TW201625289A - 使用ｇｌｐ－１及抗ｉｌ－２１治療糖尿病 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於GLP-1促效劑及抗IL-21抗體治療及/或預防1型糖尿病之用途。

Description

使用GLP-1及抗IL-21治療糖尿病
本發明係關於諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及抗IL-21抗體在1型糖尿病中之用途。
雖然外源性胰島素療法之發展已使得患有1型糖尿病之個體能夠充分控制其代謝紊亂，但仍然缺乏解決其根本病因之治療選擇。因此，需要改善之治療及用於預防1型糖尿病之選擇。
IL-21具有四螺旋束之結構(螺旋1-4/A-D，如例如以下中之圖1中所定義：J.Immunol.,2011年第186卷第2期，第708-721頁)，以I類細胞因子典型之上上下下之佈局排列。IL-21經由異二聚體受體複合物進行信號傳導，該異二聚體受體複合物由專用鏈IL-21R α(亦稱為IL-21R)及γ C/IL-2R γ/常見γ鏈組成，後者為IL-2、IL-4、IL-7、IL-9及IL-15所共享。γ C及IL-21R α結合於IL-21上之非重疊結合位點，IL-21R α結合於人類IL-21上之螺旋1+3，且γ C結合於螺旋2+4。IL-21R α以高親和性結合IL-21且提供大部分結合能量。然而，與γ C之相互作用為信號傳導所需要，且結合IL-21R α但無法與γ C恰當地相互作用的IL-21突變體為IL-21信號傳導之有效拮抗劑。IL-21對先天性與適應性免疫反應均發揮多效作用。其主要由活化之CD4+ T細胞、濾泡T細胞及自然殺傷細胞T細胞產生。 人類IL-21之胺基酸序列展示在SEQ ID NO 1中。歸因於IL-21在免疫系統刺激中之多重作用，已提出IL-21拮抗作為一種治療發炎的可能途徑。關於IL-21/IL-21R α結合之進一步細節描述於JBC,VOL.287，第12期，第9454-9460頁，2012年3月16日中，且示例性抗IL-21抗體描述於WO2010055366及WO2012098113中。
升糖素樣肽-1(GLP-1)為一種關於在葡萄糖代謝中之作用進行深入研究的肽。因為在成熟期間移除頭6個胺基酸殘基，所以人類GLP-1之活性形式稱為GLP-1(7-37)及GLP-1-(7-36)NH2。該肽非常短命，且為一種能夠刺激葡萄糖依賴性胰島素分泌及抑止升糖素分泌之有效抗高血糖激素。用於2型糖尿病治療之促進GLP-1作用的治療化合物包括利拉魯肽(liraglutide)、艾塞那肽(exenatide)、利司那肽(lixisenatide)、阿必魯肽(albiglutide)及度拉糖肽(dulaglutide)。
本發明係關於投予IL-21抑制劑與GLP-1促效劑之組合效應，如本文所描述，發現此有助於治療及預防1型糖尿病。
在一些具體實例中，本發明係關於諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑的用途，其用於治療及/或預防1型糖尿病。在一些具體實例中，本發明係關於一種治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑。在一個具體實例中，本發明係關於一種GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其用於治療及/或預防1型糖尿病之方法中。
在一個具體實例中，本發明係關於一種GLP-1促效劑及 IL-21功能抑制劑，其用於製造一或多種治療及/或預防1型糖尿病之藥劑。
在一個具體實例中根據本發明之方法可包含向有需要之個體投予有效量之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑。在一個具體實例中，個體為近期經診斷患有1型糖尿病之患者，其較佳保留內源性胰島素之一些產生。使用GLP-1促效劑與IL-21功能抑制劑之組合治療使患者避免或減少對外源性胰島素療法之需要。在一個具體實例中，與使用外源性胰島素之標準治療相比，GLP-1促效劑與IL-21功能抑制劑之組合治療保留β-細胞功能。
【描述】
本發明人意外地發現投予諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑改善對糖尿病個體中對血糖含量之控制，諸如糖尿病個體中之血糖含量持續標準化。
本發明係關於諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑的用途，其用於治療及/或預防1型糖尿病。換言之，本發明係關於一種治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑。
在一個具體實例中，諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑用於治療或預防1型糖尿病之方法中。
在一個具體實例中，諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑投予近期經診斷患有1型糖尿病之個體。在一個具體實例中， 治療在診斷12週內開始。在一個具體實例中，治療在診斷8週內開始。在一個具體實例中，治療在診斷4週內開始。
在一個具體實例中，諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑投予處於發展1型糖尿病之風險的個體，諸如具有胰島自體抗體之個體或在遺傳學上處於風險且不具有胰島自體抗體之個體。
在一個具體實例中，本發明係關於投予有效量之諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及有效量之IL-21功能抑制劑。
IL-21功能抑制劑
根據本發明，IL-21功能抑制劑為一種能夠抑制IL-21介導之信號傳導及生物作用的藥劑，此類藥劑可描述為中和IL-21。用於本發明之IL-21功能抑制劑(亦稱為IL-21/IL-21R α拮抗劑)為能夠抑制IL-21介導之信號傳導及生物作用的藥劑。在一較佳具體實例中，用於本發明之IL-21R α拮抗劑為能夠與γ C或IL-21R α競爭結合於IL-21之中和抗IL-21抗體。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑為能夠特異性結合IL-21之抗體。在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑為抗IL-21抗體。在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑與受體競爭結合於IL-21，其中該受體選自由IL-21R α及γ C組成之清單。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑與IL-21R α競爭結合於IL-21。在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合於人類IL-21之螺旋1及3。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合於IL-21上之不連續抗原決定基，其中該抗原決定基包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸 I37至Y52及N92至P108。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合於IL-21上之不連續抗原決定基，其中該抗原決定基包含如SEQ ID NO 1中所闡述之I37至Y52區域內及N92至P108區域內的胺基酸。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合於如藉由SEQ ID NO 1所定義之IL-21之R34、R38、Q41以及K102與R105之一中的至少一者。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合於如藉由SEQ ID NO 1所定義之IL-21之R34、R38、Q41、K012及R105中的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或所有五個。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合於IL-21上之不連續抗原決定基，其中該抑制劑直接接觸(截止值為4.0Å)胺基酸殘基34、37、38、41、44、45、47、48、51、52、92、94、95、97、98、99、101、102、105、106、107及108中之至少15個。
在一個具體實例中，抗體直接接觸I37、R38、Q41、D44、I45、D47、Q48、N51及Y52(螺旋1區域)。在一個具體實例中，抗體直接接觸(螺旋3區域)之N92、R94、I95、N97、V98、S99、K101、K102、R105、K106、P107及P108。
與IL-21R α競爭結合於IL-21之抗IL-21抗體的一個實例為「mAb 5」抗體，其為首先在WO2010055366中揭示為純系編號362.78.1.44之人類抗體。mAb 5重鏈及輕鏈之胺基酸序列展示在SEQ ID NO 2+3(IgG1同型型式)中。在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑為mAb 5。mAb 5抗 體結合於人類IL-21之螺旋1+3，或更特異性結合於如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸I37至Y52及N92至P108。mAb 5及其變異體之結合特性及其優點(高親和性及效能)更詳細地描述於WO2012098113中。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑如WO2010/055366或WO2012098113中所述。在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑選自WO2010/055366表1中列出之抗體之群。在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑為藉由WO2010/055366中名為362.78.1.44之融合瘤產生的抗體或抗體片段，其中融合瘤以ATCC專利寄存名稱PTA-8790寄存在美國菌種保藏中心(the American Type Culture Collection)。
JBC,VOL.287，第12期，第9454-9460頁，2012年3月16日揭示關於IL-21/IL-21R α結合之進一步細節。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑為一種抗人類IL-21單株抗體或抗體片段，其包含：(a)重鏈區，其包含：(i)包含SEQ ID NO：15之重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：16之重鏈可變區CDR2；以及(iii)包含SEQ ID NO：17之重鏈可變區CDR3；及(b)輕鏈區，其包含：(i)包含SEQ ID NO：19之輕鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：20之輕鏈可變區CDR2；以及(iii)包含SEQ ID NO：21或22之輕鏈可變區CDR3；且其中抗體之Fc部分視情況經胺基酸取代修飾以減少效應功能。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑為一種抗人類IL-21單株抗體或抗體片段，其包含i)SEQ ID NO：14之胺基酸殘基20至145及SEQ ID NO：18之胺基酸殘基21至126；或ii)SEQ ID NO：14之胺基酸殘基1至145及SEQ ID NO：18之胺基酸殘基1至126；且其中抗體之Fc部分選自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。
Fc部分可進一步優化以增加生物物理/生物化學特徵或效應功能特徵。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑包含如SEQ ID NO 2中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 3中所闡述之三個CDR序列。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑為與γ C競爭結合於IL-21之抗IL-21抗體。在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合於人類IL-21之螺旋2及4。在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合於包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150及His 151之抗原決定基。
與γ C競爭結合於IL-21之抗IL-21抗體的一個實例為「mAb 14」抗體，其為首先在WO2010055366中揭示為純系編號366.328.10.63之人類抗體。mAb 14結合於人類IL-21之螺旋2+4。更特定言之，如WO2012164021中所述，mAb 14結合於人類IL-21之Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150及His 151。mAb 14重鏈及輕鏈之胺基酸序列展示在SEQ ID NO 4+5中。與γ C競爭結合於IL-21之抗IL-21抗體的其他實例描 述於WO2012164021中。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑為mAb 14。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑包含如SEQ ID NO 4中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 5中所闡述之三個CDR序列。
抗體之mAb 5及mAb 14型一般特性為對IL-21具有罕見高之親和性(奈莫耳範圍內)且具有高的中和IL-21誘發之作用的效能。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑與mAb5競爭結合於IL-21。抑制劑可為組與mAb5相同之抗體。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑與mAb14競爭結合於IL-21。抑制劑可為組與mAb5相同之抗體。
用於本發明的IL-21功能抑制劑或中和IL-21R α拮抗劑之其他具體實例為與IL-21競爭結合於IL-21R α者。用於本發明之IL-21R α拮抗劑較佳為結合連接IL-21R α之β股之環的藥劑。AB、CD、EF、B'C'及F'G'環及連接子均含有參與結合IL-21之殘基。在IL-21R中，CD環中之Tyr36、EF環中之Met 89及Asp 91以及B'C'環中之Tyr 148構成結合表面大部分。最重要環為EF環，其供應參與結合IL-21之IL-21R之20個胺基酸中的7個。
用於本發明之抗IL-21R抗體可結合於EF環。用於本發明之較佳抗I-21R抗體結合於選自以下之至少10個胺基酸殘基之群：IL-21R(SEQ ID NO 6)之Tyr 29、Gln 52、Gln 54、Tyr 55、Glu 57、Leu 58、Phe 86、His 87、Phe 88、Met 89、Ala 90、Asp 91、Asp 92、Ile 93、Leu 113、Ala 115、Pro 145、Ala 146、Tyr 148、Met 149、Lys 153、Ser 209、Tyr 210。
