EA013821B1

EA013821B1 - Проостровковые пептиды человека, их производные и аналоги и способы их применения

Info

Publication number: EA013821B1
Application number: EA200702625A
Authority: EA
Inventors: Лорейн В. Упхэм; Клареса С. Леветан
Original assignee: Кьюрдм, Инк.
Priority date: 2005-05-25
Filing date: 2006-05-25
Publication date: 2010-08-30
Also published as: CA2726759A1; US7393919B2; CA2609667C; US8383578B2; EP2295066A1; EA200702625A1; US20080300190A1; US7714103B2; US20100093605A1; US20110280833A1; CA2609667A1; WO2006128083A2; EP1883417A2; JP2008545712A; US8829158B2; US20130190233A1; WO2006128083A3; US20150056167A1; CA2726759C; EP2295066B1

Abstract

Проостровковые пептиды человека (HIP) и их аналоги и производные, полученные из последовательности человеческого протеина REG3A или гомологичные в плане последовательности человеческому протеину REG3A, хромосома 2р12, способны вызвать островковый неогенез из эндогенных панкреатических клеток-предшественников. Проостровковые пептиды человека используют либо по отдельности, либо в сочетании с другими фармацевтическими препаратами для лечения диабета 1- и 2-го типа или иных патологий, связанных с аберрантным глюкозным, углеводородным и/или липидным метаболизмом, резистентностью к инсулину, избыточным весом, ожирением, синдромом поликистозных яичников, расстройством пищевого поведения и метаболическим синдромом.

Description

Настоящее изобретение относится к пептидам и их аналогам и к способам их использования для лечения сахарного диабета 1-го типа, сахарного диабета 2-го типа и иных заболеваний. Настоящее изобретение относится к областям молекулярной биологии, биологии, химии, медицинской химии и фармакологии.

Предпосылки создания изобретения

С 1922 года инсулин являлся единственным терапевтическим средством для лечения сахарного диабета 1-го типа и иных состояний, связанных с отсутствием инсулина либо со снижением эффективности выработки инсулина организмом. Тем не менее в организме больных сахарным диабетом, использующих инсулин, не протекал нормальный глюкозный метаболизм, так как инсулин является лишь частью недостающей и нарушенной функции поджелудочной железы. Несмотря на десятилетия проведенных исследований, внедрение в 1974 году операций по трансплантации панкреатических островков и на последние заявления относительно успеха использования протокола Эдмонтона для трансплантации панкреатических островков, указанные методы не оказались достаточно эффективными в Соединенных Штатах. Например, спустя четыре года после проведения трансплантации островков, менее 10% пациентов, которым были пересажены островки, оставалось инсулинозависимыми. Кроме того, у 18% пациентов наблюдались серьезные побочные эффекты.

Исследователи также проводили исследования на предмет того, возможно ли стимулирование эндогенной выработки инсулина при лечении лекарственными препаратами. Например, за несколько последних десятилетий было изучено несколько методов лечения, участвующих в глюкозном метаболизме, и были определены аналоги этих пептидов. Указанные методы лечения включают последовательности, аналогичные глюкагоноподобному пептиду-1 (Г1П1-1) и содержащие аналоги рецептора ГНН-1, эксендин-4, эксенатид/препарат ΒΥΕΤΤΑ™, который получают из яда ящерицы Оба Моийет, желудочный ингибирующий пептид/глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (ГИП) и соединения, сходные с ГПП-1, такие как лираглютид (NN2211), ингибиторы дипептидил-пептидазы-4, ингибирующие деградацию ГПП-1, гастрин, эпидермальный фактор роста и аналоги эпидермального фактора роста и хомячковый пептид, ассоциированный с островковым неогенезом (ΙΝΟΑΡ).

В частности, были определены фрагменты хомячкового пептида, ассоциированного с островковым неогенезом (см. Воий, В., е! а1. 1оигиа1 ок С11шса1 1пуе811да1юи, Мау 1997, νοί. 99 (9): 2100-2109; и.8. Ра1еи1 №. 5834590 и и.8. Ра!еи! Аррйсабои РиЫюа!юи №. 2004/0132644).

Хомячковый пептид, ассоциированный с островковым неогенезом, может являться эффективным при ускорении неогенеза панкреатических островков. Тем не менее хомячковый пептид, ассоциированный с островковым неогенезом, не является человеческим пептидом и, следовательно, не может быть настолько же эффективным, как человеческий, и он способен вызывать у некоторых пациентов отрицательную иммунную реакцию.

Подтверждение адаптационной способности поджелудочной железы в отношении воспроизведения новых панкреатических островков в течение периода жизни человека, сопровождаемого отмиранием, или апоптозом панкреатических островков, позволило опровергнуть существовавшую в течение длительного времени концепцию, заключавшуюся в том, что количество структур, вырабатывающих инсулин островков, является фиксированным при рождении и сохраняется в течение жизни человека, в то время как была точно установлена пластичность и способность бета-клеток разрастаться внутри существующих островков. В настоящее время принята концепция относительно того, что панкреатические островки регенерируют из ранее существовавших панкреатических клеток путем дифференциации прогениторных клеток (клеток-предшественников), обнаруженных среди как эндокринных, так и экзокринных частей поджелудочной железы. Данные указывают на то, что, даже спустя десятилетия после проявления сахарного диабета 1-го типа, секретирующие инсулин островки могут быть регенерированы. Например, у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа, в организме которых могут достигаться нормальные уровни С-пептида при протекании беременности. Несколько групп исследователей обнаружили парадоксальное повышение уровней С-пептида в течение первого триместра беременности до нормального предела у одной трети всех беременных пациенток, больных сахарным диабетом 1-го типа (Бе\\'15 е! а1., 1976, Вфд е! а1., 1980, Шс е! а1., 2000, ^ονаηον^с е! а1., 2001). Указанное повышение уровня пептидов сопровождается существенным снижением потребности в инсулине, при этом ряд пациентов был способен полностью временно прекратить прием инсулина в течение первого триместра беременности. Такое повышение уровня С-пептидов у пациентов в процессе беременности, имеющее место в течение периода 10 недель созревания плода, несмотря на то, что до беременности у них не было обнаружено поддающихся измерению уровней С-пептида, указывает на восстановление функционирования островковых структур. Предполагается, что неогенез островков, имеющий место в процессе беременности, происходит в результате сопутствующего повышения производства эндогенных стероидов и понижающей регуляции иммунной системы, предотвращающих иммунную атаку на зародыш, что, вероятно, также влияет на подавление лимфоцитарной атаки на островки.

- 1 013821

Наряду с иммунной супрессией также предполагается, что существует повышающая регуляция факторов, способствующих росту материнских островков во время беременности, что позволяет компенсировать снижение заданной величины материнской глюкозы при беременности. Аналогичным образом у пациентов, которым в течение длительного времени проводили иммуносупрессию для пересадки почек, наблюдалась регенерация вырабатывающих инсулин островков.

В течение последнего десятилетия были проведены клинические опыты с целью оценки воздействия ряда иммунных модуляторов, которые способны блокировать деструкцию бета-клеток поджелудочной железы. Были использованы анти-СО-3 антитела (6ОКТ371 (А1а-А1а и ΟΊιΛβ1νΟΌ3)). целью которых является иммунный ответ и которые, в частности, блокируют Т-лимфоциты, вызывающие гибель бетаклеток при сахарном диабете 1-го типа, а также были использованы сиролимус (рапамицин), такролимус (РК506), белок теплового шока 60 (ΌΙΑΡΕΡ277™), вакцина антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (САО65), мофетилмикофенолат в отдельности или в сочетании с даклизумабом, анти-СО20 агент, лизофиллин, ритуксимаб, Кэмпас-1Н (анти-СО52 антителом) и витамин Ό, 1ВС-У8О вакцина, являющаяся синтетической, метаболически неактивной формой инсулина, предназначенная для предотвращения деструкции панкреатических бета-клеток, вакцинация интерфероном-α с использованием ΟΌ4'ί.Ό25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток, либо аналогичное вещество используют в комбинаторных терапевтических методах по применению регуляторных Т-клеток либо непосредственно, либо путем использования иммунотерапии для блокирования деструкции клеток, производящих инсулин. Цель указанных испытаний заключается в определении способности таких веществ сохранять функции островков путем предотвращения дальнейшей иммунной атаки на бета-клетки островков поджелудочной железы.

Кроме того, результаты последних исследований позволили обнаружить, что витамин Ό может выполнять важную иммуномодулирующую функцию в предотвращении сахарного диабета 1-го типа. До 54,7% населения США независимо от географической широты имеют низкие уровни 25-гидроксивитамина Ό (Нобск, I. Сби. Епбоппо1. Мс1аЬ. 2005; 90: 3215-3224). Как было продемонстрировано, недостаток витамина Ό не только повышает риск заболевания сахарным диабетом 1-го типа и обнаруживается при вновь диагностированном диабете 1-го типа, но и в общем наблюдается среди пациентов с сахарным диабетом как 1-го типа, так и 2-го типа. Для поддержания нормальной иммунной функции рекомендуется сохранять уровни выше 40 нг/мл (Ктасбу Αρορΐοδίδ. 2006 РеЬ.; 11(2): 151-9. Нобск. Мауо С1ш. Ргос. 2006 Маг.; 81(3): 353-73, СгаШ. Ргод. Вюрбук. Мо1. Βΐοΐ. 2006 РеЬ. 28; [ЕриЬ абеаб οί ρήηΐ]. П1Секаг. О1аЬе1е5 Саге. 2006 1ап.; 29(1): 174, Век. П1аЬе1ек Ме1аЬ. 2005; 31(4 Р1. 1): 318-25, Ροζζί11ί. Ногт Ме1аЬ Век. 2005; 37(11): 680-3). При дозах до 10000 иммунизирующих единиц/сутки не было обнаружено отрицательного действия лекарственных препаратов (Неапеу. Ат. I. Сбп. Ыиб., 204-210, У1е111. Ат. I. С1ш. Уи1г. 2001; 73: 288-294).

Тем не менее до настоящего времени отсутствовала единая или комбинаторная терапия, которая нашла бы эффективное применение для лечения основных синдромов заболевания сахарным диабетом 1-го типа, сахарным диабетом 2-го типа или состояний, при которых наблюдается отсутствие или пониженный уровень выработки инсулина и/или изменения глюкозного метаболизма или секреции инсулина, включая ожирение, избыточный вес, инсулинорезистентные синдромы и метаболический синдром. Существует необходимость в новых способах лечения и фармацевтических композициях, которые устраняют основные механизмы для изменений сахарного диабета 1-го типа, сахарного диабета 2-го типа и состояний, при которых наблюдается изменение секреции инсулина.

Существует острая необходимость в способах и композициях, которые также позволят проводить лечение многих других состояний, при которых отсутствие или пониженная выработка инсулина являются причиной симптомов или способствуют проявлению симптомов у пациентов, нуждающихся в лечении. В настоящее время, по всей видимости, отсутствует метод лечения, обеспечивающий уменьшение интенсивности симптомов сахарного диабета 1-го типа путем целевого воздействия на механизмы, лежащие в основе всех указанных состояний заболевания. Настоящее изобретение позволяет удовлетворить необходимость в создании усовершенствованных методов лечения сахарного диабета 1- и 2-го типов и иных состояний.

- 2 013821

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение предусматривает создание проостровкового пептида человека (Нитап ртоШе! Рерйбе (Н1Р)), либо его аналога, либо его производного, включающего аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:13. В одном примере осуществления настоящего изобретения длина цепочки Н1Р, либо его аналога, либо его производного составляет менее 17 аминокислот. Одна особенность указанного примера осуществления настоящего изобретения заключается в том, что Н1Р, либо его аналог, либо его производное включает аминокислотную последовательность, выбранную из члена группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:2, 3, 4, 5, 6, 7, 18 и 19. Настоящее изобретение также предусматривает создание фармацевтических препаратов, включающих Н1Р, либо его аналог, либо его производное в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем.

Изобретение также предусматривает создание способа лечения патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении. Способ реализуется путем введения пациенту терапевтического количества одного или нескольких проостровковых пептидов человека, либо их аналогов, либо их производных, в результате чего обеспечивается лечение сахарного диабета 1- и 2-го типов у пациента. В одном примере осуществления способа лечения сахарного диабета 1- или 2-го типов проостровковый пептид человека включает аминокислотную последовательность, выбранную из члена группы, состоящей из 8Е0 ГО N0:2, 3, 4, 5, 6, 7, 18 и 19. Одной особенностью данного примера осуществления настоящего изобретения является то, что длина цепочки проостровкового пептида человека составляет 17 аминокислот или менее.

В другом примере осуществления способа лечения патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, способ дополнительно включает этап введения одного или нескольких веществ для стимулирования регенерации клеток панкреатических островков. Одна особенность данного примера осуществления изобретения заключается в том, что вещества выбраны из члена группы, состоящей из проостровкового пептида человека, амилина/прамлинтида (симлина™), эксендина-4 (ΕΧΕΝΑΤΙΌΕ™), желудочного ингибирующего пептида, ГИИ-1, рецепторных агонистов ГИИ-1, аналогов ГИИ-1, хомячкового пептида, ассоциированного с островковым неогенезом (ШОАР), лираглютида (NN2211) или ингибитора дипептидил-пептидазы, блокирующего деградацию ГИИ-1.

В другом примере осуществления способа лечения патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, способ дополнительно включает следующие этапы:

1) интенсификация гликемического контроля;

2) пероральное введение витамина Ό3 (холекальциферола) для поддержания уровней 25-гидроксивитамина выше 40 нг/мл;

3) проведение одного или нескольких курсов иммунотерапии для защиты формирования новых островковых клеток;

4) введение Н1Р или аналогов Н1Р для стимулирования регенерации клеток панкреатических островков, при этом сокращая вводимые дозы инсулина;

5) проведение повторной терапии для защиты островков на 3-24-месячной основе в зависимости от выбранной иммунной терапии и

6) поддержание уровней 25-гидрокси-витамина Ό выше 40 нг/мл путем перорального приема витамина Ό3 (холекальциферола).

1) интенсификация гликемического контроля;

2) введение витамина (холекальциферола) для поддержания уровней 25-гидрокси-витамина выше 40 нг/мл;

3) введение вещества для стимулирования регенерации панкреатических островков, включающее введение Н1Р или аналогов Н1Р;

4) совместное введение члена группы, состоящей из амилина/прамлинтида (симлина™), эксендина4 (ΕXΕNΑΤI^Ε™), желудочного ингибирующего пептида, ГИИ-1, рецепторных агонистов ГИИ-1, аналогов ГИИ-1, хомячкового пептида, ассоциированного с островковым неогенезом (ШОАР), лираглютида (NN2211) или ингибитора дипептидил-пептидазы, блокирующего деградацию ГИИ-1, при этом сокращая дозы лекарственных средств при терапии сахарного диабета; и

5) поддержание уровней 25-гидрокси-витамина Ό выше 40 нг/мл путем перорального приема витамина Ό3 (холекальциферола).

Одна особенность данного примера осуществления изобретения заключается в том, что вещества для стимулирования регенерации панкреатических островков или бета-клеток выбирают из члена группы, состоящей из Н1Р и аналогов Н1Р, эксендина-4 (ΕXΕNΑΤI^Ε/ΒΥΕΤΤΑ™), гастрина, эпидермального фактора роста и аналога эпидермального фактора роста, желудочного ингибирующего пептида, ГИИ-1,

- 3 013821 рецепторных агонистов ГПП-1, аналогов ГПП-1, хомячкового пептида, ассоциированного с островковым неогенезом (ΙΝΟΆΡ), лираглютида (NN2211) и/или ингибиторов дипептидил-пептидазы-4.

В другом примере осуществления способа лечения патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, способ дополнительно включает этап введения одного или нескольких веществ, ингибирующих, блокирующих или разрушающих аутоиммунные клетки, выбирающие панкреатические островки в качестве своей мишени. Одна особенность данного примера осуществления настоящего изобретения заключается в том, что вещества, ингибирующие, блокирующие или разрушающие аутоиммунные клетки, выбирающие в качестве своей мишени панкреатические островки, выбирают из группы, состоящей из анти-СЭ-3 антител (ЬОКТ3у1 (А1а-А1а и СйА§1уСЭ3)), целью которых является иммунный ответ и которые, в частности, блокируют Т-лимфоциты, вызывающие гибель бета-клеток при сахарном диабете 1-го типа, а также из сиролимуса (рапамицина), такролимуса (РК506), белка теплового шока 60 (ΌΙΑΡΕΡ277™), вакцины антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (ΟΑΌ65), мофетила микофенолата в отдельности или в сочетании с даклизумабом, анти-СЭ20 агента, ритуксимаба, Кэмпас-1Н (анти-СЭ52 антитело), лизофиллина, витамина Ό, 1ВС-У8О вакцины, являющейся синтетической, метаболически неактивной формой инсулина, предназначенной для предотвращения деструкции панкреатических бета-клеток, из вакцинации интерферономα с использованием СЭ4⁺СЭ25⁺ антигенспецифических регуляторных Т-клеток, либо аналогичное вещество, используемое в комбинаторных терапевтических методах по применению регуляторных Т-клеток либо непосредственно, либо путем использования иммунотерапии для блокирования деструкции клеток, продуцирующих инсулин.

В другом примере осуществления способа лечения патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, как минимум один симптом патологии, связанный с нарушением функции поджелудочной железы, излечивают или уменьшают его интенсивность в результате введения как минимум одного проостровкового пептида человека. Одна особенность данного примера осуществления изобретения заключается в том, что симптом выбирают из члена группы, состоящей из низких уровней инсулина или инсулиновой активности, резистентности к инсулину, гипергликемии, уровня гемоглобина А1С, превышающего 6,0%, частого мочеиспускания, чрезмерной жажды, сильного голода, необычной потери или повышения веса, повышенной утомляемости, раздражительности, неясного зрения, зуда половых органов, нерегулярных болей и болевых ощущений, ощущения сухости в полости рта, сухой или зудящей кожи, импотенции, вагинальных дрожжевых грибковых инфекций, плохого заживления порезов и царапин, тяжелых или необычных инфекций, потери или ухудшения гликемического контроля, колебаний содержания глюкозы в крови, колебаний содержания глюкагона в крови и колебаний содержания триглицеридов в крови, при этом гипергликемия в конечном счете приводит к микроваскулярным и макроваскулярным осложнениям, которые включают зрительные симптомы, приводящие к слепоте, ускоренному нарушению работы почек, что может привести к почечной недостаточности, требующей применение диализа или пересадки почек, и к невропатии, ведущей к язве ног и ампутации. Кроме того, последние исследования продемонстрировали снижение как микроваскулярного, так и макроваскулярного/кардиоваскулярного риска среди пациентов с диабетом 1-го типа, у которых было достигнуто улучшение гликемического контроля.

В другом примере осуществления способа лечения патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы у пациента, нуждающегося в таком лечении, патология, связанная с нарушением функции поджелудочной железы, является любой патологией сахарного диабета 1-го типа, впервые выявленного диабета 1-го типа, диабета 2-го типа, скрытого аутоиммунного диабета зрелого возраста, преддиабета, нарушенной гликемии натощак, нарушения толерантности к глюкозе, синдрома инсулинорезистентности, метаболического синдрома, заключающегося в избыточном весе, ожирении, гиперлипидемии, гипертриглицеридемии, расстройствах пищевого поведения или синдроме поликистозных яичников.

Настоящее изобретение также предусматривает создание антитела, селективно связывающегося с ΗΙΡ, либо его аналогом, либо его производным, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из члена группы, состоящей из 8Ε0 ΙΌ N0:2, 3, 4, 5, 6, 7, 18 и 19. В одном примере осуществления настоящего изобретения антитело является моноклональным антителом. В другом примере осуществления настоящего изобретения антитело является поликлональным антителом. Такие антитела могут быть использованы в диагностических способах, создание которых предусматривается настоящим изобретением, при этом способы включают обнаружение уровней содержания ΗΙΡ, либо его аналога, либо производного в сыворотке или в тканях млекопитающего. В одном примере осуществления настоящего изобретения такие способы используют для диагностирования заболевания или состояния, связанного аберрантными уровнями ΗΙΡ; в другом примере осуществления настоящего изобретения диагностический способ используют для контроля, лечения с применением ΗΙΡ, либо аналога, либо производного с целью обеспечения достижения терапевтически эффективных уровней в организме пациента, проходящего такую терапию.

- 4 013821

Настоящее изобретение также предусматривает создание набора для лечения пациентов, страдающих от сахарного диабета 1- или 2-го типов, либо иного состояния, при котором наблюдаются аберрантные уровни инсулина, нарушение глюкозного метаболизма или инсулинорезистентности, включающего терапевтически эффективную дозу проостровкового пептида человека и выборочно как минимум одно вещество для стимулирования рецепторов ГНН-1 или повышения уровней ГПП-1, способствующего регенерации бета-клеток, повышенному чувству сытости, уменьшению потребляемого количества пищи и потери веса, снижая при этом потребности в инсулине и иных диабетических препаратах либо в одной и той же, либо в отдельной упаковке и инструкций по его использованию. Настоящее изобретение также предусматривает создание набора для измерения уровней ΗΙΡ в пробе, набора, включающего ΗΙΡспецифическое антитело, и выборочно ΗΙΡ, и выборочно средство для мечения.

Ниже приведено более подробное описание указанных и других особенностей и примеров осуществления настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - гистограмма, иллюстрирующая повышенное продуцирование инсулина в культуре панкреатической протоковой ткани человека после лечения 3.3 мкМ (окончательная концентрация культуры 165 нМ) ΗΙΡ1 (81+) ΙΌ N0:7), ΗΙΡ2 (81+) ΙΌ N0:3) и ΗΙΡ3 (81+) ΙΌ N0:2) по сравнению с аналогичным лечением с использованием пептида ΙΝΟΑΡ и при скремблированном негативном контроле.

Фиг. 2 - гистограмма, иллюстрирующая повышенное продуцирование инсулина в ткани панкреатических островков человека после лечения 1 мМ для окончательной концентрации культур 500 нМ ΗΙΡ1 (8Е0 ΙΌ N0:7), ΗΙΡ2 (8ЕЦ ΙΌ N0:3) и ΗΙΡ3 (8ЕЦ ΙΌ N0:2) по сравнению с аналогичным лечением с использованием пептида ΑΟΑΡ и при скремблированном негативном контроле.

Фиг. 3А - микрофотография культуры части панкреатической протоковой ткани после 6 дней культивирования с использованием ΗΙΡ (8Е0 ΙΌ N0:2). Внутри клеточной культуры образовалась новая островковая структура.

Фиг. 3В - микрофотография культуры части панкреатической протоковой ткани после культивирования с использованием ΗΙΡ (8ЕЦ ΙΌ N0:2). Внутри клеточной культуры образовалась новая островковая структура.

Фиг. 3С - микрофотография культуры части панкреатической протоковой ткани после культивирования с использованием ΗΙΡ (8Е0 ΙΌ N0:2). Внутри клеточной культуры образовалась новая островковая культура.

Фиг. 3Ό - микрофотография культуры части панкреатической протоковой ткани без культуры с ΗΙΡ (81+) ΙΌ N0:2).

Фиг. 3Е - микрофотография с более высоким увеличением микроснимка, приведенного на фиг. 3 А.

Фиг. 4 - гистограмма, иллюстрирующая повышенное продуцирование инсулина в культурах ткани панкреатических островков человека, обработанных пептидами ΗΙΡ спустя 10 дней в соответствии с протоколом Розенберга. Пептиды 1, 2, 3 являются аналогами ΗΙΡ 8Е0 ΙΌ N0:7, 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:2 по сравнению с аналогичным лечением пептидом 4 (последовательность хомячкового ΑΟΑΡ) и пептидом 5; скремблированный негативный контроль. Образцы представляют собой 5 мкг суммарного протеина в дублете, и их измерение проводилось путем твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А).

Фиг. 5 - гистограмма, иллюстрирующая повышенное продуцирование инсулина в культурах ткани панкреатических островков человека, обработанных пептидами ΗΙΡ спустя 10 дней в соответствии с протоколом Розенберга. ΗΙΡ1, 2 и 3 являются аналогами ΗΙΡ 8Е0 ΙΌ N0:7, 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:2 по сравнению с аналогичным лечением пептидом 4 (последовательность хомячкового ΑΟΑΡ) и пептидом 5; скремблированный негативный контроль. Образцы представляют собой 0,002 мкг суммарного протеина в дублете, и их измерение проводилось путем твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А).

Фиг. 6А - инвертационная микрофотография панкреатических клеток-предшественников человека, образующих ядро новых островков, вырабатывающих инсулин, после 2 дней лечения ΗΙΡ.

Фиг. 6В - инвертационная микрофотография панкреатических клеток-предшественников человека, образующих островковоподобную структуру, вырабатывающую инсулин, после 6 дней лечения ΗΙΡ.

Фиг. 7А - гистограмма, иллюстрирующая повышенное продуцирование инсулина в культурах панкреатической протоковой ткани человека, обработанных двумя концентрациями пептидов ΗΙΡ. ΗΙΡ1, 2 и 3 являются аналогами ΗΙΡ 8Е0 ΙΌ N0:7, 8Е0 ΙΌ N0:3 и 8Е0 ΙΌ N0:2 по сравнению с аналогичным лечением пептидом 4 (последовательность хомячкового ΑΟΑΡ) и пептидом 5; скремблированный негативный контроль. Значения являются средними инсулиновыми единицами (дублирующих проб) в соответствии с измерениями на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А).

Фиг. 7В - гистограмма, иллюстрирующая повышенное продуцирование инсулина в культурах панкреатической островковой ткани человека, обработанных двумя концентрациями пептидов ΗΙΡ. ΗΙΡ1, 2 и 3 являются аналогами ΗΙΡ 8Е0 ΙΌ N0:7, 8Е0 ΙΌ N0:3 и 8Е0 ΙΌ N0:2 по сравнению с аналогичным лечением пептидом 4 (последовательность хомячкового ΑΟΑΡ) и пептидом 5; скремблированный негативный контроль. Значения являются средними инсулиновыми единицами (дублирующих проб) в соответствии с измерениями на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А).

