骨移植片においてＰＧ合成の促進及びＰＧ放出の抑制の両方におけるＷＩＳＰポリペプチドの影響を測定する。関節破壊の急速な進行を引き起こす多くの他の動物モデルは、徐々に進行するヒト１次ＯＡよりも２次ＯＡに類似している。対照的にＤＨモルモットは、自然発生的なゆっくりとした進行の非炎症性ＯＡ様変化を有する。これらモルモットの軟骨破壊の高い再現性のあるパターンは、ヒトの疾患に見られるものと似ているので、ＤＨモルモットは骨関節炎のためのよく知られた動物モデルである。Young等、”Osteoarthritis”, Spontaneous animal models of human disease vol.2, pp.257-261, Acad. Press. Ney York. (1979)；Bendele等、Arthritis Rheum. 34:1180-1184；Bendele等、Arthritis Rheum. 31:561-565 (1988)；Jimenez等、Laboratory Animal Science vol.47(6):598-601 (1997)；Wei等, Acta Orthop Scand 69:351-357(1998)。初めに、これらの動物モデルは最小の組織学的変化の存在により検出可能な軽いＯＡを発症する。しかしながら、疾病は進行し、16-18月齢までに関節での中程度から重篤な軟骨変成が観察される。結果として、ＤＨモルモットの軟骨マトリックスでの病気の進行を超えるＷＩＳＰポリペプチドの効果は、関節破壊の異なるステージでＯＡの治療に化合物が治療的効果を有することの示唆となった。
【００７１】
真性糖尿病（糖尿病）に関係する代謝の変化は、罹患した生物の他の多くの器官及び筋骨格システムに影響する。例えば、ヒトにおいて、筋骨格の損傷及び疾患の発生は、糖尿病になると増加し、糖尿病は関節炎進行の危険要因であるとされる。
糖尿病に類似した病理現象はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与により動物に誘発させることができる。Portha B. 等, Diabete Metab. 15: 61-75(1989)。インスリンを産生する膵臓細胞の死滅によって、ＳＴＺは処置した動物の血清インスリンの量を減少させる。ＳＴＺ誘発性糖尿病は、皮膚、骨及び軟骨を含む結合組織の萎縮に関連し、コラーゲン含量を低下させる。Craig, R.G.等, Biochim. Biophys. Acta 1402: 250-260(1998)。このアッセイにおいて、処置したＳＴＺ処理マウスの膝蓋骨をＷＩＳＰポリペプチドの存在下でインキュベートし、結果的なマトリックス合成を分析する。未処理コントロールに対して、ＰＧ合成のレベルを増加又は回復するＷＩＳＰポリペプチドの能力は、治療的潜在性を示唆する。
【００７２】
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、例えば、軟骨疾患を治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性薬剤は、典型的にはＷＩＳＰポリペプチドである。組成物は、ここで開示されるいずれの又は複数の成分をも含み得る。容器上の又は添付された説明書は、組成物が選択の状態を治療するために使用されることを示す。例えば、説明書は、組成物が変成軟骨関節炎、リウマチ様関節炎又は他の任意の軟骨疾患の治療に有効であることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容される緩衝液を含む第２の容器を具備してもよい。あるいは、組成物は、任意の担体、賦形剤及び／又は安定化剤を含んでもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【００７３】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
（実施例）
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。特記しない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いる：Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., 1990; Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【００７４】
実施例１
以下に記載されるアッセイにおいて、次の方法及び材料を用いた：
材料： ウシ気管由来のコンドロイチン硫酸Ａ、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃ、ウシ精巣由来のヒアルロニダーゼ（EC 3.2.1.45）及びアセロバクター アウレンスセンス(Artherobacter aurenscens)由来のコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（EC 4.2.2.5）をカルビオケム社（サンディエゴ）から購入した。コンドロイチン硫酸Ｂ、ブタ腸管粘膜由来のヘパリン及びヘパラン硫酸、ウシ関節軟骨由来のデコリン、バイグリカン、フラボバクテリウム ヘパニウム(Flavobacterium hepanium)コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチナーゼＢ及びへパリナーゼＩ（EC 4.2.2.7）をシグマ社から得た。サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｄ、イカ軟骨由来のコンドロイチン硫酸ＥをＵＳバイオロジカル社(United States Biological)（スウォンプスコット、ＭＡ）から購入した。コレラ菌(Vibrio Cholera)由来のノイラミニダーゼ（EC 3.2.2.18）、プロテウス ブルガリス(Proteus vulgaris)由来のコンドロイチンＡＢＣ（EC 4.2.2.4）、プロテアーゼフリー、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット及び脂肪酸ウルトラフリーＢＳＡフラクションＶをロシュ・モレキュラー・バイオケミカル社（インディアナポリス、ＩＮ）から購入した。プロテウス ブルガリス由来のコンドロイチン-４-硫酸（EC 3.1.6.9）及びコンドロイチン-６-硫酸（EC 3.1.6.10）をＩＣＮバイオメディカル（オーロラ、ＯＩ）から入手した。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的ビオチニル化抗ヒツジＩｇＧをジャクソンイムノリサーチ社（コスタメサ、ＣＡ）から購入した。プロテイナーゼＫ（EC 3.4.21.14）ready-to-use、テキサスレッドにコンジュゲートしたストレプトアビジン及び抗ビメンチンモノクローナル抗体（クローンVim 3B4）をダコ社（カーピンテリア、ＣＡ）から入手した。５-クロロメチルフルオレセインジアセテート（５-ＣＦＤＡ）及びヘキスト３３３４２をモレキュラープローブ社（ユージーン、ＯＲ）から購入した。ルネッサンスＴＳＡ間接増幅キットをＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社（ボストン、ＭＡ）から購入した。ベクタッシュイールド(Vectashield)マウンティング培地及びビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧをベクター社（バーリンゲーム、ＣＡ）から入手した。
【００７５】
完全長マウスＷＩＳＰ-１（Pennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)）を、以前ＴＮＦＲ１について記載されているようにして（Ashkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539 (1991)；WO 99/21998）、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域のＷＩＳＰ-１配列下流をコードする発現ベクターにクローン化した。得られた組み換え融合タンパク質（ＷＩＳＰ-１-Ｆｃ）はＳｆ９昆虫細胞を用いてバキュロウィルス発現系で合成し、タンパク質ＡセファロースFast Flow（ファルマシア バイオテック社、スウェーデン）カラムでの親和性クロマトグラフィーによって無血清条件培地から精製して均一にした。吸着しなかったタンパク質を1MのＮａＣｌを含有する50mMのリン酸ナトリウムバッファーで洗い流した。ＷＩＳＰ-１-Ｆｃを100mMのグリシン、ｐＨ２．５で抽出し、3MのトリスＨＣｌ、ｐＨ８の０．１量でｐＨを中性にした。透析（20mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、150mM）の後、精製したタンパク質をセントリプレップ-３０（ミリポア株式会社、ベッドフォード、ＭＡ）を用いて限外濾過により濃縮し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色によって純度を測定した。様々な回数で発現及び精製したタンパク質の３つの異なるバッチで少なくとも３回実験を繰り返して、同様の結果を得た。
【００７６】
細胞培養： ＮＲＫ（正常ラット腎線維芽細胞）、Ｈｓ５９７.Ｓｋ（ヒト正常皮膚線維芽細胞）、Ｈｓ８３９.Ｔ（ヒト皮膚メラノーマ線維芽細胞）、Ｈｓ９０８.Ｓｋ（ヒト皮膚メラノーマ線維芽細胞）、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ（ヒト大腸腺癌細胞）、ＲＡＧ（マウス腎臓腺癌細胞）、２９３（ヒト腎上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）及びＷＭ-２６６-４（ヒト皮膚メラノーマ上皮細胞）をアメリカンタイプカルチャーコレクション、マナッサス、バージニアから入手した。細胞を、10%のＦＢＳを補足した低グルコースダルベッコ変法イーグル培地／ハムＦ-１２（１：１）で３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【００７７】
細胞結合： 細胞を８ウェルプラスティックチャンバースライドに撒き、３７℃、５％ＣＯ２で一晩維持した。次の日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ウェルを３％ＢＳＡのＨＢＳ-Ｃバッファー（25mMのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、150のＮａＣｌ、3mMのＣａＣｌ２、3mMのＭｇＳＯ４、5mMのＫＣｌ、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）を用いて室温で３０分間遮断した。記載しているときに、遮断する前に細胞を洗浄し、0.1Uの様々な脱離酵素を用いて２時間３７℃でインキュベートした。（参照、Vacherot等, J. Biol. Chem., 274:7741-7747 (1999)）。1nMのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧで室温において１時間細胞をインキュベートし、洗浄して0.2μg/mlのビオチニル化抗ヒトＩｇＧＦｃ’含有ＨＢＳ-Ｃ/３％ＢＳＡで３０分間室温においてインキュベートした。ＴＳＡ間接キット（ＮＥＮデュポン社）で製造業者の使用説明書に従ってシグナルを増幅させた。１：２００のＦＩＴＣ複合ストレプトアビジン（ダコ社）で３０分インキュベーションした後、スライドを1μg/mlのヘキスト３３３４２（モレキュラープローブ社）を含有するベクタッシュイールドでマウントし、ニコンEclipse 800蛍光顕微鏡を用いて可視化した。Photometrics 300 CCDカラーカメラを用いて画像を得た。過去の記載（Szurdoki等, Anal. Biochem., 291:219-228 (2001)）に変更を加えて細胞の蛍光強度の測定をした。簡単にいうと、平均９０細胞を含む３つの別々のフィールドの最小の画像を取得し、電子ファイルとして保存した。閾値を、ＷＩＳＰ-１-Ｆｃなしで作成されたネガティブコントロールにおける１％の最も明るいピクセルの最も低い強度として決定した。細胞集団の蛍光シグナルを、細胞数で割った閾値を超える全体のピクセル強度として決定した。
