ES2202061T3 - Inhibidores para usar en la funcion hemostatica e inmunologica. - Google Patents

Abstract

Uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, que reduce la actividad trombogénica y de complemento en la vasculatura, en la fabricación de una composición farmacéutica para promover el flujo sanguíneo en la vasculatura de un mamífero.

Description

Inhibidores para usar en la función hemostática e inmunológica.

Antecedentes de la invención

Una lesión en los vasos sanguíneos pone en movimiento una serie de eventos para reparar el daño y controlar la liberación de sangre del vaso. Este proceso es conocido como hemostasis. Las plaquetas desempeñan un papel temprano en la hemostasis al formar un trombo o tapón para reparar temporalmente el daño vascular. Las plaquetas normalmente no interaccionan con el endotelio que reviste las paredes vasculares, pero la lesión en los vasos sanguíneos, por accidente o durante procedimientos quirúrgicos, puede desestabilizar las células endoteliales. Dependiendo de la extensión de la lesión, se expondrán al flujo sanguíneo diversos elementos subendoteliales tales como colágenos, lámina elástica o células de músculo liso con colágenos fibrilares asociados.

Cuando el subendotelio se expone después de lesión vascular, las plaquetas que se desplazan en el flujo sanguíneo local interaccionan con la matriz de subendotelio expuesta que contiene colágeno y se frenan. La interacción adicional entre receptores en la superficie de la plaqueta y la capa de colágeno expuesta conduce a la unión y activación de plaquetas, que dan como resultado la detención del flujo sanguíneo local. Las plaquetas unidas se activan y forman agregados con las plaquetas en el flujo sanguíneo circulante mediante la formación de puentes de fibrinógeno interplaquetas (Moroi y Jung, Frontiers in Bioscience 3: 719-728, 1998; Barnes et al., Atherosclerosis XI, Jacotot et al., Eds., Elsevier Science, pág. 299-306, 1998 y Barnes et al., Curr. Opin. Hematol. 5: 314-320, 1998).

La respuesta hemostática está graduada por y depende del grado de lesión en el vaso sanguíneo, de los constituyentes específicos expuestos de los vasos sanguíneos y de las condiciones de flujo sanguíneo en el área lesionada (Rand et al., Thrombosis and Haemostasis 78: 445-450, 1997). La exposición de la matriz de subendotelio (colágeno de tipo VI y factor de von Willebrand), tal como durante lesión vascular leve, promueve un bajo grado de adhesión y agregación en áreas con condiciones de bajo flujo sanguíneo. Las lesiones que dan como resultado un grado mayor de traumatismo vascular y exposición de constituyentes vasculares adicionales, tales como la lámina elástica interna y las microfibrillas asociadas a la elastina, estimularán la formación de agregados de plaquetas más densos. El trauma vascular severo, que expone fibrillas de colágeno, provoca una respuesta trombótica de plaquetas, que protege a la víctima de una pérdida excesiva de sangre (Rand et al., ibid.).

Serían útiles inhibidores de la hemostasis para aumentar el flujo sanguíneo después de lesión vascular y para inertizarr las superficies colagenosas.

El factor de complemento Clq está consiste en seis copias de tres polipéptidos relacionados (cadenas A, B y C), siendo cada polipéptido de aproximadamente 225 aminoácidos de longitud con un dominio de colágeno cercano al amino terminal y una región globular carboxi terminal. Se forman seis regiones de triple hélice por los dominios de colágeno de las seis cadenas A, seis B y seis C, formando una región central y seis troncos. Se forma una porción globular de cabeza mediante la asociación del dominio carboxi terminal globular de una cadena A, una B y una C. Clq está compuesto por tanto por seis cabezas globulares ligadas mediante seis troncos de tipo colágeno a una región fibrilar central. Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-490, 1991. Esta configuración se indica a menudo como de ramo de flores. Acrp30 tiene una estructura de ramo similar formada por un solo tipo de cadena polipeptídica.

Se ha encontrado que el Clq estimula mecanismos de defensa así como que desencadena la generación de especies de oxígeno tóxicas que pueden causar daño tisular (Tenner, Behring Inst. Mitt., 93: 241-253, 1993). Se encuentran sitios de unión de Clq en plaquetas. Adicionalmente, el complemento y el Clq desempeñan un papel en la inflamación. La activación del complemento se inicia mediante la unión de Clq a inmunoglobulinas.

Serían útiles inhibidores de Clq y de la ruta de complemento para aplicaciones antiinflamatorias, la inhibición de la activación del complemento y la actividad trombótica.

La presente invención proporciona dichos polipéptidos para estos y otros usos que deberían ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las exposiciones en la presente memoria.

En un aspecto, la invención proporciona un uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, que reduce la actividad trombogénica y de complemento en la vasculatura, en la fabricación de una composición farmacéutica para promover el flujo sanguíneo en la vasculatura de un mamífero.

En una realización, la proteína relacionada con el complemento de adipocitos comprende un polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoacídicos que es al menos 75% idéntica a la secuencia aminoacídica de los residuos 26-281 de la SEC ID Nº 2, en la que dicha secuencia comprende: repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en la que Xaa es cualquier aminoácido, y una porción globular carboxi terminal. En una realización relacionada, el polipéptido comprende una secuencia de residuos amionacídicos que es al menos 90% idéntica a la secuencia aminoacídica de los residuos 22-281 de la SEC ID Nº 2. En otra realización, el polipéptido comprende una secuencia aminoacídica que es al menos 90% idéntica a la secuencia aminoacídica de los residuos 26-281 de la SEC ID Nº 2. En aún otra realización, cualquier diferencia entre dicho polipéptido y la SEC ID Nº 2 es debida a sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otra realización, el dominio de colágeno está consiste en 13 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 1 repetición Gly-Xaa-Pro. En aún otra realización, el dominio globular consiste en diez láminas beta. En una realización relacionada, las láminas beta están asociadas a residuos aminoacídicos correspondientes a 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227- 239, 244-250 y 269-274 de la SEC ID Nº2. En aún otra realización, el polipéptido comprende los residuos 1-281 de la SEC ID Nº 2 o los residuos 1-281 de la SEC ID Nº 44.

La invención proporciona también el polipéptido acomplejado con un segundo polipéptido para formar un oligómero. En una realización, los polipéptidos se acomplejan mediante enlaces disulfuro intermoleculares. En otra realización, el oligómero es un trímero. En aún otra realización, el oligómero es un hexámero. En aún otra realización, el multímero es un 18-mero.

En otra realización, el polipéptido puede utilizarse para reducir la actividad trombogénica y de complemento mediante la inhibición de la ruta de complemento y la inhibición de la adhesión, activación o agregación de plaquetas mediadas por colágeno. En otra realización, el polipéptido se ha de administrar antes, durante o después de una lesión vascular aguda a dicho mamífero. En aún otra realización, la lesión es debida a reconstrucción vascular. En una realización relacionada, la reconstrucción vascular comprende angioplastia, injerto de derivación arterial coronario, endarterectomía, reparación microvascular o anastomosis de un injerto vascular. En otra realización relacionada, la lesión es debida a traumatismo, apoplejía o aneurisma.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, por el cual dicha proteína convierte en inerte al tejido colagenoso dañado frente a la activación de complemento, la actividad trombótica o la activación inmune, en la fabricación de un medicamento para inertizar tejidos colagenosos dañados en un mamífero.

En una realización, los tejidos colagenosos dañados son debidos a una lesión asociada a isquemia y reperfusión. En otra realización, la lesión comprende isquemia por lesión traumática, estrangulación intestinal o lesión asociada al pre- o post-establecimiento del flujo sanguíneo. En aún otra realización, el polipéptido se administra a un mamífero que padece isquemia por derivación cardiopulmonar y resucitación, infarto de miocardio o vasoespasmo postraumático. En una realización relacionada, el vasoespasmo postraumático comprende apoplejía, angioplastia percutánea transluminal, endarterectomía, traumatismo vascular accidental o traumatismo vascular inducido quirúrgicamente.

En aún otro aspecto, la invención proporciona el uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, por el cual dicha proteína convierte la superficie de un biomaterial protésico en inerte frente a la activación de complemento, la actividad trombótica o la activación inmune, en la fabricación de un medicamento para inertizar la superficie de un biomaterial protésico para uso asociado a un mamífero.

En una realización, la superficie de dicho biomaterial protésico se recubre con colágeno o fragmentos de colágeno, gelatina, fibrina o fibronectina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, por el cual dicha proteína potencia la progresión de la curación de heridas, en la fabricación de un medicamento para mediar en la reparación de heridas en un mamífero.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra una alineación múltiple del polipéptido zsig37 de la presente invención y HUMUPST2_1 (Maeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 221 (2): 286-289, 1996); ClQA_HUMAN (Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-490, 1991; Reid, Biochem. J. 179: 367-371, 1979, y Reid et al., Biochem. J. 203: 559-569, 1982); HP25_TAMAS (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-1521, 1993 y Kondo y Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-478, 1992); HP27_TAMAS (Takamatsu et al. y Kondo y Kondo referidos anteriormente); y CERL_RAT (Wada & Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9: 71-77, 1991).

La Figura 2 es una matriz que muestra el porcentaje de identidad de aminoácidos en una comparación de las seis proteínas mostradas en la alineación múltiple de la Fig. 1.

La Figura 3a muestra la unión de zsig37-FITC a colágeno de tipo VI.

La Figura 3b muestra la competición de zsig37 no marcada con zsig37 marcada con FITC unida a colágeno de tipo VI.

La Figura 4 muestra la unión de Clq-FITC de complemento a zsig37.

La Figura 5 muestra la inhibición de la actividad de complemento humano por zsig37.

La Figura 6 muestra el porcentaje de agregación de plaquetas por colágeno en presencia de zsig37.

La Figura 7 muestra la proliferación de fibroblastos de SK5 en presencia de zsig37.

Descripción detallada de la invención

Antes de exponer con detalle la invención, puede ser de ayuda para la comprensión de la misma definir los siguientes términos.

La expresión "marcador de afinidad" se utiliza en la presente memoria para designar un segmento peptídico que puede unirse a un polipéptido para proporcionar la purificación o detección del polipéptido o para proporcionar sitios para la unión del polipéptido a un sustrato. En general, puede utilizarse cualquier péptido o proteína para el que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica como marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen un intervalo de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol, 198: 3, 1991), glutation S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67: 31, 1988), sustancia P, péptido Flag^{TM} (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-1210, 1988; disponible en Eastman Kodak Co., New Haven, CT), péptido de unión a estreptavidina u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los ADN que codifican los marcadores de afinidad están disponibles en distribuidores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

La expresión "complementos de una molécula polinucleotídica" es una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de bases complementaria y de orientación inversa en comparación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria de 5' CCCGTGCAT 3'.

La expresión "secuencia nucleotídica degenerada" designa una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación con una molécula polinucleotídica de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo aminoacídico (concretamente los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp).

