CN106999553B - 使用glp-1和抗-il-21对1型糖尿病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及GLP‑1激动剂和抗‑IL‑21抗体在1型糖尿病的治疗和/或预防中的用途。

Description

使用GLP-1和抗-IL-21对1型糖尿病的治疗
本发明涉及GLP-1激动剂如GLP-1肽以及抗-IL-21抗体在1型糖尿病中的用途。
背景
虽然外源胰岛素疗法的进展已经使得患有1型糖尿病的受试者能够充分地控制其代谢障碍，但仍然没有应对其根本病因的治疗选项。因此，存在对1型糖尿病的改善治疗和预防选项的需要。
IL-21具有以对于I类细胞因子而言典型的上-上-下-下(up-up-down-down)拓扑学排列的四螺旋束结构(螺旋1-4/A-D——如例如J.Immunol.，2011vol.186no.2，p.708-721中的图1所定义的)。IL-21通过异源二聚体受体复合物发信号，该复合物由私有链IL-21Rα(也被称为IL-21R)和γC/IL-2Rγ/共有γ链组成，其中后者由IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15共享。γC和IL-21Rαα与IL-21上的非重叠结合位点结合-IL-21Rα与螺旋1和3结合而γC与人IL-21上的螺旋2和4结合。IL-21Rα以高亲和力结合IL-21并提供大部分的结合能。然而，信号传导需要与γC相互作用，因此结合IL-21Rα但无法与γC正确地相互作用的IL-21突变体是IL-21信号传导的强效拮抗剂。IL-21对先天性和适应性免疫应答发挥着多效的作用。其主要由激活的CD4+T细胞、滤泡T细胞和自然杀伤T细胞产生。人IL-21的氨基酸序列在SEQ ID NO 1中示出。由于IL-21在免疫系统刺激中的多种作用，IL-21拮抗作用已被建议作为治疗炎症的可能的途径。关于IL-21/IL-21Rα结合的更多细节在JBC，VOL.287，NO.12，pp.9454-9460，2012年3月16日中描述，并且示例性的抗-IL-21抗体在WO2010055366和WO2012098113中描述。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)由于其在葡萄糖代谢中的作用，是一种被充分研究的肽。由于前6个氨基酸残基在成熟期间被去除，人GLP-1的活性形式被称为GLP-1(7-37)和GLP-1-(7-36)NH2。该肽的存在时间非常短，并且是强效的抗高血糖激素，其能够刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌并抑制胰高血糖素分泌。用于2型糖尿病治疗、促进(agonising)GLP-1作用的治疗性化合物包括利拉鲁肽(liraglutide)、艾塞那肽、利司那肽、阿比鲁肽(albiglutide)和度拉鲁肽(dulaglutide)。
发明内容
本发明关注IL-21抑制剂和GLP-1激动剂给药的组合效应，如本文所述的，发现该组合效应对1型糖尿病的治疗和预防是有帮助的。
在一些实施方案中，本发明涉及GLP-1激动剂如GLP-1肽以及IL-21功能抑制剂用于治疗和/或预防1型糖尿病的用途。在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗和/或预防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用GLP-1激动剂如GLP-1肽，以及IL-21功能抑制剂。在一个实施方案中，本发明涉及在治疗和/或预防1型糖尿病的方法中使用的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及用于制备用于治疗和/或预防1型糖尿病的一种或多种药物的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂。
在一个实施方案中，根据本发明的方法可包括向有需要的受试者施用有效量的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂。在一个实施方案中，所述受试者是优选地保留一定的内源胰岛素产生的近期诊断的1型糖尿病患者。采用GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂的联合治疗允许患者免除或减少对外源胰岛素疗法的需求。在一个实施方案中，与采用外源胰岛素的标准治疗相比，采用GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂的联合治疗保持了β-细胞功能。
附图简述
图1示出了在未治疗的个体对照动物(上图)和施用利拉鲁肽后的个体动物(下图)的NOD模型中，随时间变化的血糖(BGV)。
图2示出了在施用抗-IL-21抗体后的个体动物(上图)和施用利拉鲁肽及抗-IL-21抗体后的个体动物(下图)的NOD模型中，随时间变化的血糖(BGV)。
对于每个治疗方案，实验开始时的动物数目为每组10只，然而，在实验的进程中，一些动物由于高血糖值(高于600mg/dL)和/或较差的总体健康而从该研究中移除并施以安乐死；被安乐死的动物用“*”表示。对于图1的下图和图2的下图，所示的时间段经过利拉鲁肽治疗期(糖尿病发作后的第0-35天)和额外35天的监测(用“停用利拉鲁肽”表示)。
图3和图4与图1和图2相似，但其包括参与实施例1和2中所描述的研究的全部动物。在图4中，第35天的“#”表示将来自抗-IL-21组和联合治疗组的每一组的3只小鼠处死用于其他目的(组织学评价)，因此没有进一步监测。
图5示出了Kaplan-Meier图——糖尿病发生率和存活率。
汇编了来自实施例1和2的数据。每日施用利拉鲁肽持续35天。抗-IL-21施用的时间安排由X轴上的三角形/箭头标出。通过对数秩Mantel-cox检验确定统计学显著性。仅示出了具有显著性差异的比较的P值。所有其他的比较都是不显著的。在第35天，将来自抗-IL-21单药疗法组的三只动物以及来自联合组的三只小鼠处死以供组织学分析，因此其未被包含在第70天的存活分析中。A.经过治疗期仍患糖尿病的小鼠的比例。B.经过糖尿病发作后70天的“存活率”。存活被定义为未变成终末高血糖(连续2天的BGV≥600mg/dl)的那些动物。阴影区域表示停用利拉鲁肽。由于3只小鼠被移出用于组织学分析，因此处理组3和4中小鼠的总数仅为每组15只(并非18只)。
发明详述
本发明人惊讶地发现，GLP-1激动剂如GLP-1肽以及IL-21功能抑制剂的施用在糖尿病受试者中提供了改善的血糖水平控制，如糖尿病受试者中持久的血糖水平正常化。
本发明涉及GLP-1激动剂如GLP-1肽以及IL-21功能抑制剂用于治疗和/或预防1型糖尿病的用途。换句话说，本发明涉及一种用于治疗和/或预防1型糖尿病的方法，该方法包括向有需要的患者施用GLP-1激动剂如GLP-1肽，以及IL-21功能抑制剂。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂如GLP-1肽以及IL-21功能抑制剂在用于治疗和/或预防1型糖尿病的方法中使用。
在一个实施方案中，将GLP-1激动剂如GLP-1肽以及IL-21功能抑制剂施用至近期诊断出1型糖尿病的受试者。在一个实施方案中，该治疗在诊断的12周内开始。在一个实施方案中，该治疗在诊断的8周内开始。在一个实施方案中，该治疗在诊断的4周内开始。
在一个实施方案中，将GLP-1激动剂如GLP-1肽以及IL-21功能抑制剂施用至具有发展为1型糖尿病的风险的受试者，如具有胰岛自身抗体的受试者或没有胰岛自身抗体但在遗传上存在风险的受试者。
在一个实施方案中，本发明涉及有效量的GLP-1激动剂如GLP-1肽和有效量的IL-21功能抑制剂的施用。
IL-21功能抑制剂
根据本发明，IL-21功能抑制剂是具有抑制IL-21介导的信号传导和生物效应的能力的药剂，可将这样的药剂描述为是IL-21中和性的。用于本发明的IL-21功能抑制剂(也被称为IL-21/IL-21Rα拮抗剂)是具有抑制IL-21介导的信号传导和生物效应的能力的药剂。在优选的实施方案中，用于本发明的IL-21Rα拮抗剂是具有与γC或IL-21Rα竞争结合IL-21的能力的中和性抗-IL-21抗体。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂是能够特异性结合IL-21的抗体。在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂是抗-IL-21抗体。在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与受体链竞争结合IL-21，其中所述受体链选自由IL-21Rα(私有链)和γC(共有γ链)组成的列表。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与IL-21Rα竞争结合IL-21。在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与人IL-21的螺旋1和3结合。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与IL-21上的不连续表位结合，其中所述表位包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸I37至Y52和N92至P108。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与IL-21上的不连续表位结合，其中所述表位包含如SEQ ID NO 1中所示的I37至Y52区域内和N92至P108区域内的氨基酸。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与如SEQ ID No 1定义的IL-21的R34、R38、Q41中的至少一个以及K102和R105中的至少一个结合。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与如SEQ ID No 1定义的IL-21的R34、R38、Q41、K102和R105中的至少一个、至少两个、至三个、至少四个或全部五个结合。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与IL-21上的不连续表位结合，其中所述抑制剂直接接触(截止值为
Figure BDA0001146744480000051
)氨基酸残基34、37、38、41、44、45、47、48、51、52、92、94、95、97、98、99、101、102、105、106、107和108中的至少15个。
在一个实施方案中，该抗体直接接触I37、R38、Q41、D44、I45、D47、Q48、N51和Y52(螺旋1区)。在一个实施方案中，该抗体直接接触(螺旋3区)的N92、R94、I95、N97、V98、S99、K101、K102、R105、K106、P107和P108。
与IL-21Rα竞争结合IL-21的抗-IL-21抗体的一个实例为“mAb 5”抗体，该抗体是在WO2010055366中以克隆号362.78.1.44首次披露的人抗体。mAb 5重链和轻链的氨基酸序列在SEQ ID NO 2和3中示出(IgG1同种型版本)。在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂为mAb 5。该mAb 5抗体与人IL-21的螺旋1和3结合，或者更具体地，与如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸I37至Y52和N92至P108结合。mAb 5及其变体的结合性质以及其优点(高亲和力和效力)在WO2012098113中更详细地描述。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂是如WO2010/055366或WO2012098113中所描述的。在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂选自在WO2010/055366的表1中列出的抗体组。在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂是由WO2010/055366中被命名为362.78.1.44的杂交瘤产生的抗体或抗体片段，其中该杂交瘤由美国模式培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)保藏，ATCC专利保藏名称为PTA-8790。
JBC，VOL.287，NO.12，pp.9454-9460，2012年3月16日公开了关于IL-21/IL-21Rα结合的进一步细节。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂是一种抗-人IL-21单克隆抗体或抗体片段，其包含：
(a)重链区，该重链区包含：
(i)包含SEQ ID NO：15的重链可变区CDR1；
(ii)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR2；和
(iii)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR3；以及
(b)轻链区，该轻链区包含：
(i)包含SEQ ID NO：19的轻链可变区CDR1；
(ii)包含SEQ ID NO：20的轻链可变区CDR2；和
(iii)包含SEQ ID NO：21或22的轻链可变区CDR3；
并且其中任选地通过氨基酸置换修饰该抗体的Fc部分以降低效应子功能。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂是一种抗-人IL-21单克隆抗体或抗体片段，其包含i)SEQ ID NO：14的氨基酸残基20至145和SEQ ID NO：18的氨基酸残基21至26；或ii)SEQ ID NO：14的氨基酸残基1至145和SEQ ID NO：18的氨基酸残基1至126；并且其中该抗体的Fc部分选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
可进一步优化该Fc部分以提高生物物理/生物化学属性或效应子功能属性。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂包含如SEQ ID NO 2中所示的三个CDR序列以及如SEQ ID NO 3中所示的三个CDR序列。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂是与γC竞争结合IL-21的抗-IL-21抗体。在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与人IL-21的螺旋2和4结合。在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150和His 151的表位结合。
与γC竞争结合IL-21的抗-IL-21抗体的一个实例是“mAb 14”抗体，该抗体是在WO2010055366中以克隆号366.328.10.63首次披露的人抗体。mAb 14与人IL-21的螺旋2和4结合。更具体地，如WO2012164021所述，mAb 14与人IL-21的Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met147、His 149、Gln 150和His 151结合。mAb 14重链和轻链的氨基酸序列在SEQ ID NO 4和5中示出。与γC竞争结合IL-21的抗-IL-21抗体的进一步的实例在WO2012164021中描述。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂为mAb 14。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂包含如SEQ ID NO 4中所示的三个CDR序列以及如SEQ ID NO 5中所示的三个CDR序列。
mAb 5和mAb 14类型的抗体的特征通常在于对IL-21具有异常高的亲和力(在纳摩尔的范围内)并且具有中和IL-21诱导的效应的高效力。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与mAb5竞争结合IL-21。该抑制剂可以是与mAb5相同箱元(bin)的抗体。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂与mAb14竞争结合IL-21。该抑制剂可以是与mAb5相同箱元的抗体。