【００７８】
固相結合アッセイ： タンパク質を50μl（総量）のＰＢＳに希釈し、ポリスチレンマイクロタイターウェルに適用し、４℃で一晩インキュベートした。次の日、ウェルを0.3%のＢＳＡを含有する300μlのＨＢＳ-ｃ３回洗浄し、非特異的結合部位を、200μlのＨＢＳ-Ｃ/３％ＢＳＡで室温で１時間遮断した。バッファーを吸引し、50μlの0.5nMのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ含有ＨＢＳ-Ｃ/３％ＢＳＡを室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、50μlの2μg/ml西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ’を含有するＨＢＳ-Ｃ/３％と共に１時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０を含有する200μlのＰＢＳで６回洗浄し、シグナルを100μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ色素生産性物質ＴＭＢ（ＫＰＬ社）を用いて可視化した。反応を100μlの1Mリン酸で停止させ、450nmのＯＤで測定した。インキュベーションと並行して、マイクロタイターウェルのコーティングを取り除くことによって非特異的ＷＩＳＰ-１Ｆｃ結合を測定した。ＷＩＳＰ-１-Ｆｃが除かれた場合、シグナルは作られなかった。
【００７９】
ＷＩＳＰ-１結合因子の精製： ヒト皮膚線維芽細胞で、３日おきに血清含有と無血清培地とのサイクルを実施した。無血清条件培地をCentriprep-30（ミリポア社、ベッドフォード、ＭＡ）で濃縮した。次に、続けて20mMのトリスＨＣｌ ｐＨ７．４、300mMのＮａＣｌを添加し、再び濃縮することによってバッファーを変えた。濃縮物（150μgのタンパク質/ml）をスナップフローズンし、使用まで−８０℃で保存した。濃縮した条件培地を解凍、濾過し、300mMのＮａＣｌを含有する20mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化したMono Q陰イオン交換カラムを通した。カラムを洗浄し、吸着したタンパク質を、同じバッファーでのＮａＣｌ（300mM−2M）直線勾配を用いて抽出した。500μlの分画をＷＩＳＰ-１結合活性について分析した。
【００８０】
質量分析によるタンパク質の同定： ＷＩＳＰ-１結合活性を有する分画をプール、変性、還元して、0.1UのコンドロイチナーゼＡＢＣと共に３７℃で２時間前もってインキュベーションしている、又はインキュベーションをしていない4-15%の勾配アクリルアミドＳＤＳ-ＰＡＧＥを行った。ゲルを銀染色してコンドロイチナーゼＡＢＣ消化で移動性の変化を示すタンパク質バンドを切除し、Arnott等, Electrophoresis, 19:968-980 (1998)に以前記載されているようにしてインサイツにおいてトリプシンで消化した。トリプシンペプチドを抽出し、ミクロキャピラリー逆相液体クロマトグラフィー質量分析を分析した。5μmのＣ１８ビーズの入った100μm i.d.、10cm長の融合シリカキャピラリーカラム（238MSB5；バイダック社、Hesperia、ＣＡ）にペプチド混合物を負荷し、イオントラップ質量分析計（ＬＣＱ；サーモクエスト社、サンノゼ、ＣＡ）のマイクロエレクトロスプレーイオン化手段に直接、アセトニトリル勾配で抽出した。プレカラム分離によって、ＨＰＬＣ（Ultra Plus II；マイクロテック・サイエンティフィック社、サニーベール、ＣＡ；Arnott等, 上掲）により得られる25μl/分から500nl/分の流速が得られた。質量スペクトルの自動データディペンデント収集は分子量（ＭＳ）及びカラムから抽出されるようなペプチドの配列データ（ＭＳ／ＭＳ）を与えた。Sequestプログラム（Gatlin, C., Eng, J., Cross, S., Detter, J.及びYates III, Analytical Chemistry, 72:757-763 (2000)）を用いた重複性のタンパク質配列データベースの入力したＭＳ／ＭＳの相関によってタンパク質を同定した。スペクトルの手動解読によってタンパク質の合致を確認した。
【００８１】
免疫蛍光： スライドマウントしたヒト大腸腫瘍切片を室温にもどし、７０％のエタノールで１０分間固定し、非特異的結合部位を1.5%の正常血清を含有するＰＢＳ/３％ＢＳＡを２０分間染み込ませた。切片を0.125マイクログラム/mlの抗ビメンチン抗体と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、さらに2マイクログラム/mlのビオチニル化抗マウスＩｇＧ抗体と共に３０分間インキュベートした。シグナルをＴＳＡ間接キットを用いて製造業者の使用説明書に従って増幅した。１：１０００のテキサスレッド複合ストレプトアビジンと３０分間インキュベーションした後、1マイクログラム/mlのヘキスト３３３４２を含有するベクタッシュイールドでスライドをマウントし、ニコンEclipse 800蛍光顕微鏡で可視化した。Photometrics 300 CCD冷却カメラで画像を取得した。一次抗体のない状態で行ったネガティブコントロールはいずれの蛍光染色も示されなかった。
ヒト皮膚線維芽細胞のデコリンの免疫蛍光検出を同じプロトコルを用いて実施した。8x103の細胞をチャンバースライドに撒き、一晩培養した。次の日、細胞を洗浄し、３７℃で１５分間5マイクログラム/mlの５-ＣＦＤＡを含有する新しい培地と共にインキュベートした。洗浄の後、非特異的結合部位を室温で３０分間ＨＢＳ-Ｃ/３％ＢＳＡに浸けた。次に、細胞を室温で１時間１：４０００のヒツジ抗ヒトデコリン抗体を含有するＨＢＳ-Ｃ／０．１％ＢＳＡと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間固定し、洗浄してさらに２マイクログラム/mlのビオチニル化抗ヒツジＩｇＧとインキュベートした。シグナルをＴＳＡ間接キットを用いて増幅した。１：１０００のテキサスレッドをコンジュゲートしたストレプトアビジンと３０分間インキュベーションした後、スライドを1マイクログラム/mlのヘキスト３３３４２を含有するベクタッシュイールドを用いてマウントし、ニコンEclipse 800蛍光顕微鏡で可視化した。Photometrics 300 CCD冷却カメラで画像を取得した。一次抗体のない状態で行ったネガティブコントロールはいずれの蛍光染色も示されなかった。
【００８２】
分析方法： ＳＤＳ-ＰＡＧＥをBio-Rad Mini-PROTEAN II垂直スラブゲル電気泳動装置を用いてLaemli, Nature, 227:680-685 (1970)に従って実施した。推定上の分子量をBio-Radの広範囲分子量標準を用いて測定した。Bio-Radタンパク質アッセイ銀染色試薬及びウシ血清アルブミン標準物を用いてタンパク質を決定した。
【００８３】
Ａ．様々な細胞株及びヒト大腸腫瘍切片に対するＷＩＳＰ-１の結合
ヒト免疫グロブリンＦｃ断片タグを有するキメラ組み換えマウスＷＩＳＰ-１の様々な培地内の細胞への結合を分析した。細胞をチャンバースライドに撒き、一晩培養した。次の日、非特異的結合部位を遮断し、細胞を1nMのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧと共に又はｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧなしで１時間培養した。細胞を洗浄、固定し、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧをビオチニル化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて免疫蛍光により検出し、間接チラミド基質増幅法をＦＩＴＣコンジュゲートストレプトアビジンで続けた。
図１にまとめられているように、ＷＩＳＰ-１の結合は線維芽細胞株の表面でのみ見られた。一例として、ＷＩＳＰ-１のＮＲＫ細胞への結合が例証される（図１Ａ）。さらに、タンパク質はまた、正常又は皮膚メラノーマ由来にかかわらずラット又はヒト由来の線維芽細胞に結合する。一方、マウス腎臓腺癌、ヒト大腸腺癌、ヒト腎上皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、又はヒト皮膚メラノーマ内皮細胞が使用された場合、蛍光シグナルは検出されなかった。例として、ＷＩＳＰ-１のＲＡＧ細胞への結合を例証した（図１Ｂ）。ＷＩＳＰ-１の添加を省略した場合又は無関係のビオチニル化二次抗体を使用した場合に、シグナルは検出されなかった（図１Ｃ）。
【００８４】
ＷＩＳＰ-１のヒト大腸腫瘍切片への結合をインサイツリガンド結合法を用いて評価した。スライドにマウントしたヒト大腸腫瘍切片を室温にし、すぐに3mMのＣａＣｌ２、3mMのＭｇＳＯ４、5mMのＫＣｌ及び1MのＮａＣｌを含有する35mMの酢酸（ｐＨ３．５）で４分間インキュベートした。次いでスライドを、32mMのショ糖を含有するＨＢＳ-Ｃ（25mMのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、150のＮａＣｌ、3mMのＣａＣｌ２、3mMのＭｇＳＯ４、5mMのＫＣｌ、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）で洗浄し、非特異的結合部位を３％のＢＳＡ、１．５％の正常ヤギ血清及び32mMのショ糖を含有するＨＢＳ-Ｃで２０分間遮断した。結合部位はアビジンであり、ビオチンはVector社（バーリンゲーム、ＣＡ）のアビジン／ビオチン遮断キットを用いて遮断した。スライドをＨＢＳ-Ｃ/３％のＢＳＡ及び1nMのＷＩＳＰ-１-Ｆｃで１時間インキュベートし、冷たい（４℃）ＨＢＳ-Ｃ／１％のＢＳＡを用いて各回１分で３回洗浄し、ＰＢＳ／４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。スライドを、0.2マイクログラム/mlのビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃ特異性を含有するＨＢＳ-Ｃ/３％ＢＳＡとともに３０分間インキュベートし、洗浄してＰＢＳ／４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。シグナルをＴＳＡ間接増幅キットを用いて製造業者の使用説明書に従って増幅した。ＴＢＳ／０．１％ＢＳＡで４分、３回洗浄することによって反応を停止した。スライドを、ストレプトアビジンをコンジュゲートしたＦＩＴＣ（１：１０００）含有ＴＢＳ／０．１％ＢＳＡで３０分間インキュベートし、０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０を含有するＴＢＳで洗浄した。切片を、1マイクログラム/mlのヘキスト３３３４２を含有するベクタッシュイールドマウント培地でマウントし、ニコンEclipse 800蛍光顕微鏡を用いて可視化した。
ビメンチン染色は腫瘍及び正常粘膜の両方で間葉細胞の存在を示すが（図１Ｆ及び図１Ｇ参照）、インサイツＷＩＳＰ-１結合は腫瘍周囲間質に限られる（図１Ｄ）。腫瘍上皮細胞又は正常粘膜には結合が見られなかった（図１Ｄ及び１Ｅ）。
【００８５】
Ｂ．ヒト皮膚線維芽細胞条件培地へのＷＩＳＰ-１結合