用於本發明之IL-21/IL-21R α，諸如抗IL-21R抗體或拮抗劑為干擾IL-21R α與γ C結合且因此干擾IL-21/IL-21R α/γ C複合物之組裝的抗體。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑結合IL-21且從而抑制IL-21功能。IL-21功能抑制劑可為包含結合IL-21之IL-21受體之片段的融合蛋白，諸如由Chimerigen產生且可以項目號CHI-HF-21021R-C100購自例如www.biomol.de的重組產品「IL-21R(人類)：Fc(人類)(重組)」。
在一個具體實例中，IL-21功能抑制劑以107M-1或更大、108M-1或更大、109M-1或更大、1010M-1或更大、1010M-1或更大或1012M-1或更大之結合親和力特異性結合於IL-21。
如本文所使用，術語「抗體(antibody)」、「重組抗體(recombinant antibody)」、「單株抗體(monoclonal antibody)」及「mAb」意指能夠特異性結合於抗原之根據本發明之免疫球蛋白分子及其片段。全長抗體包含四個(或更多個)多肽鏈，亦即藉由二硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及至少兩個輕(L)鏈。各重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個結構域CH1、CH2及CH3構成。各輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插稱為構架區(FR)之更保守區。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下順序配置之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體序列中之可變區及CDR可藉由將序列與已知可變區之數據庫比對來鑑別(構架及CDR根據本文中之Kabat編號方案 界定(Kabat,EA,Wu,TT,Perry,HM等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版US Department of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health,NIH公開案第91-3242號，1991))。
抗體之片段可結晶區(「Fc區」/「Fc結構域」)包含與稱為Fc受體之細胞表面受體及補體系統之一些蛋白質相互作用的抗體尾部區域。此特性允許抗體使免疫系統活化。然而，Fc結構域可包含改變此等效應功能之胺基酸突變。較佳地，經修飾之Fc結構域包含以下突變中之一或多者，較佳全部，該等突變分別使對某些Fc受體之親和力降低(L234A、L235E及G237A)及使C1q介導之補體固定減少(A330S及P331S)(殘基根據EU索引編號)。此類Fc結構域將仍然保留長的活體內循環半衰期。
稱為「Fab區」/「Fab結構域」/「Fab片段」之抗體另一部分含有界定抗體可結合之特定目標的可變區。Fab片段可使用熟知之方法由完整抗體產生，例如用諸如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)或胃蛋白酶(產生F(ab')2片段)之酶進行蛋白質裂解。或者，可使用標準重組DNA及蛋白質表現技術，以重組方式產生抗體片段。
因此，涵蓋於術語「抗體」內之結合片段之實例包括(但不限於)：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab)2及F(ab')2片段，包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之scFv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結構域組成；以及(vi)分離之互補決定區(CDR)。 此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH經獨立基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子接合，該合成連接子能夠使其製造成VL與VH區配對以形成單價分子之單個蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv))；參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。術語「抗體」內亦意欲涵蓋此類單鏈抗體。術語「抗體」內亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL結構域在單一多肽鏈上表現，但使用之連接子過短而無法在同一鏈上之兩個結構域之間配對，由此迫使結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Hol-liger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2：1121-1123)。
應瞭解，抗原可具有一或多個包含以下之抗原決定基：(1)由單一肽鏈組成之抗原決定子；(2)構形抗原決定基，其包含各別胺基酸序列沿著多肽序列不連接地定位之一或多個空間相鄰肽鏈；以及(3)轉譯後抗原決定基，其整體或部分包含在轉譯之後共價連接於抗原的分子結構，諸如碳水化合物基團或其類似物。
如本文所使用，術語「人類抗體(human antibody)」、「人類抗體(human antibodies)」意謂具有來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可例如於CDR中且尤其於CDR3中包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。
其中來源於源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)之抗體的 CDR序列已移植至人類構架序列中且視情況可能藉由突變誘發進一步工程改造之抗體稱為「人類化抗體(humanized antibody)」。
術語「嵌合抗體(chimeric antibody)」或「嵌合抗體(chimeric antibodies)」指根據本發明之抗體，其中輕鏈及重鏈基因已通常藉由基因工程改造由屬於不同物種之免疫球蛋白可變區及恆定區基因構築。舉例而言，可將來自小鼠單株抗體之基因的可變區段接合於人類恆定區段。
如本文所使用，術語「抗原決定基(epitope)」在諸如抗體(Ab)之「抗原結合多肽(antigen binding polypeptide)」與其對應抗原(Ag)之分子相互作用的情況下定義。一般而言，「抗原決定基」指Ag上Ab特異性結合之區域，亦即與Ab實體接觸之區域。實體接觸可經由Ab及Ag分子中原子之各種標準(例如距離截止值為2-6Å，諸如3Å，諸如4Å，諸如5Å；或溶劑可接近性)來定義。蛋白質抗原決定基可包含Ag中直接涉及與Ab結合之胺基酸殘基(亦稱為抗原決定基之免疫顯性組分)及不直接涉及結合之其他胺基酸殘基，諸如藉由Ab有效阻斷之Ag胺基酸殘基，亦即在Ab之「溶劑排斥表面」及/或「足跡」內之胺基酸殘基。
既定抗體(Ab)/抗原(Ag)對之抗原決定基可使用多種實驗及計算抗原決定基定位法以不同細節水準描述及特性化。實驗方法包括突變誘發、X射線結晶學、核磁共振(NMR)譜法、氫/氘交換質譜分析(HX-MS)及此項技術中熟知之各種競爭結合方法。由於各方法依賴於獨特原理，故對抗原決定基之描述與用於測定其之方法密切相關。由此，視所採用之抗原決定基定位法而定，可不同地描述既定Ab/Ag對之抗原決定基。
結合於同一抗原之抗體可關於其同時結合於其共同抗原之能力進行特性化且可進行「競爭結合」/「分組」。在本發明之上下文中，術語「分組(binning)」係指一種將與同一抗原結合之抗體分組的方法。抗體之「分組」可基於兩種抗體在基於標準技術(諸如表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)、ELISA或流動式細胞量測術)之分析中競爭結合於其共同抗原。
抗體之「組」使用參考抗體定義。若第二抗體不能與參考抗體同時結合於抗原，則第二抗體稱為屬於參考抗體之相同「組」。在此情形下，參考抗體與第二抗體競爭性結合抗原之同一部分且編撰為「競爭抗體(competing antibody)」。若第二抗體能夠與參考抗體同時與抗原結合，則將第二抗體稱為屬於分開的「組」。在此情形下，參考抗體與第二抗體不競爭性結合抗原之同一部分且編撰為「非競爭抗體(non-competing antibody)」。
根據本發明之「中和」抗體為能夠經由IL-21R α顯著抑制信號傳導之抗體。可在各種功能分析中，使用表現IL-21R及γ C之細胞，例如諸如使用NK92細胞之生物活性分析及如WO2012098113及WO2012/164021中所揭示且本文分析III及IV中例示之B細胞增殖分析進行評估。
如本文所使用，術語「親和力(affinity)」定義抗體對抗原決定基結合之強度。抗體之親和力藉由平衡解離常數KD量測，定義為[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]為抗體抗原複合物之莫耳濃度，[Ab]為未結合抗體之莫耳濃度且[Ag]為平衡時未結合抗原之莫耳濃度。KD亦可自例如藉由SPR法測定之複合物形成及解離之動力學描述。對應於單價複合物之 締合及解離的速率常數分別指締合速率常數ka(或kon)及解離速率常數kd(或koff)。接著KD經由等式KD=kd/ka與ka及kd相關聯。親和力常數KA由1/KD定義。用於藉由競爭性抑制，確定抗體特異性及親和力之較佳方法可見於Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988；Colligan等人編，Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc,and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)；及Muller,Meth.Enzymol.92：589-601(1983)中。結合本發明，使用高親和性抗體為較佳，例如以如藉由例如SPR所量測，例如107M-1或更大、108M-1或更大、109M-1或更大、1010M-1或更大、1011M-1或更大或1012M-1或更大之結合親和力特異性結合於抗原的抗體。
在一個具體實例中，術語「抗IL-21抗體(anti-IL-21 antibody)」及「抗IL-21(anti-IL-21)」在本文中可互換使用，且指能夠特異性結合於IL-21之抗體。
用於本發明之IL-21/IL-21R α拮抗劑，諸如抗IL-21抗體可藉助於重組核酸技術產生。一般而言，經選殖之野生型蛋白質X核酸序列經修飾以編碼所需蛋白質。此經修飾之序列隨後插入表現載體中，其轉而轉型或轉染至宿主細胞中。
序列
關於其他序列資訊，提及序列表。
SEQ ID NO 1：hIL-21(包括跨越胺基酸1-29之信號肽，mAb 5抗原決定基以粗體展示；IL-21R α結合位點以下劃線展示；形成mAb 14抗原決定基之胺基酸殘基以斜體小寫字母展示)。
跨越以下胺基酸之四個螺旋；螺旋1 aa 32-57，螺旋2 aa 72-81，螺旋3 aa 93-103，且螺旋4 aa 133-149。
SEQ ID No 2：「mAb 5」：輕鏈(省去信號肽-CDR序列以粗體/下劃線展示-恆定區以小寫字母展示)：
SEQ ID No 3：「mAb 5」：IgG1同型之重鏈(省去信號肽-CDR序列以粗體/下劃線展示-恆定區以小寫字母展示)：
SEQ ID No 4：「mAb 14」輕鏈(省去信號肽-CDR序列以粗 體/下劃線展示-恆定區以小寫字母展示)：
SEQ ID No 5：「mAb 14」IgG4同型之重鏈(省去信號肽-CDR序列以粗體/下劃線展示-恆定區以小寫字母展示)：
SEQ ID No 6：IL-21R α(包括信號序列)：
SEQ ID No 7：γ C(共用γ鏈/IL-2R γ)包括信號序列：
SEQ ID No 8：人類升糖素樣肽-1為GLP-1(7-37)：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG
SEQ ID No 9：基於人類GLP-1之人工序列
SEQ ID NO 10：基於人類GLP-1之人工序列
SEQ ID NO 11：重組小鼠IL-21：
SEQ ID NO 12：小鼠替代抗IL-21-可變輕鏈(mIgG1/κ同型) 之胺基酸序列
SEQ ID NO 13：小鼠替代抗IL-21-可變重鏈(mIgG1/κ同型)之胺基酸序列：
SEQ ID NO 14：
SEQ ID NO 15：SYGMH
SEQ ID NO 16：FIWYDGSDKY YADSVKG
SEQ ID NO 17：DGDSSDWYGD YYFGMDV
SEQ ID NO 18：
SEQ ID NO 19：RASQSVSSSY LA
SEQ ID No 20：GASSRAT
SEQ ID No 21：QQYGSWT
SEQ ID No 22：TYGMH
GLP-1受體促效劑
受體促效劑可定義為結合於受體且引發對於天然配位體典型之反應的類似物。完全促效劑可定義為引發與自然配位體量值相同之反應的促效劑(參見例如「Principles of Biochemistry」,AL Lehninger,DL Nelson,MM Cox，第二版，Worth Publishers,1993，第763頁)。
因此，舉例而言，「GLP-1受體促效劑」或「GLP-1促效劑」可定義為能夠結合於GLP-1受體且能夠活化其之化合物。且「完全」GLP-1受體促效劑可定義為能夠引發類似於人類GLP-1之量值的GLP-1受體反應之GLP-1受體促效劑。
GLP-1促效劑
在一個具體實例中，GLP-1促效劑為選自GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)-醯胺、GLP-1(7-37)、GLP-1(7-38)、GLP-1(7-39)、GLP-1(7-40)、GLP-1(7-41)或其類似物或衍生物的GLP-1肽。在一個具體實例中，與GLP-1(7-37)相比，GLP-1肽包含至多15個，諸如至多10個或至多6個經取代、插入或缺失的胺基酸殘基。在一個具體實例中，與GLP-1(7-37)相比，GLP-1肽包含至多5個，諸如至多4個或至多3個經取代、插入或缺失的胺基酸殘基。在一個具體實例中，GLP-1肽包含至多4個未由遺傳密碼編碼之胺基酸殘基。
在又一個具體實例中，GLP-1促效劑為腸促胰島素類似物-4 或腸促胰島素類似物-3、腸促胰島素類似物-4或腸促胰島素類似物-3類似物或此等任一者之衍生物。
在一個具體實例中，用於本發明之GLP-1促效劑具有GLP-1活性。在一個具體實例中，應瞭解「GLP-1促效劑」指包括肽及非肽化合物之完全或部分活化人類GLP-1受體之任何化合物。在一個具體實例中，「GLP-1促效劑」為如藉由此項技術中已知之方法(參見例如WO 98/08871)所量測，較佳以低於1μM，例如低於100nM之親和力常數(KD)或效能(EC50)結合於GLP-1受體之任何肽或非肽小分子。
在一個具體實例中，應瞭解「GLP-1促效劑」指完全或部分活化人類GLP-1受體之肽。在一個具體實例中，「GLP-1促效劑」為如藉由此項技術中已知之方法(參見例如WO 98/08871)所量測，較佳以低於1μM，例如低於100nM之親和力常數(KD)或效能(EC50)結合於GLP-1受體之任何肽。在一個具體實例中，應瞭解「GLP-1促效劑」指包括肽及非肽化合物之完全或部分活化人類GLP-1受體之任何化合物。在一個具體實例中，「GLP-1肽」為如藉由此項技術中已知之方法(參見例如WO 98/08871)所量測，較佳以低於1μM，例如低於100nM之親和力常數(KD)或效能(EC50)結合於GLP-1受體之任何肽或非肽小分子。在一個具體實例中，「GLP-1促效劑」不為非肽化合物，諸如非肽小分子。