用于本发明的IL-21功能抑制剂或中和性IL-21Rα拮抗剂的进一步实施方案是与IL-21竞争结合IL-21Rα的那些。用于本发明的IL-21Rα拮抗剂优选为结合连接IL-21Rα的β链的环的药剂。AB、CD、EF、B′C和F′G′环以及接头全都含有与结合IL-21有关的残基。在IL-21R中，CD环中的Tyr36、EF环中的Met 89和Asp 91以及B′C′环中的Tyr 148对结合表面贡献最大。最重要的环为EF环，其提供IL-21R中与结合IL-21有关的20个氨基酸中的7个。
用于本发明的抗IL-21R抗体可与该EF环结合。用于本发明的优选抗-IL-21R抗体与选自下组的至少10个氨基酸残基的组结合：IL-21R(SEQ ID NO 6)的Tyr 29、Gln 52、Gln54、Tyr 55、Glu 57、Leu 58、Phe 86、His 87、Phe 88、Met 89、Ala 90、Asp 91、Asp 92、Ile93、Leu 113、Ala 115、Pro 145、Ala 146、Tyr 148、Met 149、Lys 153、Ser 209、Tyr210。
用于本发明的IL-21/IL-21Rα如抗-IL-21R抗体或拮抗剂是干扰IL-21Rα与γC结合并由此干扰IL-21/IL-21Rα/γC复合物组装的抗体。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂结合IL-21并由此抑制IL-21功能。该IL-21功能抑制剂可以是包含结合IL-21的IL-21受体片段的融合蛋白，如由Chimerigen生产且可从例如www.biomol.de以产品号CHI-HF-21021R-C100商购的重组产物“IL-21R(人)：FC(人)(重组)”。
在一个实施方案中，该IL-21功能抑制剂以107M-1或更高、108M-1或更高、109M-1或更高、1010M-1或更高、1011M-1或更高或者1012M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
根据本发明的“中和性”IL-21抑制剂或抗体是具有显著抑制通过IL-21Ra的信号传导的能力的分子。可以在使用表达IL-21R和γC的细胞的多种功能试验，例如，如WO2012/098113和WO2012/164021中公开并且在本文中以试验III和IV示例的使用NK92细胞的生物活性试验和B细胞增殖试验中评价中和效应。在B细胞试验中，纳摩尔范围的IC50被认为是高度有效的中和性IL-21抑制剂。通常，具有与本文所述的抗体相似的中和效应的分子将被认为是中和性IL-21抑制剂。
如本文所用的术语“抗体”、“重组抗体”、“单克隆抗体”和“mAb”意指根据本发明的、具有与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子及其片段。全长抗体包含四条(或更多)多肽链，即，通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和至少两条(L)轻链。每条重链均由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3这三个结构域组成。每条轻链均由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布有被称为框架区(FR)的更加保守的区域。每个VH和VL区由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端以如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可通过将序列相对于已知可变区的数据库进行比对来鉴别抗体序列中的可变区和CDR(框架和CDR根据本文的Kabat编号方案定义-(Kabat，EA，Wu，TT，Perry，HM等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版.美国卫生与人类服务部(US Department of Healthand Human Services)，公共卫生署(Public Health Service)，国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health)，NIH出版号91-3242，1991))。
抗体的片段可结晶区(“Fc区”/“Fc域”)包含与被称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用的抗体尾区。该性质允许抗体激活免疫系统。然而，Fc域可包含导致这些效应子功能修饰的氨基酸突变。优选地，修饰的Fc域包含将分别导致对某些Fc受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)以及导致C1q介导的补体固定减少(A330S和P331S)的以上突变中的一种或多种，优选全部(残基根据EU索引编号)。这样的Fc域将仍然保留较长的体内循环半衰期。
被称为“Fab区”/“Fab域”/“Fab片段”的抗体的另一部分含有限定抗体可以结合的特定靶标的可变区。可使用公知的方法，例如，通过用酶如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)进行蛋白水解切割，从完整的抗体生成Fab片段。或者，可使用标准的重组DNA和蛋白质表达技术，以重组方式产生抗体片段。
因此，包含在术语“抗体”之内的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab)2和F(ab′)2片段，一种包含在铰链区处由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH域组成的scFv片段，(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个域VL和VH由单独的基因编码，但可以使用重组方法，通过合成接头将它们连接在一起，该合成接头使得它们能够被制成单条蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(ScFv)；参见例如，Bird等人，(1988)Science 242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。这样的单链抗体也意欲包含在术语“抗体”之内。单链抗体的其他形式如双抗体(diabodies)也包含在术语“抗体”之内。双抗体为二价的双特异性抗体，其中VH和VL域在单条多肽链上表达，但使用的接头由于过短而不能允许在同一条链上的两个域之间配对，使得这些域与另一条链的互补域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见例如，Hol-liger，P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。
应当理解，抗原可具有一个或多个表位，该表位包括(1)由单肽链组成的抗原决定簇；(2)包含一条或多条空间上邻近的肽链的构象表位，其中该肽链各自的氨基酸序列沿多肽序列不连贯地定位；以及(3)整个或部分地包含翻译后与抗原共价连接的分子结构如碳水化合物基团等的翻译后表位。
如本文所用的，术语“人抗体”是指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包含例如在CDR中、尤其是CDR3中的、不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
由来源于另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)的抗体衍生的CDR序列已被移植到人框架区上并任选地可能通过诱变进一步工程化的抗体被称为“人源化抗体”。
术语“嵌合抗体”是指这样的根据本发明的抗体，其中轻链和重链基因已经从属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建，一般是通过遗传工程化构建。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可连接到人恒定区段。
如本文所用的，术语“表位”在“抗原结合多肽”如抗体(Ab)与其相应的抗原(Ag)之间的分子相互作用的背景下定义。通常，“表位”是指Ag上与Ab特异性结合的区或区域，即与Ab物理接触的区或区域。物理接触可采用针对Ab和Ag分子中的原子的各种标准(例如，距离截止值为
Figure BDA0001146744480000101
如
Figure BDA0001146744480000102
如
Figure BDA0001146744480000103
如
Figure BDA0001146744480000104
或溶剂可及性)来定义。蛋白质表位可包含Ag中直接参与Ab结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)以及其他不直接参与结合的氨基酸残基，如被Ab有效阻断的Ag的氨基酸残基，即在Ab的“溶剂排斥表面”和/或“足迹”内的氨基酸残基。
可采用多种实验和计算表位作图方法在不同的详细度水平上描述和表征给定抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位。该实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)谱法、氢氚交换质谱法(HX-MS)以及各种竞争结合方法；本领域已知的方法。由于每一种方法均依赖于独特的原理，因此对表位的描述与确定表位的方法紧密相关。因此，根据所采用的表位作图方法，给定Ab/Ag对的表位可有不同地描述。
与相同抗原结合的抗体可就其同时与其共同抗原结合的能力进行表征，并且可以经历“竞争结合”/“分箱(binning)”。在该语境下，术语“分箱”是指对与相同抗原结合的抗体进行分组的方法。抗体的“分箱”可以基于在以标准技术为基础的试验中两种抗体与其共同抗原的竞争结合，该标准技术例如是表面等离子体共振(SPR)、ELISA或流式细胞术。
使用参考抗体确定抗体的“箱元”。如果第二抗体不能与参考抗体同时与抗原结合，则称第二抗体与参考抗体属于同一“箱元”。在这种情况下，参考抗体和第二抗体竞争性地结合抗原的相同部分，因此被划归为“竞争抗体”。如果第二抗体能够与参考抗体同时与抗原结合，则称第二抗体属于不同的“箱元”。在这种情况下，参考抗体和第二抗体不会竞争性地结合抗原的相同部分，因此被划归为“非竞争抗体”。
如本文所用的，术语“亲和力”定义了受体与配体结合的强度，该结合经常是抗体与表位的结合。抗体的亲和力通过平衡解离常数KD来测量，该KD被定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，而[Ag]是平衡时未结合的抗原的摩尔浓度。还可以从通过例如SPR方法确定的复合物形成和解离的动力学对KD进行描述。与单价复合物的结合和解离相对应的速率常数分别被称为结合速率常数ka(或k结合)和解离速率常数kd(或k解离)。然后通过方程KD＝kd/ka，将KD与ka和kd相关联。亲和力常数KA被定义为1/KD。通过竞争性抑制确定抗体特异性和亲和力的优选方法可见于Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)，Colligan等人编著，CurrentProtocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience，N.Y.，(1992，1993)，以及Muller，Meth.Enzymol.92：589-601(1983)。就本发明而言，使用高亲和力抗体是优选的，例如，以通过例如SPR测量的以下结合亲和力与抗原特异性结合的抗体：107M-1或更高、108M-1或更高、109M-1或更高、1010M-1或更高、1011M-1或更高，或1012M-1或更高。
在一个实施方案中，术语“抗-IL-21抗体”和“抗-IL-21”在本文中可互换地使用，并且指具有与IL-21特异性结合的能力的抗体。
用于本发明的IL-21/IL-21Rα拮抗剂，如抗-IL-21抗体，可借助于重组核酸技术生产。通常，对克隆的野生型蛋白X核酸序列进行修饰以使其编码所需蛋白质。然后将该修饰的序列插入至表达载体中，继而将该载体转化或转染到宿主细胞中。
序列
关于进一步的序列信息，请参见序列表。
SEQ ID No 1：hIL-21(包含跨越氨基酸1-29的信号肽——mAb 5表位以粗体示出；IL-21Ra结合位点以下划线示出；形成mAb 14表位的氨基酸残基以斜体小写字母示出)。
MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPedvetnCewSAFSCFQKAOLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQkhrLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSlLQkmIhqhLSSRTHGSEDS。
跨越以下氨基酸的四个螺旋′：螺旋1aa 32-57、螺旋2aa 72-81、螺旋3aa 93-103和螺旋4aa 133-149。
SEQ ID No 2：“mAb 5”：轻链(省略了信号肽——CDR序列以粗体/下划线示出——恒定区以小写字母示出)：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSWTFGQGTKVEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
SEQ ID No 3：“mAb 5”：IgG1同种型的重链(省略了信号肽——CDR序列以粗体/下划线示出——恒定区以小写字母示出)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIWYDGSDKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGDSSDWYGDYYFGMDVWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaegapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpssiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqPennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
SEQ ID No 4：“mAb 14”轻链(省略了信号肽——CDR序列以粗体/下划线示出，恒定区以小写字母示出)：
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDSALAWYQQKPGKAPKILIHDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPYTFGQGTKLEIKRtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
SEQ ID No 5：“mAb 14”IgG4同种型的重链(省略了信号肽——CDR序列以粗体/下划线示出，恒定区以小写字母示出)：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSITSGSYYIHYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRERGWGYYGMDVWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk。
SEQ ID No 6：IL-21Rα(包含信号序列)：
MPRGWAAPLLLLLLQGGWGCPDLVCYTDYLQTVICILEMWNLHPSTLTLTWQDQYEELKDEATSCSLHRSAHNATHATYTCHMDVFHFMADDIFSVNITDQSGNYSQECGSFLLAESIKPAPPFNVTVTFSGQYNISWRSDYEDPAFYMLKGKLQYELQYRNRGDPWAVSPRRKLISVDSRSVSLLPLEFRKDSSYELQVRAGPMPGSSYQGTWSEWSDPVIFQTQSEELKEGWNPHLLLLLLLVIVFIPAFWSLKTHPLWRLWKKIWAVPSPERFFMPLYKGCSGDFKKWVGAPFTGSSLELGPWSPEVPSTLEVYSCHPPRSPAKRLQLTELQEPAELVESDGVPKPSFWPTAQNSGGSAYSEERDRPYGLVSIDTVTVLDAEGPCTWPCSCEDDGYPALDLDAGLEPSPGLEDPLLDAGTTVLSCGCVSAGSPGLGGPLGSLLDRLKPPLADGEDWAGGLPWGGRSPGGVSESEAGSPLAGLDMDTFDSGFVGSDCSSPVECDFTSPGDEGPPRSYLRQWVVIPPPLSSPGPQAS。