ＷＩＳＰ-１結合因子をヒト皮膚線維芽細胞の表面から分泌又は脱落するかどうかを試験するために、固相結合アッセイを実施した。ヒト皮膚線維芽細胞から無血清条件培地（上記のようにして調製される）を回収し、濃縮してマイクロタイタープレートに一晩コートした。50マイクロリットルの条件培地を二通りにマイクロタイトレーションウェルをコートした。非特異的結合部位に３％のＢＳＡを含有するＨＢＳ-Ｃをインキュベーションによって染み込ませ、ウェルをｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧとともに２時間インキュベートした。非特異的結合部位を遮断した後、ウェルをまずＷＩＳＰ-１と、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体とインキュベートした。ウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃ’とともに１時間インキュベートした。０．３％のＢＳＡを含有するＨＢＳ-Ｃでの６回の洗浄の後、シグナルを西洋ワサビペルオキシダーゼ色素生産物質を用いて可視化した。反応を1Mのリン酸で停止し、450nmのＯＤで測定した。図２Ａは、段階希釈した条件培地でコートしたウェルへの1nMのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ結合を示し、図２Ｂは0.5μlのヒト皮膚線維芽細胞条件培地でコートしたウェルへの段階希釈したｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を示す。結合はコートした培地の量及び添加したＷＩＳＰ-１の濃度に比例し、ヒト皮膚線維芽細胞は溶解性ＷＩＳＰ-１結合因子を産生することを示す。
【００８６】
図３Ａに示されるように、ＷＩＳＰ-１と条件培地の間の相互作用を1MのＮａＣｌの存在下で消失させた。100mMのＥＤＴＡの存在は部分的に結合を減弱させるが、０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０の存在は影響がない。コート物質へのＷＩＳＰ-１の結合はカチオン性と無関係であり、イオン的要素を有すると結論づけられた。次いで、結合因子がプロテオグリカンであるという可能性を、ＷＩＳＰ-１の結合を評価する前に様々な脱酵素でコートウェルを処理することによって調べた。コンドロイチナーゼＣ、コンドロイチン-６-スルファターゼ、へパリナーゼ又はノイラミニダーゼでのコート培地の処理は、コントロールに比較してＷＩＳＰ-１の結合に変化はなかった（図３Ｂ）。しかしながら、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ又はヒアルロニダーゼでの消化は部分的に結合を減少させた。結局、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＢ、コンドロイチン-４-スルファターゼ又はプロテイナーゼＫでの処理はコートウェルへのＷＩＳＰ-１の結合を消失させた。コンドロイチナーゼＢ及びコンドロイチン-４-スルファターゼの特異性は、デルマタン硫酸成分がＷＩＳＰ-１の結合に必須であることを示す。更に、プロテイナーゼＫに対する相互作用の感応性は、結合因子がタンパク質性の成分であることを示す。結果は、ＷＩＳＰ-１がプロテオグリカンを含有する分泌デルマタン硫酸に結合することを示唆する。
【００８７】
コンドロイチナーゼＡＢＣ及びコンドロイチナーゼＢ処理は結合を完全に消失させるが、コンドロイチナーゼＣは影響しなかった。コンドロイチナーゼＢは、β-Ｄ-ガラクトサミン-Ｌ-イズロン酸結合でデルマタン硫酸を切断する。この酵素の特異性は、ＷＩＳＰ-１の結合のためにイズロン酸が必要であることを示す。コンドロイチンＡＣＩＩ又はヒアルロニダーゼでの処理は一部でのみ結合を減少させた。これは、ＷＩＳＰ-１の相互作用をもたらすグリコサミノグリカン鎖がデルマタン硫酸-コンドロイチン類硫酸共重合体から構成されることを示す。感受性のあるガラクトサミニド結合を切断することによって、これらの酵素をイズロン酸残基を含むグリコサミノグリカン鎖の部分を取り除いた。コンドロイチン-４-硫酸での処理は、結合を完全に消失させるが、コンドロイチン-６-硫酸は相互作用を変化させなかった。これは、相互作用のためにＮ-アセチルガラクトサミンの４位の硫酸基が必要であることを示す。へパリナーゼでの処理は影響がなく、結合が２位で硫酸化させるためにイズロン酸を必要としないことを示す。プロテイナーゼＫでの処理は結合を消失させ、相互作用をもたらすグリコサミノグリカンが、タンパク質分解によりウェルから脱離可能なタンパク質中心に結合されることを示唆する。まとめると、これらの結果は、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン鎖のモチーフを有するイズロン酸が、ヒト皮膚線維芽細胞条件培地に結合するＷＩＳＰ-１を調節するという結論を支持する。
【００８８】
Ｃ．ＷＩＳＰ-１結合因子の精製と同定
ＷＩＳＰ-１の結合をもたらす因子を精製するために、ヒト皮膚線維芽細胞からの無血清条件培地を培養の３日後に回収、濃縮し、20mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、300mMのＮａＣｌを含有するバッファーに移し、Ｑ-セファロース陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用した。カラムを洗浄し、残ったタンパク質を増大した濃度のＮａＣｌで取り除いた。ＷＩＳＰ-１結合因子の存在を固相結合アッセイを用いて各分画で分析し、結果を図４Ａに示す。さらに、分画１５（図４Ａに*で示される）を0.1UのコンドロイチナーゼＡＢＣの存在下（＋）又は非存在下（−）で２時間３７℃でインキュベートした。試料を還元状態下でＳＤＳ-Ｐａｇｅにより分離し、ゲルを銀染色した。示されたバンドを質量分析（図４Ｂ）で同定した。
デコリンに相当する４６、６０、及び７０ｋＤａでバンドが見られたが、４４ｋＤａのバンドはバイグリカンと同定された（２３０ｋＤａのバンドはデコリンとバイグリカンの両方の混合物であることを示す）。コンドロイチナーゼＡＢＣ処理の間に精製された不完全消化グリコサミノグリカン鎖を含むおそらくバイグリカンとデコリンに相当する異なる分子量でバンドが見られた。結果は、ＷＩＳＰ-１がプロテオグリカン、バイグリカン及びデコリンを含む２つのデルマタン硫酸に結合することを示す。
【００８９】
Ｄ．ＷＩＳＰ-１はデコリンとバイグリカンに結合する
ＷＩＳＰ-１のデコリン及びバイグリカンとの直接的な相互作用を示すために、固相結合アッセイを実施した。デコリンとバイグリカンをマイクロタイターウェルに一晩コートした。非特異的結合部位を飽和させ、0.25nMのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧＦｃ’（2μg/ml）とともに１時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０を含有するＰＢＳで６回洗浄した後、シグナルを色素生産性物質のインキュベーションによって発達させた。色の発達を1Mのリン酸を添加することで停止し、450nmのＯ.Ｄ.で測定した。
図５Ａに示されるように、デコリン及びバイグリカンへのＷＩＳＰ-１の結合に相当する曲線は非常に類似し、コートされたタンパク質の量に比例する。同様に、コートしたヒト皮膚線維芽細胞条件培地へのＷＩＳＰ-１の結合を阻害するデコリン及びバイグリカンの能力を評価した。
50マイクロリットルのヒト皮膚線維芽細胞条件培地をマイクロタイタープレートのウェルにコートした。非特異的結合部位を飽和させ、0.25nMのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを様々な濃縮のデコリン（黒丸）又はバイグリカン（白丸）（図５Ｂ）の存在下で２時間インキュベートした。ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を上記のようにして評価した。図５Ｂに見られるように、ヒト皮膚線維芽細胞条件培地へのＷＩＳＰ-１の結合は、増大した濃縮のデコリン及びバイグリカンの存在下で徐々に減少する。デコリン及びバイグリカンは、デコリンについて70μg/mlで、バイグリカンについて105μg/mlで５０％阻害されたＷＩＳＰ-１結合を示す類似した競合曲線を示す。
【００９０】
Ｅ．グリコサミノグリカンへのＷＩＳＰ-１結合
プロテオグリカンに対するＷＩＳＰ-１の相互作用の特異性がデルマタン硫酸に限定されるかを理解するために、様々なプロテオグリカンの存在下におけるヒト皮膚線維芽細胞条件培地へのＷＩＳＰ-１の結合を評価した。ヒト皮膚線維芽細胞の無血清条件培地を上記のようにして調製した。50μlの条件培地を４℃で一晩マイクロプレートのウェルにコートし、非特異的結合部位を飽和させ、ウェルを様々な濃度の種々のグリコサミノグリカンの存在下において0.5nMのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧとともに室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、シグナルを色素生産物質を用いて発達させ、450nmのＯ.Ｄ.を測定した。図６は、コンドロイチン硫酸Ａ（黒い丸）；デルマタン硫酸（白い丸）；コンドロイチン硫酸Ｃ（黒い三角）；コンドロイチン硫酸Ｄ（白い三角）；コンドロイチン硫酸Ｅ（黒い四角）；ヘパリン（Ｘ）；ヘパラン硫酸（白い四角）を示す。
図６に示されるように、ＷＩＳＰ-１の結合は、増加した濃度の様々なプロテオグリカンの存在下において比例的に減少する。ＷＩＳＰ-１の結合は、3μg/mlのデルマタン硫酸、10.5μg/mlのコンドロイチン硫酸Ｄ又はヘパリン、30μg/mlのコンドロイチン硫酸Ｅ、75μg/mlのヘパラン硫酸、105μg/mlのコンドロイチン硫酸Ａで最大結合の５０％に達する。コンドロイチン硫酸Ｃの存在は、ＷＩＳＰ-１の結合を減少させなかった。このデータは、グリコサミノグリカンとＷＩＳＰ-１の相互作用がヒト皮膚線維芽細胞条件培地へのその結合を十分に調節することを示す。さらにＷＩＳＰ-１は、試験されたあらゆる他のグリコサミノグリカンよりもデルマタン硫酸に優れた特異性を示すことが表される。
【００９１】
Ｆ．ヒト皮膚線維芽細胞へのＷＩＳＰ-１の結合はデルマタン硫酸によって阻害される
細胞表面へのＷＩＳＰ-１の結合におけるプロテオグリカンを含むデルマタン硫酸の重要性を確かめるために、様々なグリコサミノグリカンの存在下において細胞結合分析を実施した。ヒト皮膚線維芽細胞をチャンバースライドに蒔いた。非特異的結合部位を飽和させ、1nMのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを50μg/mlのコンドロイチン硫酸Ａ（図７Ｂ）、デルマタン硫酸（図７Ｃ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（図７Ｄ）、コンドロイチン硫酸Ｄ（図７Ｅ）、コンドロイチン硫酸Ｅ（図７Ｆ）、ヘパリン（図７Ｇ）又はヘパラン硫酸（図７Ｈ）の存在下又は不存在下（図７Ａ）において室温で１時間インキュベートした。細胞を洗浄、固定し、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合をビオチニル化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた免疫蛍光及びＦＩＴＣコンジュゲートストレプトアビジンで終わる間接チラミド基質増幅法によって検出した。
何れの添加グリコサミノグリカンもない状態で、細胞表面へのＷＩＳＰ-１の結合は強い蛍光染色に達した。コンドロイチン硫酸Ｃ及びコンドロイチン硫酸Ｄは、それぞれおよそ２０％及び４６％までＷＩＳＰ-１結合を減少させ、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｅ、ヘパリン硫酸又はヘパリンはおよそ６０−７０％まで相互作用を減退させた（図７Ｉ）。一方、50μg/mlのデルマタン硫酸の存在下において、ヒト皮膚線維芽細胞表面へのＷＩＳＰ-１の結合は消失した。これらの結果は共に、ＷＩＳＰ-１がデルマタン硫酸により高い親和性を有し、この相互作用が細胞表面へのＷＩＳＰ-１の結合をもたらしうることを示す。
【００９２】
Ｇ．ヒト皮膚線維芽細胞に対するＷＩＳＰ-１結合は、コンドロイチナーゼＢでの細胞表面の消化によって消失する