- 5 013821

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает создание проостровковых пептидов человека (ΗΙΡ) и его аналогов и производных. Проостровковые пептиды человека являются активными фрагментами человеческого протеина, регенерирующего островковый 3-альфа протеин (КЕ63Л) (ΝΜ138937.1), также известный как панкреатит-ассоциированный прекурсор протеина (ΝΡ002571), инкорпорированный в данное описание путем отсылки, расположенный на хромосоме 2р12. ΗΙΡ вызывает или стимулирует островковый неогенез из клеток-предшественников, находящихся внутри поджелудочной железы. Указанное вещество неогенеза используют для лечения заболеваний, связанных с низкими или недостаточными уровнями инсулина либо низкой или недостаточной активностью инсулина, возникающих в результате аберрантного углеводного обмена веществ, причиной которого может являться дисфункция панкреатических островков или иммунная деструкция, такая как сахарный диабет (диабет 1-го типа), диабет 2-го типа (неинсулинозависимый сахарный диабет и вновь диагностированный диабет зрелого возраста, требующий инсулина, диабет в детском и в подростковом возрасте) или скрытый аутоиммунный диабет зрелого возраста (БАИЛ).

Изобретение также предусматривает создание терапевтических композиций и методов для лечения панкреатической дисфункции, включающей диабеты 1- и 2-го типов. В одном примере осуществления настоящего изобретения указанные композиции включают ΗΙΡ, или его аналог, или производное. В другом примере осуществления настоящего изобретения указанные композиции включают ΗΙΡ и иные композиции, воздействующие на глюкозный метаболизм. Указанные другие композиции включают вещества, участвующие в неогенезе панкреатических островков, и вещества, ингибирующие, блокирующие или разрушающие аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью панкреатические островковые клетки. В одном примере осуществления настоящего изобретения методы лечения настоящего изобретения реализуются путем введения терапевтически эффективной дозы ΗΙΡ, либо его аналога, либо производного млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении. В другом примере осуществления настоящего изобретения методы лечения настоящего изобретения реализуются путем введения терапевтически активной дозы ΗΙΡ, либо его аналога, либо производного млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, в сочетании с другим гормоном или соединением, воздействующим на глюкозный метаболизм, включая без ограничения гормоны или соединения, участвующие в регенерации бета-клеток, создании чувства насыщения и опорожнения желудка, такие как ГИП-1, желудочный ингибирующий пептид, аналоги рецепторов ГИП-1, аналоги ГИП-1 и ингибиторы дипептидил-пептидазы-4, препятствующие деструкции ГПП-1 и веществ, ингибирующих, блокирующих или разрушающих аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью панкреатические клетки. В данном последнем примере осуществления настоящего изобретения ΗΙΡ, либо его аналог, либо производное и другой гормон или вещество могут быть введены отдельно или сначала могут быть смешаны для получения композиции в соответствии с изобретением и одновременного введения.

Определения.

В целях более ясного понимания описания ниже приведены определения терминов. Если не определено иное, все термины данной области техники, понятия и иные научные или медицинские термины или терминология, используемые в настоящем описании, имеют значения, понимаемые всеми специалистами в химической и медицинской области техники. В ряде случаев для целей ясности и/или для непосредственной ссылки в данном контексте приведены определения терминов с широко понимаемыми значениями, и включение в описание таких определений не должно обязательно истолковываться как представляющее существенное различие от определения терминов, в основном понимаемых в данной области техники.

Для целей настоящего описания лечение состояния или пациента относится к принятию мер с целью получения благотворных или желаемых результатов, включая клинические результаты. Для целей настоящего изобретения благотворные или желаемые клинические результаты включают без ограничений частичное снятие или улучшение одного или нескольких симптомов диабета, снижение степени тяжести заболевания, задержку или замедление прогрессирования болезни, улучшение, временное облегчение или стабилизацию состояния заболевания или иные, описанные ниже благотворные результаты. Симптомы диабета включают низкие или недостаточные уровни инсулина или инсулиновой активности, частое мочеиспускание, чрезмерную жажду, сильный голод, необычную потерю веса, повышенную утомляемость, раздражительность, неясное зрение, зуд половых органов, нерегулярные боли и болевые ощущения, ощущение сухости в полости рта, сухую или зудящую кожу, импотенцию, вагинальные дрожжевые грибковые инфекции, плохое заживление порезов и царапин, тяжелые или необычные инфекции, гипергликемию, потерю гликемического контроля, колебания содержания глюкозы в крови, возникающие после приема пищи, колебания содержания глюкагона в крови и колебания содержания триглицеридов в крови. Диабет может быть диагностирован с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Например, обычно у диабетиков уровень глюкозы в плазме крови превышает 126 мг/дл глюкозы. Преддиабет, который также можно лечить с применением композиций и способов настоящего изобретения, обычно диагностируют у пациентов с содержанием глюкозы в крови в пределах от 100 до 125 мг/дл глюкозы. Также могут быть использованы другие симптомы для

- 6 013821 диагностирования диабета, сопутствующих заболеваний и состояний, а также заболеваний и состояний, возникших в результате снижения функции поджелудочной железы.

Для целей настоящего описания термин уменьшение интенсивности симптома или симптомов (и грамматические эквиваленты данной фразы) означает снижение тяжести или частотности симптома(ов) или устранение симптома(ов).

Для целей настоящего описания фраза патология, связанная с нарушением функции поджелудочной железы является фразой, в которой патология связана со сниженной способностью поджелудочной железы пациента вырабатывать и/или секретировать гормоны и/или цитокины. Указанный гормон или цитокин предпочтительно является инсулином. Патологии, связанные с нарушением функции поджелудочной железы, включают диабет 1-го типа, вновь диагностированный диабет 1-го типа, диабет 2-го типа, скрытый аутоиммунный диабет зрелого возраста, преддиабет, нарушение гликемии натощак, нарушение толерантности к глюкозе, синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, заключающийся в избыточном весе, ожирении, гиперлипидемии, гипертриглицеридемии, расстройствах пищевого поведения или синдроме поликистозных яичников.

Для целей настоящего описания термин введение, или введение лекарственного средства пациенту (и грамматические эквиваленты указанной фразы), означает как непосредственное введение, в том числе самовведение, так и непрямое введение, включая процедуру прописывания лекарственного средства. Например, для целей настоящего описания врач, дающий инструкции пациенту по самовведению лекарственного средства и/или предоставляющий пациенту рецепт лекарственного средства, вводит лекарственное средство пациенту.

Для целей настоящего описания термин субъект, или пациент, является млекопитающим, обычно человеком, но в альтернативных случаях он может представлять собой млекопитающее животное, имеющее ветеринарное значение, включая без ограничений лошадей, крупный рогатый скот, овец, собак и кошек.

Для целей настоящего описания термин проявление заболевания относится к симптому, признаку, анатомическому состоянию (например, отсутствие островковых клеток), физиологическому состоянию (например, уровню глюкозы) или сообщению (например, уровеню триглицерида), которые являются характерными для субъекта с заболеванием.

Для целей настоящего описания термин терапевтически эффективное количество лекарственного средства или вещества является количеством лекарственного средства или вещества, которое при введении субъекту с заболеванием или состоянием вызывает планируемый терапевтический эффект, например частичное снятие, уменьшение интенсивности, временное ослабление и устранение одного или нескольких проявлений заболевания или состояния у субъекта. Полный терапевтический эффект не обязательно достигается путем введения одной дозы, и он может быть достигнут только после введения серии доз. Таким образом, терапевтически эффективное количество может быть введено за один или несколько приемов.

Для целей настоящего описания термин профилактически эффективное количество лекарственного средства является количеством лекарственного средства, которое при введении субъекту вызывает планируемый профилактический эффект, например предотвращение или задержку наступления (или рецидива) заболевания или симптомов или снижение вероятности наступления (рецидива) заболевания или симптомов. Полный профилактический эффект не обязательно достигается путем введения одной дозы, и он может быть достигнут только после введения серии доз. Таким образом, профилактически эффективное количество может быть введено за один или несколько приемов.

Для целей настоящего описания сокращения ΤΙΌ, РЭ и ΡΗ8 имеют обычные значения три раза в день, один раз в день и один раз перед сном соответственно.

Введение вещества в сочетании с включает параллельное введение (введение обоих веществ пациенту за период времени, например введение моноклонального антитела и пептидного гормона, такого как гормон инкретина или его аналога через день в течение одного месяца), совместное введение (при котором вещества вводят приблизительно в одно и то же время, например в пределах от приблизительно нескольких минут до нескольких часов одно за другим) и совместная композиция (в которой вещества соединены или объединены в одну лекарственную форму, приемлемую для перорального, подкожного или парентерального введения).

ΌΡΡ-4 ингибиторы - ингибиторы дипептидил-пептидазы-4.

Хомячковый ΙΝ6ΑΡ - нечеловеческий пептид, ассоциированный с островковым неогенезом.

6ΙΡ - желудочный ингибирующий пептид, также известный глюкозозависимый инсулинотропный полипептид.

Г1П1-1- глюкагонподобный пептид 1.

ΗΙΡ - один из проостровковых пептидов человека в очищенной, синтезированный или рекомбинантной форме либо включенный в фармацевтическую композицию.

Производные и аналоги могут иметь либо полную длину, либо неполную длину. Производные и аналоги нуклеиновых кислот или протеинов в соответствии с изобретением включают без ограничения молекулы, содержащие участки, являющиеся в основном идентичными нуклеиновым кислотам или про

- 7 013821 теинам в соответствии с настоящим изобретением в различных примерах осуществления по меньшей мере приблизительно на 70, 80 или 95% (при предпочтительной идентичности 80-95%) по сравнению с нуклеиново-кислотной и аминокислотной последовательностью идентичного размера либо по сравнению с выровненной последовательностью, в которой выравнивание производится с помощью компьютерной гомологической программы, известной в данной области техники, кодирующая нуклеиновая кислота которой способна к гибридизации для дополнения последовательности, кодирующей протеины при жестких, умеренно жестких или слабо жестких условиях. См., например, Аи8иЬе1, е! а1. СиЯКЕЫТ РКОТОСОЬ8 ΙΝ МОЬЕСИЬАК ВЮЬОСУ, ,ΙοΙιιι №11еу&8оп5, Хеи Уогк, ΝΥ, 1993 и ниже.

Островковые структуры.

В литературе относительно регенеративных процессов поджелудочной железы существовала создающая путаницу терминология. Нередко термин островковая клетка использовали синонимично бетаклеткам, а такое разграничение является важным ввиду рассмотрения новых методов лечения сахарного диабета. Панкреатические островки не являются клетками, а представляют собой структуры, каждая из которых состоит по оценкам из 1000 клеток четырех четко различимых типов клеток: 1) бета-клетки, вырабатывающие инсулин и амилин и составляющие 65-80% островковых клеток; 2) альфа-клетки, высвобождающие глюкагоны и составляющие 15-20% клеток; 3) дельта-клетки, вырабатывающие соматостатин; и 4) панкреатические полипептидные клетки, которые в некоторых случаях называют гаммаклетками. Дельта и панкреатические полипептидные клетки составляют менее 10% островковой структуры. Островковые структуры составляют только 1-2% панкреатической массы, но, тем не менее, используют 20% кровотока в поджелудочную железу и рассматриваются как один из наиболее васкуляризированных типов клеток в организме.

Внутри островковой структуры существует высокоорганизованное расположение четырех типов клеток. Внутри каждого островка происходит центробежная подача кровяного потока, при этом бетаклетки расположены в центральной части и, таким образом, они получают основное кровоснабжение, в то время как альфа-, дельта- и панкреатические полипептидные клетки расположены за пределами бетаклеток в области с более низкой перфузией.

Дополнительно к уровням глюкозы, влияющим на бета-клетки, бета-клетки электрически соединены с другими бета-клетками, но не с другими клетками островка или поджелудочной железы. Такая сложная система связи внутри островка позволяет дать объяснение компенсаторному увеличению альфаклеток внутри островка при существенном снижении массы бета-клеток (Кип е1 а1., I. Сйй. Епбосппо1. Ме!аЬ. 88: 2300-2308, 2003, Ь1 е! а1., 1оигпа1 о£ Епбосгшо1оду (2000), 165, 93-99).

Проостровковые пептиды человека.

Проостровковые пептиды человека (ΗΙΡ) и их аналоги в соответствии с настоящим изобретением являются активными фрагментами протеина КЕО3Л человека или панкреатит-ассоциированного прекурсора протеина на хромосоме 2р12. Протеин РЕС3Л. из которого получают ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением, приведен в табл. 1. Домен, обеспечивающий создание ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением, выделен жирным шрифтом.

Таблица 1 Аминокислотная последовательность КЕО3А/панкреатит-ассоциированного прекурсора протеина

МЕРРМАЬР8У8Ш4ЬЬ8СЬМЬЕ80У0ОЕЕРрКЕЬР5АК1КСРКО8КАУО8НС¥

АЕРЬ8РК81¥ТОАОЕАС0ККР8СХЬУ8УЬ8ОАЕО8РУ88ЕУК8ЮМ8У8У¥ЖС ΕΗΒΡΤΟΟΤΕΡΝ6ΕΟ^νΕΧνδ88θνΜΝΥΡΑ\νΕΡΝΡ8ΤΙ88ΡΟΗΟΑ8Ε8Κ8ΤΑΓΕ ΚΨΚΟΥΝΟΝνΜΤΥνΟΚΡΤΟ (ЗЕО Ю N0:1)

ΗΙΡ, и его аналоги, и производные в соответствии с настоящим изобретением включают полипептиды, приведенные в табл. 2, в очищенной, синтетической и рекомбинантной форме или содержащиеся в фармацевтической композиции.

- 8 013821

Таблица 2

Последовательность проостровкового пептида человека и аналогов

ΙΟΕΗϋΡΤφΟΤΕΡΝΟΕ	ΗΙΡ	8Еф ГО N0:2
ΙΟΕΗϋΡΤφΟΤΕΡΝΟ	Безглютаматный ΗΙΡ	8Еф ГО N0:3
νΨΙΟΕΗϋΡΤφαΤΕΡΝΟΕ	Аналог Валин-трип ΗΙΡ Апа1ое	8Еф ГО N0:4
ЮЬНОР	Гексапептидный ΗΙΡ	8Е0 ГО N0:5
ΨΙΟΕΗϋΡ	Септапептидный ΗΙΡ	8Еф ГО N0:6
νΐΟΕΗΟΡΤΟΟΤΕΡΝΟ	Трип-безглтаматный ΗΙΡ	8Ер Ιϋ N0:7
ΨΙΟΕΗΟΡΤφΟΤΕΡΝΟΕ	Трип-ΗΙΡ	8ΕφΙΟΝΟ: 19
1С.ЕНВРТ	Второй септапептидный ΗΙΡ	8ΕφΙϋΝ0: 18

Указанные пептиды являются человеческими гомологами хомячкового пептида ΙΝΟΑΡ, раскрытого в патенте США 5834590 и инкорпорированного в настоящее описание путем отсылки во всей его полноте. В указанном патенте раскрываются хомячковый протеин, ассоциированный с островковым неогенезом (ΙΝΟΑΡ), и ассоциированные пептиды с длиной цепи как минимум 15 аминокислот. ВЬА8Т2Р выравнивание человеческого ΚΕΟ3Α и хомячкового ΙΝΟΑΡ, выполненное на веб-сайте NСВI, приведено в табл. 3.

Таблица 3 Выравнивание ВЬА8Т2Р ΒΕΟ3Α (8ΕΟ ΙΌ N0:1) и ΙΝΟΑΡ золотистого хомячка (8Εφ ΙΌ N0:8)

К.Е03:! МЬРРМАЕР8У8Х¥МЬЕ8СЕМ1Х8рУрОЕЕРрКБЬР8АК1КСРКС5КАУ65НС¥АЬЕЪ8РК5 60

М+ РМ Ъ +8ΎΜΕΕ5ΟΕΜ У+ОЕР. ()++ЬР8+К1 СР+СЗ ΑΥ08+ΓΎ+Ι, Ь Р++

ΙΝΟΑΡ: I ММЕРМТЕСКМ5^МЕЕ8СЕМРЕ8\УУЕаЕЕ8рКК]-Р83К.1ТСРС)СЗУА¥С£¥СУ8Е1Е[РОТ60

КЕ63: 61 \СТЕ\АОЕАС0КРТ5СМЕ'С5УЕ80.АЕО8РУ85ЕУК5ЮМ8У5¥У\ИСЕ1П)ГГ0СТЕГНСЕС\¥ 120

У7++А+Е+Сф 804-Е +Ъ8 Е +ЕУ851_УК+ +Υ Υ+ΆΊΟΕΗΟΡ+ ОТ ΡΝΟ СО/

ΙΝΟΑΡ: 61 λν3ΝΑΕΕ500ΜΗΡ80ΗΕΑΡΕΕ8Τ0ΕΙΊΤν88ΕνΚΝ8ΕΤΑΥφΥΙ\Υ10Ε1Π>Ρ8Η0ΤΕΡΝ08θν 120

КЕСЗ: 121 Ε\ν8580νΜΝΥΡΑ\νΕΚΝΡ8ΤΙ85Ρ0Η0Α8Ε8Κ8ΤΑΡΕΚΧνΚϋΥΝ0ΝνΚΕΡΥν0ΚΡ 173 +У/533+У+ ++ \ΥΕ№Ρ3 + О+СА Ε8+ + Ρ ι Ο ιΝΟ ΕΡΥ+СКГ

ΙΝΟΑΡ: 121 Κ\ν585ΝνΕΤΡΥΝ'νΕΚΝΡ51ΑΑΟΚΟΥ€ΑνΕ5(}Κ8ΟΡ<0Κν/Κ.ΟΡΝ€ΕΝΕΕΡΥΙΟΚΡ 173

В табл. 3 жирным шрифтом выделен домен в ΚΕΟ3Α, из которого получен ΗΙΡ (8Εφ ΙΌ N0:2), и соответствующая хомячковая последовательность в ΙΝΟΑΡ. В публикации США 2004/0132644, инкорпорированной в настоящее описание путем отсылки во всей ее полноте, раскрывается пептид ΙΝΟΑΡ, выделенный жирным шрифтом выше в табл. 3. Указанный хомячковый пептид ΙΝΟΑΡ в настоящее время исследуют в плане его эффективности при неогенезе островков.

Настоящее изобретение также обеспечило идентификацию соответствующих ΗΙΡ-подобных пептидов из животных дополнительно к ранее известному хомячковому ΙΝΟΑΡ и, таким образом, в соответствии с одной важной особенностью позволяет создать указанные пептиды и их аналоги в основном в чистой и рекомбинантной форме, а также содержащие их фармацевтические препараты, и терапевтические методы в целях их применения для увеличения выработки инсулина. В то время как каждый из указанных ΗΙΡ-подобных пептидов из животных, за исключением хомячкового, являются исключительно приемлемыми для реализации способа изобретения в организме животного источника происхождения, специалистам в данной области должно быть очевидно из данного описания, что указанные пептиды также могут быть использованы в организмах животных, за исключением организмов животного источника происхождения, и в организме человека в соответствии с идеями настоящего изобретения.

В табл. 4 приведены иллюстративные нечеловеческие ΗΙΡ-подобные пептиды, создание которых предусматривается в соответствии с настоящим изобретением; в целях сравнения показана последовательность хомячкового ΙΝΟΑΡ.

- 9 013821

Таблица 4

Выравнивание ΗΙΡ гомологических последовательностей из других видов млекопитающих

Человек АIО Ь Ηϋ Р Т ф ОТ Ε Р N С Е(8Еф ГОN0:19) Шимпанзе АЮЬНОРТфСЗЕРОСС (8ЕфГО N0:20) Хомячок А I О Ь Η Ε) Р С Н С ТБ ΡΝ С 8 (ЗЕфГО N0:21) Мышь ΑΙΟΕΗΟΡΤΜΟφΙΟΡΝΟΟ (8ЕфГО N0:22)

Серая крыса ΑΙΑΕΗΌΡΤΜΟφίοΡΝΟΟ (8Еф ГО N0:23) Корова АIО Ь Η ϋ Р Т Е О 8 Е ₽ ϋι А О (8ЕЦГО N0:24) Собака ΑΜΟίΗΟΡΤΕΟΥΕΡΝΑΟ (8ЕфГО N0:25)

Овца ΑΙΟΤΗϋΡΤΕΟδΕΡΝΑΟ (8ЕфГО N0:26)

Мутации (см. табл. 4) обощены ниже.

М - метионин/1 = изолеуцин АТС по отношению к АТА	оба неполярные гидрофобные 8ΝΡ
А = триптофан/ С = глицин ТСС по отношению к ССС	зам.: неполярный гидрофобный/полярный незаряженный 8ΝΡ
8 = серин/ Т = треонин ТСХ по отношению к АСХ	оба полярные незаряженные четыре возможных 8ΝΡ с аналогичным результатом
Ь= леуцин/ ф = глутамин СТС по отношению к САС	зам.: неполярный гидрофобный/полярный незаряженный один возможный 8ΝΡ

Е=глютаминовая кислота/ф=тлютамин зам: полярный незаряженный/кислотный

САА/ОАС по отношению к САА/САО два возможных 3ΝΡ

М=аспарагин/Г)=аспарагиновая кислота ААТ/ААС по отношению к ОАТ/САС

С=глицин/ А=аланин

ОСХ по отношению к ССХ зам: полярный незаряженный/кислотный два возможных 8ΝΡ = аналогичный результат зам: полярный иезаряженный/неполярный гидрофобный четыре возможных 5ΝΡ с аналогичным результатом

Новые последовательности ΗΙΡ и ΗΙΡ-подобных пептидов, создание которых предусматривается настоящим изобретением, является высокогомологичными, отражая важность функции таких пептидов индуцирование неогенеза панкреатических островков. Такое сохранение последовательности по отношению к последовательности хомячкового ΙΝΟΑΡ позволяет в дальнейшем продемонстрировать тот факт, что ΗΙΡ, и его аналоги, и производные, в том числе нехомячковые ΗΙΡ-подобные пептиды, приведенные в табл. 4, являются эффективными при стимулировании островкового неогенеза в соответствии с настоящим описанием.

Микрочиповый анализ экспрессии генов в мышах линии ΝΘΌ продемонстрировал наличие повышенной регуляции (активации) Кед генов, в частности, при островковом неогенезе (Уиккабари с1 а1., ΡΗγκϊοΙ Сепопйск 2005 Арг. 14; 21(2): 201-11). Кроме того, как известно, Кед гены активируются на поздней стадии развития плода для создания популяции в поджелудочной железе развивающегося человека с целью поддержания его собственного глюкозного метаболизма после родов. Нао е1 а1., 2006, №1Шге Мебюше. 12(3): 310-6 продемонстрировал, что совместная пересадка тканей плода с неэндокринными панкреатическими эпителиальными клетками (ΝΕΡΕΟ) приводила к стимулированию новых островковых структур из популяции неэндокринных панкреатических эпителиальных клеток. Повышенная регуляция Кед и, таким образом, большое количество ΗΙΡ в совместно трансплантируемом материале плода, вероятно, являлись стимулом для такого эффекта.

Были проведены клинические испытания хомячкового ΙΝΟΑΡ. Несмотря на то что на фазе Ι и ΙΙ опытов была продемонстрирована хорошая переносимость хомячкового ΙΝΟΑΡ, в ходе испытаний в фазе ΙΙ произошел большой отсев диабетических больных, связанный с дискомфортом и появлением гематом на участке инъецирования хомячкового ΙΝΟΑΡ. Кроме того, на фазе ΙΙ испытаний была обнаружена низкая эффективность хомячкового ΙΝΟΑΡ. ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением не должен приводить к проблемам выбывания пациентов, так как они [пептиды] получены из организма человека в противоположность хомячковой последовательности. Кроме того, введение ΗΙΡ, и его производных, и аналогов может осуществляться при увеличении количества доз в сутки. Количество суточных доз может составлять 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Дозы могут быть введены до принятия пищи с целью повышения их

- 10 013821 эффективности у ряда пациентов. Предполагается, что ΗΙΡ стимулирует дифференциацию клетокпредшественников в поджелудочной железе на новые островковые структуры и секретируется в ответ на легкую гипергликемию. Введение ΗΙΡ непосредственно до принятия пищи и его присутствие во время гипергликемии после приема пищи воспроизводят схему секреции дикого типа, которая может привести к более эффективному лечению пациентов.

Несмотря на отрицательное воздействие, обнаруженное при проведении испытаний хомячкового ΙΝΟΑΡ в фазе II, ΙΝΟΑΡ все же продемонстрировал в ходе испытаний определенные признаки эффективности. У пациентов, лечение которых проводилось с введением 600 мг/сутки хомячкового ΙΝΟΑΡ, наблюдалось повышение секреции С-пептида.

Кроме того, в группе больных, лечение которых проводилось путем введения 300 мг/сутки в фазе ΙΙ, у 22% пациентов наблюдалось >50% увеличение титров антител СЛЭ65. Антитело СЛЭ65 связывается с лимфоцитами, которые атакуют бета-клетки внутри островков. Таким образом, повышение титров антител СЛЭ65 отражает выработку новых бета-клеток, связанных с островковым неогенезом, стимулирование которого осуществлялось с помощью хомячкового ΙΝΟΑΡ.

Также у больных диабетом 2-го типа наблюдалось снижение гемоглобина Α1Ο. Это связано со снижением гликемического воздействия и, таким образом, с более низким средним содержанием глюкозы в крови. Это также дает основание полагать, что хомячковый ΙΝΟΑΡ оказывает определенное положительное воздействие на островковую функцию у пациентов, несмотря на его негативное воздействие, продемонстрированное в фазе ΙΙ исследования по применению хомячкового ΙΝΟΑΡ.

