DE60133301T2

DE60133301T2 - Behandlungsverfahren mit wisp-polypeptiden

Info

Publication number: DE60133301T2
Application number: DE60133301T
Authority: DE
Inventors: Luc San Francisco DESNOYER; Ellen H. San Francisco FILVAROFF; Diane Burlingame Pennica
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-10-16
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2021-10-13
Also published as: AU2437702A; IL155279A0; ES2304401T3; ATE456655T1; EP2180053A2; ES2338492T3; EP2180053B1; IL200484A; JP2004534720A; CA2425145C; JP4202128B2; DE60133301D1; EP1326980A2; US20050054563A1; WO2002033085A3; US8138152B2; IL155279A; ES2381935T3; EP1326980B1; WO2002033085A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren der Verwendung von WISP-Polypeptiden in der Behandlung degenerativer Knorpelerkrankungen und verschiedener mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehender Krankheiten.
Hintergrund der Erfindung
Der Bindegewebe-Wachstumsfaktor (CTGF) ist ein Wachstumsfaktor, der durch viele Faktoren, unter anderem TGF-β, in Fibroblasten induziert wird und für die Fähigkeit von TGF-β, verankerungsunabhängiges Wachstum (AIG), eine Eigenschaft transformierter Zellen, zu induzieren, essentiell ist. CTGF wurde in einem Versuch der Identifikation des Dimertyps des aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktors (PDGF), der im Wachstumsmedium gezüchteter Endothelzellen vorhanden war, entdeckt und ist immunologisch und biologisch mit PDGF verwandt. Siehe US-Patent Nr. 5.408.040 . CTGF wirkt auch für Zellen mitogen und chemotaktisch, und daher wird von Wachstumsfaktoren dieser Familie angenommen, dass sie eine Rolle in der/dem normalen Entwicklung, Wachstum und Reparatur von menschlichem Gewebe spielen.
Sieben Proteine, die mit CTGF verwandt sind, unter anderem das Hühner-Ortholog für Cyr61, CEF10, menschlicher, Maus- und Xenopus-laevis-CTGF sowie menschlicher, Hühner- und Xenopus-laevis-Nov, wurden isoliert, kloniert, sequenziert und als zur CCN-Genfamilie gehörig beschrieben. Oemar und Luescher, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1483–1489 (1997). Von dem für Cyr61 kodierenden Gen wurde herausgefunden, dass es die Angiogenese, das Tumorwachstum und die Gefäßbildung förderte. Babic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6355–6360 (1998). Das nov-Gen wird in der Niere im Wesentlichen im Embryonalstadium exprimiert, und Veränderungen der nov-Expression im Verhältnis zur normalen Niere wurden sowohl in Vogel-Nephroblastomen als auch in menschlichen Wilms-Tumoren detektiert. Martinerie et al., Oncogene 9, 2729–2732 (1994). Wt1 reguliert die menschliche nov-Expression herab, wobei diese Herabregulierung ein Schlüsselelement in der normalen und der Tumor-Nephrogenese darstellt. Martinerie et al., Oncogene 12, 1479–1492 (1996). Es wurde vor kurzem vorgeschlagen, dass die CTGF-, nov- und cyr61-Gene, die für sekretierte Proteine kodieren, die konservierte Sequenzen und IGFBP-Motive in ihren N-Termini enthalten und IGFs mit niedriger Affinität binden, mehr Mitglieder der IGFBP-Überfamilie darstellen, und zwar zusammen mit dem niedrigaffinen mac25/IGFBP-7 (Yamanaka et al., J. Biol. Chem. 272, 30729–30734 (1997)) und den hochaffinen IGFBPs 1–6. CTGF würde diesem Vorschlag entsprechend IGFBP-8 genannt werden. Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12981–12986 (1997).
Die unterschiedlichen Mitglieder der CCN-Familie stehen in Wechselwirkung mit verschiedenen löslichen oder matrixassoziierten Makromolekülen, insbesondere mit sulfatierten Glycokonjugaten (Holt et al., J. Biol. Chem. 265, 2852–2855 (1990)). Diese Wechselwirkung wurde verwendet, um Cyr61 und CTGF durch Affinitätschromatographie auf Heparin-Agarose zu reinigen (Frazier et al., J. Invest. Dermatol. 107, 404–411 (1996); Kireeva et al., Mol. Cell. Biol. 16, 1326–1334 (1996)). Cyr61 wird sekretiert und aufgrund seiner Affinität für Heparansulfat sowohl mit der extrazellulären Matrix als auch mit der Zelloberfläche assoziiert (Yang et al., Cell. Growth Diff. 2, 351–357 (1991)).
Vor kurzem wurde ein Protein in der ELM1 genannten Maus gefunden, das in niedrigmetastatischen Zellen exprimiert wird. Hashimoto et al., J. Exp. Med. 187, 289–296 (1998). Das elm1-Gen, ein Maus-Homolog des unten stehend offenbarten WISP-1, ist ein anderes Mitglied von CTGF, Cyr61/Cef10, und der Neuroblastomüberexprimierten Genfamilie und unterdrückt in vivo das Tumorwachstum und die Metastase von murinen K-1735-Melanomzellen. Ein weiterer neuerer Artikel über rCop-1, das unten beschriebene Ratten-Ortholog von WISP-2, beschreibt den Verlust der Expression dieses Gens nach der Zelltransformation. Zhang et al., Mol. Cell. Biol. 18, 6131–6141 (1998).
CCN-Familienmitglieder (mit Ausnahme von nov) sind unmittelbare frühe auf Wachstum reagierende Gene, von denen angenommen wird, dass sie die Zellproliferation, -differenzierung, Embryogenese und Wundheilung regulieren. Die Sequenzhomologie unter Mitgliedern der CCN-Genfamilie ist etwas hoch; Funktionen dieser Proteine in vitro reichen jedoch von wachstumsstimulierend (d. h. menschlicher CTGF) bis zu wachstumsinhibierend (d. h. Hühner-nov und möglicherweise auch hCTGF). Weiters gibt es bei manchen Molekülen, die homolog zu CTGF sind, Hinweise auf einen Nutzen in der Prävention von Desmoplasie, der Bildung hochgradig zellulärer, übermäßiger Bindegewebestroma, die mit manchen Krebsarten assoziiert sind, und fibrotischer Läsionen, die mit verschiedenen Hauterkrankungen, wie z. B. Scleroderma, Keloiden, eosinophiler Fasziitis, nodularer Fasziitis und Dupuytren-Kontrakturen, assoziiert sind. Weiters wurde die CTGF-Expression vor kurzem im fibrösen Stroms von Mammatumoren gezeigt, was darauf hindeutet, dass die Krebsstroms-Bildung die Induktion ähnlicher fibroproliferativer Wachstumsfaktoren als Wundreparatur umfasst. Menschlicher CTGF wird auch in sehr hohen Ausmaßen in fortgeschrittenen atherosklerotischen Läsionen exprimiert, jedoch nicht in normalen Arterien, was auf eine mögliche Rolle bei Atherosklerose hinweist. Oemar und Luescher, s. o.
Wnts werden von einer großen Gen-Familie kodiert, deren Mitglieder in Rundwürmern, Insekten, Knorpelfischen und Wirbeltieren gefunden wurden. Holland et al., Dev. Suppl., 125–133 (1994). Von Wnts wird angenommen, dass sie in einer Reihe entwicklungsbedingter und physiologischer Prozesse funktionieren, da viele unterschiedliche Spezies mehrere konservierte Wnt-Gene aufweisen. McMahon, Trends Genet. 8, 236–242 (1992); Nusse und Varmus, Cell 69, 1073–1087 (1992). Wnt-Gene kodieren für sekretierte Glykoproteine, von denen angenommen wird, dass sie als parakrine oder autokrine Signale funktionieren, die in mehreren primitiven Zelltypen aktiv sind. McMahon, s. o. (1992); Nusse und Varmus, s. o. (1992). Die Wnt-Wachstumsfaktor-Familie umfasst mehr als zehn Gene, die in der Maus identifiziert wurden (Wnt-1, -2, -3A, -3B, -4, -5A, -5B, -6, -7A, -7B, -8A, -8B, -10B, -11, -12 und -13) (siehe z. B. Gavin et al., Genes Dev. 4, 2319–2332 (1990); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2268–2272 (1995); Christiansen et al., Mech. Dev. 51, 341–350 (1995)), und zumindest neun Gene, die im Menschen (Wnt-1, -2, -3, -5A, -7A, -7B, -8B, -10B und -11) durch cDNA-Klonierung identifiziert wurden. Siehe z. B. Vant Veer et al., Mol. Cell. Biol. 4, 2532–2534 (1984).
Das Wnt-1-Proto-Oncogen (int-1) wurde ursprünglich aus Mammatumoren identifiziert, die durch das Maus-Mamma-Tumor-Virus (MMTV) aufgrund einer Insertion viriler DNA-Sequenz induziert wurden. Nusse und Varmus, Cell 31, 99–109 (1982). Bei erwachsenen Mäusen wird das Expressionsausmaß von Wnt-1-mRNA nur in den Hoden während der späteren Stadien der Sperma-Entwicklung detektiert. Wnt-1-Protein umfasst etwa 42 KDa und enthält eine aminoterminale hydrophobe Region, die als Signalsequenz zur Sekretion fungieren kann (Nusse und Varmus, s. o. (1992)). Die Expression von Wnt-2/irp wird in fötalen und erwachsenen Maus-Geweben detektiert, und seine Verteilung überlappt nicht mit dem Expressionsmuster von Wnt-1. Wnt-3 ist mit der Maus-Mamma-Tumorgenese assoziiert. Die Expression von Wnt-3 in Maus-Embryos wird in den Neuralrohren und den Extremitätenknospen detektiert. Wnt-5a-Transkripte werden in den sich entwickelnden Vorder- und Hinter-Extremitäten an den Tagen 9,5 bis 14,5 detektiert, und die höchsten Ausmaße sind im apikalen Ektoderm an der distalen Spitze der Extremitäten konzentriert. Nusse und Varmus, s. o. (1992). Vor kurzem wurde ein Wnt-Wachstumsfaktor, genannt Wnt-x, zusammen mit der Detektion der Wnt-x-Expression in Knochengeweben und von Knochen abstammenden Zellen beschrieben ( WO 95/17416 ). Es wurde auch die Rolle von Wnt-x im Erhalt reifer Osteoblasten und die Verwendung des Wnt-x-Wachstumsfaktors als therapeutisches Mittel oder in der Entwicklung anderer therapeutischer Mittel zur Behandlung von mit den Knochen in Verbindung stehenden Erkrankungen beschrieben.
Wnts kann eine Rolle in der lokalen Zellsignalisierung spielen. Biochemische Studien haben gezeigt, dass viel des sekretierten Wnt-Proteins in Assoziation mit der Zelloberfläche oder der extrazellulären Matrix gefunden werden kann anstatt frei diffusionsfähig im Medium. Papkoff und Schryver, Mol. Cell. Biol. 10, 2723–2730 (1990); Bradley und Brown, EMBO J. 9, 1569–1579 (1990).
Mutationsstudien in Wnt-Genen haben auf eine Rolle für Wnts in der Wachstumskontrolle und der Gewebe-Musterung hingewiesen. Bei Drosophila kodiert wingless (wg) für ein Wnt-verwandtes Gen (Rijsewik et al., Cell 50, 649–657 (1987)), und wg-Mutationen verändern das Muster des embryonalen Ektoderms, der Neurogenese und des Auswuchses des imaginalen Diskus. Morata und Lawerence, Dev. Biol. 56, 227–240 (1977); Baker, Dev. Biol. 125, 96–108 (1988); Klingensmith und Nusse, Dev. Biol. 166, 396–414 (1994). Bei Caenorhabditis elegans kodiert lin-44 für ein Wnt-Homolog, das für asymmetrische Zellteilungen erforderlich ist. Herman und Horvitz, Development 120, 1035–1047 (1994). Knock-out-Mutationen bei Mäusen haben gezeigt, dass Wnts entscheidend für die Entwicklung des Gehirns sind (McMahon und Bradley, Cell 62, 1073–1085 (1990); Thomas und Cappechi, Nature 346, 847–850 (1990)) sowie für den Auswuchs der embryonalen Primordia für Nieren (Stark et al., Nature 372, 679–683 (1994)), Schwanzknospe (Takada et al., Genes Dev. 8, 174–189 (1994)) und Extemitätenknospen. Parr und McMahon, Nature 374, 350–353 (1995). Eine Überexpression von Wnts in der Brustdrüse kann zu Brust-Hyperplasie führen (McMahon, s. o. (1992); Nusse und Varmus, s. o. (1992)) sowie zu frühzeitiger alveolarer Entwicklung. Bradbury et al., Dev. Biol. 170, 553–563 (1995).
Wnt-5a und Wnt-5b werden im hinteren und im lateralen Mesoderm und im extraembryonalen Mesoderm des 7–8 Tage alten murinen Embryos exprimiert. Gavin et al., s. o. (1990). Diese embryonalen Domänen sind Bestandteile der AGM-Region und von Dottersackgeweben, von denen multipotente hämatopoetische Vorläufer und HSCs abstammen. Dzierzak und Medvinsky, Trends Genet. 11, 359–366 (1995); Zon et al., in: Gluckman und Coulombel (Hrsg.), Colloque, INSERM 235, 17–22 (1995), vorgestellt im Rahmen des Joint International Workshop an Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failure, Paris, Frankreich (3.–6. April 1995); Kanatsu und Nishikawa, Development 122, 823–830 (1996). Wnt-5a, Wnt-10b und andere Wnts wurden in Extremitätenknospen detektiert, was auf mögliche Rollen in der Entwicklung und Musterung der frühen Knochen-Mikroumgebung hindeutet, wie für Wnt-7b gezeigt wird. Gavin et al., s. o. (1990); Christiansen et al., Mech. Devel. 51, 341–350 (1995); Parr and McMahon, s. o. (1995).
Der Wnt/Wg-Signalübertragungsweg spielt eine wichtige Rolle in der biologischen Entwicklung des Organismus und wurde mit mehreren menschlichen Krebsarten in Verbindung gebracht. Dieser Weg inkludiert auch das Tumor-Suppressor-Gen, APC. Mutationen im APC-Gen sind mit der Entwicklung sporadischer und vererbter Formen von menschlichem Kolorektalkrebs assoziiert. Das Wnt/Wg-Signal führt zur Akkumulierung von β-Catenin/Armadillo in der Zelle, was zur Bildung eines zweigeteilten Transkriptionskomplexes führt, der aus β-Catenin und einem Mitglied der Lymphoid-Enhancer-Bindungsfaktor/T-Zellen-Faktor-(LEF/TCF-)HMG-Box-Transkriptionsfaktor-Familie besteht. Dieser Komplex verlagert sich zum Nucleus, wo er die Expression von Genen stromab des Wnt/Wg-Signals, wie z. B. die Engrailed- und Ultrabithorax-Gene in Drosophila, aktivieren kann.
Für eine Beschreibung von Wnt siehe Cadigan und Nusse, Genes & Dev. 11, 3286–3305 (1997).
Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 14717–14722 (1998), beschreiben die Klonierung und Charakterisierung von zwei Genen, WISP-1 und WISP-2, die in der Maus-Mammaepithel-Zelllinie C57MG, transformiert durch Wnt-1, hinaufreguliert wurden, sowie ein drittes verwandtes Gen, WISP-3. Pennica et al. berichten, dass sich diese WISP-Gene stromab des Wnt1-Signals befinden können und dass abnormale Ausmaße einer WISP-Expression bei Colon-Krebs eine Rolle in der Colon-Tumorgenese spielen können. WISP-1 wurde vor kurzem als ein β-Cateninreguliertes Gen identifiziert, und die Charakterisierung seiner onkogenen Aktivität zeigte, dass WISP-1 zu einer β-Catenin-vermittelten Tumorgenese beitragen könnte (Xu et al., Gene & Develop. 14, 585–595 (2000)). Eine WISP-1-Überexpression in normalen Ratten-Nierenzellen (NRK-49F) induzierte eine morphologische Transformation, ein beschleunigtes Zellwachstum und eine verbesserte Sättigungsdichte. Zusätzlich dazu bilden diese Zellen leicht Tumoren, wenn sie in Nacktmäuse injiziert werden, was darauf hindeutet, dass WISP-1 eine Rolle in der Tumorgenese spielen könnte (Xu et al., s. o. (2000)).
Hurvitz et al., Nature Genetics 23, 94–97 (1999), beschreiben eine Studie, die WISP3 involviert, in der bei neun verschiedenen Mutationen von WISP3 bei nicht verwandten Individuen eine Assoziation mit der autosomal-rezessiven Skeletterkrankung, progressiver pseudorheumatoider Dysplasie (PPD), zu finden war. Die WISP3-Expression durch RT-PCR wurde von Hurvitz et al. in menschlichen Synoviozyten, in Gelenksknorpel-Chondrozyten und in von Knochenmark abstammenden mesenchymalen Vorläuferzellen beobachtet.
Die PCT-Anmeldung WO 98/21236 , veröffentlicht am 22. Mai 1998, offenbart ein menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor-Gen 3 (CTGF-3), das für ein 26-kD-Mitglied der Wachstumsfaktor-Überfamilie kodiert. WO 98/21236 offenbart, dass die CTGF-3-Aminosäuresequenz von einem menschlichen Osteoblasten-cDNA-Klon abgeleitet wurde und dass CTGF-3 in mehreren Geweben exprimiert wurde, wie z. B. in den Eierstöcken, in den Hoden, im Herzen, in der Lunge, in Skelettmuskeln, im Nebennierenmark, in der Nebennierenrinde, in der Thymusdrüse, in der Prostata, im Dünndarm und im Colon.
Mehrere Forscher haben in Neoplasmen Veränderungen in der Proteoglycan-Zusammensetzung dokumentiert. Insbesondere eine deutliche Produktion an Chondroitinsulfatproteoglycan ist ein bei einer Reihe maligner Tumoren ausführlich beschriebenes Phänomen. Zusätzlich dazu wurde von der Expression von Decorin, einem Dermatansulfat enthaltenden Proteoglycan, gezeigt, dass es in engem Zusammenhang mit der Malignität bei menschlichen Karzinomen steht (Adany et al., J. Biol. Chem. 265, 11389–11396 (1990); Hunzlemann et al., J. Invest. Dermatol. 104, 509–513 (1995)). Es wurde vor kurzem gezeigt, dass Decorin das Wachstum mehrerer Karzinome unterdrückt (Santra (1997)). Obwohl die Funktion von Decorin in der onkogenen Entwicklung noch nicht vollständig geklärt ist, wurde vorgeschlagen, dass die Decorin-Expression im peritumorösen Stroms eine regionale Antwort der Bindegewebezellen des Wirts auf die eindringenden neoplastischen Zellen darstellen könnte (Ständer et al., Gene Therapy 5, 1187–1194 (1999)).
Für einen kürzlich erstellten Überblick verschiedener Mitglieder der Bindegewebe-Wachstumsfaktor/cysteinreichen 61/Nephroblastom-überexprimierten(CNN-)Familie und ihrer jeweiligen Eigenschaften und Aktivitäten siehe Brigstock, Endocrine Reviews 20, 189–206 (1999).
Degenerative Knorpelerkrankungen beschreiben in großen Zügen eine Reihe an Erkrankungen, die durch Degeneration oder durch Stoffwechselanomalien der Bindegewebe gekennzeichnet sind, die sich durch Schmerzen, Steifheit und Einschränkung der Bewegung der betroffenen Körperteile manifestieren können. Der Ursprung dieser Erkrankungen kann z. B. pathologisch sein oder aber das Resultat eines Traumas oder einer Verletzung.
Osteoarthritis (OA), auch bekannt als Osteoarthrose oder degenerative Gelenkserkrankung, ist typischerweise das Resultat einer Reihe lokalisierter degenerativer Prozesse, welche die Gelenkstruktur beeinträchtigen und zu Schmerzen und verringerter Funktion führen. OA wird oft von einer lokalen Entzündungskomponente begleitet, welche die Gelenkszerstörung beschleunigen kann. OA ist durch eine Zerstörung der glatten Gelenksknorpeloberfläche mit einem frühen Verlust an Proteoglycanen (PG) und Kollagenen charakterisiert, gefolgt von der Bildung von Spalten und Fibrillation und schließlich von einem Knorpelverlust voller Dicke. OA-Symptome umfassen lokale Schmerzen in den betroffenen Gelenken, besonders nach Beanspruchung. Mit dem Fortschreiten der Krankheit können die Symptome zu einem kontinuierlichen Schmerzgefühl, lokalem Unwohlsein und kosmetischen Veränderungen, wie z. B. Deformierungen des betroffenen Gelenks, fortschreiten.
Im Gegensatz zum lokalisierten Wesen von OA ist Gelenkrsheumatismus (RA) eine systemische, entzündliche Erkrankung, die wahrscheinlich im Synovium, den Geweben, die den Gelenkraum umgeben, beginnt. RA ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die durch symmetrische Synovitis des Gelenks charakterisiert ist und typischerweise kleine und große diarthroidale Gelenke betrifft und zu ihrer progressiven Zerstörung führt. Mit dem Fortschreiten der Erkrankung können die Symptome von RA auch Fieber, Gewichtsverlust, Dünnerwerden der Haut, eine Involvierung mehre rer Organe, Skleritis, Hornhautgeschwüre, die Bildung subkutaner oder subperiostealer Knötchen und vorzeitigen Tod umfassen. Während sich die Ursache(n) oder Ursprünge von RA und OA grundlegend unterscheiden, scheinen die in die Zerstörung des Knorpels involvierten Zytokine und Enzyme ähnlich zu sein.
Von Peptid-Wachstumsfaktoren wird angenommen, dass sie wichtige Regulatoren von Knorpelwachstum und Knorpelzellen-(Chondrozyten-)Verhalten (d. h. Differenzierung, Migration, Teilung und Matrixsynthese oder Zersetzung) sind. F. S. Chen et al., Am. J. Orthop. 26, 396–406 (1997). Wachstumsfaktoren, bei denen zuvor eine Stimulierung der Knorpelreparatur vorgeschlagen wurde, umfassen den insulinartigen Wachstumsfaktor (IGF-1), Osborn, J. Orthop. Res. 7, 35–42 (1989); Florini & Roberts, J. Gerontol. 35, 23–30 (1980); den basischen Wachstumsfaktor (bFGF), Toolan et al., J. Biomec. Mat. Res. 41, 244–50 (1998); Sah et al., Arch. Biochem. Biophys. 308, 137–47 (1994); das morphogenetische Knochenprotein (BMP), Sato & Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183, 180–87 (1984); Chin et al., Arthritis Rheum. 34, 314–24 (1991), sowie den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), Hill & Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4, 45–68 (1992); Guerne et al., J. Cell Physiol. 158, 476–84 (1994); Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis. 51, 643–47 (1992).
Der insulinartige Wachstumsfaktor (IGF-1) stimuliert sowohl die Matrix-Synthese als auch die Zellproliferation in der Kultur, K. Osborn, J. Orthop. Res. 7, 35–42 (1989), und die Insuffizienz von IGF-1 könnte eine ätiologische Rolle in der Entwicklung von Osteoarthritis spielen. R. D. Coutts et al., Instructional Course Lect. 47, 487–94, Amer. Acad. Orthop. Surg. Rosement, IL (1997). Manche Studien zeigen, dass Serum-IGF-1-Konzentrationen bei osteoarthritischen Patienten niedriger sind als bei Kontrollgruppen, während andere Studien keinen Unterschied fanden. Trotzdem verringern sich sowohl Serum-IGF-1-Spiegel als auch die Chondrozyten-Reaktionsfähigkeit auf TGF-1 mit dem Alter. J. R. Florini & S. B. Roberts, J. Gerontol. 35, 23–30 (1980). Daher kann sowohl die verringerte Verfügbarkeit von IGF-1 als auch die verringerte Chondrozyten-Reaktionsfähigkeit auf IGF-1 zu einer Knorpel-Homöostase beitragen und mit fortschreitendem Alter zu einer Degeneration führen.
IGF-1 wurde für die Präventionsbehandlung von Osteoarthritis vorgeschlagen. Die intraartikuläre Verabreichung von IGF-1 in Kombination mit Natriumpentosanpolysulfat (einem katabolischen Chondrozyten-Aktivitätsinhibitor) führte zu einer verbesserten histologischen Erscheinung und beinahe normalen Mengen an degenerativen Enzymen (neutrale Metalloproteinasen und Kollagenase), Gewebeinhibitoren von Metalloproteinase und Matrix-Kollagen. R. A. Rogachefsky et al., Ann. NY Acad. Sci. 732, 889–95 (1994). Die Verwendung von IGF-1, entweder alleine oder als ein Adjuvans mit anderen Wachstumsfaktoren, zur Stimulierung der Knorpelregeneration wurde in WO 91/19510 , WO 92/13565 , US 5.444.047 und EP 434.652 beschrieben.
Morphogenetische Knochenproteine (BMPs) sind Mitglieder der großen Wachstumsfaktor-Familie der transformierenden Wachstumsfaktoren β (TGF-β). In-vitro- und In-vivo-Studien haben gezeigt, dass BMP die Differenzierung von Mesenchym-Zellen zu Chondrozyten induziert. K. Sato & M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183, 180–87 (1984). Weiters besitzen der Skelett-Wachstumsfaktor und von Knorpeln abstammende Wachstumsfaktoren synergistische Wirkungen mit BMP, da die Kombination dieser Wachstumsfaktoren mit BMP und Wachstumshormon die mesenchymale Zelldifferenzierung initiiert. Die anschließende Proliferation der differenzierten Zellen wird von anderen Faktoren stimuliert. D. J. Hill & A. Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4, 45–68 (1992).
Der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) wird von Osteoblasten, Chondrozyten, Plättchen, aktvierten Lymphozyten und anderen Zellen produziert. R. D. Coutts et al., s. o. TGF-β kann sowohl stimulierende als auch inhibierende Eigenschaften auf die Matrixsynthese und die Zellproliferation aufweisen, in Abhängigkeit von der Target-Zelle, der Dosierung und den Zellkulturbedingungen. P. Guerne et al., J. Cell Physiol. 158, 476–84 (1994); H. Van Beuningen et al., Ann. Rheum. Dis. 52, 185–91 (1993); P. Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis. 51, 643–47 (1992). Weiters verringert sich mit dem Alter, wie mit IGF-1, die TGF-β-Reaktionsfähigkeit. P. Guerne et al., J. Cell Physiol. 158, 476–84 (1994). TGF-β ist jedoch ein stärkerer Stimulator der Chondrozytenproliferation als andere Wachstumsfaktoren, unter anderem der aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktor (PDGF), bFGF und IGF-1 (Guerne et al., s. o.), und kann die Proteoglycanproduktion durch Chondrozyten stimulieren. TGF-β reguliert auch die Wirkungen von Zytokinen herab, welche den Chondrozyten-Katabolismus stimulieren, Van der Kraan et al., s. o. In vivo induziert TGF-β die Proliferation und Differenzierung mesenchymaler Zellen in Chondrozyten und verstärkt die Reparatur von Defekten partieller Dicke bei Kaninchen-Gelenksknorpeln. E. B. Hunziker & L. Rosenberg, Trans. Orthopaed. Res. Soc. 19, 236 (1994).