SEQ ID No 7：γC(共有γ链/IL-2Rγ)包含信号序列：
MLKPSLPFTSLLFLQLPLLGVGLNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDSLSVSTLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWYKNSDNDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPREPRRQATQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLVQYRTDWDHSWTEQSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWGSNTSKENPFLFALEAVVISVGSMGLIISLLCVYFWLERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET。
SEQ ID No 11：重组小鼠IL-21：
Figure BDA0001146744480000141
SEQ ID No 12：小鼠替代抗-IL-21的氨基酸序列-可变轻链(mIgGl/κ同种型)
Figure BDA0001146744480000151
SEQ ID No 13：小鼠替代抗-IL-21的氨基酸序列-可变重链(mIgG1/κ同种型)
Figure BDA0001146744480000152
SEQ ID No 14：
Figure BDA0001146744480000153
SEQ ID No 15：SYGMH
SEQ ID No 16：FIWYDGSDKY YADSVKG
SEQ ID No 17：DGDSSDWYGD YYFGMDV
SEQ ID No 18：
Figure BDA0001146744480000154
Figure BDA0001146744480000155
SEQ ID No 19：RASQSVSSSY LA
SEQ ID No 20：GASSRAT
SEQ ID No 21：QQYGSWT
SEQ ID No 22：TYGMH
GLP-1受体激动剂
可将受体激动剂定义为与受体结合并且引起天然配体典型的应答的类似物。可将完全激动剂定义为引起与天然配体相同大小的应答的激动剂(参见例如，“Principles ofBiochemistry“，AL Lehninger，DL Nelson，MM Cox，第二版，Worth Publishers，1993，第763页)。
因此，例如，可将“GLP-1受体激动剂”或“GLP-1激动剂”定义为能够与GLP-1受体结合并能够将其激活的化合物。而可将“完全”GLP-1受体激动剂定义为能够引起与人GLP-1相似大小的GLP-1受体应答的GLP-1受体激动剂。
GLP-1激动剂
在一个实施方案中，GLP-1激动剂为选自GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或其类似物或衍生物的GLP-1肽。在一个实施方案中，与GLP-1(7-37)相比，GLP-1肽包含不超过15个，如不超过10个或不超过6个已被置换、插入或缺失的氨基酸残基。在一个实施方案中，与GLP-1(7-37)相比，GLP-1肽包含不超过5个，如不超过4个或不超过3个已被置换、插入或缺失的氨基酸残基。在一个实施方案中，GLP-1肽包含不超过4个不是由遗传密码编码的氨基酸残基。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂为毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3，毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3类似物，或任何这些的衍生物。
在一个实施方案中，用于本发明的GLP-1激动剂具有GLP-1活性。在一个实施方案中，“GLP-1激动剂”被理解为指代包括肽和非肽化合物在内的任何化合物，其完全或部分地激活人GLP-1受体。在一个实施方案中，“GLP-1激动剂”是与GLP-1受体结合的任意的肽或非肽小分子，优选地，该结合具有如通过本领域已知的方法(参见例如WO 98/08871)测量的、低于1μM例如低于100nM的亲和常数(KD)或效力(EC50)。
在一个实施方案中，“GLP-1激动剂”被理解为指代完全或部分地激活人GLP-1受体的肽。在一个实施方案中，“GLP-1激动剂”是与GLP-1受体结合的任意肽，优选地，该结合具有如通过本领域已知的方法(参见例如WO 98/08871)测量的、低于1μM例如低于100nM的亲和常数(KD)或效力(EC50)。在一个实施方案中，“GLP-1激动剂”被理解为指代包括肽和非肽化合物在内的任何化合物，其完全或部分地激活人GLP-1受体。在一个实施方案中，“GLP-1肽”是与GLP-1受体结合的任意的肽或非肽小分子，优选地，该结合具有如通过本领域已知的方法(参见例如WO 98/08871)测量的、低于1μM例如低于100nM的亲和常数(KD)或效力(EC50)。在一个实施方案中，“GLP-1激动剂”不是非肽化合物，如非肽小分子。
在一个实施方案中，用于鉴别GLP-1激动剂的方法在WO 93/19175(Novo NordiskA/S)中描述，而可根据本发明使用的适当GLP-1激动剂的实例包括在WO 2005/027978(NovoNordisk A/S)中提到的那些GLP-1激动剂，这些申请的教导均通过引用并入本文。如本领域所知的，“GLP-1活性”是指与GLP-1受体结合并且启动导致促胰岛素作用或其他生理学效应的信号转导途径的能力。例如，可使用本文试验(I)中描述的试验测定本发明GLP-1激动剂的GLP-1活性。在一个实施方案中，GLP-1激动剂具有任选地通过试验(I)确定的、等于或低于3000pM，如等于或低于500pM，或等于或低于100pM的EC50。
在另一个实施方案中，GLP-1激动剂是稳定的GLP-1激动剂。如本文所用的，“稳定的GLP-1激动剂”(例如，“稳定的GLP-1肽”)是指任选地通过下文所述的方法确定的，在人体中展现出至少24小时的体内血浆消除半衰期的GLP-1激动剂。稳定的GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)的实例可以在WO2006/097537中找到。在一个实施方案中，GLP-1激动剂是DPPIV保护的GLP-1肽。在一个实施方案中，GLP-1肽是DPPIV稳定化的。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂具有至少24小时，如至少48小时、至少60小时或至少72小时，或如至少84小时、至少96小时或至少108小时，或任选地至少120小时、至少132小时或至少144小时的半衰期，其中所述半衰期任选地例如通过试验(II)在人或小型猪中确定。
在一个实施方案中，用于确定化合物在人体中的血浆消除半衰期的方法可以如下进行：将化合物溶解在pH 7.4的等渗缓冲液、PBS或任何其他合适的缓冲液中。外周注射，优选地在腹部或大腿上部注射该剂量。以频繁的时间间隔取得用于确定活性化合物的血液样品，并且持续到足以覆盖终末消除部分的时间(例如，给药前、给药后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第2天)、60(第3天)、72(第4天)和84(第4天)小时)。活性化合物浓度的确定如Wilken等人，Diabetologia 43(51)，2000所述进行。使用可商购获得的软件WinNonlin 2.2版(Pharsight，Cary，NC，USA)，通过使用非房室方法，从每个受试个体的浓度-时间数据计算出推导的药代动力学参数。终末消除速率常数通过对浓度-时间曲线的终末对数-线性部分进行对数-线性回归来估算，并用于计算终末半衰期。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂为GLP-1衍生物。在一个这样的实施方案中，GLP-1肽经由相对于GLP-1(7-37)氨基酸序列的位置23、26、34、36或38处的氨基酸残基连接至亲水性间隔区。
在一个实施方案中，GLP-1衍生物包含任选地经由亲水性间隔区共价连接的白蛋白结合残基。在一个实施方案中，所述白蛋白结合残基任选地经由亲水性间隔区共价连接至所述GLP-1肽的C-末端氨基酸残基或并非C-末端氨基酸残基的氨基酸残基。在一个实施方案中，GLP-1肽经由相对于GLP-1(7-37)氨基酸序列的位置23、26、34、36或38处的氨基酸残基连接至亲水性间隔区。
人胰高血糖素样肽-1是GLP-1(7-37)，并且具有序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID No 8)。GLP-1(7-37)还可被称为“天然”GLP-1。在序列表中，GLP-1(7-37)的第一个氨基酸残基(组氨酸)被指定为第1号。然而，在下文中，根据本领域的惯例，该组氨酸残基被指定为第7号，并且后续的氨基酸残基相应地编号，结束于第37号甘氨酸。因此，通常，本文中对于GLP-1(7-37)的氨基酸残基编号或位置编号的任何提及均是参考从位置7处的His开始并在位置37处的Gly结束的序列。可使用相应的氨基酸位置来提及GLP-1类似物。
合适的类似物命名法的一个非限制性实例是[Aib8，Arg34，Lys37]GLP-1(7-37)，其指定这样一种GLP-1(7-37)类似物，其中位置8处的丙氨酸已被α-氨基异丁酸(Aib)置换，位置34处的赖氨酸已被精氨酸置换，并且位置37处的甘氨酸已被赖氨酸置换。
如例如在本发明的GLP-1肽的上下文中使用的，术语“肽”是指包含通过酰胺(或肽)键互相连接的一系列氨基酸的化合物。
本发明的肽包含至少五个通过肽键连接的组成氨基酸。在特定的实施方案中，该肽包含至少10个氨基酸、优选至少15个氨基酸、更优选至少20个氨基酸、甚至更优选至少25个氨基酸，或最优选至少28个氨基酸。在特定的实施方案中，该肽由i)29个，ii)30个，iii)31个，或iv)32个氨基酸组成。
在一个实施方案中，GLP-1肽在GLP-1(7-37)的整个长度上表现出与GLP-1(7-37)至少60％、65％、70％、80％或90％的序列同一性。作为用于确定两个类似物之间序列同一性的方法的实例，比对了两个肽[Aib8]GLP-1(7-37)和GLP-1(7-37)。[Aib8]GLP-1(7-37)相对于GLP-1(7-37)的序列一致性通过比对的相同残基的数目减去不同残基的数目再除以GLP-1(7-37)中的残基总数而得出。因此，在所述实例中，序列同一性为(31-1)/31。在一个实施方案中，在确定序列一致性时，不包括GLP-1肽的非肽部分。
本文中，术语“衍生物”与术语“缀合物”不同。衍生物如GLP-1衍生物包含共价连接至肽的一个或多个特定氨基酸残基的明确定义的结构的一个或多个取代基或侧链，本文中该肽主要指GLP-1肽。而缀合物是指具有经由合成接头(由此与融合蛋白相区别)与肽共价结合的一般为重组的大分子(如IgG-Fc或白蛋白)的化合物。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂为GLP-1肽衍生物。在一个实施方案中，如本文在GLP-1肽或类似物的上下文中使用的术语“衍生物”是指化学修饰的GLP-1肽或类似物，其中一个或多个取代基已经与该肽或类似物共价连接。该取代基还可被称为侧链(不要与氨基酸侧链混淆)。典型的修饰是酰胺、碳水化合物、烷基基团、酰基基团、酯等。GLP-1(7-37)衍生物的一个实例为Nε26-(γ-Glu(Nα-十六碳酰基))-[Arg34，Lys25])GLP-1(7-37)。在特定的实施方案中，该侧链能够与白蛋白形成非共价聚集体，由此促进该GLP-1肽随血流的循环，并且由于该GLP-1肽与白蛋白的聚集体仅缓慢地分解以释放活性药物成分的事实，其还具有延长该GLP-1肽的作用时间的效果。因此，该取代基或侧链作为整体可被称为白蛋白结合部分。
在特定的实施方案中，该侧链具有至少10个碳原子或至少15、20、25、30、35个或至少40个碳原子。在进一步的特定实施方案中，该侧链可进一步包含至少5个杂原子，特别是O和N，例如至少7、9、10、12、15、17个或至少20个杂原子，如至少1、2或3个N原子，和/或至少3、6、9、12或15个O原子。
在另一个特定实施方案中，白蛋白结合部分包含与白蛋白结合特别相关并由此与延长作用特别相关的部分，该部分因此可被称为延长部分(protracting moiety)。相对于延长部分与该肽的连接点，该延长部分可以在该白蛋白结合部分的对立端处或附近。
在更进一步的特定实施方案中，白蛋白结合部分包含在延长部分与至该肽的连接点之间的部分，该部分可被称为接头、接头部分、间隔区，等等。该接头可以是任选的，因此在那种情况下，白蛋白结合部分可以与延长部分相同。
在特定的实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分是亲脂性的，和/或在生理学pH(7.4)下是带负电荷的。
可通过酰化作用将白蛋白结合部分、延长部分或接头与GLP-1肽的赖氨酸残基共价连接。用于制备衍生物的其他或替代手段包括烷基化、酯形成或酰胺形成，或例如通过马来酰亚胺或卤代乙酰胺(如溴代/氟代/碘代乙酰胺)偶联与半胱氨酸残基偶联。
在一个实施方案中，例如包含延长部分和接头的白蛋白结合部分的活性酯在酰胺键形成(此过程被称为酰化作用)的情况下与赖氨酸残基的氨基基团例如其ε氨基基团共价连接。
除非另有说明，否则当提及赖氨酸残基的酰化作用时，应理解是对其ε氨基基团的提及。
对于本发明而言，术语“白蛋白结合部分”、“延长部分”和“接头”可包括这些分子的未反应形式以及经反应的形式。根据使用该术语的上下文，能够清楚是指一种形式还是指另一种形式。
通常，延长部分经由接头在指定位置与Lys的ε氨基基团连接，并且同样地，在一个实施方案中，延长部分、接头与肽之间的所有连接都是酰胺键。
由于半衰期延长的性质，脂肪酸可用作所述白蛋白结合残基并特别地用作延长部分的关键部分。对于与GLP-1肽的连接，脂肪酸的酸基团，或脂肪二酸的一个酸基团，经由酰胺键与GLP-1肽中的赖氨酸残基的ε氨基基团直接连接或通过接头连接。
在一个实施方案中，GLP-1衍生物是单酰化的。在一个实施方案中，GLP-1衍生物在K26处酰化。
在一个实施方案中，GLP-1衍生物是双酰化的。在一个实施方案中，GLP-1衍生物在K26和K37、K27和K36或K38和K42处酰化。
在一个实施方案中，术语“脂肪酸”是指具有4-28个碳原子的脂肪族一元羧酸，其任选地是无支链的和/或偶数的，并且其可以是饱和或不饱和的。
在一个实施方案中，术语“脂肪二酸”是指如上定义的脂肪酸，但其在ω位置处具有额外的羧酸基团。因此，脂肪二酸是二元羧酸。
在一个实施方案中，一个或多个延长部分包含独立地选自C14-C20脂肪酸和C16-C20脂肪二酸的一种或多种脂肪酸。
在一个实施方案中，延长部分可包含C16脂肪酸(CH3-(CH2)14-CO-)。
在一个实施方案中，延长部分可包含C18二酸基团(HOOC-(CH2)16-CO-)。在一个实施方案中，延长部分可包含C20二酸基团(HOOC-(CH2)18-CO-)。
在一个实施方案中，延长部分可包含4-COOH-PhO-脂肪酸，其中该4-COOH-PhO-结构之后为-(CH2)y-C(＝O)-，其中y为7-11。
在一个实施方案中，延长部分可包含化学式9，其中y＝9。
化学式4：
Figure BDA0001146744480000221
在一个实施方案中，GLP-1肽衍生物的一个或多个延长部分是经由接头连接的。
在一个实施方案中，本发明的GLP-1衍生物的接头可包含以下的第一接头元件：
化学式5：
Figure BDA0001146744480000222
其中k为1-5范围内的整数，并且n为1-5范围内的整数。
在特定的实施方案中，当k＝1并且n＝1时，可将该接头元件称为OEG，或8-氨基-3，6-二氧杂辛酸的二价基团，并且/或者其可由下式表示：
化学式5a：
*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*。
在另一个特定实施方案中，本发明的GLP-1肽的每个接头均可进一步独立地包含第二接头元件，例如，Glu二价基团，如化学式6和/或化学式7：
化学式6：
Figure BDA0001146744480000223
化学式7：
Figure BDA0001146744480000231
其中Glu二价基团可被包含p次，其中p为1-3范围内的整数。
由于氨基酸谷氨酸的γ羧基基团在这里被用于与另一个接头元件或赖氨酸的ε氨基基团连接，化学式6还可被称为γ-Glu，或简称为gGlu。如上文解释的，例如，另一个接头元件可以为另一个Glu残基或OEG分子。Glu的氨基基团转而与延长部分的羧基基团，或与例如OEG分子(若存在)的羧基基团，或与例如另一个Glu(若存在)的γ羧基基团形成酰胺键。