Аналоги ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением включают любой пептид, содержащий как минимум 6 аминокислотных последовательностей из вышеприведенных последовательностей, выделенных жирным шрифтом, т.е. 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:2. Например, пептидные последовательности из 15 или менее аминокислот (т.е. имеющие 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислот), включающие любую из 6 аминокислотных последовательностей, приведенных в табл. 5, рассматриваются как пептиды в соответствии с настоящим изобретением.

Таблица 5

Примеры осуществления последовательностей, содержащихся в аналогах ΗΙΡ

Пептид	8Е0 ГО ΝΟ:
1611ЮР	5
ОЬНЭРТ	9
БНОРТО	10
НПРТфО	И
ϋΡΤφΟΤ	12
РТфОТЕ	13
ТфОТЕР	14
φΟΤΕΡΝ	15
ΟΤΕΡΝΟ	16
ΤΕΡΝΟΕ	17

В одном примере осуществления настоящего изобретения ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением, полученный в очищенной, синтетической или рекомбинантной форме, вызывает неогенез панкреатических островков и полностью состоит из человеческой последовательности. Указанные пептиды имеют преимущества по отношению к нечеловеческим ΗΙΡ гомологам, таким как хомячковый ΙΝΟΑΡ, так как они не содержат какой-либо нечеловеческой пептидной последовательности. Таким образом, обеспечивается существенное снижение проявления иммунного ответа при введении указанных пептидов в организм человека по сравнению с хомячковыми пептидами ΙΝΟΑΡ.

Кроме того, пептиды ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением могут храниться в течение длительного периода времени в стабильном состоянии. Пептиды ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением сохраняют свою стабильность в течение нескольких месяцев при хранении при 20°С в изотоническом растворе.

В конкретном примере осуществления настоящего изобретения производное или аналог является функционально активным, т.е. способным проявлять одну или несколько связанных с ΗΙΡ функциональных активностей.

Может быть проведено испытание ΗΙΡ производных или аналогов на определение требуемой активности с помощью процедур, известных в данной области техники, включая без ограничения использование соответствующих клеточных линий, экспериментальных моделей на животных и клинических опытов. Например, могут быть использованы анализы, описанные в 1ата1, Α.Μ., с! а1. Се11 Эеа111 Э|ГГсг. 2005 1и1.; 12(7): 702-12, инкорпорированные в настоящее описание путем отсылки во всей полноте.

В частности, производные ΗΙΡ могут быть получены, изменяя последовательности ΗΙΡ путем замещений, вставок или делеций, обеспечивающих функционально эквивалентные или улучшенные молекулы. Ввиду дегенерации нуклеотидных кодирующих последовательностей в практике настоящего изобретения могут быть использованы другие последовательности ДНК, кодирующие аналогичную или в

- 11 013821 основном аналогичную аминокислотную последовательность в виде ΗΙΡ, или его аналогов, или производных. Они включают без ограничений последовательности нуклеиновых кислот, содержащие все или части ΗΙΡ, измененные замещением различных кодонов, кодирующих функционально эквивалентный аминокислотный остаток внутри последовательности, тем самым производя скрытое изменение. Аналогичным образом, производные ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением включают без ограничений производные, содержащие в виде первичной аминокислотной последовательности всю или часть аминокислотной последовательности ΗΙΡ, в том числе измененные последовательности, в которых остатки внутри последовательности, полученной в результате скрытого изменения, заменены функционально эквивалентными аминокислотными остатками. Например, один или несколько аминокислотных остатков внутри последовательности могут быть заменены другой аминокислотой аналогичной полярности, выступающей в качестве функционального эквивалента, полученного в результате скрытого изменения. Заместители аминокислоты в последовательности могут быть выбраны из других членов класса, к которому принадлежит аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, леуцин, изолеуцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глютамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глютаминовую кислоту. Производные ΗΙΡ в соответствии с настоящим изобретением также включают без ограничений производные, содержащие в качестве основной аминокислотной последовательности всю или часть аминокислотной последовательности ΗΙΡ, в том числе измененные последовательности, в которых остатки с аналогичными химическими свойствами заменены аминокислотными остатками. В конкретном примере осуществления настоящего изобретения аминокислоты 1, 2, 3, 4 или 5 замещены.

ΗΙΡ производные или аналоги включают без ограничений те протеины, которые в основном гомологичны ΗΙΡ или его фрагментам, либо кодирующая нуклеиновая кислота которых способна гибридизироваться в нуклеиново-кислотную последовательность ΗΙΡ.

В конкретном примере осуществления настоящего изобретения в способе изобретения могут быть использованы рекомбинантные, или слитые, протеины. Для целей настоящего описания рекомбинантный протеин, или слитый протеин, включает ΗΙΡ, или его аналоги, или производные, функционально связанные с не-ΗΙΡ, или его аналогом, или производным. Внутри такого слитого протеина ΗΙΡ, или его аналог, или производное могут соответствовать всему или части ΗΙΡ. В одном примере осуществления настоящего изобретения слитый протеин ΗΙΡ включает как минимум одну биологически активную часть ΗΙΡ. Внутри слитого протеина ΗΙΡ, или его аналог, или производное и не-ΗΙΡ полипептид являются функционально связанными, т.е. они слиты в рамке друг с другом. Не-ΗΙΡ полипептид может быть связан с Ν- или С-концом ΗΙΡ, или его аналога, или производного. Например, слитый протеин может представлять собой протеин ΗΙΡ, содержащий гетерологическую сигнальную последовательность на своем Ν-конце. В определенных клетках-хозяевах (например, клетках-хозяевах млекопитающих) экспрессия и/или секреция ΗΙΡ, или его аналога, или производного может быть повышена за счет использования гетерологической сигнальной последовательности. В другом примере осуществления изобретения слитый протеин является слитым протеином ΗΙΡ-иммуноглобулин, в котором последовательности ΗΙΡ слиты с последовательностями, полученными из члена семейства иммуноглобулинового протеина. Слитые протеины ΗΙΡ-иммуноглобулин могут быть включены в фармацевтические композиции и введены субъекту для ингибирования иммунологического ответа в соответствии с настоящим изобретением.

ΗΙΡ, его аналог или производное либо ΗΙΡ-рекомбинантный или слитый протеин, предназначенные для использования в способах в соответствии с настоящим изобретением, могут быть химически модифицированы с целью повышения биодоступности и/или повышения эффективности, растворимости и стабильности. Например, протеин может быть ковалентно или нековалентно связан с альбумином, трансферрином или полиэтиленгликолем (ПЭГ).

ΗΙΡ, его аналог или производное либо ΗΙΡ-рекомбинантный или слитый протеин, предназначенные для использования в способе в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены путем применения стандартных технологий рекомбинантных ДНК в соответствии с идеями настоящего изобретения. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные полипептидные последовательности, могут быть сшиты вместе в рамке в соответствии с известными технологиями, например, путем использования тупоконечных или зигзагоконечных концов для сшивания, расщепления рестриктазой с целью обеспечения соответствующих концов, достройки липких концов при необходимости, обработки щелочной фосфатазой с целью предотвращения нежелательного слияния и ферментативного сшивания. Кроме того, слитый ген может быть синтезирован с использованием известных технологий, включающих автоматизированные синтезаторы ДНК. В альтернативном случае может быть проведена ПЦР-амплификация фрагментов гена с использованием якорных праймеров, обеспечивающих образование комплементарных липких концов ДНК между двумя последовательными фрагментами гена, которые в дельнейшем могут быть ренатурированы и реамплифицированы с целью получения последовательности рекомбинантных генов [см., например, Аи8иЬе1, е1 а1. (еЙ8.) СГРИРХТ' ΡΚΟΤΟ(ΌΡ8 ΙΝ МОРГСГРАР ВЮЬОбУ, ,ΙοΙιιι ^11еу&8оп5 (1992)]. Более того, многие векторы экспрессии, уже кодирующие слитую часть, реализуются на рынке (например, С8Т полипептид). ΗΙΡ-кодирующая нуклеиновая кислота может быть клониро

- 12 013821 вана в такой вектор экспрессии с целью обеспечения связывания слитой части в рамке с ΗΙΡ. Слитой протеин может представлять собой протеин ΗΙΡ, слитый с Ηίδ тагом или эпитопным тагом (например, У5) в целях содействия очистки и обнаружения рекомбинантного ΗΙΡ, либо в целях маскирования иммунного ответа в организме субъекта. Относительно короткие аминокислотные последовательности ΗΙΡ и его аналогов и производных также позволяют полностью реализовать получение указанных ценных пептидов путем синтеза, осуществляется серийный выпуск приборов автоматизации синтеза пептидов, и способы синтеза пептидов, не требующие автоматизации, давно известны и могут быть использованы в соответствии с изложенными в настоящем описании идеями для получения ΗΙΡ, или его аналогов, или производных в соответствии с настоящим изобретением.

В ряде примеров осуществления изобретения ΗΙΡ, либо его аналог, либо производное или ΗΙΡрекомбинантный или слитый протеин может быть модифицирован таким образом, чтобы обеспечивалось удлинение его периода полужизни ίη νίνο, используя любые способы известные в данной области техники. Например, фрагмент Рс ΙβΟ человека или инертные полимерные молекулы, такие как полиэтиленгликоль с высоким молекулярным весом, могут быть присоединены к ΗΙΡ, либо к его аналогу, либо к его производному с многофункциональным линкером или без него, либо через сайт-специфическую конъюгацию ПЭГ с Ν- или С-концом протеина, либо через эпсилон-аминогруппы, присутствующие на лизиновых остатках. Предусматривается использование приема дериватизации линейного или разветвленного полимера, в результате которого обеспечивается минимальная потеря биологической активности. Постоянный контроль за степенью конъюгации обеспечивается путем анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и методом масс-спектроскопии с целью обеспечения надлежащей конъюгации молекул ПЭГ с ΗΙΡ, или его аналогом, или производным. Непрореагировавший ПЭГ может быть отделен от конъюгатов ΗΙΡ-ПЭГ путем гель-хроматографии или ионообменной хроматографии. Может быть проведено испытание ПЭГ-дериватизированных конъюгатов в плане их эффективности ίη νίνο, используя способы, известные специалистам в данной области техники.

Способы изобретения и используемые в нем вещества.

Обзор способов изобретения.

Настоящее изобретение предусматривает создание методов лечения на основе ΗΙΡ, или производных, или аналогов ΗΙΡ и способов повышения выработки или активности инсулина и иных панкреатических гормонов у субъекта. В одном примере осуществления настоящего изобретения реализуется способ лечения сахарного диабета 1- или 2-го типа и сопутствующих состояний, при которых наблюдается отсутствие или снижение выработки инсулина у пациента, приводящее к аберрантному глюкозному метаболизму. Способ включает введение пациенту вещества, стимулирующего регенерацию панкреатических островков и/или дифференциацию из панкреатических клеток-предшественников в островковые структуры. Указанное вещество является ΗΙΡ, либо его аналогом, либо производным. Выборочно ΗΙΡ, или аналог, или производное ΗΙΡ вводят при одновременном введении вещества, ингибирующего активность аутоиммунных клеток, выбирающих своей мишенью панкреатические островковые бета-клетки, и/или блокирующего или разрушающего их, и выборочно другое вещество, которое может также стимулировать регенерацию панкреатических бета-клеток и/или приводить к повышению ГПП-1 или стимулированию рецепторов ГПП-1 или которое является аналогом ГПП-1 либо ингибитором дипептидилпептидазы-4, ингибирующим деградацию ГПП-1.

Терапевтические методы, создание которых предусматривается в соответствии с настоящим изобретением, устраняют ряд различных основополагающих механизмов (симптомов), которые приводят либо к отсутствию, снижению или недостаточному количеству инсулина или иных гормонов, либо которые, так или иначе, вырабатываются в аберрантном количестве. Комбинаторные методы лечения на основе ΗΙΡ, предусматриваемые настоящим изобретением, позволяют восстановить глюкозный метаболизм в более нормальном режиме, в том числе достижение и поддержание соответствующих уровней инсулина, амилина, постпрандиальной глюкозы, триглицеридов и уровней глюкагона, и способствуют нормализации значительного повышения веса и уменьшению повышенного риска тяжелой гипогликемии, связанной с жестким гликемическим контролем с использованием инсулина или пероральных диабетических лекарственных средств.

Настоящее изобретение также предусматривает создание методов лечения с использованием одного вещества для лечения дефицита инсулина, в том числе диабета и сопутствующих состояний. Указанные методы лечения с использованием одного вещества включают методы введения ΗΙΡ или ΗΙΡ аналогов, либо производных, стимулирующих регенерацию панкреатических островковых клеток и/или трансформирование новых, вырабатывающих инсулин, островковых клеток из панкреатических клетокпредшественников, расположенных в поджелудочной железе взрослого человека. Неогенез островковых клеток, происходящий в результате введения ΗΙΡ, может быть использован для лечения диабета и других заболевания и состояний, относящихся к аберрантной регуляции глюкозы. В различных примерах осуществления настоящего изобретения указанные методы предусматривают введение таких веществ, включающих без ограничения ΗΙΡ, ΗΙΡ триптофан, безглютаматный ΗΙΡ, аналог ΗΙΡ валин-трипитофана, ΗΙΡ гексапептид, ΗΙΡ септапептид, ΗΙΡ второй септапептид или триптофан-безглютаматный ΗΙΡ по отдельности либо в сочетании с иммуноблокирующим веществом и/или одновременно вводимые с агони

- 13 013821 стом рецептора ГПП-1, ГПП-1, аналогом ГПП-1 или ингибитором дипептидил-пептидазы в случае лечения диабета 1-го типа, либо ΗΙΡ в сочетании с агонистом рецептора ГПП-1, ГПП-1, аналогом ГПП-1 или ингибитором дипептидил-пептидазы без необходимости введения иммунного блокатора в случае лечения диабета 2-го типа. Болезненные состояния, подлежащие лечению с применением указанной методологии, включают без ограничения диабет 1- и 2-го типов, при которых указанные методы лечения могут быть использованы для повышения гликемического контроля на основе измерений гемоглобина А1С и для снижения на 10-20% приема болюсного инсулина до приема пищи при снижении колебаний и понижении уровней постпрандиальной глюкозы, глюкагона и триглицеридов. Указанные методы также могут быть использованы для предотвращения развития от нарушения толерантности к глюкозе к диабету и для предотвращения развития от нарушенной гликемии натощак к нарушению толерантности к глюкозе и к диабету и для реверсирования вновь диагностированного диабета 2-го типа. Указанные методы также могут быть использованы для лечения диабета 2-го типа.

Экзогенный инъецируемый инсулин используют для лечения и диабета 1-го типа, и иных состояний, при которых инсулин либо отсутствует в организме, либо присутствует в незначительном или недостаточном количестве по отношению к содержанию глюкозы в кровотоке. Инсулиновая терапия не позволяет устранить основные симптомы, приводящие к диабету 1-го типа или иным таким состояниям, при которых имеет место пониженная выработка эндогенного инсулина. Методы лечения, способы, режимы и тактика лечения, приведенные в настоящем описании, предназначены в первую очередь для устранения многочисленных факторов, вызывающих диабет и осложнения в связи с этим заболеванием. Уникальные методы лечения, предусмотренные настоящим изобретением, охватывают различные аспекты диабетологии, метаболизма и иммунологии. Указанные методы лечения включают методы, обеспечивающие восстановление нормальных уровней многих различных гормонов дополнительно к инсулину, количество которых было снижено или которые отсутствовали в организме при диабете 1-го типа. Способы в соответствии с настоящим изобретением предусматривают регенерацию новых вырабатывающих инсулин клеток и выборочно иммуномодуляцию, которые в сочетании способствуют нормализации, снижению и отказу от необходимости приема инсулина среди пациентов с диабетом 1-го типа и с иными состояниями, связанными с недостаточной выработкой и секрецией инсулина.

При диабете 1-го типа имеется ряд основных механизмов, приводящих к существенному снижению выработки инсулина. Указанные механизмы включают аутоиммунную деструкцию бета-клеток и снижение регенерационной способности не только внутри бета-клеток, неспособность клетокпредшественников дифференцироваться в новые островки может быть обусловлена изменившейся глюкозной средой. Настоящее изобретение также предусматривает создание комбинаторных методов лечения, которые являются исключительно эффективными, поскольку при блокировке аутоиммунного ответа путем совместного введения иммуносупрессанта с ΗΙΡ, или ΗΙΡ аналогом, или производным производится блокировка аутоиммунных клеток, атакующих панкреатические островковые клетки, и вводятся пептиды или другие соединения, стимулирующие регенерацию панкреатических островковых клеток, в результате чего пациент становится зависимым от введения инсулина в меньшей степени.

Способы в соответствии с настоящим изобретением даже могут позволить ряду пациентов полностью отказаться от приема инсулина при лечении диабета как 1-, так и 2-го типов. Другие исследования (см. ссылки БеуеПп е! а1., Э1аЬе!е5, 2002, 51 (кирр1е 2): 429; Ьеуе!аи е! а1., Э1аЬе!е5, 2002, 51 (кирр1. 2): 474; Ьеуе!аи е! а1., Э1аЬе!е5, 2001; 50 (кирр1е 2): 2105 ΡΟ и Ьеуе!аи е! а1., Э1аЬе!е5 Саге, 2003, 26:1-8, обе инкорпорированные в настоящее описание путем отсылки) показывают, что при замещении гормонов, кроме инсулина, с пониженным количеством обеспечивается существенное снижение потребностей в инсулине у пациентов, больных диабетом 1-го типа, при одновременном улучшении глюкозного контроля. Благодаря стимулированиию дифференциации новых вырабатывающих инсулин островковых структур и блокированию иммунных клеток, которые могут нарушить их функцию, способы настоящего изобретения являются многообещающими, так как они позволяют достичь устойчивой эндогенной выработки инсулина как такового и иных совместно секретируемых гормонов, таких как амилин.

Существует необходимость в терапевтической полезности, предусматриваемой настоящим изобретением. Существуют новые лекарственные формы инсулина и подтверждение того, что интенсивная инсулиновая терапия предотвращает летальный исход и снижает частотность потери зрения, ампутаций и почечной недостаточности, при которой требуется проведение диализа. Тем не менее, интенсивная инсулиновая терапия с использованием современных режимов проведения многочисленных инсулиновых инъекций и постоянного поступления в организм инсулина с помощью насосотерапии связаны с двухкратно-трехкратно повышенным риском возникновения тяжелой гипогликемии, при которой требуется помощь другого человека. В условиях проведения клинических исследований, несмотря на нормализацию глюкозы у пациентов с диабетом 1-го типа путем внутривенного введения инсулина и глюкозы, стандартное отклонение уровней глюкозы как в сторону повышения, так и в сторону понижения колеблется в значительно более широких пределах, чем у исследуемых субъектов без диабета при аналогичном среднем уровне глюкозы в организме в течение 24-часового периода. Настоящее изобретение предусматривает альтернативные средства для достижения терапевтической полезности интенсивной инсулиновой терапии без пониженного ятрогенного риска ввиду того, что эндогенная выработка инсулина, сти

- 14 013821 мулированная настоящими способами, должна обеспечить более нормальный уровень выработки инсулина, который не может быть эффективно воспроизведен при применении интенсивной инсулиновой терапии.

Таким образом, несмотря на доступность инсулина и новые технологии, в том числе новые композиции человеческого инсулина, системы самоконтроля глюкозы в крови, датчики постоянного контроля за уровнем глюкозы и насосотерапия, существующие методы лечения не позволяют достичь нормального контроля глюкозы. Более того, основные механизмы, вызывающие диабет 1-го типа, не подлежат устранению с использованием существующих методов лечения у пациентов с диабетом 1-го типа и с состояниями, при которых наблюдается полное отсутствие выработки либо пониженная или недостаточная или аберрантная выработка инсулина или амилина и дисрегуляция секреции глюкагона.

Настоящее изобретение предусматривает создание новых способов и фармацевтических композиций для стимулирования островкового неогенеза, повышения выработки инсулина и иных панкреатических гормонов в организме пациента, который нуждается в них, и лечения сахарного диабета 1-го типа, сахарного диабета 2-го типа и других состояний, при которых отсутствие выработки или пониженная выработка инсулина является этиологическим фактором возникновения симптомов заболевания. Способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением позволяют реверсировать основополагающие патологические механизмы указанных болезненных состояний. Таким образом, способы настоящего изобретения позволяют снизить и в ряде случаев устранить необходимость введения инсулина пациенту, формально нуждающемуся в нем.

В одном примере осуществления указанного способа вещество, стимулирующее островковую регенерацию и/или дифференциацию из панкреатических клеток-предшественников в производящие инсулин островковые структуры, вводят совместно с Н1Р, или его аналогом, или производным, включая безглютаматный Н1Р, Н1Р триптофан, аналог Н1Р валин-типитофана, Н1Р гексапептид, Н1Р септапептид, второй Н1Р септапептид или типтофан-безглютаматный Н1Р. Указанное вещество, стимулирующее островковую регенерацию и/или дифференциацию из панкреатических клеток-предшественников в производящие инсулин островковые структуры, может представлять собой Н1Р, или его аналог, или производное при условии, что оно отличается от первого введенного Н1Р, или его аналога, или производного. Вещества, которые могут быть введены с Н1Р или в процессе поэтапных способов использования Н1Р для лечения диабета 1- и 2-го типов, включают амилин и/или аналог, такой как прамлинтид, желудочный ингибирующий пептид, ГИИ-1 и/или гомологичные соединения и аналоги, аналоги рецептора ГИИ-1, которые включают эксендин-4, лираглютид (NN2211), хомячковый ШСАР, или их аналоги Н1Р, любой биологически активный пептид Н1Р и/или ингибиторы дипептидил-пептидазы-4, замедляющие деградацию ГИИ-1. Второе вещество может оказывать воздействие на регенерацию бета-клеток, опорожнение желудка, создание чувства насыщения и потребность в инсулине путем воздействия на клеточные рецепторы ПП1-1 и амилина в поджелудочной железе, прилежащие ядра, область агеа ройгета и желудочнокишечный тракт и может быть использовано в таком примере осуществления способа с Н1Р, или его аналогом, или производным в отличие от первого введенного вещества.

Один способ лечения диабета 1-го типа и иных патологий, возникающих в результате снижения функции поджелудочной железы, включает пять стадий:

(1) интенсивный гликемический котроль;

(2) достижение и поддержание уровней 25-гидрокси-витамина Ό выше 40 нг/дл путем перорального введения холекальциферола (витамин Ό3);

(3) проведение курса иммунотерапии;

(4) введение Н1Р и сокращение введения инсулина после прекращения приема как Н1Р, так и инсулина;

(5) повторное использование иммунной модуляции на квартальной или годовой основе в зависимости от выбранной иммунной терапии.

Другой способ включает две стадии для лечения диабета 2-го типа, ожирения, избыточного веса, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, гипертриглицеридемии и расстройств пищевого поведения:

1) достижение и поддержание уровней 25-гидрокси-витамина Ό выше 40 нг/дл путем перорального введения холекальциферола (витамин Ό3) и

2) введение Н1Р в сочетании с ГИИ-1, либо агонистом рецептора ГИИ-1, либо аналогом ГИИ-1, либо ингибитором дипептидил-пептидазы-4.

Ниже приведено более детальное описание стадий (1), (2) для лечения диабета 1-го типа и иных патологий, возникающих в связи с пониженной панкреатической функцией.

Стадия 1. Для проведения первой стадии до введения Н1Р либо до введения Н1Р аналога или производного и до введения или при одновременном введении вещества, ингибирующего активность аутоиммунных клеток, выбирающих в качестве своей мишени бета-клетки, и/или блокирующего или разрушающего их, выдерживается трехмесячный период жесткой/интенсивной оптимизации глюкозы. Указанный период жесткой/интенсивной оптимизации глюкозы может предусматривать несколько суточных доз инсулина, вводимых подкожно или постоянно вводимых подкожно с помощью инсулинового насоса,

- 15 013821 и может предусматривать введение синтетического амилина/прамлинтида (симлина™), который также отсутствует при диабете 1-го типа и аберрантно секретируется при диабете 2-го типа. Как было продемонстрировано, синтетический амилин/прамлинтид (симлина™) снижает гликемические экскурсии (колебания) у пациентов с диабетом 1-го типа, снижая при этом потребности в инсулине до принятия пищи (Ьеуе1ап е1 а1., Э|аЬе1ек Саге, 2003, 26(1): 1-8).

Кроме того, на протяжении всего периода жесткого контроля проводится иммунотерапия, вводится Н1Р и может вводиться витамин Ό3 (холекалциферол) при дозе 1000-2000 иммунизирующих единиц в сутки. Недавно проведенные исследования продемонстрировали, что до 54,7% населения США независимо от географической широты имеют низкие уровни 25-гидрокси-витамина Ό (Нобск, I. Сбп. Εη6οπηο1. Ме1аЬ. 2005; 90: 3215-3224). Как было продемонстрировано, недостаток витамина Ό не только повышает риск заболевания сахарным диабетом 1-го типа и обнаруживается при вновь диагностированном диабете 1-го типа, но и в общем наблюдается среди пациентов с сахарным диабетом как 1-го типа, так и 2-го типа и для поддержания нормальной иммунной функции у больных с диабетом и без диабета рекомендуется сохранять уровни выше 40 нг/мл (В1асбу АрорЮкк. 2006 РеЬ., 11(2): 151-9; Нобск. Мауо Сбп. Ргос. 2006 Маг., 81(3): 353-73; Сгапб Ргод. Вюрбук Мо1. Βίο1. 2006 РеЬ. 28, [ЕриЬ абеаб οί рг1п1|; О1Секаг. Э|аЬе1ек Саге. 2006 1ап., 29(1): 174; Век. Э|аЬе1ек Ме1аЬ. 2005, 31(4 Р1. 1): 318-25; Ροζζ^11^. Ногт Ме1аЬ Век. 2005, 37(11): 680-3). При дозах до 10000 иммунизирующих единиц/сутки не было обнаружено отрицательного действия лекарственных препаратов (Неапеу. Ат. I. Сбп. ΝηΐΓ., 204-210, У1е111. Ат. I. Сбп. ΝώΓ., 2001, 73: 288-294). Продолжается введение витамина Ό при дозах 1000-2000 иммунизирующих единиц/сутки для поддержания уровней 25-гидрокси-витамина Ό выше 40 нг/дл у пациентов с диабетом как 1-го, так и 2-го типа.