デルマタン硫酸を含む小プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンとのＷＩＳＰ-１相互作用の間に、同じ形態の相互作用を通じて細胞表面に相互作用するかどうかは未だ決定されていなかった。この可能性に取り組むために、様々なグリコサミノグリカン脱離酵素で処理したヒト皮膚線維芽細胞の表面へのＷＩＳＰ-１の結合を分析した。ヒト皮膚線維芽細胞を、0.1UのコンドロイチナーゼＡＢＣ（図８Ｂ）、コンドロイチナーゼＢ（図８Ｃ）、コンドロイチナーゼＣ（図８Ｄ）、へパリナーゼ（図８Ｅ）の存在下、又は不存在下（図８Ａ）において、或いはｍＷＩＳＰ-１（図８Ｆ）の不存在下において３７℃で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、非特異的結合部位を飽和させ、1nMのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄の後、細胞を固定し、ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合をビオチニル化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた免疫蛍光及びＦＩＴＣコンジュゲートストレプトアビジンで終わる間接チラミド基質増幅法によって検出した。
図８Ａに示されるように、未処理のヒト皮膚線維芽細胞の表面に対するＷＩＳＰ-１の結合は、強い蛍光シグナルに達した。細胞をコンドロイチナーゼＡＢＣ又はコンドロイチナーゼＢで処理した場合、ＷＩＳＰ-１の結合は、ＷＩＳＰ-１が除かれたネガティブコントロールに相当するレベルに対して減少していた（それぞれ図８Ｂ、Ｃ及びＤ）。一方、コンドロイチナーゼＣ又はへパリナーゼで処理した細胞に対するＷＩＳＰ-１の結合は、分布又は強さに関して何の変更も示さなかった（図８、それぞれパネルＤ及びＥ）。これらの結果は、ヒト皮膚線維芽細胞の細胞表面へのＷＩＳＰ-１の結合はプロテオグリカンを含むデルマタン硫酸により媒介されることを示した。
【００９３】
Ｈ．デコリン及びバイグリカンはＷＩＳＰ-１ヒト皮膚線維芽細胞の結合を阻害する
ヒト皮膚線維芽細胞へのＷＩＳＰ-１の結合は、過剰なデコリン又はバイグリカンの存在下又は不存在下において評価された。ヒト皮膚線維芽細胞をチャンバースライドに撒き、非特異的結合部位を飽和させた。1ナノモルのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを1mg/mlのデコリン（図９Ａ）、バイグリカン（図９Ｂ）の存在下において、あるいは添加競合物のない状態で（図９Ｃ）室温で１時間インキュベートした。細胞を洗浄、固定し、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合をビオチニル化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた免疫蛍光及びＦＩＴＣコンジュゲートストレプトアビジンで終わる間接チラミド基質増幅法によって検出した。
図９に示されるように、デコリン又はバイグリカンの存在は、ヒト皮膚線維芽細胞とＷＩＳＰ-１の相互作用を部分的に阻害した。阻害は十分である（およそ８８％及び９４％）が、最も高い濃度の試験（1mg/ml）であっても、結合は完全には消失しなかった。これは、デコリン及びバイグリカンが細胞の細胞外マトリックスに存在するコラーゲンと相互作用する必要があるという能力によって説明することができる。
【００９４】
デコリン及びバイグリカンは、結合組織の細胞外マトリックスに存在する小さいロイシンリッチプロテオグリカンのファミリーのメンバーである。デコリンの分泌形態は36,319Daの中心タンパク質（Krusius等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:7683-7687 (1986)）及び４位のセリンに付着するデルマタン硫酸の単一のグリコサミノグリカン鎖からなる（Scott, PG, Dermatan Sulfate Proteoglycans: Chemistry,Biology, Chemical Pathology, Portoland Press, London, England, 1993）。バイグリカンの分泌形態は、２つのグリコサミノグリカン鎖、１つのデルマタン硫酸及び１つのコンドロイチン硫酸に代わる37,983Daの中心タンパク質からなる（Fisher等, J. Biol. Chem., 264:4571-4576 (1989)）。バイグリカン及びデコリンの中心タンパク質は約５５％のアミノ酸同一性で共有する。デコリンとバイグリカンの中心タンパク質の分子量は、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理の後に最も速い電気泳動移動性を有する上に挙げた２つのバンドの推定分子量に相当する。遅い方の移動バンドは、部分的に消化されたグリコサミノグリカン鎖を担持するデコリン及びバイグリカンに相当しうる。
デコリンは、ヒト皮膚の線維芽細胞表面でフィブロネクチン原繊維と共存する（Schmidt, G., Robenek, H., Harrach, B., Glossl, J., Nolte, V., Hormann, H., Richter, H. 及び Kresse, H., J. Cell. Biol, 104:1683-1691 (1987)）。細胞表面とのＷＩＳＰ-１相互作用は細胞外マトリックスに付着するデコリンによって媒介される可能性がある。免疫蛍光を用いて、ヒト皮膚線維芽細胞の表面でのデコリンの存在は上記のアッセイで確認した。また、デコリン及びバイグリカンは細胞表面に結合するＷＩＳＰ-１を有意に減少させることが示された。ヒト皮膚線維芽細胞とデコリン及びバイグリカンとの相互作用は、恐らくＷＩＳＰ-１結合の完全な阻害を阻止した。これらの結果は共に、デコリンがＷＩＳＰ-１に対する細胞表面結合部位として働くことができることを示した。
【００９５】
細胞膜又は細胞外マトリックスに関する幾つかのプロテオグリカンは、イズロン酸を含むことが示された。従って、ＷＩＳＰ-１はイズロン酸モチーフを示すヘパラン硫酸プロテオグリカンのコンドロイチン硫酸と相互作用することができる。また、様々なプロテオグリカンのグリコサミノグリカンのイズロン酸含量が組織分布によって異なることが示された。例えば、皮膚由来のデコリン及びバイグリカンはおよそ８０％のイズロン酸を含むが、軟骨ではそれらを４０％しか含まない（Choi等, J. Biol. Chem., 264:2876-2884 (1989)）。骨及びウシ鼻軟骨由来のバイグリカン及びデコリンのグリコサミノグリカン鎖は、イズロン酸を含まず、従ってコンドロイチン硫酸を含む（Fisher等, J. Biol. Chem. 262:9702-9708 (1987); Heinegard等, Biochem. J., 3:2042-2051 (1981)）。また、ＴＧＦ-β処理は、デコリン及びバイグリカンの側鎖のイズロン酸含量の１０〜１５％の減少を引き起こす（Malmstrom, A等, Dermatan Sulfate Proteoglycans:Chemistry, Biology, Chemical Pathology, Portoland Press, London, England, 1993）。従って、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン鎖のイズロン酸含量のレベルの変化によってＷＩＳＰ-１の相互作用を調節することができる。
【００９６】
バイグリカン及びデコリンは、様々な細胞外マトリックスタンパク質、サイトカイン及び細胞表面レセプターと相互作用することが知られている（Hocking等, Matrix Biol., 17:1-19 (1998)及びIozzo, R.V. J. Biol. Chem. 274:18843-18846 (1999)参照）。デコリン及びバイグリカンは形質転換成長因子-β（ＴＧＦ-β）と相互作用してその生物学的活性をネガティブに調節する（Hildebrand等, Biochem. J., 302:527-534 (1994)）。また、デコリンは、インビトロでｍＲＮＡレベル及びＴＧＦ-βタンパク質合成を減少させることが示された（Stander等, Gene Therapy, 5: 1187-1194 (1998)）。一方、デコリンの発現は、一般的に様々な細胞及び生物でＴＧＦ-βによって下方制御される（Iozzo, Ann. Rev. Biochem., 67:609-652 (1998)）。デコリン遺伝子のプロモーター領域はＴＧＦ-β-ネガティブ制御要素を含む。ＴＧＦ-β-ネガティブ制御要素はＴＧＦ-βによって下方制御された幾つかのプロテアーゼ遺伝子で見られ、デコリン遺伝子発現を抑制するように機能する（Iozzo, Experientia, 49: 447-455 (1993)）。さらに、デコリンの発現はヒト癌腫の悪性の性質と非常に関係する（Adany等, J. Biol. Chem., 265:11389-11396 (1990); Hunzlemann等, J. Invest. Sermatol., 104:509-513 (1995)）。それは多くの腫瘍組織で抑制され（Iozzo, 上掲、1993）及び幾つかの腫瘍細胞株でなくなる（Iozzo等, FASEB J., 10:598-614 (1996)）ことが分かった。しかしながら、デコリンの発現は腫瘍間質で増加する（Adany等, 上掲, 1991; Iozzo, 上掲、1993, Brown等, Clin. Cancer Res., 5:1041-1056 (1999)）。デコリンは、発ガン及び腫瘍の進行を促進する腫瘍によって放出されるＴＧＦ-βの潜在的なネガティブ制御物質である。デコリンは、ＴＧＦ-β依存性及び非依存性の機構によって幾つかの腫瘍の成長を直接抑制することが示され、腫瘍周辺間質でのその発現は、浸潤腫瘍性細胞に対する宿主結合組織細胞の局所的な応答を反映しうる（Stander等, 上掲, 1999）。
【００９７】
実施例２
ＷＩＳＰ-１及び他のＥＣＭタンパク質へのＣＨＯ細胞の接着
次のＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣ番号で同定）を10%のＦＢＳを含有するハム-Ｆ１２/ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）で維持した：
CHO-K1 (CCL-61)
CHO pgs A-745 (CRL-2242; プロテオグリカンを合成しない)
CHO pgs B-618 (CRL-2241; プロテオグリカンを合成しない)
CHO pgs D-677 (CRL-2244; ヘパラン硫酸を合成しない)
CHO pgs E-606 (CRL-2246; 十分に硫酸化されていないヘパラン硫酸を合成する)
Maxisorpプレートを４℃で一晩ＰＢＳの50μlのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ（5μg/ml）又はＢＳＡ３％（分画Ｖ、脂肪酸ウルトラフリー；べーリンガー・マンハイム社）溶液でコートした。次の日、ウェルの中身を吸引し、ウェルを室温で１時間200μl のＰＢＳ/３％ＢＳＡで遮断した。細胞を、2mMのＥＤＴＡを含有するＰＢＳにとり、凝集塊をピペットで壊し、次いで1000rpmで１０分間遠心分離した。上清を取り除き、細胞を１％のＢＳＡを含有する無血清ハム-Ｆ１２/ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）で２回洗浄した。
細胞を、１％のＢＳＡを含有する無血清ハム-Ｆ１２/ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）中に25x105細胞/mlで再懸濁した。50μlの無血清ハム-Ｆ１２/ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）/１％ＢＳＡを各ウェルに加え、続いて50μlの細胞懸濁物を加えた。ふたをせずにプレートを３７℃で２時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、上清が完全に取り除かれたら、プレートを−７０℃で保存した。
プレートを解凍し、分子プローブCyQUANT（モレキュラープローブ社）を添加した。蛍光を480nm-520nmで測定した。
結果を図１０に示す。
【００９８】