Während sich manche Forscher auf die Verwendung gewisser Wachstumsfaktoren zur Reparatur von Knorpel- oder Chondrozyten-Gewebe spezialisiert haben, haben sich andere mit der Inhibierung der Aktivität von Molekülen beschäftigt, die eine Knorpelzerstörung induzieren und/oder die Matrixsynthese inhibieren. Eines dieser Moleküle ist das Zytokin IL-1α, das nachteilige Wirkungen auf mehrere Gewebe innerhalb des Gelenks hat, unter anderem die Entstehung einer synovialen Entzündung und die Hinauf-Regulierung von Matrix-Metalloproteinasen- und Prostaglandin-Expression. V. Baragi et al., J. Clin. Invest. 96, 2454–60 (1995); V. M. Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage 5, 275–82 (1997); C. H. Evans et al., J. Keukoc. Biol. 64, 55–61(1998); C. H. Evans und P. D. Robbins, J. Rheumatol. 24, 2061–63 (1997); R. Kang et al., Biochem. Soc. Trans. 25, 533–37 (1997); R. Kang et al., Osteoarthritis Cartilage 5, 139–43 (1997). Ein Mittel zur Antagonisierung von IL-1α ist durch Behandlung mit löslichem IL-1-Rezeptor-Antagonist (IL-1ra), einem natürlich auftretenden Protein, das IL-1 an der Bindung an seinen Rezeptor hindert, wodurch sowohl direkte als auch indirekte Wirkungen von IL-1 auf den Knorpel inhibiert werden. Bei Säugetieren kann nur eine Protease, nämlich Interleukin-1β-Konvertase (ICE), spezifisch reifes aktives IL-1α erzeugen. Es wurde gezeigt, dass die Inhibierung von ICE die IL-1α-Produktion blockiert und die arthritische Degeneration verlangsamen kann (zusammengefasst in J. Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4, d694–703). Vom löslichen IL-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1ra), einem natürlich auftretenden Protein, das die Wirkungen von IL-1 inhibieren kann, indem es IL-1 an der Wechselwirkung mit Chondrozyten hindert, wurde ebenfalls gezeigt, dass er in Tiermodellen von Arthritis wirksam ist, und wird momentan am Menschen auf seine Fähigkeit, das Auftreten oder die Progression von Arthritis zu verhindern, getestet. Andere Zytokine, wie z. B. IL-1β, der Tumornekrosefaktor α, Interferon γ, IL-6 und IL-8, wurden mit einer erhöhten Aktivierung von synovialen fibroblastenartigen Zellen, Chondrozyten und/oder Makrophagen in Verbindung gebracht. Die Inhibierung dieser Zytokine kann einen therapeutischen Nutzen in der Prävention von Entzündungen und Knorpelzerstörung haben. Bei Molekülen, welche die TNF-α-Aktivität inhibieren, wurden vorteilhafte Wirkungen auf die Gelenke von Patienten mit Gelenksrheumatismus gezeigt.
Es wird angenommen, dass eine Knorpelmatrix-Degeneration auf eine Spaltung von Matrix-Molekülen (Proteoglycanen und Kollagenen) durch Proteasen zurückzuführen ist (zusammengefasst in J. F. Woessner Jr., Proteases of the extracellular matrix, in: V. Mow, A. Ratcliffe (Hrsg.), Structure and Function of Articular Cartilage, CRC Press, Boca Raton, FL (1994), und R. L. Smith, Front. In Biosci. 4, d704–712). Während die in den Matrix-Zerfall involvierten Schlüsselenzyme noch nicht klar identifiziert wurden, scheinen Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und „Aggrecanasen" bei der Gelenkszerstörung eine Schlüsselrolle zu spielen. Zusätzlich dazu können auch Mitglieder der Serin- und der Cystein-Familie an Proteinasen (z. B. die Cathepsine und der Urokinase- oder Gewebeplasminogen-Aktivator (uPA und tPA)) involviert sein. Plasmin, Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) und Gewebeplasminogen-Aktivator (tPA) können eine wichtige Rolle im Aktivierungsweg der Metalloproteinasen spielen. Beweise verbinden die eng verwandte Gruppe von Cathepsin B, L und S mit dem Matrix-Zerfall, und diese Cathepsine sind bei OA etwas erhöht. Viele Zytokine, unter anderem IL-1, TNF-α und LIF, induzieren die MMP-Expression in Chondrozyten. Die Induktion von MMPs kann durch TGF-β und IL-4 antagonisiert werden und, zumindest bei Kaninchen, durch FGF und PDGF potenziert werden. Wie durch Tierstudien gezeigt wird, können Inhibitoren dieser Proteasen (MMPs und Aggrecanasen) das Gelenksgewebe in vivo zumindest partiell vor Schaden schützen.
Stickstoffoxid (NO) kann in der Zerstörung von Knorpeln auch eine wesentliche Rolle spielen. Ashok et al., Curr. Opin. Rheum. 10, 263–268 (1998). Im Gegensatz zu normalem Knorpelgewebe, das kein NO produziert, es sei denn, es wird mit Zytokinen, wie z. B. IL-1, stimuliert, produziert Knorpelgewebe, das von osteoarthritischen Gelenken erhalten wurde, über einen Zeitraum von 3 Tagen in Kultur große Mengen an Stickstoffoxid, und zwar trotz der Abwesenheit hinzugefügter Stimuli. Weiters wurde gezeigt, dass die Inhibierung der NO-Produktion die IL-1-vermittelte Knorpelzerstörung und den Chondrozyten-Tod sowie das Fortschreiten von Osteoarthritis in Tiermodellen verhinderte.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Anmelder haben überraschenderweise herausgefunden, dass WISP-Polypeptide nützliche Aktivitäten, wie z. B. die Fähigkeit der Stimulation oder Verbesserung der Chondrozytendifferenzierung oder -proliferation, aufweisen, und daher können WISP-Polypeptide in der Behandlung, der Reparatur oder dem Schutz von Knorpelgewebe, unter anderem von durch eine Knorpelerkrankung und/oder Verletzung verletztem Knorpelgewebe, von Nutzen sein.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Behandlung von Knorpelgewebe, das als Resultat einer Knorpelerkrankung geschädigt wurde, umfassend das Kontaktieren des Knorpelgewebes mit einer wirksamen Menge an WISP-1-Polypeptid, sowie die Verwendung von WISP-1-Polypeptid in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Knorpelgewebe, das als Resultat einer Knorpelerkrankung geschädigt wurde. WISP-Polypeptide, die zur Verwendung in der Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen WISP-1-Polypeptide und Varianten dieser, die unten stehend beschrieben werden. Gegebenenfalls handelt es sich bei dem Knorpelgewebe um Gelenksknorpelgewebe, und die Menge an verwendetem WISP-1-Polypeptid ist eine therapeutisch wirksame Menge. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Knorpelerkrankung um Osteoarthritis oder Gelenkrheumatismus. Die Verfahren können ex vivo durch Kontaktieren des Knorpelgewebes mit einer wirksamen Menge an WISP-1-Polypeptid in der Kultur und anschließendes Transplantieren des behandelten Knorpelgewebes in das Säugetier durchgeführt werden. Zusätzlich dazu können die Verfahren und Verwendungen durch Anwendung von WISP-1-Polypeptid als therapeuti sches Mittel allein oder in Kombination mit einer wirksamen Menge eines Knorpelmittels oder eines anderen therapeutischen Verfahrens durchgeführt werden. Das WISP-1-Polypeptid kann z. B. in Kombination mit beliebigen Standard-Knorpelgewebe-Operationsverfahren verwendet werden. Das WISP-1-Polypeptid kann vor dem, nach dem und/oder gleichzeitig mit dem Standard-Knorpelgewebe-Operationsverfahren verabreicht werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Behandlung von Knorpelgewebe, das durch Verletzung geschädigt wurde, oder die Prävention des anfänglichen oder fortgeführten Schadens, umfassend das Kontaktieren des Knorpelgewebes mit einer wirksamen Menge an WISP-1-Polypeptid, sowie die Verwendung von WISP-1-Polypeptid in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Knorpelgewebe, das durch Verletzung geschädigt wurde, oder zur Prävention des anfänglichen oder fortgeführten Schadens. Genauer gesagt handelt es sich bei der behandelten Verletzung um einen Mikroschaden oder ein stumpfes Trauma, eine Knorpelfraktur, eine osteochondrale Fraktur oder einen Schaden an Sehnen, Meniskus oder Bändern. In einem spezifischen Aspekt kann die Verletzung das Resultat übermäßiger mechanischer Belastung oder einer anderen biomechanischen Instabilität sein, die aus einer Sportverletzung oder Fettleibigkeit resultiert. Alternativ dazu betrifft die vorliegende Erfindung ein In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Behandlung oder zur Erleichterung der Reparatur von Knochenfrakturen, umfassend das Kontaktieren der Region der Knochenverletzung mit einer wirksamen Menge an WISP-1-Polypeptid, oder die Verwendung von WISP-1-Polypeptid für solch eine Behandlung.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Verbesserung, Stimulierung oder Förderung der Differenzierung von Chondrozyten oder Chondrozyten-Vorläuferzellen durch Kontaktieren der Chondrozyten oder Chondrozyten-Vorläuferzellen mit einer wirksamen Menge an WISP-1-Polypeptid.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Set oder Fabrikat, umfassend WISP-1-Polypeptid und einen Träger, Exzipienten und/oder Stabilisator (z. B. einen Puffer) in einer geeigneten Verpackung. Das Set oder der Artikel enthält vorzugsweise Instruktionen für die Verwendung von WISP-Polypeptid zur Behandlung von geschädigtem Knorpelgewebe oder zur Vermeidung von anfänglichem oder kontinuierlichem Schaden an Knorpelgewebe als Resultat einer Knorpelerkrankung. Alternativ dazu kann das Set Instruktionen zur Verwendung von WISP-Polypeptid zur Behandlung einer Knorpelerkrankung enthalten.
Genauer gesagt umfassen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Behandlung von Säugetier-Knorpelzellen oder -gewebe, umfassend das Kontaktieren von durch eine degenerative Knorpelerkrankung (oder durch eine Verletzung) geschädigten/m Säugetier-Knorpelzellen oder -gewebe mit einer wirksamen Menge an WISP-1-Polypeptid, oder die Verwendung von WISP-1-Polypeptid für solch eine Behandlung, worin das WISP-Polypeptid ein Polypeptid ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist:

a) einem WISP-1-Polypeptid, umfassend die Aminosäuren 23 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3;
b) einem WISP-1-Polypeptid, umfassend die Aminosäuren 1 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3;
c) einem WISP-1-Polypeptid mit zumindest 90% Identität mit dem Polypeptid aus a) oder b); sowie
d) einem biologisch aktiven Fragment des Polypeptids aus a) oder b),

In Fällen, in denen das WISP-1-Polypeptid zumindest 90% Identität mit dem Polypeptid aus a) oder b) aufweist, stimuliert das Polypeptid WISP-1 die Chondrozytenproliferation oder -differenzierung. Alternativ dazu stimuliert in Fällen, in denen das WISP-1-Polypeptid ein biologisch aktives Fragment des WISP-1-Polypeptids aus a) oder b) ist, das biologisch aktive Fragment die Chondrozytenproliferation oder -differenzierung. Die oben beschriebenen WISP-Polypeptide können an ein oder mehrere Polyethylenglykol-Moleküle gebunden sein. Gegebenenfalls können die WISP-Polypeptide an eine Epitopmarkierung oder ein Immunglobulin-Molekül gebunden sein. In den Verfahren kann das Knorpelgewebe Gelenksknorpelgewebe sein, und bei der degenerativen Knorpelerkrankung kann es sich um Gelenkrheumatismus oder Osteoarthritis handeln.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die 1A–1G zeigen die Bindung von WISP-1 an verschiedene Zelllinien. Zellen wurden in Kammer-Objektträgern beimpft und über Nacht gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die nicht-spezifischen Bindungsstellen blockiert, und die Zellen wurden mit 1 nM mWISP-1-IgG (1A und 1B) oder ohne mWISP-1-IgG (1C) 1 Stunde lang inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, fixiert, und die Bindung von WISP-1-IgG wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Mensch-IgG-Antikörpers und des indirekten Tyramid-Substrat-Amplifikationsverfahrens gefolgt von FITC-konjugiertem Streptavidin detektiert. In 1A sind die Zelllinien gruppiert, an die mWISP-1-IgG band. Das Bild stellt das typische Fluoreszenzsignal dar, das auf einer Oberfläche von NRK-Zellen nach der mWISP-1-IgG-Bindung zu finden ist. In 1B sind die Zelllinien gruppiert, an die mWISP-1-IgG nicht band. Das Bild stellt das typische Fluoreszenzsignal dar, das auf Oberflächen von RAG-Zellen nach der mWISP-1-IgG-Bindung zu finden ist. Das Bild in 1C stellt das typische Fluoreszenzsignal dar, das auf Oberflächen von NRK-Zellen zu finden war, als mWISP-1-IgG aus dem Bindungsverfahren ausgenommen wurde. Auf Objektträgern aufgebrachte menschliche Kolon-Tumor-Schnitte wurden auf Raumtemperatur gebracht und gewaschen, gesättigt und 1 Stunde lang in HBS-C/3% BSA und 1 nM WISP-1-Fc inkubiert (1D und 1E). Gleichzeitig wurde die immunfluoreszierende Detektion von Vimentin auf angrenzenden Schnitten durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben ist (1F und 1G).
Die 2A–2B zeigen die Bindung von mWISP-1-IgG an mit menschlichen Haut-Fibroblasten konditioniertes Medium. Serumfreies konditioniertes Medium von menschlichen Haut-Fibroblasten wurde hergestellt, wie im Abschnitt „Reinigung von WISP-1-Bindungsfaktoren" beschrieben. Es wurden fünfzig Mikroliter konditioniertes Medium im Duplikat in Mikrotitrierungswells beschichtet. Die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden durch Inkubation mit HBS-C, enthaltend 3% BSA, gesättigt, und die Wells wurden 2 Stunden lang mit mWISP-1-IgG inkubiert. Die Wells wurden gewaschen und 1 Stunde lang mit meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Mensch-IgG-Fc' inkubiert. Nach 6 Waschgängen mit HBS-C, enthaltend 0,3% BSA, wurde das Signal unter Verwendung eines chromogenen Meerrettichperoxidase-Substrats sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde mit 1 M Phosphorsäure gestoppt, und die OD wurde bei 450 nm gemessen. 2A zeigt die Bindung von 1 nM mWISP-1-IgG an Wells, die mit Reihenverdünnungen konditionierter Medien beschichtet sind; 2B zeigt die Bindung von Reihenverdünnungen von mWISP-1-IgG an Wells, die mit 0,5 µl menschlichem konditioniertem Haut-Fibroblasten-Medium beschichtet sind.
Die 3A–3B zeigen die Bindung von mWISP-1-IgG an einen Chondroitinase-B-empfindlichen Faktor von menschlichem konditioniertem Haut-Fibroblasten-Medium. In 3A wurden fünfzig Mikroliter konditioniertes Medium im Duplikat in Mikrotitrierungswells beschichtet, und die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden durch Inkubation mit HBS-C, enthaltend 3% BSA, gesättigt. 1 nM WISP-1-IgG wurde 2 Stunden lang in Abwesenheit oder in Gegenwart von 1 M NaCl, 100 mM EDTA oder 0,05% Tween-20 inkubiert. Die. Wells wurden gewaschen und 1 Stunde lang mit meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Mensch-IgG-Fc' inkubiert. Nach 6 Waschgängen mit HBS-C, enthaltend 0,3% BSA, wurde das Signal unter Verwendung eines chromogenen Meerrettichperoxidase-Substrats sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde mit 1 M Phosphorsäure gestoppt, und die OD wurde bei 450 nm gemessen. In 3B wurden 50 µl HBS-C, enthaltend 0,5 U/ml Chondroitinase ABC (Ch ABC), 0,5 U/ml Chondroitinase AC II (Ch AC II), 0,5 U/m, Chondroitinase B (Ch B), 0,5 U/ml Chondroitinase C (Ch C), 0,5 U/ml Chondroitin-4-Sulfatase (Ch-4-Sulf), 0,5 U/ml Chondroitin-6-Sulfatase (Ch-6-Sulf), 0,5 U/ml Heparinase (Hep), 0,5 U/ml Hyaluronidase (Hyal), 0,5 U/ml Neuraminidase (Neuram) oder 100 µg/ml Proteinase K (Prot K), zu den beschichteten Wells hinzugefügt und 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden ausgiebig gewaschen, und die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt, und 1 nM mWISP-1-IgG wurde 2 Stunden lang bei Raumtempera tur inkubiert. Die Wells wurden gewaschen, und die Bindung von WISP-1-IgG wurde gemessen.
Die 4A–4B zeigen die Reinigung von WISP-1-Bindungsfaktoren aus menschlichem konditioniertem Haut-Fibroblasten-Medium. In 4A wurde das serumfreie konditionierte Medium aus menschlichen Haut-Fibroblasten nach drei Tagen Kultur gesammelt, konzentriert, in einen Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, und 300 mM NaCl, transferiert und auf eine Q-Sepharose-Anionenaustauschchromatographie-Säule aufgebracht. Die Säule wurde gewaschen, und die zurückgehaltenen Proteine wurden mit einer ansteigenden NaCl-Konzentration desorbiert. Die Gegenwart eines WISP-1-Bindungsfaktors wurde in jeder Fraktion unter Verwendung eines Festphasen-Bindungstests analysiert. In 4B wurde Fraktion 15 (in 4A durch einen * gekennzeichnet) bei 37°C 2 Stunden lang in Gegenwart (+) oder in Abwesenheit (–) von 0,1 U an Chondroitinase-ABC inkubiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getrennt, und die Gele wurden einer Silberfärbung unterzogen. Die angegebenen Banden wurden durch Massenspektroskopie identifiziert.
Die 5A–5B zeigen eine WISP-1-Bindung an Decorin und Biglycan. In 5A wurden Mikrotiterwells mit Reihenverdünnungen von Decorin (schwarze Kreise) oder Biglycan (weiße Kreise) beschichtet. Nicht-spezifische Bindungsstellen wurden gesättigt, und 0,25 nM von mWISP-1-IgG wurde 2 Stunden lang inkubiert. Die Wells wurden gewaschen und 1 Stunde lang mit meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Mensch-IgG-Fc' (2 µg/ml) inkubiert. Nach 6 Waschgängen mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20, wurde durch die Inkubation eines chromogenen Substrats ein Signal entwickelt. Die Farbentwicklung wurde durch die Zugabe von 1 M Phosphorsäure gestoppt, und die O. D. bei 450 nm wurde gemessen. In 5B wurden fünfzig Milliliter menschliches konditioniertes Haut-Fibroblasten-Medium in den Wells von Mikrotiterplatten beschichtet. Nicht-spezifische Bindungsstellen wurden gesättigt, und 0,25 nM WISP-1-IgG wurde in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Decorin (schwarze Krei se) oder Biglycan (weiße Kreise) 2 Stunden lang inkubiert. Die Bindung von mWISP-1-IgG wurde evaluiert, wie in 5A beschrieben wird.
6 zeigt die mWISP-1-IgG-Bindung an Glycosaminoglycane. Serumfreies konditioniertes Medium aus menschlichen Haut-Fibroblasten wurde hergestellt, wie unten stehend in den Beispielen beschrieben wird. Fünfzig µl konditioniertes Medium wurden in Wells von Mikroplatten über Nacht bei 4°C beschichtet, die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt, und die Wells wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in Gegenwart verschiedener Konzentrationen verschiedener Glycosaminoglycane mit 0,5 nM WISP-1-IgG inkubiert. Die Wells wurden gewaschen, es wurde unter Verwendung eines chromogenen Substrats ein Signal entwickelt, und die O. D. bei 450 nm wurde gemessen. Chondroitinsulfat A (schwarze Kreise); Dermatansulfat (weiße Kreise); Chondroitinsulfat C (schwarze Dreiecke); Chondroitinsulfat D (weiße Dreiecke); Chondroitinsulfat E (schwarze Quadrate); Heparin (X); Heparansulfat (weiße Quadrate).
Die 7A–7I zeigen, dass eine WISP-1-Bindung an menschliche Haut-Fibroblasten in Konkurrenz mit Dermatansulfat steht. Menschliche Haut-Fibroblasten wurden in Kammer-Objektträgern beimpft. Die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt, und 1 nM WISP-1-IgG wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in Abwesenheit (7A) oder in Gegenwart (7B) von 50 µg/ml Chondroitinsulfat A („CSA"), Dermatansulfat („DS"); (7C), Chondroitinsulfat C („CS C"); (7D), Chondroitinsulfat D („CS D"); (7E), Chondroitinsulfat E („CS E") (7F); Heparin („Hep") (7G) oder Heparansulfat („HS") (7H) inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und fixiert, und die Bindung von WISP-1-IgG wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Mensch-IgG-Antikörpers detektiert, und das indirekte Tyramidsubstrat-Amplifikationsverfahren endete mit FITC-konjugiertem Streptavidin. Die relative Fluoreszenzintensität der erworbenen digitalen Bilder wurde mittels morphometrischer Analyse gemessen (7I).
Die 8A–8G zeigen, dass die WISP-1-Bindung an menschliche Haut-Fibroblasten durch den Verdau der Zelloberfläche mit Chondroitinase B eliminiert wird. Menschliche Haut-Fibroblasten wurden 2 Stunden lang bei 37°C in Abwesenheit (8A) oder Anwesenheit von 0,1 U Chondroitinase ABC (Oh ABC); (8B), Chondroitinase B („Ch B"); (8C), Chondroitinase C („Ch C"); (8D), Heparinase („Hep") (8E) inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt, und 1 nM WISP-1-IgG wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3 Waschgängen wurden die Zellen fixiert, und die Bindung von WISP-1-IgG wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Mensch-IgG-Antikörpers detektiert, und das indirekte Tyramidsubstrat-Amplifikationsverfahren endete mit FITC-konjugiertem Streptavidin. 8E stellt eine negative Kontrolle dar, in der nicht verdaute Zellen verwendet wurden, in der jedoch mWISP-1-IgG aus dem Bindungsverfahren weggelassen wurde. Die relative Fluoreszenzintensität der erworbenen digitalen Bilder wurde mittels morphometrischer Analyse gemessen (8G).
Die 9A–9D zeigen, dass die WISP-1-Bindung an menschliche Haut-Fibroblasten in Konkurrenz mit Decorin und Biglycan steht. Menschliche Haut-Fibroblasten wurden in Kammer-Objektträgern beimpft, und die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt. 1 nM mWISP-I-IgG wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1 mg/ml Decorin (9A) oder Biglycan (9B) oder in Abwesenheit zugesetzter Konkurrenten (9C) inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und fixiert, und die Bindung von WISP-1-IgG wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Mensch-IgG-Antikörpers detektiert, und das indirekte Tyramid substrat-Amplifikationsverfahren endete mit FITC-konjugiertem Streptavidin. Die relative Fluoreszenzintensität der erworbenen digitalen Bilder wurde mittels morphometrischer Analyse gemessen (9D).
10 zeigt die Adhäsion verschiedener Mutanten von CHO-Zellen an WISP-1. Zellen wurden in PBS, enthaltend 2 mM EDTA, aufgenommen und anschließend gewaschen und in serumfreiem Ham-F12/LGDMEM (50:50), enthaltend 1% BSA, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde zu Mikrotiter-Wells hinzugegeben, die mit WISP-1 beschichtet waren, und anschließend bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert. Die Wells wurden 3X mit PBS gewaschen, der Überstand wurde entfernt, und die Anzahl anhaftender Zellen wurde unter Verwendung von CyQUANT von Molecluar Probes gemessen. Die Adhäsion von CHO-K1-Zellen an Mikrotiter-Wells, die mit WISP-1 beschichtet waren, wurde als 100% verwendet, und alle Werte wurden für die nichtspezifische Adhäsion an Mikrotiter-Wells, die mit BSA beschichtet waren, korrigiert.
11 zeigt die Adhäsion menschlicher Haut-Fibroblasten an WISP-1. Zellen wurden in PBS, enthaltend 15 mM EDTA, aufgenommen und anschließend gewaschen und in serumfreiem Ham-F12/LGDMEM (50:50), enthaltend 1% BSA, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in Abwesenheit oder in Gegenwart von 100 µg/ml Dermatan-Sulfat (d. h. Chondroitinsulfat B) oder Heparin zu Mikrotiter-Wells hinzugegeben. Nach 2 Stunden bei 37°C wurden die Wells 3X mit PBS gewaschen, der Überstand wurde entfernt, und die Anzahl anhaftender Zellen wurde durch Kristallviolettfärbung gemessen. Alle Werte wurden für die nicht-spezifische Adhäsion an Mikrotiter-Wells, die mit BSA beschichtet waren, korrigiert.
12 zeigt die Resultate eines Chondrozyten-Differenzierungstests.
13 zeigt die Resultate eines Kollagen-II-Färbungstests.
14 zeigt die Resultate eines Knorpelmatrixzerfall-Tests. Die veranschaulichten Daten zeigen, dass WISP-3 den Knorpelmatrixzerfall verringert. Gelenksknorpel-Explantate wurden 3 Tage lang nur mit Medium (–) oder mit 150 ng/ml WISP-3 (WISP-3) oder in Medium mit nur 1 ng/ml IL-1α (+) oder IL-1α plus WISP-3 (WISP3+) behandelt. Der Knorpelmatrixzerfall wurde durch Messen der Menge an Proteoglycanen im Medium unter Verwendung des DMMB-Tests bestimmt.
Die 15A–15B zeigen, dass WISP-1 den Knorpelmatrixzerfall und die Produktion von Stickstoffoxid inhibiert. Gelenksknorpel-Explantate wurden 3 Tage lang nur mit Medium (–) oder mit 1,1 nM WISP-1 (WISP1–) oder in Medium mit nur 1 ng/ml IL-1α (+) oder IL-1α mit WISP-1 (WISP1+) behandelt. In 15A wurde der Knorpelmatrixzerfall durch Messen der Menge an Proteoglycanen im Medium unter Verwendung des DMMB-Tests bestimmt. In 15B wurde die Stickstoffoxid-(NO-)Produktion durch Messung der Menge an NO im Medium unter Verwendung der Griess-Reaktion bestimmt.
16 zeigt den Skelettphänotyp transgener Mäuse, die WISP-2 überexprimieren. Histologische Schnitte des Femurs von 14 Wochen alten Wildtyp-(rechtes Feld) oder transgenen (linkes Feld) Mäusen, die in ihren Skelettmuskeln WISP-2 überexprimieren, werden gezeigt. Auffallend ist die Expansion der Bereiche an Hyalin-Knorpelgewebe, nämlich die Wachstumsplatte und das Gelenksknorpelgewebe, bei den transgenen Mäusen im Vergleich zu jenen der Wildtyp-Mäuse. Zusätzlich dazu scheinen Bereiche der Knorpelmatrix im Kortexknochen der transgenen Tiere vorhanden zu sein, jedoch nicht bei den Wildtyp-Mäusen.