Стадия 2. До введения Н1Р, или аналога, или производного Н1Р в соответствии с предписанными способами предусматривается введение одного из иммуномодуляторов. Такие иммуномодуляторы включают иммуномодуляторные пептиды, блокирующие деструкцию панкреатических островковых клеток. Например, один такой иммуномодулятор представляет собой моноклональное антитело, способное задержать прогрессию потери островков, или замедлить, или остановить начало заболевания диабетом 1-го типа. Анти-СО3 антитела образуют общий класс веществ, являющихся полезными в способах настоящего изобретения. Например, приемлемые анти-СО3 антитела для целей настоящего изобретения включают ТВХ4 (А1а-А1а и СбАд1у СЭ3) антитело, разработкой которого занимается в настоящее время То1егВх, и гуманизированное анти-СО3 антитело, описанное в ссылке Него1б е1 а1., 30 Мау, 2002, ΝΕ^, 546(22): 1692-1698, инкорпорированной в настоящее описание путем отсылки. В одном примере осуществления настоящего изобретения гуманизированное В1иекбэпе анти-СО3 антитело вводят внутривенно в течение 14 дней в год в дозах 1-1,42 мкг/кг на 1-й день, 5,67 мкг/кг на 2-й день, 11,3 мкг/кг на 3-й день, 22,6 мкг/кг на 4-й день и 45,4 мкг/кг на 5-14-й дни. Указанные методы лечения также ежегодно необходимо повторять после 3-6 месяцев использования Н1Р при одновременном снижении количества инсулина по мере образования новых островковых клеток. На этапе лечения с использованием Н1Р может быть продолжен прием витамина Ό или использование прамлинтида/симлина™. После прекращения введения Н1Р и инсулиновой терапии ежегодно повторяется иммунная модуляция для анти-СО3 антител, хотя недавно проведенное исследование позволило обнаружить их эффективность, сохраняющуюся в течение 24 месяцев (Него1б. Э|аЬе1ек. 2005, 54(6): 1763-9).

В другом примере осуществления изобретения иммуномодуляторное соединение представляет собой лизофиллин или белок теплового шока, способный блокировать или замедлять деструкцию островковых клеток. Такие протеины включают ^IΑΡΕΡ277™, белок теплового шока, разработкой которого занимается компания Эеуекдеп АС (см. ссылку Ваζ е1 а1., 2002, бапсеб 358(9295): 1749-53, инкорпорированную в настоящее описание путем отсылки). В одном примере осуществления настоящего изобретения ^IΑΡΕΡ277™ вводят подкожно в количестве 1 мг в 40 мг маннитола в растительном масле на исходном уровне и с интервалом в 1 месяц, а затем с интервалом в 3 месяца. Введение ^IΑΡΕΡ277™ продолжают в течение всего периода Н1Р терапии и после завершения Н1Р терапии с интервалом в 4 месяца с целью защиты вновь генерированных островков в результате проведения Н1Р терапии. В одном примере осуществления комбинаторной терапии настоящего изобретения Н1Р вводят совместно с ^IΑΡΕΡ277™ в соответствии с нижеописанной процедурой. Сначала вводят подкожно ^IΑΡΕΡ277™ при дозе приблизительно 1 мг приблизительно за 30 дней до начала проведения Н1Р терапии. Второе введение ^IΑΡΕΡ277™ осуществляют в период (30 дней после первого введения) начального проведения Н1Р терапии. При необходимости Н1Р терапию можно провести повторно и ^IΑΡΕΡ277™ вводят с частотностью приблизительно раз в 3 месяца.

В другом примере осуществления настоящего изобретения хомячковый ШСАР может быть введен путем 24-часовой непрерывной подкожной инфузии при дозе приблизительно от 8 до 18 мг/кг веса тела пациента в сутки. При необходимости Н1Р терапию можно провести повторно и ^IΑΡΕΡ277™ вводят с частотностью приблизительно раз в 3 месяца.

- 16 013821

Новые ΗΙΡ терапевтические способы, предусматриваемые настоящим изобретением, позволяют устранить ряд различных основополагающих симптомов, возникающих в результате отсутствия либо пониженного или недостаточного количества инсулина и иных гормонов, либо которые вырабатываются в аберрантных количествах. Методы лечения на основе ΗΙΡ, на основе аналогов или производных ΗΙΡ или на основе комбинаторной терапии, предусматриваемые настоящим изобретением, позволяют восстановить глюкозный метаболизм в более нормальном режиме, включая достижение и поддержание соответствующих уровней инсулина, амилина, постпрандиальной глюкозы, триглицеридов и глюкагона, нормализовать существенное повышение веса и снизить риск тяжелой гипогликемии, связанной с жестким гликемическим контролем.

Исходя из описания изобретения, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что может быть использовано сочетание нескольких веществ, стимулирующих островковый неогенез, и/или дифференциацию клеток-предшественников, и/или деградацию в способах настоящего изобретения.

Дополнительно при реализации способов настоящего изобретения ΗΙΡ, или его аналоги, или производные при совместном введении или при отдельном введении другого выбранного вещества, такого как симлин™/прамлинтид, ГПП-1, агонист рецептора ГПП-1, агонист Г1П1-1 или ингибитор дипептидилпептидазы-4, ингибирующий деградацию ГПП-1, которые позволяют снизить вес, повысить чувство сытости, замедлить абсорбцию глюкозы в желудочно-кишечном тракте, могут быть использованы в сочетании с конкретным веществом, ингибирующим, блокирующим деятельность или разрушающим аутоиммунные клетки, выбирающие своей целью панкреатические бета-клетки. Такие вещества включают, например, пептиды, протеины и синтетические соединения.

В одном примере осуществления настоящего изобретения вещество представляет собой моноклональное антитело, белок теплового шока или иное соединение, которое, в частности, замедляет, предотвращает или останавливает аутоиммунную деструкцию островковой функции.

Исходя из приведенного описания изобретения, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что может быть использовано сочетание нескольких веществ, блокирующих аутоиммунную деструкцию панкреатической островковой функции, в способах настоящего изобретения. Вещества, ингибирующие, блокирующие деятельность или разрушающие аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью панкреатическую островковую функцию, включают анти-СО-3 антитела (1ιϋΚΤ3γ1 (А1а-А1а и Ο’1ιΑ§1νΟΌ3)). сиролимус (рапамицин), такролимус (ЕК506), белок теплового шока 60 (ΌΙΑΡΕΡ277™), вакцину антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (ΟΑΌ65), мофетилмикофенолат в отдельности или в сочетании с даклизумабом, анти-СЭ20 агент, ритуксимаб, Кэмпас-1Н (анти-СИ52 антитело), лизофиллин и витамин Ό, ГВС-У8О вакцину, являющуюся синтетической метаболически неактивной формой инсулина, предназначенной для предотвращения деструкции панкреатических бета-клеток, вакцинацию интерфероном-α с использованием ΟΌ4'ΟΌ25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток либо аналогичное вещество, предназначенное для предотвращения деструкции панкреатических бета-клеток. В данном последнем примере осуществления изобретения вакцинацию интерфероном-α с использованием ΟΌ4'ΟΌ25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток либо аналогичное вещество используют в сочетании с комбинаторной терапией для применения регуляторных Т-клеток либо непосредственно, либо путем использования анти-СИ3 иммунотерапии. Иммунное вещество в соответствии с указанным примером предусматривается использовать, в частности, для введения пациентам с диабетом 1-го типа для защиты вновь образовавшихся островковых клеток от иммунной атаки.

Таким образом, комбинаторная терапия и связанные с ней способы настоящего изобретения предусматривают введение ΗΙΡ, или его аналогов, или производных либо совместное введение ΗΙΡ или его аналогов и производных с одним или несколькими веществами, стимулирующими дифференциацию островков от клеток в поджелудочной железе взрослого человека, с одним или несколькими веществами, блокирующими аутоиммунную деструкцию панкреатических бета-клеток. Для целей настоящего описания вещество вводят совместно или используют в сочетании с другим веществом, которое также называется в настоящем описании, как соединение или гормон, когда два или три вещества вводят как часть одного и того же курса терапии. В одном примере осуществления настоящего изобретения первое вещество вводят первым до введения второго вещества и лечение с использованием обоих веществ продолжают на протяжении всего курса терапии. В другом примере осуществления изобретения второе вещество вводят после начала проведения или завершения терапии с использованием первого вещества. В других примерах осуществления настоящего изобретения первое вещество вводят одновременно с началом проведения терапии с использованием второго вещества. В другом примере осуществления изобретения третье вещество вводят одновременно либо до, либо после введения первого или второго вещества или обоих веществ. В одном примере осуществления настоящего изобретения сначала проводят терапию с использованием одного или нескольких веществ для блокирования или уничтожения аутоиммунных клеток, выбирающих своей мишенью панкреатические бета-клетки, вырабатывающие инсулин и амилин, а затем проводят терапию, стимулирующую дифференциацию островков от клеток-предшественников в поджелудочной железе взрослого человека. В другом примере осуществления настоящего изобретения

- 17 013821 лечение с использованием специфического аутоиммунного блокатора продолжают после прекращения лечения с использованием веществ, стимулирующих дифференциацию островков. До введения иммуномодулирующих веществ или при их одновременном введении проводится трехмесячный интенсивный/жесткий гликемический контроль, который может предусматривать введение нескольких суточных инъекций инсулина, инсулиновую насосотерапию и применение терапии с использованием прамлинтида/симлина™ и витамина Ό при дозах 1000-2000 иммунизирующих единиц/сутки для поддержания уровня 25-гидрокси-витамина Ό выше 40 нг/мл.

Реализация способов настоящего изобретения может предусматривать несколько периодов, или циклов лечения. Например, введение вещества, стимулирующего дифференциацию островков от клеток-предшественников при одновременном введении вещества, блокирующего аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью панкреатические бета-клетки, может рассматриваться как один цикл способа настоящего изобретения, включающий совместное введение обоих типов вещества. В альтернативном случае каждое введение дифференцирующего островки вещества может рассматриваться как цикл лечения и при введении блокирующего аутоиммунные клетки вещества оно может быть введено только в виде дополнительной процедуры таких циклов или после последнего введения дифференцирующего островки вещества, например только две инъекции ΌΙΑΜΥΏ™ квасцового человеческого рекомбинантного СЛЭ65. введенные подкожно с интервалом в 4 недели для предотвращения дальнейшей деструкции бета-клеток у пациентов с аутоиммунным диабетом (Лдагйй с1 а1., 1. 0|айе1ек СотрНсайопк. 2005, 19(4): 238-46). Хотя единичный курс с использованием анти-СЭЗ моноклонального антитела (йОКТ3у1 (А1аА1а)) приводит к улучшению С-пептидных ответов и клинических параметров, терапию с использованием анти-СЭЗ антитела рекомендуется проводить по меньшей мере в течение 2 лет после наступления диабета 1-го типа (НегоИ с1 а1., 0|айе1ек. 2005, 54(6): 1763-9). Таким образом, в зависимости от выбранного иммуноблокатора цикличность терапии может изменяться с целью защиты новых островков от иммунной атаки. Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что вышеприведенные примеры носят исключительно иллюстративный характер и никоим образом не ограничивают настоящее изобретение. Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что во многих случаях схема совместного введения может отличаться при первом или последующем терапевтическом цикле в целях удобства пациента.

Комбинаторные методы лечения и связанные с ними способы настоящего изобретения направлены исключительно на основные патологические механизмы диабета 1-го типа при использовании веществ, регенерирующих новые островковые структуры и/или дифференцирующих панкреатические клеткипредшественники, в сочетании с веществами, обеспечивающими целевую иммунотерапию. Указанная комбинаторная терапия реверсирует полностью или частично основные механизмы диабета 1-го типа, представляющего собой аутоиммунное явление, при котором аутоантитела атакуют поджелудочную железу. Существующие методы лечения диабета 1-го типа, которые в основном полагаются на введение инсулина, не позволяют реверсировать дефекты, лежащие в основе диабета 1-го типа. Более того, существующие иммунотерапии для лечения диабета 1-го типа основаны на ослаблении функции панкреатических бета-клеток и не воздействуют на дифференциацию новых полностью функциональных островковых структур, содержащих новые альфа, бета, дельта и полипептидные клетки внутри каждого нового островка.

Для пациентов с диабетом 2-го типа не потребуется иммунное блокирующее вещество, так как иммунная деструкция не лежит в основе заболевания, хотя последние исследования указывают на потенциально важную роль дефицита витамина Ό при диабете 1-го типа, и недавно проведенные исследования позволили обнаружить, что в процессе диагностирования у большего количества пациентов с диабетом 2-го типа наблюдается недостаток витамина Ό, чем у пациентов с диабетом 1-го типа, и в этой связи рекомендуется поддержание уровней выше 40 нг/мл с целью обеспечения нормальной иммунной функции (В1асйу Αρορΐοκίκ. 2006 Рей.; 11(2): 151-9; Нойск. Мауо Сйп Ριυα 2006 Маг.; 81(3): 353-73, СгаШ. ΡΐΌβ. Вюрйук Мо1. Вю1. 2006 Рей. 28; [Ерий айеак ок рип!]; О1Секаг. О1айе1ек Саге. 2006 1ап.; 29(1): 174; Вещ. 0|айе1ек Ме1аЬ. 2005; 31(4 Ρΐ. 1): 318-25; кох/Ш!. Ногт Ме1аЬ Век. 2005; 37(11): 680-3). При дозах до 10000 иммунизирующих единиц/сутки не было обнаружено отрицательного действия лекарственных препаратов (Неапеу. Αт. 1. Сйп. ΝπίΓ., 204-210, У1е1й. Αт. 1. Сйп. ΝπΐΓ. 2001; 73: 288-294).

Новые способы, предусматриваемые настоящим изобретением, позволяют реверсировать лежащие в основе патологические механизмы диабета 2-го типа, а также заболеваний и состояний, вызванных снижением выработки инсулина ввиду дисбаланса между деструкцией, регенерацией и поддержанием деятельности бета-клеток, путем дифференциации новых островковых структур, содержащих полностью функциональные новые бета-клетки. Способы и соединения в соответствии с настоящим изобретением позволяют снизить потребности в инсулине и противодиабетических препаратах у пациентов, в настоящее время принимающих лекарства ввиду заболевания диабетом 2-го типа или страдающих от иных заболеваний или состояний, и обеспечивают улучшение контроля глюкозы в организме таких пациентов. У ряда пациентов лечение в соответствии со способами настоящего изобретения позволяет снизить количество вводимого инсулина или полностью отказаться от его введения. В нижеприведенном разделе дано

- 18 013821 описание ряда заболеваний и состояний, для лечения которых могут быть использованы способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением, обладающие терапевтической полезностью.

Заболевания и состояния, подлежащие лечению.

Методы лечения на основе ΗΙΡ, или аналогов, или производных ΗΙΡ и комбинаторные методы лечения в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для лечения любых млекопитающих, включая людей и животных, страдающих от заболеваний, симптомов или состояний, связанных с пониженной выработкой или секрецией инсулина ввиду прекращения или ослабления функции бетаклеток или связанных с необходимостью выработки большего количества инсулина, которое может быть обеспечено субъекту путем дифференциации новых островковых структур от клеток-предшественников путем использования соединений ΗΙΡ или способов лечения.

Такие заболевания и состояния включают сахарный диабет 1-го типа, сахарный диабет 2-го типа, преддиабет, нарушенную гликемию натощак, гиперинсулинемию натощак, включая без ограничений пациентов с диабетом типа 1а или пациентов со скрытым аутоиммунным диабетом зрелого возраста, у которых могут обнаруживаться антитела (анти-САО65 антитела, аутоантитела и антиинсулиновые антитела), либо пациентов с диабетом 1-го типа с инсулиновой недостаточностью без аутоиммунности, направленной на бета-клетки (диабет типа 1Ь). Более того, настоящее изобретение может быть применино с терапевтической полезностью в отношении пациентов с вновь диагностированным диабетом 1-го типа, детей и ближайших родственников пациентов с диабетом 1-го типа и в отношении людей с положительными антителами и иными аутоиммунными состояниями, указывающими на предрасположенность к диабету 1-го типа. В одном примере осуществления настоящего изобретения способы в соответствии с настоящим изобретением применяются для реверсирования диабета 1-го типа у пациентов, нуждающихся в таком лечении.

Комбинаторные методы лечения и связанные с ними способы и композиции настоящего изобретения также могут быть применены в качестве дополнительных лечебных мероприятий к инсулиновой терапии при диабете 1-го типа у детей и взрослых для снижения колебаний уровней глюкозы в организме пациентов с диабетом и пациентов со слабо контролируемым диабетом, гипогликемической неосведомленностью и рецидивной гипогликемией при диабете 1-го типа.

Методы лечения на основе ΗΙΡ, или аналогов, или производных ΗΙΡ и связанные с ними способы и композиции изобретения могут быть использованы для лечения вновь диагностированного у пациентов диабета 2-го типа, диабета 2-го типа у детей и гипогликемии и диабета 2-го типа у взрослых, которые одновременно лечат инсулином, применяя пероральные диабетические и иные подкожные диабетические методы лечения, а также для лечения слабо контролируемого диабета 2-го типа. У ряда пациентов, как детей, так и взрослых, способы и композиции изобретения позволяют реверсировать диабет 1- и 2-го типов. Способы и композиции настоящего изобретения также могут быть использованы для лечения как детей, так и взрослых, имеющих атипичные формы диабета, и пациентов с состоянием постпрандиальной гипергликемии.

Методы лечения на основе ΗΙΡ, или аналогов, или производных ΗΙΡ и связанные с ними способы и композиции также могут быть применены для лечения как детей, так и взрослых, нуждающихся в снижении веса, уменьшении триглицеридов, липопротеина низкой плотности, включая без ограничений снижение веса или лечение ожирения, снижение избыточного веса у пациентов, имеющих диабет, а также у пациентов, не имеющих диабет 1- или 2-го типа. В одном примере осуществления настоящего изобретения способы и композиции настоящего изобретения применяют для лечения пациентов с патологическим ожирением. В других примерах осуществления настоящего изобретения способы и композиции в соответствии с изобретением применяют для лечения пациентов с патологическим ожирением или пациентов, болеющих анорексией, булимией или иными расстройствами пищевого поведения.

Методы лечения с использованием одного вещества и связанные с ними способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для детей и взрослых, имеющих дисметаболический синдром или метаболический синдром, а также для пациентов, у которых наблюдается состояния синдромов невропатической боли, являющихся следствием измененного глюкозного метаболизма, и пациентов с гипертриглицеридемией с диабетом или без него и с постпрандиальной гипертриглицеридемией. В одном примере осуществления настоящего изобретения указанные способы применяются для лечения синдрома поликистозных яичников у пациентов, нуждающихся в таком лечении.

Другие пациенты, которые могут получить пользу от применения терапии на основе ΗΙΡ, или аналогов, или производных ΗΙΡ и связанных с ними способов в соответствии с настоящим изобретением, включают детей и взрослых, которым поставлен диагноз таких состояний, как гипергликемия натощак, преддиабет, нарушенная гликемия натощак, нарушенная толерантность к глюкозе и в общем гипергликемические состояния.

Методы лечения на основе ΗΙΡ, или аналогов, или производных ΗΙΡ и связанные с ними способы и композиции также могут быть применены для лечения пациентов, имеющих синдромы невропатической боли и невропатию независимо от того, поставлен ли пациенту диагноз диабет или нет.

Методы лечения на основе ΗΙΡ, или аналогов, или производных ΗΙΡ и связанные с ними способы и композиции также могут быть применены для лечения пациентов, имеющих рецидивирующий панкреа

- 19 013821 тит или рак поджелудочной железы, и могут быть использованы во всех режимах, направленных на формирование новых островковых структур, полученных из клеток-предшественников в поджелудочной железе.

В нижеприведенных разделах дано описание веществ, используемых в способах настоящего изобретения. Исходя из описания настоящего изобретения, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что квалифицированный изобретатель может выбрать определенные вещества с учетом заболевания или состояния в процессе их лечения, состояния здоровья и терапевтического состояния пациента.

Вещества для стимулирования регенерации панкреатических островков.

В одном примере осуществления способов настоящего изобретения вещество, стимулирующее дифференциацию островков из панкреатических клеток-предшественников в вырабатывающие инсулин островковые структуры, выбирают из группы, состоящей из ΗΙΡ, или его аналога, или производного, включающего безглютаматный ΗΙΡ, ΗΙΡ триптофан, ΗΙΡ валин-трипитофан, ΗΙΡ гексапептид, ΗΙΡ септапептид, ΗΙΡ второй септапептид или триптофан-безглютаматный ΗΙΡ, амилин и/или аналог, включая без ограничений прамлинтид (симлин™), аналоги рецептора ГИИ-1, эксендин-4 (ЕXЕNΑΤI^Е™), лираглютид (NN2211), ГПП-1, аналоги Г1П1-1, желудочный ингибирующий пептид, Г1П1-1, хомячковый ШСАГ. другие инкретин-миметические гормоны и/или аналогичным образом действующие соединения и вещества и вещества, удлиняющие полужизнь либо повышающие уровень или активность любого из вышеперечисленных соединений и веществ, таких как, например, ингибитор дипептидил-пептидазы-4, замедляющий деградацию ГПП-1. Существуют многочисленные Г1П1-1 миметики, которые воздействуют за счет прямой активности агониста на рецепторы ГПП-1 или за счет ингибирования деградации ГПП-1. Указанные вещества являются полезными при использовании в способах настоящего изобретения. ГПП-1 миметики могут быть использованы в сочетании с ΗΙΡ и/или целевой иммунотерапией для лечения диабета 1-го типа и, как предусмотрено настоящим изобретением, они могут использоваться для улучшения гликемического контроля, повышения чувства сытости, замедления абсорбции глюкозы желудочно-кишечным трактом и реверсирования лежащих в основе механизмов, приводящих к диабету 1-го типа. Указанные вещества и способы позволяют предотвратить развитие нарушенной толерантности к глюкозе при диабете; предотвратить преддиабет, развитие нарушенной гликемии натощак в нарушение толерантности к глюкозе и в диабет; реверсировать вновь диагностированный диабет 2-го типа; лечить диабет 2-го типа и лечить или предотвращать избыточный вес, ожирение, синдром поликистозных яичников и синдромы невропатической боли.

Способы, вещества и фармацевтические композиции являются полезными при реализации настоящего изобретения с целью достижения дифференциации панкреатических островков из клетокпредшественников в поджелудочной железе взрослого человека и включают способы, вещества и фармацевтические композиции, описанные в ссылках, каждая из которых инкорпорирована в описание путем отсылки: ВокепЬегд е1 а1., 1992, Α6ν. Ехр. Меб. ΒίοΙ. 321: 95-104; Маг. 1996, И1аЬе1о1од1а, 59(3): 25662; 1и1. 1996, Гапсгеак 15(1): 38-46 апб №ν. 2004, Апп. 8игд. 240(5): 875-84; У1шк е1 а1., 1ип. 1997, Ηοηη. Ме1аЬ. Век. 29(6): 278-93. Стимулирование регенерации островков или дифференциация панкреатических клеток-предшественников могут проявиться в форме повышенной выработки и/или секреции инсулина в организме субъекта.

В одном примере осуществления настоящего изобретения амилин или его аналог, симлин™, прамлинтид используют до введения или при совместном введении с ΗΙΡ; амилин может быть введен до островковой регенерации и его введение может быть продолжено в течение всего периода островковой регенерации в соответствии с основополагающей ссылкой Уоипд е1 а1., 1997, Сигг. 0рт. Епбоепп. И1аЬе1ек 4: 282-290, инкорпорированной путем отсылки. В одном примере осуществления настоящего изобретения амилин и/или его аналог, включая без ограничений прамлинтид, вводят подкожно для оптимизации гликемического контроля до начала лечения с применением ΗΙΡ и затем может быть использован отдельно или в сочетании с другими пептидами, стимулирующими островки, такими как ΗΙΡ, или аналог, или производное ΗΙΡ. В одном примере осуществления настоящего изобретения амилин или прамлинтид вводится в дозах 0,3-0,8 мкг/кг веса пациента. В одном примере осуществления настоящего изобретения указанную дозу вводят подкожно до принятия пищи, например один раз перед сном и в 3 ч ночи. В одном примере осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективную дозу вводят подкожно, или через инфузионное устройство/насос, и/или трансдермальную, интраназальную, буккальную систему доставки лекарственного вещества микроиглами, или путем перорального принятия инкапсулированной дозы. В другом примере осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективную дозу вводят с использованием композиции замедленного высвобождения, при этом введение инъецированием или с помощью иного способа используется не чаще одного раза в неделю, одного раза в 2 недели и один раз в месяц. Как указывалось выше, в ряде примеров осуществления изобретения амилин или прамлинтид вводят совместно с другим стимулирующим островки веществом.

- 20 013821

В одном примере осуществления настоящего изобретения аналог рецептора ГПП-1, включающий эксендин-4 или аналог, используют в способе с применением ΗΙΡ при дозах 5-10 мкг при принятии пищи. Рецептура эксендина-4 может быть составлена и введена в целях настоящего изобретения в соответствии с идеями нижеприведенных ссылок, каждая из которых инкорпорирована в настоящее описание по отсылке: А1сап!ага е! а1., 1998, Се11 Вюсйет. Рипй. 16(1): 51-6; Эирге е! а1., 2004, 1. С1Ш. Епйоспп. Ме!аЬ. 89(1): 3469-73; Ей^агйк е! а1., 1999, Э1аЬе!ек, 48: 86-93 и Хи е! а1., 1999, Э1аЬе!ек 48: 2270-76. В одном примере осуществления настоящего изобретения эксендин-4 дозируется в пределах 5-10 мкг до принятия пищи. В одном примере осуществления настоящего изобретения эксендин-4 вводят подкожно отдельно или в сочетании с ΗΙΡ и/или со стимулирующими островки пептидами. В одном примере осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективную дозу вводят подкожно. В другом примере осуществления изобретения эксендин-4 вводят трансдермально, буккально, перорально в виде капсул, интраназально или с использованием систем доставки лекарственного вещества микроиглами. В другом примере осуществления изобретения терапевтически эффективная доза содержится в композиции замедленного высвобождения, которую необходимо вводить не чаще одного раза в неделю, один раз в 2 недели или один раз в месяц. В одном примере осуществления настоящего изобретения эксендин-4 вводят совместно с ΗΙΡ или иным веществом, вызывающим неогенез островковых клеток или трансформирование клетокпредшественников, пациентам с диабетом 1- и 2-го типов либо пациентам с ожирением, избытком веса, синдромом резистентности к инсулину, нарушенной гликемии натощак, преддиабетом, синдромом поликистозных яичников, метаболическим синдромом и расстройствами пищевого поведения.