グリコサミノグリカン合成に障害のある突然変異ＣＨＯ細胞株を用いて、ＷＩＳＰ-１への細胞接着におけるプロテオグリカンの役割を確かめた。図１０に示されるように、グリコサミノグリカンの合成を完全に欠くＣＨＯ細胞株の何れも（ＣＨＯｐｇｓＡ及びＣＨＯｐｇｓＢ）、ＷＩＳＰ-１への接着が見られなかった。この結果は、ＷＩＳＰ-１へのＣＨＯ細胞の接着がプロテオグリカンのグリコサミノグリカン側鎖に完全に依存することを示す。一方、ヘパラン硫酸を欠く（ＣＨＯｐｇｓＤ）又は十分に硫酸化されていないヘパラン硫酸を合成するＣＨＯ細胞株は、正常なプロテオグリカンを合成するＣＨＯ-Ｋ１に比較して４０％減少したＷＩＳＰ-１結合を示した。これは、ＣＨＯ細胞のヘパラン硫酸プロテオグリカンがＷＩＳＰ-１への細胞接着を一部でのみもたらし、その硫酸化がその活性に必要であることを示す。従って、ＣＨＯｐｇｓＤ及びＣＨＯｐｇｓＥのプロテオグリカンの残りの分画であるデルマタン硫酸プロテオグリカンは、ＷＩＳＰ-１へのＣＨＯ細胞の接着のほとんどの原因である。
【００９９】
実施例３
ＷＩＳＰ-１及び他のＥＣＭタンパク質へのヒト皮膚線維芽細胞の接着
ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ７３５６）を10%のＦＢＳを含有するハム-Ｆ１２/ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）で維持した。Maxisorpプレートを４℃で一晩ＰＢＳの50μlのタンパク質（下に定義）溶液でコートした：
コラーゲンＩ、ヒト （2μg/ml）（ヒト；BioDesign社）
コラーゲンＩＩ、ヒト（2μg/ml）（ヒト；BioDesign社）
ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ（2μg/ml）（上記実施例１参照）
ＢＳＡ ３％ （分画Ｖ、脂肪酸ウルトラフリー；べーリンガー・マンハイム社）
次の日、ウェルの中身を吸引し、ウェルを室温で１時間200μl のＰＢＳ/３％ＢＳＡに浸けた。細胞を、15mMのＥＤＴＡを含有するＰＢＳにとり、凝集塊をピペットで壊した。細胞懸濁液を45μmのフィルターで濾過し、1000rpmで１０分間遠心分離した。
上清を取り除き、１％のＢＳＡを含有する無血清ハム-Ｆ１２/ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）で細胞を２回洗浄した。細胞を、１％のＢＳＡを含有する無血清ハム-Ｆ１２/ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）中に3x105細胞/mlで再懸濁した。次いで50μlの無血清ハム-Ｆ１２/ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）/１％ＢＳＡを100μg/mlのデルマタン硫酸（ブタの腸管粘膜由来のコンドロイチン硫酸Ｂ；シグマ社）；100μg/mlのヘパリン（ブタの腸管粘膜；シグマ）と共に又は何も添加せずに加えた。プレートを室温で１５分間インキュベートした。次いで50μlの細胞懸濁物を各ウェルに加え、ふたをせずにプレートを３７℃で２時間インキュベートした。その後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。クリスタルバイオレットで３０分間染色を実施した。次に水で洗浄した。Ｏ.Ｄ.を570nmで測定した。
結果を図１１に示す。
【０１００】
データは、ポジティブコントロール（コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩへの接着）よりも低い値であるがヒト皮膚線維芽細胞はＷＩＳＰ-１でコートしたウェルに接着することが示された（図１１）。100μg/mlのヘパリン又は100μg/mlのデルマタン硫酸の存在は、それぞれ３０％又は７０％までＷＩＳＰ-１への細胞接着を減少させた。同様の条件で、コラーゲンＩ及びＩＩへの細胞接着はあまり変化しなかった。これらの結果は、ＷＩＳＰ-１へのヒト皮膚線維芽細胞の接着がコラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩへの接着とは異なる機構によって媒介されることを示す。また、プロテオグリカンを含有するヘパリンはこの現象に関与できるが、ＷＩＳＰ-１へのヒト皮膚線維芽細胞の接着はデルマタン硫酸プロテオグリカンによって主に媒介されることが示される。
【０１０１】
実施例４
軟骨細胞の再分化アッセイ
軟骨細胞の分化における様々な濃度のＷＩＳＰ-１ポリペプチドの影響を測定する実験を構築した。軟骨細胞を培養するために、細胞外マトリックスを取り除く酵素で関節軟骨を消化した。こうして、この培養系の細胞環境はマトリックスが枯渇し軟骨細胞が「未成熟」な表現型に戻る傾向のある軟骨疾患の後期に見られるものと同様となりうる。
４−６月齢の雌のブタの中手指節関節を無菌で解剖し、下の骨を避けるように注意して関節軟骨をフリーハンドのスライシングによって取り出した。次に、これらの軟骨切片を３７℃で２５分間、無血清ハムＦ１２中の0.05%のトリプシンで消化した。培地を流し捨て、軟骨を３７℃で３０分間、無血清ハムＦ１２培地中の0.3%のコラゲナーゼＢで消化した。培地を流し捨て、軟骨をハムＦ１２中の0.06%のコラゲナーゼＢ＋10%のウシ胎児血清中で一晩消化した。次いで、細胞を７０ミクロンのナイロンフィルターで濾過し、無血清のハムＦ１２培地に蒔いた。単離した細胞を１０％のＦＢＳ及び4μg/mlのゲンタマイシンを含有するハムＦ-１２に25000細胞/cm2に蒔く。培地を３日毎に替え、細胞を５日毎に25000細胞/cm2まで再び蒔いた。１２日目に、血清なしの100μlの同じ培地5000細胞/ウェルで96ウェルプレートに細胞を蒔き、1%希釈で100μlのヒトＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ（図１７参照）を最終容積が200μl/ウェルになるまで添加した。３７℃で５日後、ステージ駆動式倒立顕微鏡を用いて各ウェルの写真を撮った。分化状態をユニバーサルイメージ社のMetamorphソフトウェアで形態学的に測定した。それぞれの写真で再分化した軟骨細胞に相当する周辺細胞をそれらの大きさ及び形によって選択するが、脱分化した表現型を有する平らな細胞を排除する。次に、写真上の選択された細胞によって覆われた全ての領域を測定し、ポジティブコントロール（スタウロスポリンによる再分化軟骨細胞）及びネガティブコントロール（未処理細胞）と比較した。
【０１０２】
結果の算出及び解釈は次のように導いた：
結果の算出：
Ｙ＝軟骨細胞の領域
再分化指数＝[(Ｙ−Ｙネガティブコントロール)/(Ｙポジティブコントロール−Ｙネガティブコントロール)]*１００
結果の解釈：
再分化指数が高いほど、ＷＩＳＰ分子は軟骨細胞の再分化を促進する。
結果のカットオフ：再分化指数＞４０→陽性の結果。
結果を図１２に示す。
【０１０３】
実施例５
コラーゲンＩＩの染色アッセイ
コラーゲンＩＩは軟骨細胞の好適なマーカーである。一次ブタ軟骨細胞を１０日間培地で間葉細胞に「脱分化」させた後、細胞はそのコラーゲンＩＩ発現が緩くなる傾向がある。上記のような軟骨細胞分化アッセイを実施した。３通りのウェルを(+)及び(-)コントロール、及び次の各タンパク質の二通りに５日間処理した：
ポジティブ−5nM (0.5μl/50ml)のスタウロスポリン
100nMのＩＧＦ-１
ネガティブ−培地のみ
試験− 100nMのヒトＷＩＳＰ-１-Ｈｉｓ
100nMのヒトＷＩＳＰ-２-Ｈｉｓ
100nMのヒトＷＩＳＰ-３-Ｈｉｓ
（ＷＩＳＰポリペプチド構築物は各ＷＩＳＰポリペプチドに接着したＮ末端Ｈｉｓタグを用いて調製した）。
（実施例４に記載されるように）倒立顕微鏡を用いて写真を撮った後、細胞を室温で１５分間７０％のエチルアルコールで固定し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。プレートをＰＢＳ/３％ＢＳＡで６０分間200μl/ウェルで遮断した。処理したウェルを、１：２０００に希釈しつつ室温で１時間マウス抗コラーゲンＩＩ（Neomarker-5 B2.5）を含有するＰＢＳ/３％ＢＳＡで処理した。プレートを再びＰＢＳ/０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。
【０１０４】
洗浄に続き、プレートを１：１０００のベクタービオチニル化抗マウス含有ＰＢＳ/０．１％ＢＳＡと共に室温で３０分間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳで２分間３回洗浄した。
細胞を室温で１０分間４％のパラホルムアルデヒド含有ＰＢＳで固定し、次いでＴＢＳ（50mMのトリス-ＨＣｌ、150mMのＮａＣｌ、ｐＨ８）＋０．３％のＢＳＡで３分間２回洗浄した（500μl/ウェル）。次に、Dupont HRP-ストレプトアビジン１：１０００含有ＴＢＳ＋１％のＢＳＡと共に３０分間インキュベートする（100μl/ウェル）。この後、ＴＢＳ＋０．１％のＢＳＡで４分間３回洗浄する（500μl/ウェル）。次に、ビオチニル化チラミドとともに増幅希釈液（NEN Dupont）の１：５０で１０分間インキュベートする（100μl/ウェル）。インキュベートに続いて、ＴＢＳ＋０．１％ＢＳＡで４分間３回洗浄した（500μl/ウェル）。
次のインキュベーションにおいて、ＤＡＫＯ ＦＩＴＣ-ストレプトアビジンを１：１０００含むＴＢＳ含有ＨＢＳ-Ｃ＋１％ＢＳＡを３０分間添加した（100μl/ウェル）。次いで、ＰＢＳで簡単に洗浄した。最後に、１：１０００ヘキスト含有ＰＢＳ（100μl/ウェル）を添加し、次いで倒立顕微鏡を用いて評価した。
データを図１３に示す。ポジティブコントロール（スタウロスポリン及びＩＧＦ-１）はコラーゲンＩＩを強度に染色したが、ネガティブコントロールは全く染色が示されなかった。100nMのＷＩＳＰ-１又はＷＩＳＰ-２又はＷＩＳＰ-３で処理した細胞は、コラーゲンＩＩの強いポジティブ染色を示した。このデータは、ＷＩＳＰタンパク質が培地中の一次ブタ軟骨細胞の再分化を促進したことを示した。
【０１０５】
実施例６
関節軟骨移植アッセイ
この実験は、軟骨マトリックス代謝回転におけるＷＩＳＰポリペプチドの合成及び予防可能性の両方を試験する。この可能性は、関節軟骨におけるマトリックス（即ち、プロテオグリカン）合成と分解、並びに酸化窒素の合成を測定することにより決定される。これらのパラメータは、インターロイキン１αの存在及び不存在で評価される。関節軟骨外植片は培養において初代細胞の間、いくつかの利点を有する。第１に、恐らく最も重要であるが、外植片中の細胞は生体内での組織構造に組み込まれたままである。第２に、これらの外植片は、生体外で組織向上性を保持できる間の数週間、表現型的に安定である。最後に、初代細胞と異なり、外植片はマトリックス分解の測定に使用できる。軟骨外植片を準備するために、関節軟骨を解剖し、細かく刻んで、コラーゲン網を破壊し、培地中にプロテオグリカンを放出させなければならない。従って、このシステムは、マトリックスが次第に消耗した関節炎等の変性状態を模倣する。
４−６月齢の雌ブタの中手指節関節が上記のようにして無菌的に開かれる。軟骨は、細かく刻まれ、洗浄され、バルクで少なくとも２４時間３７℃で外植片培地、即ち0.1%ＢＳＡ、100U/ml ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、2mMのＬ-グルタミン、0.1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、20μg/mlのゲンタマイシン（Gibco）、1.25mg/LのアムホテリシンＢ（Sigma）を含有する無血清（ＳＦ）ＬＧ ＤＭＥＭ/Ｆ１２培地において５％のＣＯ２で培養される。関節軟骨をマイクロチューブに等分（１チューブにつき約55mg）し、少なくとも２４時間上記培地中でインキュベートする。培地を回収し、種々の時点（例えば、０，２４，４８，７２時間）で新しい培地（培地のみ又はＷＩＳＰポリペプチド（ＩｇＧ融合構築物）と共に）を加えた。
【０１０６】
種々の時点で収集された培地を、上記されるように、Farndale及びButtle. Biochem. Biophys. Acta 883:173-177(1985)の１,９-ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）比色定量アッセイを用いてプロテオグリカン含量についてアッセイした。時間０におけるＰＧ放出を基準測定値として使用し、特に高い又は低いＰＧ放出を有する任意の試料をＷＩＳＰ-１ポリペプチドでの処置前に捨てた。全ての処理の間、結果は５つの各試料の平均を示す。