17 zeigt die Aminosäuresequenzen für menschliches WISP-1-IgG (Seq.-ID Nr. 1); Maus-WISP-1-IgG (Seq.-ID Nr. 2); menschliches „Wildtyp"-WISP-1 (Seq.-ID Nr. 3); „Wildtyp"-Maus-WISP-1 (Seq.-ID Nr. 4); sowie für die menschliche IgG-Markierung (Seq.-ID Nr. 5).
18 zeigt die Aminosäuresequenzen für WISP-3-IgG (Seq.-ID Nr. 6); „alternierendes" WISP-3-IgG (Seq.-ID Nr. 7); WISP-3 (Seq.-ID Nr. 8); und „langes-5'-Spleißungs"-WISP-3 (Seq.-ID Nr. 9).
19 zeigt die Aminosäuresequenz für menschliches WISP-2 (Seq.-ID Nr. 10).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Der Ausdruck „WISP-Polypeptid" bezieht sich auf die hierin beschriebene Familie menschlicher und Maus-Nativsequenz-WISP-Proteine und -Varianten, deren Gene zumindest durch Wnt-1 induziert werden. Dieser Ausdruck umfasst WISP-1 und Varianten davon. Solche WISP-1-Proteine werden weiters unten stehend sowie in der PCT-Anmeldung WO 99/21998 , veröffentlicht am 6. Mai 1999, und in Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 14717–14722 (1998), beschrieben.
Die Ausdrücke „WISP-1-Polypeptid", „WISP-1-Homolog" und grammatikalische Varianten davon umfassen, wie hierin verwendet, Nativsequenz-WISP-1-Proteine und -Varianten (die hierin unten stehend näher definiert sind). Das WISP-1-Polypeptid kann aus einer Reihe an Quellen isoliert werden, z. B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder es kann durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden oder durch eine Kombination dieser und ähnlicher Verfahren.
Die Ausdrücke „WISP-2-Polypeptid", „WISP-2-Homolog", „PRO261" und „PRO261-Polypeptid" sowie grammatikalische Varianten davon umfassen, wie hierin verwendet, Nativsequenz-WISP-2-Proteine und -Varianten (die hierin näher definiert sind). Das WISP-2-Polypeptid kann aus einer Reihe an Quellen isoliert werden, z. B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder es kann durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden oder durch eine Kombination dieser und ähnlicher Verfahren.
Die Ausdrücke „WISP-3-Polypeptid", „WISP-3-Homolog" sowie grammatikalische Varianten davon umfassen, wie hierin verwendet, Nativsequenz-WISP-3-Proteine und -Varianten (die hierin näher definiert sind). Das WISP-3-Polypeptid kann aus einer Reihe an Quellen isoliert werden, z. B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, oder es kann durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden oder durch eine Kombination dieser und ähnlicher Verfahren.
Ein „Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie ein WISP-1-Polypeptid, das aus der Natur stammt. Solche Nativsequenz-WISP-1-Polypeptide können aus der Natur isoliert werden oder können durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid” umfasst spezifisch natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen eines hierin offenbarten WISP-1-Polypeptids, natürlich auftretende Formvarianten (z. B. alternativ gespleißte Formen oder Spleißvarianten) sowie natürlich auftretende Allelvarianten eines WISP-1-Polypeptids.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid ein reifes menschliches Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid oder ein menschliches Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid voller Länge, umfassend die Aminosäuren 23 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3 hierin (zuvor auch in den 3A und 3B (Seq.-ID Nr. 3), dargestellt in WO 99/21998 , veröffentlicht am 6. Mai 1999, beschrieben) oder die Aminosäuren 1 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3 hierin (zuvor in den 3A und 3B (Seq.-ID Nr. 14), dargestellt in WO 99/21998 , beschrieben), mit einem bzw. ohne ein N-terminales Methionin. Gegebenenfalls umfasst das menschliche WISP-1-Polypeptid die zusammenhängende Sequenz der Aminosäuren 23 bis 367 oder der Aminosäuren 1 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3 hierin. Gegebenenfalls wird das menschliche WISP-1-Polypeptid durch eine Polynucleotidsequenz kodiert, welche die kodierende Nucleotidsequenz wie in der ATCC-Hinterlegungsnr. 209533 aufweist.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid um das menschliche Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid voller Länge oder um das reife menschliche Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid, umfassend die Aminosäuren 23 bis 367 oder 1 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3 hierin, worin der Valin-Rest an Position 184 oder der Alanin-Rest an Position 202 zu einem Isoleucin- bzw. Serin-Rest verändert wurde, mit oder ohne ein N-terminales Methionin. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid um das menschliche Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid voller Länge oder um das reife menschliche Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid, umfassend die Aminosäuren 23 bis 367 oder 1 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3 hierin, worin der Valin-Rest an Position 184 und der Alanin-Rest an Position 202 zu einem Isoleucin- bzw. Serin-Rest verändert wurden, mit oder ohne ein N-terminales Methionin. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid um ein reifes Nativsequenz-Maus-WISP-1-Polypeptid oder um ein Nativsequenz-Maus-WISP-1-Polypeptid voller Länge, umfassend die Aminosäuren 23 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 4 hierin (zuvor in 1 (Seq.-ID Nr. 11), dargestellt in WO 99/21998 , beschrieben) oder die Aminosäuren 1 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 4 hierin (zuvor in 1 (Seq.-ID Nr. 12), dargestellt in WO 99/21998 , beschrieben), mit einem bzw. ohne ein N-terminales Methionin.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Nativsequenz-WISP-1-Polypeptid um eines, für das eine Nucleotidsequenz, umfassend eine der menschlichen WISP-1-Spleiß- oder anderen Nativsequenz-Varianten, umfassend Seq.-ID Nr. 23, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29, dargestellt in WO 99/21998 , kodiert, und zwar mit einem bzw. ohne ein N-terminales Methionin.
Ein „Nativsequenz-WISP-2-Polypeptid" oder ein „Nativsequenz-PRO261-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie ein WISP-2-Polypeptid, das aus der Natur stammt. Solche Nativsequenz-WISP-2-Polypeptide können aus der Natur isoliert werden oder können durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren produziert werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-WISP-2-Polypeptid" umfasst spezifisch natürlich auftretende trunkierte oder sekretierte Formen eines hierin offenbarten WISP-2-Polypeptids, natürlich auftretende Formvarianten (z. B. alternativ gespleißte Formen oder Spleißvarianten) sowie natürlich auftretende Allelvarianten eines WISP-2-Polypeptids. Das Nativsequenz-WISP-2-Polypeptid kann ein reifes menschliches Nativsequenz-WISP-2-Polypeptid oder ein menschliches Nativsequenz-WISP-2-Polypeptid voller Länge sein, umfassend die Aminosäuren 1–24 und bis zu 250 aus Seq.-ID Nr. 10 hierin (zuvor in 4 (Seq.-ID Nr. 15, 16 und 56–77), dargestellt in WO 99/21998 , beschrieben), umfassend die Aminosäuren 24 bis 250 und die Aminosäuren 1 bis 250 aus Seq.-ID Nr. 10 hierin, mit einem bzw. ohne ein N-terminales Methionin. Gegebenenfalls umfasst das menschliche WISP-2-Polypeptid die zusammenhängende Sequenz der Aminosäuren 24 bis 250 oder der Aminosäuren 1 bis 250 aus Seq.-ID Nr. 10 hierin. Gegebenenfalls wird das menschliche WISP-2-Polypeptid von einer Polynucleotidsequenz kodiert, welche die kodierende Nucleotidsequenz wie in der ATCC-Hinterlegungsnr. 209391 aufweist. Das Nativsequenz-WISP-2-Polypeptid kann ein reifes Nativsequenz-Maus-WISP-2-Polypeptid oder ein Nativsequenz-Maus-WISP-2-Polypeptid voller Länge sein, umfassend die Aminosäuren 1–24 und bis zu 251 aus 2 (Seq.-ID Nr. 19, 20 und 78–99), dargestellt in WO 99/21998 , umfassend die Aminosäuren 24 bis 251 und die Aminosäuren 1 bis 251 aus 2 (Seq.-ID Nr. 19 bzw. 20), dargestellt in WO 99/21998 , mit einem bzw. ohne ein N-terminales Methionin.
Ein „Nativsequenz-WISP-3-Polypeptid" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie ein WISP-3-Polypeptid, das aus der Natur stammt. Solche Nativsequenz-WISP-3-Polypeptide können aus der Natur isoliert werden oder können durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren produziert werden. Der Ausdruck „Nativsequenz-WISP-3-Polypeptid" umfasst spezifisch natürlich auftretende trunkierte oder andere Formen eines hierin offenbarten WISP-3-Polypeptids, natürlich auftretende Formvarianten (z. B. alternativ gespleißte Formen oder Spleißvarianten) sowie natürlich auftretende Allelvarianten eines WISP-3-Polypeptids. Das Nativsequenz-WISP-3-Polypeptid kann ein reifes menschliches Nativsequenz-WISP-3-Polypeptid oder ein menschliches Nativsequenz-WISP-3-Polypeptid voller Länge sein, umfassend die Aminosäuren 34 bis 372 aus Seq.-ID Nr. 9 hierin (zuvor in den 6A und 6B (Seq.-ID Nr. 32) aus WO 99/21998 beschrieben) oder die Aminosäuren 1 bis 372 aus Seq.-ID Nr. 9 hierin (zuvor in den 6A und 6B (Seq.-ID Nr. 33), dargestellt in WO 99/21998 , beschrieben), mit einem bzw. ohne ein N-terminales Methionin. Das Nativsequenz-WISP-3-Polypeptid kann ein reifes menschliches Nativsequenz-WISP-3-Polypeptid oder ein menschliches Nativsequenz-WISP-3-Polypeptid voller Länge sein, umfassend die Aminosäuren 16 bis 354 aus Seq.-ID Nr. 8 hierin (zuvor in den 7A und 7B (Seq.-ID Nr. 36), dargestellt in WO 99/21998 , beschrieben) oder die Aminosäuren 1 bis 354 aus Seq.-ID Nr. 8 hierin (zuvor in den 7A und 7B (Seq.-ID Nr. 37), dargestellt in WO 99/21998 , beschrieben), mit einem bzw. ohne ein N-terminales Methionin. Gegebenenfalls umfasst das menschliche WISP-3-Polypeptid die zusammenhängende Sequenz der Aminosäuren 34 bis 372 oder der Aminosäuren 1 bis 372 aus Seq.-ID Nr. 9 hierin. Gegebenenfalls umfasst das menschliche WISP-3-Polypeptid die zusammenhängende Sequenz der Aminosäuren 16 bis 354 oder 1 bis 354 aus Seq.-ID Nr. 8 hierin. Gegebenenfalls wird das menschliche WISP- 3-Polypeptid von einer Polynucleotidsequenz kodiert, welche die kodierende Nucleotidsequenz wie in der ATCC-Hinterlegungsnr. 209707 aufweist.
Der Ausdruck „WISP-1-Variante" beschreibt ein aktives WISP-1-Polypeptid, wie unten stehend definiert, mit zumindest etwa 80%, vorzugsweise zumindest etwa 85%, noch bevorzugter zumindest etwa 90%, insbesondere zumindest etwa 95%, Aminosäuresequenzidentität mit menschlichem reifem WISP-1 mit der deduzierten Aminosäuresequenz der Aminosäuren 23 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3 und/oder mit menschlichem WISP-1 voller Länge mit der deduzierten Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 bis 367 aus Seq.-ID Nr. 3 und/oder mit reifem Maus-WISP-1 mit der deduzierten Aminosäuresequenz, dargestellt in 1 (Seq.-ID Nr. 11), dargestellt in WO 99/21998 , und/oder mit Maus-WISP-2 voller Länge mit der deduzierten Aminosäuresequenz, dargestellt in 1 (Seq.-ID Nr. 12) aus WO 99/21998 . Solche Varianten umfassen z. B. WISP-1-Polypeptide, bei denen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) (d. h. Fragmente) zum N- oder C-Terminus der Sequenzen voller Länge oder der reifen Sequenzen aus Seq.-ID Nr. 3 hinzugefügt werden oder daraus deletiert werden, umfassend Varianten anderer Spezies, jedoch unter Ausschluss eines Nativsequenz-WISP-1-Polypeptids.
Der Ausdruck „WISP-2-Variante" oder „PRO261-Variante" beschreibt ein aktives WISP-2-Polypeptid, wie unten stehend definiert, mit zumindest etwa 80%, vorzugsweise zumindest etwa 85%, noch bevorzugter zumindest etwa 90%, insbesondere zumindest etwa 95%, Aminosäuresequenzidentität mit menschlichem reifem WISP-2 mit der mutmaßlichen deduzierten Aminosäuresequenz der Aminosäuren 24 bis 250 aus Seq.-ID Nr. 10 und/oder mit menschlichem WISP-2 voller Länge mit der deduzierten Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 bis 250 aus Seq.-ID Nr. 10 und/oder mit reifem Maus-WISP-2 mit der mutmaßlichen deduzierten Aminosäuresequenz, dargestellt in 2 (Seq.-ID Nr. 19) aus WO 99/21998 , und/oder mit Maus-WISP-2 voller Länge mit der deduzierten Aminosäuresequenz, dargestellt in 2 (Seq.-ID Nr. 20) aus WO 99/21998 . Solche Varianten umfassen z. B. WISP-2-Polypeptide, bei denen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) (d. h. Fragmente) zum N- oder C-Terminus der Sequenzen voller Länge und der mutmaßlichen reifen Sequenzen aus Seq.-ID Nr. 10 hinzugefügt werden oder daraus deletiert werden, umfassend Varianten anderer Spezies, jedoch unter Ausschluss eines Nativsequenz-WISP-2-Polypeptids.
Der Ausdruck „WISP-3-Variante" beschreibt ein aktives WISP-3-Polypeptid, wie unten stehend definiert, mit zumindest etwa 80%, vorzugsweise zumindest etwa 85%, noch bevorzugter zumindest etwa 90%, insbesondere zumindest etwa 95%, Aminosäuresequenzidentität mit menschlichem reifem WISP-3 mit der deduzierten Aminosäuresequenz der Aminosäuren 34 bis 372 aus Seq.-ID Nr. 9 und/oder mit menschlichem WISP-3 voller Länge mit der deduzierten Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 bis 372 aus Seq.-ID Nr. 9 und/oder mit reifem menschlichem WISP-3 mit der deduzierten Aminosäuresequenz der Aminosäuren 16 bis 354 aus Seq.-ID Nr. 8 oder mit menschlichem WISP-3 voller Länge mit der deduzierten Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 bis 354 aus Seq.-ID Nr. 8. Solche Varianten umfassen z. B. WISP-3-Polypeptide, bei denen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) (d. h. Fragmente) zum N- oder C-Terminus der Sequenzen voller Länge und der reifen Sequenzen aus Seq.-ID Nr. 9 oder Seq.-ID Nr. 8 hinzugefügt werden oder daraus deletiert werden, umfassend Varianten anderer Spezies, jedoch unter Ausschluss eines Nativsequenz-WISP-3-Polypeptids.
Der „Prozentsatz (%) der Aminosäuresequenzidentität" im Hinblick auf die hierin identifizierten WISP-Polypeptidsequenzen wird als der Prozentsatz der Aminosäurereste in einer Kandidatensequenz identifiziert, die nach der Anordnung der Sequenzen und der Einführung von Lücken, falls notwendig, um den maximalen Prozentsatz der Sequenzidentität zu erzielen und unter Außerachtlassen etwaiger konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität, mit den Aminosäureresten in den hierin identifizierten WISP-Sequenzen identisch sind. Die Anordnung für Zwecke der Bestimmung des Prozentsatzes der Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erzielt werden, die nach dem Stand der Technik möglich sind, z. B. unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computer-Software, wie z. B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN-, ALIGN-2- oder Megalign-(DNASTAR-)Software. Der Fachmann kann geeignete Parameter zum Messen der Anordnung bestimmen, unter anderem etwaige Algorithmen, die benötigt werden, um die maximale Anordnung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erzielen. Für die hierin beschriebenen Zwecke werden die%-Werte der Aminosäuresequenzidentität jedoch durch Verwendung des Sequenzvergleich-Computerprogramms ALIGN-2 erhalten. Das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm wurde von Genentech, Inc., entworfen, und der Quellcode wurde mit Bedienungsanleitung im U. S. Copyright Office, Washington D. C., 20559, eingereicht, wo er unter der U. S.-Copyright-Registrierungsnr. TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist bei Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.OD, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter werden vom ALIGN-2-Programm festgelegt und variieren nicht.
„Stringente Bedingungen" sind jene, die (1) eine geringe Ionenstärke und eine hohe Temperatur zum Waschen, 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C verwenden; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel, wie z. B. Formamid, 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C, verwenden; (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 µg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS, verwenden; oder (4) einen Puffer aus 10% Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C verwenden, gefolgt von einem Waschschritt hoher Stringenz, bestehend aus 0,1 × SSC, enthaltend EDTA, bei 55°C.
„Moderat stringente Bedingungen" werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York (1989), beschrieben und umfassen die Verwendung einer Waschlösung und von Hybridisierungsbedingungen (z. B. Temperatur, Ionenstärke und SDS-Prozentsatz), die weniger stringent ist/sind als oben stehend beschrieben. Ein Beispiel moderat stringenter Bedingungen ist eine Bedingung, wie z. B. die Über-Nacht-Inkubation bei 37°C in einer Lösung, die Folgendes umfasst: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachsspermien-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Der Fachmann erkennt, wie man die Temperatur, die Ionenstärke etc., je nach Notwendigkeit, anpassen kann, um Faktoren, wie z. B. die Sondenlänge und dergleichen, einzubeziehen.
„Isoliert" bedeutet bei Verwendung, um die verschiedenen hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, ein Polypeptid, das identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder gewonnen wurde. Kontaminierende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen des Polypeptids stören würden, und können Enzyme, Hormone oder andere proteinartige oder nicht proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid gereinigt, und zwar (1) bis zu einem Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz durch die Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenzers zu erhalten, oder (2) mittels SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung bis zur Homogenität. Isoliertes Polypeptid umfasst Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen WISP-Umgebung nicht vorhanden ist. Normalerweise wird isoliertes Polypeptid jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen z. B. einen Promotor, gegebenenfalls eine Operator-Sequenz, und eine Ribosomen-Bindungsstelle. Von eukaryotischen Zellen ist bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in einem funktionellen Verhältnis mit einer anderen Nucleinsäuresequenz platziert ist. DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader ist z. B. operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinträchtigt; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie positioniert ist, um die Translation zu erleichtern. Allgemein bedeutet „operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden werden, zusammenhängend sind und, im Fall eines sekretorischen Leaders, zusammenhängend und in der Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an passenden Restriktionsstellen erzielt. Falls solche Stellen nicht existieren, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker in Einklang mit der herkömmlichen Praxis verwendet.
Ein „Liposom" ist ein kleines Bläschen, das aus verschiedenen Typen an Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid besteht, das für die Anlieferung eines Arzneimittels (wie z. B. der hierin offenbarten WISP-Polypeptide und WISP-Varianten) an ein Säugetier von Nutzen ist. Die Komponenten des Liposoms sind häufig in einer Doppelschicht-Formation angeordnet, die der Lipidanordnung biologischer Membranen ähnelt.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „Immunoadhäsin" antikörperartige Moleküle, welche die Bindungsspezifitäten eines heterologen Proteins (eines „Adhäsins") mit den Effektorfunktionen konstanter Immunglobulin-Domänen kombinieren. Strukturell umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion einer Aminosäuresequenz mit der gewünschten Bindungsspezifität, bei der es sich um eine andere als die Antigen-Erkennungs- und -Bindungsstelle eines Antikörpers handelt (d. h. die „heterolog" ist), sowie eine konstante Immunglobulin-Domänensequenz. Der Adhäsin-Teil eines Immunoadhäsin-Moleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, umfassend zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden. Die konstante Immunglobulin-Domänensequenz im Immunoadhäsin kann aus einem beliebigen Immunglobulin, wie z. B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (unter anderem IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM, erhalten werden.
„Aktiv" oder „Aktivität" im Kontext der WISP-Polypeptide oder WISP-Varianten der Erfindung bezieht sich auf (eine) Form(en) von Proteinen der Erfindung, welche die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten eines nativen oder natürlich auftretenden WISP-Polypeptids beibehalten, worin sich „biologische" Aktivität auf eine biologische Funktion (entweder inhibierend oder stimulierend) bezieht, die durch ein natives oder natürlich auftretendes WISP-Polypeptid hervorgerufen wird, die anders als die Fähigkeit ist, als Antigen in der Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu dienen, das von einem nativen oder natürlich auftretenden Polypeptid der Erfindung aufgewiesen wird. Auf ähnliche Art und Weise bezieht sich eine „immunologische" Aktivität auf die Fähigkeit, als ein Antigen in der Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu dienen, das von einem nativen oder natürlich auftretenden Polypeptid der Erfindung aufgewiesen wird.
„Biologische Aktivität" im Kontext eines WISP-Polypeptids oder einer WISP-Variante hierin wird verwendet, um sich auf die Fähigkeit solcher Moleküle zu beziehen, die Regenerierung von Knorpelgewebe zu fördern und/oder dessen Zerstörung zu vermeiden oder die Chondrozytendifferenzierung oder -proliferation (d. h. die Differenzierung einer Vorläuferzelle in eine reife Chondrozyte) zu verstärken oder zu fördern. Gegebenenfalls handelt es sich bei dem Knorpelgewebe um Gelenksknorpelgewebe, und die Regenerierung und/oder Zerstörung des Knorpelgewebes ist mit einer Verletzung oder einer degenerativen Knorpelerkrankung assoziiert. Solch eine biologische Aktivität kann z. B. durch die Inhibierung der Proteoglycan-(PG-)Freisetzung aus Gelenksknorpelgewebe, durch die Erhöhung der PG-Synthese in Gelenksknorpelgewebe, durch die Inhibierung der NO-Produktion etc. quantifiziert werden.
Der Ausdruck „Knorpelerkrankung" bezieht sich im Allgemeinen auf eine Erkrankung, die sich durch folgende Symptome manifestiert: Schmerzen, Steifheit und/oder Bewegungseinschränkung der betroffenen Körperteile. Im Umfang einer „Knorpelerkrankung" inkludiert sind „degenerative Knorpelerkrankungen" – Erkrankungen, die, zumindest teilweise, durch Degeneration oder eine Stoffwechselstörung in Bindegeweben des Körpers, umfassend nicht nur die Gelenke oder verwandte Strukturen, unter anderem Muskeln, Bursae (Synovialmembran), Sehnen und Fasergewebe, jedoch auch die Wachstumsplatte, gekennzeichnet sind. In einer Ausführungsform umfasst der Ausdruck „Gelenksknorpelerkrankungen", die durch Zerstörung der glatten Gelenksknorpeloberfläche und Degeneration der Knorpelmatrix gekennzeichnet sind. Zusätzliche Pathologien umfassen die Produktion von Stickstoffoxid und die Inhibierung oder Reduktion der Matrix-Synthese.
Im Umfang von „Gelenksknorpelerkrankungen" sind Osteoarthritis (OA) und Gelenkrheumatismus (RA) inkludiert. OA ist durch eine lokalisierte asymmetrische Zerstörung des Knorpelgewebes charakterisiert, die gleich groß ist wie ertastbare knöcherne Vergrößerungen an den Gelenksrändern. OA betrifft typischerweise die Interphalangealgelenke der Hände, das erste Karpometakarpalgelenk, die Hüften, die Knie, die Wirbelsäule und manche Gelenke des Mittelfußes, während große Gelenke, wie z. B. die Knöchel, Ellenbogen und Schultern, meist nicht betroffen sind. OA kann mit Stoffwechselerkrankungen, wie z. B. Hämochromatose und Alkaptonurie, Entwicklungsanomalien, wie z. B. Entwicklungsdysplasie der Hüften (angeborene Dislokation der Hüften), Diskrepanzen über die Länge der Extremitäten, unter anderem Trauma und entzündlicher Arthritis, wie z. B. Gicht, septischer Arthritis, neuropathischer Arthritis, assoziiert sein. OA kann sich auch nach ausgedehnter biomechanischer Instabilität, wie z. B. als Resultat von Sportverletzungen oder Fettleibigkeit, entwickeln.
Gelenkrheumatismus (RA) ist eine systemische, chronische Autoimmunerkrankungen, die durch symmetrische Synovitis des Gelenks charakterisiert ist und typischerweise kleine und große diarthroide Gelenke gleichermaßen beeinträchtigt. Mit dem Fortschreiten von RA können die Symptome Fieber, Gewichtsverlust, Dünnerwerden der Haut, eine Involvierung mehrerer Organe, Skleritis, Hornhautgeschwüre, die Bildung subkutaner oder subperiostealer Knötchen und sogar vorzeitigen Tod umfassen. Die Symptome von RA treten oftmals in der Jugend auf und können Vaskulitis, Atrophie der Haut und der Muskeln, subkutane Knötchen, Lymphadenopathie, Splenomegalie, Leukopenie und chronische Anämie umfassen.
Weiters kann der Ausdruck „degenerative Knorpelerkrankung" systemischen Lupus erythematodes und Gicht, Amyloidose oder das Felty-Syndrom umfassen. Zusätzlich umfasst der Ausdruck den Knorpelabbau und die Knorpelzerstörung, der/die mit psoriatischer Arthritis, Osteoarthritis, akuter Entzündung (z. B. Yersinia-Arthritis, Pyrophosphat-Arthritis, Gicht-Arthritis (Arthritis urica), septische Arthritis), Arthritis, die mit Trauma assoziiert ist, Colitis ulcerosa (z. B. die Crohn-Erkrankung), multipler Sklerose, Diabetes (z. B. insulinabhängig und nicht insulinabhängig), Fettleibigkeit, Riesenzellenarthritis und dem Sjögren-Syndrom assoziiert ist.