Желудочный ингибирующий пептид и ГПП-1 относятся к семейству инкретинов гормонов роста (см. ссылки Сгеи1хГе1й1. 1979, Э1аЬе!о1о_ё1а, 16: 75-85; Сгеп1хГе1й1 апй ЕЬей, 1985, Э1аЬе!о1о_ё1а, 28: 565-573; Ηοίδΐ е! а1., 2001, 8сапй. 1. Сйп. ЬаЬ. Шуей. 8ирр1. 234: 75-85 и УйкЬо11 е! а1., 1ип. 2003, 1. Сйп. Епйоспп. Ме!аЬ. 88(6): 2706-13, каждая из которых инкорпорирована в описание путем отсылки), и в одном примере осуществления настоящего изобретения гормон инкретина или аналог при одновременном использовании ΗΙΡ или без него применяют в способе для стимулирования дифференциации до островков из клеток-предшественников в поджелудочной железе взрослого человека.

В одном примере осуществления настоящего изобретения желудочный ингибирующий пептид или аналог применяют в сочетании с ΗΙΡ или без ΗΙΡ. Рецептура желудочного ингибирующего пептида может быть составлена и введена для целей настоящего изобретения в соответствии с идеями нижеприведенных ссылок, каждая из которых инкорпорирована в описание путем отсылки: Апйегкеп е! а1., 1978, Сйп. Шуей. 62: 152-161; Сгеи!Ге1й! е! а1., РеЬ. 1980, Э1аЬе!ек, 29(2): 140-5; Эирте е! а1., 1973, 1. Сйп. Епйоспп. Ме!аЬ. 37: 826-828; ЕЬей е! а1., 1980, Сйшса1 6айгоеп!его1оду, 9(3): 679-98; Е1аЫ е! а1., 1979, Ат. 1. Ρ^^ώΕ 237: Е185-Е191 и 1994, Кеди1а!огу Ρерййе, 51(1): 63-74; Кгагир е! а1., Шп. 1983, 1. Сйп. Епйоспп. Ме!аЬ. 55(6):1306-12; Кгагир е! а1., 1987, Ме!аЬойкт, 36(7): 677-82; Кгагир е! а1., 1988, Ас!а Мей. 8сапй. 223(5): 437-41; Ьупп е! а1., 2003, РА8ЕВ, 17: 19-93; Мей е! а1., 2002, Кеди1а!огу Ρерййек, 107: 1-3 и №-шк е! а1., 1993, 1. Сйп. Епйоспп. Ме!аЬ. 76(4): 912-7.

В одном примере осуществления настоящего изобретения желудочный ингибирующий пептид вводят внутривенно или подкожно в сочетании с ΗΙΡ или его аналогом или производным и дозируют в пределах 2-10 нг/км веса пациента с целью обеспечения 30-минутной непрерывной внутривенной или подкожной диффузии за 3-5 мин до принятия пищи, до отхода ко сну и с 3 ч ночи. В одном примере осуществления настоящего изобретения желудочный ингибирующий пептид вводят подкожно до принятия пищи, один раз перед сном и в 3 ч ночи. В одном примере осуществления настоящего изобретения желудочный ингибирующий пептид вводят перорально или с помощью инфузионного устройства, или трансдермальных, интраназальных, буккальных систем доставки лекарственного вещества, или систем доставки микроиглами. В другом примере осуществления настоящего изобретения используют композицию замедленного высвобождения, которую необходимо вводить не чаще одного раза в неделю, одного раза в 2 недели или один раз в месяц путем инъецирования. Описание приемлемых композиций для введения желудочного ингибирующего пептида в соответствии со способами изобретения прведено в ссылке Шпек е! а1., 6 Уу. 1989, Э1аЬе!ек Кек. Сйп. йгас!. 7(4): 263-9.

В одном примере осуществления настоящего изобретения ГПП-1 или аналог, либо агонист рецептора ГПП-1, либо ингибитор дипептидил-пептидазы-4 применяют в сочетании с ΗΙΡ, или его аналогом, или производным в способе для стимулирования дифференциации островков из клетокпредшественников. ГПП-1, агонисты рецептора ГПП-1, аналоги ГПП-1 и ингибиторы дипептидилпептидазы-4 могут быть составлены в виде рецептуры и введены для целей настоящего изобретения в соответствии с идеями нижеприведенных ссылок, каждая из которых инкорпорирована в описание путем отсылки: Е1ай1 е! а1., 1994, Кеди1а!огу Ρерййек, 51(1): 65-1 А; 6и!шак е! а1., 1994, Э1аЬе!ек Саге, 77: 103944; Кгеутапп е! а1., 1987, Ьапсе!, 2: 1300-1304; Ьагкеп е! а1., 1996, Э1аЬе!ек, 45(8ирр1. 2): 233А (АЬйгас!); Ьагкеп е! а1., 2001, Э1аЬе!ек Саге, 24(8): 1416-21; Шк! е! а1., 2004, Ат. 1. Ρйук^ο1. Епйоспп. Ме!аЬ. 286(6): Е875-81; Ьи_ёап е! а1., 2000, Иогт. Ме!аЬ. Кек. 32: 424-428; Магсще/ е! а1., Маг. 1998, Се11. Вюсйет. Рипс!. 16(1): 51-6; Ме1ег е! а1., Магсй 2004, Спйса1 Саге МейюШе, 52(3): 848-851; МепеШу е! а1., 2003, Э1аЬе!ек Саге, 26: 2835-41; №-шк е! а1., 1996, Э1аЬе!о1о_ё1а, 39(12): 1546-53; Тйогепк е! а1., Эес. 1995, Э1аЬе!ек Ме!аЬ. 21(5): 311-8; УйкЬо11 е! а1., 2003, 1. Сйп. Епйоспп. Ме!аЬ. 88(6): 2706-13; \\ηιιμ е! а1., 1997, 1. Сйп. Шуей.

- 21 013821

99: 2883-2889 и 2аибег е! а1., 2002, Ьаисе!, 359: 824-30.

В одном примере осуществления настоящего изобретения ГПП-1, агонисты рецептора ГПП-1 и аналоги ГПП-1 вводят подкожно или ингибиторы дипептидил-пептидазы-4 принимают перорально в сочетании с ΗΙΡ, или его аналогом, или производным и дозируют в пределах 400-800 мг в сутки при 8-20 мг/кг веса пациента. В одном примере осуществления настоящего изобретения ГПП-1 вводят перорально или подкожно до принятия пищи, один раз перед сном. В одном примере осуществления настоящего изобретения ГПП-1 вводят с использованием устройства непрерывной подкожной инфузии при скорости 1-30 нг/кг веса тела/мин или с использованием трансдермальной, буккальной или микроигольной системы доставки лекарственного вещества с целью обеспечения 30-минутной непрерывной инфузии путем либо внутривенной, либо подкожной доставки лекарственного вещества за 3-5 мин до принятии пищи, перед отходом ко сну и с 3 ч ночи. В другом примере осуществления настоящего изобретения используют композицию замедленного высвобождения, которую необходимо инъекционно вводить не чаще одного раза в неделю, раз в 2 недели или один раз в месяц.

В одном примере осуществления настоящего изобретения нечеловеческий/хомячковый ΙΝΟΑΡ вводят подкожно в сочетании с ΗΙΡ, или его аналогом, или производным при дозах 5-20 мг/кг веса пациента на вес тела в день. В другом примере осуществления настоящего изобретения хомячковый ΙΝΟΑΡ вводят при непрерывной подкожной инфузии в течение 24 ч. В другом примере осуществления настоящего изобретения хомячковый ΙΝΟΑΡ вводят разделенными на курс лечения лекарственными дозами в течение дня до принятия пищи, один раз перед сном. В другом примере осуществления настоящего изобретения хомячковый ΙΝΟΑΡ вводят путем непрерывной инфузии с помощью устройства внутривенной доставки или подкожной доставки лекарственного вещества, путем непрерывной инфузии с помощью насоса, трансдермального пластыря, путем перорального приема капсул и микроигольной системы доставки лекарственного вещества с целью обеспечения доставки хомячкового ΙΝΟΑΡ при неизменном базальном уровне. В другом примере осуществления настоящего изобретения хомячковый ΙΝΟΑΡ доставляют путем непрерывной инфузии либо внутривенно, либо подкожно с доставкой болюса до приема пищи. В другом примере осуществления настоящего изобретения используют композицию замедленного высвобождения, которую необходимо инъекционно вводить не чаще одного раза в неделю, раз в 2 недели или один раз в месяц.

В одном примере осуществления настоящего изобретения лираглютид (ΝΝ2211) вводят подкожно в сочетании с ΗΙΡ, или его аналогом, или производным при дозах 10-40 мкг/кг веса тела. В другом примере осуществления настоящего изобретения лираглютид вводят подкожно до принятия пищи, один раз перед сном и в 3 ч ночи. В другом примере осуществления настоящего изобретения лираглютид вводят с использованием инфузионного устройства или систем трансдермальной, буккальной или микроигольной доставки лекарственного вещества с целью обеспечения 30-минутной непрерывной инфузии путем либо внутривенной, либо подкожной доставки за 3-5 мин до принятия пищи, до отхода ко сну и начиная с 3 ч ночи. В другом примере осуществления настоящего изобретения используют композицию замедленного высвобождения, которую необходимо инъекционно вводить не чаще одного раза в неделю, раз в 2 недели или раз в месяц.

При применении комбинаторных методов лечения настоящего изобретения лираглютид, или ΝΝ2211, вводят при дозе, составляющей приблизительно 20 мкг/кг веса пациента ежедневно. Указанная доза позволяет пациентам снизить прием болюсного инсулина на 10-20% до принятия пищи при снижении колебаний и пониженном уровне постпрандиальной глюкозы, глюкагона и триглицеридов. Введение лираглютида в соответствии со способом настоящего изобретения может быть использовано для улучшения гликемического контроля на основе измерений, например, без ограничений гемоглобина Α1ί.' при диабете 1-го типа; предотвращения развития нарушенной толерантности к глюкозе при диабете; предотвращения развития нарушенной гликемии натощак в нарушение толерантности к глюкозе и в диабет; реверсирования вновь диагностированного диабета 2-го типа и лечения диабета 2-го типа.

В примере осуществления комбинаторной терапии в соответствии с настоящим изобретением лираглютид, или ΝΝ2211, вводят взрослому пациенту утром, приблизительно за 4 ч до принятия пищи и при отходе ко сну в течение 3 последовательных недель при дозе приблизительно 20 мкг/кг веса пациента. В том случае, когда пациент приступает к лечению при уровнях С-пептида ниже приблизительно 1,0 нг/мл, производится контроль уровней С-пептида, и при превышении ими 0,5 нг/мл вводят антитело ЮКТ3у1 (Л1а-Л1а) в течение 12 последовательных дней.

При использовании комбинаторных методов лечения в соответствии с настоящим изобретением эксендин-4, или синтетический эксендин-4, или другой аналог ГПП-1, агонит рецептора ГПП-1 или ингибитор дипептидил-пептидазы-4 вводят отдельно до принятия пищи либо в сочетании с ΗΙΡ или иным дифференцирующим островки веществом с целью улучшения гликемического контроля до проведения ΗΙΡ терапии или на начальном этапе ΗΙΡ терапии. Такие вещества, доставляемые до принятия пищи, могут привести к снижению необходимого количества инсулина как минимум на 20%, и при принятии ΗΙΡ или иных дифференцирующих островки лекарственных веществ может быть обеспечено соответствующее постепенное снижение дозы инсулина и диабетических препаратов. (Ьеуе1аи е! а1., Э|аЬе1е5 Саге, 2003 1аи.; 26(1): 1-8). По мере доставки ΗΙΡ и/или иных лекарственных веществ в организм пациентов с

- 22 013821 диабетом как 1-, так и 2-го типа необходимо проводить осторожное постепенное снижение дозы инсулина и диабетических препаратов с целью защиты против гипогликемии по мере дифференциации новых островковых клеток от клеток-предшественников. В конечном счете предусматривается сокращение инсулина и диабетических препаратов, включая ΗΙΡ, по мере репопуляции поджелудочной железы новыми функциональными островковыми клетками. В том случае, когда пациент приступает к лечению при уровнях С-пептида ниже приблизительно 1,0 нг/мл, производится контроль уровней С-пептида, и при превышении ими 0,5 нг/мл проводят тщательный мониторинг и постепенное снижение доз экзогенного инсулина.

До того как приступить к лечению с применением ΗΙΡ и/или иных пептидных соединений пациентам с диабетом 1-го типа вводят до проведения иммунной терапии, в течение или после нее, симлин™, хомячковый ΙΝΟΑΡ, ГПП-1, агонисты рецептора ГПП-1, аналоги ГПП-1, ингибиторы ДПП-4 для защиты вновь образовавшихся островков. Например, антитело Ь0КТ3у1 (А1а-А1а) вводят в течение 12 последовательных дней, при этом его эффективность проявляется после проведения первого курса лечения по завершении 24 месяцев, в то время как аналогичное гуманизированное моноклональное антитело, СНАДуСЭЗ. может вводиться в течение 6 последовательных дней и затем введение может повторяться ежегодно. Соединение ΟΑΌ65, разработанное компанией П1атуб, доставляют путем двух подкожных инъекций с интервалом в один месяц. Применение ΌΙΑΡΕΡ277™, белка теплового шока 60, оказалось успешным среди пациентов с вновь диагностированным диабетом, для лечения которых использовались подкожные инъекции в количестве 1 мг с 40 мг маннитола в растительном масле на начальном этапе исследования, спустя 1 месяц и спустя 6 месяцев. Цикличность лечения определяется исходя из выбранного иммуномодулятора. В другом примере осуществления настоящего изобретения ΌΙΑΡΕΡ277™, вакцина белка теплового шока 60, ΌΙΑΡΕΡ277™ и вакцина ГВС-У80, являющаяся синтетической метаболически неактивной формой инсулина, предназначенной для предотвращения деструкции панкреатических бета-клеток, либо вакцинация интерферон-альфа, с использованием СЭ4 'СЭ25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток, либо аналогичное вещество используют в комбинаторной терапии. В другом примере осуществления настоящего изобретения используют способы, в которых применяют иммуномодуляцию, включающую без ограничения использование анти-СЭЗ иммунотерапии, при этом иммуномодуляция включает сиролимус (рапамицин), такролимус (РК506), белок теплового шока 60 (ΌΙΑΡΕΡ277™), вакцину антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (ΟΑΌ65), мофетилмикофенолат в отдельности или в сочетании с даклизумабом, анти-СЭ20 агент, ритуксимаб, Кэмпас-1Н (анти-СЭ52 антитело) и/или витамин Ό, используемые по отдельности или в сочетании с терапевтическими способами по применению регуляторных Т-клеток либо непосредственно, либо путем применения анти-СЭЗ иммунотерапии.

Вещества, ингибирующие, блокирующие или разрушающие аутоиммунные клетки, выбирающие в качестве мишени клетки внутри панкреатических островковых структур.

Аутоиммунные клетки, выбирающие в качестве своей мишени панкреатические бета-клетки, являются этиологическим фактором при возникновении, по меньшей мере, ряда заболеваний и состояний, поддающихся к излечению в соответствии со способами настоящего изобретения. См. ссылки ВасЬ с1 а1., 2001, Αηη. Ееу. Iттиη. 19: 131-161; Ьеттагк е1 а1., Нпбоспп. Ме!аЬ. С1т. Ν. Αт. 20(3): 589-617 и МаШщ с1 а1., Эес. 2001, №1иге, 414(6865): 792-798, каждая из которых инкорпорирована в описание путем отсылки.

Способы лечения известного уровня техники, предусматривающие введение иммунных веществ пациентам с диабетом 1-го типа, позволяют защитить только те островковые клетки, которые еще не были разрушены в результате иммунной атаки, и не решают проблему репопуляции поджелудочной железы новыми островковыми структурами с полностью функциональными бета-клетками. Указанные способы сочетают неспецифическую и специфическую иммунную модуляцию, направленную на снижение деструкции бета-клеток, и методологию дифференциации новых островковых клеток от клетокпредшественников в поджелудочной железе взрослого человека.

В способах настоящего изобретения могут использоваться вещества, специфически ингибирующие активность аутоиммунных клеток, блокирующие или разрушающие аутоиммунные клетки, которые выбирают своей мишенью панкреатические бета-клетки, вырабатывающие инсулин, амилин ил глюкагон. Такие вещества включают иммуномодуляторные пептиды, блокирующие деструкцию панкреатических островковых клеток. Например, одним таким веществом является моноклональное антитело, способное задержать прогрессию потери островковых клеток, либо замедлить, либо остановить наступление заболевания диабетом 1-го типа. Анти-СЭ3 антитела образуют общий класс веществ, являющихся полезными в способах настоящего изобретения. Например, приемлемые анти-СО3 антитела для целей настоящего изобретения включают антитело ТЕХ4 (ΑΗ-ΑΗ и СйΑд1уС^3), разработкой которого занимается компания То1егВх, и гуманизированное анти-СЭ3 антитело, описанное в ссылке Иего1б е1 а1., 30 Мау 2002, ΝΕΙΜ, 346(22): 1692-1698, инкорпорированной в описание путем отсылки. В одном примере осуществления настоящего изобретения гуманизированное анти-СО3 антитело доставляют внутривенно в течение 14 дней в год при дозе 1-1,42 мкг/кг на 1-й день, 5,67 мкг/кг на 2-й день, 11,3 мкг/кг на 3-й день,

- 23 013821

22,6 мкг/кг на 4-й день и 45,4 мкг/кг на 5-14-й дни. Указанные методы лечения могут быть применены повторно каждый год после применения Н1Р в течение 3-6-месячного периода при одновременном постепенном снижении дозы инсулина по мере образования новых островковых клеток. В течение этапа лечения с применением Н1Р можно продолжить прием витамина Ό и использование прамлинтида/симлина™. Иосле прекращения введения Н1Р и инсулиновой терапии ежегодно повторяется иммунная модуляция для анти-СО3 антител, хотя недавно проведенное исследование позволило обнаружить их эффективность, сохраняющуюся в течение 24 месяцев (Него1б. Э|аЬе1е5. 2005; 54(6): 1763-9).

В другом примере осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующее соединение представляет собой белок теплового шока, способный блокировать или замедлять деструкцию островковых клеток. Такие белки включают П1АРЕР277™, белок теплового шока, разработка которого ведется компанией Оеуе1одеп АО (см. ссылку Ках е! а1., 2002, Ьапсе!, 358(9295): 1749-53, инкорпорированную в описание по отсылке). В одном примере осуществления настоящего изобретения Э1АРЕР277™ доставляют подкожно в количестве 1 мг в 40 мг маннитола в растительном масле на начальном этапе и с интервалом в один месяц, а затем дважды с интервалом в 3 месяца. В одном примере осуществления комбинаторной терапии настоящего изобретения Н1Р, или аналог, или производное Н1Р вводят совместно с Э1АРЕР277™ в соответствии с нижеописанной процедурой. Сначала вводят подкожно Э1АРЕР277™ при дозе приблизительно 1 мг приблизительно за 30 дней до начала проведения терапии с применением Н1Р, или аналога, или производного Н1Р. Второе введение Э1АРЕР277™ осуществляют в период (90 дней после первого введения) начального проведения терапии с применением Н1Р, или аналога, или производного Н1Р.

Н1Р, или его аналог, или производное доставляют путем подкожной инъекции, перорально через везикулы, действующие на печень, или другое липосомное вещество, либо путем 24-часовой непрерывной подкожной инфузии при дозе приблизительно 5-20 мг/кг веса тела пациента таким образом, чтобы доза составила приблизительно 600-800 мг/сутки на пациента. Терапию с применением Н1Р, или его аналога, или производного проводят в течение 3-6-месячного периода и проводят тщательный контроль на основе выработки С-пептида. Иредусматривается проведение иммунотерапии на циклической основе исходя из выбранного иммунного вещества. Например, Э1АРЕР277™ вводят с 3-месячным интервалом в течение полных 6 месяцев и первоначально предусматривается его доставка за 6 месяцев до проведения терапии с применением Н1Р, или его аналога, или производного (Ках е! а1., ЬапсеЕ 2001 №у. 24; 358(9295): 174953).

Составление, введение и дозирование иммуномодуляторных веществ, используемых в способах настоящего изобретения, может быть осуществлено в соответствии со способами известного уровня техники или способами, приведенными в настоящем описании. Фармацевтические композиции и дополнительные протоколы дозирования и введения для реализации способов изобретения описаны ниже.

Аддитивность/синергизм.

Композиции Н1Р, или его аналога, или производного, например безглютаматный Н1Р, Н1Р триптофан, Н1Р валин-трипитофан, Н1Р гексапептид, Н1Р септапептид, Н1Р второй септапептид или триптофанбезглютаматный Н1Р и их фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры, являются синергически или аддитивно эффективными для осуществления дифференциации клеток-предшественников в новые островковые клетки при лечении диабета или аналогичных заболеваний при сочетании с другими различными соединениями. Указанные соединения включают Н1Р, или его аналоги, или производные, амилин и/или аналог, включая без ограничений симлин/прамлинтид, ГИИ-1, агонисты рецептора ГИИ-1, такие как эксендин-4, лираглютид (NN2211), аналоги ГИИ-1, ингибиторы дипептидил-пептидазы-4, желудочный ингибирующий пептид, хомячковый ШОАР и другие инкретин-миметические гормоны и/или аналогичным образом действующие соединения и вещества, и вещества, удлиняющие время полужизни, либо повышающие уровень или активность любого из вышеперечисленных соединений и веществ, таких как, например, ингибиторы дипептидил-пептидазы-4, замедляющий деградацию ГИИ-1, и вещества, ингибирующие, блокирующие или разрушающие аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью бета-клетки, и включающие без ограничений анти-СЭ-Л антитела (1ι0ΚΤγ71 (А1а-А1а и СЬАд1уСП3)), сиролимус (рапамицин), такролимус (РК506), белок теплового шока 60 (П1АРЕР277™), вакцину антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (ОАЭ65), мофетилмикофенолат в отдельности или в сочетании с даклизумабом, анти-СЭ20 агент, ритуксимаб, Кэмпас-1Н (анти-СЭ52 антитело), лизофиллин и витамин Ό, 1ВС-У80 вакцину, являющуюся синтетической, метаболически неактивной формой инсулина, предназначенной для предотвращения деструкции панкреатических бета-клеток и вакцинацию интерфероном-α с использованием СЭ4'СЭ25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток, либо аналогичное вещество, предназначенное для предотвращения деструкции панкреатических бета-клеток. В данном последнем примере осуществления изобретения вакцинацию интерфероном-α с использованием ί.Ό4'ί.Ό25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток либо аналогичное вещество используют в сочетании с комбинаторной терапией для применения регуляторных Т-клеток либо непосредственно, либо путем использования анти-СО3 иммунотерапии.

- 24 013821

Такие соединения, как сиролимус (рапамицин), такролимус (ЕК506), антитело ΤΚΧ4, гиманизироанное анти-СИ3 антитело, ΌΥΑΜΙΌ™ анти-САЭ65 антитело и ΌΙΑΡΕΡ277™, также являются синергически или аддитивно эффективными при их совместном применении с ΗΙΡ или веществом для осуществления дифференциации клеток-предшественников в новые островковые клетки при лечении диабета или аналогичных заболеваний.

Синергизм определяется как взаимодействие двух или более веществ, благодаря которому их совместное воздействие сильнее, чем сумма их отдельных воздействий. Например, если воздействие только одного лекарственного препарата А при лечении заболевания составляет 25% и воздействие только одного лекарственного препарата В при лечении заболевания составляет 25%, то при сочетании двух лекарственных препаратов воздействие при лечении болезни составляет 75%, т.е. воздействие препаратов А и В является синергическим.

Аддитивность определяется как взаимодействие двух или более веществ, в результате которого их совместное воздействие аналогично среднему их отдельных воздействий. Например, если воздействие только одного лекарственного препарата А при лечении заболевания составляет 25% и воздействие только одного лекарственного препарата В при лечении заболевания составляет 25%, то при сочетании двух лекарственных препаратов воздействие при лечении болезни составляет приблизительно 50% или по меньшей мере превышает 25%, т.е. воздействие препаратов А и В является аддитивным.

Улучшение лекарственного лечебного режима может быть достигнуто путем совместного введения двух веществ, обладающих терапевтическим эффектом, если результатом взаимодействие двух или более веществ является их совместное воздействие, обеспечивающее снижение частоты побочных реакций, вызываемых либо одним, либо двумя веществами, используемыми при совместной терапии. Такое снижение частоты побочных реакций может являться результатом, например, введения меньших доз одного либо обоих веществ, используемых при совместной терапии. Например, если воздействие только одного лекарственного препарата А составляет 25% и его частота побочных реакций составляет 45% при использовании этикетированной дозы и воздействие только одного лекарственного препарата В составляет 25% и его частота побочных реакций составляет 30% при использовании этикетированной дозы, то при сочетании двух лекарств при дозах каждого препарата менее этикетированных доз обеспечивается достижение улучшения лекарственного лечебного режима, если общее воздействие составляет 35% и частоте побочных реакций - 20%. Комбинаторная терапия, предусматриваемая настоящим изобретением, включает терапии, демонстрирующие такое улучшение.