El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, designa que el polinucleótido se ha extraído de su medio genético natural y está por tanto exento de otras secuencias de codificación extrañas o indeseadas, y que es una forma adecuada para uso en sistemas de producción de proteína por ingeniería genética. Dichas moléculas aisladas son aquellas que se separan de su entorno natural, e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas de ADNc aisladas de la presente invención están exentas de otros genes con los que están habitualmente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural tales como promotores y terminadores. La identificación de las regiones asociadas resultará evidente para un experto en la técnica (véase por ejemplo Dynan y Tijan, Nature 316: 774-778, 1985).

Un polipéptido o proteína "aislado" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición distinta de su entorno nativo, tal como apartado de la sangre o tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente exento de otros polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar el polipéptido en una forma altamente purificada, concretamente más de un 95% pura, más preferiblemente más de un 99% pura. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas glicosiladas o derivatizadas de forma alternativa.

El término "ortólogo" indica un polipéptido o proteína obtenido a partir de una especie que es la contrapartida funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencia entre ortólogos son el resultado de la especiación.

El término "polinucleótido" designa un polímero mono- o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leído del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse a partir de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan en forma de pares de bases (abreviado "pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Cuando el contexto lo permite, los dos últimos términos pueden describir polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias, se utiliza para designar la longitud global, y ha de entenderse que es equivalente a la expresión "pares de bases". Los expertos en la técnica reconocerán que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos del mismo pueden estar escalonados como resultado de una escisión enzimática; por tanto, pueden no estar apareados todos los nucleótidos en una molécula polinucleotídica bicatenaria. Dichos extremos no apareados no superarán en general los 20 nt de longitud.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos aminoacídicos unido por enlaces peptídicos, producido natural o sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos aminoacídicos se indican habitualmente como "péptidos".

"Sondas y/o cebadores", como se utiliza en la presente memoria, pueden ser ARN o ADN. El ADN puede ser ADNc o ADN genómico. Las sondas y cebadores polinucleotídicos son ARN o ARN mono- o bicatenario, generalmente oligonucleótidos sintéticos, pero pueden generarse a partir de ADNc clonado o secuencias genómicas o sus complementos. Las sondas analíticas serán generalmente de al menos 20 nucleótidos de longitud, aunque pueden utilizarse sondas algo más cortas (14-17 nucleótidos). Los cebadores de PCR son al menos de 5 nucleótidos de longitud, preferiblemente 15 o más nt, más preferiblemente 20-30 nt. Pueden utilizarse polinucleótidos cortos cuando se dirigen al análisis de una región pequeña del gen. Para análisis a gran escala de genes, una sonda polinucleotídica puede comprender un exón entero o más. Las sondas pueden marcarse para proporcionar una señal detectable, tal como con una enzima, biotina, un radionucleido, fluoróforo, agente quimioluminiscente, partícula paramagnética y similares, que están comercialmente disponibles en muchas fuentes, tales como Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, y Amersham Corp., Arlington Heights, IL, utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica.

Los pesos moleculares y longitudes de los polímeros determinados por procedimientos analíticos imprecisos (por ejemplo electroforesis en gel) se ha de entender que son valores aproximados. Cuando dicho valor se expresa como "aproximadamente" X, el valor de X expresado se ha de entender que será exacto en un \pm 10%.

La presente invención estaba basada en parte en el descubrimiento de que un nuevo homólogo de proteína relacionada con el complemento de adipocitos inhibe la activación de plaquetas mediada por colágeno y la ruta de complemento incluyendo Clq. Esta proteína se designó zsig37, y se describe con detalle en la solicitud de patente PCT publicada de cesión común con la presente WO 99/04000.

La secuencia nucleotídica de zsig37 (SEC ID Nº 1) codifica un polipéptido (SEC ID Nº 2) que tiene una secuencia señal amino terminal, una región N-terminal adyacente no homóloga, un dominio de colágeno truncado compuesto por repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro y una porción globular carboxi terminal. La nueva secuencia polinucleotídica contiene también una larga región 3' no traducida. La estructura polipeptídica general expuesta anteriormente es compartida por Acrp30 y HUMUPST2_1, excepto porque el dominio de tipo colágeno de cada una de estas proteínas es más largo que el de los polipéptidos zsig37. También, la secuencia de ADN de HUMUPST2_1 se caracteriza por una larga región 3' no traducida. Además, Acrp30 y todas las secuencias alineadas en la Fig. 1, con la excepción de CERL_RAT, comparten un residuo de cisteína conservado en la posición 187 del polipéptido zsig37, como se muestra en la Fig. 1 y la SEC ID Nº 2. También, los polipéptidos zsig37 de la presente invención incluyen un supuesto sitio de glucosilación ligado por N en el aminoácido 93 (Asn) de la SEC ID Nº 2.

El análisis de la distribución en tejido del ARNm, correspondiente a zsig37 mostró que la expresión era mayor en corazón y placenta, con señales relativamente menos intensas en riñón, ovario, glándula suprarrenal y músculo esquelético y señales menores en una amplia variedad de otros tejidos presentes en la transferencia Northern.

Se estableció una relación homóloga de zsig37 con la proteína Acrp30 relacionada con el complemento de adipocitos (SEC ID Nº 3) y la proteína apM1 secretada por adipocito (HUMUPST2_1 en las fig. 1 y 2). Se identificó también una homología algo más distante con la cadena A de ClQ de componente de complemento, con dos factores observados en el estado activo de hibernación de marmotas siberianas (HP25_TAMAS y HP27_TAMAS) y con una proteína de cerebro de rata (CERL_RAT), como se muestra en las Fig. 1 y 2.

La secuencia nucleotídica de zsig37 se describe en la SEC ID Nº 1, y su secuencia aminoacídica deducida se describe en la SEC ID Nº 2. Se proporciona una secuencia nucleotídica degenerada que codifica el polipéptido de SEC ID Nº 2 en la SEC ID Nº 23. Como se describe en general anteriormente, el polipéptido zsig37 incluye una secuencia señal en el intervalo del aminoácido 1 (Met) al residuo aminoacídico 21 (Gly). Una secuencia señal alternativa está en el intervalo del aminoácido 1 (Met) al aminoácido 25 (Ser). El polipéptido maduro está por tanto en el intervalo del aminoácido 22 (Leu) o 26 (Arg) al aminoácido 281 (Pro). En el polipéptido maduro, se encuentra una región N-terminal de homología desconocida, en el intervalo entre el residuo aminoacídico 22 (Leu) y 98 (Lys). Además, se encontró un dominio de colágeno truncado entre el aminoácido 99 (Gly) y 140 (Arg). En el dominio de colágeno truncado, se observan 1 repetición Gly-Xaa-Pro perfecta y 13 repeticiones Gly-Xaa-Xaa imperfectas. En contraposición, Acrp30 contiene 22 repeticiones perfectas o imperfectas. El polipéptido zsig37 incluye también un dominio globular carboxi terminal en el intervalo de aproximadamente el aminoácido 141 (Cys) a 281 (Pro). El polipéptido zsig37, HUMUPST2_1 y Acrp30 parecen ser homólogos en el dominio de colágeno y en el dominio globular, pero no en la porción N-terminal del polipéptido maduro.

El dominio Clq globular de ACRP30 se ha determinado que tiene 10 cadenas beta de topología "brazo de gitano" (Shapiro y Scherer, Curr. Biol. 8: 335-338, 1998) que muestra una homología estructural significativa con la familia de TNF, y la secuencia de zsig37 representada por la SEC ID Nº 2 contiene las 10 cadenas beta de esta estructura (residuos aminoacídicos 147-151, 170-172, 178-181, 185-188, 191-203, 207-214, 219-225, 227-238, 244-250 y 269-274 de la SEC ID Nº 2). Estas 10 cadenas beta se han designado "A", "A'", "B", "B'", "C", "D", "E", "F", "G" y "H", respectivamente.

La zsig37 tiene dos bucles de unión a receptor, en los residuos aminoacídicos 152-180 y 213-226. Los residuos aminoacídicos 191 (Gly), 193 (Tyr), 238 (Leu) y 272 (Gly) parecen estar conservados en la superfamilia que incluye CD40, TNF\alpha, TNF\beta, ACRP30 y zsig37.

Otro aspecto de la presente invención incluye el uso de fragmentos polipeptídicos de zsig37 como inhibidores de la hemostasis y funciones inmunes. Los fragmentos preferidos incluyen el dominio de tipo colágeno de polipéptidos zsig37, en el intervalo del aminoácido 99 (Gly) al aminoácido 140 (Arg) de la SEC ID Nº 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio de tipo colágeno o una porción del dominio de tipo colágeno capaz de dimerización u oligomerización. Otros fragmentos preferidos incluyen el dominio globular de polipéptidos zsig37, en el intervalo del aminoácido 140 (Arg) ó 141 (Cys) a 281 (Pro) de la SEC ID Nº 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio de tipo globular o una porción activa del dominio de tipo globular. Otro fragmento del polipéptido zsig37 de la presente invención incluye tanto el dominio de tipo colágeno como el dominio globular en el intervalo del residuo aminoacídico 99 (Gly) a 281 (Pro) de la SEC ID Nº 2. Estos fragmentos son particularmente útiles en la inhibición de la activación de plaquetas mediada por colágeno y en la inhibición de complemento y Clq.

La presente invención proporciona también el uso de proteínas de fusión zsig37. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la presente invención comprenden (1) un polipéptido seleccionado del grupo que comprende: (a) moléculas polipeptídicas que comprenden una secuencia de residuos aminoacídicos como se muestra en la SEC ID Nº 2 desde el residuo aminoacídico 1 (Met), 22 (Leu) ó 26 (Arg) hasta el residuo aminoacídico 281 (Pro); (b) moléculas polipeptídicas en el intervalo del aminoácido 99 (Gly) al aminoácido 140 (Arg) de la SEC ID Nº 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el domino de tipo colágeno o una porción del dominio de tipo colágeno capaz de dimerización u oligomerización; (c) moléculas polipeptídicas en el intervalo del aminoácido 140 (Arg) ó 141 (Cys) a 281 (Pro) de la SEC ID Nº 2, una porción del polipéptido zsig37 que contiene el dominio de tipo globular o una porción activa del dominio de tipo globular; o (d) moléculas polipeptídicas en el intervalo del aminoácido 99 (Gly) a 281 (Pro), una porción del polipéptido zsig37 que incluye el dominio de tipo colágeno y el dominio globular; y (2) otro polipéptido. Los otros polipéptidos pueden ser un dominio globular alternativo o adicional, un dominio de tipo colágeno alternativo o adicional, un péptido señal para facilitar la secreción de la proteína de fusión o similares.