Beispiele anderer Immun- und Entzündungskrankheiten, von denen zumindest manche mit den Verfahren der Erfindung behandelbar sein können, umfassen juvenile chronische Arthritis, Spondyloarthropathien, systemische Sklerose (Skleroderma), idiopathische entzündliche Myopathien (Dermatomyositis, Polymyositis), Sjögren-Syndrom, systemische Vaskulitis, Sarkoidose, hämolytische Autoimmunanämie (Immun-Panzytopenie, paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie), Autoimmunthrombozytopenie (idiopathische thrombozytopenische Purpurs, immunvermittelte Thrombozytopenie), Thryeoiditis (Graves-Erkrankung, Hashimoto-Thyreoiditis, juvenile lymphozytische Thyreoiditis, atrophische Thyreoiditis), entzündliche Autoimmunerkrankungen (z. B. allergische Encephalomyelitis, multiple Sklerose, insulinabhängiger Diabetes mellitus, Autoimmunuveoretinitis, Thyreotoxikose, Skleroderma, systemischer Lupus erythematodes, Gelenkrheumatismus, entzündliche Darmerkrankungen (z. B. Crohn-Erkrankung, Colitis ulcerosa, regionale Enteritis, distale Ileitis, granulomatöse Enteritis, regionale Ileitis, terminale Ileitis), Autoimmun-Schilddrüsenerkrankung, perniziöse Anämie) und Allotransplantat-Abstoßung, Diabetes mellitus, immunvermittelte Nierenerkrankung (Glomerulonephritis, tubulointerstitiale Nephritis), Entmarkungserkrankungen des zentralen und des peripheren Nervensystems, wie z. B. multiple Sklerose, idopathische Entmarkungspolyneuropathie oder Guillain-Barre-Syndrom und chronische entzündliche Entmarkungspolyneuropathie, Leber-Gallen-Erkrankungen, wie z. B. infektiöse Hepatitis (Hepatitis A, B, C, D, E und andere nicht hepatotrope Viren), chronische aktive Autoimmunhepatitis, primär-biliäre Leberzirrhose, granulomatöse Hepatitis und sklerosierende Cholangitis, entzündliche Darmerkrankungen (Colitis ulcerosa, Crohn-Erkrankung), glutenempfindliche Enteropathie und Whipple- Krankheit, Autoimmun- oder immunvermittelte Hauterkrankungen, unter anderem bullöse Hauterkrankungen, Erythema multiforme und Kontaktdermatitis, Psoriasis, allergische Erkrankungen, wie z. B. Asthma, allergische Rhinitis, atopische Dermatitis, Lebensmittelüberempfindlichkeit und Urticaria, immunologische Erkrankungen der Lunge, z. B. eosinophile Pneumonien, idiopathische Lungenfibrose und Überempfindlichkeitspneumonie, mit Transplantation assoziierte Erkrankungen, unter anderem Transplantatabstoßung und Transplantat-Wirt-Erkrankung. Infektiöse Erkrankungen umfassen virale Erkrankungen wie z. B. AIDS (HIV-Infektion), Hepatitis A, B, C, D und E, Herpes etc., bakterielle Infektionen, Pilzinfektionen, Protozoeninfektionen, parasitäre Infektionen und das respiratorische Synzytialvirus, das menschliche Immundefizienz-Virus etc. sowie allergische Erkrankungen, wie z. B. anaphylaktische Überempfindlichkeit, Asthma, allergische Rhinitis, atopische Dermatitis, Conjunctivitis vernalis, Ekzem, Urticaria und Lebensmittelallergien etc.
„Behandlung" ist eine Intervention, die mit der Intention des Verhinderns der Entwicklung oder des Veränderns der Pathologie einer Erkrankung durchgeführt wird. Dementsprechend bezieht sich „Behandlung" sowohl auf therapeutische als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen, wobei es das Ziel ist, die pathologische Erkrankung oder Störung, auf die abgezielt wird, zu vermeiden oder zu verlangsamen (verringern). Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen Individuen, die bereits an der Erkrankung leiden, sowie Individuen, bei denen die Erkrankung verhindert werden soll. In der Behandlung einer degenerativen Knorpelerkrankung kann ein therapeutisches Mittel das Ausmaß der Antwort einer pathologischen Komponente der Erkrankung direkt verringern oder erhöhen oder die Erkrankung auf Behandlung durch andere therapeutische Mittel, z. B. Antibiotika, Antimykotika, entzündungshemmende Mittel, Chemotherapeutika etc., besser ansprechbar zu machen.
Der Ausdruck „wirksame Menge" ist die minimale Konzentration von WISP-Polypeptid, die entweder zu einer detektierbaren Verbesserung oder Reparatur des geschädigten Knorpelgewebes oder zu messbarem Schutz vor der kontinuierlichen oder induzierten Knorpelzerstörung in einer isolierten Probe von Knorpelmatrix (z. B. Retention von Proteoglycanen in der Matrix, Inhibierung der Proteogiycanfreisetzung aus der Matrix, Stimulierung der Proteoglycansynthese) führt, diese induziert oder darin resultiert. Weiters ist eine „therapeutisch wirksame Menge" die minimale Konzentration (Menge) an WISP-Polypeptid, die einem Säugetier verabreicht wird, die zumindest für die Linderung eines pathologischen Symptoms (z. B. entweder eine detektierbare Verbesserung oder Reparatur in geschädigtem Gelenksknorpelgewebe hervorrufend, diese induzierend oder darin resultierend oder messbaren Schutz vor der kontinuierlichen oder anfänglichen Knorpelzerstörung, eine Verbesserung im Bereich der Bewegung, eine Reduktion der Schmerzen etc. hervorrufend, induzierend oder darin resultierend) wirksam wäre, das als Resultat einer Verletzung oder einer degenerativen Knorpelerkrankung auftritt.
Ein „Knorpelmittel" kann ein Wachstumsfaktor, Zytokin, Kleinmolekül, Antikörper, Teil von RNA oder DNA, Viruspartikel, Peptid oder eine Chemikalie mit einer vorteilhaften Wirkung auf Knorpelgewebe sein, unter anderem Peptidwachstumsfaktoren, Katabolismus-Antagonisten und Osteo-, Synovial- oder entzündungshemmende Faktoren. Alternativ dazu kann ein „Knorpelmittel" ein Peptidwachstumsfaktor sein – z. B. einer der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (z. B. FGF-1, FGF-2, ... FGF-21 etc.), IGFs (I und II), TGF-βs (1–3), BMPs (1–7) oder Mitglieder der epidermalen Wachstumsfaktorfamilie, wie z. B. EGF, HB-EGF, TGF-β-, das die intrinsische reparierende Antwort von Knorpelgewebe verbessern könnte, z. B. durch Veränderung der Proliferation, Differenzierung, Migration, Adhäsion oder Matrix-Produktion durch Chondrozyten. Alternativ dazu kann ein „Knorpelmittel" ein Faktor sein, der den Katabolismus von Knorpelgewebe antagonisiert (z. B. IL-1-Rezeptor-Antagonist (IL-1ra), NO-Inhibitoren, IL1-β-Convertase-(ICE-)Inhibitoren, Faktoren, welche die Aktivität von IL-6, IL-8, LIF, IFN-γ oder TNF-α-Aktivität hemmen, Tetrazykline und Varianten davon, Inhibitoren von Apoptose, MMP-Inhibitoren, Aggrecanase-Inhibitoren, Inhibitoren von Serin- und Cystein-Proteinasen, wie z. B. Cathepsine und Urokinase- oder Gewebeplasminogen-Aktivator (uPA und tPA)). Wiederum einer anderen Alternative zufolge umfasst das Knorpelmittel Faktoren, die indirekt auf das Knorpelgewebe wirken, indem sie den darunter liegenden Knochen (d. h. Osteofaktoren, z. B. Bisphosphonate oder Osteoprotegerin) oder das umgebende Synovium (d. h. Synovialfaktoren) oder ent zündungshemmende Faktoren (z. B. Anti-TNF-α (umfassend Anti-TNF-α-Antikörper, wie z. B. Remicade^®, sowie TNF-Rezeptor-Immunoadhäsine, wie z. B. Enbrel^®), IL-1ra, IL-4, IL-10, IL-13, NSAIDs) beeinflussen. Für eine Beschreibung von Beispielen von Knorpelmitteln siehe bitte Martel-Pelletier et al., Front. Biosci. 4, d694–703 (1999); T. M. Hering, Front. Biosci. 4, d743–761 (1999).
Eine „chronische" Verabreichung bezieht sich auf eine Verabreichung des/der Faktors/Faktoren auf kontinuierliche Art und Weise im Gegensatz zu einem akuten Modus, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) für eine ausgedehnte Zeitspanne beizubehalten.
Eine „intermittierende" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht fortlaufend ohne Unterbrechung erfolgt, sondern vielmehr zyklischer Natur ist.
„Säugetier" bezieht sich für die Zwecke der Behandlung auf ein beliebiges Tier, das als ein Säugetier klassifiziert wird, unter anderem auf Menschen, Haus- und Nutztiere sowie Zoo-, Sport- oder Haustiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder, Schweine, Hamster etc. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Säugetier um einen Menschen.
Die Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren therapeutischen Mitteln umfasst die simultane (gleichzeitige) und die aufeinander folgende Verabreichung in einer beliebigen Reihenfolge.
„Träger" umfassen, wie hierin verwendet, pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren, die für die Zelle oder das Säugetier, die/das diesen ausgesetzt ist, in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist. Oft handelt es sich bei dem physiologisch annehmbaren Träger um eine wässrige pH-gepufferte Lösung. Beispiele physiologisch annehmbarer Träger umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, unter anderem Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, umfassend Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. TWEEN^®, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICS^®, Hyaluronsäure (HA).
II. Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung
Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung können verschiedene WISP-Polypeptide zur Behandlung degenerativer Knorpelerkrankungen sowie verschiedener anderer Immun- und immunvermittelter Erkrankungen verwendet werden. Solche WISP-Polypeptide umfassen die Polypeptide, die hierin als WISP-1 bezeichnet werden, und dessen Varianten (sowie Fusionsproteine davon, wie z. B. epitopmarkierte Formen oder Ig-Fusionskonstrukte davon). Die WISP-Polypeptide können in vivo als Medikamente verwendet werden sowie auch ex vivo. Gegebenenfalls werden die WISP-Polypeptide in der Form pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet, die unten stehend ausführlicher beschrieben werden.
Degenerative Knorpelerkrankungen, die durch die Erfindung inkludiert sind, umfassen Gelenkrheumatismus (RA). RA ist eine systemische degenerative Autoimmunerkrankung, die zu symmetrischen Rissen des Synoviums von sowohl großen als auch kleinen diarthroidalen Gelenken führen kann. Mit dem Fortschreiten der Erkrankung können Symptome von RA Fieber, Gewichtsverlust, Dünnerwerden der Haut, eine Involvierung mehrerer Organe, Skleritis, Hornhautgeschwüre, die Bildung subkutaner oder subperiostealer Knötchen und vorzeitigen Tod umfassen. Symptome von RA treten typischerweise in der Jugend auf, ein Auftreten außerhalb der Gelenke kann jedes Organsystem beeinträchtigen, und die Gelenkzerstörung ist symmetrisch und erfolgt sowohl in großen als auch in kleinen Gelenken. Symptome außerhalb der Gelenke können Vaskulitis, Atrophie der Haut und der Muskeln, subkutane Knötchen, Lymphadenopathie, Splenomegalie, Leukopenie und chronische Anämie umfassen. RA scheint heterogener Natur zu sein mit einer variablen Erkrankungsexpression und ist zu irgendeinem Zeitpunkt während der Erkrankung bei 90% der Patienten mit der Bildung von Serumrheumafaktor assoziiert. RA-Patienten weisen typischerweise auch ein hyperaktives Immunsystem auf. Die Mehrheit der Menschen mit RA besitzt eine genetische Anfälligkeit, die mit einer erhöhten Aktivierung der Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplex-Moleküle auf Monozyten und Makrophagen assoziiert ist. Diese Histokompatibilitätskomplex-Moleküle sind in die Präsentation des Antigens für aktivierte T-Zellen, die Rezeptoren für diese Klasse-II-Moleküle aufweisen, involviert. Die genetische Prädisposition für RA wird durch das Vorherrschen des hochgradig konservierten Leukozyten-Antigen-DR-Subtyps Dw4, Dw14 und Dw15 bei menschlichen Patienten mit sehr schwerer Erkrankung unterstützt.
Osteoarthritis (OA) ist eine weitere degenerative Knorpelerkrankung, die eine lokalisierte Erkrankung umfasst, die Gelenkknorpelgewebe und Knochen beeinträchtigt und zu Schmerzen und verringerter Gelenksfunktion führt. OA kann in zwei Typen klassifiziert werden: primär und sekundär. Primäre OA bezieht sich auf das Spektrum degenerativer Gelenkserkrankungen, für die keine ihnen zugrunde liegende Ätiologie bestimmt wurde. Primäre OA betrifft typischerweise folgende Gelenke: die Interphalangealgelenke der Hände, die ersten Karpometakarpalgelenke, die Hlüften, die Knie, die Wirbelsäule und manche Gelenke des Mittelfußes. Große Gelenke, wie z. B. die Knöchel, Ellenbogen und Schultern, sind meist bei primärer OA nicht betroffen. Im Gegensatz dazu tritt sekundäre OA oftmals als ein Resultat einer definierten Verletzung oder eines Traumas auf. Sekundäre Arthritis kommt auch bei Individuen mit Stoffwechselerkrankungen, wie z. B. Hämochromatose und Alkaptonurie, Entwicklungsanomalien, wie z. B. Entwicklungsdysplasie der Hüften (angeborene Dislokation der Hüften) und Diskrepanzen über die Länge der Extremitäten, Fettleibigkeit, entzündlichen Arthritiden, wie z. B. Gelenkrheumatismus oder Gicht, septischer Arthritis und neuropathischer Arthritis, vor.
Der mit OA assoziierte Abbau tritt anfänglich als Auffaserung und Fibrillation der Gelenksknorpeloberfläche auf, da Proteoglycane aus der Matrix verloren gehen. Mit kontinuierlicher Verwendung des Gelenks schreitet die Oberflächen-Fibrillation fort, Defekte dringen tiefer in das Knorpelgewebe ein, und Stücke von Knorpelgewebe gehen verloren. Zusätzlich dazu verdickt sich der unter dem Knorpelgewebe liegende Knochen (subchondraler Knochen), und, da das Knorpelgewebe verloren geht, es kommt langsam zu einer Exposition des Knochens. Mit der asymmetrischen Knorpelzerstörung kann es zu Verunstaltungen kommen. Knöcherne Knötchen, genannt Osteophyten, bilden sich oftmals an der Peripherie der Gelenksoberfläche und wachsen manchmal über die angrenzenden erodierten Gebiete. Wird die Oberfläche dieser knöchernen Auswüchse durchdrungen, so kann es zu einem vaskulären Auswuchs kommen und die Bildung von Gewebeverschlüssen verursachen, die Faserknorpelgewebe enthalten.
Da Knorpelgewebe gefäßlos ist, müssen Schäden, die der Knorpelschicht zugefügt werden, die jedoch nicht bis zum subchondralen Knochen vordringen, von vor Ort befindlichen Chondrozyten repariert werden, die ein geringes intrinsisches Replikationspotential aufweisen. Wird der subchondrale Knochen jedoch durchdrungen, so ermöglicht dessen Gefäßversorgung jedoch, dass ein triphasisches Reparaturverfahren vollzogen wird. Das suboptimale Knorpelgewebe, das als Reaktion auf diese Art von Schaden synthetisiert wird, hierin aufgrund seiner Fasermatrix „Faserknorpelgewebe" genannt, besitzt suboptimale biochemische und mechanische Eigenschaften und ist daher weiterer Abnutzung und Zerstörung ausgesetzt. In einem erkrankten oder geschädigten Gelenk führt die erhöhte Freisetzung von Metalloproteinasen (MMPs), wie z. B. Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysinen, Aggrecanasen und anderer Proteasen, zu weiterer Verdünnung und Verlust von Knorpel. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass Zytokine, wie z. B. IL-1α, IL-1β, TNF-α, PDGF, GM-CSF, IFN-γ, TGF-β, LIF, IL-2 und IL-6, IL-8, die Aktivität fibroblastenartiger Synovialzellen, Makrophagen, T-Zellen und/oder Osteoklasten verändern kann, was darauf hindeutet, dass diese Zytokine den Knorpelmatrix-Umsatz in vivo regulieren können.
Die mechanischen Eigenschaften von Knorpelgewebe werden von seiner biochemischen Zusammensetzung bestimmt. Während die Kollagen-Architektur zur Zugfes tigkeit und Steifheit von Knorpelgewebe beiträgt, ist die Verdichtbarkeit (oder Elastizität) auf seine Proteoglycan-Komponente zurückzuführen. Bei gesundem Gelenksknorpelgewebe dominiert Typ-II-Kollagen (umfassend etwa 90–95%), es sind jedoch auch geringere Mengen der Typ-V-, -VI-, -IX- und -XI-Kollagenarten vorhanden. Knorpelgewebe-Proteoglycane (PG) umfassen hydrodynamisch große, aggregierende PG mit kovalent gebundenen sulfatisierten Glycosaminoglycanen sowie hydrodynamisch kleinere, nicht aggregierende PG, wie z. B. Decorin, Biglycan und Lumican.
Verletzungen am Knorpelgewebe können drei Kategorien zugeordnet werden: (1) Mikroschäden oder stumpfes Trauma, (2) Knorpelfrakturen und (3) osteochondrale Frakturen.
Mikroschäden an Chondrozyten und Knorpelmatrix können durch einmalige Einwirkung hervorgerufen werden, durch repetitive stumpfe Traumata oder durch die kontinuierliche Verwendung eines biomechanisch instabilen Gelenks. Metabolische und biochemische Veränderungen, wie z. B. jene, die in den frühen Stadien degenerativer Arthritis zu finden sind, können in Tiermodellen repliziert werden, welche die repetitive Beladung von Gelenksknorpelgewebe umfassen. Radin et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 131, 288–93 (1978). Solche Experimente heben, zusammen mit dem deutlichen Muster des Knorpelverlusts, das in arthritischen Gelenken zu finden ist, die Rolle hervor, welche die biomechanische Beladung im Verlust der Homöostase und der Integrität von Gelenksknorpelgewebe bei Erkrankungen spielt. Radin et al., J. Orthop. Res. 2, 221–234 (1984); Radin et al., Semin. Arthritis Rheum. 21, Ergänzungsband 2, 12–21 (1991); Wei et al., Acta Orthop. Scand. 69, 351–357 (1998). Während Chondrozyten anfänglich in der Lage sein können, die Knorpelmatrix in einer Basalrate mit Proteoglycanen aufzufüllen, kann gleichzeitiger Schaden am Kollagen-Netzwerk die Verlustrate erhöhen und zu einer irreversiblen Degeneration führen. Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2, 192–201 (1994).
Knorpelfrakturen sind durch eine Zerstörung der Gelenksoberfläche ohne Verletzung der subchondralen Platte charakterisiert. Es kommt zu Chondrozyten-Nekrose an der verletzten Stelle, gefolgt von erhöhter mitotischer und metabolischer Aktivität der ü berlebenden Chondrozyten, die an die Verletzung angrenzen, was zu einem Überzug der Spalten der Gelenksoberfläche mit fibrösem Gewebe führt. Die Erhöhung der Chondrozytenaktivität ist vorübergehend, und die Reparaturantwort führt zu einer ungenügenden Menge und Qualität neuer Matrix-Komponenten.
Osteochondrale Frakturen, die schwerwiegendsten der drei Verletzungsarten, sind Läsionen, welche die Tidemark in die darunter liegende subchondrale Platte überschreiten. Bei dieser Verletzungsart führt die Gegenwart subchondraler Gefäßanordnung zu der Dreiphasen-Antwort, die typischerweise in vaskulären Geweben anzutreffen ist: (1) Nekrose, (2) Entzündung und (3) Reparatur. Anfänglich füllt sich die Läsion mit Blut und Klumpen. Der resultierende Fibrin-Klumpen aktiviert eine Entzündungsantwort und wird zu mit Blutgefäßen ausgestattetem Reparaturgewebe, und die verschiedenen zellulären Komponenten setzen Wachstumsfaktoren und Zytokine frei, umfassend den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF), morphogene Knochenproteine und die insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II. Buckwalter et al., J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2, 191–201 (1994).
Die anfängliche Reparaturantwort, die mit osteochondralen Frakturen assoziiert ist, ist durch Rekrutierung, Proliferation und Differenzierung von Vorläufern in Chondrozyten charakterisiert. Mesenchymale Stammzellen werden im Fibrin-Netzwerk abgelagert, das schließlich zu einer Faserknorpelzone wird. F. Shapiro et al., J. Bone Joint Surg. 75, 532–53 (1993); N. Mitchell und N. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58, 230–33 (1976). Bei diesen Stammzellen, von denen angenommen wird, dass sie aus dem darunter liegenden Knochenmark stammen anstatt aus der angrenzenden Gelenksoberfläche, kommt es zu einer schrittweisen Differenzierung in Chondrozyten. Sechs bis acht Wochen nach der Verletzung enthält das Reparaturgewebe chondrozytenartige Zellen in einer Matrix an Proteoglycanen und vorwiegend Typ-II-Kollagen mit etwas Typ-I-Kollagen. T. Furukawa et al., J. Bone Joint Surg. 62, 79–89 (1980); J. Cheung et al., Arthritis Rheum. 23, 211–19 (1980); S. O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8, 54–72 (1971). Diese neu abgelagerte Matrix degeneriert jedoch, und das Chondroidgewebe wird durch stärker fibröses Gewebe und Faserknorpel gewebe ersetzt, und es kommt zu einer Verschiebung in der Synthese von Kollagen vom Typ II zu Typ I. H. S. Cheung et al., J. Bone Joint Surg. 60, 1076–81 (1978); D. Hamerman, Prospects for medical intervention in cartilage repair, Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects, J. F. Woessner et al. (Hrsg.) (1993); Shapiro et al., J. Bone Joint Surg. 75, 532–53 (1993); N. Mitchell & N. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58, 230–33 (1976); S. O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8, 54–72 (1971). Frühe degenerative Veränderungen umfassen Oberflächen-Fibrillation, Erschöpfung an Proteoglycanen, Chondrozyten-Klonierung und -Tod sowie vertikale Risse von der oberflächlichen bis in tiefgelegene Schichten. Ein Jahr nach der Verletzung ist das Reparaturgewebe ein Gemisch aus Faserknorpel und Hyalinknorpel mit einer wesentlichen Menge an Typ-I-Kollagen, das nicht in nennenswerten Mengen in normalem Gelenksknorpelgewebe zu finden ist. T. Furukawa et al., J. Bone Joint Surg. 62, 79–89 (1980).
Während eine Entzündung nicht das initiierende Ereignis bei Osteoarthritis zu sein scheint, tritt eine Entzündung in osteoarthritischen Gelenken auf. Die Entzündungszellen (d. h. Monozyten, Makrophagen und Neutrophile), welche nach der Verletzung und während der Entzündung die Synovialauskleidung angreifen, produzieren Malloproteinasen und katabolische Zytokine, die zur weiteren Freisetzung abbauender Enzyme beitragen können. Obwohl Entzündung und Gelenkszerstörung keine perfekte Korrelation in allen Tiermodellen von Arthritis zeigen, verringern auch Mittel, wie z. B. IL-4, IL-10 und IL-13, welche die Entzündung inhibieren, auch Knorpel- und Knochenpathologien bei arthritischen Tieren (beschrieben in J. Martel-Pelletier, Front. Biosci. 4, d694–703). Die Anwendung von Mitteln, die entzündliche Zytokine inhibieren, können das Fortschreiten von OA durch das Entgegenwirken gegen lokale Synovitis, die bei OA-Patienten auftritt, verlangsamen.
OA involviert nicht nur die Degeneration von Gelenksknorpelgewebe, die zur Eburneation des Knochens führt, sondern auch das extensive Remodellieren von subchondralen Knochen, was zur so genannten Sklerose dieses Gewebes führt. Diese knöchernen Veränderungen werden oftmals von der Bildung subchondraler Zysten als Resultat einer fokalen Resorption begleitet. Mittel, welche die Knochenresorption inhibieren, d. h. Osteoprotegerin oder Bisphosphonate, haben vielversprechende Resultate in Arthritis-Tiermodellen gezeigt. Kong et al., Nature 402, 304–308 (1999).
Bei systemischem Lupus erythematodes ist der zentrale Krankheitsvermittler die Produktion autoreaktiver Antikörper gegen Selbstproteine/-gewebe und die anschließende Erzeugung einer immunvermittelten Entzündung. Diese Antikörper vermitteln die Gewebeverletzung entweder direkt oder indirekt. Obwohl von T-Lymphozyten nicht gezeigt wurde, dass sie direkt in den Gewebeschaden involviert sind, sind T-Lymphozyten für die Entwicklung autoreaktiver Antikörper erforderlich. Die Entstehung der Erkrankung ist daher T-Lymphozyten-abhängig. Mehrere Organe und Systeme werden klinisch beeinträchtigt, unter anderem die Nieren, die Lunge, das Muskelskelettsystem, das mukokutane System, die Augen, das Zentralnervensystem, das kardiovaskuläre System, der Magendarmtrakt, das Knochenmark und das Blut.
Juvenile chronische Arthritis ist eine chronische idiopathische Entzündungskrankheit, die oftmals im Alter von weniger als 16 Jahren beginnt und die manche Ähnlichkeiten mit RA aufweist. Manche Patienten, die auf den Rheumafaktor positiv getestet wurden, werden als an juvenilem Gelenkrheumatismus leidend klassifiziert. Die Erkrankung wird in drei Hauptkategorien als Untergruppen eingeteilt: pauciartikulär, polyartikulär und systemisch. Die Arthritis kann schwerwiegend sein und führt zu Gelenkankylose und verzögertem Wachstum. Andere Symptome können chronische anteriore Uveitis und systemische Amyloidosen umfassen.
Spondyloarthropathien sind eine Gruppe an Erkrankungen mit manchen gemeinsamen klinischen Merkmalen und der gemeinsamen Assoziation mit der Expression des HLA-B27-Genprodukts. Die Erkrankungen umfassen: ankylosierende Spondylitis, das Reiter-Syndrom (reaktive Arthritis), Arthritis, die mit entzündlichen Darmerkrankungen assoziiert ist, Spondylitis, die mit Psoriasis assoziiert ist, juveniles Auftreten von Spondyloarthropathie und undifferenzierte Spondyloarthropathie. Kennzeichnende Faktoren umfassen Sakroileitis mit oder ohne Spondylitis; asymmetrische Entzündungsarthritis; Assoziation mit HLA-B27 (einem serologisch definierten Allel des HLA-B-Locus der Klasse-I-MHC); Augenentzündung und das Fehlen von Auto antikörpern, die mit anderen rheumatischen Erkrankungen assoziiert sind. Jene Zelle, die am stärksten als Schlüssel zur Induktion der Erkrankung betrachtet wird, ist der CD8+-T-Lymphozyt, eine Zelle, die auf Antigene abzielt, die von Klasse-I-MHC-Molekülen präsentiert werden. CD8+-T-Zellen können gegen das Klasse-I-MHC-Allel HLA-B27 reagieren, so als würde es sich dabei um ein fremdes Peptid handeln, das von MHC-Klasse-I-Molekülen exprimiert wird. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein Epitop von HLA-B27 ein bakterielles oder anderes mikrobielles antigenes Epitop imitieren könnte und daher eine CD8+-T-Zellen-Antwort induzieren könnte.
Die in der Erfindung verwendeten WISP-Polypeptide können durch ein beliebiges geeignetes Verfahren hergestellt werden, umfassend Rekombinationsexpressionsverfahren. Rekombinationsexpressionsverfahren sind dem Fachmann wohlbekannt, und optionale Materialien und Verfahren werden in der PCT-Anmeldung WO 99/21998 beschrieben. Gegebenenfalls werden die WISP-Polypeptide unter Verwendung von Wirtszellen, wie z. B. CHO-Zellen, E.-coli-Zellen oder Hefe-Zellen, exprimiert. Die WISP-Polypeptide können Polypeptide voller Länge (hierin definiert) oder Varianten davon sowie andere modifizierte Formen der WISP-Polypeptide (z. B. durch Fusionieren oder Verbinden mit einem Immunglobulin, einer Epitopmarkierung, einem Leucin-Zipper oder einem anderen nicht proteinartigen Polymer) umfassen.