Фармацевтические композиции, дозирование и введение.

Дозирование и введение веществ, применяемых в способах настоящего изобретения в соответствии с описанием, обеспечивают ускоренную дифференциацию островков от клеток-предшественников взрослого человека с целью оптимизации возможностей человека секретировать инсулин из эндогенных вновь образовавшихся островковых структур в сочетании с используемыми методами иммунотерапии и методами лечения, которые обеспечивают минимальную токсичность при одновременной защите от разрушения новых островков. Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают кинетическую доставку указанных веществ, простоту доставки и повышенную эффективность.

В одном примере осуществления настоящего изобретения предусматривается дозированное подкожное введение пептида ΗΙΡ в пределах 20-2000 мг (0,02857-285,7 мг/кг) четыре раза в день препрандиально, до каждого принятия пищи и введение одной дозы при отходе ко сну.

В другом примере осуществления настоящего изобретения предусматривается введение пептида ΗΙΡ при дозе приблизительно 200 мг (2,857 мг/кг) четыре раза в день препрандиально, до каждого принятия пищи и введение одной дозы при отходе ко сну.

Предпочтительно, чтобы пептид ΗΙΡ доставляли в дозах 10-15 мг/кг путем четырех отдельных подкожных инъекций и общее количество составляло бы приблизительно 800 мг/день.

Пептид ΗΙΡ можно вводить от нескольких раз до максимально 20 раз в день либо путем непрерывной инфузии.

Вещества, используемые в способах настоящего изобретения, могут вводиться с использованием различных способов применения. Известные вещества, используемые в способах настоящего изобретения, могут быть введены различными путями с использованием фармацевтических композиций, ранее разработанных для других показаний. Такие пути доставки большинства известных веществ включают, по меньшей мере, пероральную доставку, системы целевой и нецелевой липосомной доставки лекарственных средств для пероральной или подкожной доставки, которые могут включать везикулы, действующие на печень (ΑΜΌΟ/8ΌΟ), прикрепленные к ΗΙΡ или соединениям, используемым в описанных в настоящее патенте методологиях, топическую доставку, включающую системы топической доставки мицелл и наносфер, подкожная доставка, включающая непрерывную инфузию с помощью насоса путем либо внутривенной либо подкожной доставки и одноразовые микронасосы и микроиглы (включая без ограничений микронасосы и микроиглы, производимые компанией Απίιηαδ Согр.) и буккальную доставку.

- 25 013821

Конкретный путь введения и фармацевтическая композиция вещества, используемого при реализации способов настоящего изобретения, будут выбраны врачом исходя из заболевания и состояния пациента, проходящего лечение, и исходя из применяемого вещества. В способах настоящего изобретения может быть использовано широкое разнообразие фармацевтических композиций. В ряде примеров осуществления настоящего изобретения препараты широкого применения могут быть использованы для упрощения введения веществ и повышения эффективности.

В одном примере осуществления настоящего изобретения одно или несколько веществ, применяемых в настоящем способе, имеют рецептуру, составленную в виде мицеллы. Нередко максимально простое введение достигается путем перорального введения. В то время как синтетические фармацевтические вещества могут быть нередко легко составлены для пероральной доставки, составление фармацевтических веществ на основе пептидов и протеинов для пероральной доставки может оказаться более сложным. Тем не менее, существуют приемлемые технологии для составления композиций, и в соответствии с одной важной особенностью настоящее изобретение предусматривает создание протеиновых и пептидных фармацевтических композиций, составленных для пероральной доставки. В одном примере осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции, применяемые в способах настоящего изобретения и приемлемые для пероральной доставки, в основном составляют в соответствии с известной технологией ТЕСНХО8РНЕЯЕ™, разработанной компанией МаппКтб Согр., технологией ЕЬЮЕХ®, разработанной компанией ЕтЪрйеге, и в виде систем назальной доставки, разработанных компанией Хайесй, и в форме липосом перорального применения с избирательным воздействием на печень (везикулы доставки лекарственного препарата к печени), разработанных АМЭС/8ЭС.

Другие технологии пероральной доставки и инкапсулирования, приемлемые для изготовления фармацевтических композиций настоящего изобретения, включают везикулярный транспорт лекарственного препарата к печени (ΗΌν). Технология везикулярного транспорта лекарственного препарата к желудочной железе (ΡΌν) была предложена компанией СигеЭМ для компании 8ЭС/АМЭС в целях возможного ее использования при доставке соединений, описанных в способах в настоящем патенте. Технология ΗΌν может быть использована для доставки соединений в соответствии с описанными методологиями, включая ΗΙΡ (Όιινίδ е! а1., 2001, I. 01аЬе1е5 Сотр. 15(5): 227-33) и ГШ1-1 непосредственно к печени. Технология ΡΌν предусматривает создание липосом с конъюгированным белком или иной молекулой на их поверхности, которая направляет непосредственно к поджелудочной железе вещество, такое как пептид, стимулирующий неогенез островковых клеток.

Вещества, рецептура которых может быть составлена для пероральной доставки и которые могут быть использованы в способах настоящего изобретения, включают ΗΙΡ, или его аналог, или производное, включающее безглютаматный ΗΙΡ, ΗΙΡ триптофан, ΗΙΡ валин-триптофан, ΗΙΡ гексапептид, ΗΙΡ септапептид, второй ΗΙΡ септапептид или триптофан-безглютаматный ΗΙΡ, симлин™/пармлинтид, эксендин-4, лираглютид (NN2211), агонисты рецептора ГПП-1, ГПП-1, аналоги ГПП-1, хомячковый ΙΝ6ΑΡ и его аналоги, желудочный ингибирующий пептид, ингибитор дипептидил-пептидазы-4 и пептиды и протеины или непептидные ниметики с аналогичным действием или гомологией по отношению к предшествующим веществам, использовавшимся с моноклональными антителами или иными специфическими и общими иммунными веществами, предназначенными для замедления прогрессии потери бета-клеток или для предотвращения наступления диабета 1-го типа как у детей, так и у взрослых, включая без ограничений анти-СО-3 антитела (11ОКТ3у1 (А1а-А1а и СйАд1уСО3)), целью которых является иммунный ответ и которые, в частности, блокируют Т-лимфоциты, вызывающие гибель бета-клеток при сахарном диабете 1-го типа, а также сиролимус (рапамицин), такролимус (ЕК506), белок теплового шока 60 (^IΑΡЕΡ277™), вакцину антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (САО65), мофетилмикофенолат в отдельности или в сочетании с даклизумабом, анти-СЭ20 агент, ритуксимаб, Кэмпас-1Н (анти-СЭ52 антитело), лизофиллин и витамин Ό, ГВС-У8О вакцину, являющуюся синтетической, метаболически неактивной формой инсулина, предназначенной для предотвращения деструкции панкреатических бетаклеток, вакцинацию интерфероном-α с использованием ί.'Ό4'ί.'Ό25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток, либо аналогичное вещество используют в комбинаторных терапевтических методах по применению регуляторных Т-клеток либо непосредственно, либо путем использования иммунотерапии для блокирования деструкции производящих инсулин клеток.

Наборы.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает создание наборов для лечения пациентов, имеющих диабет 1-го типа или диабет 2-го типа, либо иные расстройства глюкозного метаболизма у детей и взрослых, включающие преддиабет, нарушение гликемии натощак, синдром инсулинорезистентности, метаболический синдром, ожирение, избыточный вес, синдром поликистозных яичников, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию, при этом наборы содержат один или несколько терапевтически эффективных способов их лечения с использованием ΗΙΡ, его аналогов или производного (например, ΗΙΡ триптофан, безглютаматный ΗΙΡ, ΗΙΡ валин-триптофан, ΗΙΡ гексапептид, ΗΙΡ септапептид, второй ΗΙΡ септапептид или триптофан-безглютаматный ΗΙΡ). Выборочно набор также может содержать другие вещества (например, симлин™/пармлинтид, эксендин-4, желудочный ингибирующий пептид, агонисты

- 26 013821 рецептора ГПП-1, лираглютид (NN2211), аналоги ГПП-1, хомячковый ΙΝΟΑΡ или ингибитор дипептидил-пептидазы) и/или вещества, ингибирующие, блокирующие или разрушающие аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью панкреатические островковые клетки, включающие без ограничений антиСЭ-3 антитела (1ιϋΚΤ3γ 1 (А1а-А1а и С11А§1уСО3)). целью которых является иммунный ответ и которые, в частности, блокируют Т-лимфоциты, вызывающие гибель островковых клеток при сахарном диабете 1-го типа, а также сиролимус (рапамицин), такролимус (РК506), белок теплового шока 60 (ΌΙΑΡΕΡ277™), вакцину антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (ΘΑΌ65), мофетилмикофенолат в отдельности или в сочетании с даклизумабом, анти-СЭ20 агент, ритуксимаб, Кэмпас-1Н (анти-СЭ52 антитело), лизофиллин и витамин Ό, ГВС-У80 вакцину, являющуюся синтетической, метаболически неактивной формой инсулина, предназначенной для предотвращения деструкции панкреатических бетаклеток, вакцинацию интерфероном-α с использованием СЭ4'СЭ25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток, либо аналогичное вещество используют в комбинаторных терапевтических методах по применению регуляторных Т-клеток либо непосредственно, либо путем использования иммунотерапии для блокирования деструкции производящих инсулин клеток либо в одной и той же, либо в отдельной упаковке с инструкциями по их использованию.

Антитела специфические для ΗΙΡ и его аналогов или производных.

В различных примерах осуществления настоящего изобретения для проведения иммунологических анализов могут быть использованы моноклональные или поликлональные антитела, являющиеся специфическими для ΗΙΡ, или его аналогов, или производных, с целью измерения количества ΗΙΡ, или его аналогов, или производных либо они могут быть использованы при иммуноаффиной очистке ΗΙΡ, или его аналогов, или производных. Для идентификации гидрофильных областей белка и для идентификации эпитопов ΗΙΡ, или его аналогов, или производных может быть использован гидрофильный анализ компании Иорр & \Уооб5 (см. Иорр & ХУооб^ ΡΐΌ^ №111. Αсаб. 8с1. υ.8.Α. 78: 3824-3828 (1981)).

Антитела, иммуноспецифически связывающиеся с ΗΙΡ или его аналогами или производными, могут быть получены с помощью любого известного в данной области техники способа для синтезирования антител, в частности, путем химического синтезирования или предпочтительно путем рекомбинантной экспрессии (см., например, υ.8. ΡυΜ^!^ №. 2005/0084449, включенную в настоящее описание по отсылке).

Поликлональные антитела, иммуноспецифические для ΗΙΡ, или его аналогов, или производных, могут быть получены с помощью различных известных в данной области техники способов. Например, ΗΙΡ, или его аналоги, или производные могут быть введены различным животным-хозяевам, включающим без ограничений кроликов, мышей и крыс, с целью индуцирования выработки содержащих сыворотку поликлональных антител, специфических для ΗΙΡ, или его аналогов, или производных. С целью повышения иммунологического ответа могут быть использованы различные адъюванты в зависимости от вида хозяина, включающие без ограничений минеральные гели Фрейнда (полные и неполные), такие как гидроокись алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные адъюванты человека, такие как В СО (бацилла Камельтта-Герина) и согуиеЬас!егшт рапгпп. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области техники.

Моноклональные антитела могут быть получены путем использования различных технологий, известных в данной области техники, включая использование гибридомной технологии, рекомбинантной технологии и технологии фагового дисплея или их сочетаний. Например, моноклональные антитела могут быть получены с использованием гибридомных технологий, включающих технологии, известные в данной области техники и идеи которых излагаются, например, в Иаг1о\\· е! а1., ЛиНЬоФех: Α ЬаЬога!огу Маииа1. (Со1б 8ргтд ИагЬог ЬаЬога!огу Ρκδδ, 2'¹ еб. 1988) аиб ИаттеНтд е! а1. ш: Моиос1оиа1 Αи!^Ьοб^е8 аиб Τ Се11 ИуЬпбопт 563 681 (ЕРе^че!; КУ., 1981). Термин моноклональное антитело для целей настоящего описания не ограничен антителами, полученными путем гибридомной технологии. Термин моноклональное антитело относится к антителу, полученному из единичного клона, включающего любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не способ, в соответствии с которым он получен.

Способы получения и скрининга специфических антител с использованием гибридомной технологии являются стандартными и хорошо известными в данной области техники. Вкратце, мышь может быть иммунизирована немышиным антигеном и после обнаружения иммунного ответа, например при обнаружении в сыворотке мыши антител специфических для антигена, селезенку мыши изымают и выделяют спленоциты. Далее, используя хорошо известные способы, производят слияние спленоцитов с любыми приемлемыми клетками миеломы, например с клетками из клеточной линии 8Ρ20, поставляемой компанией АТСС. Гибридомы выбирают и клонируют методом предельного разведения. Далее проводят анализ гибридомных клонов с помощью известных в данной области техники способов на наличие клеток, секретирующих антитела, способные связывать полипептид в соответствии с настоящим изобретением. Асцитная жидкость, обычно содержащая высокие уровни антител, может быть получена путем иммунизации мышей положительными гибридомными клонами.

- 27 013821

Настоящее изобретение предусматривает создание способов получения моноклональных антител, а также антител, полученных с помощью способа, включающего культивирование гибридомных клеток, секретирующих антитела в соответствии с настоящим изобретением, в которых гибридому предпочтительно получают путем слияния сплентоцитов, выделенных из мышей, иммунизированных немышиным антигеном, с клетками миеломы и путем скрининга гибридом, полученных в результате слияния, на наличие гибридомных клонов, секретирующих антитело, способное связываться с антигеном.

Фрагменты антител, распознающие специфические конкретные эпитопы, могут быть получены с помощью любого известного в данной области техники способа. Например, фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')₂ могут быть получены путем протеолитического расщепления иммуноглобулиновых молекул с использованием энзимов (ферментов), таких как папаин (для получения фрагментов ЕаЬ) или пепсин (для получения фрагментов Е(аЬ')₂). Фрагменты Е(аЬ')₂ содержат вариабельную область, константную область легкой цепи и домен С_Н1 тяжелой цепи. Кроме того, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены с использованием различных известных в данной области техники способов фагового дисплея.

При использовании способов фагового дисплея функциональные домены антител отображаются на поверхности фаговых частиц, несущих кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В частности, последовательности ДНК, кодирующие домены ν_Η (вариабельная область тяжелой цепи) и Уь (вариабельная область легкой цепи), усиливаются из библиотек животных комплементарных ДНК (например, библиотеки человеческих или мышиных комплементарных ДНК пораженных тканей). ДНК, кодирующие домены ν_Η и Уь, рекомбинируют вместе с линкером ксЕу путем цепной реакции полимеразы и клонируют в фагемидный вектор. Осуществляют электропорацию вектора в Е.со11 и Е.со11 инфицируют фагом-помощником. Используемые в указанных способах фаги являются обычно нитчатыми фагами, включающими Γά и М 13, и обычно проводят рекомбинантное слияние доменов ν_Η и Уь либо с фаговым геном ΙΙΙ, либо с геном νΙΙΙ. Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, который связывается с конкретным антигеном, может быть выбран или определен с антигеном, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой, либо захваченного твердой поверхностью или гранулой. Примеры способов фагового дисплея, которые могут быть использованы для получения антител в соответствии с настоящим изобретением, включают способы, описанные в Впиктаи е! а1., 1995, 1. Iттиηο1. МеШобк, 182: 41-50; Αтек е! а1., 1995, 1. Iттиηο1. Ме!йобк, 184: 177-186; КеШеЬогоидй е! а1., 1994, Еиг. 1. ^типоЕ 24: 952-958; Ρе^к^с е! а1., 1997, Оеие, 187: 9-18; Вийои е! а1., 1994, Αάνаисек ίη Ιιηιηι.ιπο1θβν. 57: 191-280; [п1егпа1юпа1 аррйса!юи Νο. Ρί’Τ/ΟΒ91/Ο1 134; международные публикации № АО 90/02809; АО 91/10737; АО 92/01047; АО 92/18619; АО 93/11236; АО 95/15982; АО 95/20401 и АО 97/13844; патенты США № 5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727;5733743 и 5969108.

В соответствии с описанием в вышеприведенных ссылках после выбора фага кодирующие антитело области могут быть выделены из фага и использованы для получения двухвалентных антител или любого иного требуемого антигена, связывающего фрагмент и экспрессирующего в любом требуемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии, например, в соответствии с приведенном ниже описанием. Также могут быть применены технологии для рекомбинантного получения фрагментов ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')₂ с использованием известных в данной области техники способов, таких как описаны в международной публикации согласно РСТ № АО 92/22324; МцШиах е! а1., 1992, ВюТесйшдиек, 12(6): 864-869; 5>а\уа1 е! а1., 1995, Α1ΚΙ, 34: 26-34 и Ве!!ег е! а1., 1988, 8с1еисе, 240: 1041-1043.

Для получения двухвалентных антител праймеры ПЦР, включающие нуклеотидные последовательности ν_Η или Уь, сайт рестрикции и фланкирующую последовательность для защиты сайта рестрикции, могут быть использованы для амплификации последовательностей ν_Η или Уь в клонах ксЕу. Использование технологий клонирования, известных специалистам в данной области техники, позволяет клонировать ПЦР-амплифицированные домены ν_Η в векторы, экспрессирующие константную область ν_Η, например человеческую константную область гамма 4, а ПЦР-амплифицированные домены клонировать в векторы, экспрессирующие константную область У_ъ, например в человеческие каппа и лямбда константные области. Предпочтительно, чтобы векторы для экспрессии доменов ν_Η или Уь включали промотор ЕЕ-1а, сигнал секреции, сайт клонирования для вариабельных доменов, константные домены и маркер выделения, такой как неомицин. Домены ν_Η и Уь также могут быть клонированы в один вектор, экспрессирующий необходимые константные области. Конверсионные векторы тяжелой цепи и конверсионные векторы легкой цепи далее совместно трансфектируют в клеточные линии с целью получения стабильных или транзиторных клеточных линий, экспрессирующих полноразмерные антитела, например ЦО, с использованием способов, известных специалистам в данной области техники.

Для применения в ряде случаев, включающих использование ίη νίνο антител в организме человека и использование ίη νίίτο при проведении диагностических анализов, предпочтительным может явиться использование гуманизированных антител или химерных антител. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных известных в данной области техники способов, включающих вышеописанные способы фагового дисплея, с использованием библиотек антител, полученных из последо- 28 013821 вательностей человеческого иммуноглобулина. См. также патенты США № 4444887 и 4716111 и международные публикации № №0 98/46645, №0 98/50433, №0 98/24893, №0 98/16654, №0 96/34096, №0 96/33735 и №0 91/10741.

Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные части антитела получены из различных молекул иммуноглобулина. Способы получения химерных антител известны в данной области техники. См., например, Моткой, 1985, 8с1епсе, 229: 1202; 01 е! а1., 1986, ВюТесйшдиек, 4: 214; 01Шек е! а1., 1989, I 1ттипо1. МеШойк, 125: 191-202 и патенты США № 5807715; 4816567; 4816397 и 6311415.

Гуманизированное антитело является антителом, либо его вариантом, либо фрагментом, способным связываться с заданным антигеном и включающим каркасную область, имеющую в основном аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и комплементарно определяемую область, имеющую в основном аминокислотную последовательность нечеловеческого иммуноглобулина.

Гуманизированное антитело содержит в основном как минимум все из одного и обычно из двух вариабельных доменов (ЕаЬ. ЕаЬ', Е(аЬ')₂, ЕаЬс, Εν), в которых все или в основном все из комплементарно определяемых областей соответствуют областям нечеловеческого иммуноглобулина (т.е. донорское тело) и все или в основном все из каркасных областей являются областями консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Предпочтительно, чтобы гуманизированное антитело также содержало как минимум часть константной области иммуноглобулина (Ес), обычно область человеческого иммуноглобулина. Обычно антитело содержит как вариабельную область легкой цепи, так и, по меньшей мере, вариабельную область тяжелой цепи. Антитело также может включать С_Н1, шарнирные соединения, С_Н2, С_Н3 и С_Н4 участки тяжелой цепи. Гуманизированное антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулина, включающего 1дМ, 1дС, Ι§Ό, 1дА и 1дЕ, и любого изотипа, включающего 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4. Обычно константный домен является связывающим комплемент константным доменом, и в этом случае желательно, чтобы гуманизированное антитело проявляло цитотоксическую активность и относилось бы к классу 1дС1. В тех случаях, когда цитотоксическая активность является нежелательной, константный домен может относиться к классу 1дС2. Гуманизированное антитело может включать последовательности более чем из одного класса или изотипа, и выбор конкретных константных доменов для оптимизации требуемых эффекторных функций находится на усмотрении специалистов в данной области техники. Необязательно, чтобы каркасные и комплементарно определяемые области гуманизированного антитела точно соответствовали родительским последовательностям, например донорская комплементарно определяемая область или консенсусный каркас могут быть мутагенезированы путем замещений, вставок или делеций как минимум одного остатка таким образом, чтобы комплементарно определяемая область и каркасный остаток на сайте не соответствовали ни консенсусному, ни импортированному домену. Тем не менее, такие мутации не будут являться экстенсивными. Обычно как минимум 75% остатков гуманизированного антитела соответствуют остаткам последовательностей родительской каркасной области и комплементарно определяемой области, более часто 90% и наиболее предпочтительно свыше 95%. Гуманизированное антитело может быть получено с использованием различных технологий, известных в данной области техники, включающих без ограничения прививку комплементарно определяемой области (европейский патент № ЕР 239400; международная публикация № №0 91/09967 и патенты США № 5225539; 5530101 и 5585089), венирование и шлифовку (европейские патенты № ЕР 592106 и ЕР 519596; Рай1ап, 1991, Мо1еси1аг 1ттипо1оду, 28(4/5): 489, 498; 8!ийшска е! а1., 1994, Рго!ет Епдтеегтд, 7(6): 805-814 и Кодикка е! а1., 1994, ΡΝΑ8, 91: 969-973), перетасовку цепей (патент США № 5565332) и технологии, раскрытые, например, в патентах США № 6407213; 5766886; №0 9317105; Тап е! а1., I 1ттипо1. 169: 1119-25 (2002); Са1йак е! а1., Рго!ет Епд. 13(5): 353-60 (2000); Могеа е! а1., МеШойк 20(3): 267-79 (2000); Васа е! а1., I Вю1. Сйет. 272(16): 10678-84 (1997); Кодикка е! а1., Рго!ет Епд. 9(10): 895-904 (1996); Сои!о е! а1., Сапсег Кек. 55 (23 8ирр1.): 5973к-5977к (1995); Сои!о е! а1., Сапсег Кек. 55(8): 1717-22 (1995); 8;ιικΙΙιιι 18., Сепе, 150(2): 409-10 (1994) и Рейегкеп е! а1., I Мо1. Вю1. 235(3): 959-73 (1994). Нередко каркасные остатки в каркасных областях будут замещены соответствующим остатком из донорского антитела комплементарно определяемой области с целью изменения, предпочтительно улучшения связывания антигена. Указанные каркасные замещения определяются с помощью хорошо известных в данной области техники способов, например путем моделирования взаимодействий комплементарно определяемой области и каркасных остатков с целью определения каркасных остатков, являющихся важными для связывания антигена и сравнения последовательностей для определения необычных каркасных остатков в определенных позициях (см., например, Онееп е! а1., патент США № 5585089 и Ктесйтаии е! а1., 1988, Ж!иге, 332:323).

Способы получения Н1Р и его аналогов или производных.

Любые технологии, известные в данной области техники, могут быть использованы для очистки Н1Р, или его аналога, или производного, включающие без ограничений разделение путем осаждения, разделение путем адсорбции (например, колончатая хроматография, мембранные адсорбенты, центробежные колонки, периодическая адсорбция, жидкостная хроматография высокого разрешения, ионообменная хроматография, неорганические адсорбенты, гидрофобные адсорбенты, аффинная хроматография с иммобилизованным на носителе металлом, аффинная хроматография) либо разделение в растворе (например, гель-фильтрация, электрофорез, разделения жидкой фазы, разделение с помощью ПАВ, экстрак

- 29 013821 ция с помощью органических растворителей и ультрафильтрация), см., например, 8сорек, ΡΚΟΤΕΙΝ ΡυΚΙΡΊί.ΆΤΙΟΝ. ΡΚΙΝΟΡΕΕδ ΑΝΌ ΡΕΑί.’ΤΙί.Έ. 3'¹ ей., 8рттдет (1994). В процессе очистки контроль за биологической активностью ΗΙΡ, или его аналога, или производного может осуществляться путем проведения одного или нескольких ίη νίίτο или ίη νίνο. Анализ на определение степени чистоты ΗΙΡ, или его аналога, или производного может быть проведен с помощью любых способов, известных в данной области техники, включающих без ограничения гель-электрофорез, см. 8соре§, кирга. В некоторых примерах осуществления настоящего изобретения содержание ΗΙΡ, или его аналога, или производного, используемых в композиции настоящего изобретения, может находиться в пределах от 80 до 100% от общего веса протеина (в мг) или составлять как минимум 80%, как минимум 85%, как минимум 90%, как минимум 95% или как минимум 98% от общего веса протеина (в мг). В одном примере осуществления настоящего изобретения содержание ΗΙΡ, или его аналога, или его производного, используемого в композиции настоящего изобретения, составляет как минимум 99% от общего количества протеина. В другом примере осуществления настоящего изобретения ΗΙΡ, или его аналог, или производное очищают до кажущейся однородности в соответствии с результатами проведенного анализа, например, путем проведения полиакриламидного гель-электрофореза с додецилсульфатом натрия.

Способы, известные в данной области техники, могут быть использованы для рекомбинантного получения ΗΙΡ, или его аналога, или производного. Нулкеиновокислотная последовательность, кодирующая ΗΙΡ, или его аналог, или производное, может быть вставлена в вектор экспрессии для репродукции и экспрессии в клетках-хозяевах.