由于氨基酸谷氨酸的α羧基基团在这里被用于与另一个接头元件或赖氨酸的ε氨基基团连接，化学式7还可被称为α-Glu，或简称为aGlu，或简写为Glu。
化学式6和化学式7的上述结构涵盖了Glu的L形式以及D形式。在特定实施方案中，化学式6和/或化学式7独立地为a)L形式，或b)D形式。
在更进一步的特定实施方案中，该接头具有a)5至41个C原子；和/或b)4-28个杂原子。
可使用任何合适的方法确定本发明的GLP-1激动剂(GLP-1肽)的血浆浓度。例如，可使用LC-MS(液相色谱质谱法)，或免疫测定如RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)以及LOCI(发光氧通道免疫测定)。合适的RIA和ELISA测定的一般方案可见于例如WO09/030738第116-118页。优选的测定为LOCI(发光氧通道免疫测定)，通常如Poulsen和Jensen在Journal of Biomolecular Screening 2007，vol.12，p.240-247中针对胰岛素测定所描述的——简单来说，可以以期望的间隔收集血液样品，将血浆分离，立即冷冻并保持在-20℃下直至分析相应GLP-1激动剂(例如，GLP-1肽)的血浆浓度；将供体珠子用链霉亲和素包被，并将接受体珠子与识别肽的中间/C末端表位的单克隆抗体缀合；将对N末端具有特异性的另一种单克隆抗体进行生物素化；将三种反应物与分析物混合并形成双位点的免疫复合物；对复合物的照射使单线态氧原子从供体珠子上释放，该单线态氧原子被引导至接受体珠子中并触发可以在Envision酶标仪中测量的化学发光；光的量与化合物的浓度成比例。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂如GLP-1肽包含式(I)(SEQ ID NO 9)的氨基酸序列：
式(I)：Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19Xaa20GluXaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35--Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
其中
Xaa7为L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa8为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa16为Val或Leu；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa19为Tyr或Gln；
Xaa20为Leu或Met；
Xaa22为Gly、Glu或Aib；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa25为Ala或Val；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；
Xaa27为Glu或Leu；
Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa33为Val或Lys；
Xaa34为Lys、Glu、Asn或Arg；
Xaa35为Gly或Aib；
Xaa36为Arg、Gly或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或不存在；
Xaa38为Lys、Ser、酰胺或不存在；
Xaa39为Ser、Lys、酰胺或不存在；
Xaa40为Gly、酰胺或不存在；
Xaa41为Ala、酰胺或不存在；
Xaa42为Pro、酰胺或不存在；
Xaa43为Pro、酰胺或不存在；
Xaa44为Pro、酰胺或不存在；
Xaa45为Ser、酰胺或不存在；
Xaa46为酰胺或不存在；
条件是如果Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或Xaa46不存在，则每个下游氨基酸残基也不存在。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂如GLP-1肽包含式(II)(SEQ ID NO 10)的氨基酸序列：
式(II)：Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa3o-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37Xaa38
其中
Xaa7为L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基-组氨酸、-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；
Xaa8为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸或(1-氨基环辛基)羧酸；
Xaa18为Ser、Lys或Arg；
Xaa22为Gly、Glu或Aib；
Xaa23为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa26为Lys、Glu或Arg；Xaa30为Ala、Glu或Arg；
Xaa34为Lys、Glu或Arg；
Xaa35为Gly或Aib；
Xaa36为Arg或Lys；
Xaa37为Gly、Ala、Glu或Lys；
Xaa38为Lys、酰胺或不存在。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂如GLP-1肽为利拉鲁肽。利拉鲁肽是用于每日一次给药的单酰化GLP-1肽，其由Novo Nordisk A/S销售，并且在WO98/08871的实施例37中公开。
在一个实施方案中，本发明包括GLP-1激动剂(例如，GLP-1肽)的药学上可接受的盐。这样的盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化的铵盐。药学上可接受的酸加成盐还意欲包括本发明的GLP-1激动剂(例如，GLP-1肽)能够形成的水合物。
在一个实施方案中，GLP-1肽包含在位置8处的Aib残基。在一个实施方案中，如本文所用的术语“Aib”是指α-氨基异丁酸。
在一个实施方案中，所述GLP-1肽的位置7处的氨基酸残基选自D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂肽包含下式的氨基酸序列：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂包含经由亲水性间隔区与所述GLP-1肽的C末端氨基酸残基连接的白蛋白结合残基。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂包含与不是C末端氨基酸残基的氨基酸残基连接的第二白蛋白结合残基。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂(例如，GLP-1肽)选自利拉鲁肽和司美鲁肽(semaglutide)。
利拉鲁肽是用于每日一次给药的单酰化GLP-1激动剂，其由Novo Nordisk A/S自2009年起销售，在WO 98/08871的实施例37中公开。
在一个实施方案中，GLP-1肽为司美鲁肽。WO 06/097537公开了司美鲁肽(实施例4)，它是一种用于每周一次给药的单酰化GLP-1激动剂。在一个实施方案中，GLP-1肽具有结构His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg。
在一个实施方案中，GLP-1肽包含Arg34GLP-1(7-37)或[Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂包含IgG的Fc片段。在一个实施方案中，GLP-1激动剂包含IgG的Fc片段以及一个或多个、例如两个GLP-1肽。
在一个实施方案中，GLP-1激动剂选自阿比鲁肽和度拉鲁肽(dulaglitide)。
在一个实施方案中，GLP-1肽具有以下结构：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg。
在一个实施方案中，GLP-1肽具有以下结构：与人白蛋白重组融合的(His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg)2。
在一个实施方案中，GLP-1肽为度拉鲁肽。
在一个实施方案中，配制GLP-1激动剂以使其在人体中具有至少48小时的半衰期。这可以通过本领域已知的持续释放制剂获得。
在又一个实施方案中，GLP-1激动剂为毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3，毒蜥外泌肽-4或毒蜥外泌肽-3类似物，或任何这些的衍生物。
在一个实施方案中，GLP-1肽选自艾塞那肽、阿比鲁肽和度拉鲁肽。
在一个实施方案中，GLP-1肽为艾塞那肽。在一个实施方案中，GLP-1肽包含下式的氨基酸序列：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。艾塞那肽是在钝尾毒蜥(Gila monster)唾液中发现的一种激素——毒蜥外泌肽-4的合成形式。艾塞那肽展现出与GLP-1相似的生物学性质。在一些实施方案中，组合物为
Figure BDA0001146744480000281
(含艾塞那肽的PLGA颗粒的长效释放配方)。在一个实施方案中，“
Figure BDA0001146744480000282
组合物”是指包含艾塞那肽、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)和蔗糖的粉末，其在临注射前，在包含羧甲基纤维素钠、氯化钠、聚山梨酯20、磷酸二氢钠(例如其一水合物)、磷酸氢二钠(例如其七水合物)和注射用水的溶剂中重建。
在一个实施方案中，GLP-1肽具有结构：与人白蛋白遗传融合的(His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg)2。阿比鲁肽是一种重组的人血清白蛋白(HSA)-GLP-1杂合蛋白，像是与HSA融合的GLP-1二聚体。组成GLP-1肽是其中位置8处的Ala已被Glu置换的类似物。
在一个实施方案中，GLP-1肽为度拉鲁肽。度拉鲁肽是一种GLP-1-Fc构建体(GLP-1-接头-来自IgG4的Fc)。
药物组合物
药物组合物的制备是本领域已知的。为方便起见，参考Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第19版，1995。
根据本发明的制剂可包含缓冲液体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，该药物制剂为水性制剂，即包含水的制剂。这样的制剂通常是溶液或悬浮液。在本发明的进一步实施方案中，该药物制剂为水溶液。术语“水性制剂”被定义为包含至少50％w/w水的制剂。类似地，术语“水溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施方案中，所述药物制剂为无需任何预先溶解即可备用的干燥制剂(例如，冷冻干燥的或喷雾干燥的)。
在一个实施方案中，所述缓冲液可选自乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、磷酸盐、磷酸氢盐和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、琥珀酸盐、天冬氨酸、天冬酰胺或其混合物。
在一个实施方案中，所述组合物的pH在5-10，如6-9、6-8、5-7、7-9或如5.5-7.5的范围内。
在本发明的进一步实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。
在本发明的进一步实施方案中，所述防腐剂选自苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苄醇、氯丁醇、氯甲酚、苄索氯铵或其混合物。防腐剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明的进一步实施方案中，所述制剂进一步包含等渗剂。该等渗剂可选自盐(例如氯化钠)，糖如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖(包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐)，或糖醇如氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)，醛醇(例如甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)，或其混合物。糖醇包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿糖醇。
等渗剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明的进一步实施方案中，所述制剂进一步包含螯合剂。在本发明的进一步实施方案中，该螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸、EGTA的盐，及其混合物。
在本发明的进一步实施方案中，所述制剂进一步包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington：The Science and Practiceof Pharmacy，第19版，1995。
本发明的药物组合物可进一步包含一定量的氨基酸碱，该量足以减少该组合物储存期间多肽或蛋白质的聚集体形成。“氨基酸碱”意指氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定的氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。该氨基酸可以是精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸、乙硫氨酸和丁硫氨酸以及S-甲基-L半胱氨酸。
在本发明的进一步实施方案中，所述制剂进一步包含选自高分子量聚合物或低分子量化合物的稳定剂。在本发明的进一步实施方案中，该稳定剂选自聚乙二醇(例如，PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羟基纤维素或其衍生物(例如，HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇，以及不同的盐(例如氯化钠)。
在本发明的进一步实施方案中，所述制剂进一步包含表面活性剂。典型的表面活性剂(其中商品名的例子在方括号[]中给出)为聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯[吐温20]、聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯[吐温40]或聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯[吐温80]、泊洛沙姆如聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物[Pluronic F68/泊洛沙姆188]、聚乙二醇辛基苯基醚[Triton X-100]或聚氧乙二醇十二烷基醚[Brij 35]。表面活性剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在特定的实施方案中，利拉鲁肽可以以包含5-10.0mg/ml利拉鲁肽、1-2mg/ml磷酸二钠二水合物、10-20mg/ml丙二醇和2-8mg/ml苯酚的水溶液施用。
在特定的实施方案中，利拉鲁肽可以以由6.0mg/ml利拉鲁肽、1.42mg/ml磷酸二钠二水合物、14.0mg/ml丙二醇、5.5mg/ml苯酚以及用于将pH调节至8.15的NaOH和/或HCl组成的水溶液施用。
在一个实施方案中，本发明提供包含GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)和IL-21功能抑制剂的组合物。GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)和IL-21功能抑制剂可包含在单个组合物或不同的组合物中。在一个实施方案中，GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂以不同的组合物提供。在一个实施方案中，本发明提供了包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂一起配制的一种或多种本发明IL-21功能抑制剂和/或GLP-1激动剂(如GLP-1肽)的药物组合物。在一个实施方案中，将根据本发明使用的组合物单独地配制成分别包含适合于GLP-激动剂和IL-21抑制剂的不同缓冲液和赋形剂。