在一個具體實例中，用於鑑別GLP-1促效劑之方法描述於WO 93/19175中(Novo Nordisk A/S)且可根據本發明使用之適合GLP-1促效劑的實例包括WO 2005/027978中提及之GLP-1促效劑(Novo Nordisk A/S)，WO 2005/027978之教示內容以引用的方式併入本文中。「GLP-1活性」指結 合於GLP-1受體及起始導致促胰島素作用或其他如此項技術中已知之生理效應的信號轉導路徑之能力。舉例而言，可使用本文分析(I)中所述之分析測試本發明之GLP-1促效劑的GLP-1活性。在一個具體實例中，視情況藉由分析(I)測定，GLP-1促效劑具有小於或等於3000pM、諸如小於或等於500pM或小於或等於100pM之EC50。
在又一具體實例中，GLP-1促效劑為穩定GLP-1促效劑。如本文中所使用之「穩定GLP-1促效劑」(例如「穩定GLP-1肽」)意謂視情況藉由下文描述之方法測定，顯示在人體內至少24小時之活體內血漿消除半衰期之GLP-1促效劑。穩定GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)之實例可見於WO2006/097537。在一個具體實例中，GLP-1促效劑為經DPPIV保護之GLP-1肽。在一個具體實例中，GLP-1肽經DPPIV穩定化。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑具有至少24小時，諸如至少48小時、至少60小時或至少72小時，或諸如至少84小時、至少96小時或至少108小時或視情況至少120小時、至少132小時或至少144小時之半衰期，其中該半衰期視情況在人類或小型豬中例如藉由分析(II)確定。
在一個具體實例中，用於測定化合物在人體內血漿消除半衰期之方法可如下進行。化合物溶解於等張緩衝液(pH 7.4)、PBS或任何其他適合之緩衝液中。劑量在外周注射，較佳在腹部或大腿上部中。以頻繁之時間間隔獲取血液樣品用於測定活性化合物，持續時間足以覆蓋終末消除部分(例如給藥前、給藥後1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)及84(第4天)小時)。活性化合物濃度之測定如Wilken等人，Diabetologia 43(51),2000中所述進 行。針對每一個別個體，藉由使用非間隔法，使用市售軟體WinNonlin 2.1版(Pharsight,Cary,NC,USA)自濃度-時間資料計算衍生藥物動力學參數。終末消除速率常數藉由在濃度-時間曲線之終末log-線性部分上log-線性消退來評估，且用於計算消除半衰期。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑為GLP-1衍生物。在一個此類具體實例中，GLP-1肽經由相對於GLP-1(7-37)之胺基酸序列，位置23、26、34、36或38之胺基酸殘基附接至親水性間隔基。
在一個具體實例中，GLP-1衍生物包含視情況經由親水性間隔基共價附接之白蛋白結合殘基。在一個具體實例中，該白蛋白結合殘基視情況經由親水性間隔基共價附接至該GLP-1肽之C端胺基酸殘基或不為C端胺基酸殘基之胺基酸殘基。在一個具體實例中，GLP-1肽經由相對於GLP-1(7-37)之胺基酸序列，位置23、26、34、36或38之胺基酸殘基附接至親水性間隔基。
人類升糖素樣肽-1為GLP-1(7-37)且具有序列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID No 8)。GLP-1(7-37)亦可稱為「天然」GLP-1。在序列表中，GLP-1(7-37)之第一胺基酸殘基(組胺酸)分配為第1號。然而，在下文中，根據此項技術中確定之操作，此組胺酸殘基稱為第7號且隨後胺基酸殘基因此編號，以甘胺酸第37號結束。因此，一般而言，本文中對GLP-1(7-37)序列之胺基酸殘基編號或位置數目的任何提及均為開始於位置7之His且以位置37之Gly結束的序列。GLP-1類似物可使用對應aa位置提及。
適合類似命名之一非限制性實例為 [Aib8,Arg34,Lys37]GLP-1(7-37)，其表示一種GLP-1(7-37)類似物，其中位置8之丙胺酸已經α-胺基異丁酸(Aib)取代，位置34之離胺酸已經精胺酸取代，且位置37之甘胺酸已經離胺酸取代。
如例如用於本發明之GLP-1肽之情形的術語「肽」指包含一系列藉由醯胺(或肽)鍵互連之胺基酸的化合物。
本發明之肽包含至少五個由肽鍵連接之構成胺基酸。在特定具體實例中，肽包含至少10個、較佳至少15個、更佳至少20個、甚至更佳至少25個或最佳至少28個胺基酸。在特定具體實例中，肽由i)29、ii)30、iii)31或iv)32個胺基酸組成。
在一個具體實例中，在GLP-1(7-37)之整個長度上，GLP-1肽顯示與GLP-1(7-37)至少60%、65%、70%、80%或90%序列一致性。作為測定兩個類似物之間的序列一致性之方法之實例，比對兩個肽[Aib8]GLP-1(7-37)及GLP-1(7-37))。[Aib8]GLP-1(7-37)相對於GLP-1(7-37)之序列一致性藉由比對一致殘基數目減去不同殘基數目除以GLP-1(7-37)中殘基總數來給出。因此，在該實例中，序列一致性為(31-1)/31。在一個具體實例中，當確定序列一致性時不包括GLP-1肽之非肽部分。
在本文中術語「衍生物」不同於術語「結合物」。諸如GLP-1衍生物之衍生物包含定義明確之結構的一或多個取代基或側鏈，其共價連接於肽，本文中主要為GLP-1肽之一或多個特定胺基酸殘基。而結合物指具有經由合成連接子(由此區別於融合蛋白)共價結合於肽之大的通常重組分子(諸如IgG-Fc或白蛋白)之化合物。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑為GLP-1肽衍生物。在一 個具體實例中，如本文中所使用之術語「衍生物」在GLP-1肽或類似物之情況下意謂經化學修飾之GLP-1肽或類似物，其中一或多個取代基已共價連接於肽或類似物。取代基亦可稱為側鏈(未與胺基酸側鏈混合)。典型修飾為醯胺、碳水化合物、烷基、醯基、酯及其類似物。GLP-1(7-37)之衍生物之一個實例為Nε 26-(y-Glu(Nα-十六醯基))-[Arg34,Lys25])GLP-1(7-37)。在一特定具體實例中，側鏈能夠與白蛋白形成非共價凝集物，藉此促進GLP-1肽在血流中之循環，且亦具有延長GLP-1肽之作用時間的效果，因為GLP-1肽與白蛋白之凝集物僅緩慢崩解以釋放活性藥物成分。因此，取代基或側鏈整體上可稱為白蛋白結合部分。
在特定具體實例中，側鏈具有至少10個碳原子，或至少15、20、25、30、35或至少40個碳原子。在其他特定具體實例中，側鏈可進一步包括至少5個雜原子，尤其O及N，例如至少7、9、10、12、15、17或至少20個雜原子，諸如至少1、2或3個N原子，及/或至少3、6、9、12或15個O原子。
在另一特定具體實例中，白蛋白結合部分包含尤其與白蛋白結合相關且藉此與延長相關之部分，因此可將該部分稱作延長部分。相對於白蛋白結合部分與肽之附接點，延長部分可在或靠近白蛋白結合部分之相反末端。
在另一特定具體實例中，白蛋白結合部分包含延長部分及與肽之附接點之間的部分，該部分可稱為連接子、連接部分、間隔子或其類似物。連接子可視情況選用，且因此在彼情況下白蛋白結合部分可與延長部分一致。
在特定具體實例中，白蛋白結合部分及/或延長部分為親脂性的，及/或在生理pH值(7.4)下帶負電。
白蛋白結合部分、延長部分或連接子可藉由醯化共價連接於GLP-1肽之離胺酸殘基。用於製備衍生物之其他或替代性方式包括烷基化、酯形成或醯胺形成或與半胱胺酸殘基偶合，諸如藉由順丁烯二醯亞胺或鹵乙醯胺(諸如溴-/氟-/碘-)偶合。
在一個具體實例中，例如包含延長部分及連接子之白蛋白結合部分之活性酯在形成醯胺鍵下共價連接於離胺酸殘基之胺基，例如其ε胺基(此過程稱為醯化)。
除非另有說明，當提及離胺酸殘基之醯化時，應瞭解為其ε-胺基。
出於本發明之目的，術語「白蛋白結合部分」、「延長部分」及「連接子」可包括此等分子之未反應以及反應形式。意謂一種還是另一種形式可自使用術語之上下文瞭解。
通常，延長部分經由連接子在指定位置連接於Lys之ε胺基，且同樣在一個具體實例中，延長部分、連接子及肽之間的所有連接均為醯胺鍵。
歸因於半衰期延長特性，脂肪酸可用作該白蛋白結合殘基且尤其用作延長部分之關鍵部分。為附接於GLP-1肽，脂肪酸之酸基或脂肪二酸之酸基之一經由與GLP-1肽中離胺酸殘基之ε胺基的醯胺鍵直接或經由連接子附接。
在一個具體實例中，GLP-1衍生物經單醯基化。在一個具體 實例中，GLP-1衍生物在K26經醯基化。
在一個具體實例中，GLP-1衍生物經二醯基化。在一個具體實例中，GLP-1衍生物在K26及K37、K27及K36或K38及K42經醯基化。
在一個具體實例中，術語「脂肪酸」指具有4至28個碳原子之脂族基單羧酸，其視情況未分支及/或甚至編號，且其可為飽和或不飽和。
在一個具體實例中，術語「脂肪二酸」指如上所定義，但Ω位置中具有另一羧酸基之脂肪酸。因此，脂肪二酸為二羧酸。
在一個具體實例中，延長部分包含獨立地選自C14-C20脂肪酸及C16-C20脂肪二酸之一或多種脂肪酸。
在一個具體實例中，延長部分可包含C16脂肪酸(CH3-(CH2)14-CO-)。
在一個具體實例中，延長部分可包含C18二酸基團(HOOC-(CH2)16-CO-)。在一個具體實例中，延長部分可包含C20二酸基團(HOOC-(CH2)18-CO-)。
在一個具體實例中，延長部分可包含4-COOH-PhO-脂肪酸，其中4-COOH-PhO-結構後面為-(CH2)y-C(=O)-，其中y為7-11。
在一個具體實例中，延長部分可包含化學式9，其中y=9。
在一個具體實例中，GLP-1肽衍生物之一或多個延長部分經由連接子附接。
在一個具體實例中，本發明之GLP-1衍生物之連接子可包含以下第一連接子元件：
其中k為在1-5範圍內之整數，且n為在1-5範圍內之整數；在一特定具體實例中，當k=1且n=1時，此連接子元件可稱為OEG，或8-胺基-3,6-二氧雜辛酸二基，及/或其可由下式表示：化學式5a：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*。
在另一具體實例中，本發明之GLP-1肽之每一連接子可進一步獨立地包含第二連接子元件，例如Glu二基，諸如化學式6及/或化學式7：
化學式7：
其中Glu二基可包括p次，其中p為1-3範圍內之整數。
化學式6亦可稱為γ-Glu，或簡稱為gGlu，因為其為此處用於連接於另一連接子元件或離胺酸之ε-胺基的胺基酸麩胺酸之γ羧基。如以上所解釋，另一連接子元件可例如為另一Glu殘基，或OEG分子。繼而Glu之胺基與延長部分之羧基或與例如OEG分子(若存在)之羧基或與例如另一麩胺酸(若存在)之γ-羧基形成醯胺鍵。
化學式7亦可稱為α-Glu，或簡稱為aGlu，或簡單地為Glu，因為其為此處用於連接於另一連接子元件或離胺酸之ε-胺基的胺基酸麩胺酸之α羧基。
化學式6及化學式7之以上結構涵蓋Glu之L-形式以及D形式。在特定具體實例中，化學式6及/或化學式7獨立地a)呈L-形式或b)呈D-形式。
在其他特定具體實例中，連接子具有a)5至41個C原子；及/或b)4至28個雜原子。
本發明之GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)在血漿中之濃度可使用任何適合之方法測定。舉例而言，可使用LC-MS(液相層析質譜分析)或免疫分析，諸如RIA(放射免疫分析)、ELISA(酶聯免疫吸附分析)及LOCI(發光氧通道免疫分析)。用於適合RIA及ELJSA分析之一般方案 見於例如WO09/030738第116-118頁上。一較佳分析為LOCI(發光氧通道免疫分析)，一般如Poulsen及Jensen在Journal of Biomolecular Screening 2007,第12卷，第240-247頁中針對胰島素測定所述；簡言之，可以所需時間間隔收集血液樣品，分離血漿，即刻冷凍，且保存在-20℃下直至分析相應GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)之血漿濃度；將供體珠粒用抗生蛋白鏈菌素塗佈，而接受體珠粒與識別肽之中間/C端抗原決定基之單株抗體結合；對N端具有特異性之另一單株抗體經生物素標記；三種反應物與分析物組合且形成兩位點免疫複合物；照射複合物將單重態樣原子自供體珠粒釋放，該等原子引導至接受體珠粒且引發化學發光，可在Envision盤式讀取器量測；光之量與化合物濃度成比例。
在一個具體實例中，諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑包含式(I)之胺基酸序列(SEQ ID NO 9)：式(I)：Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19Xaa20GluXaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Xaa43-Xaa44-Xaa45-Xaa46
其中Xaa7為L-組胺酸、D-組胺酸、去胺基-組胺酸、2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、Nα-乙醯基-組胺酸、α-氟甲基-組胺酸、α-甲基-組胺酸、3-吡啶基丙胺酸、2-吡啶基丙胺酸或4-吡啶基丙胺酸；Xaa8為Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-胺基環丙基)甲酸、(1-胺基環丁基)甲酸、(1-胺基環戊基)甲酸、(1-胺基環己基)甲酸、(1-胺基環庚基)甲酸或(1-胺基環辛基)甲酸； Xaa16為Val或Leu；Xaa18為Ser、Lys或Arg；Xaa19為Tyr或Gln；Xaa20為Leu或Met；Xaa22為Gly、Glu或Aib；Xaa23為Gln、Glu、Lys或Arg；Xaa25為Ala或Val；Xaa26為Lys、Glu或Arg；Xaa27為Glu或Leu；Xaa30為Ala、Glu或Arg；Xaa33為Val或Lys；Xaa34為Lys、Glu、Asn或Arg；Xaa35為Gly或Aib；Xaa36為Arg、Gly或Lys；Xaa37為Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、醯胺或不存在；Xaa38為Lys、Ser、醯胺或不存在；Xaa39為Ser、Lys、醯胺或不存在；Xaa40為Gly、醯胺或不存在；Xaa41為Ala、醯胺或不存在；Xaa42為Pro、醯胺或不存在；Xaa43為Pro、醯胺或不存在；Xaa44為Pro、醯胺或不存在； Xaa45為Ser、醯胺或不存在；Xaa46為醯胺或不存在；其條件為若Xaa38、Xaa39、Xaa40、Xaa41、Xaa42、Xaa43、Xaa44、Xaa45或Xaa46不存在，則下游每一胺基酸殘基亦不存在。
在一個具體實例中，諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑包含式(II)之胺基酸序列(SEQ ID NO 10)：式(II)：Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37Xaa38
其中Xaa7為L-組胺酸、D-組胺酸、去胺基-組胺酸、2-胺基-組胺酸、-羥基-組胺酸、高組胺酸、Nα-乙醯基-組胺酸、α-氟甲基-組胺酸、α-甲基-組胺酸、3-吡啶基丙胺酸、2-吡啶基丙胺酸或4-吡啶基丙胺酸；Xaa8為Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-胺基環丙基)甲酸、(1-胺基環丁基)甲酸、(1-胺基環戊基)甲酸、(1-胺基環己基)甲酸、(1-胺基環庚基)甲酸或(1-胺基環辛基)甲酸；Xaa18為Ser、Lys或Arg；Xaa22為Gly、Glu或Aib；Xaa23為Gln、Glu、Lys或Arg；Xaa26為Lys、Glu或Arg；Xaa30為Ala、Glu或Arg；Xaa34為Lys、Glu或Arg；Xaa35為Gly或Aib；Xaa36為Arg或Lys； Xaa37為Gly、Ala、Glu或Lys；Xaa38為Lys、醯胺或不存在。
在一個具體實例中，諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑為利拉魯肽。利拉魯肽為由Novo Nordisk A/S出售之每日投予一次的單醯基化GLP-1肽，且揭示於WO 98/08871實施例37中。