Son también útiles en los métodos de la invención agonistas y antagonistas de zsig37. Los métodos de identificación de antagonistas son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los antagonistas del polipéptido zsig37 pueden identificarse proporcionando células sensibles a un polipéptido zsig37, cultivando una primera porción de las células en presencia de polipéptido zsig37, cultivando una segunda porción de las células en presencia de polipéptido zsig37 y un compuesto de ensayo, y detectando una reducción de la respuesta celular de la segunda porción de las células en comparación con la primera porción de las células. Además de los ensayos descritos en la presente memoria, puede ensayarse en muestras la inhibición de la actividad zsig37 con una variedad de ensayos diseñados para medir la unión a receptor o la estimulación/inhibición de respuestas celulares dependientes de zsig37. Por ejemplo, las estirpes celulares sensibles a zsig37 pueden transfectarse con un constructo de gen indicador que es sensible a la ruta celular estimulada por zsig37. Los constructos de gen indicador de este tipo son conocidos en la técnica, y comprenderán generalmente un elemento de respuesta a ADN de zsig37 ligado operativamente a un gen que codifica una proteína ensayable, tal como luciferasa. Los elementos de respuesta a ADN pueden incluir, pero sin limitación, elementos de respuesta a AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta a hormonas (HRE), elementos de respuesta a insulina (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273-5277, 1990) y elementos de respuesta sérica (SRE) (Shaw et al., Cell 56: 563-572, 1989). Los elementos de respuesta a AMP cíclico se revisan en Roestler et al., J. Biol. Chem. 263 (19): 9063-9066, 1988 y Habener, Molec. Endocrinol. 4 (8): 1087-1094, 1990. Los elementos de respuesta a hormonas se revisan en Beato, Cell 56: 335-344, 1989. En los compuestos, soluciones, mezclas o extractos candidatos se ensaya su capacidad de inhibir la actividad de zsig37 sobre células diana, como evidencia una reducción de la estimulación por zsig37 de la expresión del gen indicador. Los ensayos de este tipo detectarán compuestos que bloquean directamente la unión de zsig37 a receptores de superficie celular, así como compuestos que bloquean procesos en la ruta celular subsiguientes a la unión receptor-ligando. Como alternativa, en los compuestos u otras muestras puede ensayarse el bloqueo directo de la unión de zsig37 a receptor utilizando zsig37 marcada con un marcador detectable (por ejemplo ^{125}I, biotina, peroxidasa de rábano picante, FITC y similares). En ensayos de este tipo, la capacidad de una muestra de ensayo de inhibir la unión de zsig37 marcada al receptor es indicativa de actividad inhibidora, que puede confirmarse mediante ensayos secundarios. Los receptores utilizados en los ensayos de unión pueden ser receptores celulares o receptores aislados inmovilizados.

Son también útiles en los métodos de la invención anticuerpos que se unen específicamente a epítopos polipeptídicos, péptidos o polipéptidos zsig37. Los métodos para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1982).

Como resultaría evidente para un experto en la técnica, los anticuerpos policlonales pueden generarse inoculando una variedad de animales de sangre caliente tales como caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones, hámsteres, conejillos de indias y ratas, así como animales transgénicos tales como ovejas, vacas, cabras o cerdos transgénicos. Los anticuerpos pueden expresarse también en levaduras y hongos en formas modificadas, así como en células de mamífero e insecto. El polipéptido zsig37 o un fragmento del mismo sirve como antígeno (inmunógeno) para inocular un animal o desencadenar una respuesta inmune. Los antígenos adecuados incluirían el polipéptido zsig37 codificado por la SEC ID Nº 2, desde el residuo aminoacídico 22-281 de la SEC ID Nº 2, desde el residuo aminoacídico 26-281 de la SEC ID Nº 2, o un fragmento de residuo aminoacídico 9-281 contiguo del mismo. La inmunogenicidad de un polipéptido zsig37 puede aumentarse mediante el uso de un coadyuvante, tal como alúmina (hidróxido de aluminio) o coadyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para inmunización incluyen también polipéptidos de fusión, tales como fusiones de zsig37 o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con un marcador de afinidad. El inmunógeno polipeptídico puede ser una molécula completa o una porción de la misma. Si la porción polipeptídica es "de tipo hapteno", dicha porción puede estar unida o ligada ventajosamente a un vehículo macromolecular (tal como hemocianina de lapa bocallave (KLH), seroalbúmina bovina (BSA) o toxoide del tétanos) para inmunización.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno tales como fragmentos proteolíticos F(ab')_{2} y Fab. Se incluyen también anticuerpos o fragmentos intactos modificados por ingeniería genética, tales como anticuerpos quiméricos, fragmentos Fv, anticuerpos monocatenarios y similares, así como péptidos y polipéptidos sintéticos de unión a antígeno. Los anticuerpos no humanos pueden humanizarse injertando sólo CDR no humanas en un marco y regiones constantes humanos, o incorporando los dominios variables no humanos enteros (opcionalmente "cubriéndolos" con una superficie de tipo humano mediante reemplazo de los residuos expuestos, siendo el resultado un anticuerpo "revestido"). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos en los dominios marco de región variable humana para potenciar las características de unión apropiadas. Humanizando los anticuerpos, puede aumentarse la semivida biológica, y se reduce el potencial de reacciones inmunes adversas tras la administración a seres humanos. Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos útiles en la presente memoria incluyen la exposición in vitro de linfocitos a proteína o péptido zsig37, y la selección de bibliotecas de contenido anticuerpo en fagos o vectores similares (por ejemplo mediante el uso de proteína o péptido zsig37 inmovilizado o marcado).

Los anticuerpos se define que se unen específicamente si: 1) exhiben un nivel umbral de actividad de unión, y/o 2) no reaccionan significativamente de forma cruzada con moléculas polipeptídicas relacionadas. En primer lugar, los anticuerpos en la presente memoria se unen específicamente si se unen a un polipéptido, péptido o epítopo zsig37 con una afinidad de unión (K_{a}) de 10^{6} mol^{-1} o mayor, preferiblemente 10^{7} mol^{-1} o mayor, más preferiblemente 10^{8}mol^{-1} o mayor y lo más preferiblemente 10^{9} mol^{-1} o mayor. La afinidad de unión de un anticuerpo puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo mediante análisis Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51, 660-672, 1949).

En segundo lugar, los anticuerpos se unen específicamente si no reaccionan significativamente de forma cruzada con polipéptidos relacionados. Los anticuerpos no reaccionan significativamente de forma cruzada con moléculas peptídicas relacionadas, por ejemplo, si detectan el polipéptido zsig37 pero no polipéptidos relacionados conocidos utilizando un análisis de transferencia Western estándar (Ausubel et al., ibid.). Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos incluyen otros miembros de una familia de proteínas tal como Acrp30 (SEC ID Nº 3), los polipéptidos mostrados en la alineación de la Fig. 1 y similares. Podrían incluir también, si se desea, polipéptidos zsig37 ortólogos y humanos mutantes. Además, los anticuerpos pueden "analizarse frente a" polipéptidos relacionados conocidos para aislar una población que se una específicamente a los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, los anticuerpos originados por polipéptidos zsig37 humanos se adsorben sobre polipéptidos relacionados adheridos a una matriz insoluble; los anticuerpos específicos de polipéptidos zsig37 humanos fluirán a través de la matriz en las condiciones de tamponación apropiadas. Dicho examen permite el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales no reactivos de forma cruzada con polipéptidos estrechamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). El examen y aislamiento de anticuerpos específicos es bien conocido en la técnica (véanse Fundamental Immunology, Paul (Eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (Eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984). Los ejemplos representativos de dichos ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA), transferencia de mancha o ensayo de transferencia Western, ensayo de inhibición o competición y ensayo sándwich.

El efecto de los polipéptidos, fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas de zsig37 sobre la hemostasis, en particular la adhesión y activación de plaquetas que conduce a la agregación de plaquetas, puede determinarse utilizando métodos y ensayos proporcionados en la presente memoria y los conocidos en la técnica. El colágeno es un potente inductor de la agregación de plaquetas. Esto plantea riesgos a pacientes que se recuperan de lesiones vasculares. Serían útiles inhibidores de la agregación de plaquetas inducida por colágeno para dichos fines. Se encontró que zsig37 se unía a fibronectina y colágenos de tipo I, II, III, V y VI. En particular, zsig37 se une a dominios específicos en el colágeno VI de manera dependiente de la concentración. Se encontró también que zsig37 inhibía la activación de plaquetas mediada por colágeno. La inhibición inducida por zsig37 era selectiva de la activación de colágeno, zsig37 no tenía efecto sobre plaquetas activadas por los activadores de plaquetas conocidos ADP o trombina. Estos resultados se describen con más detalle a continuación en la sección de ejemplos siguiente. Se anticipa que los polipéptidos, fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas de zsig37 serán útiles para bloquear la unión de plaquetas a superficies recubiertas con colágeno y para reducir la agregación de plaquetas inducida por colágeno asociada.

Clq es un componente de la ruta de complemento, y se ha encontrado que estimula mecanismos de defensa así como que desencadena la generación de especies de oxígeno tóxicas que pueden causar daño tisular (Tenner, Behring Inst. Mitt., 93: 241-253, 1993). Se encuentran sitios de unión de Clq en plaquetas. Se ha encontrado que Clq, independiente de un asociado de unión inmune, inhibe la agregación de plaquetas pero no la adhesión de plaquetas o el cambio de forma. La región amino terminal de Clq comparte homología con el colágeno (Peerschke y Ghebrehiwet, J. Immunol. 145: 2984-2988, 1990). Zsig37 se une a Clq de complemento de manera dependiente de la concentración. Se encontró que zsig37 era eficaz en la inhibición de la ruta de complemento que incluía Clq, tanto con eritrocitos de oveja sensibilizados como no sensibilizados.

Los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de zsig37 de la presente invención pueden utilizarse en métodos para promover el flujo sanguíneo en la vasculatura de un mamífero al reducir el número de plaquetas que se adhieren y son activadas y el tamaño de los agregados de plaquetas. Dichos métodos comprenderían la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de polipéptidos, fragmentos, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas de zsig37 a un mamífero necesitado de dicho tratamiento, con lo cual zsig37 reduce la actividad trombogénica y de complemento en la vasculatura del mamífero. Como se describe a continuación, los polipéptidos zsig37 inhiben la activación de plaquetas mediada por colágeno e inactivan la fibronectina y colágenos de tipo I, II, III, V y VI mediante unión. La administración de zsig37 reduce la actividad trombogénica en el sitio de lesión vascular al reducir los modos de adhesión, activación y agregación de plaquetas. Zsig37 inhibe también la ruta de complemento y Clq como se describe a continuación, reduciendo así la actividad del complemento en la vasculatura. Los polipéptidos, fragmentos, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas de zsig37 utilizados en dichos métodos pueden administrarse antes, durante o después de una lesión vascular aguda en el mamífero.