Immunoadhäsin-Moleküle werden zur Verwendung in den Verfahren hierin in Betracht gezogen. WISP-Immunoadhäsine können verschiedene Formen von WISP umfassen, wie z. B. das Polypeptid voller Länge sowie Varianten oder Fragmente davon. In einer Ausführungsform kann das Molekül eine Fusion des WISP mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des Immunoadhäsins könnte solch eine Fusion an die Fc-Region eines IgG-Moleküls erfolgen. Für die Produktion von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130 , ausgegeben am 27. Juni 1995, und Chamow et al., TIBTECH 14, 52–60 (1996).
In einer anderen Ausführungsform kann das WISP-Polypeptid durch Verbinden des Polypeptids mit einem einer Reihe nicht-proteinartiger Polymere, z. B. Polyethylen glykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, kovalent modifiziert werden, und zwar auf die in US-Patent Nr. 4.640.835 ; 4.496.689 ; 4.301.144 ; 4.670.417 ; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegte Art und Weise. Solche pegylierten Formen des WISP-Polypeptids können unter Verwendung von Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden.
Leucin-Zipper-Formen dieser Moleküle werden auch durch die Erfindung in Betracht gezogen. „Leucin-Zipper" ist ein nach dem Stand der Technik verwendeter Ausdruck, um eine leucinreiche Sequenz zu beschreiben, welche die Dimerisation oder Trimerisation ihres Fusionspartners (z. B. der Sequenz oder des Moleküls, an die/das der Leucin-Zipper fusioniert oder gebunden ist) verstärkt, fördert oder vorantreibt. Verschiedene Leucin-Zipper-Polypeptide wurden auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben. Siehe z. B. Landschulz et al., Science 240, 1759 (1988); US-Patent Nr. 5.716.805 ; WO 94/10308 ; Hoppe et al., FEBS Letters 344, 1991 (1994); Maniatis et al., Nature 341, 24 (1989). Der Fachmann weiß es zu schätzen, dass eine Leucin-Zipper-Sequenz entweder am 5'- oder am 3'-Ende des WISP-Polypeptids fusioniert sein kann.
Die WISP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch auf eine Art modifiziert werden, so dass sie chimäre Moleküle bilden, indem das Rezeptor-Polypeptid an ein(e) andere(s) heterologe(s) Polypeptid oder Aminosäure fusioniert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei solch einer heterologen Polypeptid- oder Aminosäuresequenz um eine, die eine Oligomerisation des chimären Moleküls bewirkt. In einer Ausführungsform umfasst solch ein chimäres Molekül eine Fusion des WISP-Polypeptids mit einem Markierungs-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird allgemein am Amino- oder Carboxyl-Terminus des Polyepeptids platziert. Die Gegenwart solcher epitopmarkierter Formen des WISP-Polypeptids kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid detektiert werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht ebenfalls eine leichte Reinigung des WISP-Polypeptids durch Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder einer anderen Art an Affinitätsmatrix, die an die Epitop-Markierung bindet. Verschiedene Markierungs-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin-(poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin-(poly-his-gly-)Markierungen; das Grippe-HA-Markierungs-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper dagegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)); sowie die Herpes-Simplex-Virus-Glycoprotein-D-(gD-)Markierung und dessen Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3 (6), 547–553 (1990)). Andere Markierungs-Polypeptide umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitop-Peptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); sowie die T7-Gen-10-Protein-Peptid-Markierung (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)).
Formulierungen von WISP-Polypeptiden, die im Rahmen der Erfindung verwendbar sind, können durch Mischen des WISP-Polypeptids mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren hergestellt werden (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)). Diese therapeutischen Formulierungen können die Form von gefriergetrockneten Formulierungen oder wässrigen Lösungen aufweisen. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für den Empfänger in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, unter anderem Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsstoffe (wie z. B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z. B. Methyl- oder Propyl-Paraben; Catechol; Resorcinol; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Cresol); Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, unter anderem Glucose, Mannose, Dextrine oder Hyaluronan; Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Zucker, wie z. B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; Metallkomplexe (z. B. Zn-Protein-Komplexe); und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. TWEEN^®, PLURONICS^® oder Polyethylenglykol (PEG).
Die WISP-Polypeptide können auch durch Einschluss in Mikrokapseln hergestellt werden, die z. B. durch Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, z. B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln. Solche Präparate können in kolloidalen Arzneimittel-Anlieferungssystemen verabreicht werden (z. B. Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage (oder neuer), A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
Wenn eine Verabreichung mit verzögerter oder verlängerter Freisetzung der WISP-Polypeptide in einer Formulierung mit Freisetzungseigenschafte gewünscht ist, die für die Behandlung einer beliebigen Krankheit oder Störung geeignet sind, die eine Verabreichung solcher Polypeptide erfordert, wird eine Mikroeinkapselung in Betracht gezogen. Die Mikroeinkapselung rekombinanter Proteine für eine verzögerte Freisetzung wurde erfolgreich durchgeführt. Siehe z. B. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795–799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221–1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755–758 (1990); Cleland, Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, 439–462, Powell and Newman (Hrsg.), Plenum Press, New York (1995); WO 97/03692 , WO 96/40072 , WO 96/07399 und US-Patent Nr. 5.654.010 .
Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen fester hydrophober Polymere, enthaltend das aktive Molekül, wobei die Matrizen die Form von Formartikeln, z. B. Filme oder Mikrokapseln, aufweisen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen ein oder mehr Polyanhydrid(e) (z. B. US-Patent 4.891.225 ; 4.767.628 ), Polyerster, wie z. B. Polyglykolide, Polylactide und Polylactid-co-glykolide (z. B. US-Patent 3.773.919 ; US-Patent 4.767.628 ; US-Patent 4.530.840 ; Kulkarni et al., Arch. Surg. 93, 839 (1966)), Polyaminosäuren, wie z. B. Polylysin, Polymere und Copolymere von Polyethylenoxid, Polyethylenoxidacrylate, Polyacrylate, Ethylen-Vinylacetate, Polyamide, Polyurethane, Polyorthoester, Polyacetylnitrile, Polyphosphazene und Polyesterhydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), oder Poly(vinylalkohol)), Zellulose, acylsubstituierte Zelluloseacetate, nicht-abbaubare Polyurethane, Polystyrole, Polyvinylchlorid, Polyvinylfluorid, Poly(vinylimidazol), chlorsulfonierte Polyolefine, Polyethylenoxid, Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht-abbaubares Ethylen-Vinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z. B. LUPRON DEPOT^® (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolid-Acetat bestehen), sowie Poly-D-(–)-3-Hydroxybuttersäure. Während Polymere, wie z. B. Ethylen-Vinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen für eine Zeitspanne von über 100 Tagen ermöglichen, setzen gewisse Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen frei. Zusätzliche biologisch nicht-abbaubare Polymere, die verwendet werden kennen, sind Polyethylen, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Polyethylenglykol, Zelluloseacetatbutyrat und Zelluloseacetatpropionat.
Alternativ dazu können Retard-Formulierungen aus abbaubaren biologischen Materialien bestehen. Biologisch abbaubare Polymere sind aufgrund ihrer Biokompatibilität, ihrer hohen Verantwortlichkeit für spezifischen Abbau und ihre Leichtigkeit, mit welcher der Wirkstoff in die biologische Matrix inkorporiert wird, attraktive Arzneimittelformulierungen. Hyaluronsäure (HA) kann z. B. vernetzt sein und als polymeres Anlieferungsvehikel mit Schwellkapazität für biologische Materialien verwendet werden. US-Patent 4.957.744 ; Valle et al., Polym. Mater. Sci. Eng. 62, 731–735 (1991). HA-Polymer, das mit Polyethylenglykol gepfropft wurde, wurde ebenfalls als verbesserte Anlieferungsmatrix hergestellt, die sowohl ungewollte Arzneimittelaustritte als auch die mit Langzeitlagerung bei physiologischen Bedingungen assoziierte Denaturierung reduzierte. M. Kazuteru, J. Controlled Release 59, 77–86 (1999). Zusätzliche biologisch abbaubare Polymere, die verwendet werden können, sind Poly(caprolacton), Polyanhydride, Polyaminosäuren, Polyorthoester, Polycyanoacrylate, Poly(phosphazine), Poly(phosphodiester), Polyesteramide, Polydioxanone, Polyacetale, Polyketa le, Polycarbonate, Polyorthocarbonate, abbaubare und nicht-toxische Polyurethane, Polyhydroxylbutyrate, Polyhydroxyvalerate, Polyalkylenoxalate, Polyalkylensuccinate, Poly(apfelsäure), Chitin und Chitosan.
Alternativ dazu können biologisch abbaubare Hydrogele als Anlieferungsvehikel für biologische Materialien und Arzneimittel mit kontrollierter Freisetzung verwendet werden. Durch die geeignete Auswahl an Makromeren können Membranen mit einer Reihe verschiedener Werte bezüglich Permeabilität, Porengröße und Abbauraten produziert werden, die für eine große Bandbreite an Biomolekülen geeignet sind.
Alternativ dazu können Retard-Abgabesysteme für biologische Materialien und Arzneimittel aus Dispersionen bestehen. Dispersionen können weiters entweder als Suspensionen oder Emulsionen klassifiziert werden. Im Kontext von Anlieferungsvehikeln für biologische Materialien sind Suspensionen ein Gemisch aus sehr kleinen festen Partikeln, die in einem flüssigen Medium (mehr oder weniger einheitlich) dispergiert sind. Die festen Partikel einer Suspension können in der Größe von ein paar Nanometern bis zu Hunderten Mikrometern reichen und umfassen Mikrokügelchen, Mikrokapseln und Nanokügelchen. Emulsionen wiederum sind ein Gemisch aus zwei oder mehreren unmischbaren Flüssigkeiten, die durch kleine Mengen von Emulgatoren in Suspension gehalten werden. Emulgatoren bilden einen Grenzflächenfilm zwischen den unmischbaren Flüssigkeiten und sind auch als Tenside oder Detergenzien bekannt. Emulsionsformulierungen können sowohl Öl-in-Wasser (o/w) sein, worin sich das Wasser in einer kontinuierlichen Phase befindet, während das Öl oder Fett dispergiert ist, sowie Wasser-in-Öl (w/o), worin sich das Öl in einer kontinuierlichen Phase befindet, während das Wasser dispergiert ist. Ein Beispiel einer geeigneten Retard-Formulierung wird in WO 97/25563 offenbart. Zusätzlich dazu umfassen Emulsionen zur Verwendung mit biologischen Materialien multiple Emulsionen, Mikroemulsionen, Mikrotröpfchen und Liposomen. Mikrotröpfchen sind einschichtige Phospholipidbläschen, die aus einer runden Lipidschicht mit einer Ölphase im Inneren bestehen. Z. B. US-Patent 4.622.219 und US-Patent 4.725.442 . Liposomen sind Phospholipidbläschen, die durch Mischen wasserunlöslicher polarer Lipide mit einer wässrigen Lösung hergestellt werden.
Alternativ dazu können die WISP-Polypeptid-Retard-Formulierungen unter Verwendung von Poly-Milchsäure-Co-Glykolsäure (PLGA) entwickelt werden, einem Polymer, das ein starkes Ausmaß an Biokompatibilität und eine Vielzahl biologisch abbaubarer Eigenschaften aufweist. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glykolsäure, werden schnell aus dem menschlichen Körper ausgeschieden. Weiters kann die Abbaubarkeit dieses Polymers in Abhängigkeit von dessen Molekulargewicht und Zusammensetzung von Monaten auf Jahre angepasst werden. Für weitere Informationen siehe Lewis, Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide Polymer, in: Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, 1–41, M. Chasin und R. Langeer (Hrsg.), Marcel Dekker, New York (1990).
Die eingekapselten Polypeptide oder Polypeptide in Formulierungen mit verlängerter Freisetzung können durch Formulierung des Polypeptids mit „wasserlöslichen wehrwertigen Metallsalzen", die in der Konzentration und Temperatur der Freisetzung nicht toxisch sind, übertragen werden. Beispiele für „mehrwertige Metalle" umfassen die folgenden Kationen: Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Sn²⁺, Sn⁴⁺, Al²⁺ und Al³⁺ Beispiele für Anionen, die wasserlösliche Salze mit den oben genannten mehrwertigen Metall-Kationen bilden, umfassen jene, die durch anorganische Säuren und/oder organische Säuren gebildet werden. Solche wasserlöslichen Salze besitzen eine Löslichkeit in Wasser (bei 20°C) von zumindest etwa 20 mg/ml, alternativ dazu 100 mg/ml, alternativ dazu 200 mg/ml.
Geeignete anorganische Säuren, die zur Bildung der „wasserlöslichen mehrwertigen Metallsalze" verwendet werden können, umfassen Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure und Phosphorsäure. Geeignete organische Säuren, die verwendet werden können, umfassen aliphatische Carbonsäure und aromatische Säuren. Aliphatische Säuren innerhalb dieser Definition können als gesättigte oder ungesättigte C_2-9-Carbonsäuren (z. B. aliphatische Mono-, Di- und Tricarbonsäuren) definiert werden. Häufig verwendete wasserlösliche mehrwertige Metallsalze, die zur Förderung der Stabilisierung der eingekapselten Polypeptide dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen z. B.: (1) die Metallsalze anorganischer Säuren von Halogeniden (z. B. Zinkchlorid, Calciumchlorid), Sulfaten, Nitraten, Phosphaten und Thiocyanaten; (2) die aliphatischen Carbonsäure-Metallsalze Calciumacetat, Zinkacetat, Calciumpropionat, Zinkglykolat, Calciumlactat, Zinklactat und Zinktartrat; sowie (3) die aromatischen Carbonsäure-Metallsalze von Benzoaten (z. B. Zinkbenzoat) und Salicylaten.
Damit die Formulierungen zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden können, müssen sie steril sein. Die Formulierung kann vor oder nach dem Gefriertrocknen und der Wiederherstellung leicht durch Filtration durch sterile Filtermembranen sterilisiert werden. Die hierin enthaltenen therapeutischen Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einem Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung platziert, z. B. einem Beutel für intravenöse Lösung oder einer Phiole mit einem Stöpsel, der von einer subkutanen Injektionsnadel zu durchstechen ist.
Zur In-vivo-Behandlung des Säugetiers steht der Verabreichungsweg in Einklang mit bekannten Verfahren, z. B. Injektion oder Infusion durch intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, intraarterielle, intraläsionale oder intraartikuläre Verabreichungswege, durch topische Verabreichung, mittels verzögerter Freisetzung oder verlängerter Freisetzung. Gegebenenfalls wird die aktive Verbindung oder Formulierung direkt oder lokal in die betroffene Knorpelregion oder das betroffene Gelenk injiziert. Die von der Erfindung in Betracht gezogene Behandlung kann auch die Form einer Gentherapie annehmen.
Dosierungen und gewünschte Arzneimittelkonzentrationen pharmazeutischer Zusammensetzungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können in Abhängigkeit von der spezifischen, in Betracht gezogenen Nutzung variieren. Die Bestimmung der geeigneten Dosierung oder des geeigneten Verabreichungswegs liegt mit Sicherheit innerhalb der Fähigkeiten eines normalen Arztes. Tierexperimente können verlässliche Richtlinien für die Bestimmung wirksamer Dosierungen für die Therapie am Menschen bereitstellen. Eine Skalierung zwischen den Spezies bezüglich wirksamer Dosierungen kann jenen Prinzipien folgend durchgeführt werden, die von J. Mordenti und W. Chappell, The use of interspecies scaling in toxicokinetics, in: Toxikokinetics and New Drug Development, 42–96, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York (1989), dargelegt wurden.
Wird eine In-vivo-Verabreichung von WISP-Polypeptiden verwendet, so können normale Dosierungsmengen von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg des Körpergewichts des Säugetiers oder mehr pro Tag variieren, vorzugsweise etwa 1 µg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag, in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg. Richtlinien bezüglich spezifischer Dosierungen und Anlieferungsverfahren werden in der Literatur bereitgestellt; siehe z. B. US-Patent Nr. 4.657.760 ; 5.206.344 oder 5.225.212 . Es wird erwartet, dass unterschiedliche Formulierungen für unterschiedliche Behandlungen und unterschiedliche Erkrankungen wirksam sind und dass die Verabreichung, die zur Behandlung eines spezifischen Organs oder Gewebes gedacht ist, die Anlieferung auf eine andere Art und Weise als an ein anderes Organ oder Gewebe erfordern kann.
Die hierin verwendeten Formulierungen können auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, je nach Notwendigkeit für die bestimmte Indikation, die behandelt wird, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die einander nicht nachteilig beeinträchtigen. Das WISP-Polypeptid kann in Kombination mit einem zytotoxischen Mittel, einem Zytokin oder einem wachstuminhibierenden Mittel verabreicht werden. Solche Moleküle sind in Kombinationen und Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind. Es kann wünschenswert sein, Antikörper gegen andere mit Immunkrankheiten assoziierte oder tumorassoziierte Antigene zu verabreichen, z. B. Antikörper, die an CD20, CD11a, CD40, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 oder den Gefäßendothelwachstumsfaktor binden. Alternativ oder zusätzlich dazu können dem Patienten in Coverabreichung zwei oder mehr Antikörper verabreicht werden, die dieselben oder zwei oder mehr verschiedene Antigene binden, wie sie hierin offenbart sind. Manchmal kann es von Vorteil sein, dem Patienten auch ein oder mehrere Zytokin(e) zu verabreichen. In einer Ausführungsform werden die Polypeptide der Erfindung in Coverabreichung mit einem wachstumsinhibierenden Mittel verabreicht. Das wachstumsinhibierende Mittel kann z. B. zuerst verabreicht werden, gefolgt von einem WISP-Polypeptid der Erfindung. Wiederum andere Mittel können in Kombination mit WISP-Polypeptid verabreicht werden, wie z. B. Mittel, wie etwa Decorin oder Biglycan. Eine gleichzeitige Verabreichung oder eine aufeinander folgende Verabreichung wird auch in Betracht gezogen.
Das vorliegende Verfahren kann auch in Kombination mit einem beliebigen Standard-Knorpeloperationsverfahren angewandt werden. Standard-Operationsverfahren sind Operationsverfahren, die häufig für therapeutische Manipulationen von Knorpelgewebe verwendet werden und umfassen: Knorpelshaving, Abrasionschondroplastik, Laser-Reparatur, Debridement, Chondroplastik, Mikrofraktur mit oder ohne subchondrale Knochenpenetration, Mosaikplastik, Knorpelzellen-Allotransplantate, Stammzellen-Autotransplantate, Rippenknorpeltransplantate, chemische Stimulation, elektrische Stimulation, perichondrale Autotransplantate, periosteale Autotransplantate, Knorpelgerüste, (osteoartikuläre) Cortex-Autotransplantate oder -Allotransplantate oder Osteotomie. Diese Verfahren werden ausführlicher in Frenkel et al., Front. Bioscience 4, d671–685 (1999), beschrieben und erörtert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die WISP-Polypeptide in Kombination mit Mikrofraktur-Operationen verwendet. Mikrofrakturoperationsverfahren sind nach dem Stand der Technik bekannt und umfassen allgemein das Bohren in den Knochenmarkhohlraum des Säugetiers im Rahmen eines chirurgischen Eingriffs. Anschließend bilden sich Fibrin-Klumpen, die den Defekt im Körper des Säugetiers auffüllen. Dann bilden sich Faserknorpel-Formen.
Es wird in Betracht gezogen, dass WISP-Polypeptide zur Ex-vivo-Behandlung von Knorpel- oder Chondrozyten-Zellen verwendet werden können. Solch eine Ex-vivo-Behandlung kann bei Transplantationen von Nutzen sein, insbesondere bei autologen Transplantationen. Die Behandlung von Zellen oder Gewebe(n) etwa, die diese Knorpel- oder Chondrozyten-Zellen enthalten, mit WISP-Polypeptid und gegebenenfalls mit einem oder mehreren anderen Therapien, wie oben stehend beschrieben, kann verwendet werden, um Knorpelgewebe zu regenerieren oder um die Differenzierung von Vorläufer-Chondrozyten-Zellen vor der Transplantation in ein Empfänger-Säugetier zu induzieren.
Zellen oder Gewebe, die Knorpel- oder Chondrozyten-Zellen enthalten, werden zuerst von einem Spender-Säugetier erhalten. Die Zellen oder Gewebe können operativ erhalten werden und werden vorzugsweise aseptisch erhalten. Die Zellen oder Gewebe werden anschließend mit WISP-Polypeptid behandelt und gegebenenfalls mit einem oder mehreren anderen Therapien, wie oben stehend beschrieben wurde.
Die behandelten Zellen oder Gewebe können anschließend in ein Empfänger-Säugetier infundiert oder transplantiert werden. Bei dem Empfänger-Säugetier kann es sich um dasselbe Individuum handeln wie bei dem Spender-Säugetier oder kann ein anderes heterologes Tier sein.
Der Fortschritt oder die Wirksamkeit der hierin beschriebenen Therapien kann durch konventionelle Verfahren und Tests, die dem geübten Arzt bekannt sind, leicht überwacht werden.
Die Aktivität oder Wirkungen der hierin beschriebenen WISP-Polypeptide auf das Knorpelgewebe oder die Chondrozyten kann/können ohne übermäßige Experimente unter Verwendung verschiedener In-vitro- oder In-vivo-Tests bestimmt werden. Als Beispiel werden einige dieser Tests unten stehend beschrieben.
In einem Test kann das synthetische und prophylaktische Potential von WISP-Polypeptid auf intaktes Knorpelgewebe getestet werden. Dazu werden Proteoglycan(PG-)Synthese und -Zerstörung sowie die Stickstoffoxidfreisetzung in getesteten Gelenksknorpel-Explantaten gemessen. Proteoglycane sind die zweitgrößte Komponente des organischen Materials in Gelenksknorpelgewebe (K. E. Kuettner et al., Articular Cartilage Biochemistry, 456, Raven Press, New York, USA (1986); H. Muir, Biochem. Soc. Tran. 11, 613–622 (1983); T. E. Hardingham, Biochem. Soc. Trans. 9, 489–497 (1981)). Da Proteoglycane die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Knorpelgewebe bestimmen helfen, führt die Verringerung von Knorpel-PGs, die während einer Gelenkdegeneration auftritt, zu einem Verlust kompressiver Steifheit und Elastizität, einer Erhöhung der hydraulischen Permeabilität, einem erhöhten Wassergehalt (Schwellung) sowie Veränderungen in der Organisation anderer extra zellulärer Komponenten, wie z. B. Kollagene. Daher ist PG-Verlust ein früher Schritt in der Progression degenerativer Knorpelerkrankungen, und zwar einer, der die biomechanische und biochemische Stabilität des Gelenks weiter stört. PGs in Gelenkknorpelgewebe wurden aufgrund der Wahrscheinlichkeit ihrer Rolle im Wachstum und bei Erkrankungen des Skeletts ausgiebig untersucht. V. C. Mow & A. Ratcliffe, Biomaterials 13, 67–97 (1992). Die Proteoglycan-Zerstörung, die in erkrankten Gelenken erhöht ist, kann durch Quantifizierung von PGs, die in das Medium durch Gelenksgewebe-Explantate freigesetzt werden, unter Verwendung des kolorimetrischen DMMB-Tests gemessen werden. Farndale und Buttle, Biochem. Biophys. Acta. 883, 173–177 (1985). Die Inkorporation von ³⁵S-Sulfat in Proteoglycane wird verwendet, um die Proteoglycan-Synthese zu messen.
Beweise, die Interleukin-1α, IL-1β und degenerative Knorpelerkrankungen in Verbindung bringen, weisen ein wesentliches Ausmaß auf. Große Mengen von IL-1α etwa (J. P. Pelletier et al., Cytokines and inflammation in cartilage degradation, in: Osteoarthritic Edition of Rheumatic Desease Clinics of North America, 545–568, R. W. Moskowitz (Hrsg.), W. D. Saunders Company, Philadelphia (1993)) sowie IL-1-Rezeptoren (Martel-Pelletier et al., Arthritis Rheum. 35, 530–540 (1992)) wurden in erkrankten Gelenken gefunden, und IL-1α induziert die Knorpelmatrix-Zerstörung und inhibiert die Synthese neuer Matrix-Moleküle. Baragi et al., J. Clin. Invest. 96, 2454–60 (1995); Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage 5, 275–82 (1997); Evans et al., J. Leukoc. Biol. 64, 55–61 (1998); Evans et al., J. Rheumatol. 24, 2061–63 (1997); Kang et al., Biochem. Soc. Trans. 25, 533–37 (1997); Kang et al., Osteoarthritis Cartilage 5, 139–43 (1997). Aufgrund der Assoziierung von IL-1α mit Erkrankungen kann das WISP-Polypeptid auch in Gegenwart von IL-1α getestet werden. Die Fähigkeit des WISP-Polypeptids, nicht nur positive Wirkungen auf Knorpelgewebe aufzuweisen, sondern auch den katabolischen Wirkungen von IL-1α entgegenzuwirken, ist ein starker Beweis der schützenden Wirkung des WISP-Polypeptids. Zusätzlich dazu deutet solch eine Aktivität darauf hin, dass das WISP-Polypeptid die Degradation inhibieren könnte, die bei arthritischen Erkrankungen auftritt, da katabolische Vorkommnisse, die von IL-1α initiiert werden, auch von vielen anderen Zytokinen indu ziert werden und da vom Antagonismus der IL-1α-Aktivität gezeigt wurde, dass er das Fortschreiten von Osteoarthritis reduziert. W. P. Arend et al., Ann. Rev. Immunol. 16, 27–55 (1998).
Die Produktion von Stickstoffoxid (NO) kann in Knorpelgewebe durch katabolische Zytokine, wie z. B. IL-1, induziert werden. R. M. J. Palmer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 398–405 (1993). NO wurde auch mit der Gelenkzerstörung in Verbindung gebracht, die in arthritischen Erkrankungen auftritt. Ashok et al., Curr. Opin. Rheum. 10, 263–268 (1998). Im Gegensatz zu normalem (nicht erkranktem oder nicht verletztem) Knorpelgewebe produzierte osteoarthritisches Knorpelgewebe ex vivo signifikante Mengen an Stickstoffoxid, sogar in Abwesenheit zugeführter Stimuli, wie z. B. Interleukin-1 oder Lipopolysaccharid (LPS). In-vivo-Tier-Modelle zeigen, dass die Inhibierung der Stickstoffoxid-Produktion das Fortschreiten von Arthritis reduziert. J. P. Pelletier et al., Arthritis Rheum. 7, 1275–86 (1998); Van de Loo et al., Arthritis Rheum. 41, 634–46 (1998); D. O. Stichtenoth und J. C. Frolich, Br. J. Rheumatol. 37, 246–57 (1998). In vitro weist Stickstoffoxid schädliche Wirkungen auf die Chondrozytenfunktion auf, unter anderem die Inhibierung von Kollagen- und Proteoglycan-Synthese, die Inhibierung der Adhäsion an die extrazelluläre Matrix und die Verbesserung des Zelltods (Apoptose). Höhere Konzentrationen von Nitrit sind im Vergleich zu Flüssigkeit von rheumatoiden arthritischen Patienten in Synovialflüssigkeit von osteoarthritischen Patienten zu finden. Renoux et al., Osteoarthritis Cartilage 4, 175–179 (1996). Weiters zeigen Tiermodelle, dass die Inhibierung der Stickstoffoxid-Produktion das Fortschreiten von Arthritis reduziert. J. P. Pelletier et al., Arthritis Rheum. 7, 1275–86 (1998); Van de Loo et al., Arthritis Rheum. 41, 634–46 (1998); D. O. Stichtenoth und J. C. Frolich, Br. J. Rheumatol. 37, 246–57 (1998). Da NO auch Wirkungen auf andere Zellen zeigt, könnte die Gegenwart von NO innerhalb des Gelenks die Gefäßerweiterung und -permeabilität erhöhen, die Zytokin-Freisetzung durch Leukozyten potenzieren und die angiogene Aktivität stimulieren. Da NO wahrscheinlich sowohl bei den erosiven als auch bei den entzündlichen Komponenten von Gelenkserkrankungen eine Rolle spielt, könnte ein Faktor, der die Stickstoffoxid-Produktion verringert, wahrscheinlich für die Behandlung von degenerativen Knorpelerkrankungen von Vorteil sein.