在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含抗体的水溶液和缓冲液，其中该抗体以1mg/ml或以上(例如1-200、1-100、50-200、50-150、50-100、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200mg/ml)的浓度存在，并且其中所述组合物具有从约6.0至约8.0的pH，例如约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7，9或8.0。
在一个实施方案中，所述抗体制剂包含组氨酸、蔗糖、精氨酸、聚山梨酯和氯化钠。高浓度抗体制剂的实例是本领域已知的并且在例如WO 2011/104381中描述。
在一个实施方案中，配制GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)以使其在人体中具有至少48小时的半衰期。这可以通过本领域已知的持续释放组合物获得。
给药模式
根据本发明的药物组合物的给药可通过若干种给药途径，例如，舌部给药、舌下给药、颊部给药、口中给药、口服给药、胃肠中给药、鼻部给药、肺部给药，例如通过细支气管和肺泡或其组合、表皮给药、真皮给药、经皮给药、阴道给药、直肠给药、眼部给药，例如通过结膜，输尿管给药以及肠胃外给药来给予需要这样的治疗的患者。
药物组合物可在若干个部位处施用至需要这样的治疗的患者，例如，在局部部位例如皮肤和粘膜部位，在绕开吸收的部位例如在动脉、静脉、心脏中给药，以及在与吸收有关的部位例如在皮肤中、皮肤下、肌肉中或腹部中给药。
可借助于注射器，任选地笔式注射器，通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行肠胃外给药。或者，可借助于输液泵进行肠胃外给药。进一步的选项是可以为用于以鼻部或肺部喷雾的形式施用化合物的溶液或悬浮液的组合物。作为更进一步的选项，还可使含有本发明的[蛋白质]化合物的药物组合物适应于例如通过无针注射或从贴片(任选地离子电渗贴片)经皮给药，或经粘膜例如颊部给药。
本发明的GLP-1激动剂(如GLP-1肽)和IL-21功能抑制剂可单独或组合施用，例如各自以分开的剂量形式施用或以单剂量形式组合施用。
本发明的GLP-1激动剂(如GLP-1肽)和IL-21功能抑制剂可伴随地或顺序地施用。
在一个实施方案中，所述GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂与在本文定义的治疗中使用的其他治疗活性剂一起共施用。在一个实施方案中，所述其他治疗活性剂为胰岛素。
在一个实施方案中，本发明的GLP-1激动剂和/或IL-21功能抑制剂的给药途径可以是有效地将活性化合物转运至适当或期望的作用部位的任何途径，如肠胃外途径。
在一个实施方案中，包含本发明的GLP-1激动剂和/或IL-21功能抑制剂的药物或药物组合物可以肠胃外施用至有需要的患者。在一个实施方案中，可借助于注射器，任选地笔式注射器，通过皮下、肌肉内或静脉内注射进行肠胃外给药。
本发明的GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)和/或IL-21功能抑制剂可肠胃外施用，如静脉内施用，如肌肉内施用，如皮下施用。在一个实施方案中，该GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)和/或IL-21功能抑制剂通过肠胃外给药如皮下注射施用。在一个实施方案中，可借助于注射器，任选地笔式注射器，通过皮下、肌肉内或静脉内注射进行肠胃外给药。或者，可借助于输液泵进行肠胃外给药。进一步的选项是可以为用于以鼻部或肺部喷雾的形式施用GLP-1激动剂的粉末或液体的组合物。作为更进一步的选项，该GLP-1激动剂还可以经皮或经粘膜施用，例如，颊部施用。
或者，本发明的GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)和/或IL-21功能抑制剂可经由非肠胃外途径施用，如经口或局部施用。本发明的GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)和/或IL-21抑制剂可预防性地施用。本发明的GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)和/或IL-21抑制剂可治疗性地(按需)施用。
在一个实施方案中，皮下施用GLP-1激动剂。在一个实施方案中，静脉内或皮下施用IL-21抑制剂。
GLP-1激动剂和IL-21抑制剂的频率和剂量将取决于多个因素，特别是受试者中取决于给药途径的治疗剂半衰期和生物利用度。
已用于治疗2型糖尿病的GLP-1激动剂每日一次或两次施用。具有进一步延长的半衰期的GLP-1激动剂适合于每周一次给药。如果可能，只要半衰期和生物利用度支持，甚至更加不频繁的给药如每10天或每两星期(2周)都可以是合适的。根据关于GLP-1激动剂治疗的一般知识调整剂量方案。可以使用更低的起始剂量来减少副作用。
同样，根据在给定组合物中的治疗剂的半衰期和生物利用度，可以每日或每周施用IL-21抑制剂。在一个实施方案中，IL-21抑制剂如抗体分子具有延长的半衰期，因此给药较不频繁，如每月或至多每4周给药。在一个实施方案中，每年施用约6-10个剂量单位，如每4-8周(如每5-7周)一个剂量单位。在一个实施方案中，GLP-1肽每日施用而IL-21抑制剂每6周施用。
在一个实施方案中，如本文所用的，关于数字或间隔给出的具体值可被理解为该具体值或大约该具体值。
治疗和/或预防
1型糖尿病是一种进行性自身免疫疾病，其中身体产生胰岛素的能力随着胰腺的β细胞被破坏而逐渐降低。
1型糖尿病被认为是一种慢性病，其通常快速进展至胰岛素依赖性阶段，例如，患者需要外源胰岛素来使血糖保持得较低。1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus)(T1DM)或仅仅1型糖尿病(type 1 diabetes)(T1D)的临床诊断为：
●HbA1c≥6.5％，或
●空腹血浆葡萄糖≥7.0(126mg/dL)，或
●在葡萄糖负荷为在水中的75克无水葡萄糖的口服葡萄糖耐量试验期间，2小时血浆葡萄糖≥11.1mmol/dL(200mg/dL)，或者
●高血糖症的典型症状并且随机血浆葡萄糖≥11.1mm/L。
1型糖尿病的典型治疗是补充外源胰岛素，以便替代失去的胰岛素并由此获得血糖的控制。健康个体能够非常严格地调节血糖水平。即使使用现代的胰岛素产品，糖尿病患者仍难以获得类似地良好调控的血糖，并且仍存在低血糖和高血糖发作的风险。
本发明涉及新诊断的个体中的1型糖尿病的治疗和预防。在一个实施方案中，该个体具有至少0.2nmol/L的非空腹C-肽。在一个实施方案中，该个体具有至少0.2nmol/L的空腹C-肽。在一个实施方案中，已检测到该个体中一种或多种胰岛自身抗体的存在。
如上文所述，本发明涉及通过施用有效量的GLP-1激动剂如GLP-1肽和有效量的IL-21功能抑制剂治疗和/或预防1型糖尿病。在本案中，治疗和/或预防不一定指完全治愈或阻止1型糖尿病进展。本发明涉及最近诊断的1型糖尿病患者或具有发展为1型糖尿病的风险的个体的治疗。如上所述，1型糖尿病是一种进行性疾病，其中患者逐渐丧失产生足够胰岛素的能力。
多数1型糖尿病患者需要胰岛素治疗，而本文所述的方法允许遵循正常指南的伴随性胰岛素治疗，以便实现代谢控制。
在一个实施方案中，该治疗保持p细胞功能。在一个实施方案中，该治疗增强内源胰岛素分泌。
在一个实施方案中，从治疗开始起，β细胞功能保持至少一年，如至少两年。
可使用标准技术测量β细胞功能，例如产生胰岛素的能力。在一个实施方案中，该治疗增加空腹C-肽的浓度。
C-肽在胰岛素产生过程中释放。在健康个体中，C-肽的浓度为0.5至2.7纳克/毫升(ng/mL)。尽管1型糖尿病患者在诊断时产生一些胰岛素并因此产生相似量的C-肽，但该能力通常在相对较短的时期内丧失。
在患有T1DM的一些个体中，诊断后可能产生非常少量的胰岛素，持续延长的一段时间(＞10年)。
在一个实施方案中，从治疗开始起，C-肽浓度保持至少一年，如至少两年。
在一个实施方案中，可以响应于混合餐耐量试验(MMTT)测量产生胰岛素的能力。在一个这样的实施方案中，在该试验中测量C-肽的量，并与治疗前响应于该试验测得的C-肽的量相比较。参数可以是血液中C-肽的AUC0-2h、AUC0-4h或最大MMX。
在一个实施方案中，与标准治疗相比，非空腹C-肽分泌的减少是降低的。在一个实施方案中，与标准胰岛素治疗相比，非空腹C-肽分泌的减少(MMTT)是降低的，持续至少一年或例如两年。
在一个实施方案中，非空腹C-肽的水平从治疗开始起得到维持。在一个实施方案中，非空腹C-肽相对于基线(治疗开始)的减少为1年后至多10％，或例如1年后至多5％。
在一个实施方案中，该治疗改善了血糖控制。在一个实施方案中，根据本发明的治疗和/或预防使受试者的平均血糖降低。该治疗可帮助患者达成治疗目标。在一个实施方案中，患者达到了低于使用标准治疗通常获得的HbA1c。糖尿病患者的一般目标是保持HbA1c低于6.5％。在一个实施方案中，该治疗在治疗期内降低HbA1c。在一个实施方案中，该治疗在延长的一段时间内降低HbA1c。在一个实施方案中，更多患者获得低于6.5％的HbA1C(与标准治疗相比)。
在一个实施方案中，与治疗前的空腹血浆葡萄糖的测量值相比，该治疗改善了空腹血浆葡萄糖。在一个实施方案中，与使用标准胰岛素治疗达到的平均值相比，该治疗改善了空腹血浆葡萄糖。
在一个实施方案中，该治疗延长了受试者产生内源胰岛素的时间段。因此，该治疗因此可以使受试者需要(外源)胰岛素的时间点延后，并且/或者降低所需(外源)胰岛素的量。因此，该治疗可减缓β细胞破坏的进展并减低对外源胰岛素的依赖性。在一个实施方案中，该治疗降低对外源胰岛素的依赖性。
在一个实施方案中，根据本发明的治疗和/或预防允许受试者降低外源胰岛素例如胰岛素注射的量。
在一个实施方案中，该治疗降低空腹血浆葡萄糖。在一个实施方案中，该治疗减轻胰岛炎。
在一个实施方案中，在1-4周或1-6个月的时间框架内观察治疗。由于1型糖尿病被认为是一种进行性慢性疾病，因此所观察到的效果应该优选地维持长达一年或两年。在一个实施方案中，该治疗使β细胞功能保持6、12、18或24周。在一个实施方案中，该治疗使β细胞功能保持36、42、48或52周。
在一个实施方案中，大多数患者维持β细胞功能至少一年。在一个实施方案中，大多数患者维持β细胞功能至少两年。
在一个实施方案中，该治疗允许患者减少外源胰岛素的量，该减少是通过减少每日剂量(以经过三天的平均值计算的单位/kg)或每天施用的胰岛素注射的次数(三天平均值)。在一个实施方案中，该治疗使胰岛素需求降低6、12、18或24周。在一个实施方案中，该治疗使胰岛素需求降低36、42、48或52周。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗和/或预防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GLP-1激动剂和有效量的IL-21抑制剂。如上文所述，两种化合物可以分开施用，然而应当理解，GLP-1激动剂和L-21抑制剂的联合给药才是如本文所述对1型糖尿病治疗有效的。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗1型糖尿病的方法，其包括向有需要的受试者施用组合起来有效的一定量的GLP-1激动剂和一定量的IL-21功能抑制剂。
可根据GLP-1和IL-21抑制剂的身份调整确切剂量。可根据产品的半衰期调整剂量和剂量频率。
对于GLP-1肽衍生物，如利拉鲁肽，每剂量单位施用0.01-100mg如0.1-1.8mg的剂量。在一个实施方案中，每剂量单位施用0.5mg至2mg。通常施用一个每日剂量。对于半衰期延长的GLP-1激动剂(包括GLP-1肽)，给药可以为每周两次或一次。如果生物利用度扩大，甚至可以预见每月给药一次。
对于抗体IL-21抑制剂，每单位剂量施用5-20mg/kg的剂量。在一个实施方案中，施用10-15mg/kg。与GLP-1激动剂相比，抗体产品的施用通常不那么频繁，例如至多每周一次。在一个实施方案中，抗体IL-21抑制剂每4-10周施用，如每4-8周，如每6周施用。在一个实施方案中，每6周施用12mg/kg的抗-IL-21抗体。
虽然本文描述和示出了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现将想到许多修改、替换、改变和等同物。因此，应当理解，本申请旨在涵盖落在本发明的真正精神内的所有这类修改和变化。所附的实施方案和权利要求不应被解释为限制本发明。
本发明的实施方案
1.GLP-1激动剂如GLP-1肽以及IL-21功能抑制剂用于治疗和/或预防1型糖尿病的用途。
2.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述抑制剂中和IL-21功能。
3.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂是能够特异性结合IL-21的抗体。
4.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂为抗-IL-21抗体。
5.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与受体竞争结合IL-21，其中所述受体选自由IL-21Rα和γC组成的列表。
6.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与IL-21Rα竞争结合IL-21。
7.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与人IL-21的螺旋1和3结合。
8.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与IL-21上的不连续表位结合，其中所述表位包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸I37至Y52和N92至P108。
9.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂包含如SEQID NO 2中所示的三个CDR序列以及如SEQ ID NO 3中所示的三个CDR序列。
10.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂是与γC竞争结合IL-21的抗-IL-21抗体。
11.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与人IL-21的螺旋2和4结合。
12.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150和His 151的表位结合。
13.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂包含如SEQ ID NO 4中所示的三个CDR序列以及如SEQ ID NO 5中所示的三个CDR序列。
14.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂以107M-1或更高、108M-1或更高、109M-1或更高、1010 M-1或更高、1011M-1或更高或者1012M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
15.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述GLP-1肽为利拉鲁肽。
16.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂伴随地或顺序地施用。
17.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述GLP-1激动剂每日施用而所述IL-21抑制剂每6周施用。
18.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至近期诊断出1型糖尿病的受试者。
19.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至具有至少0.2nmol/L的非空腹C-肽的受试者。