En un método preferido, la lesión vascular es debida a reconstrucción vascular, incluyendo pero sin limitación angioplastia, endarterectomía, injerto de derivación arterial coronario, reparación microvascular o anastomosis de un injerto vascular. Se contemplan también lesiones vasculares debidas a traumatismo, apoplejía o aneurisma. En otros métodos preferidos, la lesión vascular es debida a ruptura de placas, degradación de la vasculatura, complicaciones asociadas a la diabetes y aterosclerosis. La ruptura de placas en la arteria coronaria induce ataque cardiaco, y en la arteria cerebral induce apoplejía. El uso de polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de zsig37 en dichos métodos sería también útil para mejorar enfermedades sistémicas globales asociadas al sistema inmune, tales como coagulación intravascular diseminada (DIC) y SID. Adicionalmente, la actividad inhibidora del complemento sería útil para tratar enfermedades inmunes no vasculatorias tales como arteriolosclerosis.

Se ha encontrado una correlación entre la presencia de Clq en miocardio isquémico localizado y la acumulación de leucocitos después de oclusión y reperfusión coronaria. La liberación de componentes celulares después del daño tisular desencadena la activación del complemento, que da como resultado productos de oxígeno tóxicos que pueden ser la causa primaria de lesión miocárdica (Rossen et al., Circ. Res. 62: 572-584, 1998 y Tenner, ibid.). El bloqueo de la ruta de complemento se encontró que protegía al miocardio isquémico de lesión por reperfusión (Buerke et al., J. Pharm. Exp. Therp. 286: 429-438, 1998). La inhibición del complemento y de la actividad de unión de Clq de polipéptidos zsig37 sería útil para dichos fines.

Las capacidades de unión a colágeno y Clq de zsig37 serían útiles para inertizar tejidos colagenosos dañados evitando la adhesión, activación o agregación de plaquetas, y la activación de procesos inflamatorios que conducen a la liberación de productos de oxígeno tóxicos. Al convertir el tejido expuesto en inerte frente a procesos tales como la actividad del complemento, la actividad trombótica y la activación inmune, los polipéptidos, fragmentos, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas de zsig37 serían útiles en la reducción de los efectos dañinos de isquemia y reperfusión. En particular, dichas lesiones incluirían isquemia por lesión traumática, estrangulación intestinal y lesión asociada al pre- y post-establecimiento del flujo sanguíneo. Zsig37 sería útil en el tratamiento de isquemia por derivación cardiopulmonar y resucitación, infarto de miocardio y vasoespasmo postraumático, tal como apoplejía o angioplastia percutánea transluminal, así como traumatismo vascular accidental o inducido por la cirugía.

Los polipéptidos, fragmentos, fusiones, anticuerpos, agonistas o antagonistas de zsig37 serían también útiles para inertizar biomateriales protésicos y equipo quirúrgico para convertir la superficie de los materiales en inerte frente a la activación del complemento, la actividad trombótica o la activación inmune. Dichos materiales incluyen, pero sin limitación, colágeno o biomateriales recubiertos con fragmentos de colágeno, biomateriales recubiertos con gelatina, biomateriales recubiertos con fibrina, biomateriales recubiertos con fibronectina, biomateriales recubiertos con heparina, colágeno y prótesis endovasculares recubiertas con gel, injertos arteriales, válvulas cardiacas sintéticas, órganos artificiales o cualquier aplicación protésica expuesta a la sangre que una zsig37 a más de 1 x 10^{8}. El recubrimiento de dichos materiales puede realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica, véase por ejemplo Rubens, patente de EE.UU. nº 5.272.074.

El complemento y Clq desempeñan un papel en la inflamación. La activación del complemento se inicia por la unión de Clq a inmunoglobulinas (Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12: 933-941, 1993; Ward y Ghetie, Therap. Immunol. 2: 77-94, 1995). Los inhibidores de Clq y complemento serían útiles como agentes antiinflamatorios. Dicha aplicación puede realizarse para prevenir la infección. Adicionalmente, dichos inhibidores pueden administrarse a un individuo que padece inflamación mediada por la activación del complemento y la unión de complejos inmunes a Clq. Los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de zsig37 serían útiles en métodos para mediar en la reparación de heridas y potenciar la progresión de la curación de heridas al superar la curación de heridas alterada. La progresión en la curación de heridas incluiría, por ejemplo, elementos tales como reducción de la inflamación, agrupamiento de fibroblastos, retracción de la herida y reducción de la infección.

La capacidad de las células tumorales de unirse al colágeno puede contribuir a la metástasis de tumores. Los inhibidores de la unión a colágeno son también útiles para mediar en las interacciones adhesivas y la extensión metastásica de tumores (Noeske-Jungbult et al., patente de EE.UU. nº 5.723.312).

Se encontró que zsig37 inducía la vasodilatación en anillos aórticos contraídos con norepinefrina utilizando los procedimientos de Dainty et al., J. Pharmacol. 100: 767, 1990 y Rhee et al., Neurotox. 16: 179, 1995, como se describe a continuación con más detalle.

La adhesión, activación y agregación de plaquetas pueden evaluarse utilizando métodos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica, tales como el ensayo de agregación de plaquetas (Chiang et al., Thrombosis Res. 37: 605-612, 1985) y los ensayos de adhesión de plaquetas (Peerschke y Ghebrehiwet, J. Immunol. 144: 221-225, 1990). La inhibición de Clq y de la ruta de complemento puede determinarse utilizando métodos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica, tales como los descritos en Suba y Csako, J. Immunol. 117: 304-309, 1976. Los ensayos para la adhesión de plaquetas a colágeno y la inhibición de la agregación de plaquetas inducida por colágeno pueden medirse utilizando métodos descritos en Keller et al., J. Biol. Chem. 268: 5450-5456, 1993; Waxman y Connolly, J. Biol. Chem. 268: 5445-5449, 1993; Noeske-Jungblut et al., J. Biol. Chem. 269: 5050-5053 o 1994, Deckmyn et al., Blood 85: 712-719, 1995.

Están disponibles diversos modelos in vitro e in vivo para evaluar los efectos de los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas y antagonistas de zsig37 sobre la lesión por isquemia y reperfusión. Véanse por ejemplo Shandelya et al., Circulation 88: 2812-2826, 1993; Weisman et al., Science 249: 146-151, 1991; Buerke et al., Circulation 91: 393-402, 1995; Horstick et al., Circulation 95: 701-708, 1997 y Burke et al., J. Phar. Exp. Therp. 286: 429-438, 1998. Se describe un ensayo de agregación de plaquetas de hámster ex vivo por Deckmyn et al., ibid. Los tiempos de hemorragia en hámsteres y babuinos pueden medirse después de la inyección de polipéptidos zsig37 utilizando el modelo descrito por Deckmyn et al., ibid. La formación de trombos en respuesta a la administración de proteínas de la presente invención puede medirse utilizando el modelo de trombosis de vena femoral de hámster proporcionado por Deckmyn et al., ibid. Los cambios en la adhesión de plaquetas en condiciones de flujo después de la administración de zsig37 pueden medirse utilizando el método descrito en Harsfalvi et al., Blood 85: 705-711, 1995.

La inhibición del complemento y la curación de heridas pueden ensayarse en polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, anticuerpos, agonistas o antagonistas de zsig37 solos o en combinación con otros inhibidores conocidos de la activación y agregación de plaquetas inducida por colágeno, tales como paldipina, moubatina o calina, por ejemplo.

Los polipéptidos, fragmentos, proteínas de fusión, agonistas o antagonistas de zsig37 pueden evaluarse utilizando métodos descritos en la presente memoria o conocidos en la técnica, tales como la curación de capas dérmicas en cerdos (Lynch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7696-7700, 1987) y heridas de todo el grosor de la piel en ratones genéticamente diabéticos (Greenhalgh et al., Am. J. Pathol. 136: 1235-1246, 1990), por ejemplo. Los polipéptidos de la presente invención pueden ensayarse solos o en combinación con otros inhibidores de complemento conocidos como se describen anteriormente.

Además, los polipéptidos, fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas de zsig37 de los mismos pueden ser terapéuticamente útiles para aplicaciones antimicrobianas. Por ejemplo, el componente del complemento Clq desempeña un papel en la defensa del hospedador frente a agentes infecciosos, tales como bacterias y virus. Clq es conocido por exhibir diversas funciones especializadas. Por ejemplo, Clq desencadena la cascada del complemento mediante la interacción con anticuerpo unido o proteína reactiva con C (CRP). También, Clq interacciona directamente con ciertas bacterias, virus de ARN, micoplasmas, cristales de ácido úrico, el componente lípido A de endotoxina bacteriana y membranas de ciertos orgánulos intracelulares. La unión de Clq al receptor de Clq se cree que promueve la fagocitosis. También parece que Clq potencia el aspecto de formación de anticuerpos del sistema de defensa del hospedador. Véase, por ejemplo, Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12(11): 933-941, 1993. Por tanto, las moléculas de tipo Clq solubles pueden ser útiles como agentes antimicrobianos, promoviendo la lisis o fagocitosis de agentes infecciosos.

Los dominios colagenosos de triple hélice extracelular cargada positivamente de Clq y el receptor de secuestrante de macrófagos se determinó que desempeñaban un papel en la unión de ligando, y se mostró que tenían una amplia especificidad de unión por polianiones (Acton et al., J. Biol. Chem. 268: 3530-3537, 1993). El factor de crecimiento de lisofosfolípidos (ácido lisofosfatídico, LPA) y otros aniones mitogénicos se localizan en el sitio de los tejidos dañados y ayudan a la reparación de heridas. El LPA ejerce muchos efectos biológicos incluyendo la activación de plaquetas y la estimulación del ensamblaje de la matriz. Se cree que el LPA actúa sinérgicamente con otros factores de coagulación sanguínea y media en la curación de heridas.

Los dominios colagenosos de proteínas tales como Clq y receptor de secuestrante de macrófagos son conocidos por unir fosfolípidos ácidos tales como LPA. Una región nonamérica del dominio de colágeno de zsig37, los residuos aminoacídicos 127-135 de la SEC ID Nº 2, comparte homología de secuencia con el dominio de colágeno encontrado en Clq y el receptor de secuestrante de macrófago. La interacción de polipéptidos, fragmentos, fusiones, agonistas o antagonistas de zsig37 con aniones mitogénicos tales como LPA puede determinarse utilizando ensayos conocidos en la técnica, véase por ejemplo Acton et al., ibid. La inhibición de los procesos inflamatorios por polipéptidos y anticuerpos de la presente invención sería también útil para prevenir la infección en el sitio de la herida.

Para uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención pueden formularse con vehículos farmacéuticamente aceptables para administración parenteral, oral, nasal, rectal, tópica, transdérmica o similares, según métodos convencionales. Preferiblemente, la administración se realiza en o cerca del sitio de lesión vascular. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína zsig37 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina tamponada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponación, albúmina para prevenir la pérdida de proteína en superficies de vial, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 19ª ed., 1995. Las dosis terapéuticas serán determinadas generalmente por el médico según los estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad de la afección a tratar, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel del experto en la técnica.