Der Test zur Messung der Stickstoffoxid-Produktion basiert auf dem Prinzip, dass 2,3-Diaminonaphthalin (DAN) mit Nitrit unter sauren Bedingungen reagiert, um 1-(H)-Naphthotriazol, ein fluoreszierendes Produkt, zu bilden. Da NO schnell zu Nitrit (NO₂ ^–1) und Nitrat (NO₃ ^–1) metabolisiert wird, ist die Detektion von Nitrit ein Verfahren zur Detektion (trotz Unterzählung) des tatsächlichen NO, das vom Gewebe produziert wurde.
Die Fähigkeit eines WISP-Polypeptids, die Lebensfähigkeit von Chondrozyten in Kulturen in Abwesenheit von Serum oder anderen Wachstumsfaktoren zu verbessern, zu fördern oder beizubehalten, kann ebenfalls untersucht werden. Gelenks-Chondrozyten werden zuerst durch Entfernung der extrazellulären Matrix vorbereitet und in einer Monoschicht gezüchtet, von der angenommen wird, dass sie den späteren Stadien von Knorpelerkrankungen, wenn die Matrix erschöpft wurde, ähnelt. Bei dem Test handelt es sich um einen kolorimetrischen Test, der die metabolische Aktivität der gezüchteten Zellen basierend auf der Fähigkeit lebensfähiger Zellen, das gelbe Tetrazolium-Salz MMT zu spalten, um purpurrote Formazankristalle zu bilden, misst. Diese zelluläre Reduktionsreaktion umfasst die Pyridin-Nucleotid-Cofaktoren NADH und NADPH. M. V. Berridge & A. S. Tan, Arch. Biochem. Biophys. 303, 474 (1993). Das solubilisierte Produkt ist spektrophotometrisch auf einem ELISA-Lesegerät quantifiziert.
Ein anderer Test untersucht die Wirkungen von WISP-Polypeptiden auf die Proteoglycan-Synthese in Patellen (Kniescheiben) von Mäusen. Dieser Test verwendet intaktes Knorpelgewebe (inklusive dem darunter liegenden Knochen) und testet daher Faktoren unter Bedingungen, die der In-vivo-Umgebung von Knorpelgewebe ähneln. Verbindungen werden entweder in vitro zu den Patellen zugegeben oder in vivo in Kniegelenke vor der Analyse der Proteoglycan-Synthese in Patellen ex vivo injiziert. Wie zuvor bereits gezeigt wurde, zeigen in vivo behandelte Patellen deutliche Veränderungen der PG-Synthese ex vivo (Van den Berg et al., Rheum. int. 1, 165–9 (1982); P. J. Vershure et al., Ann. Heum. Dis. 53, 455–460 (1994); und Van de Loo et al., Arthrit. Rheum. 38, 164–172 (1995)). In diesem Modell kann das kontralaterale Gelenk eines jeden Tieres als Kontrolle verwendet werden.
Ein Meerschweinchen-Modell kann verwendet werden, um die Wirkungen von WISP-Polypeptiden sowohl auf die Stimulierung von PG-Synthese als auch auf die Inhibierung von PG-Freisetzung in Gelenksknorpel-Explantaten aus einer Meerschweinchen-Art, Dunkin Hartley (DH), zu messen, die spontan Knie-Osteoarthritis (OA) entwickelt. Die meisten anderen Tiermodelle, die zu einem schnell fortschreitenden Gelenkszusammenbruch führen, ähneln sekundärer OA mehr als der langsam fortschreitenden menschlichen primären OA. Im Gegensatz dazu weisen DH-Meerschweinchen natürlich auftretende, langsam fortschreitende, nicht-entzündliche OA-ähnliche Veränderungen auf. Da das hochgradig reproduzierbare Muster des Knorpelzusammenbruchs bei diesen Meerschweinchen jenem ähnelt, das bei der menschlichen Erkrankung zu sehen ist, ist das DH-Meerschweinchen ein weitgehend akzeptiertes Tiermodell für Osteoarthritis. Young et al., Osteoarthritis, Spontaneous animal models of human disease, Band 2, 257–261, Acad. Press, New York (1979); Bendele et al., Arthritis Rheum. 34, 1180–1184; Bendele et al., Arthritis Rheum. 31, 561–565 (1988); Jimenez et al., Laboratory Animal Sciences 47 (6), 598–601 (1997); Wei et al., Acta Orthop. Scand. 69, 351–357 (1998). Anfänglich entwickeln diese Tiere eine leichte OA, die durch die Gegenwart minimaler histologischer Veränderungen detektierbar ist. Die Krankheit schreitet jedoch weiter fort, und im Alter von 16–18 Monaten werden moderate bis schwere Knorpeldegenerationen innerhalb der Gelenke beobachtet. Als ein Resultat wäre die Wirkung des WISP-Polypeptids auf die Knorpelmatrix der DH-Meerschweinchen während des Fortschreitens der Krankheit ein Indikator der therapeutischen Wirkung der Verbindung in der Behandlung von OA in verschiedenen Stadien der Gelenkzerstörung.
Die metabolischen Veränderungen, die mit Diabetes mellitus (Diabetes) assoziiert sind, betreffen viele andere Organ- und Muskel-Skelett-Systeme der betroffenen Organismen. Bei Menschen wird z. B. das Auftreten von Muskel-Skelett-Verletzungen und -Erkrankungen mit dem Ausbruch von Diabetes erhöht, und Diabetes wird als Risikofaktor für die Entwicklung von Arthritis angesehen.
Ein Syndrom ähnlich dem des Diabetes kann bei Tieren durch Verabreichung von Streptozotocin (STZ) induziert werden. B. Portha et al., Diabete Metab. 15, 61–75 (1989). Durch das Abtöten von Pankreaszellen, die Insulin produzieren, verringert STZ die Serum-insulin-Menge bei behandelten Tieren. STZ-induzierter Diabetes ist mit Atrophie und verringertem Kollagengehalt des Bindegewebes, unter anderem der Haut, der Knochen und des Knorpelgewebes, assoziiert. R. G. Craig et al., Biochim. Biophys. Acta 1402, 250–260 (1998). In diesem Test werden die Patellen behandelter STZ-behandelter Mäuse in Gegenwart des WISP-Polypeptids inkubiert, und die resultierende Matrix-Synthese wird analysiert. Die Fähigkeit des WISP-Polypeptids, das Ausmaß der PG-Synthese auf jenes unbehandelter Kontrollen zu erhöhen oder wiederherzustellen, ist ein Indikator des therapeutischen Potentials.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Sets und Fabrikate bereitgestellt, die Materialien enthalten, die für die Diagnose oder die Behandlung der oben stehend beschriebenen Erkrankungen von Nutzen sind. Das Fabrikat umfasst einen Behälter und eine Gebrauchsanweisung. Geeignete Behälter umfassen z. B. Flaschen, Phiolen, Injektionsspritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus einer Reihe an Materialien, z. B. Glas oder Kunststoff, bestehen. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die zur Diagnose oder Behandlung der degenerativen Gelenkserkrankung wirksam ist und kann eine sterile Zugangsöffnung aufweisen (z. B. kann der Behälter ein Beutel für intravenöse Lösung oder eine Phiole mit einem Stöpsel, der von einer subkutanen Injektionsnadel zu durchstechen ist, sein). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist typischerweise ein WISP-Polypeptid. Die Zusammensetzung kann ein beliebiges oder mehrere hierin offenbarte Bestandteile umfassen. Die Anleitung, die sich auf dem Behälter oder in Assoziierung mit diesem befindet, gibt an, dass die Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung der ausgewählten Erkrankung verwendet wird. Die Anleitung könnte z. B. angeben, dass die Zusammensetzung für die Behandlung von Osteoarthritis, Arthritis, Gelenkrheumatismus oder einer beliebigen anderen degenerativen Knorpelerkrankung von Nutzen ist. Das Fabrikat kann weiters einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z. B. phosphatgepufferte Salzlösung, Ringerlösung und Dextrose-Lösung, umfasst. Alternativ dazu kann die Zusammensetzung beliebige der hierin genannten Träger, Exzipienten und/oder Stabilisatoren enthalten. Sie kann weiters andere Materialien umfassen, die vom kommerziellen Standpunkt oder vom Standpunkt des Benutzers wünschenswert sind, umfassend andere Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Injektionsnadeln und Packungsbeilagen mit Anweisungen zur Verwendung.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht zur Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung auf irgendeine Art und Weise gedacht.
BEISPIELE
Im Handel erhältliche Reagenzien, die in den Beispielen angeführt werden, wurden, falls nicht anders angegeben, den Anweisungen des Herstellers entsprechend verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnr. identifiziert wurde, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA. Falls nicht anders angegeben, verwendet die vorliegende Erfindung Standardverfahren der DNA-Rekombinationstechnologie, wie z. B. jene, die hierin oben stehend und in den folgenden Lehrbüchern beschrieben werden: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N. Y. (1990); Harlow et al., Antibodies: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor (1988); M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford (1984); R. I. Freshney, Animal Cell Culture (1987); Coligan et al., Current Protocols in Immunology (1991).
Beispiel 1
In den unten stehend beschriebenen Versuchen werden folgende Verfahren und Materialien verwendet:
Materialien: Chondroitinsulfat A aus der Rinder-Trachea, Chondroitinsulfat C aus Hai-Knorpelgewebe, Hyaluronidase (EC 3.2.1.45) aus Rinder-Hoden und Chondroitinase AC II (EC 4.2.2.5) aus Artherobacter aurenscens wurden von Calbiochem (San Diego) gekauft. Chondroitinsulfat B, Heparin und Heparansulfat aus Darmschleimhaut von Schweinen, Decorin und Biglycan aus Rinder-Gelenksknorpelgewebe, Chondroitinase C, Chondroitinase B und Heparinase I (EC 4.2.2.7) aus Flavobacterium hepanium wurden von Sigma erhalten. Chondroitinsulfat D aus Hai-Knorpelgewebe und Chondroitinsulfat E aus Theutida-Knorpelgewebe wurden von United States Biological (Swampscott, MA) gekauft. Neuraminidase (EC 3.2.2.18) aus Vibrio Cholera, Chondroitinase ABC (EC 4.2.2.4), proteasefrei aus Proteus vulgaris, vollständige EDTA-freie Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten und die Fettsäure-ultrafreie BSA-Fraktion V wurden von Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN) gekauft. Chondroitin-4-sulfatase (EC 3.1.6.9) und Chondroitin-6-sulfatase (EC 3.1.6.10) aus Proteus vulgaris stammten von ICN Biomedicals (Aurora, 10). Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes und biotinyliertes Ziegen-Anti-Mensch-IgG, Fc-Fragment-spezifisches und biotinyliertes Anti-Schaf-IgG wurde von Jackson ImmunoResearch (Costa Mesa, CA) gekauft. Verwendungsfertige Proteinase K (EC 3.4.21.14), konjugiertes Texasrot-Streptavidin und monoklonale Anti-Vimentin-Antikörper (Klon Vim 3B4) stammten von Dako (Carpinteria, CA). 5-Chlormethylfluoresceindiacetat (5-CFDA) und Hoechst 33342 wurden von Molecular Probes (Eugene, OR) gekauft. Das indirekte Renaissance-TSA-Amplifikationsset wurde von NEN Life Science Products (Boston, MA) gekauft. Vectashield-Einbettungsmittel und biotinyliertes Pferde-Anti-Maus-IgG wurden von Vector (Burlingame, CA) erhalten.
Murines WISP-1 voller Länge (Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 14717–14722 (1998); WO 99/21998 ) wurde in einen Expressionsvektor kloniert, der für die menschliche IgG1-Fc-Region stromab der WISP-1-Sequenz kodiert, wie zuvor für TNFR1 beschrieben (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 10535–10539 (1991)). Das resultierende rekombinante Fusionsprotein (WISP-1-Fc) wurde in einem Baculovirus-Expressionssystem unter Verwendung von Sf9-Insektenzellen synthetisiert und durch Affinitätschromatographie auf einer Protein-A-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Pharmacia Biotech, Schweden) bis zur Homogenität aus serumfreiem konditi oniertem Medium gereinigt. Nicht absorbierte Proteine wurden mit 50 mM Natriumphosphatpuffer, enthaltend 1 M NaCl, ausgewaschen. WISP-1-Fc wurde mit 100 mM Glycin, pH 2,5, eluiert, und der pH wurde mit 0,1 Volumeneinheiten 3 M Tris-HCl, pH 8, neutralisiert. Nach der Dialyse (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM) wurde das gereinigte Protein durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centriprep-30 (Millipore Corp., Redford, MA) konzentriert, und die Reinheit wurde durch SDS-PAGE und Silberfärbung berechnet. Die Experimente wurden zumindest drei Mal mit drei verschiedenen Protein-Chargen wiederholt, die zu unterschiedlichen Zeiten exprimiert und gereinigt wurden, und es wurden ähnliche Resultate erhalten.
Zellkultur: NRK (normale Ratten-Nieren-Fibroblasten), Hs 597.Sk (normale menschliche Haut-Fibroblasten), Hs 839.T (menschliche Haut-Melanom-Fibroblasten), Hs 908.Sk (menschliche Haut-Melanom-Fibroblasten), COLO 320 DM (menschliche Kolon-Adenokarzinom-Zellen), RAG (Maus-Nieren-Adenokarzinom-Zellen), 293 (menschliche Nieren-Epithelzellen), HUVEC (menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen) und WM-266-4 (menschliche Haut-Melanom-Epithelzellen) wurden von der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit niedrigem Glucosegehalt/Ham F-12 (1:1), ergänzt mit 10% FRS, bei 37°C unter 5% CO₂ gehalten.
Zellbindung: Die Zellen wurden in 8-Well-Kunststoffkammer-Objektträgern ausplattiert und über Nacht bei 37°C, 5% CO₂, gehalten. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit PBS gewaschen, und die Wells wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3% BSA in HBS-C-Puffer blockiert (25 mM Hepes, pH 7,2, 150 NaCl, 3 mM CaCl₂, 3 mM MgSO₄, 5 mM KCl, vollständiger Protease-Inhibitor-Cocktail). Falls angegeben, wurden die Zellen gewaschen und vor dem Blockieren 2 Stunden lang bei 37°C mit 0,1 U der verschiedenen Lyasen inkubiert (siehe Vacherot et al., J. Biol. Chem. 274, 7741–7747 (1999)). Die Zellen wurden mit 1 nM mWISP-1-IgG 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und mit 0,2 µg/ml biotinyliertem Anti-Mensch-IgG-Fc' in HBS-C/3% BSA 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Signal wurde unter Verwendung des indirekten TSA-Sets (NEN Dupont) gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Nach einer 30-Minuten-Inkubation mit 1:200-FITC-konjugiertem Streptavidin (DAKO) wurden die Objektträger unter Verwendung von Vectashield, enthaltend 1 µg/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes), angeordnet und unter einem Nikon-Eclipse-800-Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Bilder wurden unter Verwendung einer gekühlten Photometrics-300-CCD-Kamera erhalten. Die Messung der Fluoreszenzintensität der Zellen war wie zuvor beschrieben mit Modifikationen (Szurdoki et al., Anal. Biochem. 291, 219–228 (2001)). Kurz gesagt wurden Bilder von mindestens drei verschiedenen Feldern, enthaltend einen Durchschnitt von 90 Zellen, erhalten und als elektronische Dateien gespeichert. Der Schwellenwert wurde als die niedrigste Intensität der 1% der hellsten Pixel in einer negativen Kontrolle definiert, die ohne WISP-1-Fc durchgeführt wurde. Das Fluoreszenzsignal für eine Zellpopulation wurde als die gesamte Pixelintensität über dem Schwellenwert, dividiert durch die Zellenanzahl, definiert.
Festphasen-Bindungstest: Proteine wurden in 50 µl (Gesamtvolumen) PBS verdünnt, auf Polystyrol-Mikrotiter-Wells aufgebracht und bei 4°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Wells drei Mal mit 300 µl HBS-c, enthaltend 0,3% BSA, gewaschen, und die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 200 µl HBS-C/3% BSA blockiert. Der Puffer wurde abgesaugt, und 50 µl 0,5 nM WISP-1-IgG wurde in HBS-C/3% BSA wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Wells wurden gewaschen und 1 Stunde lang mit 50 µl von 2 µl/ml Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Mensch-IgG-Fc' in HBS-C/3% inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Wells 6-mal mit 200 µl PBS, enthaltend 0,05% Tween-20, gewaschen, und das Signal wurde unter Verwendung von 100 µl des chromogenen Meerrettich-Peroxidase-Substrats TMB (KPL) sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde mit 100 µl 1 M Phosphorsäure gestoppt, und die OD bei 450 nm wurde gemessen. Die nicht-spezifische WISP-1-Fc-Bindung wurde in parallelen Inkubationen durch Auslassen der Mikrotiterwell-Beschichtung bestimmt. Es wurde kein Signal erzeugt, als WISP-1-Fc ausgelassen wurde.
Reinigung von WISP-1-Bindungsfaktoren: Menschliche Haut-Fibroblasten wurden alle 3 Tage zwischen serumhältigem und serumfreiem Kulturmedium einem Zyklus unterzogen. Das serumfreie konditionierte Medium wurde auf einem Centriprep-30 (Millipore, Redford, MA) konzentriert. Anschließend wurde der Puffer durch sequenzielles Hinzufügen von 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl und erneutes Konzentrieren verändert. Das Konzentrat (150 µl Protein/ml) wurde schockgefroren und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Das konzentrierte, konditionierte Medium wurde aufgetaut, filtriert und auf eine Mono-Q-Anionenaustauschsäule aufgebracht, die in 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 300 mM NaCl, äquilibriert worden war. Die Säule wurde gewaschen, und die adsorbierten Proteine wurden unter Verwendung eines linearen Gradienten aus NaCl (300 mM – 2 M) in demselben Puffer eluiert. Fraktionen von 500 µl wurden auf die WISP-1-Bindungsaktivität analysiert.
Protein-Identifikation durch Massen-Spektrometrie: Die Fraktionen, welche die WISP-1-Bindungsaktivität enthielten, wurden gepoolt, denaturiert, reduziert und auf 4-15-%-Gradienten-Acrylamid-SDS-PAGE mit oder ohne eine vorhergehende Inkubation für 2 Stunden bei 37°C mit 0,1 U Chondroitinase ABC aufgebracht. Die Gele wurden silbergefärbt, und die Proteinbanden, die eine Mobilitätsveränderung nach dem Chondroitinase-ABC-Verdau zeigten, wurden ausgeschnitten und in situ mit Trypsin verdaut, wie zuvor von Arnott et al., Electrophoresis 19, 968–980 (1998), beschrieben. Tryptische Peptide wurden extrahiert und mittels mikrokapillarer Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie analysiert. Peptidgemische wurden auf 10 cm lange Quarzglas-Kapillarsäulen mit einem Innendurchmesser von 100 µm aufgebracht, die mit 5-µm-C18-Perlen (238MSB5; Vydac, Hesperia, CA) gepackt sind, und mit einem Acetonitrilgradienten direkt in die Mikroelektrospraylonisierungsquelle eines Ionenfallen-Massenspektrometers eluiert (LCQ; Thermoquest, San Jose, CA). Eine Durchflussgeschwindigkeit von 500 nl/min wurde durch eine Prä-Säulen-Teilung von 25 µl/min erhalten, die von der HPLC stammen (Ultra Plusll; Microtech Scientific, Sunnyvale, CA; Arnott et al., s. o.). Die automatisierte, datenabhängige Akquisition von Massenspektren stellte die Molekülmassen-(MS) und die Sequenzdaten (MS/MS) für Peptide bereit, als diese aus der Säule eluiert wur den. Es wurden Proteine durch Korrelation von MS/MS-Daten mit Einträgen in einer nicht-redundanten Proteinsequenz-Datenbank unter Verwendung des Sequest-Programms identifiziert (C. Gatlin, J. Eng, S. Cross, J. Detter und Yates III, Analytical Chemistry 73, 757–763 (2000)). Proteinübereinstimmungen wurden durch händische Interpretation der Spektra bestätigt.
Immunfluoreszenz: Auf Objektträgern angebrachte, menschliche Kolon-Tumorschnitte wurden auf Raumtemperatur gebracht, mit 70% Ethanol 10 Minuten lang fixiert, und die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden mit PBS/3% BSA, enthaltend 1,5% normales Serum, 20 Minuten lang gesättigt. Die Schnitte wurden 1 Stunde lang mit 0,125 Mikrogramm/ml Anti-Vimentin-Antikörper inkubiert, mit PBS gewaschen und weiters 30 Minuten lang mit 2 Mikrogramm/ml biotinyliertem Anti-Maus-IgG-Antikörper inkubiert. Das Signal wurde unter Verwendung des indirekten TSA-Sets gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Nach einer 30-Minuten-Inkubation mit 1:1000-Texasrot-konjugiertem Streptavidin wurden die Objektträger unter Verwendung von Vectashield, enthaltend 1 Mikrogramm/ml Hoechst 33342, angeordnet und unter einem Nikon-Eclipse-800-Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Bilder wurden unter Verwendung einer gekühlten Photometrics-300-CCD-Kamera erhalten. Die negative Kontrolle, die in Abwesenheit von Primär-Antikörper durchgeführt wurde, zeigte keine fluoreszierende Färbung.
Die immunfluoreszierende Detektion von Decorin auf menschlichen Haut-Fibroblasten wurde unter Verwendung eines ähnilchen Protokolls durchgeführt. 8 × 10³ Zellen wurden in Kammer-Objektträgern ausplattiert und über Nacht gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die Zellen gewaschen und bei 37°C 15 Minuten lang mit frischem Medium, enthaltend 5 Mikrogramm/ml 5-CFDA, inkubiert. Nach dem Waschen wurden die nicht-spezifischen Bindungsstellen mit HBS-C/3% BSA 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gesättigt. Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1:4000 Schaf-Anti-Mensch-Decorin-Antikörper in HBS-C/0,1% BSA inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd/PBS 10 Minuten lang fixiert, gewaschen und weiter 30 Minuten lang mit 2 Mikrogramm/ml biotinyliertem Anti-Schaf-IgG inkubiert. Das Signal wurde unter Verwendung des indirekten TSA-Sets amplifiziert. Nach einer 30-Minuten-Inkubation mit 1:1000-Texasrot-konjugiertem Streptavidin wurden die Objektträger unter Verwendung von Vectashield, enthaltend 1 Mikrogramm/ml Hoechst 33342, angeordnet und unter einem Nikon-Eclipse-800-Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Bilder wurden unter Verwendung einer gekühlten Photometrics-300-CCD-Kamera erhalten. Die negative Kontrolle, die in Abwesenheit von Primär-Antikörper durchgeführt wurde, zeigte keine fluoreszierende Färbung.
Analyseverfahren: Eine SDS-PAGE wurde gemäß Laemli, Nature 227, 680–685 (1970), durchgeführt, und zwar unter Verwendung einer Bio-Rad-Mini-PROTEAN-II-Vertikal-Plattengel-Elektrophoresevorrichtung. Die offensichtliche Molekülmasse wurde unter Verwendung der Breitband-Molekulargewichtstandards von Bio-Rad bestimmt. Das Protein wurde unter Verwendung des Bio-Rad-Proteintest-Silberfärbungs-Farbreagens und des Rinderserum-Albumin-Standards bestimmt.
A. Bindung von WISP-1 an verschiedene Zelllinien und menschliche Kolon-Tumorschnitte
Es wurde die Bindung eines chimären rekombinanten Maus-WISP-1, das eine menschliche Immunglobulin-Fc-Fragment-Markierung aufweist, an verschiedene Zellen in der Kultur analysiert. Die Zellen wurden in Kammer-Objektträgern ausgesät und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die nicht-spezifischen Bindungsstellen blockiert, und die Zellen wurden 1 Stunde lang mit 1 nM mWISP-1-IgG oder ohne mWISP-1-IgG inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, fixiert, und die Bindung von WISP-1-IgG wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Mensch-IgG-Antikörpers und des indirekten Tyramid-Substrat-Amplifikationsverfahrens, gefolgt von FITC-konjugiertem Streptavidin, detektiert.
Wie in 1 zusammengefasst, war die Bindung von WISP-1 nur an der Oberfläche von Fibroblasten-Zelllinien zu sehen. Es wird z. B. die Bindung von WISP-1 an NRK-Zellen veranschaulicht (1A). Weiters band das Protein auch an Fibroblasten von Ratten oder menschlichen Ursprungs, unabhängig davon, ob diese normal waren oder von Haut-Melanomen stammten. Auf der anderen Seite konnte kein fluoreszierendes Signal detektiert werden, wenn Maus-Nieren-Adenokarzinom-Zellen, menschliche Kolon-Adenokarzinom-Zellen, menschliche Nieren-Epithelzellen, menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen oder menschliche Haut-Melanom-Epithelzellen verwendet wurden. Es wird z. B. die Bindung von WISP-1 an RAG-Zellen veranschaulicht (1B). Es konnte kein Signal detektiert werden, wenn die Zugabe von WISP-1 weggelassen wurde oder wenn ein nicht verwandter biotinylierter Sekundär-Antikörper verwendet wurde (IC).