在一個具體實例中，本發明涵蓋GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)之醫藥學上可接受之鹽。此類鹽包括醫藥學上可接受之酸加成鹽、醫藥學上可接受之金屬鹽、銨及烷基化銨鹽。亦意欲醫藥學上可接受之酸加成鹽為本發明GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)能夠形成之水合物。
在一個具體實例中，GLP-1肽包含位置8中之Aib殘基。在一個具體實例中，如本文中所使用之術語「Aib」指α-胺基異丁酸。
在一個具體實例中，該GLP-1肽之位置7中之胺基酸殘基選自由D-組胺酸、去胺基-組胺酸、2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、N α-乙醯基-組胺酸、α-氟甲基-組胺酸、α-甲基-組胺酸、3-吡啶基丙胺酸、2-吡啶基丙胺酸及4-吡啶基丙胺酸組成之群。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑肽包含下式之胺基酸序列：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑包含經由親水性間隔基附接於該GLP-1肽之C端胺基酸殘基的白蛋白結合殘基。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑包含附接於不為C端胺基 酸殘基之胺基酸殘基的第二白蛋白結合殘基。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)選自由利拉魯肽及司美魯肽(semaglutide)組成之群。
利拉魯肽為截至2009年由Novo Nordisk A/S出售之每日投予一次的單醯基化GLP-1促效劑，揭示於WO 98/08871實施例37中。
在一個具體實例中，GLP-1肽為司美魯肽。WO 06/097537揭示司美魯肽(實施例4)，一種每週投予一次之單醯基化GLP-1促效劑。在一個具體實例中，GLP-1肽具有結構His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg。
在一個具體實例中，GLP-1肽包含Arg34 GLP-1(7-37)或[Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37)。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑包含IgG之Fc片段。在一個具體實例中，GLP-1促效劑包含IgG之Fc片段及一或多種，諸如兩種GLP-1肽。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑選自阿必魯肽及度拉糖肽(dulaglitide)。
在一個具體實例中，GLP-1肽具有以下結構：His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Aib-Arg。
在一個具體實例中，GLP-1肽具有以下結構：(His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala- Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg)2-重組融合於人類白蛋白。
在一個具體實例中，GLP-1肽為度拉糖肽。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑經調配以在人體中具有至少48小時之半衰期。此可藉由此項技術中已知之持續釋放調配物獲得。
在又一個具體實例中，GLP-1促效劑為腸促胰島素類似物-4或腸促胰島素類似物-3、腸促胰島素類似物-4或腸促胰島素類似物-3類似物或此等任一者之衍生物。
在一個具體實例中，GLP-1肽選自由艾塞那肽、阿必魯肽及度拉糖肽組成之群。
在一個具體實例中，GLP-1肽為艾塞那肽。在一個具體實例中，GLP-1肽包含下式之胺基酸序列：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。艾塞那肽為存在於希拉毒蜥(Gila monster)之唾液中的激素腸促胰島素類似物-4之合成型式。艾塞那肽顯示類似於GLP-1之生物特性。在一些具體實例中，組合物為BYDUREON®(艾塞那肽在PLGA粒子中之長效釋放調配物)。在一個具體實例中，「Bydureon®組合物」指包含艾塞那肽、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)及蔗糖之粉末，其在臨注射前在包含羧甲基纖維素鈉、氯化鈉、聚山梨醇酯20、磷酸二氫鈉(例如其單水合物)、磷酸氫二鈉(例如其七水合物)及水之溶劑中復原以供注射。
在一個具體實例中，GLP-1肽具有結構(His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala- Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg)2-基因融合於人類白蛋白。阿必魯肽為一種重組人類血清白蛋白(human serum albumin，HSA)-GLP-1混合蛋白質，可能為融合至HSA之GLP-1二聚體。構成GLP-1肽為類似物，其中位置8處之Ala已由Glu取代。
在一個具體實例中，GLP-1肽為度拉糖肽。度拉糖肽為GLP-1-Fc構築體(GLP-1-連接子-來自IgG4之Fc)。
醫藥組成物
醫藥組合物之製備為此項技術中已知。為方便起見，參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
根據本發明之調配物可包含緩衝系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、穩定劑及界面活性劑。在本發明之一個具體實例中，醫藥調配物為水性調配物，亦即包含水之調配物。此類調配物通常為溶液或懸浮液。在本發明之另一具體實例中，醫藥調配物為水溶液。術語「水性調配物」定義為包含至少50% w/w水之調配物。同樣，術語「水溶液」定義為包含至少50% w/w水之溶液，且術語「水性懸浮液」定義為包含至少50% w/w水之懸浮液。
在另一具體實例中，醫藥組成物為一種無需任何預先溶解的即用型乾燥調配物(例如凍乾或噴霧乾燥)。
在一個具體實例中，緩衝液可選自由以下組成之群：乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、雙甘胺肽、組胺酸、甘胺酸、磷酸鹽、磷酸氫鹽及參(羥基甲基)-胺基甲烷(TRIS)、二甘胺酸、麥黃酮、丁二酸鹽、天冬胺酸、天冬醯胺或其混合物。
在一個具體實例中，組合物具有在5-10、諸如6-9、6-8、5-7、7-9或諸如5.5-7.5範圍內之pH值。
在本發明之另一具體實例中，調配物進一步包含醫藥學上可接受之防腐劑。
在本發明之另一具體實例中，防腐劑選自由苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苯甲醇、氯丁醇、氯甲酚、苄索氯銨(benzethonium chloride)或其混合物組成之群。防腐劑在醫藥組成物中之使用為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本發明之另一具體實例中，調配物進一步包含等張劑。等張劑可選自由以下各物組成之群：鹽(例如氯化鈉)/糖，諸如單、二或多醣或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、聚葡萄糖或糖醇，諸如胺基酸(例如L-甘胺酸、L-組胺酸、精胺酸、離胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸)、醛醇(例如丙三醇(甘油)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。糖醇包括例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇、木糖醇及阿拉伯糖醇。
等張劑在醫藥組成物中之使用為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本發明之另一具體實例中，調配物進一步包含螯合劑。在本發明之另一具體實例中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸及 天冬胺酸、EGTA之鹽及其混合物。
在本發明之另一具體實例中，調配物進一步包含穩定劑。穩定劑在醫藥組成物中之使用為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
本發明之醫藥組成物可進一步包含足夠減少組合物儲存期間多肽或蛋白質之聚集體形成之量的胺基酸鹼。術語「胺基酸鹼(amino acid base)」意欲為胺基酸或胺基酸之組合，其中任何既定胺基酸以其自由鹼形式或其鹽形式存在。胺基酸可為精胺酸、離胺酸、天冬胺酸及麩胺酸、胺基脈、鳥胺酸及N-單乙基L-精胺酸、乙硫胺酸及丁硫胺酸及S-甲基-L半胱胺酸。
在本發明之另一具體實例中，調配物進一步包含選自高分子量聚合物或低分子量化合物之群的穩定劑。在本發明之另一具體實例中，穩定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯啶酮、羧基/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L及HPMC)、環糊精、含硫物質(如單硫代甘油、硫代乙醇酸及2-甲基硫代乙醇)及不同鹽(例如氯化鈉)。
在本發明之另一具體實例中，調配物進一步包含界面活性劑。典型界面活性劑(商標名之實例在方括號[]中給出)為聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，諸如聚氧化乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯[Tween 20]、聚氧化乙烯(20)脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯[Tween 40]或聚氧化乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯[Tween 80]、泊洛沙姆(poloxamer)(諸如聚氧化丙烯-聚氧化乙烯)嵌段共聚物[Pluronic F68/泊洛沙姆188]、聚乙二醇辛基苯基 醚[Triton X-100]或聚氧乙二醇十二烷基醚[Brij 35]。界面活性劑在醫藥組成物中之使用為熟習此項技術者所熟知。為方便起見，參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在一個具體實例中，本發明提供包含GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)及IL-21功能抑制劑之組合物。GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)及IL-21功能抑制劑可包含於單一組合物或分開組合物中。在一個具體實例中，GLP-1促效劑及IL-21抑制劑提供於分開組合物中。在一個具體實例中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含一或多種本發明之IL-21功能抑制劑及/或GLP-1促效劑(諸如GLP-1肽)，連同一或多種醫藥學上可接受之賦形劑一起調配。在一個具體實例中，根據本發明使用之組成物經個別調配，以包含分別適合於GLP-1促效劑及IL-21抑制劑之不同緩衝劑及賦形劑。
在另一具體實例中，醫藥組成物包含抗體水溶液及緩衝液，其中抗體以1mg/ml或超過1mg/ml(諸如1-200、1-100、50-200、50-150、50-100、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175或200mg/ml)之濃度存在且其中該組成物具有約6.0至約8.0，諸如約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0之pH值。
在一個具體實例中，抗體調配物包括組胺酸、蔗糖、精胺酸、聚山梨醇酯及氯化鈉。高濃縮抗體調配物之實例為此項技術中已知且描述於諸如WO 2011/104381中。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)經調配以在人體內具有至少48小時之半衰期。此可藉由此項技術中已知之持續釋 放組成物獲得。
投藥模式
根據本發明之醫藥組成物可經由例如經舌、舌下、經頰、口中、口腔、胃及腸中、經鼻、肺部(例如經由細支氣管及肺泡或其組合)、表皮、真皮、經皮、陰道、直腸、眼(例如經由結膜)、輸尿管及非經腸之若干投藥途徑投予需要此類治療之患者。
醫藥組成物可投予需要此類治療之患者的若干位點，例如局部位點，例如皮膚及黏膜位點；繞過吸收之位點，例如投予動脈中、靜脈中、心臟中；及涉及吸收之位點，例如投予皮膚中、表皮下、肌肉中或腹部中。
非經腸投藥可藉助於注射器(視情況藉助於筆樣注射器)藉由皮下、肌肉內、腹膜內或靜脈內注射來進行。或者，非經腸投藥可藉助於輸注泵進行。另一選擇為可為溶液或懸浮液之組成物以使化合物呈經鼻或經肺噴霧形式投予。作為另一選擇，含有本發明[蛋白質]化合物之醫藥組成物亦可適於經皮投予，例如藉由無針注射或自貼片(視情況選用之離子導入式貼片)或經黏膜(例如頰內)投予。
本發明之GLP-1促效劑(諸如GLP-1肽)及IL-21功能抑制劑可分開或組合投予，諸如各在分開劑型在或組合在單一劑型中。
本發明之GLP-1促效劑(諸如GLP-1肽)及IL-21功能抑制劑可同時或依序投予。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑與用於本文所定義之治療的另一治療活性劑一起共同投予。在一個具體實例 中，該另一治療活性劑為胰島素。
在一個具體實例中，本發明之GLP-1促效劑及/或IL-21抑制劑之投予途徑可為有效輸送活性化合物至適當或所需作用位點之任何途徑，諸如非經腸。
在一個具體實例中，包含本發明之GLP-1促效劑及/或IL-21抑制劑之藥劑或醫藥組成物可非經腸投予有需要之患者。在一個具體實例中，非經腸投藥可藉助於注射器(視情況藉助於筆樣注射器)藉由皮下、肌肉內或靜脈內注射來進行。
本發明之GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)及/或IL-21功能抑制劑可非經腸，諸如經靜脈內，諸如肌肉內，諸如皮下投予。在一個具體實例中，GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)及/或IL-21功能抑制劑藉由非經腸投予，諸如皮下注射來投予。在一個具體實例中，非經腸投藥可藉助於注射器(視情況藉助於筆樣注射器)藉由皮下、肌肉內或靜脈內注射來進行。或者，非經腸投藥可藉助於輸注泵進行。另一選擇為可為粉末或液體之組成物以使GLP-1促效劑呈經鼻或經肺噴霧形式投予。作為另一選擇，GLP-1促效劑亦可經皮或經黏膜，例如經頰投予。
或者，本發明之GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)及/或IL-21抑制劑可經由非腸外途徑，諸如經口或局部投予。本發明之GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)及/或IL-21抑制劑可預防性投予。本發明之GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)及/或IL-21抑制劑可治療性投予(按需求)。
在一個具體實例中，GLP-1促效劑皮下投予。在一個具體實例中，IL-21抑制劑經靜脈內或皮下投予。
GLP-1促效劑及IL-21抑制劑之頻率及劑量將視多個因素而定，尤其個體中治療劑之半衰期及生體可用率，視投予途徑而定。