Como se utiliza en la presente memoria, una "cantidad farmacéuticamente eficaz" de un polipéptido, fragmento, proteína de fusión, agonista o antagonista de zsig37 es una cantidad suficiente para inducir un resultado biológico deseado. El resultado puede ser el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un polipéptido zsig37 es aquella que proporciona un alivio subjetivo de los síntomas o una mejora identificable objetivamente observada por el médico u otro observador cualificado. Dicha cantidad eficaz de un polipéptido zsig37 proporcionaría, por ejemplo, la inhibición de la activación de plaquetas activada por colágeno y de la ruta de complemento, incluyendo Clq, el aumento del flujo sanguíneo localizado en la vasculatura de un paciente y/o la reducción de los efectos dañinos de isquemia y reperfusión. Las cantidades eficaces de los polipéptidos zsig37 pueden variar ampliamente dependiendo de la enfermedad o síntoma a tratar. La cantidad de polipéptido a administrar y su concentración en las formulaciones depende del vehículo seleccionado, de la vía de administración, de la potencia del polipéptido particular, del estado clínico del paciente, de los efectos secundarios y de la estabilidad del compuesto en la formulación. Por tanto, el médico empleará la preparación apropiada que contenga la concentración apropiada en la formulación, así como la cantidad de formulación administrada, dependiendo de la experiencia clínica con el paciente en cuestión o con pacientes similares. Dichas cantidades dependerán, en parte, de la afección particular a tratar, edad, peso y estado de salud general del paciente, y de otros factores evidentes para los expertos en la técnica. Típicamente, una dosis estará en el intervalo de 0,01-100 mg/kg del sujeto. En aplicaciones tales como catéteres de balón, el intervalo de dosis típico sería de 0,05-5 mg/kg de sujeto. Las dosis para compuestos específicos pueden determinarse a partir de estudios in vitro o ex vivo en combinación con estudios en animales experimentales. Las concentraciones de compuestos encontradas eficaces in vitro o ex vivo proporcionan una guía para estudios animales, en los que las dosis se calculan para proporcionar concentraciones similares en el sitio de acción.

La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Extensión de secuencia EST

Los nuevos polinucleótidos que codifican polipéptido zsig37 de la presente invención se identificaron inicialmente seleccionando una EST de una base de datos de EST, prediciendo una secuencia proteica basada en la misma y buscando en bases de datos de secuencias conocidas la proteína secretada que sea más homóloga con la proteína predicha basada en la EST. Se identificaron las EST que codifican potencialmente proteínas que tienen homología biológicamente interesante con proteínas secretadas conocidas para un estudio adicional. Se descubrió una sola secuencia EST y se predijo que era homóloga con la proteína específica de adipocito. Véase, por ejemplo, Scherer et al., J. Biol. Chem. 270(45): 26746-26749, 1995. Para identificar el correspondiente ADNc, se utilizó un clon que se consideraba que probablemente contenía la secuencia de codificación completa para secuenciar. Utilizando un kit S.N.A.P.^{TM} Miniprep de Invitrogen (Invitrogen, Corp., San Diego, CA), según las instrucciones del fabricante, se preparó un cultivo de 5 ml durante una noche en LB + ampicilina 50 \mug/ml. El molde se secuenció en un secuenciador de ADN ABIPRISM^{TM} modelo 377 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) utilizando el kit "Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" ABI PRISM^{TM} (Perkin-Elmer Corp.), según las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los oligonucleótidos ZC695 (SEC ID Nº 5), ZC694 (SEC Nº ID 6) hasta los promotores SP6 y T7 en el vector que contiene clon como cebadores de secuenciación. Se utilizaron los oligonucleótidos ZC13210 (SEC ID Nº 7), ZC13588 (SEC ID Nº 8), ZC13532 (SEC ID Nº 9), ZC13641 (SEC ID Nº 10), ZC13586 (SEC ID Nº 11), ZC13651 (SEC ID Nº 12), ZC13622 (SEC ID Nº 13), ZC13625 (SEC ID Nº 14), ZC13650 (SEC ID Nº 15), ZC13589 (SEC ID Nº 16), ZC13624 (SEC ID Nº 17), ZC13531 (SEC ID Nº 18), ZC13587 (SEC ID Nº 19) y ZC13623 (SEC ID Nº 20) para completar la secuencia del clon. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo en un "Hybaid Omnigene Temperature Cycling System" (National Labnet Co., Woodbridge, NY). Se utilizó el software de análisis de secuencia SEQUENCHER^{TM} 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) para análisis de datos. La secuencia de 2769 pb resultante se describe en la SEC ID Nº 1. La comparación de la secuencia EST derivada originalmente con la secuencia representada en la SEC ID Nº 1 mostró que había ambigüedad en un par de bases (un residuo "N" desconocido), que no había inserciones de par de bases que dieran como resultado la identificación de la leucina en la resolución de la ambigüedad, y un desplazamiento de marco cero entre las secuencias aminoacídicas deducidas.

Ejemplo 2 Distribución en tejido

Se efectuaron transferencias Norhern utilizando "Human Multiple Tissue Blots" de Clontech (Palo Alto, CA). Se marcó radiactivamente una sonda de ADN de 30 bases (ZC12447; SEC ID Nº 4) al extremo 5' de la secuencia nucleotídica de la proteína madura mostrada en la SEC ID Nº 1 con 32P, utilizando polinucleótido quinasa T4 y tampón de reacción directa (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD), según las especificaciones del fabricante. La sonda se purificó utilizando una columna a presión NUCTRAP (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Se utilizó una solución de EXPRESSHYB (Clontech, Palo Alto, CA) para prehibridación y como solución de hibridación para las transferencias Northern. La hibridación tuvo lugar durante una noche a 50ºC, y las transferencias se lavaron después con 2 x SSC y 0,1% de SDS a TA, seguido de un lavado con 1 x SSC y 0,1% de SDS a 68ºC (aproximadamente 5ºC menos que el punto de fusión). Se observó un tamaño de transcripto de aproximadamente 2,8 kb. La intensidad de la señal fue máxima para corazón y placenta, con señales relativamente menos intensas en riñón, ovario, glándula suprarrenal y músculo esquelético, y señales menores en una amplia variedad de otros tejidos presentes en la transferencia Northern.

Se realizó un análisis de transferencia Northern adicional utilizando una transferencia Northern de tejido intestinal. La transferencia se preparó utilizando ARNm de la estirpe celular de adenocarcinoma colorrectal humano SW480 (Clontech, Palo Alto, CA), tejido de intestino delgado humano (Clontech), tejido de estómago humano (Clontech), una estirpe celular de músculo liso intestinal humano (Hism; ATCC Nº CRL-1692; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD), una estirpe celular de colon humano normal (FHC; ATCC Nº CRL-1831; American Type Culture Collection) y una estirpe celular de intestino delgado fetal normal humano (FHs74 Int.; ATCC Nº CCL241; American Type Culture Collection).

Se aislaron los ARN totales de Hism, FHC y FHs74 Int. mediante el método del guanidio ácido (Cheomczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156-159, 1987). Los ARN poliA^{+} se seleccionaron eluyendo el ARN total a través de una columna que retiene los ARN poliA^{+} (Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 1408-1412, 1972). Se separaron 2 \mug de ARN poliA^{+} de cada muestra en un gel de agarosa al 1,5% en formaldehído 2,2 M y tampón fosfato. Los ARN se transfirieron a una membrana Nytran (Schleicher y Schuell, Keene, NH) en 20 x SSC durante una noche. La transferencia se trató con UV Stratalinker 2400 (Stratagene, La Jolla, CA) a 0,12 julios. La transferencia se calentó después a 80ºC durante una hora.

Se amplificó ADNc completo (mostrado en la SEC ID Nº 1) por PCR y se marcó radiactivamente con ^{32}P-dCTP utilizando un kit de sedimento Rediprime (Amersham, Arlington Heights, IL), según las especificaciones del fabricante. La transferencia se hibridó en EXPRESSHYB (Clontech) a 56ºC durante una noche. La transferencia se lavó a temperatura ambiente con 2 x SSC y 0,1% de SDS, después con 2 x SSC y 0,1% de SDS a 65ºC y finalmente a 65ºC en 0,1 x SSC y 0,1% de SDS. Los resultados mostraron que zsig37 hibridaba en todos los tejidos excepto la estirpe celular de músculo liso intestinal humano HISM.

Ejemplo 3 Cartografía cromosómica del gen zsig37

El gen zsig37 se cartografió en el cromosoma humano 17, región 17q25.2, mediante PCR utilizando el panel de cartografía híbrida de células somáticas humanas/de roedor NIGMS número 2 (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of Medical Research). El panel consiste en ADN aislado de 24 híbridos de células somáticas humanas/de roedor que retienen cada uno un cromosoma humano específico y los ADN originales. Para la cartografía del gen zsig37, se establecieron reacciones de 20 \mul en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Stratagene, La Jolla, CA) y se utilizaron en un ciclador térmico "Robocycler Gradient 96" (Stratagene). Cada una de las 27 reacciones PCR consistía en 2 \mul de 10 x tampón de reacción PCR KlenTaq (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 \mul de mezcla de dNTP (2,5 mM cada uno, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 \mul de cebador con sentido (SEC ID Nº 21), 1 \mul de cebador sin sentido (SEC ID Nº 22), 2 \mul de RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0,4 \mul de 50 x "Advantage KlenTaq Polymerase Mix" (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng de ADN de un clon híbrido individual o control y H_{2}O dd para un volumen total de 20 \mul. Las reacciones se recubrieron con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del ciclador PCR fueron las siguientes: un ciclo inicial de 5 minutos de desnaturalización a 95ºC, 35 ciclos de 1 minuto de desnaturalización a 95ºC, 1 minuto de reasociación a 60ºC y 1,5 minutos de extensión a 72ºC, seguido de un ciclo final de extensión de 7 minutos a 72ºC. Las reacciones se separaron por electroforesis en un gel de agarosa NuSieve GTG al 3% (FMC Bioproducts, Rockland, ME).

Ejemplo 4 Creación de vectores de expresión de mamífero zsig37NEE/pZP9 y zsig37CEE/pZP9

Se prepararon dos vectores de expresión para el polipéptido zsig37, zSIG37NEE/pZP9 y zSIG37CEE/pZP9, en los que los constructos se diseñaron para expresar un polipéptido zsig37 que tenía un marcador Glu-Glu C- o N-terminal.

Zsig37NEE/pZP9

Se creó un fragmento de ADN de zsig37 de 800 pb generado por PCR utilizando ZC15040 (SEC ID Nº 24) y ZC15033 (SEC ID Nº 25) como cebadores de PCR y el molde descrito en el ejemplo 1 anterior. La reacción PCR se incubó a 94ºC durante 3 minutos, y después se corrió durante 5 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, a 30ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 1 minuto, seguido de 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 64ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 1 minuto. Siguió una extensión de 5 minutos a 72ºC. El producto PCR resultante se corrió después en gel de TBE agarosa al 0,9% con 1 x tampón TBE. Se extrajo una banda del tamaño predicho y se purificó el ADN del gel con una resina Qiaex II® (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ADN se digirió con las enzimas de restricción Bam HI y Xba I, seguido de extracción y precipitación.