Die Bindung von WISP-1 an menschliche Kolon-Tumorschnitte wurde unter Verwendung von In-situ-Ligandenbindungsverfahren evaluiert. Auf Objektträger aufgebrachte menschliche Kolon-Tumorschnitte wurden auf Raumtemperatur gebracht und sofort 4 Minuten lang in 35 mM Essigsäure (pH 3,5), enthaltend 3 mM CaCl₂, 3 mM MgSO₄, 5 mM KCl und 1 M NaCl, inkubiert. Die Objektträger wurden anschließend in HBS-C gewaschen (25 mM Hepes, pH 7,2, 150 NaCl, 3 mM CaCl₂, 3 mM MgSO₄, 5 mM KCl, vollständiger Protease-Inhibitor-Cocktail), enthaltend 32 mM Saccharose, und die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden 20 Minuten lang in HBS-C, enthaltend 3% BSA, 1,5% normales Ziegenserum und 32 mM Saccharose, blockiert. Die Bindungsstellen waren Avidin und Biotin und wurden unter Verwendung des Avidin/Biotin-Blockierungssets von Vector (Burlingame, CA) blockiert. Die Objektträger wurden 1 Stunde lang in HBS-C/3% BSA und 1 nM WISP-1-Fc inkubiert, drei Mal jeweils eine Minute lang mit kaltem (4°C) HBS-C/1% BSA gewaschen und 10 Minuten lang in PBS/4% Paraformaldehyd fixiert. Die Objektträger wurden mit 0,2 Mikrogramm/ml biotinyliertem Ziegen-Anti-Mensch-IgG, Fc-spezifisch in HBS-C/3% BSA, 30 Minuten lang inkubiert, gewaschen und 10 Minuten lang in PBS/4% Paraformaldehyd fixiert. Das Signal wurde unter Verwendung des indirekten TSA-Amplifikationssets gemäß den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Die Reaktion wurde durch drei Waschschritte zu 4 Minuten in TBS/0,1% BSA gestoppt. Die Objektträger wurden 30 Minuten lang mit Streptavidin-konjugiertem FITC (1:1000) in TBS/0,1% BSA inkubiert und in TBS, enthaltend 0,05% Tween-20, gewaschen. Die Schnitte wurden unter Verwendung von Vectashield-Einbettungsmitteln, enthaltend 1 Mikro gramm/ml Hoechst 33342, angeordnet und unter einem Nikon-Eclipse-800-Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.
Obwohl die Vimentin-Färbung die Gegenwart von Mesenchym-Zellen sowohl im Tumor als auch in der normalen Schleimhaut zeigte (siehe 1F und 1G), war die In-situ-WISP-1-Bindung auf das peritumorale Stroms beschränkt (1D). Es wurde keine Bindung an die Tumor-Epithelzellen oder an die normale Schleimhaut nachgewiesen (1D und 1E).
B. WISP-1 bindet an konditioniertes menschliches Haut-Fibroblasten-Medium
Um zu untersuchen, ob ein WISP-1-Bindungsfaktor von der Oberfläche menschlicher Haut-Fibroblasten sekretiert oder abgesondert wurde, wurde ein Festphasen-Bindungstest durchgeführt. Serumfreies konditioniertes Medium aus menschlichen Haut-Fibroblasten (hergestellt wie oben stehend beschrieben) wurde gesammelt, konzentriert und über Nacht in Mikrotiter-Platten beschichtet. Fünfzig Mikroliter konditioniertes Medium wurden im Duplikat in Mikrotitrierungswells beschichtet. Die nichtspezifischen Bindungsstellen wurden durch Inkubation mit HBS-C, enthaltend 3% BSA, gesättigt, und die Wells wurden 2 Stunden lang mit mWISP-1-IgG inkubiert. Nach dem Blockieren der nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden die Wells zuerst mit WISP-1 und anschließend mit einem Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Antimensch-IgG-Antikörper inkubiert. Die Wells wurden gewaschen und 1 Stunde lang mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Mensch-IgG-Fc' inkubiert. Nach 6 Waschschritten mit HBS-C, enthaltend 0,3% BSA, wurde das Signal unter Verwendung eines chromogenen Meerrettich-Peroxidase-Substrats sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde mit 1 M Phosphorsäure gestoppt, und die OD bei 450 nm wurde gemessen. 2A zeigt die Bindung von 1 nM mWISP-1-IgG an Wells, die mit Reihenverdünnungen konditionierter Medien beschichtet sind, und 2B zeigt die Bindung von Reihenverdünnungen von mWISP-1-IgG an Wells, die mit 0,5 µl menschlichem konditioniertem Haut-Fibroblasten-Medium beschichtet sind. Die Bindung war proportional zu der Menge an beschichtetem Medium und der hinzugefügten Konzentration an WISP-1, was darauf hindeutet, dass menschliche Haut-Fibroblasten lösliche WISP-1-Bindungsfaktoren produzieren.
Wie aus 3A hervorgeht, wurde die Wechselwirkung zwischen WISP-1 und dem konditionierten Medium in Gegenwart von 1 M NaCl eliminiert. Die Gegenwart von 100 mM EDTA verringerte die Bindung nur partiell, während die Gegenwart von 0,05 % Tween-20 keine Wirkung zeigte. Es wurde gefolgert, dass die Bindung von WISP-1 an das beschichtete Material kationen-unabhängig war und eine ionische Komponente aufwies. Die Möglichkeit, dass der Bindungsfaktor ein Proteoglycan war, wurde anschließend durch Behandlung der beschichteten Wells mit verschiedenen Lyasen untersucht, bevor die Bindung von WISP-1 evaluiert wurde. Die Behandlung des beschichteten Materials mit Chondroitinase C, Chondroitin-6-sulfatase, Heparinase oder Neuraminidase veränderte die Bindung von WISP-1 nicht im Vergleich zur Kontrolle (3B). Der Verdau mit Chondroitinase AC II oder Hyaluronidase verringerte die Bindung jedoch partiell. Schlussendlich eliminierte die Behandlung mit Chondroitinase ABC, Chondroitinase B, Chondroitin-4-sulfatase oder Proteinase K die Bindung von WISP-1 an die beschichteten Wells. Die Spezifität von Chondroitinase B und Chondroitin-4-sulfatase zeigt, dass Dermatansulfat-Komponenten essentiell für die Bindung von WISP-1 sind. Weiters zeigt die Empfindlichkeit der Wechselwirkung mit einer Proteinase K, dass der Bindungsfaktor eine proteinartige Komponente aufweist. Die Resultate zeigen, dass WISP-1 an ein sekretiertes Dermatansulfat bindet, das Proteoglycan enthält.
Chondroitinase-ABC- und Chondroitinase-B-Behandlungen eliminierten die Bindung vollständig, während eine Behandlung mit Chondroitinase C keine Wirkung zeigte. Chondroitinase B spaltet Dermatansulfat an der β-D-Galactosamin-L-Iduronsäure-Bindung. Die Spezifität dieses Enzyms zeigt die Erfordernis von Iduronsäure für die Bindung von WISP-1. Behandlungen mit Chondroitinase AC II oder Hyaluronidase reduzierten die Bindung nur partiell. Dies könnte darauf hinweisen, dass die für die Wechselwirkung von WISP-1 verantwortliche Glycosaminoglycankette aus einem Dermatansulfat-Chondroitinsulfat-Copolymer bestand. Durch Spalten der anfälligen Galactosaminbindungen könnten jene Enzyme Teile der Glycosaminoglycankette, die Iduronsäure-Reste enthielten, entfernt haben. Eine Behandlung mit Chondroitin-4-sulfatase eliminierte die Bindung vollständig, während Chondroitin-6-sulfatase die Wechselwirkung nicht veränderte. Dies zeigt die Notwendigkeit für eine Sulfatgruppe an Position 4 des N-Acetylgalactosamins für die Wechselwirkung. Eine Behandlung mit Heparinase zeigte keine Wirkung, was zeigte, dass die Bindung nicht erfordert, dass die Iduronsäure an Position 2 sulfatiert ist. Eine Behandlung mit Proteinase K eliminierte die Bindung, was zeigt, dass das für die Wechselwirkung verantwortliche Glycosaminoglycan an einen Protein-Kern gebunden ist, der von den Wells durch proteolytischen Abbau getrennt werden konnte. Zusammen unterstützen diese Resultate die Schlussfolgerung, dass ein iduronsäurehältiges Motiv der Glycosaminoglycankette eines Proteoglycans die WISP-1-Bindung an konditioniertes menschliches Haut-Fibroblasten-Medium vermittelt.
C. Reinigung und Identifikation des WISP-1-Bindungsfaktors
Um den Faktor zu reinigen, der für die Bindung von WISP-1 verantwortlich ist, wurde das serumfreie konditionierte Medium aus menschlichen Haut-Fibroblasten nach drei Kulturtagen gesammelt, konzentriert, in einen Puffer transferiert, der 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 300 mM NaCl enthielt, und auf eine Q-Sepharose-Antionenaustausch-Chromatographiesäule aufgebracht. Die Säule wurde gewaschen, und die enthaltenen Proteine wurden mit einer ansteigenden NaCl-Konzentration desorbiert. Die Gegenwart eines WISP-1-Bindungsfaktors wurde in jeder Fraktion unter Verwendung eines Festphasen-Bindungstests analysiert, und die Resultate sind in 4A dargestellt. Weiters wurde die Fraktion 15 (durch einen * in 4A gekennzeichnet) bei 37°C 2 Stunden lang in Gegenwart (+) oder in Abwesenheit (–) von 0,1 U Chondroitinase ABC inkubiert. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getrennt, und die Gele wurden silbergefärbt. Die angegebenen Banden wurden mittels Massenspektroskopie identifiziert (4B).
Die bei 46, 60 und 70 kDa gefundenen Banden entsprachen Decorin, während die bei 44 kDa gefundene Bande als Biglycan identifiziert wurde (die Bande bei 230 kDa schien ein Gemisch aus sowohl Decorin als auch Biglycan zu sein). Die an den un terschiedlichen Molekulargewichten angetroffenen Banden entsprachen wahrscheinlich Biglycan und Decorin, die unvollständig verdaute Glycosaminoglycanketten enthielten, die während der Chondroitinase-ABC-Behandlung erzeugt wurden. Die Resultate zeigen, dass WISP-1 an die zwei Dermatansulfate bindet, die Proteoglycane, Biglycan und Decorin enthielten.
D. WISP-1 bindet an Decorin und Biglycan
Um die direkte Wechselwirkung von WISP-1 mit Decorin und Biglycan zu demonstrieren, wurde ein Festphasen-Bindungstest durchgeführt. Decorin und Biglycan wurden über Nacht auf Mikrotiter-Platten beschichtet. Nicht-spezifische Bindungsstellen wurden gesättigt, und 0,25 nM mWISP-1-IgG wurden 2 Stunden lang inkubiert. Die Wells wurden gewaschen und mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Mensch-IgG-Fc' (2 µg/ml) 1 Stunde lang inkubiert. Nach 6 Waschschritten mit PBS, enthaltend 0,05% Tween-20, wurde ein Signal durch die Inkubation eines chromatogenen Substrats entwickelt. Die Farbentwicklung wurde durch die Addition von 1 M Phosphorsäure gestoppt, und die OD bei 450 nm wurde gemessen.
Wie in 5A dargestellt, sind die Kurven, die der Bindung von WISP-1 an Decorin und Biglycan entsprechen, sehr ähnlich und proportional zu der Menge an beschichtetem Protein. Auf ähnliche Art und Weise wurde die Fähigkeit von Decorin und Biglycan, die Bindung von WISP-1 an beschichtetes konditioniertes menschliches Haut-Fibroblasten-Medium zu inhibieren, evaluiert.
Fünfzig Mikroliter konditioniertes menschliches Haut-Fibroblasten-Medium wurden in Mikrotiterplatten-Wells beschichtet. Nicht-spezifische Bindungsstellen wurden gesättigt, und 0,25 nM WISP-1-IgG wurden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Decorin (schwarze Kreise) oder Biglycan (weiße Kreise) 2 Stunden lang inkubiert (5B). Die Bindung von mWISP-1-IgG wurde wie oben stehend beschrieben evaluiert. Wie in 5B zu sehen ist, wird die Bindung von WISP-1 an das konditionierte menschliche Haut-Fibroblasten-Medium in Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen an Decorin und Biglycan allmählich verringert. Decorin und Biglycan ergaben ähnliche Wettbewerbskurven, die bei 70 µg/ml für Decorin und 105 µg/ml für Biglycan eine Inhibierung der WISP-1-Bindung von 50% zeigten.
E. WISP-1 bindet an Glycosaminoglycan
Um zu verstehen, ob die Spezifität der Wechselwirkung von WISP-1 mit dem Proteoglycan auf Dermatansulfat beschränkt ist, wurde die Bindung von WISP-1 an das konditionierte menschliche Haut-Fibroblasten-Medium in Gegenwart verschiedener Proteoglycane evaluiert. Serumfreies konditioniertes Medium menschlicher Haut-Fibroblasten wurde wie oben stehend beschrieben hergestellt. Fünfzig µl konditioniertes Medium wurden in Wells von Mikroplatten über Nacht bei 4°C beschichtet, die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt, und die Wells wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 0,5 nM WISP-1-IgG in Gegenwart verschiedener Konzentrationen verschiedener Glycosaminoglycane inkubiert. Die Wells wurden gewaschen, es wurde unter Verwendung eines chromogenen Substrats ein Signal entwickelt, und die O. D. bei 450 nm wurde gemessen. 6 zeigt: Chondroitinsulfat A (schwarze Kreise); Dermatansulfat (weiße Kreise); Chondroitinsulfat C (schwarze Dreiecke); Chondroitinsulfat D (weiße Dreiecke); Chondroitinsulfat E (schwarze Quadrate); Heparin (X); Heparansulfat (weiße Quadrate).
Wie in 6 dargestellt, wird die Bindung von WISP-1 in Gegenwart zunehmender Konzentrationen verschiedener Proteoglycane proportional reduziert. Die Bindung von WISP-1 erreichte 50% der maximalen Bindung bei 3 µg/ml Dermatansulfat, 10,5 µg/ml Chondroitinsulfat D oder Heparin, 30 µg/ml Chondroitinsulfat E, 75 µg/ml Heparansulfat, 105 µg/ml Chondroitinsulfat A. Die Gegenwart von Chondroitinsulfat C reduzierte die Bindung von WISP-1 nicht. Diese Daten zeigen, dass die Wechselwirkung von WISP-1 mit Glycosaminoglycan ausreichend ist, um dessen Bindung an konditioniertes menschliches Haut-Fibroblasten-Medium zu vermitteln. Weiters wird dadurch gezeigt, dass WISP-1 eine größere Spezifität für Dermatansulfat zeigt als jedes andere getestete Glycosaminoglycan.
F. Die Bindung von WISP-1 an menschliche Haut-Fibroblasten wird durch Dermatansulfat inhibiert
Um die Bedeutung von Dermatansulfat, das Proteoglycane enthält, in der Bindung von WIPS-1 an die Zelloberfläche festzustellen, wurde eine Zellbindungsanalyse in Gegenwart verschiedener Glycosaminoglycane durchgeführt. Menschliche Haut-Fibroblasten wurden in Kammer-Objektträgern beimpft. Die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt, und 1 nM WISP-1-IgG wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in Abwesenheit (7A) oder in Gegenwart von 50 µg/ml Chondroitinsulfat A (78), Dermatansulfat (7C), Chondroitinsulfat C (7D), Chondroitinsulfat D (7E), Chondroitinsulfat E (7F), Heparin (7G) oder Heparansulfat (7H) inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und fixiert, und die Bindung von WISP-1-IgG wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Mensch-IgG-Antikörpers detektiert, und das indirekte Tyramid-Substrat-Amplifikationsverfahren endete mit FITC-konjugiertem Streptavidin.
In Abwesenheit eines etwaigen hinzugefügten Glycosaminoglycans führte die Bindung von WISP-1 an die Zelloberfläche zu einer starken fluoreszierenden Färbung. Chondroitinsulfat C und Chondroitinsulfat D reduzierten die WISP-1-Bindung um etwa 20% bzw. 46%, während Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat E, Heparinsulfat oder Heparin die Wechselwirkung um etwa 60–70% verringerten (71). Auf der anderen Seite wurde in Gegenwart von 50 µg/ml Dermatansulfat die Bindung von WISP-1 an die Oberfläche menschlicher Haut-Fibroblasten eliminiert. Zusammen zeigen diese Resultate, dass WISP-1 eine höhere Affinität für Dermatansulfat besitzt, und diese Wechselwirkung kann für die Bindung von WISP-1 an die Zelloberfläche verantwortlich sein.
G. Die WISP-1-Bindung an menschliche Haut-Fibroblasten wird durch den Verdau der Zelloberfläche mit Chondroitinase B eliminiert
Während WISP-1 mit Glycosaminoglycanen und kleinen Proteoglycanen, die Dermatansulfat enthalten, wechselwirkt, muss erst bestimmtwerden, ob es mit der Zelloberfläche durch dieselbe Art der Wechselwirkung wechselwirkt. Um diese Möglichkeit einzubeziehen, wurde die Bindung von WISP-1 an die Oberfläche menschlicher Haut-Fibroblasten, die mit unterschiedlichen Glycosaminoglycan-Lyasen behandelt waren, analysiert. Menschliche Haut-Fibroblasten wurden 2 Stunden lang bei 37°C in Abwesenheit (8A) oder in Gegenwart von 0,1 U Chondroitinase ABC (8B), Chondroitinase B (8C), Chondroitinase C (8D), Heparinase (8E) oder in Abwesenheit von mWISP-1 (8F) inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, und die nicht-spezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt, und 1 nM mWISP-1-IgG wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Nach 3 Waschschritten wurden die Zellen fixiert, und die Bindung von mWISP-1-IgG wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Mensch-IgG-Antikörpers detektiert, und das indirekte Tyramid-Substrat-Amplifikationsverfahren endete mit FITC-konjugiertem Streptavidin.
Wie in 8A dargestellt, ergab die Bindung von WISP-1 an die Oberfläche unbehandelter menschlicher Haut-Fibroblasten ein starkes fluoreszierendes Signal. Wurden die Zellen mit Chondroitinase ABC oder Chondroitinase B behandelt, so wurde die Bindung von WISP-1 auf ein Ausmaß verringert, das mit der negativen Kontrolle vergleichbar ist, in der WISP-1 weggelassen wurde (8B, C bzw. D). Auf der anderen Seite zeigte die Bindung von WISP-1 an die Zellen, die mit Chondroitinase C oder Heparinase behandelt wurden, keine Modifikation hinsichtlich der Verteilung oder der Intensität (8, Feld D bzw. E). Diese Resultate zeigten, dass die Bindung von WISP-1 an die Zelloberfläche menschlicher Haut-Fibroblasten durch ein Dermatansulfat enthaltendes Proteoglycan vermittelt wird.
H. Decorin und Biglycan blockieren die Bindung von menschlichen WISP-1-Haut-Fibroblasten
Die Bindung von WISP-1 an menschliche Haut-Fibroblasten wurde in Gegenwart oder Abwesenheit eines Überschusses an Decorin oder Biglycan evaluiert. Menschliche Haut-Fibroblasten wurden in Kammer-Objektträgern beimpft, und die nichtspezifischen Bindungsstellen wurden gesättigt. 1 nM mWISP-1-IgG wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in Gegenwart von 1 mg/ml Decorin (9A), Biglycan (9B) oder in Abwesenheit hinzugefügter Konkurrenzstoffe (9C) inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und fixiert, und die Bindung von WISP-1-IgG wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines biotinylierten Anti-Mensch-IgG-Antikörpers detektiert, und das indirekte Tyramid-Substrat-Amplifikationsverfahren endete mit FITC-konjugiertem Streptavidin.
Wie in 9 dargestellt, blockierte die Gegenwart von Decorin oder Biglycan partiell die Wechselwirkung von WISP-1 mit menschlichen Haut-Fibroblasten. Obwohl die Inhibierung signifikant ist (etwa 88% und 94%), konnte die Bindung sogar bei der höchsten getesteten Konzentration (1 mg/ml) nicht vollständig eliminiert werden. Dies kann durch die Fähigkeit erklärt werden, dass Decorin und Biglycan mit Kollagen wechselwirken müssen, das in der extrazellulären Matrix der Zelle vorhanden ist.
Decorin und Biglycan sind Mitglieder einer Familie kleiner leucinreicher Proteoglycane, die in der extrazellulären Matrix von Bindegeweben vorhanden sind. Die sekretierte Form von Decorin besteht aus einem Kern-Protein mit 36.319 Da (Krusius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 7683–7687 (1986)) und einer einzelnen Glycosaminogylcan-Kette von Dermatansulfat, gebunden an ein Serin an Position 4 (P. G. Scott, Dermatan Sulfate Proteoglycans: Chemistry, Biology, Chemical Pathology, Portoland Press, London, England (1993)). Die sekretierte Form von Biglycan besteht aus einem Kern-Protein mit 37.983 Da, das mit zwei Glycosaminoglycan-Ketten substituiert ist, eine von Dermatansulfat und eine von Chondroitinsulfat (Fisher et al., J. Biol. Chem. 264, 4571–4576 (1989)). Die Kern-Proteine von Biglycan und Decorin zeigen eine gemeinsame Aminosäureidentität von etwa 55%. Das Molekulargewicht des Kern-Proteins von Decorin und Biglycan entspricht dem prognostizierten Molekulargewicht der zwei Banden, die oben stehend als die schnellste elektrophoretische Mobilität nach der Chondroitinase-ABC-Behandlung aufweisend beschrieben wurden. Die langsamer migrierenden Banden würden Decorin und Biglycan entsprechen, die partiell verdaute Glycosaminoglycan-Ketten aufweisen.
Decorin co-lokalisiert mit Fibronectin Fibrillen auf der Oberfläche menschlicher Haut-Fibroblasten (G. Schmidt, H. Robenek, B. Harrach, J. Glossl, V. Nolte, H. Hormann, H. Richter und H. Kresse, J. Cell. Biol. 104, 1683–1691 (1987)). Es ist möglich, dass die WISP-1-Wechselwirkung mit der Zelloberfläche durch Decorin vermittelt wird, das an die extrazelluläre Matrix gebunden ist. Unter Verwendung von Immunfluoreszenz wurde die Gegenwart von Decorin auf der Oberfläche der menschlichen Haut-Fibroblasten in den oben genannten Tests bestätigt. Es wurde auch gezeigt, dass Decorin und Biglycan die WISP-1-Bindung an die Zelloberfläche signifikant verringerten. Die Wechselwirkung von Decorin und Biglycan mit menschlichen Haut-Fibroblasten verhinderte wahrscheinlich die vollständige Inhibierung der WISP-1-Bindung. Zusammen zeigten diese Resultate, dass Decorin als Zelloberflächen-Bindungsstelle für WISP-1 fungieren kann.
Es wurde von mehreren Proteoglycanen, die mit der Zellmembran oder der extrazellulären Matrix assoziiert sind, gezeigt, dass sie Iduronsäure enthalten. Daher ist es möglich, dass WISP-1 mit Chondroitinsulfat von Heparansulfatproteoglycan, das Iduronatmotive aufweist, in Wechselwirkung steht. Weiters wurde gezeigt, dass der Iduronsäuregehalt der Glycosaminoglycankette verschiedener Proteoglycane mit ihrer Gewebeverteilung variierte. Decorin und Biglycan aus der Haut enthalten z. B. etwa 80% Iduronsäure, wohingegen sie in Knorpelgewebe nur 40% enthalten (Choi et al., J. Biol. Chem. 264, 2876–2884 (1989)). Die Glycosaminoglycanketten von Biglycan und Decorin aus Knochen- und Rinder-Nasalknorpel-Gewebe enthalten kein Iduronat und stellen daher Chondroitinsulfat dar (Fisher et al., J. Biol. Chem. 262, 9702–9708 (1987); Heinegard et al., Biochem. J. 3, 2042–2051 (1981)). Es wurde ebenfalls berichtet, dass eine TGF-β-Behandlung eine 10- bis 15-%-Verringerung des Iduronsäuregehalts von Seitenketten von Decorin und Biglycan induziert (A. Malmström et al., Dermatan Sulfate Proteoglycans: Chemistry, Biology, Chemical Pathology, Portoland Press, London, England (1993)). Daher ist es möglich, dass eine Modifikation des Ausmaßes des Iduronsäuregehalts in der Glycosaminoglycankette von Proteoglycanen die Wechselwirkung von WISP-1 moduliert.
Von Biglycan und Decorin ist bekannt, dass sie mit einer Reihe extrazellulärer Matrixproteine, Zytokine und Zelloberflächenrezeptoren Wechselwirken (für eine Beschreibung siehe Hocking et al., Matrix Biol. 17, 1–19 (1998), und R. V. Iozzo, J. Biol. Chem. 274, 18843–18846 (1999)). Decorin und Biglycan Wechselwirken mit dem transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β) und führen zu einer negativen Regulierung seiner biologischen Aktivität (Hildebrand et al., Biochem. J. 302, 527–534 (1994)). Von Decorin wurde auch gezeigt, dass es mRNA-Mengen und die TGF-β-Proteinsynthese in vitro reduzierte (Stander et al., Gene Therapy 5, 1187–1194 (1998)). Auf der anderen Seite wird die Expression von Decorin allgemein durch TGF-β in verschiedenen Zellen und Organismen herabreguliert (Iozzo, Ann. Rev. Biochem. 67, 609–652 (1998)). Die Promotorregion des Decorin-Gens enthält ein TGF-β-negatives reguliertes Element. Dieses TGF-β-negative regulierte Element wurde in mehreren Protease-Genen gefunden, die durch TGF-β herabreguliert wurden, und könnte eine Suppression der Decorin-Genexpression bewirken (Iozzo, Experientia 49, 447–455 (1993)). Weiters korreliert die Expression von Decorin gut mit einer malignen Eigenschaft des mensclichen Karzinoms (Adany et al., J. Biol. Chem. 265, 11389–11396 (1990); Hunzlemann et al., J. Invest. Sermatol. 104, 509–513 (1995)). Es wurde herausgefunden, dass es in vielen Tumorgeweben verringert war (Iozzo, s. o. (1993)) und in mehreren Tumorzelllinien ganz verloren gegangen war (Iozzo et al., FASEB J. 10, 598–614 (1996)). Die Expression von Decorin ist jedoch im Tumorstroms erhöht (Adany et al., s. o. (1991); Iozzo, s. o. (1993); Brown et al., Clin. Cancer Res. 5, 1041–1056 (1999)). Decorin könnte ein starker negativer Regulator des TGF-β sein, freigesetzt vom Tumor, um die Karzinogenese und das Fortschreiten des Tumors zu erleichtern. Da von Decorin gezeigt wurde, dass es das Wachstum mehrerer Karzinome durch TGF-β-abhängige und -unabhängige Mechanismen direkt unterdrückte, wurde vorgeschlagen, dass seine Expression im peritumoralen Stroms eine regionale Antwort der Bindegewebezellen des Wirts auf die invasiven neoplastischen Zellen darstellen könnte (Ständer et al., s. o. (1999)).
Beispiel 2

Adhäsion von CHO-Zellen an WISP-1 und andere ECM-Proteine Die folgenden CHO-Zelllinien (durch ATCC-Nr. identifiziert) wurden in Ham-F12/LGDMEM (50:50), enthaltend 10% FBS, gehalten:

CHO-K1	(CCL-61)
CHO pgs A-745	(CRL-2242; synthetisieren KEIN Proteoglycan)
CHO pgs B-618	(CRL-2241; synthetisieren KEIN Proteoglycan)
CHO pgs D-677	(CRL-2244; synthetisieren KEIN Haparansulfat)
CHO pgs E-606	(CRL-2246; synthetisieren ein untersulfatiertes Heparansulfat)

Maxisorp-Platten wurden mit 50 µl mWISP-1-IgG (5 µg/ml) oder BSA 3% (Fraktion V, ultrafrei von Fettsäure; Boehringer Mannheim) in Lösung in PBS über Nacht bei 4°C beschichtet. Am nächsten Tag wurde der Inhalt der Wells abgesaugt, und die Wells wurden mit 200 µl PBS/3% BSA 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Die Zellen wurden in PBS, enthaltend 2 mM EDTA, aufgenommen, und die Klumpen wurden unter Verwendung einer Pipette aufgebrochen und anschließend bei 1000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Zellen wurden zwei Mal mit serumfreiem Ham-F12/LGDMEM (50:50), enthaltend 1% BSA, gewaschen.