Для целей настоящего описания экспрессионная конструкция относится к нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей ΗΙΡ, или его аналог, или производное, операбельно ассоциированной с одной или несколькими регуляторными областями, обеспечивающими экспрессию ΗΙΡ, или его аналога, или производного в соответствующей клетке-хозяине. Операбельно-ассоциированный относится к ассоциации, в которой регуляторные области и экспрессируемые ΗΙΡ, или его аналог, или производное соединяются и располагаются таким образом, чтобы обеспечить транскрипцию и в конечном счете трансляцию.

Регуляторные области, необходимые для транскрипции ΗΙΡ, или его аналога, или производного, могут быть обеспечены с помощью вектора экспрессии. Также может быть обеспечен кодон инициации трансляции (ΑΤΟ), если предусматривается экспрессия генной последовательности ΗΙΡ, или его аналога, или производного, в которой отсутствует ее когнатный кодон инициации. В совместимой системе хозяин-конструкция клеточные транскрипционные факторы, такие как полимераза РНК, будут связываться с регуляторными областями на экспрессионной конструкции с целью воздействия на транскрипцию последовательности ΗΙΡ в организме-хозяине. Точная природа регуляторных областей, необходимых для генной экспрессии, может варьироваться в зависимости от клетки-хозяина. В целом необходим промотор, способный связывать полимеразу РНК и активирующий транскрипцию операбельноассоциированной нуклеиново-кислотной последовательности. Такие регуляторные области могут включать 5' некодирующих последовательностей, задействованных в инициации транскрипции и транслитерации, такие как ТАТА бокс, кэппинг-последовательность, СААТ-последовательность и т. п. Некодирующая область 3' к кодирующей последовательности может содержать транскрипционные терминационные регуляторные последовательности, такие как терминаторы и сайты полиаденилирования.

С целью присоединения ДНК-последовательностей с регуляторными функциями, такими как промоторы, к генной последовательности ΗΙΡ, или его аналога, или производного либо для вставки генной последовательности ΗΙΡ, или его аналога, или производного в клонирующий сайт вектора линкеры или адаптеры, обеспечивающие соответствующие совместимые рестрикционные сайты, могут быть лигированы к концам комплементарных ДНК с помощью хорошо известных в данной области техники способов (см., например, XVи е1 а1., 1987, Ме11юЙ5 ίη Еп7уто1, 152: 343-349). После расщепления с помощью рестрикционных энзимов может быть проведена модификация с целью создания тупоконечных концов путем обратного дигерирования или заполнения концов однонитиевой ДНК до сшивания. В альтернативном случае требуемый сайт рестрикционного энзима может быть введен в фрагмент ДНК путем амплификации ДНК с использованием ПЦР с праймерами, содержащими требуемый сайт рестрикционного энзима.

Экспрессионная конструкция, включающая последовательность ΗΙΡ, или его аналога, или производного, операбельно-ассоциированную с регуляторными областями, может быть непосредственно введена в соответствующие клетки-хозяева для экспрессии и продукции ΗΙΡ, или его аналога, или производного без дополнительного клонирования. См., например, патент США № 5580859. Экспрессионные конструкции также могут содержать последовательности ДНК, упрощающие интегрирование последовательности ΗΙΡ или его аналога или производного в геном клетки-хозяина, например, путем гомологической рекомбинации. В этом случае отпадает необходимость в использовании вектора экспрессии, содержащего репликатор, приемлемый для соответствующих клеток-хозяев для пропагации и экспрессии ΗΙΡ, или его аналога, или производного в клетках-хозяевах.

- 30 013821

Может быть использовано большое разнообразие векторов экспрессии, включающих без ограничения плазмиды, космиды, фаги, фагмиды или модифицированные вирусы. Такие системы хозяинэкспрессия представляют собой носители, с помощью которых кодирующие последовательности гена ΗΙΡ, или его аналога, или производного могут быть продуцированы и в последующем очищены, но также представляют собой клетки, которые могут при трансформировании или трансфектировании соответствующими нуклеотидными кодирующими последовательностями экспрессировать ΗΙΡ, или его аналог, или производное ш κίΐιι. Они включают без ограничений такие микроорганизмы, как бактерии (например, Е.сой и В.киЬййк), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии бактериофаговой ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими кодирующие последовательности ΗΙΡ, или его аналога, или производного; дрожжи (например, 8ассйаготусек, Ρ^сй^а), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии, содержащими кодирующие последовательности ΗΙΡ, или его аналога, или производного; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, бакуловирус), содержащими кодирующую последовательность ΗΙΡ, или его аналога, или производного; клеточные системы растений, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например, вирус мозаики цветной капусты; вирус мозаики табака), либо трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Τι плазмид), содержащими кодирующие последовательности ΗΙΡ, или его аналога, или производного; или клеточные системы млекопитающих (например, С08, СИ0, ΒΗΚ, 293, N80 и 3Т3 клетки), заключающие в себе рекомбинантные конструкции экспрессии, содержащие промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; промотор вируса осповакцины 7.5Κ). Предпочтительно, чтобы бактериальные клетки, такие как ЕксйепсЫа сой, и эукариотические клетки использовали для экспрессии рекомбинантного ΗΙΡ, или его аналога, или производного. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка, могут быть использованы с элементом вектор-несущего промотора из основного промежуточного раннего гена цитомегаловируса для эффективной экспрессии последовательностей ΗΙΡ, или его аналога, или производного (Еоесктд е! а1., 1986, Сене, 45: 101 и Соске!! е! а1., 1990, Вю/Тесйпо1оду, 8: 2).

В бактериальных системах может быть предпочтительно выбран ряд векторов экспрессии в зависимости от предназначенного использования экспрессируемого ΗΙΡ, или его аналога, или производного. Например, если предусматривается продуцирование большого количества ΗΙΡ, или его аналога, или производного для получения фармацевтических композиций ΗΙΡ, или его аналога, или производного, желательными могут являться векторы, направляющие экспрессию высоких уровней продуктов слитых белков, которые быстро очищаются. Векторы включают без ограничений экспрессирующий вектор Е.сой рСВ2.1 Τ0Ρ0 (йкйгодеп); векторы рШ Дпоиуе & йоиуе, 1985, №с1ею Ас1бк Век. 13: 3101-3109; Уап Иееке & 8сйик!ег, 1989, 1. Вю1. Сйет. 24: 5503-5509) и т.д. Также может быть использован ряд таких векторов, как рТЬАС (81дта), рМАЬ (МВ) и рЕТ (Nονадеπ), для экспрессии чужеродных белков в виде слитых белков с пептидом ТЬАС, та1Е- или СВЭ-протеином. Эти рекомбинантные протеины могут быть направлены в переплазматическое пространство для корректной укладки и созревания. Слитая часть может быть использована для аффинной очистки экспрессированного протеина. Наличие сайтов расщепления для специфических протеаз, таких как энтерокиназа, также обеспечивает отщепление ΗΙΡ, или его аналога, или производного. Также могут быть использованы векторы рСЕХ для экспрессии чужеродных белков в виде слитых белков с глютатион 5-трансферазы (С8Т). В целом такие слитые белки являются растворимыми и могут быть легко очищены от лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матричными глутатион-агарозными гранулами с последующим элюцированием в присутствии свободного глутатиона. Векторы рСЕХ предназначены для включения тромбина или сайтов расщепления протеазы фактором Ха таким образом, чтобы обеспечивалось высвобождение клонированного целевого генного продукта из части С8Т.

В клеточной системе насекомых могут быть использованы многие векторы для экспрессии чужеродных генов, например в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов может быть использован вирус ядерного полиэдроза Аи!одгарйа сайГогшса (Ас№У). Вирус развивается в таких клетках, как клетки 8робор!ега Ггид1регба. Кодирующая последовательность ΗΙΡ, или его аналога, или производного может быть клонирована отдельно в неосновные области (например, ген полиэдрина) вируса и контролироваться промотором Ас№У (например, промотором полиэдрина).

В клетках-хозяевах млекопитающих может быть использован ряд вирусных экспрессирующих систем. При использовании аденовируса в качестве вектора экспрессии представляющая интерес кодирующая последовательность ΗΙΡ, или его аналога, или производного может быть лигирована в комплекс контроля за транскрипцией/трансляцией аденовируса, например в поздний промотор и трехкомпонентную лидерную последовательность. Указанный химерный ген далее может быть вставлен в геном аденовируса путем рекомбинации 1п сйго или 1п νί\Ό. Вставка несущественной области вирусного генома (например, область Е1 или Е3) приведет к образованию рекомбинантного вируса, являющегося жизнеспособным и способным экспрессировать ΗΙΡ, или его аналог, или производное в инфицированных организмаххозяевах (см., например, Бодан & 8йепк, 1984, Егос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 81: 355-359). Для эффективной

- 31 013821 трансляции вставленных кодирующих последовательностей ΗΙΡ, или его аналога, или производного также могут потребоваться специфические сигналы инициации. Указанные сигналы включают кодон инициации ЛТС и смежные последовательности. Кроме того, кодон инициации должен быть в фазе с рамкой считывания требуемой кодирующей последовательности с целью обеспечения трансляции всей вставки. Указанные экзогенные сигналы трансляционного контроля и кодоны инициации могут иметь различное происхождение, а именно как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть повышена путем включения соответствующих элементов энхансера транскрипции, терминаторов транскрипции и т.д. (см., например, Вй!пег е! а1., 1987, Ме!йойк ш Епхуто1. 153: 51-544).

Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, требуемым образом модулирующий экспрессию вставленной последовательности или модифицирующий и обрабатывающий генный продукт. Такие модификации (например, гликозиляция) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важным фактором для функции протеина. Различные клетки-хозяева имеют характеристики и специфические механизмы для посттрансляционного процессинга и модификации протеинов и генных продуктов. С целью обеспечения корректной модификации и процессинга экспрессированного чужеродного белка могут быть выбраны соответствующие клеточные линии и системы хозяев. С этой целью могут быть использованы эукариотические клетки-хозяева, обладающие клеточным комплексом для надлежащего процессинга первичного транскрипта и для посттрансляционной модификации генного продукта, например гликозиляции и фосфориляции генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают без ограничения ΡΟ2, СНО, νΕΒΥ, ВНК, НеЬа, СО8, МОСК, 293, 3Т3, Л138, ВТ483, Нк578Т, НТВ2, ВТ20 и Τ47Ό, N80 (клеточная линия мышиной миеломы, которая не продуцирует эндогенно любые иммуноглобулиновые цепи), СВЙ7030 и Нк878Вк! клетки. Экспрессия в бактериальной или дрожжевой системе может быть использована в том случае, если обнаруживается, что посттрансляционные модификации являются несущественными для требуемой активности НГ₽, или его аналога, или производного.

Для долгосрочного продуцирования надлежащим образом процессированных 4ΙΡ, или его аналога, или производного с высоким выходом предпочтительным является стабильная экспрессия в клетках. Клеточные линии, стабильно экспрессирующие 4ΙΡ, или его аналог, или производное, могут быть рекомбинированы с использованием вектора, содержащего селектируемый маркер. В качестве примера, но не ограничения, после проведения интродукции экспрессирующих конструкций рекомбинантные клетки выращивают в течение 1-2 дней в обогащенных средах, а затем переводят на селективные среды. Селектируемый маркер в экспрессирующей конструкции придает резистентность селекции и в зависимости от используемой векторной конструкции и клеток-хозяев позволяет клеткам стабильно интегрировать экспрессирующую конструкцию в свои хромосомы, расти в культуре и расширяться в клеточные линии. Такие линии могут культивироваться в течение длительного периода времени, в то время как 4ΙΡ, или его аналог, или производное постоянно экспрессируется.

Может быть использован ряд селекционных систем, включающих без ограничения устойчивость к антибиотикам (такие маркеры, как №о, придающий устойчивость к генетицину, или С-418 (Ли и Ли, 1991, Вю!йегару, 3: 87-95; ТоШокйеу, 1993, Αηη. Веу. Ρйа^тасο1. Тох1со1. 32: 573-596; МиШдап, 1993, 8с1епсе, 260: 926-932 и Могдап и Αηάе^кοη, 1993, Αηη. Веу. Вюсйет. 62: 191-217; Мау, 1993, ТШ ТЕСН 11(5): 155-215); 2ео для устойчивости к зеоцину и Вкй для устойчивости к бластицидину); устойчивость к антиметаболитам (такие маркеры, как ЭйГг, придающий устойчивость к метотрексату, Лщ1ег е! а1., 1980, Νίώ. Αсаά. 8сг υ8Α, 77: 357 и О'Наге е! а1., 1981, Пос. №И. Αсаа. 8сг υ8Α, 78: 1527); др!, придающий устойчивость к микофенольной кислоте (МиШдап & Вегд, 1981, Ριό^ №И. Αсаά. 8ск υ8Α, 78: 2072); и йудго, придающий устойчивость к гигромицину (8ап!егге е! а1., 1984, Сепе, 30: 147). Кроме того, мутантные клеточные линии, включающие без ограничения !к-, йдрй- или арй-клетки, могут быть использованы в сочетании с векторами, несущими соответствующие гены тимидин киназы, гипоксантина, гуанина или аденин-фосфорибозил-трансферазы. Способы технологии рекомбинантной ДНК, широко известные в данной области техники, могут быть стандартно применены для выбора требуемого рекомбинантного клона и такие способы описаны, например, в ΑιικιΑΙ е! а1. (ейк.), Сиггеп! Ρ^οΐοсο1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойп Л11еу&8опк, ΝΥ (1993); Кпед1ег, Сепе ТгапкГег апй Ехргеккюп, Α Ьайога!огу Мапиа1, 81оск1оп Ριόκκ, ΝΥ (1990); Сйар!егк 12 апй 13, Эгасорой е! а1. (ейк), оГ Сиггеп! Ρ^οΐοсο1к ш Нитап Сепейск, 1ойп Л11еу&8опк, ΝΥ (1994) апй Со1йегге-Сагарш е! а1., 1981, 1. Мо1. Вю1. 150: 1.

Рекомбинантные клетки могут быть культивированы при стандартных условиях: температура, период инкубации, оптическая плотность и состав сред. Тем не менее, условия для выращивания рекомбинантных клеток могут отличаться от условий для экспрессии НР, или его аналога, или производного. Модифицированные условия культивирования и среды также могут быть использованы для увеличения продуцирования НР, или его аналогов, или производных.

Альтернативой продуцирования НР или его фрагмента путем рекомбинантных технологий или очистки при поступлении из естественных источников является пептидный синтез. Например, весь НР, или его аналог, или производное либо белок, соответствующий части НР, или его аналога, или производного может быть синтезирован с помощью пептидного синтезатора. Могут быть использованы известные технологии пептидного синтеза или иные синтетические протоколы, хорошо известные в данной

- 32 013821 области техники.

Протеины, имеющие аминокислотную последовательность Н1Р, или его аналога, или производного, либо ее часть, могут быть синтезированы путем твердофазного пептидного синтеза использованием процессов, аналогичных процессам, описанным Меглйе1б, 1963, I. Ат. Сбет. 8ос., 85: 2149. В процессе синтеза защищенные Ν-α-аминокислоты, имеющие защищенные боковые цепи, поэтапно добавляют к растущей полипептидной цепи, связанной своим С-терминалом, и к нерастворимой полимерной подложке, т.е. к полистироловым гранулам. Протеины синтезируют путем связывания аминогруппы незащищенной Ν-α-аминокислоты с α-карбоксильной группой защищенной Ν-α-аминокислоты, которая была активизирована путем проведения ее реакции с таким реагентом, как дициклогексилкарбодиимид. Присоединение свободной аминогруппы к активизированному карбоксилу приводит к формированию пептидной связи. Наиболее широко используемые защищающие Ν-α-группы включают группу Вос, являющуюся кислотолабильной, и Ртос, являющуюся основолабильной. Детальная информация о соответствующих химических композициях, смолах, защищающих группах, защищенных аминокислотах и реагентах хорошо известна в данной области техники, и в этой связи в данном патенте не приведено ее подробное описание (см. АШеНоп е1 а1., 1989, 8обб Рбаке Рерббе 8уп1йек1к: А Ргасбса1 Арргоасб, 1ВЬ Ргекк, апб Βοбаηкζку, 1993, Рерббе Сбеткбу, А Ргасбса1 ТехЛоок, 2^пб Ε6., 8рппдег-Уег1ад).

Очистку полученного Н1Р, или его аналога, или производного осуществляют с помощью известных технологий, таких как препаративная жидкостная хроматография высокого разрешения на проницаемом геле и разделительная и/или ионообменная хроматография. Выбор соответствующих матриц и буферов хорошо известен в данной области техники и в этой связи в настоящем патенте не приведено их детальное описание.

Исходя из вышеприведенного подробного описания реагентов и способов настоящего изобретения, ниже приведены примеры для иллюстрирования различных особенностей настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1.

Н1Р вызывают увеличение выработки инсулина ίη νίίτο в культуре панкреатической протоковой ткани человека и в культурах островковой ткани человека.

Панкреатические островки человека и фракции-предшественники культивировали в течение 10 дней в соответствии со стандартным протоколом. Вкратце, панкреата из донорского органа трупа взрослого человека была получена через местную организацию по закупке органов. Островки были выделены в соответствии с установленными протоколами, описанными Воппег-Аей апб 1ата1 (Воппег-Аеп еί а1., Реб1а1пс Ό*α£οί0,κ:2004; 5(8ирр1. 2): 16-22. 1ата1 еί а1., Се11 Эеа111 ΌίΓίοΓ. 2005 1и1.; 12(7): 702-12).

После изъятия органа критическое время хранения трансплантата на холоде составляло не более 8 ч до выделения островков. Главный проток поджелудочной железы был канюлирован и перфузирован либеразой Н1 (Восбе И1адпокбск). Перфузированный орган размещали в закрытой системе и нагревали до 37°С для активизации ферментной смеси. После появления свободных островков в образце систему охлаждали и свободные ткани собирали и промывали. Ткани подвергали постоянному градиенту плотности, создаваемому с использованием Р1со11 (Вюсйгот КС) в клеточном процессоре (СОВЕ). Свободные островки с диаметром в пределах от 75 до 400 мкм при чистоте более 90%, определенной путем окрашивания дитизоном (81дта), хелатом цинка, были собраны и промыты. Проведенная иммуногистохимия с целью обнаружения наличия амилазы и цитокератина дала отрицательные результаты, согласующиеся с отсутствием ткани предшественника и экзокринной ткани. Из этого разделения также была собрана фракция-предшественник для культивирования.

Выделенные островки были погружены в коллагеновую подложку 1-го типа при плотности 2000 островковых эквивалентов/25 см² и культивированы в ^МΕМ/Р12, содержащем 10% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8), 1 мк дексаметазона, 10 нг/мл фактора роста эпидермиса (ΕΟΓ), 24 мг/мл инсулина и 100 нг/мл холерного экзотоксина. Среду заменяли через день. На 10-й день культивирование было продолжено в вышеуказанной среде без холерного экзотоксина с неогенными веществами и ингибиторами при нижеперечисленных окончательных концентрациях. Среду заменяли через день. Погруженные в коллагеновую подложку культуры собирали путем инкубирования 0,25 г/л коллагеназой XI (81дта) в течение 30 мин при 37°С.

После культивирования человеческие панкреатические островки и фракции предшественников были обработаны при слепом исследовании одним из трех Н1Р: 8ΕΟ ΙΌ N0:7, 3 или 2, последовательностью хомячкового ШОАР в качестве положительного контроля (Ю^Н^Ρ8Н6Т^ΡN68 (8Ε0 ΙΌ N0:27)) или последовательностью скремблированного пептида, которая была синтезирована Ьу Васбет Вю8с1епсе (чистота 95%, исследовательский класс) (^66ТΡ^Ρ6NАIΕ^ТН (8Ε0 ΙΌ N0:28)). На 10- и 12-й день были обработаны дупликатные культуры и далее лизированы для обнаружения содержания инсулина на 14-й день. В течение 10-дневного культивирования выработка инсулина снижается до незначительно малого количества, а после обработки пептидами снова начинается выработка инсулина.

- 33 013821

Уровни инсулина были обнаружены с помощью радиоиммуннологического анализа из культур, обработанных только солевым раствором, скремблированным пептидом, 8Е0 ГО N0:7, 3 или 2 и хомячковым ΙΝΟΑΡ. Результаты по фракции человеческой протоковой ткани приведены на фиг. 1 и по человеческой островковой ткани - на фиг. 2. Обе фракции содержат клетки-предшественники, являющиеся центром для новых островковых структур и на основе которых ΗΙΡ оказывает свое стимулирующее воздействие. На фиг. 3 показана фракция культуры протоковой ткани после обработки ΗΙΡ непосредственно до лизиса и проведения измерений с помощью радиоиммунологического анализа. Морфологические изменения показывают островковоподобную структуру. Постоянно наблюдается большая индукция новых островков из клеток, культивированных из протоковой фракции панкреатической ткани. Указанные наблюдения согласуются с предположением, что после процесса выделения среди фракций островковой ткани имеется меньше клеток-предшественников.

Пример 2. ΗΙΡ индуцирует продуцирование инсулина ίη νίίτο в клетках Ηιιά 270.

Ткань поджелудочной железы человека обрабатывали в соответствии с описанием в примере 1 и продуцирование инсулина измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа. На фиг. 4 и 5 приведены результаты данного эксперимента, на которых показаны дозные характеристики и воздействие ΗΙΡ на две различные фракции ткани по сравнению с последовательностью хомячкового ΙΝΟΑΡ и последовательностью скремблированного негативного пептида. В рядах 1-3 показаны результаты исходя из клеток Ηυά 270, протоковых клеток человека, выделенных в соответствии с описанием в примере 1 и обработанных ΗΙΡ с последовательностями 8Е0 ГО N0:7, 3 и 2 соответственно. В ряду 4 показаны клетки, обработанные пептидом с последовательностью ΙΝΟΑΡ (8Е0 ГО N0:27). В ряду 5 показаны клетки, обработанные скремблированным пептидом (8Е0 ГО N0:28). Результаты на фиг. 4 предусматривают использование 5 мкг каждого пептида, в то время как результаты на фиг. 5 были получены с использованием 0,002 мкг каждого пептида. На фиг. 7А показаны результаты в отношении клеток, культивированных из островковой фракции и обработанных 3 мкм и 1 мМ каждого пептида, в то время как на фиг. 7В показаны результаты в отношении клеток, культивированных из протоковой фракции и обработанных 3 мкм и 1 мМ каждого пептида.

Каждая из пептидных последовательностей ΗΙΡ индуцировала более эффективно продуцирование инсулина, чем ^ΟΑΡ или скремблированный пептид, и более высокая концентрация пептида позволяла достигать более выраженного эффекта в протоковых культурах, в которых в большей степени сконцентрированы клетки-предшественники. В островковых культурах ограничивающим фактором в отношении степени, в которой культуры способны продуцировать больше инсулина, является не концентрация пептида, а количество клеток-предшественников на одну культуру.

Пример 3. ΗΙΡ индуцирует образование островков в культуре протоковой ткани человека.

Фракцию протоковой ткани человека изолировали и культивировали в соответствии с описанием в примере 1. После 10 дней культивирования клетки обрабатывали ΗΙΡ в течение 4 дней и проводили наблюдения с использованием инвертированной микроскопии. На фиг. 3А-3С показаны культуры, обработанные последовательностями ΗΙΡ, на фиг. 3Ό показана протоковая ткань негативного контроля, необработанная пептидом. На фиг. 6А показаны культуры ткани-предшественника поджелудочной железы человека на 12-й день (2-й день обработки ΗΙΡ). Образовались островки, ранее описываемые как протоковые эпителиальные кисты, и они начинали реплицироваться на одном конце, на котором находятся клетки-предшественники. На фиг. 7В показаны культуры ткани-предшественника поджелудочной железы человека на 18-й день (6-й день обработки ΗΙΡ). На этом изображении затемнение репликационной части протоковой эпителиальной кисты указывает на дифференциацию клеток, согласующуюся с ранее показанными изменениями, имеющими место при обработке хомячковым ^ΟΑΡ ίη νίίτο.

Пример 4. Протокол клинических испытаний для ΗΙΡ.

В данном примере используют отвечающие условиям экспериментальные модели на животном для диабета с целью исследования дозных диапазонов ΗΙΡ.

Лечение с использованием ΗΙΡ.

Экспериментальная модель на животном.

В течение длительного времени проводили исследование штамма диабетических мышей без ожирения (N00) в качестве отличной модели диабета 1-го типа, так как он спонтанно развивает болезнь, являющуюся исключительно сходной с заболеванием человека. ΌβΙονίΐοΗ, Т.Ь. и 8тдй, В. 1997. ΙιηιηιιηίΙν. 7: 727-738. Диабет у мышей N00 вызывается воспалительными аутореактивными Т-клетками, распознающими панкреатические островковые антигены и избегающие центральной и периферической толерантности.

Процедура.

В родительской колонии мышей N00 частота заболевания диабетом у самок мышей N00 обычно составляет 75-90% к 30-й неделе, но в некоторых когортах может превышать 90%. Каждая мышь получает дозы ΗΙΡ и их сравнивают с мышами N00, не получающими ΗΙΡ. Дозы ΗΙΡ находятся в пределах от 1 мкг/кг/день до 100 мг/кг/день.

- 34 013821

Лечение.

Лечение когорт проводят в 2-х группах с диапазоном доз ΗΙΡ от 2 до 4 и плацебо при компенсированной дозе для размера животного, метаболизма и циркуляции или приблизительно при эквивалентности мг/кг 1/6. Группа 1: солевой раствор; группа 2: ΗΙΡ.

Оценка исследования.

Измерение уровней глюкозы в крови проводили каждую неделю с помощью глюкометра Опе ТоисН ΙΙ (ЫГе^сап). Мыши считаются диабетическими после 2-х последовательных измерений при показаниях свыше 300 мг/дл. Для проведения гистологического анализа осуществляли мгновенное замораживание поджелудочных желез. Несколько срезов толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и проводили подсчет слепым методом для определения тяжести инсулита в соответствии со способом, известным в данной области техники.