El fragmento de ADN de zsig37 extraído digerido con restricción se subclonó en el plásmido NEE/pZP9, que se había cortado con las enzimas de restricción Bam HI y Xba I. El vector de expresión zsig37NEE/pZP9 incorpora el líder TPA y une un marcador Glu-Glu (SEC ID Nº 26) N-terminal a la secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido zsig37. El plásmido NEE/pZP9 (depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, ATCC nº 98668) es un vector de expresión de mamífero que contiene un módulo de expresión que tiene el promotor metalotioneína-1 de ratón, un péptido líder TPA, seguido por la secuencia que codifica el marcador Glu-Glu (SEC ID Nº 26), múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias de codificación, y un terminador de hormona del crecimiento humano. El plásmido contiene también un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador selectivo de mamífero que tiene un promotor, potenciador y origen de replicación SV40, un gen DHFR y el terminador SV40.

Zsig37CEE/pZP9

Se creó un fragmento de ADN de zsig37 de 866 pb generado por PCR según el procedimiento expuesto anteriormente utilizando ZC15721 (SEC ID Nº 27) y ZC15035 (SEC ID Nº 28) como cebadores de PCR. El fragmento purificado por PCR se digirió con las enzimas de restricción Eco RI y Bam HI, y se purificó en gel utilizando una resina Qiaex II como se describe anteriormente.

El ADN de zsig37 extraído y digerido con restricción se subclonó en el plásmido CEE/pZP9, que se había cortado con Eco RI y Bam HI. El vector de expresión zsig37CEE/pZP9 utiliza el péptido señal de zsig37 nativo, y el epítopo Glu-Glu (SEC ID Nº 26) está unido a la terminación C como auxiliar de purificación. El plásmido CEE/pZP9 (depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, ATCC nº 98668) es un vector de expresión de mamífero que contiene un módulo de expresión que tiene el promotor metalotioneína-1 de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias de codificación, una secuencia que codifica el marcador Glu-Glu (SEC ID Nº 26), un codón de paro y un terminador de hormona del crecimiento. El plásmido tiene también un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador selectivo de mamífero que tiene un promotor, potenciador y origen de replicación SV40, un gen DHFR y el terminador SV40.

Para los constructos marcados en N y C, se ligaron aproximadamente 30 ng de los insertos digeridos con restricción y 50 ng de los vectores correspondientes a temperatura ambiente durante 4 horas. Se electroporó independientemente 1 \mul de cada reacción de ligamiento en células DH10B competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante, se sembraron sobre placas LB que contenían ampicilina 50 mg/ml, y se incubaron durante una noche.

Las colonias se examinaron por PCR como se describe anteriormente. Para los análisis de zsig37NEE/pZP9 y zsig37CEE/pZP9, los cebadores fueron ZC13006 (SEC ID Nº 29) y ZC13007 (SEC ID Nº 20). La reacción PCR se incubó a 94ºC durante 2,5 minutos, y después se corrió durante 25 ciclos de 94ºC durante 10 segundos, a 58ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 1 minuto. Siguió una extensión de 5 minutos a 72ºC. La secuencia del inserto de clones positivos, 1013 pb para zsig37NEE y un fragmento de 950 pb para zsig37CEE, se verificó mediante análisis de secuencia. Se realizó una preparación de plásmido a gran escala utilizando un kit Maxi Prep de QIAGEN® (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 5 Transfección y expresión de polipéptidos zsig37NEE y CEE

Se sembraron células BHK 570 (ATCC nº CRL-10314) en discos de cultivo de tejido de 10 cm y se permitieron crecer hasta aproximadamente 50 a 70% de confluencia durante una noche a 37ºC, CO_{2} al 5%, en medio DMEM/FBS (DMEM, High Glucose de Gibco/BRL (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina 2 \muM (JRH Biosciences, Lenexa, KS), piruvato de sodio 1 \muM (Gibco BRL)). Las células se transfectaron después con el plásmido zsig37NEE/pZP9 (marcador Glu-Glu N-terminal) o zsig37CEE/pZP9 (marcador Glu-Glu C-terminal), utilizando Lipofectamine^{TM} (Gibco BRL), en formulación en medios exentos de suero (SF) (DMEM, High Glucose de Gibco/BRL (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 2 mM, transferrina 10 \mug/ml, insulina 5 \mug/ml, fetuina 10 \mug/ml y selenio 2 ng/ml). Se diluyeron separadamente 16 \mug de zsig37NEE/pZP9 y 16 \mug de zsig37CEE/pZP9 en tubos de 15 ml hasta un volumen final total de 640 \mul de medio SF. En tubos separados, se mezclaron 35 \mul de Lipofectamine^{TM} (Gibco BRL) con 605 \mul de medio SF. La mezcla de Lipofectamine^{TM} se añadió a la mezcla de ADN y se permitió incubar aproximadamente durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 5 ml de medio SF a la mezcla de ADN:Lipofectamine^{TM}. Las células se aclararon una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron y se añadieron a la mezcla ADN/Lipofectamine^{TM}. Las células se incubaron a 37ºC durante 5 horas, después se añadieron 6,4 ml de medio DMEM/10% de FBS, 1% de PSN a la placa. La placa se incubó a 37ºC durante una noche y se reemplazó la mezcla de ADN:Lipofectamine^{TM} por medio FBS/DMEM fresco el día siguiente. El día 2 después de la transfección, las células se diluyeron en el medio de selección (ESTEP nº 1 con MTX 1 \muM) en placas de 150 ml a 1:50, 1:100 y 1:200. Las placas se realimentaron el día 5 después de la transfección con medio de selección fresco.

Examen de colonias

Aproximadamente 10-12 días después de la transfección, se eligió un disco de cultivo de 150 mm de colonias resistentes al metotrexato de cada transfección, se aspiró el medio, se lavaron las placas con 10 ml de medio ESTEP 2 exento de suero (668,7 g/50 l de DMEM (Gibco); 5,5 g/50 l de ácido pirúvico, sal de sodio al 96% (Mallinckrodt); 185,0 g/50 l de NaHCO_{3} (Mallinckrodt), 5,0 mg/ml; 25 ml/50 l de insulina, 10,0 mg/ml; y 25 ml/50 l de transferrina). El medio de lavado se aspiró y se reemplazó por 5 ml de ESTEP 2 exento de suero. Se dispuso entonces una malla de teflón estéril (Spectrum Medical Industries, Los Ángeles, CA) preempapada en ESTEP 2 exento de suero sobre las células. Se dispuso después un filtro de nitrocelulosa estéril preempapado en ESTEP 2 exento de suero sobre la malla. Las marcas de orientación en la nitrocelulosa se transfirieron al disco de cultivo. Las placas se incubaron después durante 5-6 horas en un incubador a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después de la incubación, se retiró el filtro, y el medio se aspiró y se reemplazó por medio DMEM/5% de FBS, 1 x PSN (Gibco BRL). El filtro se dispuso después en una bolsa sellable que contenía 50 ml de tampón (Tris 25 mM, glicina 25 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM) y se incubó en un baño de agua a 65ºC durante 10 minutos. Los filtros se bloquearon con tampón de 10% de leche en polvo desgrasada/Western A (Western A: Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, 0,05% de NP-40, NaCl 150 mM y 0,25% de gelatina) durant 15 minutos a temperatura ambiente en un agitador giratorio. El filtro se incubó después con un conjugado anticuerpo-HRP anti-Glu-Glu a una dilución 1:1000 de tampón de 2,5% de leche en polvo desgrasada/Western A (Western A: Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, 0,05% de NP-40, NaCl 150 mM y 0,25% de gelatina) durante una noche a 4ºC en un agitador giratorio. El filtro se lavó después tres veces a temperatura ambiente en PBS más 0,1% de Tween 20, 5-15 minutos por lavado. El filtro se reveló con reactivo ECL (Amersham Corp. Arlington Heigths, IL) según las instrucciones del fabricante y se expuso a película (Hyperfilm ECL, Amersham) durante aproximadamente 5 minutos.

La película se alineó con la placa que contenía las colonias. Utilizando la película como guía, se seleccionaron las colonias adecuadas. Se empaparon discos de colonias de 3 mm (PGC Scientific Corp., Frederick, MD) con tripsina, y se dispusieron sobre las colonias. Se transfirieron 12 colonias por cada constructo a 200 \mul de medio de selección en una placa de 96 pocillos. Se llevaron a cabo una serie de 7 diluciones dobles para cada colonia. Las células se hicieron crecer durante una semana a 37ºC, en cuyo momento los pocillos que recibieron la dilución más baja de células, que están entonces a la densidad óptima, se seleccionaron, se tripsinizaron y se transfirieron a una placa de 12 pocillos que contenía medio de selección. El disco de cultivo de 150 mm se tripsinizó también y el resto de las células se agruparon y se sometieron a análisis Western y ensayo de micoplasma. El conjunto se congeló para almacenamiento.

Los clones se expandieron directamente a partir de la placa de 12 pocillos en dos matraces T-75. Un matraz se mantuvo con crecimiento celular continuo, el segundo matraz se hizo crecer en ESTEP 2 exento de suero, que se recogió para análisis por transferencia Western. Se seleccionaron clones de cada uno de los constructos de expresión, basándose en análisis de transferencia Western, se agruparon y se transfirieron a cultivos a gran escala.

Ejemplo 7 Expresión a gran escala de zsig37CEE en mamíferos

Se expandieron un matraz T-162 que contenía células confluentes que expresaban zsig37CEE y uno que contenía zsig37NEE, obtenidos mediante el procedimiento de expresión descrito anteriormente, en cuatro matraces T-162 cada uno. Uno de los cuatro matraces resultantes se utilizó para congelar cuatro crioviales, y los otros tres matraces se utilizaron para generar una fábrica celular Nunc.

Las células de los tres matraces T-162 de zsig37CEE y zsig37NEE se utilizaron para sembrar independientemente dos fábricas celulares Nunc (10 capas, comercialmente disponible en VWR). Brevemente, las células de los matraces T-162 descritos anteriormente se despegaron utilizando tripsina, se agruparon y se añadieron a 1,5 litros de medio ESTEP 1 (668,7 g/50 l de DMEM (Gibco); 5,5 g/50 l de ácido pirúvico, sal de sodio al 96% (Mallinckrodt); 185,0 g/50 l de NaHCO_{3} (Mallinckrodt), 5,0 mg/ml; y 25 ml/50 l de insulina (JRH Biosciences), 10,0 mg/ml; y 25 ml/50 l de transferrina (JRH Biosciences); 2,5 l/50 l de suero bovino fetal (caracterizado) (Hyclone), MTX 1 \muM, con el pH ajustado a 7,05 \pm 0,05) precalentado a 37ºC. El medio que contenía las células se vertió después en las fábricas celulares Nunc mediante un embudo. Las fábricas celulares se dispusieron en un incubador a 37ºC/CO_{2} al 5%.