最初の処理の４８時間後、３５Ｓ-硫酸塩を新しい培地（試験化合物を含有又は無し）とともに10μＣｉ/mlの最終濃度で軟骨外植片に添加した。３７℃での更なる１２−１７時間のインキュベーションの後、培地を取り除き、次のＰＧ及び酸化窒素（ＮＯ）分析に備えた。軟骨片を外植片用培地を用いて２回洗浄し、900mLの反応容積の10mMのＥＤＴＡ、0.1Mのリン酸ナトリウム及び1mg/mlのプロテイナーゼＫ（Gibco BRL）中、５０℃で一晩消化した。消化反応物を10%Ｗ／Ｖ塩化セチルピリジニウム（Sigma）と混合して（２：１）プロテオグリカンを沈殿させ、1000ｘ gで１５分間遠心した。上清を除去し、沈殿物を溶解させるためにギ酸（500mL、Sigma）を添加した。次いで試料を10mlのシンチレーション液（ＩＣＮ）を含むバイアルに移し、シンチレーションカウンターで読み取った。
【０１０７】
７２時間後、残りの関節軟骨外植片を上記のようにして消化し、ＤＭＭＢ比色アッセイ（上記されている）を用いてプロテオグリカン含量を検定した。
関節軟骨移植片をＷＩＳＰ-３（図１４）又はＷＩＳＰ-１（図１５Ａ）の何れかで処理し、基礎及びＩＬ-１α誘発軟骨マトリックス破壊を減少させた。さらに、ＷＩＳＰ-１は基礎及びＩＬ-１α誘発一酸化窒素生成の何れも抑制した（図１５Ｂ）
これらの結果は、ＷＩＳＰポリペプチドが軟骨異化を防御できることを示す。一酸化窒素とＩＬ-１αの両方の上昇したレベルが罹患した間接で見られるという事実があるとすれば、ＩＬ-１αの活性化と一酸化窒素の生成を阻害するＷＩＳＰポリペプチドの能力は、ＷＩＳＰポリペプチドが関節炎軟骨の組織障害の程度を低減させることができることを示唆する。
【０１０８】
実施例７
ＷＩＳＰ-２を発現する遺伝子組換えマウス
インビトロでＷＩＳＰポリペプチドの効果を試験するために、ミオシン軽鎖プロモーターによって筋肉にＷＩＳＰ-２を過剰発現する遺伝子組換えマウスを作成した。遺伝子組換えは、当分野で公知の技術（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Beddington等, Cold Spring Harbor Press, 1994; Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, New York, 1994）を用いて作成した。これらのマウスの骨を標準的な組織学によって１４周齢で試験した。動物を屠殺した後、骨を４％緩衝ホルマリンで固定し、続いてFormical(商品名)で４−８時間脱灰した。次いで試料をパラフィン包埋し、組織学評価をした。３ミクロンの厚さの切片にし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
図１６に示されるように、硝子軟骨区画（つまり成長プレート及び関節軟骨）の膨張が見られる。これらの結果は、軟骨細胞分化の誘発及び軟骨マトリックス破壊の阻害のためのＷＩＳＰポリペプチドの能力を示す上記の実施例に示される結果と一致する。従って、ＷＩＳＰポリペプチドは、インビボの軟骨組織において潜在的な影響を有しうる。このような活性を有するポリペプチドをもつ関節炎個体の治療、つまり軟骨の量を増加させるものは、関節炎患者に生じうる障害及び間接破壊を防止しうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ−１Ｇは異なった細胞株へのＷＩＳＰ-１の結合性を示している。細胞をチャンバースライドに蒔き、一晩培養した。次の日に、非特異的結合部位をブロックし、細胞を１ｎＭのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧと共に（１Ａ及び１Ｂ）又はｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧなしで（１Ｃ）１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる免疫蛍光法と、間接的チラミド基質増幅法の次にＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンを用いて検出した。１Ａでは、ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧが結合した細胞株がグループ分けされている。写真はｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ結合に続くＮＲＫ細胞表面上に見出される典型的な蛍光シグナルを表している。１Ｂでは、ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧが結合しなかった細胞株がグループ分けされている。写真はｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ結合に続くＲＡＧ細胞表面上に見出される典型的な蛍光シグナルを表している。１Ｃの写真は、ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧが結合手順から省かれた場合にＮＲＫ細胞の表面上に見出される典型的な蛍光シグナルを表している。スライドに取り付けたヒト大腸腫瘍切片を室温にして洗浄し、飽和させ、ＨＢＳ-Ｃ／３％ＢＳＡ及び１ｎＭのＷＩＳＰ-１-Ｆｃ中で１時間インキュベートした（１Ｄ及び１Ｅ）。平行して、ビメンチンの免疫蛍光検出を実施例１に記載した隣接する切片について実施した（１Ｆ及び１Ｇ）。
【図２】 図２Ａ−２Ｂは、ヒト皮膚線維芽細胞馴化培地へのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を示している。「ＷＩＳＰ-１結合因子の精製」の項に記載したようにしてヒト皮膚線維芽細胞の無血清馴化培地を調製した。馴化培地の５０マイクロリットルをマイクロタイターウェル中で二組コートした。非特異的結合部位を、３％のＢＳＡを含むＨＢＳ-Ｃと共にインキュベーションすることによって飽和させ、ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧと共に２時間ウェルをインキュベートした。ウェルを洗浄し、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧＦｃ'と共に１時間インキュベートした。０．３％ＢＳＡを含むＨＢＳ-Ｃでの６回の洗浄後、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ発色体基質を使用してシグナルを可視化した。反応を１Ｍのリン酸で停止させ、４５０ｎｍのＯＤを測定した。２Ａは、連続希釈した馴化培地でコートしたウェルに対する１ｎＭのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を示し；２Ｂは０．５μｌのヒト皮膚線維芽細胞馴化培地でコートしたウェルに対するｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの連続希釈物の結合を示す。
【図３】 図３Ａ−３Ｂは、ヒト皮膚線維芽細胞馴化培地のコンドロイチナーゼＢ感受性因子へのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を示している。３Ａでは、馴化培地の５０マイクロリットルをマイクロタイターウェル中で二組コートし、非特異的結合部位を、３％のＢＳＡを含むＨＢＳ-Ｃと共にインキュベーションすることによって飽和させた。１ナノモルのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを、１ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ又は０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０の不存在下又は存在下で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧＦｃ'と共に１時間インキュベートした。０．３％ＢＳＡを含むＨＢＳ-Ｃでの６回の洗浄後、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ発色体基質を使用してシグナルを可視化した。反応を１Ｍのリン酸で停止させ、４５０ｎｍのＯＤを測定した。３Ｂでは、０．５Ｕ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃｈ ＡＢＣ）、０．５Ｕ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＣＩＩ（Ｃｈ ＡＣＩＩ）、０．５Ｕ／ｍｌのコンドロイチナーゼＢ（Ｃｈ Ｂ）、０．５Ｕ／ｍｌのコンドロイチナーゼＣ（Ｃｈ Ｃ）、０．５Ｕ／ｍｌのコンドロイチン-４-スルファターゼ（Ｃｈ-４-Ｓｕｌｆ）、０．５Ｕ／ｍｌのコンドロイチン-６-スルファターゼ（Ｃｈ-６-Ｓｕｌｆ）、０．５Ｕ／ｍｌのヘパリナーゼ（Ｈｅｐ）、０．５Ｕ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｈｙａｌ）、０．５Ｕ／ｍｌのノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍ）又は１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔ Ｋ）を含む５０μｌのＨＢＳ-Ｃをコートしたウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルを十分に洗浄し、非特異的結合部位を飽和させ、１ｎＭのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を測定した。
【図４】 図４Ａ−４Ｂは、ヒト皮膚線維芽細胞馴化培地からのＷＩＳＰ-１結合因子の精製を示している。４Ａでは、ヒト皮膚線維芽細胞からの無血清馴化培地を培養の３日後に収集し、濃縮し、２０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．４及び３００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液に移し、Ｑ-セファロース陰イオン交換クロマトグラフィーカラムにかけた。カラムを洗浄し、保持されたタンパク質を増加する濃度のＮａＣｌで脱着させた。ＷＩＳＰ-１結合因子の存在を、固相結合アッセイを用いて各画分において分析した。４Ｂでは、画分１５（図４Ａでａ＊で示した）を、０．１ＵのコンドロイチナーゼＡＢＣの存在下（＋）又は不存在下（−）で３７℃にて２時間インキュベートした。サンプルを還元条件下でＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離し、ゲルを銀染色した。示されたバンドは質量分析によって同定した。
【図５】 図５Ａ−５Ｂはデコリン及びバイグリカンへのＷＩＳＰ-１結合を示す。５Ａでは、マイクロタイターウェルをデコリン（塗りつぶした円）又はバイグリカン（白抜きの円）の連続希釈物でコートした。非特異的結合部位を飽和させ、０．２５ｎＭのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを２時間インキュべートした。ウェルを洗浄し、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧＦｃ'（2μg/ml）と共に１時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ-２０を含むＰＢＳでの６回の洗浄後、発色体基質のインキュベーションによってシグナルを明らかにした。発色を１Ｍのリン酸で停止させ、４５０ｎｍのＯＤを測定した。５Ｂでは、ヒト皮膚線維芽細胞馴化培地の５０ミリリットルをマイクロタイタープレートのウェル中でコートした。非特異的結合部位を飽和させ、０．２５ｎＭのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを、様々な濃度のデコリン（塗りつぶした円）又はバイグリカン（白抜きの円）の存在下で２時間インキュベートした。ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合は５Ａに記載したようにして評価した。
【図６】 図６はグリコサミノグリカンへのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ結合を示す。ヒト皮膚線維芽細胞の無血清馴化培地を以下の実施例に記載したようにして調製した。５０μｌの馴化培地をマイクロプレートのウェル中で４℃にて一晩コートし、非特異的結合部位を飽和させ、ウェルを、様々な濃度の異なったグリコサミノグリカンの存在下で０．５ｎＭのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧと共に室温で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、発色体基質を用いてシグナルを明らかにし、４５０ｎｍのＯ.Ｄ.を測定した。コンドロイチン硫酸Ａ（塗りつぶした円）；デルマタン硫酸（白抜きの円）；コンドロイチン硫酸Ｃ（塗りつぶした三角）；コンドロイチン硫酸Ｄ（白抜きの三角）；コンドロイチン硫酸Ｅ（塗りつぶした四角）；ヘパリン（Ｘ）；ヘパリン硫酸（白抜きの四角）。
【図７】 図７Ａ−７Ｉは、ヒト皮膚線維芽細胞へのＷＩＳＰ-１の結合についてデルマタン硫酸が競合することを示している。ヒト皮膚線維芽細胞をチャンバースライドに蒔いた。非特異的結合部位を飽和させ、１ｎＭのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを、（７Ｂ）５０μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ａ（「ＣＳＡ」）、デルマタン硫酸（「ＤＳ」）；（７Ｃ）、コンドロイチン硫酸Ｃ（「ＣＳ Ｃ」）；（７Ｄ）、コンドロイチン硫酸Ｄ（「ＣＳ Ｄ」）；（７Ｅ）、コンドロイチン硫酸Ｅ（「ＣＳ Ｅ」）（７Ｆ）；ヘパリン（「Ｈｅｐ」）（７Ｇ）又はヘパラン硫酸（「ＨＳ」）（７Ｈ）の存在下で又は不存在下（図７Ａ）で室温で１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる免疫蛍光法と、間接的チラミド基質増幅法の次にＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンを用いて検出した。得られたデジタル画像の相対的蛍光強度を形態計測分析を用いて測定した（７Ｉ）。
【図８】 図８Ａ−８Ｇは、ヒト皮膚線維芽細胞へのＷＩＳＰ-１結合が、コンドロイチナーゼＢでの細胞表面の消化によって消滅することを示している。ヒト皮膚線維芽細胞を、０．１ＵのコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃｈ ＡＢＣ）；（８Ｂ）、コンドロイチナーゼＢ（「Ｃｈ Ｂ」）；（８Ｃ）、コンドロイチナーゼＣ（「Ｃｈ Ｃ」）；（８Ｄ）、ヘパリナーゼ（「Ｈｅｐ」）（８Ｅ）の不存在下（８Ａ）又は存在下で、３７℃にて２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、非特異的結合部位を飽和させ、１ｎＭのＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを室温で１時間インキュべートした。３回の洗浄後、細胞を固定し、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合をビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる免疫蛍光法と、間接的チラミド基質増幅法の最後にＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンを用いて検出した。図８Ｆは未消化の細胞が使用されたが、ｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧが結合手順から省かれた負のコントロールを示している。得られたデジタル画像の相対的蛍光強度を形態計測分析を用いて測定した（８Ｇ）。
【図９】 図９Ａ−９Ｄは、ヒト皮膚線維芽細胞へのＷＩＳＰ-１の結合についてデコリンとバイグリカンが競合することを示している。ヒト皮膚線維芽細胞をチャンバースライドに蒔き、非特異的結合部位を飽和させた。１ナノモルのｍＷＩＳＰ-１-ＩｇＧを、１ｍｇ／ｍｌのデコリン（９Ａ）又はバイグリカン（９Ｂ）の存在下で、又は加えた競合剤の不存在下で（９Ｃ）室温にて１時間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの結合を、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる免疫蛍光法と、間接的チラミド基質増幅法の最後にＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンを用いて検出した。得られたデジタル画像の相対的蛍光強度を形態計測分析を用いて測定した（９Ｄ）。
【図１０】 図１０はＷＩＳＰ-１に対するＣＨＯ細胞の異なった変異体の付着を示している。細胞を２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に取った後、洗浄し、１％ＢＳＡを含む無血清Ｈａｍ-Ｆ１２／ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、ＷＩＳＰ-１をコートしたマイクロタイターウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳを用いて３Ｘ洗浄し、上清を除き、付着細胞数を、Molecular ProbesのCyQUANTを用いて測定した。ＷＩＳＰ-１をコートしたマイクロタイターウェルへのＣＨＯ-Ｋ１細胞の付着を１００％として使用し、全ての値を、ＢＳＡでコートしたマイクロタイターウェルへの非特異的接着に対して補正した。
【図１１】 図１１はＷＩＳＰ-１に対するヒト皮膚線維芽細胞の付着を示している。細胞を１５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に取った後、洗浄し、１％ＢＳＡを含む無血清Ｈａｍ-Ｆ１２／ＬＧＤＭＥＭ（５０：５０）中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、１００μｇ／ｍｌのデルマタン硫酸（つまりコンドロイチン硫酸Ｂ）又はヘパリンの不存在又は存在下でマイクロタイターウェルに加えた。３７℃で２時間後、ウェルをＰＢＳを用いて３Ｘ洗浄し、上清を除き、付着細胞数をクリスタルバイオレット染色によって測定した。全ての値はＢＳＡでコートしたマイクロタイターウェルへの非特異的接着に対して補正した。
【図１２】 軟骨細胞分化アッセイの結果を示す。
【図１３】 コラーゲンＩＩ染色アッセイの結果を示す。
【図１４】 軟骨基質破壊アッセイの結果を示す。示されたデータは、ＷＩＳＰ-３が軟骨基質の破壊を減少させることを示している。関節軟骨移植片を培地だけで（−）又は１５０ｎｇ／ｍｌのＷＩＳＰ-３で（ＷＩＳＰ３−）、又は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１αだけを有する培地中で（＋）又はＩＬ-１αプラスＷＩＳＰ-３（ＷＩＳＰ３＋）で３日間処理した。軟骨基質の破壊は、ＤＭＭＢアッセイを使用して培地中のプロテオグリカン量を測定することによって決定した。
【図１５】 図１５Ａ−１５ＢはＷＩＳＰ-１が軟骨基質破壊と一酸化窒素の生成を阻害することを示している。関節軟骨移植片を培地だけで（−）又は１．１ｎＭのＷＩＳＰ-１で（ＷＩＳＰ１−）、又は１ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１αだけを有する培地中で（＋）又はＩＬ-１αとＷＩＳＰ-１（ＷＩＳＰ１＋）で３日間処理した。図１５Ａでは、軟骨基質の破壊を、ＤＭＭＢアッセイを使用して培地中のプロテオグリカン量を測定することによって決定した。図１５Ｂでは、一酸化窒素（ＮＯ）の生成を、グリース反応を使用して培地中のＮＯ量を測定することによって決定した。
【図１６】 図１６はＷＩＳＰ-２を過剰発現するトランスジェニックマウスの骨格表現型を示す。その骨格筋中にＷＩＳＰ-２を過剰発現する１４週齢の野生型（右のパネル）又はトランスジェニック（左のパネル）マウスの大腿骨の組織切片が示されている。野生型マウスのものに対してトランスジェニックマウスにおいて硝子軟骨の領域、すなわち成長板と関節軟骨の拡大が見られる。また、軟骨基質の領域がトランスジェニックの皮質骨中に存在しているようであるが、野生型マウスでは存在しない。
【図１７】 図１７はヒトＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ（配列番号：１）；マウスＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ（配列番号：２）；「野生型」ヒトＷＩＳＰ-１（配列番号：３）；「野生型」マウスＷＩＳＰ-１（配列番号：４）；及びヒトＩｇＧタグ（配列番号：５）のアミノ酸配列を示す。
【図１８】 図１８はＷＩＳＰ-３-ＩｇＧ（配列番号：６）；「交互」ＷＩＳＰ-３-ＩｇＧ（配列番号：７）；ＷＩＳＰ-３（配列番号：８）；及びＷＩＳＰ-３-「ロング５’スプライシング」（配列番号：９）のアミノ酸配列を示す。
【図１９】 図１９はヒトＷＩＳＰ-２のアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【配列表】
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Claims (36)

  1. 変性軟骨性疾患を治療するための医薬であって：
    ａ）配列番号：３のアミノ酸２３から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：３のアミノ酸１から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｄ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）又はｂ）のポリペプチドの断片；
    ｅ）配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｆ）配列番号：１０のアミノ酸１から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｇ）ｅ）又はｆ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｈ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ｅ）又はｆ）のポリペプチドの断片；
    ｉ）配列番号：９のアミノ酸３４から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｊ）配列番号：９のアミノ酸１から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｋ）配列番号：８のアミノ酸１６から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｌ）配列番号：８のアミノ酸１から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｍ）ｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-３ポリペプチド；及び
    ｎ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドの断片；
    からなる群から選択されるＷＩＳＰポリペプチドの有効量を含んでなる医薬。
  2. 前記ＷＩＳＰポリペプチドが：
    ａ）配列番号：３のアミノ酸２３から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：３のアミノ酸１から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｄ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）又はｂ）のＷＩＳＰ-１ポリペプチドの断片；