已用於治療2型糖尿病之GLP-1促效劑每日投予一次或兩次。半衰期進一步增加之GLP-1促效劑適合於每週投予一次。若可能，則在半衰期及生體可用率支持的情況下，甚至更少之投予可為適合的，諸如每10天或每兩星期(2週)。
同樣，IL-21抑制劑可每日或每週投予，視既定組成物中治療劑之半衰期及生體可用率而定。在一個具體實例中，IL-21抑制劑具有延長之半衰期，諸如抗體分子，且投予不太頻繁，諸如每月或至多每4週。在一個具體實例中，每年投予大約6-10個劑量單元，諸如每4-8週，諸如每5-7週一個劑量單元。在一個具體實例中，GLP-1肽每日投予，而IL-21抑制劑每6週投予。
在一個具體實例中，如本文所使用，關於數目或時間間隔所給出之特定值可理解為該特定值或大約該特定值。
治療及/或預防
1型糖尿病為一種進展性自體免疫疾病，其中身體產生胰島素之能力隨著胰臟β細胞破壞而逐漸減少。1型糖尿病視為一種慢性疾病，其通常迅速發展至胰島素依賴性階段，例如患者需要外源性胰島素來保持血糖為低的。1型糖尿病(T1DM)或僅1型糖尿病(T1D)之臨床診斷為：‧HbA1c6.5%或‧空腹血漿葡萄糖7.0(126mg/dL)或‧在口服葡萄糖耐受測試期間在75公克無水葡萄糖於水中之葡萄糖 負荷下，2小時血漿葡萄糖11.1mmol/dL(200mg/dL)或‧高血糖症之經典症狀及隨機血漿葡萄糖11.1mm/L
1型糖尿病之經典治療為補充外源性胰島素，以代替缺少之胰島素，從而控制血糖。健康個體能夠非常緊密地調整血糖含量。即使使用現代胰島素產品，糖尿病患者亦難以類似地良好控制血糖且仍有低血糖及高血糖發作之風險。
本發明係關於1型糖尿病在新診斷之個體中的治療及預防。在一個具體實例中，個體具有至少0.2nmol/L之非空腹C-肽。在一個具體實例中，個體具有至少0.2nmol/L之空腹C-肽。在一個具體實例中，已偵測到個體中存在一或多種胰島自體抗體。
如上文所描述，本發明係關於1型糖尿病之治療及/或預防，其藉由投予有效量之GLP-1促效劑，諸如GLP-1肽及有效量之IL-21功能抑制劑。在本發明之情況下，治療及/或預防未必指1型糖尿病完全治癒或不進展。本發明係關於近期經診斷患有1型糖尿病之患者或處於發展1型糖尿病風險之個體的治療。如上所述，1型糖尿病為一種進行性疾病，其中患者逐漸喪失產生足夠胰島素之能力。
大多數1型糖尿病患者需要胰島素治療且本文所述之方法允許根據正常指導進行同時胰島素治療以實現代謝控制。
在一個具體實例中，治療保留β細胞功能。在一個具體實例中，治療增強內源性胰島素分泌。
在一個具體實例中，β細胞功能保留自治療開始起至少一年，諸如至少兩年。
β細胞功能，例如產生胰島素之能力可使用標準技術量測。在一個具體實例中，治療增加空腹C-肽之濃度。
C-肽在胰島素產生期間釋放。在健康個體中，C-肽之濃度為0.5至2.7奈克/毫升(ng/mL)。雖然在診斷時1型糖尿病患者產生一些胰島素且因此產生類似量之C-肽，但此能力通常在相對較短之時間內喪失。
在具有T1DM之一些個體中，可在診斷之後長期(>10年)產生極少量之胰島素。
在一個具體實例中，C-肽濃度自治療開始起保留至少一年，諸如至少兩年。
在一個具體實例中，量測回應於混合膳食耐量測試(MMTT)來產生胰島素之能力。在一個此類具體實例中，在測試中量測C-肽之量且與在治療前回應於測試所量測之C-肽之量相比。參數可為AUC0-2h/AUC0-4h或血液中C-肽之最大MMX。
在一個具體實例中，非空腹C-肽分泌之下降與標準治療相比減少。在一個具體實例中，非空腹C-肽(MMTT)之下降與標準胰島素治療相比減少至少一年或諸如兩年。
在一個具體實例中，非空腹C-肽之含量自治療開始起維持。在一個具體實例中，非空腹C肽自基線(治療起始)之減退為在1年之後至多10%或諸如在1年之後至多5%。
在一個具體實例中，治療提高血糖控制。在一個具體實例中，根據本發明之治療及/或預防降低個體中之平均血糖。治療可幫助患者達到治療目標。在一個具體實例中，患者實現低於使用標準治療通常獲得 之HbA1c。糖尿病患者之通用目標為保持HbA1c低於6.5%。在一個具體實例中，治療在治療期內降低HbA1c。在一個具體實例中，治療長時間降低HbA1c。在一個具體實例中，更多患者獲得低於6.5%之HbA1c(與標準治療相比)。
在一個具體實例中，與治療之前空腹血漿葡萄糖之量測相比，治療提高空腹血漿葡萄糖。在一個具體實例中，與使用標準胰島素治療達到之平均值相比，治療提高空腹血漿葡萄糖。
在一個具體實例中，治療延長個體產生內源性胰島素之時間。因此，治療可推遲個體需要(外源性)胰島素之時間點及/或減少所需(外源性)胰島素之量。因此，此治療可延遲β細胞破壞之進展且降低對外源性胰島素之依賴性。在一個具體實例中，治療降低對外源性胰島素之依賴性。
在一個具體實例中，根據本發明之治療及/或預防允許個體減少外源性胰島素，例如胰島素注射液之量。
在一個具體實例中，治療降低空腹血漿葡萄糖。在一個具體實例中，治療減輕胰島炎。
在一個具體實例中，治療在1-4週或1-6個月之時間範圍內觀測。因為據瞭解1型糖尿病為一種進行性慢性疾病，所以觀測到之作用較佳應維持至多一年或兩年。在一個具體實例中，治療保留β細胞功能6、12、18或24週。在一個具體實例中，治療保留β細胞功能36、42、48或52週。
在一個具體實例中，大部分患者維持β細胞功能至少一年。在一個具體實例中，大部分患者維持β細胞功能至少兩年。
在一個具體實例中，治療允許患者藉由減少日劑量(單元/公斤，計算為三天之平均值)或每日投予之胰島素注射液次數(三天平均值)來減少外源性胰島素之量。在一個具體實例中，治療降低胰島素需要達6、12、18或24週。在一個具體實例中，治療降低胰島素需要達36、42、48或52週。
在一個具體實例中，本發明係關於一種治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予有效量之GLP-1促效劑及有效量之IL-21抑制劑。如上所述，兩種化合物可分開投予，同時應瞭解其為如本文所描述之有效治療1型糖尿病的GLP-1與IL-21抑制劑之組合給藥。
在一個具體實例中，本發明係關於一種治療1型糖尿病之方法，其包含向有需要之個體投予組合下有效量之GLP-1促效劑及IL-21功能。
視GLP-1及IL-21抑制劑之身分而定，準確劑量可調整。視產品半衰期而定，可調整劑量及給藥頻率。
對於GLP-1肽衍生物，諸如利拉魯肽，每一劑量單元投予0.01-100mg，諸如0.1-1.8mg之劑量。在一個具體實例中，每一劑量單元投予0.5mg至2mg。一般而言，投予一種日劑量。對於具有延長半衰期之GLP-1促效劑(包括GLP-1肽)，投予可為每週兩次或一次。
對於抗體IL-21抑制劑，每一劑量單元投予5-20mg/kg之劑量。在一個具體實例中，投予10-15mg/kg。抗體產品通常不如GLP-1促效劑投予頻繁，諸如至多一週一次。在一個具體實例中，抗體IL-21抑制劑每4-10週，諸如每4-8週，諸如每6週投予。在一個具體實例中，每6週投予12mg/kg抗IL-21抗體。
儘管已在本文中描述及展示本發明之某些特徵，但一般技術者現將想到多種修改、取代、變化及相等物。因此，應瞭解，申請案意欲涵蓋如屬於本發明之真實精神內的所有此類修改及變化。隨附具體實例及申請專利範圍不視為限制本發明。
本發明之具體實例
1. 一種諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑之用途，其用於治療及/或預防1型糖尿病。
2. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑為能夠特異性結合IL-21之抗體。
3. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑為抗IL-21抗體。
4. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑與受體競爭結合於IL-21，其中該受體選自由IL-21R α及γ C組成之清單。
5. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑與IL-21R α競爭結合於IL-21。
6. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑結合於人類IL-21之螺旋1及3。
7. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑結合於IL-21上之不連續抗原決定基，其中該抗原決定基包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸I37至Y52及N92至P108。
8. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能 抑制劑包含如SEQ ID NO 2中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 3中所闡述之三個CDR序列。
9. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑為與γ C競爭結合於IL-21之抗IL-21抗體。
10. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑結合於人類IL-21之螺旋2及4。
11. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑結合於包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150及His 151之抗原決定基。
12. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑包含如SEQ ID NO 4中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 5中所闡述之三個CDR序列。
13. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該IL-21功能抑制劑以107M-1或更大、108M-1或更大、109M-1或更大、1010M-1或更大、1010M-1或更大或1012M-1或更大之結合親和力特異性結合於IL-21。
14. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該GLP-1肽為利拉魯肽。
15. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑同時或依序投予。
16. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該GLP-1促效劑每日投予，而該IL-21抑制劑每6週投予。
17. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑投予近期經診斷患有1型糖尿病之個體。
18. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑投予非空腹C-肽為至少0.2nmol/L之個體。
19. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑投予處於發展1型糖尿病之風險之個體，諸如具有胰島自體抗體之個體或在遺傳學上處於風險且不具有胰島自體抗體的個體。
20. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中β-細胞功能自治療開始起保留至少一年。
21. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中與標準胰島素治療相比，平均每日胰島素需要減少。
22. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中每一劑量單元投予0.01-100mg，諸如0.1-1.8mg GLP-1促效劑，諸如GLP-1肽。
23. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑包含於視情況包含一或多種其他賦形劑之組成物中。
24. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑由視情況包含一或多種其他賦形劑之分開醫藥組成物包含。
25. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該(等)組成物呈水性組成物或凍乾組成物形式。
26. 根據前述具體實例中任一項之用途，其中該(等)組成物具有5-10，諸如6-8範圍內之pH值。
27. 一種用於治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑。
28. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑為能夠特異性結合IL-21之抗體。
29. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑為抗IL-21抗體。
30. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑與受體競爭結合於IL-21，其中該受體選自由IL-21R α及γ C組成之清單。
31. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑與IL-21R α競爭結合於IL-21。
32. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑結合於人類IL-21之螺旋1及3。
33. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑結合於IL-21上之不連續抗原決定基，其中該抗原決定基包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸I37至Y52及N92至P108。
34. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑包含如SEQ ID NO 2中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 3中所闡述之三個CDR序列。
35. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能 抑制劑為與γ C競爭結合於IL-21之抗IL-21抗體。
36. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑結合於人類IL-21之螺旋2及4。
37. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑結合於包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150及His 151之抗原決定基。
38. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑包含如SEQ ID NO 4中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 5中所闡述之三個CDR序列。
39. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該IL-21功能抑制劑以107M-1或更大、108M-1或更大、109M-1或更大、1010M-1或更大、1010M-1或更大或1012M-1或更大之結合親和力特異性結合於IL-21。
40. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該GLP-1促效劑為利拉魯肽。
41. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑同時或依序投予。
42. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該GLP-1促效劑每日投予，而該IL-21抑制劑每6週投予。
43. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑投予近期經診斷患有1型糖尿病之個體。
44. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該GLP-1促效 劑及該IL-21功能抑制劑投予非空腹C-肽濃度為至少0.2nmol/L之個體。
45. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑投予處於發展1型糖尿病之風險之個體，諸如具有胰島自體抗體之個體或在遺傳學上處於風險且不具有胰島自體抗體的個體。
46. 根據前述具體實例中任一項之用於治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予有效量之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑。
47. 根據前述具體實例中任一項之用於治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予有效量之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中非空腹C-肽分泌之下降與標準治療相比減少。根據前述具體實例中任一項之用於治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予有效量之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中β細胞功能自治療開始起保留至少一年。
48. 根據前述具體實例中任一項之用於治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予有效量之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中平均每日胰島素需要與標準胰島素治療相比減少。
49. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中每一劑量單元投予0.01-100mg，諸如0.1-1.8mg GLP-1促效劑，諸如GLP-1肽。
50. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑由視情況包含一或多種其他賦形劑之分開醫藥組成物包含。
51. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該(等)組成物呈水性組成物或凍乾組成物形式。
52. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該(等)組成物具有5-10，諸如6-8範圍內之pH值。
53. 一種諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其用於製造一或多種供治療及/或預防1型糖尿病之藥劑。
54. 一種諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其用於治療及/或預防1型糖尿病之方法中。
55. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑為能夠特異性結合IL-21之抗體。
56. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑為抗IL-21抗體。
57. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑與受體競爭結合於IL-21，其中該受體選自由IL-21R α及γ C組成之清單。
58. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑與IL-21R α競爭結合於IL-21。
59. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑結合於人類IL-21之螺旋1及3。
60. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑結合於IL-21上之不連續抗原決定基，其中該抗原決定基包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸I37至Y52及N92 至P108。
61. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑包含如SEQ ID NO 2中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 3中所闡述之三個CDR序列。
62. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑為與γ C競爭結合於IL-21之抗IL-21抗體。
63. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑結合於人類IL-21之螺旋2及4。
64. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑結合於包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150及His 151之抗原決定基。
65. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑包含如SEQ ID NO 4中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 5中所闡述之三個CDR序列。
66. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑以107M-1或更大、108M-1或更大、109M-1或更大、1010M-1或更大、1010M-1或更大或1012M-1或更大之結合親和力特異性結合於IL-21。
67. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功 能抑制劑，其中該GLP-1促效劑為利拉魯肽。
68. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑同時或依序投予。
69. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑每日投予，而該IL-21抑制劑每6週投予。
70. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑投予近期經診斷患有1型糖尿病之個體。
71. 根據前述具體實例中任一項之方法，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑投予非空腹C-肽濃度為至少0.2nmol/L之個體。
72. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑投予處於發展1型糖尿病之風險之個體，諸如具有胰島自體抗體之個體或在遺傳學上處於風險且不具有胰島自體抗體的個體。
73. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中β細胞功能自治療開始起保留至少一年。
74. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中平均每日胰島素需要與標準胰島素治療相比減少。
75. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中每一劑量單元投予0.01-100mg，諸如0.1-1.8mg GLP-1促效劑。
76. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功 能抑制劑，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑包含於視情況包含一或多種其他賦形劑之組成物中。
77. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑由視情況包含一或多種其他賦形劑之分開醫藥組成物包含。
78. 根據前述具體實例中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該(等)組成物呈水性組成物或凍乾組成物形式。
79. 根據前述具體實例中任一項之諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該(等)組成物具有在5-10，諸如6-8範圍內之pH值。
實施例
材料與方法
GLP-1肽利拉魯肽可購得且可如WO98/08871之實施例37中所述產生。抗IL-21抗體可如WO2010/055366之實施例1中所述，例如藉由用人類IL-21或小鼠IL-21免疫接種來產生，且如其中隨後實施例中所述將中和活性特性化。
分析(I)：諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑的活體外效能
此實施例之目的為測試GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)在活體外之活性或效能。GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)之效能可如下所述測定，亦即在含有表現人類GLP-1受體之膜的培養基中環狀AMP(cAMP)之形成的刺激。
原理：將來自表現人類GLP-1受體之穩定轉染細胞系 BHK467-12A(tk-tsl3)的純化血漿膜用所討論之GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)刺激，且使用來自Perkin Elmer Life Sciences之AlphaScreenTM cAMP分析套組量測cAMP產生效能。AlphaScreen分析之基本原理為內源性cAMP與外源性添加之生物素-cAMP之間的競爭。藉由使用結合於接受體珠粒之特定抗體實現cAMP之捕捉。
細胞培養及膜製備：選擇穩定轉染之細胞系及高表現純系用於篩選。細胞在5% CO2下在DMEM、5% FCS、1% Pen/Strep(青黴素/鏈黴素)及0.5mg/ml選擇標記物G418中生長。將處於約80%匯合之細胞用PBS洗滌2次且用維爾烯(Versene)(乙二胺四乙酸四鈉鹽之水溶液)收穫，在1000rpm下離心5分鐘且移除上清液。其他步驟均在冰上進行。細胞小球藉由Ultrathurax在10ml緩衝液1(20mM Na-HEPES、10mM EDTA，pH=7.4)中均質化20-30秒，在20,000rpm下離心15分鐘且使球粒再懸浮於10ml緩衝液2(20mM Na-HEPES、0.1mM EDTA，pH=7.4)中。將懸浮液均質化20-30秒且在20,000rpm下離心15分鐘。重複緩衝液2中之懸浮、均質化及離心一次且使膜再懸浮於緩衝液2中。測定蛋白質濃度且膜儲存在-80℃下直至使用。在半區96孔平底培養盤(例如Costar目錄號：3693)中進行分析。最終體積/孔為50μl。
溶液及試劑：以下給出示例性溶液及試劑。
來自Perkin Elmer Life Sciences之AlphaScreen cAMP分析套組(目錄號：6760625M)；含有抗cAMP接受體珠粒(10U/μl)、抗生蛋白鏈菌素供體珠粒(10U/μl)及生物素標記之cAMP(133U/μl)。
AlphaScreen緩衝液，pH=7.4：50mM TRIS-HCI(Sigma，目錄 號：T3253)；5mM HEPES(Sigma，目錄號：H3375)；10mM MgCl2，6H2O(Merck，目錄號：5833)；150mM NaCI(Sigma，目錄號：S9625)；0.01% Tween(Merck，目錄號：822184)。在使用之前將以下添加至AlphaScreen緩衝液(指示最終濃度)：BSA(Sigma，目錄號：A7906)：0.1%；IBMX(Sigma，目錄號：15879)：0.5mM；ATP(Sigma，目錄號：A7699)：1mM；GTP(Sigma，目錄號：G8-877)：1μM。
cAMP標準(分析中之稀釋因子=5)：cAMP溶液：5μL 5 cAMP儲備液+495μL AlphaScreen緩衝液。
製備cAMP標準以及待測試之諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑在AlphaScreen緩衝液中之適合連續稀釋液，例如以下八個濃度之諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑：10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13及10-14M，以及例如10-6至3×10-11cAMP之系列。
膜/接受體珠粒：使用hGLP-1/BHK 467-12A膜；6微克/孔對應於0.6mg/ml(每孔使用之膜量可變化)。「無膜」：AlphaScreen緩衝液中接受體珠粒(最終15μg/ml)。「每孔6μg膜」：AlphaScreen緩衝液中膜+接受體珠粒(最終15μg/ml)。添加10μl「無膜」至cAMP標準(每孔一式兩份)及陽性及陰性對照組。添加10μl「6微克/孔膜」至GLP-1及GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)(每孔一式兩份/一式三份)。陽性對照組：10μl「無膜」+10μl AlphaScreen緩衝液。陰性對照組：10μl「無膜」+10μl cAMP儲備溶液(50μM)。因為珠粒對直接光敏感，所以任何處置均在黑暗中(儘可能黑)，或在綠光中。在冰上進行所有稀釋。
程序：1)製備AlphaScreen緩衝液。2)在AlphaScreen緩衝 液中溶解及稀釋GLP-1促效劑/cAMP標準(例如GLP-1肽/cAMP標準)。3)製備供體珠粒溶液且在室溫下培育30分鐘。4)添加cAMP/GLP-1促效劑(例如cAMP/GLP-1肽)至培養盤：每孔10μl。5)製備膜/接受體珠粒溶液且添加其至培養盤：每孔10μl。6)添加供體珠粒：每孔30μl。7)將培養盤包裏在鋁箔中且在震盪器上於室溫下培育3小時(非常緩慢)。8)在AlphaScreen上計數-在計數前每一培養盤在AlphaScreen中預培育3分鐘。EC50[pM]值可使用Graph-Pad Prism軟體(5版)計算。必要時，關於GLP-1之變化倍數可計算為EC50(GLP-1)/EC50(類似物)-3693.2。
分析(II)：小型豬中GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)之半衰期
此研究之目的為測定在向小型豬靜脈內投予之後GLP-1促效劑(例如GLP-1肽)在活體內之延長，亦即其作用時間之延長。此在藥物動力學(PK)研究中進行，其中測定所討論之諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑的終末半衰期。終半衰期一般意謂在初始分配階段之後量測之使某一血漿濃度減半所花費的時間。
將大致7-14月齡且稱重為大致16-35kg的獲自Ellegaard Göttingen小型豬(Dalmose,Denmark)之雄性Göttingen小型豬用於研究。將小型豬個別圈養且每日用SDS小型豬飲食(Special Diets Services,Essex,UK)限制性地餵養一次或兩次。在至少2週馴化之後，將兩個永久中心靜脈導管植入各動物之尾側腔靜脈或顱側腔靜脈中。在手術之後允許動物恢復1週，且接著用於給藥之間具有適合間歇期的重複藥物動力學研究。
動物在給藥前禁食大約18小時且在給藥之後禁食至少4小時，但在整個時期期間隨意取水。
諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑溶解於50mM磷酸鈉、145mM氯化鈉、0.05% tween 80 pH 7.4中，至通常20-60nmol/ml之濃度。化合物之靜脈內注射液(體積對應於通常1-2nmol/kg，例如0.033ml/kg)經由導管給出，且直至給藥後13天，在預定時間點抽取血液(較佳經由另一導管)。血液樣品(例如0.8ml)收集在EDTA緩衝劑(8mM)中且接著在4℃及1942G下離心10分鐘。將血漿吸移至乾冰上之Micronic管中，且保存在-20℃下，直至使用ELISA或類似之基於抗體之分析或LC-MS分析相應GLP-1化合物之血漿濃度。藉由非間隔模型，在WinNonlin v.5.0(Pharsight Inc.,Mountain View,CA,USA)中分析個別血漿濃度-時間特徵，且確定所得末端半衰期(調和平均值)。
分析(III)：抑制IL-21介導之STAT-3磷酸化
抗IL-21抗體中和IL-21之能力可在基於細胞之分析中使用STAT3磷酸化作為讀出值來量測。使用經IL-21受體(IL-21R)轉染之BaF3細胞且因為IL-21誘發STAT3磷酸化，所以抗IL-21抗體使磷酸化減少反映IL-21中和活性。
在含有抗體之上清液存在下鼠類IL-21活性之降低藉由量測BaF3/KZ134/hIL-21R細胞中配位體-受體相互作用後之STAT3-磷酸化程度來確定。
相對中和活性基於磷酸化STAT3含量相對於與單獨配位體一起培育之對照細胞之減少百分比來確定。將Baf3/KZ134/hIL-21R細胞以50,000個細胞/孔之密度塗鋪在96孔圓底組織培養盤中。在轉移至塗鋪細胞之前，將鼠類IL-21與來自每一測試孔之上清液一起預培育。使反應停止且 根據製造商之說明書(BIO-RAD Laboratories)使細胞溶解。收集上清液，與分析緩衝液混合且儲存。將捕捉珠粒(BIO-PLEX Phospho-STAT3 Assay，BIO-RAD Laboratories)塗鋪在96孔過濾器盤中且與細胞溶解產物樣品混合且根據製造商之說明書(BIO-RAD Laboratories)培育。添加偵測抗體(BIORAD laboratories)及抗生蛋白鏈菌素-PE且使反應物再懸浮於再懸浮緩衝液(BIO-RAD實驗室)中。磷酸化STAT3之含量在陣列讀取器(BIO-PLEX，BIO-RAD Laboratories)上根據製造商之說明書確定。溶解產物中磷酸化STAT3轉錄因子含量之增加指示小鼠IL-21受體-配位體相互作用。對於中和分析，磷酸化STAT3轉錄因子含量之減少指示mAb能夠中和IL-21受體-配位體相互作用。
分析(IV)：抑制IL-21驅動之B細胞增殖
作為功能性測試，測試抗mIL-21中和mIL-21驅動之B細胞增殖的能力。可進行同等分析以測試抗hIL-21抗體，諸如利用自健康人類志願者分離之PBMC的WO2013/164021之實施例10。關於抑制B細胞成熟之能力的進一步資訊可如WO2012/098113之實施例6中所述獲得。
材料
培養盤：U形底96孔盤(Corning Costar #3894)
完全培養基：具有GlutaMAX(目錄號61870)、0.5mM丙酮酸鈉、5ml非必需胺基酸(100x)、50μM 2-ME、Pen/Strep及10% HI FBS之RPMI
純化之抗CD40：BD#553787
純化之抗IgM：Jackson #115-006-020
CD45R(B220)微珠：Miltenyi Biotec 130-049-501
3H-胸苷：Amersham,TRK-565。
測試及對照材料
小鼠抗mIL-21 mAb，純系397.18.2.1
重組小鼠IL-21(rmIL-21)
小鼠IgG1同型(抗TNP)
小鼠B細胞自獲自6-8週齡野生型C57BL/6小鼠之脾純化。藉由迫使器官穿過70μm細胞過濾器至PBS中來製備單細胞脾細胞。B細胞藉由磁性珠粒之抗B220陽性選擇，使用磁性珠粒及AutoMACS細胞分離器(Miltenyi Biotec)，根據製造商之方案來純化。
細胞在活體外用以下刺激：a)可溶性抗IgM(1μg/mL)，b)可溶性抗CD40(1μg/mL)及c)mIL-21(25、50、100ng/mL)。在96孔盤中每孔添加105個純化之B細胞，且在37℃下在抗IL-21抗體或同型對照抗體存在下用可溶性IgM(1μg/ml)、可溶性抗CD40 IgM(1μg/mL)及rmIL-21(100ng/mL)刺激72小時。對於持續18小時之培育，將3H-胸苷添加至每一孔且在Top Counter液體閃爍計(Perkin Elmer)上量測胸苷之併入(增殖)。
結果證實抗mIL-21抗體能夠以濃度依賴性方式抑制B細胞增殖。
分析(V)：測定NOD模型中之血糖作用
此實驗之目的為確定諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及/或IL-21功能抑制劑之投予對血糖之作用。
使用近期發作之NOD小鼠模型。每週篩選小鼠兩次且糖尿病發作定義為2次連續血糖值>250mg/dL。小鼠招收至在11週齡開始之實驗且繼續招收至26週齡。基於重量給藥。
藉由使用血糖儀(Bayer Contour USB)，使用對應血糖條量測血糖。連續兩日血糖含量>250mg/dL之小鼠視為患糖尿病。當第一次觀測到高血糖時，第二天再次量測血糖。若再次量測>250mg/dL，則動物記錄為患糖尿病，招收至處理組，且進一步監測，直至其達到兩次連續讀數>600mg/dL。此時處死小鼠。若如藉由重量及/或整體外觀所確定，小鼠整體情況變差，則在小鼠達到>600mg/dL之血糖值前亦處死小鼠。若第二次量測未證實糖尿病發作(亦即<250mg/dL)，則動物留下，直至下一次常規量測，且重複上述程序。
實施例1-NOD模型中利拉魯肽與抗IL-21組合
此實驗之目的為確定抗IL-21抗體與利拉魯肽之組合對血糖之作用。測試小鼠替代抗IL-21抗體與每日利拉魯肽投予組合之短過程是否可逆轉高血糖症。小鼠替代抗IL-21抗體藉由皮下注射於佐劑混合物中之重組小鼠IL-21將6至8週齡BALB/c小鼠免疫接種來製備。重組小鼠IL-21可購得且具有序列MHKSSPQGPD RLLIRLRHLI DIVEQLKIYE NDLDPELLSA PQDVKGHCEH AAFACFQKAK LKPSNPGNNK TFIIDLVAQL RRRLPARRGG KKQKHIAKCP SCDSYEKRTP KEFLERLKWL LQKMIHQHLS(SEQ ID NO 13)。最初使用標準捕捉式樣ELISA分析來選擇結合mIL-21之抗體純系且隨後選擇如藉由上述STAT3磷酸化分析所確定，具有強中和活性之純系。
如本文中之分析(V)中所述進行實驗，其中實驗細節如下：處理組為以下：(1)未經處理；(2)抗IL-21 25mg/kg，5次投予；(3)利拉魯肽，每日1mg/kg，5週；以及(4)抗IL-21，25mg/kg，5次投予+利拉魯肽，每日1mg/kg，5週。在納入小鼠之後即刻開始，亦即自第0天起，抗IL-21經腹膜內投予五次，每週兩次。利拉魯肽於其市售組成物中皮下投予，逐漸加強，在第0天0.3mg/kg，在第1天0.6mg/kg，且接著在第2天及此後1mg/kg。在糖尿病發作後利拉魯肽處理進行0-35天；再監測血糖35天，每週兩次。小鼠替代抗IL-21為具有以下之mIgG1/κ同型：VL胺基酸序列MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQTVLIQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYM HWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAAT YYCQQWNSNPPTFGGGTKLEMK，及VH胺基酸序列MNFGPSLIFLVLILKGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFNRYSM SWVRQSPEKRLEWVAEISVGGSYTQYVDIVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSL RSEDTAMYYCARLYYSGSGDSYYYAMDYWGQGTSVTVSS。抗IL-21之儲備濃度為20mM磷酸鹽、150mM NaCl pH=7.4中11mg/ml；內毒素含量<0.01EU/mg且純度>95%且在-80℃下長期儲存。在使用之前，抗IL-21在緩衝液(20mM磷酸鹽、150mM NaCl pH=7.4)中稀釋。用於注射至動物之抗IL-21等分試樣僅僅解凍一次。結果展示在表1及圖1-2中。
表1. 在NOD模型中投予利拉魯肽及/或抗IL-21後平均血糖(mg/dL)+/-SD(標準差)(發作時每組N=10。在實驗過程中，一些動物因高血糖值(超過600mg/dL)及/或整體健康不佳而自研究移除且處死。剩餘n在表中指示)。所示時段貫穿利拉魯肽處理期(糖尿病發作後之0-35天) *)利拉魯肽僅僅在糖尿病發作後0-35天投予。
結果藉由圖1及2進一步展示，清楚地顯示組1或2中無一隻動物在70天期間存活。相比之下，處理組3及4中移除少得多之小鼠，其中組合療法最有效，因為在70天時期期間僅僅一隻小鼠自研究移除。
來自此實驗之資料表明使用抗IL-21之單治療劑處理能夠逆轉一些小鼠之高血糖症。根據先前實驗及文獻，利拉魯肽單一療法不影響進展至末期高血糖症，不過在給藥第一天，注意到血糖值顯著然而暫時性降低。僅僅當兩種治療，亦即抗IL-21及利拉魯肽組合時，幾乎所有動物均經歷持續之血糖含量標準化。有趣地，許多經處理之動物在停止服用利拉 魯肽時保持血糖量正常，表明功能β-細胞塊擴增及/或恢復。
實施例2-NOD模型中利拉魯肽與抗IL-21組合-補充資料
如實施例1中所述，繼續招收小鼠，分別添加9、8、8及8隻個體至處理組1至4。新個體之平均血糖量測包括於表2中，而完整資料集之平均血糖量測包括於表3中。
與以上個體相對比，此等資料包括3隻未經處理之小鼠，其僅僅短暫患有糖尿病(持續低BGV，直至第70天)。此不同尋常，但已觀測到在一些頻率下發生，尤其在小鼠在糖尿病發作時相對較大的情況下。經單獨抗IL-21處理之小鼠的平均BGV藉由移除三個「治癒」小鼠(具有低BGV)而影響，且因此剩餘小鼠之平均BGV高於仍然包括所有小鼠下之結果。
*利拉魯肽僅僅在糖尿病發作後0-35天投予。
#自單獨抗IL-21及利拉魯肽+抗IL-21組，在第35天獲取三隻小鼠之組織學樣品，且因此5至2及8至5之n減少不反映因高BGV或整體健康不佳而移除小鼠。
實施例3-NOD模型中利拉魯肽與抗IL-21組合-來自實例1及實例2之資料的彙集
來自實施例1及實施例2之所有資料均已彙集以提供四個處理組中總共19、18、18及18隻個體之資料，如下表中所述。
平均BGV值包括於表3中，如上。
實施例1及2之所有小鼠之平均BGV值在圖3及4中展示，再次表明在未經處理及經利拉魯肽處理之組中存活之小鼠數目極少，而實質數目之經單獨或與利拉魯肽組合之抗IL-21處理的小鼠在整個70天研究期中保持為活的。再次，此兩個組中移除三隻動物不完全與實際作用一致。
*利拉魯肽僅僅在糖尿病發作後0-35天投予。 #自單獨抗IL-21及利拉魯肽+抗IL-21組，在第35天獲取三隻小鼠之組織學樣品，且因此5至2及8至5之n減少不反映因高BGV或整體健康不佳而移除小鼠。
為評估結果，平均BGV值必須與相對於在研究期間因末期病而移除之小鼠數目，參與該研究且剩餘之小鼠數目組合。此藉由圖5之卡普蘭-梅爾曲線圖(Kaplan-Meyer plot)展示。上圖(圖5A)展示仍患糖尿病之小鼠，例如BGV超過250之小鼠之分數(百分比)且包括因BGV超過600或整體健康不佳而自該研究移除之小鼠。不出意外地，僅僅很少未經處理或經利拉魯肽處理之小鼠在35天時期期間自發地恢復。相比之下，在一半小鼠中用抗IL-21處理能夠逆轉糖尿病(將BGV降低至低於250mg/mL)，且與利拉魯肽組合，在該研究代表處理期之頭35天期間僅僅2隻 (18隻中)小鼠仍患糖尿病。
下圖(圖5B)展示相對於每一組中之n，每一處理組中藉由整個時期(70天)該研究中所剩餘之小鼠數目定義之存活率。看到抗IL-21及組合處理之n為15(且不為18)，從而解釋移除用於組織學檢查之3+3隻小鼠。再次，組合療法為有效的，因為15隻中僅僅2隻小鼠因晚期高血糖或整體不良健康而處死。亦注意到直至70天，分別僅僅3隻及0隻未經處理及經利拉魯肽處理之動物未變成晚期高血糖。
組織學檢查：在來自每一組之小鼠子集的胰臟組織上進行組織學分析。將切片用蘇木精及曙紅(H&E)染色以評估胰島炎，且用CD8及胰島素或CD4及胰島素進行免疫螢光染色以評估胰島炎，且亦將浸潤物內之細胞類型特性化。未經處理之小鼠及經利拉魯肽處理之小鼠剩餘很少的可見胰島(正如變成晚期高血糖(BGV>600mg/dL)之小鼠中所料)。來自此等小鼠之胰臟顯示嚴重細胞浸潤，而經單獨或與利拉魯肽組合之抗IL-21處理之小鼠展示浸潤程度降低。在經單獨或與利拉魯肽組合之抗IL-21處理之存活小鼠中胰島炎減少。
實例4-NOD模型中利拉魯肽與抗IL-21組合-證實研究
該研究如針對實施例1所述用處理組來進行，如下表中所述。
此處不包括詳細資料，因為整體結果與前面研究一致。
簡要描述：抗IL-21單一療法在疾病發作後頭35天成功治癒75%確定患有高血糖症之小鼠，而單獨利拉魯肽對糖尿病進展幾乎無作用，其中60%小鼠在利拉魯肽處理期結束前變成晚期高血糖，且剩餘40%在此後不久變成晚期高血糖。
然而，當抗IL-21與利拉魯肽組合投予時，此方案逆轉87%經處理小鼠中確定之高血糖症，且亦使得貫穿高血糖症發作後70天，存活與未經處理之小鼠及經單獨利拉魯肽處理之小鼠相比增強(組合療法80%存活；單獨利拉魯肽及未經處理0%存活)。抗IL-21單一療法亦提供與未經處理及經單獨利拉魯肽處理之小鼠相比增強之存活(75%)。
資料顯示在逆轉確定之糖尿病上，抗IL-21加利拉魯肽之組合療法提供與任一藥劑之單一療法相比增強之功效。對於大部分小鼠而言，甚至在停止服用利拉魯肽之後，此返回至正常血糖仍然穩定。
圖1展示在NOD模型中，個別未經處理之對照動物(上圖)及投予利拉魯肽後之個別動物(下圖)隨時間之血糖(BGV)。
圖2展示在NOD模型中，投予抗IL-21抗體後之個別動物(上圖)及投予利拉魯肽及抗IL-21抗體後之個別動物(下圖)隨時間之血糖(BGV)。
對於每種處理方案，在實驗開始時動物數目為每組10隻，然而，在實驗過程中，一些動物因血糖值高(超過600mg/dL)及/或整體健康不佳而自研究移除且處死；處死動物由「*」指示。對於圖1下圖及圖2下圖，所示時段貫穿利拉魯肽處理期(糖尿病開始後0-35天)及另外35天監測(由「停止服用利拉魯肽」指示)。
圖3及圖4類似於圖1及圖2，但包括實施例1及2中所述之研究中招收的所有動物。在圖4上，第35天「#」表示來自抗IL-21及組合處理組每一者之3隻小鼠因其他目的而處死(組織學評估)且因此未進一步監測。
圖5卡普蘭-梅爾曲線圖(Kaplan-Meier plot)-彙集來自實施例1及2之糖尿病發生率及存活率資料。每日投予利拉魯肽，歷時35天。抗IL-21投予時間安排由X軸上三角形/箭頭標記。藉由對數秩曼特-考克斯檢驗(log-rank Mantel-cox test)確定統計顯著性。僅僅展示具有顯著差異之比較的p值。所有其他比較不顯著。來自抗IL-21單一療法組之三隻動物以及來自組合組之三隻小鼠在第35天處死，進行組織學分析，且不包括於70天存活分析中。A.貫穿處理期仍然患糖尿病之小鼠的比例。B.貫穿糖尿病發作後70天的「存活」。存活定義為最終未變成高血糖(連續2天BGV600mg/dl)之彼等動物。陰影區域指示停止服用利拉魯肽。因為移除3隻小鼠用於組織學，所以處理組3及4中小鼠總數僅僅為每組15隻(且不為18隻)。
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 「mAb 5」輕鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG1同型之「mAb 5」重鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 「mAb 14」輕鏈
<400> 4
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG4同型之「mAb 14」重鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 538