A 80-10% de confluencia, se efectuó un ensayo de contaminación visual (cambio de color con rojo fenol) en los contenidos de las fábricas celulares Nunc. Puesto que no se observó contaminación, se vertió el sobrenadante de las fábricas confluentes en un pequeño recipiente colector, se tomaron muestras y se desechó. Las células adherentes se lavaron después una vez con 400 ml de PBS. Para despegar las células de las fábricas, se añadieron 100 ml de tripsina a cada una y se retiró, y las células se incubaron después durante 5 a 10 minutos en la tripsina residual. Las células se recogieron después de dos lavados con 200 ml de medio ESTEP 1. Se añadió a cada una de las diez botellas que contenían medio ESTEP 1 (1,5 l cada una, a 37ºC), 40 ml de células recogidas. Se utilizó después una botella de 1,5 l para rellenar una fábrica Nunc. Cada fábrica celular se dispuso en un incubador a 37ºC/CO_{2} al 5,0%.

A 80-90% de confluencia, se efectuó un ensayo de contaminación visual (cambio de color con rojo fenol) en las fábricas celulares Nunc. Puesto que no se observó contaminación, se vertió el sobrenadante de las fábricas confluentes en un pequeño recipiente colector, se tomaron muestras y se desechó. Las células se lavaron después una vez con 400 ml de PBS. Se añadieron 1,5 l de medio ESTEP 2 (668,7 g/50 l DMEM (Gibco); 5,5 g/50 l de ácido pirúvico, sal de sodio, al 96% (Mallinckrodt); 185,0 g/50 l de NaHCO_{3} (Mallinckrodt), 5,0 mg/ml; 25 ml/50 l de insulina, 10,0 mg/ml; y 25 ml/50 l de transferrina) a cada fábrica celular Nunc. Las fábricas celulares se incubaron a 37ºC/CO_{2} al 5,0%.

Aproximadamente a las 48 horas, se efectuó un ensayo de contaminación visual (cambio de color con rojo fenol) en las fábricas celulares Nunc. Se vertió el sobrenadante de cada fábrica en pequeños recipientes colectores. Se vertió medio exento de suero fresco (1,5 l) en cada fábrica celular Nunc, y las fábricas se incubaron a 37ºC/CO_{2} al 5,0%. Se transfirió 1 ml de recogida de sobrenadante por cada constructo a un portaobjetos de microscopio, y se sometió a análisis microscópico en busca de contaminación. Los contenidos de los pequeños recipientes colectores se agruparon para cada constructo y se filtraron inmediatamente. Se efectuó después una segunda recogida, sustancialmente como la descrita anteriormente a las 48 horas, y las fábricas celulares se desecharon después de ello. Se utilizó un aparato de tren de filtración ensamblado asépticamente para la filtración aséptica del sobrenadante de recogida (medio acondicionado). El ensamblado fue como sigue: se sujetó con alambre el conducto a un filtro Opti-Cap (Millipore Corp., Bedford, MA) y un filtro Gelman Supercap 50 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). El filtro Supercap 50 se unió también a un recipiente tapado estéril localizado en una campana; el conducto localizado aguas arriba del filtro Opti-cap de Millipore se insertó en una bomba peristáltica; y el extremo libre del conducto se dispuso en el recipiente colector grande. La bomba peristáltica se hizo funcionar a entre 200 y 300 rpm, hasta que todo el medio acondicionado pasó a través del filtro final de 0,22 \mum a un recipiente colector estéril. El filtrado se dispuso en una cámara enfriada a 4ºC pendiente de la purificación. El medio se concentró 10 x con un concentrador de corte 5 kDa de Millipore (Millipore Corp., Bedford, MA), según las instrucciones del fabricante, y se sometió a análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo marcador anti-FLAG (Kodak).

Zsig37CEE:

5 matraces T-162= 0,12 mg/l, 38 kDa;

1 fábrica, FBS= 0,12 mg/ml, 38 kDa;

10 fábricas, FBS= 0,12 mg/l, 38 kDa;

10 fábricas (nº 1), SF= 1,2 mg/l, 38 kDa; y

10 fábricas (nº 2), SF= 3,56 mg/l, 38 kDa.

Zsig37NEE:

5 matraces T-162= 0,137 mg/l, 35 kDa;

1 fábrica, FBS= 0,137 mg/l, 35 kDa;

10 fábricas, FBS: 0,137 mg/l, 35 kDa;

10 fábricas (nº 1), SF= 1,37 mg/l, 35 kDa; y

10 fábricas (nº 2), SF= 4,11 mg/l, 35 kDa.

Ejemplo 7 Purificación de zsig37NEE y zsig37CEE

A menos que se indique otra cosa, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. Se utilizó el siguiente procedimiento para purificar zsig37 que contenía marcadores Glu-Glu N-terminal o C-terminal (EE). Se esterilizaron por filtración secuencialmente un total de 25 litros de medio acondicionado de células de riñón de hámster recién nacido (BHK) a través de un filtro de cápsula Opticap de 10,16 cm, 0,2 mm de Millipore (Bedford, MA) y un Supercap 50 de 0,2 mm de Gelman (Ann Arbor, MI). El material se concentró después aproximadamente a 1,3 litros utilizando un concentrador de flujo tangencial Millipore ProFlux A30 equipado con una membrana S10Y3 de Amicon de 3000 Da de corte (Bedford, MA). El material concentrado se esterilizó por filtración de nuevo con el filtro Gelman como se describe anteriormente. Se añadió una mezcla de inhibidores de proteasa al medio acondicionado concentrado hasta concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético 2,5 mM (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), leupeptina 0,001 mM (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN), pepstatina 0,001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0,4 mM (Boehringer- Mannheim). Se añadió una muestra de 25,0 ml de Sepharose anti-EE, preparada como se describe a continuación, a la muestra para adsorción por lotes, y la mezcla se agitó suavemente en un aparato de cultivo en rodillos Wheaton (Millville, NJ) durante 18,0 horas a 4ºC.

La mezcla se vertió después en una Econo-Column de 5,0 x 20,0 cm (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA) y el gel se lavó con 30 volúmenes de columna de solución salina tamponada con fosfato (PBS). La fracción de flujo no retenida se desechó. Una vez la absorbancia del efluyente a 280 nm fue menor de 0,05, se redujo el flujo a través de la columna a cero y se lavó el gel Sepharose anti-EE por lotes con 2,0 volúmenes de columna de PBS que contenía péptido EE 0,4 mg/ml (AnaSpec, San José, CA). El péptido utilizado tiene la secuencia Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp, SEC ID Nº 31). Después de 1,0 h a 4ºC, se reanudó el flujo y se recogió la proteína eluída. Esta fracción se indicó como la elución de péptido. Se lavó después el gel Sepharose anti-EE con 2,0 volúmenes de columna de glicina 0,1 M, pH 2,5 y se recogió separadamente el lavado con glicina. El pH de la fracción eluída con glicina se ajustó a pH 7,0 mediante la adición de un pequeño volumen de 10 x PBS y se almacenó a 4ºC para futuros análisis si fuera necesario.

Se concentró la elución de péptido a 5,0 ml utilizando un concentrador de membrana de corte de 15.000 de peso molecular (Millipore, Bedford, MA), según las instrucciones del fabricante. La elución de péptido concentrado se separó del péptido libre mediante cromatografía en una columna Sephadex G-50 (Pharmacia, Piscataway, NJ) de 1,5 x 50 cm equilibrada con PBS a un caudal de 1,0 ml/min utilizando HPLC BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA). Se recogieron fracciones de 2 ml y se monitorizó la absorbancia a 280 nm. Se recogió el primer pico de material que absorbe a 280 nm y que eluye cerca del volumen vacío de la columna. Esta fracción era zsig37NEE o zsig37CEE puro. El material puro se concentró como se describe anteriormente, se analizó por SDS-PAGE, se sometió a transferencia Western con anticuerpos anti-EE y se tomaron muestras para análisis de aminoácidos y secuenciación N-terminal. El resto de la muestra se dividió en alícuotas y se almacenó a -80ºC según procedimientos estándar de los inventores.

La electroforesis de zsig37NEE en geles de SDS-PAGE en ausencia de agentes reductores mostró una banda mayoritaria teñida con azul de Coomasie de peso molecular aparente 39.000 y varios componentes minoritarios de pesos moleculares entre 60.000 y 116.000. Todas las bandas mostraron reactividad cruzada con anticuerpos anti-EE en transferencias Western. En presencia de un agente reductor, la única banda observada fue la proteína de 39.000 Da, y su intensidad de tinción con azul de Coomasie aumentó. Esta banda mostró también reactividad cruzada con el anticuerpo anti-EE en transferencias Western.

Para zsig37CEE, la electroforesis en geles SDS-PAGE en ausencia de agentes reductores mostró una banda mayoritaria teñida con azul de Coomasie de peso molecular aparente 30.000 y varios componentes minoritarios de pesos moleculares entre 60.000 y 116.000. En las transferencias Western, sólo las bandas de pesos moleculares aparentes 150.000, 116.000 y 60.000 mostraron reactividad cruzada con anticuerpos anti-EE. En presencia de agentes reductores, sólo se observó la banda teñida con azul de Coomasie a 39.000 Da, y este material mostró reactividad cruzada con el anticuerpo anti-EE en transferencias Western. En estas condiciones, se observó también una pequeña cantidad de material con reactividad cruzada a 150.000 Da.

Preparación de Sepharose anti-EE

Se lavó tres veces un volumen de lecho de 100 ml de Sepharose-proteína G (Pharmacia, Piscataway, NJ) con 100 ml de PBS que contenía 0,02% de azida de sodio utilizando una unidad de filtración de 500 ml Nalgene de 0,45 micrómetros. El gel se lavó con 6,0 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO) y se añadió un volumen igual de solución de anticuerpo EE que contenía 900 mg de anticuerpo. Después de una incubación durante una noche a 4ºC, se retiró el anticuerpo no unido mediante lavado de la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM como se describe anteriormente. La resina se resuspendió en 2 volúmenes de TEA, se transfirió a un recipiente adecuado, y se añadió dimetilpimilimidato-2 HCl (Pierce, Rockford, IL) disuelto en TEA a una concentración final de 36 mg/ml de gel. El gel se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos, y el líquido se retiró utilizando la unidad de filtrado como se describe anteriormente. Los sitios no específicos en el gel se bloquearon después incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM en TEA 200 mM. El gel se lavó con 5 volúmenes de PBS que contenía 0,02% de azida de sodio y se almacenó en esta solución a 4ºC.