Результаты.

У мышей ΝΟΌ, принимающих ΗΙΡ, проявлялось выраженное снижение уровней глюкозы в крови и снижение инсулинита в их поджелудочных железах.

Пример 5. Протокол клинических испытаний для исследования воздействий ΗΙΡ на неэндокринные панкреатические эпителиальные клетки человека.

Всего 48 взрослых мышей ΝΟΌ-δαά использовали в качестве реципиентов для трансплантатов ткани, выделенной из донорских органов поджелудочной железы человека. Две когорты определяли на основе типа ткани человека, пересаживаемой мышам:

Ι) неэндокринная протоковая ткань и

ΙΙ) контрольная непранкреатическая ткань.

Лечение с использованием пептидов ΗΙΡ.

Всего 24 животных из каждой группы спонтанно отбирали в одну из 4-х исследуемых групп для проведения полного объема терапевтических мероприятий, заключающихся в интраперитонеальных инъекциях дважды в день в течение 39 дней.

Производные ΗΙΡ (250 мкг/100 мкл 2 раза в день при общей дозе 500 мкг/сутки):

А пептид селективно блокированного ΗΙΡ 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:7 (п=6);

В пептид селективно блокированного ΗΙΡ 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:3 (п=6);

С пептид селективно блокированного ΗΙΡ 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:2 (п=6);

соляной раствор вводили 2 раза в день при эквивалентном объеме (100 мкл) (п=6).

Содержание глюкозы в крови определяли один раз в 3 дня в одно и то же время суток у всех исследуемых животных. Всех животных умерщвляли на 48-й день путем кровоизвлечения и проводили эксцизию трансплантата для морфологического анализа.

Подготовка пептида.

Каждая пробирка содержала 1500 мкг лиофилизированного ΗΙΡ, или его аналогов, или производных. В стерильных условиях в каждую пробирку добавляли 600 мкл изотонического солевого раствора и проводили шесть интраперитонеальных стерильных инъекций по 100 мл на пробирку каждому исследуемому животному в группе, одна инъекция на одно животное при проведении каждой процедуры.

Измерение содержания глюкозы.

У каждого животного во всех исследуемых группах один раз в 3 дня в одно и то же время суток определяли уровень глюкозы в плазме. С течением времени проводили определение уровней глюкозы во всех исследуемых группах.

Измерение человеческого С-пептида и инсулина.

С помощью твердофазного радиоиммунологического анализа измеряли уровень инсулина поджелудочной железы в плазме. Собранную кровь центрифугировали и плазму замораживали при -70°С до проведения анализа на содержание инсулина. Часть каждого эксцизированного трансплантата взвешивали и затем подвергали кислотно-этаноловой экстракции при 4°С. Несодержащие клеток экстракты собирали, нейтрализовали 0,4 М Тп5 основанием и хранили при -70°С до проведения анализа на содержание человеческого С-пептида и инсулина. Измерения проводили 3 раза.

Микроскопия и морфометрический анализ.

После эксцизии ткани человека каждую часть ткани взвешивали и затем фиксировали в параформальдегиде. Погруженные образцы окрашивали и проводили оценку следующих параметров:

a) количество островков/мм²;

b) масса бета-клеток/мг веса ткани;

c) масса протоково-ассоциированных и ацинарно-ассоциированных внеостровковых бета-клеток и б) процент ΡΌΧ-Ι иммунопозитивных протоковых клеток.

Ткань зондировали первичными антителами, направленными против С-пептида человека, человеческого инсулина, человеческого глюкагона, человеческого соматостатина и человеческого панкреатического полипептида.

- 35 013821

Пример 6. Протокол клинических испытаний для ΗΙΡ и ГПП-1 или агониста рецептора ГПП-1, аналога ГПП-1.

В данном примере использовали отвечающие условиям экспериментальные модели на животном для диабета с целью исследования дозных диапазонов синергического взаимодействия ΗΙΡ и веществ для стимулирования регенерации островковых клеток поджелудочной железы.

Лечение с использованием ΗΙΡ и ГПП-1, либо агониста рецептора ГПП-1, либо аналога ГПП-1.

Экспериментальная модель на животном.

В течение длительного времени проводили исследование штамма диабетических мышей без ожирения (ΝΘΌ) в качестве отличной модели диабета 1-го типа, так как он спонтанно развивает болезнь, являющуюся исключительно сходной с заболеванием человека. Ое1оуПс11. Т.Ь. и 81идй, В. 1997. ПптшШу. 7: 727-738. Диабет у мышей ΝΘΌ вызывали воспалительными аутореактивными Т-клетками, распознающими панкреатические островковые антигены и избегающие центральной и периферической толерантности.

Процедура.

В родительской колонии мышей ΝΘΌ частота заболевания диабетом у самок мышей ΝΘΌ обычно составляет 75-90% к 30-й неделе, но в некоторых группах может превышать 90%. Каждая мышь получала дозы ΗΙΡ и/или амилина и их сравнивали с мышами ΝΘΌ, не получающими ΗΙΡ и/или амилин. Дозы ΗΙΡ составляли от 1 мкг/кг /день до 100 мг/кг /день. Дозы амилина составляли 0,3-0,8 мкг/кг/день.

Лечение.

Лечение групп проводили в 4-х группах с диапазоном доз каждого лекарственного средства от 2 до 4 и плацебо при компенсированной дозе для размера животного, метаболизма и циркуляции или приблизительно при эквивалентности мг/кг 1/6. Группа 1: солевой раствор; группа 2: ΗΙΡ; группа 3: амилин; группа 4: ΗΙΡ плюс амилин.

Оценка исследования.

Измерение уровней глюкозы в крови проводили каждую неделю с помощью глюкометра Оие ТоисН ΙΙ (ЬИезсаи). Мыши считаются диабетическими после 2-х последовательных измерений при показаниях свыше 300 мг/дл. Для проведения гистологического анализа осуществляли мгновенное замораживание поджелудочных желез. Несколько срезов толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и проводили подсчет слепым методом для определения тяжести инсулита в соответствии со способом, известным в данной области техники.

Результаты.

Пример 7. Протокол клинических испытаний для ΗΙΡ, амилина/симлина™ и ΌΙΑΡΕΡ277™ у пациентов с предсуществующим диабетом 1-го типа.

В данном примере по клиническому испытанию на человеке приведено описание 5-этапного способа, используемого в отношении пациентов с диабетом 1-го типа, с применением ΗΙΡ, симлина™ и ΌΙΑΡΕΡ277™. Пятиэтапные способы для лечения диабета 1-го типа с применением ΗΙΡ и/или аналогов ΗΙΡ включают следующие этапы:

1) интенсивный гликемический контроль;

2) пероральное введение холекальциферола (витамина Ό3) для поддержания уровней 25-гидроксивитамина И выше 40 нг/дл;

3) проведение иммунотерапии;

4) введение ΗΙΡ и снижение дозы инсулина после прекращения приема как ΗΙΡ, так и инсулина и

5) протокол иммунной модуляции с ΌΙΑΡΕΡ277 в конце 2-го месяца интенсификации глюкозного контроля и при начальном использовании ΗΙΡ, а также на 6-м месяце после начала приема ΗΙΡ (Иах е! а1. Ьапсе!. 2001: 24; 358(9295): 1749-53), при необходимости, основываясь на С-пептиде и титрах антитела ΟΑΌ.

Отвечающие условиям пациентов с диабетом 1-го типа отбирали для проведения исследования, и все пациенты проходили 3-месячный курс интенсификации лечения диабета с использованием нескольких инсулиновых инъекций, инсулиновых насосов и/или с добавлением симлина™ до принятия пищи при соответствующем снижении дозы инсулина до еды. В течение указанного периода интенсивного глюкозного контроля у всех пациентов проводили измерение значений 25-гидрокси-витамина И и к режиму лечения тех пациентов, у которых значения составляли менее 40 нг/мл, добавляли 1000 или 2000 иммунологических единиц витамина Ό3 (холекальциферола).

Пациентов поровну разделяли путем случайного выбора на лечебные группы или группы, получавшие плацебо. Пациенты в группе плацебо получали одну подкожную инъекцию плацебо/носителя в конце второго месяца интенсификации глюкозного контроля, в то время как пациенты в опытной лечебной группе получали подкожную инъекцию 1 мг ΌΙΑΡΕΡ277™ (Иах е! а1., Ьапсе!. 2001: 24; 358(9295): 1749-53). Пациенты наблюдались еженедельно и в их режим лечения диабета вносили изменения.

- 36 013821

В конце третьего месяца интенсификации у пациентов в обеих группах продолжали проводить измерение уровней 25-гидрокси-витамина Ό, и при необходимости они получали витамин Ό3 с целью обеспечения уровней выше 40 нг/мл. Пациентам в лечебной группе делали еще одну подкожную инъекцию ΌΙΑΡΕΡ277™, в то время как пациенты в группе плацебо получали инъекцию плацебо/носителя. Пациенты, получающие инсулин и симлин™ или только инсулин, которые были включены в группу для лечения ΗΙΡ путем случайного выбора, получали общую дозу в размере 800-900 мг/сутки (средняя доза 10 мг/кг/сутки за 4 разделенные дозы), которую вводили в виде подкожной инъекции до каждого принятия пищи и при отходе ко сну. Пациентам в группе плацебо делали 4 инъекции инертного носителя до принятия пищи и при отходе ко сну.

Всех пациентов подвергали тщательному контролю в отношении уровней глюкозы, уровней С-пептида и стимулированного С-пептида. При необходимости проводили титрование инсулина и симлина™ для поддержания целевых уровней глюкозы в размере 80-110 мг/дл натощак и 110-140 мг/дл постпрандиально спустя 2 ч. Ожидали, что в течение 3-6 месяцев пациенты в лечебной группе могут полностью прекратить прием дозы инсулина. В конце 6-го месяца после первоначального введения ΗΙΡ или проведения терапии с плацебо пациентам в лечебной группе вводили последнюю инъекцию ΌΙΑΡΕΡ277™ или плацебо для защиты новых островков.

Пример 8. Протокол клинических испытаний для ΗΙΡ, амилина/симлина™ и ΌΙΑΡΕΡ277™ у пациентов с вновь диагностированным диабетом 1-го типа.

В данном примере по клиническому испытанию на человеке приведено описание способов, используемых в отношении пациентов с диабетом 1-го типа, с применением ΗΙΡ, симлина™ и ΌΙΑΡΕΡ277™. Способы для лечения диабета 1-го типа с применением ΗΙΡ и/или аналогов ΗΙΡ включают следующие этапы:

1) непосредственная рандомизация пациентов по распределению в лечебную или контрольную группу после введения подкожно ΌΙΑΡΕΡ277™ и введения плацебо пациентам контрольной группы;

2) достижение и поддержание уровней 25-гидрокси-витамина Ό выше 40 нг/дл путем перорального введения холекальциферола (витамина Ό3);

3) проведение одномесячного интенсивного контроля с использованием инсулина и симлина™;

5) протокол иммунной модуляции с ΌΙΑΡΕΡ277™ на 1-м месяце после первоначальной инъекции и затем на 6-м месяце (Κηζ е! а1., Ьапсе!. 2001: 24; 358(9295): 1749-53), при необходимости, основываясь на С-пептиде и титрах антитела ΟΑΌ.

Отвечающие условиям пациентов с вновь диагностированным диабетом 1-го типа отбирали для проведения исследования, и все пациенты получали либо плацебо, либо ΌΙΑΡΕΡ277™ с последующим одномесячным курсом интенсификации лечения диабета с использованием нескольких инсулиновых инъекций, инсулиновых насосов и/или с добавлением симлина™ до принятия пищи при соответствующем снижении дозы инсулина до еды. В течение указанного периода интенсивного глюкозного контроля у всех пациентов проводили измерение значений 25-гидрокси-витамина Ό и к режиму лечения тех пациентов, у которых значения составляли менее 40 нг/мл, добавляли 1000 или 2000 иммунологических единиц витамина Ό3 (холекальциферола).

В конце 1-го месяца интенсификации у пациентов в обеих группах продолжали проводить измерение уровней 25-гидрокси-витамина Ό, и при необходимости они получали витамин Ό3 с целью обеспечения уровней выше 40 нг/мл. Пациентам в лечебной группе делали еще одну подкожную инъекцию ΌΙΑΡΕΡ277™, в то время как пациенты в группе плацебо получали инъекцию плацебо/носителя. Пациенты, получающие инсулин и симлин™ или только инсулин, которые были включены в группу для лечения ΗΙΡ путем случайного выбора, получали общую дозу в размере 800-900 мг/сутки (средняя доза 10 мг/кг/сутки за 4 разделенные дозы), которую вводили в виде подкожной инъекции до каждого принятия пищи и при отходе ко сну. Пациентам в группе плацебо делали 4 инъекции инертного носителя до принятия пищи и при отходе ко сну.

- 37 013821

Экспериментальная модель на животном.

В течение длительного времени проводили исследование штамма диабетических мышей без ожирения (Ν0Ό) в качестве превосходной модели диабета 1-го типа, так как он спонтанно развивает болезнь, являющуюся исключительно сходной с заболеванием человека. Ое^йсй, Т.Ь. и 81пдЬ, В. 1997. Iттишίу. 7: 727-738. Диабет у мышей Ν0Ό вызывается воспалительными аутореактивными Т-клетками, распознающими панкреатические островковые антигены и избегающие центральной и периферической толерантности.

Процедура.

В родительской колонии мышей Ν0Ό частота заболевания диабетом у самок мышей Ν0Ό обычно составляет 75-90% к 30-й неделе, но в некоторых группах может превышать 90%. Каждая мышь получает дозы ΗΙΡ, и/или амилина, и/или ΌΙΑΡΕΡ277™ и их сравнивают друг с другом и с мышами Ν0Ό, не получающими никаких препаратов. Дозы ΗΙΡ находятся в пределах от 1 мкг/кг/день до 100 мг/кг/день. Дозы амилина находятся в пределах 0,3-0,8 мкг/кг/день. Дозы ΌΙΑΡΕΡ277™ находятся в пределах приблизительно 0,1-0,2 мг за 1 неделю до введения ΗΙΡ или амилина.

Лечение.

Лечение групп проводили в 6 группах с диапазоном доз каждого лекарственного средства и плацебо от 2 до 4 при компенсированной дозе для размера животного, метаболизма и циркуляции или приблизительно при эквивалентности мг/кг 1/6. Группа 1: солевой раствор; группа 2: ΗΙΡ; группа 3: амилин; группа 4: ΗΙΡ плюс амилин; группа 5: ΗΙΡ плюс ΌΙΑΡΕΡ277™; группа 6: ΗΙΡ плюс амилин плюс ΌΙΑΡΕΡ277™.

Оценка исследования.

Измерение уровней глюкозы в крови проводили каждую неделю с помощью глюкометра 0пе ТоисЬ ΙΙ (ЫГексап). Мыши считаются диабетическими после 2-х последовательных измерений при показаниях свыше 300 мг/дл. Для проведения гистологического анализа осуществляли мгновенное замораживание поджелудочных желез. Несколько срезов толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и проводили подсчет слепым методом для определения тяжести инсулита в соответствии со способом, известным в данной области техники

Результаты.

У мышей Ν0Ό, принимающих ΗΙΡ, проявлялось выраженное снижение уровней глюкозы в крови и снижение инсулинита в их поджелудочных железах.

Несмотря на то что выше было приведено подробное описание настоящего изобретения со ссылками на конкретные примеры осуществления, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что многочисленные модификации и усовершенствования не выходят за пределы объема и существа изобретения, определенные следующей ниже формулой изобретения. Все публикации и патентные документы (патенты, опубликованные патентные заявки и неопубликованные патентные заявки), на которые в настоящем описании дается ссылка, включены в описание путем отсылки, как если бы было конкретно и отдельно указано, чтобы каждая такая публикация или документ были включены в описание путем отсылки. Ссылка на публикации и патентные документы не является признанием того факта, что любой такой документ является материалом, относящимся к предмету заявки, либо не является какимлибо признанием в отношении содержания или даты документа. Исходя из приведенного выше письменного описания настоящего изобретения со ссылками на примеры, специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что изобретение может быть реализовано в различных примерах осуществления и что вышеприведенное описание и примеры предназначены для целей иллюстрации, а не для ограничения приведенной ниже формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Изолированный проостровковый пептид человека, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из 8Е0 ΙΌ ХО:3 и 8Е0 ΙΌ ХО:7.
2. Проостровковый пептид человека по п.1, включающий соединение, конъюгированное с проостровковым пептидом человека, в котором соединение выбрано из альбумина, трансферрина и полиэтиленгликоля.
3. Проостровковый пептид человека по п.2, в котором соединение является полиэтиленгликолем.
4. Проостровковый пептид человека по п.2, в котором соединение является ковалентно связанным с проостровковым пептидом человека.
5. Проостровковый пептид человека по п.2, в котором соединение является нековалентно связанным с проостровковым пептидом человека.
6. Фармацевтическая композиция, включающая наполнитель и проостровковый пептид человека, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ ХО:3 и 8Е0 ΙΌ ХО:7.
7. Фармацевтическая композиция по п.6, включающая терапевтическое количество проостровкового пептида человека.
8. Фармацевтическая композиция по п.6, дополнительно включающая соединение, конъюгированное с проостровковым пептидом человека, в котором соединение выбрано из альбумина, трансферрина и полиэтиленгликоля.
9. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой соединение является полиэтиленгликолем.
10. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой соединение ковалентно связано с проостровковым пептидом человека.
11. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой соединение нековалентно связано с проостровковым пептидом человека.
12. Способ лечения патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы у субъекта, нуждающегося в лечении, путем введения субъекту терапевтического количества проостровкового пептида человека, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ ХО:3 и 8Е0 ΙΌ ХО:7, тем самым осуществляя лечение патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы.
13. Способ по п.12, дополнительно включающий этап введения одного или нескольких веществ, стимулирующих регенерацию островковых клеток поджелудочной железы.
14. Способ по п.13, в котором вещества для стимулирования регенерации островковых клеток поджелудочной железы выбирают из проостровкового пептида человека, или его аналога, или производного, амилина, симлина™, прамлинтида, эксендина-4, лираглютида, агонистов рецептора ГПП-1, ГПП-1, аналогов ГПП-1, хомячкового пептида, ассоциированного с островковым неогенезом (INСΑΡ). и его аналогов, желудочного ингибирующего пептида и ингибиторов дипептидил-пептидазы-4 и их сочетаний.
15. Способ по п.12, дополнительно включающий этап введения одного или нескольких веществ, ингибирующих, блокирующих или разрушающих аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью островковые клетки поджелудочной железы.
16. Способ по п.15, в котором вещества, ингибирующие, блокирующие или разрушающие аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью панкреатические островковые клетки, выбирают из антиСИ3 антитела, рапамицина, ЕК506, белка теплового шока 60, вакцины антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (САО65), мофетилмикофенолата, лизофиллина, ритуксимаба, Кэмпаса-1Н, витамина Ό, вакцины ГВС-У8О, СЭ4'СЭ25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток и их сочетаний.
17. Способ по п.16, в котором мофетилмикофенолат вводят совместно с даклизумабом.
18. Способ по п.16, в котором витамин Ό является витамином Ό3.
19. Способ по п.18, в котором витамин Ό3 вводят субъекту в количестве, являющемся эффективным для поддержания уровня 25-гидроксивитамина Ό выше приблизительно 40 нг/мл в организме субъекта.
20. Способ по п.12, в котором в результате введения по меньшей мере одного проостровкового пептида человека обеспечивают лечение или снижение интенсивности по меньшей мере одного симптома патологии, связанной с нарушением функции поджелудочной железы.
21. Способ по п.20, в котором симптом выбран из таких симптомов, как частое мочеиспускание, чрезмерная жажда, сильный голод, необычная потеря веса, повышенная утомляемость, раздражительность, неясное зрение, зуд половых органов, нерегулярные боли и болевые ощущения, ощущение сухости в полости рта, сухая или зудящая кожа, импотенция, вагинальные дрожжевые грибковые инфекции, плохое заживление порезов и царапин, тяжелые или необычные инфекции, гипергликемия, потеря гликемического контроля, колебания постпрандиального содержания глюкозы в крови, колебания содержания глюкагона в крови и колебания содержания триглицеридов в крови и их сочетание.
22. Способ по п.12, дополнительно включающий этап интенсификации гликемического контроля в организме субъекта до введения терапевтического количества проостровкового пептида человека.
23. Способ по п.12, в котором субъекту вводят инсулин во время введения терапевтического коли

- 39 013821 чества проостровкового пептида человека.
24. Способ по п.23, в котором дозу инсулина уменьшают после введения терапевтического количества проостровкового пептида человека.
25. Способ по п.23, в котором дозу инсулина уменьшают один или несколько раз после введения терапевтического количества проостровкового пептида человека.
26. Способ по п.23, в котором дозу инсулина уменьшают до нуля.
27. Антитело, селективно связывающееся с проостровковым пептидом человека, включающим аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:7.
28. Антитело по п.27, в котором антитело является моноклональным антителом.
29. Антитело по п.27, в котором антитело является поликлональным антителом.
30. Набор для лечения пациента, имеющего диабет 1-го типа, преддиабет, диабет 2-го типа или скрытый аутоиммунный диабет зрелого возраста, содержащий терапевтически эффективную дозу проостровкового пептида человека, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из 8Е0 ΙΌ N0:3 и 8ЕЦ ΙΌ N0:7, и по меньшей мере одно вещество для стимулирования регенерации островковых клеток поджелудочной железы, и инструкции по его применению.
31. Способ для лечения диабета 1-го типа, преддиабета, диабета 2-го типа или скрытого аутоиммунного диабета зрелого возраста, включающий терапевтически эффективную дозу проостровкового пептида человека, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕЦ ΙΌ N0:3 и 8ЕО ΙΌ N0:7.
32. Способ для лечения диабета 2-го типа у субъекта, нуждающегося в лечении, путем введения субъекту терапевтического количества проостровкового пептида человека, состоящего из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:2, тем самым обеспечивая лечение диабета 2-го типа.
33. Способ по п.32, дополнительно включающий этап введения одного или нескольких веществ для стимулирования регенерации островковых клеток поджелудочной железы.
34. Способ по п.30, в котором вещества для стимулирования регенерации островковых клеток поджелудочной железы выбирают из проостровкового пептида человека, или его аналога, или производного, амилина, симлина™, прамлинтида, эксендина-4, лираглютида, агонистов рецептора ГИИ-1, ГИИ-1, аналогов ГИИ-1, хомячкового пептида, ассоциированного с островковым неогенезом (ШОАР), и его аналогов, желудочного ингибирующего пептида и ингибиторов дипептидил-пептидазы-4 и их сочетаний.
35. Способ по п.32, дополнительно включающий этап введения одного или нескольких веществ, ингибирующих, блокирующих или разрушающих аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью островковые клетки поджелудочной железы.
36. Способ по п.35, в котором вещества, ингибирующие, блокирующие или разрушающие аутоиммунные клетки, выбирающие своей мишенью панкреатические островковые клетки, выбирают из антиί.Ό3 антитела, рапамицина, РК506, белка теплового шока 60, вакцины антиглютаминовой кислоты декарбоксилазы 65 (ОАЭ65), мофетилмикофенолата, лизофиллина, ритуксимаба, Кэмпаса-1Н, витамина Ό, вакцины ГВС-У80, СЭ4'СЭ25' антигенспецифических регуляторных Т-клеток и их сочетаний.
37. Способ по п.36, в котором мофетилмикофенолат вводят совместно с даклизумабом.
38. Способ по п.36, в котором витамин Ό является витамином Ό3.
39. Способ по п.38, в котором витамин Ό3 вводят субъекту в количестве, являющемся эффективным для поддержания уровня 25-гидроксивитамина Ό выше приблизительно 40 нг/мл в организме субъекта.
40. Способ по п.32, в котором в результате введения по меньшей мере одного проостровкового пептида человека обеспечивают лечение или снижение по меньшей мере одного симптома патологии, связанной с диабетом 2-го типа.
41. Способ по п.40, в котором симптом выбран из таких симптомов, как частое мочеиспускание, чрезмерная жажда, сильный голод, необычная потеря веса, повышенная утомляемость, раздражительность, неясное зрение, зуд половых органов, нерегулярные боли и болевые ощущения, ощущение сухости в полости рта, сухая или зудящая кожа, импотенция, вагинальные дрожжевые грибковые инфекции, плохое заживление порезов и царапин, тяжелые или необычные инфекции, гипергликемия, потеря гликемического контроля, колебания постпрандиального содержания глюкозы в крови, колебания содержания глюкагона в крови и колебания содержания триглицеридов в крови и их сочетание.
42. Способ по п.32, дополнительно включающий этап интенсификации гликемического контроля в организме субъекта до введения терапевтического количества проостровкового пептида человека.
43. Способ по п.32, в котором субъекту вводят инсулин во время введения терапевтического количества проостровкового пептида человека.
44. Способ по п.43, в котором дозу инсулина уменьшают после введения терапевтического количества проостровкового пептида человека.
45. Способ по п.43, в котором дозу инсулина уменьшают один или несколько раз после введения терапевтического количества проостровкового пептида человека.
46. Способ по п.43, в котором дозу инсулина уменьшают до нуля.
47. Антитело, селективно связывающееся с проостровковым пептидом человека, включающим аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0:2.

- 40 013821
48. Антитело по п.47, в котором антитело является моноклональным антителом.
49. Антитело по п.47, в котором антитело является поликлональным антителом.
50. Набор для лечения пациента, имеющего диабет 2-го типа, содержащий терапевтически эффективную дозу проостровкового пептида человека, состоящего из аминокислотной последовательности, выбранной из 8ΕΟ ΙΌ Ν0:2, и по меньшей мере одно вещество для стимулирования регенерации островковых клеток поджелудочной железы, и инструкции по его применению.