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
<210> 7
<211> 369
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
<210> 8
<211> 31
<212> PRT
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<400> 8
<210> 9
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人類GLP-1之人工序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> L-組胺酸、D-組胺酸、去胺基-組胺酸、2-胺基-組胺酸、 α-羥基-組胺酸、高組胺酸、Nα-乙醯基-組胺酸、 α-氟甲基-組胺酸、α-甲基-組胺酸、3-吡啶基丙胺酸、 2-吡啶基丙胺酸或4-吡啶基丙胺酸
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-胺基環丙基)甲酸、 (1-胺基環丁基)甲酸、(1-胺基環戊基)甲酸、 (1-胺基環己基)甲酸、(1-胺基環庚基)甲酸或(1-胺基環辛基)
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (10)..(10)
<223> Val或Leu
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (12)..(12)
<223> Ser、Lys或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (13)..(13)
<223> Tyr或Gln
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (14)..(14)
<223> Leu或Met
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (16)..(16)
<223> Gly、Glu或Aib
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (17)..(17)
<223> Gln、Glu、Lys或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (19)..(19)
<223> Ala或Val
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (20)..(20)
<223> Lys、Glu或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (21)..(21)
<223> Glu或Leu
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (24)..(24)
<223> Ala、Glu或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (27)..(27)
<223> Val或Lys
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (28)..(28)
<223> Lys、Glu、Asn或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (29)..(29)
<223> Gly或Aib
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (30)..(30)
<223> Arg、Gly或Lys
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (31)..(31)
<223> Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、醯胺或不存在；其條件為若不 存在，則下游每一胺基酸殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (32)..(32)
<223> Lys、Ser、醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一 胺基酸殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (33)..(33)
<223> Ser、Lys、醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一 胺基酸殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (34)..(34)
<223> Gly、醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一胺基酸 殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (35)..(35)
<223> Ala、醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一胺基酸 殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (36)..(36)
<223> Pro、醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一胺基酸 殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (37)..(37)
<223> Pro、醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一胺基酸 殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (38)..(38)
<223> Pro、醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一胺基酸 殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (39)..(39)
<223> Ser、醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一胺基酸 殘基亦不存在
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (40)..(40)
<223> 醯胺或不存在；其條件為若不存在，則下游每一胺基酸殘基 亦不存在
<400> 9
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基於人類GLP-1之人工序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> L-組胺酸、D-組胺酸、去胺基-組胺酸、2-胺基-組胺酸、 -羥基-組胺酸、高組胺酸、Nα-乙醯基-組胺酸、α-氟甲基- 組胺酸、α-甲基-組胺酸、3-吡啶基丙胺酸、2-吡啶基丙胺酸或
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-胺基環丙基)甲酸、 (1-胺基環丁基)甲酸、(1-胺基環戊基)甲酸、(1-胺基環己基) 甲酸、(1-胺基環庚基)甲酸或
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (12)..(12)
<223> Ser、Lys或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (16)..(16)
<223> Gly、Glu或Aib
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (17)..(17)
<223> Gln、Glu、Lys或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (20)..(20)
<223> Lys、Glu或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (24)..(24)
<223> Ala、Glu或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (28)..(28)
<223> Lys、Glu或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (29)..(29)
<223> Gly或Aib
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (30)..(30)
<223> Arg或Lys
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (31)..(31)
<223> Gly、Ala、Glu或Lys
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (32)..(32)
<223> Lys、醯胺或不存在
<400> 10
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<211> 130
<212> PRT
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<220>
<223> 重組小鼠IL-21
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<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠替代抗IL-21之VL胺基酸序列為mIgG1/κ同型
<400> 12
<210> 13
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠替代抗IL-21之VH胺基酸序列為mIgG1/κ同型
<400> 13
<210> 14
<211> 145
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗IL-21抗體之一部分，SEQ ID No 29
<400> 14
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗IL-21抗體之一部分，SEQ ID No 31
<400> 15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗IL-21抗體之一部分，SEQ ID No 33
<400> 16
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗IL-21抗體之一部分，SEQ ID No 35
<400> 17
<210> 18
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗IL-21抗體之一部分，SEQ ID No 37
<400> 18
<210> 19
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗IL-21抗體之一部分，SEQ ID No 39
<400> 19
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗IL-21抗體之一部分，SEQ ID No 41
<400> 20
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗IL-21抗體之一部分，SEQ ID No 43
<400> 21
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 22

Claims (15)

  1. 一種GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其用於治療及/或預防1型糖尿病之方法中。
  2. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑為能夠特異性結合IL-21之抗體。
  3. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑結合於a. 人類IL-21之螺旋1及3或b. 人類IL-21之螺旋2及4。
  4. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑結合於IL-21上之不連續抗原決定基，其中該抗原決定基包含如SEQ ID NO 1中所闡述之胺基酸I37至Y52及N92至P108。
  5. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑結合於如藉由SEQ ID NO 1所定義之IL-21之R34、R38、Q41以及K102與R105之一中的至少一者。
  6. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑包含a. 如SEQ ID NO 2中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 3中所闡述之三個CDR序列或b. 除了重鏈CDR1為TYGMH外，如SEQ ID NO 2中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 3中所闡述之三個CDR序列 c. 如SEQ ID NO 4中所闡述之三個CDR序列及如SEQ ID NO 5中所闡述之三個CDR序列。
  7. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該IL-21功能抑制劑以107M-1或更大、108M-1或更大、109M-1或更大、1010M-1或更大、1010M-1或更大或1012M-1或更大之結合親和力特異性結合於IL-21。
  8. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑為GLP-1肽。
  9. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑為GLP-1衍生物。
  10. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑為結合白蛋白之GLP-1衍生物，諸如脂肪酸GLP-1衍生物。
  11. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑為GLP-1肽，其中白蛋白結合部分經由Lys殘基，諸如選自GLP-1(7-37)之殘基23、26、34、36或38之Lys殘基附接。
  12. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑為利拉魯肽(liraglutide)。
  13. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑同時或依序投予。
  14. 根據前述申請專利範圍中任一項之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑，其中該GLP-1促效劑及該IL-21功能抑制劑包含於視情況包含一或多種 其他賦形劑之組成物中。
  15. 一種治療及/或預防1型糖尿病之方法，其包含向有需要之患者投予有效量之諸如GLP-1肽之GLP-1促效劑及IL-21功能抑制劑。
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