Die Zellen wurden bei 25 × 10⁵ Zellen/ml in serumfreiem Ham-F12/LGDMEM (50:50), enthaltend 1% BSA, resuspendiert. 50 µl serumfreies Ham-F12/LGDMEM (50:50)/1% BSA wurden zu jedem Well hinzugefügt, gefolgt von 50 μl Zellsuspension. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei 37°C ohne Deckel inkubiert. Anschließend wurden die Wells 3 × mit PBS gewaschen, und war der Überstand einmal vollständig entfernt, so wurden die Platten bei –70°C gelagert.
Die Platten wurden aufgetaut, und Molecular-Probes-CyQUANT (Molecular Probes) wurde hinzugefügt. Die Fluoreszenz wurde bei 480 nm–520 nm gemessen.
Die Resultate sind in 10 dargestellt.
Mutanten-CHO-Zelllinien, die in ihrer Glycosaminoglycansynthese beeinträchtigt waren, wurden verwendet, um die Rolle des Proteoglycans in der Zelladhäsion an WISP-1 zu verifizieren. Wie in 10 dargestellt, wurde von keiner der CHO-Zelllinien; die vollständig defizient für die Synthese von Glycosaminoglycan waren (CHO pgs A und CHO pgs B), herausgefunden, dass sie an WISP-1 anhafteten. Dieses Resultat zeigte, dass die Adhäsion von CHO-Zellen an WISP-1 vollständig von den Glycosaminoglycan-Seitenketten des Proteoglycans abhängt. Auf der anderen Seite zeigten CHO-Zelllinien, denen Heparansulfat fehlte (CHO pgsD) oder die ein untersulfatiertes Heparansulfat synthetisierten, eine Reduktion um 40% in der Adhäsion an WISP-1 im Vergleich zu CHO-K1, die ein normales Proteoglycan synthetisieren. Dies zeigt, dass Heparansulfat-Proteoglycan von CHO-Zellen nur teilweise für die Zelladhäsion an WISP-1 verantwortlich ist und dass seine Sulfatierung für seine Aktivität notwendig ist.
Daher sollte das Dermatansulfat-Proteoglycan, das die verbleibende Fraktion des Proteoglycans von CHO pgs D und CHO pgs E ist, für den Großteil der Adhäsion der CHO-Zellen an WISP-1 verantwortlich sein.
Beispiel 3
Adhäsion menschlicher Haut-Fibroblasten an WISP-1 und andere ECM-Proteine

Menschliche Haut-Fibroblasten (ATCC; CRL 7356) wurden in Ham-F12/LGDMEM (50:50), enthaltend 10% FBS, gehalten. Maxisorp-Platten wurden mit 50 μl der Proteine (unten stehend identifiziert) in Lösung in PBS über Nacht bei 4°C beschichtet:

Kollagen I, menschlich (2 µg/ml)	(menschlich; BioDesign)
Kollagen II, menschlich (2 µg/ml)	(menschlich; BioDesign)
mWISP-1-IgG (2 µg/ml)	(siehe oben stehendes Beispiel 1)
BSA 3%	(Fraktion V, ultrafrei von Fettsäure; Boehringer
	Mannheim)

Am nächsten Tag wurde der Inhalt der Wells abgesaugt, und die Wells wurden mit 200 μl PBS/3% BSA 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gesättigt. Die Zellen wurden in PBS, enthaltend 15 mM EDTA, aufgenommen, und die Klumpen wurden unter Verwendung einer Pipette aufgebrochen. Die Zellsuspension wurde über einem 45-µm-Filter filtriert und bei 1000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert.
Der Überstand wurde entfernt, und die Zellen wurden zwei Mal mit serumfreiem Ham-F12/LGDMEM (50:50), enthaltend 1% BSA, gewaschen. Die Zellen wurden bei 3 × 10⁵ Zellen/ml mit serumfreiem Ham-F12/LGDMEM (50:50), enthaltend 1% BSA, resuspendiert. 50 µl serumfreies Ham-F12/LGDMEM (50:50)/1% BSA wurden anschließend hinzugefügt, zusammen mit 100 µg/ml Dermatansulfat (Chondroitinsulfat B aus der Darmschleimhaut von Schweinen; Sigma), 100 µg/ml Heparin (Schweine-Darmschleimhaut; Sigma), oder es erfolgte keine Zugabe. Die Platten wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 50 µl der Zellsuspension zu jedem Well hinzugefügt und 2 Stunden lang bei 37°C ohne Deckel inkubiert. Anschließend wurden die Wells 3 × mit PBS gewaschen. Die Färbung wurde mit Kristallviolett für eine Zeitspanne von 30 Minuten durchgeführt. Anschließend wurden die Platten in Wasser gewaschen. Die O. D. wurde bei 570 nm gemessen.
Die Resultate sind in 11 dargestellt.
Die Daten zeigen, dass, obwohl der Wert niedriger ist als bei den positiven Kontrollen (Adhäsion an Kollagen I und Kollagen II), menschliche Haut-Fibroblasten an Wells, die mit WISP-1 beschichtet sind, anhaften (11). Die Gegenwart von 100 µg/ml Heparin oder 100 µg/ml Dermatansulfat reduzierte die Zelladhäsion an WISP-1 um 30% bzw. 70%. Bei ähnlichen Bedingungen veränderte sich die Zelladhäsion an Kollagen 1 und II nicht signifikant. Diese Resultate zeigen, dass die Adhäsion menschlicher Haut-Fibroblasten an WISP-1 durch einen anderen Mechanismus vermittelt wird als die Adhäsion an Kollagen 1 und Kollagen II. Sie zeigen auch, dass die Adhäsion der menschlichen Haut-Fibroblasten an WISP-1 hauptsächlich durch Dermatansulfat-Proteoglycan vermittelt wird, obgleich Heparin enthaltendes Proteoglycan an diesem Phänomen beteiligt sein kann.
Beispiel 4
Chondrozyten-Redifferenzierungstest
Es wurde ein Versuch durchgeführt, um die Wirkungen verschiedener Konzentrationen an WISP-1-Polypeptiden auf die Chondrozyten-Differenzierung zu bestimmen. Um Chondrozyten zu züchten, wird Gelenksknorpelgewebe mit Enzymen verdaut, welche die extrazelluläre Matrix entfernen. Daher kann die zelluläre Umgebung in diesem Kultursystem ähnlich jener sein, die in späteren Stadien von Knorpelerkrankungen anzutreffen ist, bei denen die Matrix erschöpft wurde und Chondrozyten-Zellen dazu tendieren, sich in einen „unreifen" Phänotyp zurückzuverwandeln.
Die Metakarpophalangealgelenke von 4–6 Monate alten weiblichen Schweinen wurden aseptisch zergliedert, und das Gelenksknorpelgewebe wurde durch Freihand-Schnitte entfernt, wobei darauf geachtet wurde, dass der darunter befindliche Knochen verschont wurde. Diese Knorpelfragmente wurden anschließend in 0,05% Trypsin in serumfreiem Ham-F12 25 Minuten lang bei 37°C verdaut. Das Medium wurde entwässert und verworfen, und das Knorpelgewebe wurde in 0,3% Kollagenase B in serumfreiem Ham-F12-Medium 30 Minuten lang bei 37°C verdaut. Das Medium wurde entwässert und verworfen, und das Knorpelgewebe wurde über Nacht in 0,06% Kollagenase B in Ham-F12 + 10% fötalem Rinderserum verdaut. Anschließend wurden die Zellen durch einen 70-µm-Nylon-Filter filtriert und in Ham-F12-Medium ohne Serum beimpft. Die isolierten Zellen werden bei 25.000 Zellen/cm² in Ham-F12, enthaltend 10% FBS, und 4 µg/ml Gentamycin, beimpft. Das Kulturme dium wurde jeden dritten Tag gewechselt, und die Zellen wurden erneut alle fünf Tage auf 25.000 Zellen/cm² beimpft. An Tag 12 wurden die Zellen mit 5.000 Zellen/Well in 100 μl desselben Mediums ohne Serum in 96-Well-Platten beimpft, und 100 μl menschliches WISP-1-IgG (siehe 17) mit einer Verdünnung von 1% wurden hinzugefügt, um ein Endvolumen von 200 µl/Well zu ergeben. Nach 5 Tagen bei 37°C wurde unter Verwendung eines mit Objekttisch betriebenen Umkehrmikroskops ein Bild eines jeden Wells aufgenommen. Der Differenzierungszustand wurde unter Verwendung der Metamorph-Software der Universal Imaging Corporation morphologisch bestimmt. Auf jedem Bild werden runde Zellen, die redifferenzierten Chondrozyten entsprechen, ihrer Größe und Form entsprechend selektiert, wohingegen abgeflachte Zellen mit einem dedifferenzierten Phänotyp eliminiert werden. Der Gesamtbereich, der von den selektierten Zellen auf einem Bild bedeckt wird, wird anschließend berechnet und mit einer positiven Kontrolle (redifferenzierte Chondrozyten von Staurosporin) und mit einer negativen Kontrolle (unbehandelte Zellen) verglichen.
Die Berechnung und Interpretation des Ergebnisses wurde folgendermaßen durchgeführt:
Berechnung des Ergebnisses:

Y = Chondrozyten-Bereich Redifferenzierungsindex = [(Y-Ynegative Kontrolle)/(Ypositive Kontrolle – Ynegative Kontrolle)]·100

Interpetation des Ergebnisses:
Je größer der Redifferenzierungsindex ist, desto besser unterstützt das WISP-Molekül die Chondrozyten bei der Redifferenzierung.
Ergebnis Cutoff: Redifferenzierungsindex > 40 → positives Ergebnis.
Die Ergebnisse werden in 12 dargestellt.
Beispiel 5
Kollagen-II-Färbungstest
Kollagen II ist ein bevorzugter Marker für Chondrozyten. Nachdem primäre Schweine-Chondrozyten 10 Tage lang in Kultur gehalten wurden, um eine „Dedifferenzierung" in Mesenchymzellen zu erhalten, tendieren die Zellen dazu, ihre Kollagen-II-Expression zu verlieren. Der oben stehend beschriebene Chondrozyten-Differenzierungstest wurde durchgeführt, wobei dabei Dreifach-Wells für (+)- und (–)-Kontrollen und Duplikate eines jeden der folgenden Proteine 5 Tage lang behandelt wurden:
Positive – 5 nM (0,5 µl/50 ml) Staurosporin
100 nM IGF-1
Negative – nur Medium
Test – 100 nM menschliches WISP-1-His
100 nM menschliches WISP-2-His
100 nM menschliches WISP-3-His
(Die WISP-Polypeptid-Konstrukte wurden unter Verwendung einer N-terminalen His-Markierung, die an jedes WISP-Polypeptid gebunden ist, hergestellt.)
Nachdem die Bilder unter Verwendung des Umkehrmikroskops aufgenommen wurden (wie in Beispiel 4 beschrieben), wurden die Zellen in 70% Ethylalkohol 15 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert und anschließend 3 × mit PBS gewaschen. Die Platten wurden mit PBS/3% BSA 60 Minuten lang bei 200 µl/Well blockiert. Die behandelten Wells wurden mit Maus-Anti-Kollagen-II (Neomarken-5 B2.5) in PBS/3% BSA 1 Stunde lang bei Raumtemperatur behandelt, wobei eine 1:2000-Verdünnung verwendet wurde. Die Platten wurden erneut 3 × mit PBS/0,1% BSA gewaschen.
Nach dem Waschen wurden die Platten mit biotinyliertem 1:1000-Vektor-Anti-Maus in PBS/0,1% BSA 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Platten 3 × 2 Minuten lang in PBS gewaschen.
Die Zellen wurden in 4% Paraformaldehyd in PBS 10 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert und anschließend mit TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8) + 0,3% BSA, 2 × 3 Minuten lang (500 µl/Well) gewaschen. Anschließend folgte eine Inkubation mit Dupont-HRP-Streptavidin 1:1000 in TBS + 1% BSA für eine Zeitspanne von 30 Minuten (100 µl/Well). Darauf folgen Waschschritte mit TBS + 0,1% BSA, 3 × 4 Minuten lang (500 µl/Well). Als Nächstes muss mit biotinyliertem Tyramid 10 Minuten lang 1:50 in Amplifikationsverdünnungsmittel (NEN Dupont) (100 µl/Well) inkubiert werden. Waschschritte mit TBS + 0,1% BSA, 3 × 4 Minuten lang (500 µl/Well), folgten der Inkubation.
Bei der nächsten Inkubation wurde DAKO-FITC-Streptavidin 1:1000 in TBS in HBS-C + 1% BSA für eine Zeitspanne von 30 Minuten (100 µl/Well) hinzugefügt. Anschließend folgte ein kurzer Waschschritt in PBS. Schließlich wurde 1:1000-Hoechst in PBS (100 µl/Well) hinzugefügt und danach unter einem Umkehrmikroskop evaluiert.
Die Daten sind in 13 dargestellt. Positive Kontrollen (Staurosporin und IGF-1) ergaben eine starke Färbung für Kollagen II, während die negative Kontrolle gar keine Färbung aufwies. Zellen, die mit 100 nM WISP-1 oder WISP-2 oder WISP-3 behandelt wurden, zeigten eine starke positive Färbung für Kollagen II. Diese Daten zeigten, dass WISP-Proteine die Redifferenzierung von primären Schweine-Chondrozyten in Kultur fördern.
Beispiel 6
Gelenksknorpel-Explantat-Test
Es wurde ein Experiment durchgeführt, um sowohl das synthetische als auch das prophylaktische Potential von WISP-Polypeptiden auf den Knorpelmatrix-Umsatz zu untersuchen. Dieses Potential wird durch Messung der/des Matrix-(d. h. Proteoglycan-)Synthese und -Zerfalls sowie der Stickstoffoxidproduktion in Gelenksknorpelgewebe bestimmt. Diese Parameter werden in Gegenwart und Abwesenheit von Interleukin-1α evaluiert. Gelenksknorpel-Explantate besitzen mehrere Vorteile gegenüber Primärzellen in Kultur. Erst einmal, was vielleicht auch am wichtigsten ist, bleiben Zellen in Explantaten in eine in vivo produzierte Gewebearchitektur eingebettet. Zweitens sind diese Explantate ex vivo mehrere Wochen phänotypisch stabil, während dieser Zeit sind sie in der Lage, die Gewebe-Homöostase aufrechtzuerhalten. Schließlich können Explantate im Gegensatz zu Primärzellen zur Messung des Matrix-Zerfalls verwendet werden. Um Knorpel-Explantate aufzubauen, muss Gelenksknorpelgewebe zergliedert und zerkleinert sein, was zur Zerstörung des Kollagen-netzwerks und zur Freisetzung von Proteoglycanen in das Kulturmedium führt. Dieses System imitiert daher degenerative Erkrankungen, wie z. B. Arthritis, bei denen die Matrix progressiv abgebaut wird.
Das Metakarpophalangealgelenk von 4–6 Monate alten weiblichen Schweinen wurde aseptisch zergliedert, wie oben stehend beschrieben. Das Knorpelgewebe wurde zerkleinert, gewaschen und in großer Menge zumindest 24 Stunden lang bei 37°C und 5% CO₂ in Explantat-Medium gezüchtet, d. h. in serumfreiem (SF) LG-DMEM/F12-Medium mit 0,1% BSA, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (Gibco), 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM Natriumpyruvat (Gibco), 20 µg/ml Gentamicin (Gibco) und 1,25 mg/l Amphotericin B. Gelenksknorpelgewebe wurde in Micronics-Röhrchen aliquotiert (etwa 55 mg pro Röhrchen) und zumindest 24 Stunden lang in den oben stehenden Medien inkubiert. Das Medium wurde geerntet und neues Medium wurde hinzugefügt (alleine oder mit WISP-Polypeptiden (IgG-Fusionskonstrukte)), und zwar zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 24, 48 und 72 Stunden).
Medium wurde zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und dann auf den Proteoglycangehalt unter Verwendung des kolorimetrischen 1,9-Dimethylmethylen-Blau-(DMMB-)Tests von Farndale und Buttle, Biochim. Biophys. Acta 883, 173–177 (1985), wie oben stehend beschrieben getestet. Die PG-Freisetzung zu Stunde 0 wurde als Grundlinien-Messwert verwendet, und alle Proben mit besonders hoher oder besonders niedriger PG-Freisetzung wurden vor der Behandlung mit WISP-1-Polypeptid verworfen. Bei allen Behandlungen stellen die Resultate den Durchschnitt von 5 unabhängigen Proben dar.
48 Stunden nach der ersten Behandlung wurde ³⁵S-Sulfat zu Knorpelgewebe-Explantaten in einer Endkonzentration von 10 µCi/ml zusammen mit frischem Medium (mit oder ohne Testverbindung) zugegeben. Nach zusätzlichen 12–17 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und für eine anschließende PG- und Stickstoffoxid-(NO-)Analyse aufgehoben. Die Knorpel-Explantate wurden zwei Mal mit Explantat-Medium gewaschen und über Nacht bei 50°C in einem 900-ml-Reaktionsvolumen von 10 mM EDTA, 0,1 M Natriumphosphat und 1 mg/ml Proteinase K (Gibco BRL) verdaut. Die Verdauungsreaktion wurde mit 10% (Gew./Vol.) Cetylpyridiniumchlorid (Sigma) gemischt (2:1), um die Proteoglycane zu präzipitieren, und bei 1000 × g 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und Ameisensäure (500 ml, Sigma) wurde hinzugefügt, um die Pellets aufzulösen. Die Proben wurden anschließend in Phiolen transferiert, die 10 ml Szintillationsflüssigkeit (ION) enthielten, und in einem Szintillationszähler gelesen.
Nach 72 Stunden wurden die verbleibenden Gelenksknorpel-Explantate verdaut, wie oben stehend beschrieben, und unter Verwendung des kolorimetrischen DMMB-Tests (auf den oben stehend verwiesen wurde) auf den Proteoglycangehalt getestet.
Wurden die Gelenksknorpel-Explantate entweder mit WISP-3 (14) oder WISP-1 (15A) behandelt, so wurde sowohl der basale als auch der IL-1α-induzierte Knorpelmatrix-Zerfall verringert. Zusätzlich dazu inhibierte WISP-1 sowohl die basale als auch die IL-1α-induziorte Stickstoffoxidproduktion (15B).
Diese Resultate zeigen, dass WISP-Polypeptide gegen Knorpel-Katabolismus schützen können. Angesichts der Tatsache, dass erhöhte Mengen von sowohl Stickstoffoxid als auch von IL-1α in erkrankten Gelenken zu finden sind, so zeigt die Fähigkeit von WISP-Polypeptiden, die Aktivität von IL-1α und die Produktion von Stickstoffoxid zu blockieren, dass WISP-Polypeptide das Ausmaß des Gewebeschadens in arthritischen Gelenken verringern können.
Beispiel 7
Transgene Mäuse, die WISP-2 exprimieren
Um die Wirkung von WISP-Polypeptiden in vivo zu testen, wurden transgene Mäuse geschaffen, die WISP-2 in ihren Muskeln aufgrund des Myosin-Leichtketten-Promotors überexprimierten. Die transgenen Tiere wurden unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die nach dem Stand der Technik bekannt sind (Beddington et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press (1994); Transgenic Animal Technology: A Laborstory Handbook, Academic Press, New York (1994)). Die Knochen dieser Mäuse wurden mittels standardhistologischer Verfahren im Alter von 14 Wochen untersucht. Nachdem die Tiere getötet worden waren, wurden die Knochen in 4% gepuffertem Formalin fixiert, gefolgt von der Entkalkung in Formical^TM für eine Zeitspanne von 4–8 Stunden. Anschließend wurden Proben für eine Paraffin-Einbettungs- und eine histologische Untersuchung weiterverarbeitet. Schnitte mit einer Dicke von drei µm wurden geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.
Wie in 16 dargestellt, scheinen die Hyalinknorpel-Kompartimente (d. h. die Wachstumsplatte und das Gelenksknorpelgewebe) erweitert zu sein. Diese Resultate stehen in Einklang mit Resultaten, die oben stehend in den Beispielen dargestellt werden, welche die Fähigkeit von WISP-Polypeptiden zeigen, eine Knorpelzellen-Differenzierung zu induzieren und einen Knorpelgewebe-Matrix-Zerfall zu inhibieren. Daher können WISP-Polypeptide in vivo starke Wirkungen auf Knorpelgewebe haben. Die Behandlung eines arthritischen Individuums mit einem Polypeptid mit solch einer Aktivität, nämlich eine, welche die Menge an Knorpelgewebe erhöht, kann die Beschädigung und Zerstörung des Gelenks verhindern, die bei arthritischen Patienten auftreten kann.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines WISP-1-Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Knorpelzell- oder Gewebeschäden bei einer degenerativen Knorpelerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Knorpel ein Gelenksknorpel ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die degenerative Knorpelerkrankung rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis ist.
Verwendung nach Anspruch 3, worin die degenerative Knorpelerkrankung rheumatoide Arthritis ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das WISP-Polypeptid ein Polypeptid ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) einem WISP-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 23 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (b) einem WISP-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (c) einem WISP-1-Polypeptid, das zumindest 90% Identität mit einem Polypeptid gemäß (a) oder (b) aufweist, worin das WISP-1-Polypeptid Chondrozytenproliferation oder -differenzierung stimuliert; und (d) einem biologisch aktiven Fragment eines WISP-1-Polypeptids gemäß (a) oder (b), worin das biologisch aktive Fragment Chondrozytenproliferation oder -differenzierung stimuliert.
Verwendung nach Anspruch 5, worin das WISP-1-Polypeptid die Aminosäuren 23 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 5, worin das WISP-1-Polypeptid an ein oder mehrere Polyethylenglykolmoleküle gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin das WISP-1-Polypeptid an eine Epitopmarkierung oder ein Immunglobulinmolekül gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 5, worin das Medikament zum Kontaktieren mit Säugetierknorpelzellen oder -gewebe in Kultur vor der Transplantation in ein Säugetier dient.
Verwendung nach Anspruch 5, worin das Medikament weiters einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Behandlung von Säugetierknorpelzellen oder -gewebe, umfassend das Kontaktieren von Säugetierknorpelzellen oder -gewebe, die durch eine degenerative Knorpelerkrankung geschädigt sind, mit einer wirksamen Menge an WISP-Polypeptid, worin das WISP-Polypeptid ein Polypeptid ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) einem WISP-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 23 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (b) einem WISP-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (c) einem WISP-1-Polypeptid, das zumindest 90% Identität mit einem Polypeptid gemäß (a) oder (b) aufweist, worin das WISP-1-Polypeptid Chondrozytenproliferation oder -differenzierung stimuliert; und (d) einem biologisch aktiven Fragment eines WISP-1-Polypeptids gemäß (a) oder (b), worin das biologisch aktive Fragment Chondrozytenproliferation oder -differenzierung stimuliert.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das WISP-1-Polypeptid die Aminosäuren 23 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das WISP-1-Polypeptid an ein oder mehrere Polyethylenglykolmoleküle gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das WISP-1-Polypeptid an eine Epitopmarkierung oder ein Immunglobulinmolekül gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin der Knorpel ein Gelenksknorpel ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die degenerative Knorpelerkrankung rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die degenerative Knorpelerkrankung rheumatoide Arthritis ist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das WISP-Polypeptid in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten ist.
Verwendung von WISP-Polypeptid zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Säugetierknorpelzell- oder -gewebeschäden, worin das WISP-Polypeptid ein Polypeptid ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) einem WISP-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 23 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (b) einem WISP-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (c) einem WISP-1-Polypeptid, das zumindest 90% Identität mit einem Polypeptid gemäß (a) oder (b) aufweist, worin das WISP-1-Polypeptid Chondrozytenproliferation oder -differenzierung stimuliert; und (d) einem biologisch aktiven Fragment eines WISP-1-Polypeptids gemäß (a) oder (b), worin das biologisch aktive Fragment Chondrozytenproliferation oder -differenzierung stimuliert.
Verwendung nach Anspruch 19, worin die Verletzung ein Mikroschaden oder eine Aufprallverletzung, eine Knorpelfraktur, eine osteochondrale Fraktur oder ein Schaden an Meniskus, Sehne oder Band ist.
Verwendung nach Anspruch 19, worin das WISP-Polypeptid zur Verabreichung an ein Säugetier durch Injektion in Knorpelzellen oder -gewebe oder ein Gelenk des Säugetiers dient.
Verwendung nach Anspruch 19, worin das WISP-1-Polypeptid die Aminosäuren 23 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 19, worin das WISP-1-Polypeptid an ein oder mehrere Polyethylenglykolmoleküle gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 19, worin das WISP-1-Polypeptid an eine Epitopmarkierung oder ein Immunglobulinmolekül gebunden ist.
Verwendung nach Anspruch 19, worin das Medikament zum Kontaktieren mit Säugetierknorpelzellen oder -gewebe in Kultur vor der Transplantation in ein Säugetier dient.
Verwendung nach Anspruch 25, worin das Medikament weiters einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Behandlung von Säugetierknorpelzellen oder -gewebe, umfassend das Kontaktieren von Säugetierknorpelzellen oder -gewebe, die durch eine Verletzung geschädigt sind, mit einer wirksamen Menge an WISP-Polypeptid, worin das WISP-Polypeptid ein Polypeptid ist, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) einem WISP-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 23 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (b) einem WISP-1-Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (c) einem WISP-1-Polypeptid, das zumindest 90% Identität mit einem Polypeptid gemäß (a) oder (b) aufweist, worin das WISP-1-Polypeptid Chondrozytenproliferation oder -differenzierung stimuliert; und (d) einem biologisch aktiven Fragment eines WISP-1-Polypeptids gemäß (a) oder (b), worin das biologisch aktive Fragment Chondrozytenproliferation oder -differenzierung stimuliert.
Verfahren nach Anspruch 27, worin die Verletzung ein Mikroschaden oder eine Aufprallverletzung, eine Knorpelfraktur, eine osteochondrale Fraktur oder ein Schaden an Meniskus, Sehne oder Band ist.
Verwendung nach Anspruch 27, worin das WISP-1-Polypeptid die Aminosäure. 23 bis 367 von Seq.-ID Nr. 3 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, worin das WISP-1-Polypeptid an ein oder mehrere Polyethylenglykolmoleküle gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 27, worin das WISP-1-Polypeptid an eine Epitopmarkierung oder ein Immunglobulinmolekül gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 27, worin das WISP-Polypeptid in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten ist.
Fabrikat, das (a) einen Behälter, der eine Zusammensetzung enthält, die zur Behandlung einer Knorpelerkrankung dient, worin die Zusammensetzung eine wirksame Menge an WISP-1-Polypeptid umfasst, sowie (b) Gebrauchsanleitungen für die Verwendung des WISP-Polypeptids zur Behandlung einer Knorpelerkrankung umfasst.