20.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至具有发展为1型糖尿病的风险的受试者，如具有胰岛自身抗体的受试者或没有胰岛自身抗体但在遗传上存在风险的受试者。
21.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中从治疗开始起，β-细胞功能保持至少一年。
22.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中与标准胰岛素治疗相比，平均每日胰岛素需求降低。
23.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中每个剂量单位施用0.01-100mg，如0.1-1.8mg的GLP-1激动剂，如GLP-1肽。
24.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被包含在任选地含有一种或多种额外赋形剂的组合物中。
25.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被任选地含有一种或多种额外赋形剂的单独药物组合物所包含。
26.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述组合物为水性组合物或冷冻干燥组合物的形式。
27.根据上述实施方案中任一项所述的用途，其中所述组合物具有在5-10如6-8范围内的pH。
28.一种用于治疗和/或预防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用GLP-1激动剂如GLP-1肽，以及IL-21功能抑制剂。
29.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述抑制剂中和IL-21功能。
30.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂是能够特异性结合IL-21的抗体。
31.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂为抗-IL-21抗体。
32.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂与受体竞争结合IL-21，其中所述受体选自由IL-21Rα和γC组成的列表。
33.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂与IL-21Rα竞争结合IL-21。
34.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂与人IL-21的螺旋1和3结合。
35.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂与IL-21上的不连续表位结合，其中所述表位包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸I37至Y52和N92至P108。
36.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂包含如SEQ ID NO 2中所示的三个CDR序列以及如SEQ ID NO 3中所示的三个CDR序列。
37.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂是与γC竞争结合IL-21的抗-IL-21抗体。
38.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂与人IL-21的螺旋2和4结合。
39.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂与包含如SEQ ID NO1中所示的氨基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150和His 151的表位结合。
40.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂包含如SEQ ID NO 4中所示的三个CDR序列以及如SEQ ID NO 5中所示的三个CDR序列。
41.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述IL-21功能抑制剂以107M-1或更高、108M-1或更高、109M-1或更高、1010M-1或更高、1011M-1或更高或者1012M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
42.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述GLP-1激动剂为利拉鲁肽。
43.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂伴随地或顺序地施用。
44.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述GLP-1激动剂每日施用而所述IL-21抑制剂每6周施用。
45.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至近期诊断出1型糖尿病的受试者。
46.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至具有至少0.2nmol/L的非空腹C-肽浓度的受试者。
47.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至具有发展为1型糖尿病的风险的受试者，如具有胰岛自身抗体的受试者或没有胰岛自身抗体但在遗传上存在风险的受试者。
48.根据上述实施方案中任一项所述的用于治疗和/或预防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂。
49.根据上述实施方案中任一项所述的用于治疗和/或预防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中与标准治疗相比，非空腹C-肽分泌的减少是降低的。根据上述实施方案中任一项所述的用于治疗和/或预防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中从治疗开始起，β细胞功能保持至少一年。
50.根据上述实施方案中任一项所述的用于治疗和/或预防1型糖尿病的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中与标准胰岛素治疗相比，平均每日胰岛素需求降低。
51.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中每个剂量单位施用0.01-100mg，如0.1-1.8mg的GLP-1激动剂，如GLP-1肽。
52.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被任选地含有一种或多种额外赋形剂的单独药物组合物所包含。
53.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物为水性组合物或冷冻干燥组合物的形式。
54.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述组合物具有在5-10如6-8范围内的pH。
55.在用于治疗和/或预防1型糖尿病的一种或多种药物的制备中使用的GLP-1激动剂如GLP-1肽，以及IL-21功能抑制剂。
56.在治疗和/或预防1型糖尿病的方法中使用的GLP-1激动剂如GLP-1肽，以及IL-21功能抑制剂。
57.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述抑制剂中和IL-21功能。
58.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂是能够特异性结合IL-21的抗体。
59.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂为抗-IL-21抗体。
60.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂与受体竞争结合IL-21，其中所述受体选自由IL-21Rα和γC组成的列表。
61.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂与IL-21Rα竞争结合IL-21。
62.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂与人IL-21的螺旋1和3结合。
63.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂与IL-21上的不连续表位结合，其中所述表位包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸I37至Y52和N92至P108。
64.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂包含如SEQ ID NO 2中所示的三个CDR序列以及如SEQ ID NO 3中所示的三个CDR序列。
65.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂是与γC竞争结合IL-21的抗-IL-21抗体。
66.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂与人IL-21的螺旋2和4结合。
67.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂与包含如SEQ ID NO1中所示的氨基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150和His 151的表位结合。
68.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂包含如SEQ ID NO 4中所示的三个CDR序列以及如SEQ ID NO 5中所示的三个CDR序列。
69.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述IL-21功能抑制剂以107M-1或更高、108M-1或更高、109M-1或更高、1010M-1或更高、1011M-1或更高或者1012M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
70.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述GLP-1激动剂为利拉鲁肽。
71.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂伴随地或顺序地施用。
72.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述GLP-1激动剂每日施用而所述IL-21抑制剂每6周施用。
73.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至近期诊断出1型糖尿病的受试者。
74.根据上述实施方案中任一项所述的方法，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至具有至少0.2nmol/L的非空腹C-肽浓度的受试者。
75.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被施用至具有发展为1型糖尿病的风险的受试者，如具有胰岛自身抗体的受试者或没有胰岛自身抗体但在遗传上存在风险的受试者。
76.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中从治疗开始起，β细胞功能保持至少一年。
77.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中与标准胰岛素治疗相比，平均每日胰岛素需求降低。
78.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中每个剂量单位施用0.01-100mg，如0.1-1.8mg的GLP-1激动剂。
79.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被包含在任选地含有一种或多种额外赋形剂的组合物中。
80.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述GLP-1激动剂和所述IL-21功能抑制剂被任选地含有一种或多种额外赋形剂的单独药物组合物所包含。
81.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂和IL-21功能抑制剂，其中所述组合物为水性组合物或冷冻干燥组合物的形式。
82.根据上述实施方案中任一项所述的GLP-1激动剂如GLP-1肽以及IL-21功能抑制剂，其中所述组合物具有在5-10如6-8范围内的pH。
实施例
材料与方法
GLP-1肽利拉鲁肽是可商购获得的，并且可以如WO98/08871的实施例37所述生产。例如，可通过用人IL-21或小鼠IL-21免疫，如WO2010/055366的实施例1所述生产抗-IL-21抗体，并且如其中的后续实施例所述表征中和活性。
试验(I)：GLP-1激动剂如GLP-1肽的体外效力
该实施例的目的在于在体外测试GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)的活性或效力。GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)的效力可如下确定，即，作为在含有表达人GLP-1受体的膜的培养基中形成环AMP(cAMP)的刺激。
原理；用所讨论的GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)刺激来自稳定的转染细胞系BHK467-12A(tk-ts13)、表达人GLP-1受体的纯化的质膜，并使用来自Perkin Elmer LifeSciences的AlphaScreenTM cAMP测定试剂盒测量cAMP产生的效力。AlphaScreen测定的基本原理是内源cAMP与外源添加的生物素-cAMP之间的竞争。通过使用缀合至接受体珠子的特异性抗体实现cAMP的捕获。
细胞培养和膜的制备；选择稳定的转染细胞系和高表达的克隆以供筛选。细胞在5％CO2下于DMEM、5％FCS、1％Pen/Strep(青霉素/链霉素)和0.5mg/ml选择性标记G418中生长。将约80％汇合度的细胞用PBS洗涤2次并用维尔烯(Versene)(乙二胺四乙酸四钠盐的水溶液)收获，在1000rpm下离心5min并去除上清液。其他步骤全部在冰上进行。用Ultrathurax将细胞沉淀物在10ml缓冲液1(20mM Na-HEPES，10mM EDTA，pH＝7.4)中匀浆化20-30秒，在20,000rpm下离心15min，并将沉淀物在10ml缓冲液2(20mM Na-HEPES，0.1mMEDTA，pH＝7.4)中重悬。将悬浮液匀浆化20-30秒并在20,000rpm下离心15min。将在缓冲液2中的悬浮、匀浆化和离心重复一次，并将膜在缓冲液2中重悬。确定蛋白质浓度，并将膜储存在-80℃下直至使用。在平底的1/2区域96孔板(例如Costar目录号：3693)中进行测定。每孔的最终体积为50μl。
溶液和试剂；示例性的溶液和试剂在下文给出。
来自Perkin Elmer Life Sciences的AlphaScreenTM cAMP测定试剂盒(目录号：6760625M)；含有抗cAMP接受体珠子(10U/μl)，链霉亲和素供体珠子(10U/μl)和生物素化的cAMP(133U/μl)。
AlphaScreen缓冲液，pH＝7.4：50mM TRIS-HCl(Sigma，目录号：T3253)；5mM HEPES(Sigma，目录号：H3375)；10mM MgCl2，6H2O(Merck，目录号：5833)；150mM NaCl(Sigma，目录号：S9625)；0.01％吐温(Merck，目录号：822184)。在使用前，将以下试剂添加至AlphaScreen缓冲液(示出了最终浓度)：BSA(Sigma，目录号A7906)：0.1％；IBMX(Sigma，目录号I5879)：0.5mM；ATP(Sigma，目录号A7699)：1mM；GTP(Sigma，目录号G8877)：1μM。
cAMP标准物(测定中的稀释倍数＝5)：cAMP溶液：5μL的5mM cAMP储备液+495μLAlphaScreen缓冲液。