    から選択されるポリペプチドである、請求項１に記載の医薬。
  3. 前記ＷＩＳＰ-１ポリペプチドが配列番号：３のアミノ酸２３から３６７を含む、請求項２に記載の医薬。
  4. 前記ＷＩＳＰ-１ポリペプチドが一又は複数のポリエチレングリコール分子に結合している、請求項２に記載の医薬。
  5. 前記ＷＩＳＰ-１ポリペプチドがエピトープタグ又は免疫グロブリン分子に結合している、請求項２に記載の医薬。
  6. 前記ＷＩＳＰポリペプチドが：
    ａ）配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：１０のアミノ酸１から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-２ポリペプチド；及び
    ｄ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）又はｂ）のＷＩＳＰ-２ポリペプチドの断片；
    から選択されるポリペプチドからなる、請求項１に記載の医薬。
  7. 前記ＷＩＳＰ-２ポリペプチドが配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０を含む、請求項６に記載の医薬。
  8. 前記ＷＩＳＰ-２ポリペプチドが一又は複数のポリエチレングリコール分子に結合している、請求項６に記載の医薬。
  9. 前記ＷＩＳＰ-２ポリペプチドがエピトープタグ又は免疫グロブリン分子に結合している、請求項６に記載の医薬。
  10. 前記ＷＩＳＰポリペプチドが：
    ａ）配列番号：９のアミノ酸３４から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：９のアミノ酸１から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｃ）配列番号：８のアミノ酸１６から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｄ）配列番号：８のアミノ酸１から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-３ポリペプチド；及び
    ｆ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のポリペプチドの断片；
    から選択されるポリペプチドからなる、請求項１に記載の医薬。
  11. 前記ＷＩＳＰ-３ポリペプチドが配列番号：９のアミノ酸３４から３７２を含む、請求項１０に記載の医薬。
  12. 前記ＷＩＳＰ-３ポリペプチドが配列番号：８のアミノ酸１６から３５４を含む、請求項１０に記載の医薬。
  13. 前記ＷＩＳＰ-３ポリペプチドが一又は複数のポリエチレングリコール分子に結合している、請求項１０に記載の医薬。
  14. 前記ＷＩＳＰ-３ポリペプチドがエピトープタグ又は免疫グロブリン分子に結合している、請求項１０に記載の医薬。
  15. 前記軟骨が関節軟骨である、請求項１に記載の医薬。
  16. 前記変性軟骨性疾患がリウマチ様関節炎又は変形性関節症である、請求項１に記載の医薬。
  17. 前記変性軟骨性疾患がリウマチ様関節炎である、請求項１６に記載の医薬。
  18. ＷＩＳＰポリペプチドが製薬的に許容可能な担体中に含まれる、請求項１に記載の医薬。
  19. 傷害により損傷を受けた哺乳動物軟骨細胞又は軟骨組織を治療するための医薬であって：
    ａ）配列番号：３のアミノ酸２３から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：３のアミノ酸１から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｄ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）又はｂ）のポリペプチドの断片；
    ｅ）配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｆ）配列番号：１０のアミノ酸１から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｇ）ｅ）又はｆ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｈ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ｅ）又はｆ）のポリペプチドの断片；
    ｉ）配列番号：９のアミノ酸３４から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｊ）配列番号：９のアミノ酸１から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｋ）配列番号：８のアミノ酸１６から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｌ）配列番号：８のアミノ酸１から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｍ）ｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-３ポリペプチド；及び
    ｎ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドの断片；
    からなる群から選択されるＷＩＳＰポリペプチドの有効量を含んでなる医薬。
  20. 傷害が、マイクロダメージ又は鈍的外傷、軟骨骨折、骨軟骨骨折あるいは腱、半月板、もしくは靱帯の損傷である、請求項１９に記載の医薬。
  21. 前記ＷＩＳＰポリペプチドが、哺乳動物の前記軟骨細胞又は軟骨組織又は関節中への注射により哺乳動物に投与される、請求項１９に記載の医薬。
  22. 前記ＷＩＳＰポリペプチドが：
    ａ）配列番号：３のアミノ酸２３から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：３のアミノ酸１から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｄ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）又はｂ）のポリペプチドの断片；
    から選択されるポリペプチドである、請求項１９に記載の医薬。
  23. 前記ＷＩＳＰ-１ポリペプチドが配列番号：３のアミノ酸２３から３６７を含む、請求項２２に記載の医薬。
  24. 前記ＷＩＳＰ-１ポリペプチドが一又は複数のポリエチレングリコール分子に結合している、請求項２２に記載の医薬。
  25. 前記ＷＩＳＰ-１ポリペプチドがエピトープタグ又は免疫グロブリン分子に結合している、請求項２２に記載の医薬。
  26. 前記ＷＩＳＰポリペプチドが：
    ａ）配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：１０のアミノ酸１から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｄ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）又はｂ）のポリペプチドの断片；
    から選択されるポリペプチドからなる、請求項１９に記載の医薬。
  27. 前記ＷＩＳＰ-２ポリペプチドが配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０を含む、請求項２６に記載の医薬。
  28. 前記ＷＩＳＰ-２ポリペプチドが一又は複数のポリエチレングリコール分子に結合している、請求項２６に記載の医薬。
  29. 前記ＷＩＳＰ-２ポリペプチドがエピトープタグ又は免疫グロブリン分子に結合している、請求項２６に記載の医薬。
  30. 前記ＷＩＳＰポリペプチドが：
    ａ）配列番号：９のアミノ酸３４から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：９のアミノ酸１から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｃ）配列番号：８のアミノ酸１６から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｄ）配列番号：８のアミノ酸１から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｆ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）、ｂ）、ｃ）又はｄ）のポリペプチドの断片；
    から選択されるポリペプチドからなる、請求項１９に記載の医薬。
  31. 前記ＷＩＳＰ-３ポリペプチドが配列番号：９のアミノ酸３４から３７２を含む、請求項３０に記載の医薬。
  32. 前記ＷＩＳＰ-３ポリペプチドが配列番号：８のアミノ酸１６から３５４を含む、請求項３０に記載の医薬。
  33. 前記ＷＩＳＰ-３ポリペプチドが一又は複数のポリエチレングリコール分子に結合している、請求項３０に記載の医薬。
  34. 前記ＷＩＳＰ-３ポリペプチドがエピトープタグ又は免疫グロブリン分子に結合している、請求項３０に記載の医薬。
  35. ＷＩＳＰポリペプチドが製薬的に許容可能な担体中に含まれる、請求項１９に記載の医薬。
  36. （イ）軟骨性疾患の治療に有効な組成物であって：
    ａ）配列番号：３のアミノ酸２３から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｂ）配列番号：３のアミノ酸１から３６７を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｃ）ａ）又はｂ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
    ｄ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ａ）又はｂ）のポリペプチドの断片；
    ｅ）配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｆ）配列番号：１０のアミノ酸１から２５０を含んでなるＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｇ）ｅ）又はｆ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-２ポリペプチド；
    ｈ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ｅ）又はｆ）のポリペプチドの断片；
    ｉ）配列番号：９のアミノ酸３４から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｊ）配列番号：９のアミノ酸１から３７２を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｋ）配列番号：８のアミノ酸１６から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｌ）配列番号：８のアミノ酸１から３５４を含んでなるＷＩＳＰ-３ポリペプチド；
    ｍ）ｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、軟骨細胞の増殖又は分化を刺激するＷＩＳＰ-３ポリペプチド；及び
    ｎ）軟骨細胞の増殖又は分化を刺激する、ｉ）、ｊ）、ｋ）又はｌ）のポリペプチドの断片；
    からなる群から選択されるＷＩＳＰポリペプチドの有効量を含有する組成物を収容する容器と、
    （ロ）軟骨性疾患の治療のために前記ＷＩＳＰポリペプチドを使用するための指示書とを含んでなる製造品。
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