制备了cAMP标准物以及待测GLP-1激动剂如GLP-1肽在AlphaScreen缓冲液中的合适的稀释系列，例如，如下八个浓度的GLP-1激动剂如GLP-1肽：10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13和10-14M，以及cAMP的从例如10-6至3x10-11的系列。
膜/接受体珠子；使用hGLP-1/BHK 467-12A膜；6μg/孔，对应于0.6mg/ml(每个孔所用的膜的量可能变化)。“无膜”：在AlphaScreen缓冲液中的接受体珠子(最终15μg/ml)。“6μg/孔的膜”：膜+在AlphaScreen缓冲液中的接受体珠子(最终15μg/ml)。将10μl“无膜”添加至cAMP标准物(每个孔，一式两份)以及阳性和阴性对照。将10μl“6μg/孔的膜”添加至GLP-1和GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)(每孔，一式两份/一式三份)。阳性对照：10μl“无膜”+10μlAlphaScreen缓冲液。阴性对照：10μl“无膜”+10μl cAMP储备溶液(50μM)。由于珠子对直射光是敏感的，因此任何处理均在暗处(尽可能暗)或绿光中进行。所有稀释都在冰上进行。
程序；1)制备AlphaScreen缓冲液。2)将GLP-1激动剂/cAMP标准物(例如GLP-1肽/cAMP标准物)在AlphaScreen缓冲液中溶解并稀释。3)制备供体珠子溶液并在室温下温育30min。4)向平板上添加cAMP/GLP-1激动剂(例如cAMP/GLP-1肽)：每孔10μl。5)制备膜/接受体珠子溶液并将其添加至平板：每孔10μl。6)添加供体珠子：每孔30μl。7)将平板包裹在铝箔中并在室温下(非常缓慢地)在摇床上温育3小时。8)在AlphaScreen上计数-计数前将每个平板在AlphaScreen中预温育3分钟。可使用Graph-Pad Prism软件(第5版)计算EC50[pM]值。如需要，可将关于GLP-1的倍数变化计算为EC50(GLP-1)/EC50(类似物)-3693.2。
试验(II)：GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)在小型猪中的半衰期
该研究的目的在于确定在向小型猪静脉内给药后，GLP-1激动剂(例如GLP-1肽)的体内延长作用，即其作用时间的延长。这在药代动力学(PK)研究中完成，其中确定了所讨论的GLP-1激动剂如GLP-1肽的终末半衰期。终末半衰期通常是指在初始分布阶段后测量的、达到某个血浆浓度的一半所花费的时间。
本研究使用的雄性哥延根
Figure BDA0001146744480000471
小型猪从Ellegaard
Figure BDA0001146744480000472
Minipigs(Dalmose，Denmark)获得，年龄约7-14个月并且重量约16-35kg。将小型猪单独圈养，并严格地每日喂食SDS小型猪饮食(Special Diets Services，Essex，UK)一次或两次。在至少2周的适应后，将两条永久性中央静脉导管植入每只动物的尾侧腔静脉或颅侧腔静脉中。使动物在手术后恢复1周，然后用于反复的药代动力学研究，在给药之间具有适当的洗脱期。
使动物在给药前禁食约18h并且在给药后禁食至少4h，但整个时期内其随意获取水。
将GLP-1激动剂如GLP-1肽溶解在pH 7.4的50mM磷酸钠、145mM氯化钠、0.05％吐温80中，达到通常为20-60nmol/ml的浓度。通过一条导管给予该化合物的静脉内注射(体积通常对应于1-2nmol/kg，例如0.033ml/kg)，并在预定的时间点对血液进行取样，直到给药后13天(优选地通过另一条导管)。将血液样品(例如0.8ml)收集在EDTA缓冲液(8mM)中，然后在4℃和1942G下离心10分钟。将血浆移取至干冰上的Micronic管中，并在-20℃下保存，直到使用ELISA或类似的基于抗体的测定或LC-MS分析相应GLP-1化合物的血浆浓度。通过WinNonlin v.5.0(Pharsight Inc.，Mountain View，CA，USA)中的非房室模型分析单独的血浆浓度-时间谱，并确定所得到的终末半衰期(调和平均值)。
试验(III)：IL-21介导的STAT-3磷酸化的抑制
可使用STAT3的磷酸化作为读出，在基于细胞的试验中测量抗-IL-21抗体中和IL-21的能力。使用了用IL-21受体(IL-21R)转染的BaF3细胞，并且当IL-21诱导STAT3磷酸化时，其被抗-IL-21抗体的降低反映了IL-21中和活性。
通过测量BaF3/KZ134/hIL-21R细胞中配体-受体相互作用后的STAT3磷酸化水平，来确定在含有抗体的上清液的存在下鼠IL-21活性的降低。
根据磷酸化的STAT3水平相对于与单独配体一起温育的对照细胞的降低百分比来确定相对中和活性。将Baf3/KZ134/hIL-21R细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在96孔圆底组织培养板中。将鼠IL-21与来自每个测试孔的上清液一起预温育，之后转移至接种的细胞。根据制造商的说明(BIO-RAD Laboratories)停止反应并将细胞裂解。收集上清液，将其与测定缓冲液混合并储存。根据制造商的说明(BIO-RAD Laboratories)，将捕获珠子(BIO-PLEX Phospho-STAT3 Assay，BIO-RAD Laboratories)接种在96孔过滤板中并与细胞裂解物样品混合并温育。添加检测抗体(BIORAD laboratories)和链霉亲和素-PE，并将反应在重悬缓冲液(BIORAD laboratories)中重悬。根据制造商的说明，在阵列读取仪(BIO-PLEX，BIO-RAD Laboratories)上确定磷酸化STAT3的水平。裂解物中磷酸化STAT3转录因子水平的增加表明小鼠IL-21受体-配体相互作用。对于中和试验，磷酸化STAT3转录因子水平的降低表明mAb能够中和IL-21受体-配体相互作用。
试验(IV)：IL-21驱动的B细胞增殖的抑制。
作为功能性测试，测试了抗mIL-21中和mIL-21驱动的B细胞增殖的能力。可进行等同的试验来测试抗hIL-21抗体，如采用从健康人类志愿者中分离的PBMC的WO2013/164021实施例10。关于抑制B细胞成熟的能力的进一步信息可如WO2012/098113的实施例6和12中所述获得。
材料
板：U型底96孔板(Corning Costar#3894)
完全培养基：含有GlutaMAX的RPMI(目录号61870)、0.5mM丙酮酸钠、5ml非必需氨基酸(100x)、50μM2-ME、Pen/Strep和10％HI FBS。
纯化的抗CD40：BD#553787：
纯化的抗-IgM：Jackson#115-006-020
CD45R(B220)微珠：Miltenyi Biotec 130-049-501
3H-胸苷：Amersham，TRK-565。
测试和对照材料
小鼠抗-mIL-21mAb，克隆397.18.2.1
重组小鼠IL-21(rmIL-21)
小鼠IgG1同种型(抗-TNP)
从6-8周龄的野生型C57BL/6小鼠收获脾脏，从该脾脏纯化小鼠B细胞。通过迫使该器官通过70μm细胞滤器进入PBS而制备单细胞的脾细胞。根据制造商的方案，使用磁珠和AutoMACS细胞分离器(Miltenyi Biotec)，通过经由磁珠的抗-B220阳性选择来纯化B细胞。
用以下物质在体外刺激细胞：a)可溶性抗-IgM(1μg/mL)，b)可溶性抗-CD40(1μg/mL)，和c)mIL-21(25、50、100ng/mL)。在96孔板中每孔添加105个纯化的B细胞，并在抗-IL-21抗体或同种型对照抗体的存在下，在37℃下用可溶性IgM(1μg/mL)、可溶性抗-CD40IgM(1μg/mL)和rmIL-21(100ng/mL)刺激72h。对于温育的最后18h，向每个孔中添加3H-胸苷，并在Top Counter液体闪烁仪(Perkin Elmer)上测量胸苷掺入(增殖)。
结果表明，抗-mIL-21抗体能够以依赖于浓度的方式抑制B细胞增殖。
试验(V)：在NOD模型中血糖效应的确定
该实验的目的在于确定GLP-1激动剂如GLP-1肽和/或IL-21功能抑制剂的施用对血糖的影响。
使用近期发作的NOD小鼠模型。每周筛选小鼠两次，并将糖尿病发作定义为连续2个血糖值＞250mg/dL。小鼠从11周龄开始加入该实验，并且持续加入直到26周龄。给药是基于体重的。
通过将血糖仪(Bayer Contour USB)与相应的血糖试纸一起使用来测量血糖。连续两天血糖水平＞250mg/dL的小鼠被认为是患糖尿病的。当第一次观察到高血糖时，次日再次测量血糖。如果该测量值再次＞250mg/dL，则将动物记录为患糖尿病的，加入处理组，并进一步监测直到其达到连续两个读数＞600mg/dL。此时将该小鼠处死。如果如通过体重和/或总体表现确定的，小鼠的总体状况正在恶化，则还在其达到血糖值＞600mg/dL之前将其处死。如果第二个测量值没有确认糖尿病的发作(即，＜250mg/dL)，则留下该动物直到下一次常规测量，并且重复上述程序。
实施例1-NOD模型中利拉鲁肽与抗-IL-21的组合
该实验的目的在于确定抗-IL-21抗体与利拉鲁肽的组合对血糖的影响。测试了短疗程的小鼠替代抗-IL-21抗体与每日利拉鲁肽给药组合是否可以逆转高血糖症。通过皮下注射在佐剂混合物中的重组小鼠IL-21来免疫6至8周龄的BALB/c小鼠，由此制备小鼠替代抗-IL-21抗体。重组小鼠IL-21可商购获得，并具有序列MHKSSPQGPD RLLIRLRHLIDIVEQLKIYE NDLDPELLSA PQDVKGHCEH AAFACFQKAK LKPSNPGNNK TFTIDLVAQL RRRLPARRGGKKQKHIAKCP SCDSYEKRTP KEFLERLKWL LQKMIHQHLS(SEQ ID No 13)。首先，使用标准捕获型ELISA测定选择结合mIL-21的抗体克隆，随后选择如通过上述STAT3磷酸化试验所确定的具有强中和活性的克隆。
如本文试验(V)中所述进行实验，其中实验细节如下：以下为处理组：(1)未治疗的；(2)抗-IL-2125mg/kg，5次给药；(3)利拉鲁肽，每日1mg/kg持续5周；以及(4)抗-IL-2125mg/kg，5次给药+利拉鲁肽，每日1mg/kg持续5周。在包含小鼠后立即开始，即从第0天开始，每周两次腹膜内施用抗-IL-21，5次。利拉鲁肽以其销售的组合物形式皮下施用，从第0天的0.3mg/kg、第1天的0.6mg/kg到随后第2天及之后的1mg/kg缓慢升高。利拉鲁肽治疗在糖尿病发作后0-35天进行；额外监测血糖35天，每周两次。小鼠替代抗-IL-21是一种mIgG1/κ同种型，其具有以下VL氨基酸序列：MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQTVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMH
WYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQ
QWNSNPPTFGGGTKLEMK，和以下VH氨基酸序列：MNFGPSLIFLVLILKGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFNRYSMSW
VRQSPEKRLEWVAEISVGGSYTQYVDIVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDT
AMYYCARLYYSGSGDSYYYAMDYWGQGTSVTVSS。抗-IL-21的储备浓度为在pH＝7.4的20mM磷酸盐、150mM NaCl中的11mg/ml；内毒素水平＜0.01EU/mg且纯度＞95％，并且长期储存在-80℃下进行。使用前，将抗-IL-21在缓冲液(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH＝7.4)中稀释。用于注射至动物中的抗-IL-21的等份只解冻一次。结果在表1和图1-2中示出。
表1.在NOD模型中施用利拉鲁肽和/或抗-IL-21后的平均血糖(mg/dL)+/-SD(标准偏差)(发作时每组N＝10只。在实验的进程中，一些动物由于高血糖值(高于600mg/dL)和/或较差的总体健康而从研究中移除并施以安乐死。剩余的n在表中示出)。所示的时间段经过利拉鲁肽治疗期(糖尿病发作后的第0-35天)和额外35天的监测。葡萄糖计的检测极限为600mg/dL。
Figure BDA0001146744480000521
*)利拉鲁肽仅在糖尿病发作后0-35天施用。
结果进一步由图1和图2说明，图1和图2清楚地显示出组1或组2中没有动物在70天期间存活下来。相反，在处理组3和4中被移除的小鼠的数目少得多，其中联合治疗最有效，只有一只小鼠在70天期间从研究中被移除。
来自该实验的数据显示，采用抗-IL-21的单一治疗剂治疗能够逆转一些小鼠中的高血糖症。利拉鲁肽单药疗法与之前的实验和文献一致，不影响向终末高血糖症的进展，尽管在给药的前几天记录到血糖值的显著却短暂的下降。只有在两种治疗(即抗-IL-21和利拉鲁肽)联合时，几乎全部动物才经历持久的血糖水平正常化。有趣的是，许多经治疗的动物在停用利拉鲁肽后保持正常血糖，提示功能性β-细胞群的扩充和/或恢复。
实施例2-NOD模型中利拉鲁肽与抗-IL-21的组合-补充数据
分别向处理组1至4中加入9、8、8和8个受试者来继续如实施例1所述的小鼠的加入。新受试者的平均血糖测量值被包含在表2中，而完整数据集的平均血糖测量值被包含在表3中。
与上述受试者不同，这些数据包含3只仅仅是暂时性糖尿病的未治疗小鼠(低BGV持续到第70天)。这是不常见的，但已观察到以一定的频率出现，特别是如果小鼠在糖尿病发作时相对较老。单独用抗-IL-21治疗的小鼠的平均BGV受到三只“已治愈”小鼠(具有低BGV)移除的影响，因此剩余小鼠的平均BGV高于仍包含所有小鼠时将会得到的结果。
表2(额外的小鼠)
Figure BDA0001146744480000531
Figure BDA0001146744480000541
*利拉鲁肽仅在糖尿病发作后0-35天施用。
#在第35天从单独的抗-IL-21和利拉鲁肽+抗-IL-21组取走三只小鼠以获得组织学样品，因此n从5降至2和从8降至5并不反映由高BGV或较差的总体健康导致的小鼠的移除。
实施例3-NOD模型中利拉鲁肽与抗-IL-21的组合-来自实施例1和实施例2的数据的汇编
来自实施例1和实施例2的所有数据都已被汇编，以提供如下表中所示的四个处理组中总共19、18、18和18个受试者的数据。
Figure BDA0001146744480000542
如上所述，表3中包含平均BGV值。
实施例1和2的所有小鼠的平均BGV值在图3和图4中示出，再次表明，未治疗组和利拉鲁肽治疗组中存活小鼠的数目非常少，而相当多数目的采用单独的或与利拉鲁肽联合的抗-IL-21治疗的小鼠在整个70天的研究期内保持存活。同样，从这两组中移除三只动物导致该数据表示与实际效果不完全一致。
表3(全部小鼠)
Figure BDA0001146744480000551
*利拉鲁肽仅在糖尿病发作后0-35天施用。
#在第35天从单独的抗-IL-21和利拉鲁肽+抗-IL-21组中取出三只小鼠以获得组织学样品，因此n从5降至2和从8降至5并不反映由高BGV或较差的总体健康导致的小鼠的移除。
为评估该结果，平均BGV值必须与相对于在研究期间由于具有终末疾病而被移除的小鼠的数目而言参与并保留在该研究中的小鼠的数目相组合。这通过图5的Kaplan-Meyer图示出。上图(图5A)示出了仍患糖尿病的小鼠(例如BGV高于250的小鼠)的分数(百分比)，并且包括由于BGV高于600或较差的总体健康而从研究中移除的小鼠。不出所料，只有少数未经治疗的或利拉鲁肽治疗的小鼠在35天时期内自发地恢复。相反，用抗-IL-21治疗能够在一半的小鼠中逆转糖尿病(使BGV降低至250mg/mL以下)，并且与利拉鲁肽联合时，在代表治疗期的该研究的前35天期间，(18只中)只有2只小鼠仍患有糖尿病。
下图(图5B)示出了每个处理组的存活率，其被定义为相对于每组的n，整个期间(70天)都保留在研究中的小鼠数目。可以看到，抗-IL-21和联合治疗的n为15(而非18)，这解释了被移除以供组织学检查的3+3只小鼠。同样，联合治疗是有效的，因为15只小鼠中仅有2只由于终末高血糖或较差的总体健康而被处死。还注意到，到第70天时，未治疗的和利拉鲁肽治疗的动物中分别只有3只和0只未变成终末高血糖。
组织学检查：组织学分析在来自每个组的小鼠子集的胰腺组织上进行。将切片用苏木精和伊红(H&E)染色以评价胰岛炎，并用CD8和胰岛素或CD4和胰岛素进行免疫荧光染色以评价胰岛炎并同时表征浸润物内的细胞类型。未治疗的小鼠和利拉鲁肽治疗的小鼠保留有较少的可见胰岛(如在已变成终末高血糖(BGV＞600mg/dL)的小鼠中所预期的)。来自这些小鼠的胰腺表现出重度细胞浸润，而用单独的或与利拉鲁肽联合的抗-IL-21治疗的小鼠显示出降低的浸润程度。在用单独的或与利拉鲁肽联合的抗-IL-21治疗的存活小鼠中，胰岛炎减轻。
实施例4-NOD模型中利拉鲁肽与抗-IL-21的组合-确认研究
本研究使用如下表所示的处理组，如实施例1所述进行。
Figure BDA0001146744480000561
Figure BDA0001146744480000571
此处未包含详细数据，因为总体结果与较早的研究一致。
简要说明：抗-IL-21单药疗法在疾病发作后的前35天内成功地治愈了75％患有确定的高血糖症的小鼠，而单独的利拉鲁肽对糖尿病进展影响较小，其中60％的小鼠在利拉鲁肽治疗期结束前变成终末高血糖，而剩余的40％在之后很快变成终末高血糖。
然而，当抗-IL-21和利拉鲁肽联合施用时，此方案逆转了87％的经治疗小鼠中的确定的高血糖症，并且直到高血糖症发作后70天，与未治疗的小鼠和用单独利拉鲁肽治疗的小鼠相比，还导致了提高的存活率(对于联合疗法，80％存活；对于单独利拉鲁肽治疗和未治疗，0％存活)。与未治疗的和用单独利拉鲁肽治疗的小鼠相比，抗-IL-21单药疗法还提供了提高的存活率(75％)。
数据表明，与采用任一种药剂的单药疗法相比，抗-IL-21加上利拉鲁肽的联合疗法提供了增强的逆转确定的糖尿病的效力。即使在停用利拉鲁肽后，大多数小鼠的这种向正常血糖的恢复仍保持稳定。
Figure IDA0001146744520000011
Figure IDA0001146744520000021
Figure IDA0001146744520000031
Figure IDA0001146744520000041
Figure IDA0001146744520000051
Figure IDA0001146744520000061
Figure IDA0001146744520000071
Figure IDA0001146744520000081
Figure IDA0001146744520000091
Figure IDA0001146744520000101
Figure IDA0001146744520000111
Figure IDA0001146744520000121
Figure IDA0001146744520000131
Figure IDA0001146744520000141
Figure IDA0001146744520000151
Figure IDA0001146744520000161
Figure IDA0001146744520000171
Figure IDA0001146744520000181
Figure IDA0001146744520000191
Figure IDA0001146744520000201
Figure IDA0001146744520000211
Figure IDA0001146744520000221
Figure IDA0001146744520000231
Figure IDA0001146744520000241
Figure IDA0001146744520000251
Figure IDA0001146744520000261
Figure IDA0001146744520000271
Figure IDA0001146744520000281
Figure IDA0001146744520000291
Figure IDA0001146744520000301

Claims (62)

1.GLP-1受体激动剂以及IL-21功能抑制剂在制备用于治疗1型糖尿病的药物中的用途，其中所述GLP-1受体激动剂为与白蛋白结合部分共价连接的GLP-1肽，所述白蛋白结合部分包含脂肪酸或脂肪二酸，并且其中所述IL-21功能抑制剂是能够特异性结合IL-21的抗体，所述抗体与人IL-21的螺旋1和3结合或者与人IL-21的螺旋2和4结合。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与IL-21上的不连续表位结合，其中所述表位包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸I37至Y52和N92至P108。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与如SEQ ID No 1所示的IL-21的R34、R38、Q41中的至少一个以及K102和R105中的至少一个结合。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂的重链区包含如SEQ ID NO15所示的CDR1，如SEQ ID NO 16所示的CDR2以及如SEQ ID NO 17所示的CDR3，轻链区包含如SEQ ID NO 19所示的CDR1，如SEQ ID NO 20所示的CDR2以及如SEQ ID NO 21所示的CDR3。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂的重链区包含TYGMH的CDR1，如SEQ ID NO 16所示的CDR2以及如SEQ ID NO17所示的CDR3，轻链区包含如SEQ ID NO 19所示的CDR1，如SEQ ID NO 20所示的CDR2以及如SEQ ID NO 21所示的CDR3。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂与包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150和His 151的表位结合。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂的重链区包含：
SEQ ID NO 5所示 的氨基酸残基31-35的CDR1序列，
SEQ ID NO 5所示 的氨基酸残基50-66的CDR2序列，和
SEQ ID NO 5所示 的氨基酸残基99-109的CDR3序列，
轻链区包含：
SEQ ID NO 4所示 的氨基酸残基24-34的CDR1序列，
SEQ ID NO 4所示 的氨基酸残基50-56的CDR2序列，和
SEQ ID NO 4所示 的氨基酸残基89-97的CDR3序列。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂以107M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂以108M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂以109M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂以1010M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂以1011M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述IL-21功能抑制剂以1012M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述白蛋白结合部分经由GLP-1肽的Lys残基与GLP-1肽连接。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述Lys残基选自GLP-1(7-37)的残基23、26、34、36或38的Lys残基。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述GLP-1受体激动剂为利拉鲁肽。
17.根据权利要求1所述的用途，其中所述GLP-1受体激动剂和所述IL-21功能抑制剂伴随地或顺序地施用。
18.根据权利要求1所述的用途，其中所述GLP-1受体激动剂每日施用而所述IL-21抑制剂每6周施用。
19.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被施用至近期诊断出1型糖尿病的受试者。
20.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被施用至具有至少0.2nmol/L的非空腹C-肽的受试者。
21.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物被施用至具有发展为1型糖尿病的风险的受试者。
22.根据权利要求19-21任一项所述的用途，其中所述受试者是具有胰岛自身抗体的受试者或没有胰岛自身抗体但在遗传上存在风险的受试者。
23.根据权利要求19-21任一项所述的用途，其中从治疗开始起，受试者的β细胞功能保持至少一年。
24.根据权利要求19-21任一项所述的用途，其中与标准胰岛素治疗相比，受试者的平均每日胰岛素需求降低。
25.根据权利要求1所述的用途，其中每个剂量单位包含0.01-100mg的GLP-1受体激动剂。
26.根据权利要求1所述的用途，其中每个剂量单位包含0.1-1.8mg的GLP-1受体激动剂。
27.根据权利要求1所述的用途，其中所述GLP-1受体激动剂和所述IL-21功能抑制剂被包含在任选地含有一种或多种额外赋形剂的组合物中。
28.根据权利要求1所述的用途，其中所述GLP-1受体激动剂和所述IL-21功能抑制剂被任选地含有一种或多种额外赋形剂的单独药物组合物所包含。
29.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述组合物为水性组合物或冷冻干燥组合物的形式。
30.根据权利要求27或28所述的用途，其中所述组合物具有在5-10范围内的pH。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述组合物具有在6-8范围内的pH。
32.用于治疗1型糖尿病的药物组合物，其包含GLP-1受体激动剂以及IL-21功能抑制剂，其中所述GLP-1受体激动剂为与白蛋白结合部分共价连接的GLP-1肽，所述白蛋白结合部分包含脂肪酸或脂肪二酸，并且其中所述IL-21功能抑制剂是能够特异性结合IL-21的抗体，所述抗体与人IL-21的螺旋1和3结合或者与人IL-21的螺旋2和4结合。
33.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂与IL-21上的不连续表位结合，其中所述表位包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸I37至Y52和N92至P108。
34.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂与如SEQ ID No 1所示的IL-21的R34、R38、Q41中的至少一个以及K102和R105中的至少一个结合。
35.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂的重链区包含如SEQ IDNO 15所示的CDR1，如SEQ ID NO 16所示的CDR2以及如SEQ ID NO 17所示的CDR3，轻链区包含如SEQ ID NO 19所示的CDR1，如SEQ ID NO 20所示的CDR2以及如SEQ ID NO 21所示的CDR3。
36.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂的重链区包含TYGMH的CDR1，如SEQ ID NO 16所示的CDR2以及如SEQ ID NO 17所示的CDR3，轻链区包含如SEQ IDNO 19所示的CDR1，如SEQ ID NO 20所示的CDR2以及如SEQ ID NO 21所示的CDR3。
37.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂与包含如SEQ ID NO 1中所示的氨基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150和His 151的表位结合。
38.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂的重链区包含：
SEQ ID NO 5所示 的氨基酸残基31-35的CDR1序列，
SEQ ID NO 5所示 的氨基酸残基50-66的CDR2序列，和
SEQ ID NO 5所示 的氨基酸残基99-109的CDR3序列，
轻链区包含：
SEQ ID NO 4所示 的氨基酸残基24-34的CDR1序列，
SEQ ID NO 4所示 的氨基酸残基50-56的CDR2序列，和
SEQ ID NO 4所示 的氨基酸残基89-97的CDR3序列。
39.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂以107M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
40.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂以108M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
41.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂以109M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
42.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂以1010M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
43.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂以1011M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
44.根据权利要求32的药物组合物，其中所述IL-21功能抑制剂以1012M-1或更高的结合亲和力特异性结合IL-21。
45.根据权利要求32的药物组合物，其中所述白蛋白结合部分经由GLP-1肽的Lys残基与GLP-1肽连接。
46.根据权利要求45的药物组合物，其中所述Lys残基选自GLP-1(7-37)的残基23、26、34、36或38的Lys残基。
47.根据权利要求32的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂为利拉鲁肽。
48.根据权利要求32的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂和所述IL-21功能抑制剂伴随地或顺序地施用。
49.根据权利要求32的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂每日施用而所述IL-21抑制剂每6周施用。
50.根据权利要求32的药物组合物，其被施用至近期诊断出1型糖尿病的受试者。
51.根据权利要求32的药物组合物，其被施用至具有至少0.2nmol/L的非空腹C-肽浓度的受试者。
52.根据权利要求32的药物组合物，其被施用至具有发展为1型糖尿病的风险的受试者。
53.根据权利要求50-52任一项的药物组合物，其中所述受试者是具有胰岛自身抗体的受试者或没有胰岛自身抗体但在遗传上存在风险的受试者。
54.根据权利要求50-52任一项的药物组合物，其中从治疗开始起，受试者的β细胞功能保持至少一年。
55.根据权利要求50-52任一项的药物组合物，其中与标准胰岛素治疗相比，受试者的平均每日胰岛素需求降低。
56.根据权利要求32的药物组合物，其中每个剂量单位包含0.01-100mg的GLP-1受体激动剂。
57.根据权利要求32的药物组合物，其中每个剂量单位包含0.1-1.8mg的GLP-1受体激动剂。
58.根据权利要求32的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂和所述IL-21功能抑制剂被包含在任选地含有一种或多种额外赋形剂的组合物中。
59.根据权利要求32的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂和所述IL-21功能抑制剂被任选地含有一种或多种额外赋形剂的单独药物组合物所包含。
60.根据权利要求58或59的药物组合物，其中所述组合物为水性组合物或冷冻干燥组合物的形式。
61.根据权利要求58或59的药物组合物，其中所述组合物具有在5-10范围内的pH。
62.根据权利要求61的药物组合物，其中所述组合物具有在6-8范围内的pH。
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