Ejemplo 8 Ensayos de adhesión y proliferación

Se ensayó la capacidad de zsig37 de estimular la adhesión y difusión de células TF-1 de la siguiente manera. Se preparó una serie de diluciones a partir de zsig37 marcada C-terminal con Glu-Glu, de 10 a 0,0625 \mug/ml, en PBS o tampón de recubrimiento ELISA (NaCO_{3} 0,1 M), y se sembró cada una en una placa de 96 pocillos (Costar, Pleasanton, CA) a 100 \mul/pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 2 horas. Las placas se lavaron después 3 x con RPMI/10% de FBS (RPMI 1640, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 110 \mug/ml, PSN y suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10%) y se permitió bloquear durante 15 minutos.

Se resuspendieron células TF-1 (derivadas de células de leucemia mieloide aguda) en RPMI/10% de FBS y se sembraron a 10.000 células/pocillo en las placas de 96 pocillos recubiertas con zsig37CEE a un volumen final de 120 \mul/pocillo. La placa se incubó a 37ºC en CO_{2} al 5% durante 2 horas. Las placas se lavaron después 3 x con PBS y se añadieron 200 \mul/pocillo de medio de crecimiento (RPMI/10% de FBS, GM-CSF 5 ng/ml). Las células se inspeccionaron microscópicamente antes y después del lavado.

Se utilizó también un ensayo de incorporación de tinte para medir cuantitativamente el número de células adherentes basándose en un cambio colorimétrico y un aumento de la señal fluorescente. Se añadió Alamar Blue^{TM} (AccuMed, Chicago, IL) a las placas de 96 pocillos y las células se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5% durante una noche. Las placas se analizaron después utilizando un fluorímetro con longitud de onda de excitación de 544 nm y longitud de onda de emisión de 590 nm. Hubo más células adherentes en las placas recubiertas con zsig37CEE-PBS que en las placas recubiertas con zsig37CEE-NaCO_{3} 0,1 M. La adición de zsig37 soluble no bloqueó la adhesión de las células a la zsig37 unida.

Se realizó un segundo ensayo utilizando TF-1, DA-1 (una estirpe celular dependiente de IL-3 derivada del nódulo linfático de un ratón con linfoma de células B como producto en medio IL-3 (proporcionado por el Dr. Kenneth Kaushansky, Universidad de Washington, Seattle, WA)), pre-B (células de médula de ratón p53 -/-, dependientes de IL-7, B220+, bajas en Thyl, Sca-1+), y estirpes celulares A7BaF-3 como se describen anteriormente a 5.000 células/pocillo. Las células BHK se sembraron también a 500 células/pocillo. La zsig37 potenció el crecimiento de células A7-BaF-3 e inhibió ligeramente el crecimiento de células DA-1.

Ejemplo 9 Secuencia ortóloga de ratón

Se utilizaron los nuevos polinucleótidos que codifican el polipéptido zsig37 humano de la presente invención para analizar una base de datos EST de ratón en busca de secuencias homólogas de ratón. Se descubrió una sola secuencia EST y se predijo que era la secuencia de zsig37 humano. Para identificar el correspondiente ADNc, se utilizó un clon que se consideraba probable que contuviera la secuencia de codificación entera para secuenciación. Utilizando un kit S.N.A.P.^{TM} Miniprep de Invitrogen (Invitrogen Corp.), según las instrucciones del fabricante, se preparó un cultivo de 5 ml durante una noche en LB + ampicilina 50 \mug/ml. El molde se secuenció en un secuenciador de ADN ABIPRISM^{TM} modelo 377 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) utilizando el kit "PRISM^{TM} Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (Perkin-Elmer Corp.) según las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los oligonucleótidos ZC694 (SEC ID Nº 6), ZC6768 (SEC ID Nº 32), ZC18297 (SEC ID Nº 33), ZC18298 (SEC ID Nº 34), ZC18402 (SEC ID Nº 35), ZC18403 (SEC ID Nº 36), ZC18456 (SEC ID Nº 37), ZC18457 (SEC ID Nº 38), ZC18560 (SEC ID Nº 39), ZC18561 (SEC ID Nº 40), ZC18687 (SEC ID Nº 41) y ZC18688 (SEC ID Nº 42) para completar la secuencia del clon. Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación en un "Hybaid OmniGene Temperature Cycling System" (National Labnet Co., Woodbridge, NY). Se utilizó el software de análisis de secuencia SEQUENCHER^{TM} 3.1 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) para análisis de datos. La secuencia de 2559 pb resultante se describe en la SEC ID Nº 43, y la secuencia aminoacídica deducida en la SEC ID Nº 44. La alineación con la secuencia nucleotídica de zsig37 humano (SEC ID Nº 1) muestra un 77% de identidad a nivel de nucleótido. La secuencia aminoacídica supuesta (SEC ID Nº 33) tiene un 77% de identidad con la secuencia polipeptídica humana (SEC ID Nº 2).

Ejemplo 10 Ensayos basados en células

Se ensayaron polipéptidos zsig37 en un ensayo in vitro de alto rendimiento para identificar sustancias que activan selectivamente respuestas celulares en estirpes celulares de osteoblasto inmortalizadas. Se utiliza en el ensayo una estirpe celular madura de osteoblasto derivada de ratón p53 -/- (deficiente), CCC4, que se transfecta con un plásmido que contiene un elemento de respuesta sérica inducible (SRE) que conduce a la expresión de la luciferasa. Estas células expresan también receptores de PTH, PDGF y bFGF endógenos. La estimulación de los SRE, y por tanto la expresión de la luciferasa en células CCC4, indica que es probable que la entidad química estimule la mitogénesis en osteoblastos.

Se tripsinizaron estirpes celulares CCC4 y se ajustaron a 5 x 10^{4} células/ml en medio de siembra (alfa-MEM, 1% de suero bovino fetal inactivado térmicamente, piruvato de Na 1 mM y L-glutamato 2 mM), se sembraron (200 \mul/pocillo) en placas de microvaloración blancas opacas Microlite de Dynatech (Dynatec, Chantilly, VA) y se incubaron durante una noche a 37ºC con CO_{2} al 5%. El medio de crecimiento se aspiró después y se reemplazó por medio de ensayo 50 \mul/pocillo (F-12 HAM, 0,5% de seroalbúmina bovina, HEPES 20 mM, piruvato de Na 1 mM y L-glutamato 2 mM). Se realizaron diluciones en serie de zsig37 en medio de ensayo (0,29-1000 ng/ml de concentración final de ensayo) y se añadieron a los pocillos. Las muestras de zsig37 se ensayaron por triplicado. Se utilizaron también controles de suero (negativos) y bFGF (positivos). La concentración final de bFGF era de 3 ng/ml. Los controles se ensayaron por cuadruplicado. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37ºC con CO_{2} al 5%. El medio de ensayo se aspiró después y se aclararon las placas una vez con PBS. Se añadieron después a cada pocillo 25 \mul de tampón de lisis (reactivo de ensayo de luciferasa, E1501, Promega Corp., Madison, WI). Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 50 \mul/pocillo de sustrato de luciferasa (reactivo de ensayo de luciferasa, E1501, Promega Corp.) y se detectó la actividad luciferasa utilizando un LUMINOSKAN® de Labsystems a 2 segundos/pocillo, después de un retardo de 1 segundo. La señal basal media (no inducida) se restó de todas las lecturas, que se expresan en la Tabla 5 como porcentaje de la inducción máxima producida por bFGF 3 ng/ml.

La zsig37 estimula la expresión de luciferasa en este ensayo, indicando que estimula los osteoblastos. La zsig37 estimula un máximo de 73-75% a 1000 ng/ml.

Se efectuó un ensayo mimético de factor de crecimiento contrapartida para determinar si zsig37 actúa como mimético de factor de crecimiento, particularmente de los ligandos de receptor de tirosina quinasa PDGF, bFGF y EGF (negativos de insulina-R). Se utilizó en el ensayo una estirpe celular clonal derivada de ratones Swiss 3T3, Swiss 3T3, que se transfecta con un plásmido que contiene un elemento de respuesta sérica inducible (SRE) que conduce a la expresión de luciferasa. Estas células expresan también los receptores endógenos de PMA, EGF y bFGF. La estimulación del SRE, y por tanto la expresión de la luciferasa en las células Swiss 3T3, indica que la entidad química imita probablemente la actividad del factor de crecimiento PDGF, bFGF y EGF.

Las células Swiss 3T3 se tripsinizaron y se ajustaron a 5 x 10^{4} células/ml en medio de siembra, se sembraron y se incubaron como se describe anteriormente. El medio de crecimiento se aspiró después y se reemplazó por medio de ensayo 50 \mul/pocillo (F-12 HAM, 0,5% de seroalbúmina bovina, HEPES 20 mM). Se realizaron diluciones en serie de zsig37 en medio de ensayo (0,29-1000 ng/ml de concentración final de ensayo) y se añadieron a los pocillos. Se ensayaron muestras de zsig37 por triplicado. Se utilizó también un control de suero (negativo) y bFGF (positivo) para promover la proliferación celular. La concentración final de bFGF fue de 3 ng/ml. Los controles se ensayaron por cuadruplicado. Las placas se incubaron durante 5 horas a 37ºC, con CO_{2} al 5%. El medio de ensayo se aspiró después y se aclararon las placas una vez con PBS. Se añadieron a cada pocillo 25 \mul de tampón de lisis (reactivo de ensayo de luciferasa, E1501, Promega Corp., Madison, WI). Las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 40 \mul/pocillo de sustrato de luciferasa (reactivo de ensayo de luciferasa, E1501, Promega Corp.) y se detectó la actividad luciferasa utilizando un LUMINOSKAN® de Labsystems a 2 segundos/pocillo después de un retardo de 1 segundo. La señal basal media (no inducida) se restó de todas las lecturas, que se expresan en forma de porcentaje de la inducción máxima producida por bFGF 3 ng/ml. Un tratamiento de cinco horas de esta estirpe celular con bFGF, DDGF, EGF o PMA conduce a una inducción de 25-50 veces de la expresión de SRE-luciferasa.

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La zsig37 no parece estimular la expresión de la luciferasa en este ensayo. La zsig37 estimula un máximo de 0,2 a 0,1% a 1000 ng/ml.

Ejemplo 10 Administración in vivo de zsig37 mediante suministro adenoviral

Se pesaron 24 ratones C57B16/J macho y 24 hembras de aproximadamente 12 semanas (Jackson Labs, Bar Harbor, ME), se midió la temperatura corporal y se monitorizó diariamente la ingesta de alimento durante cuatro días antes de la inyección (días -4 a -1). El día 0, los ratones se dividieron en tres grupos, y recibieron 0,1 ml de virus (1,8 x 10^{11} partículas de virus AdV vacías/0,1 ml o 5 x 10^{11} partículas de virus AdV-zsig37CEE/0,1 ml) mediante inyección intravenosa en la vena de la cola, o sin inyección en absoluto. La inyección debe dar como resultado la infección del hígado del hospedador, y la expresión del gen suministrado viralmente debería comenzar a las 24 horas y continuar durante 1 a 4 semanas. Se ensayaron tres grupos de ratones. El grupo 1, no tratado, n= 8 para machos y hembras. El grupo 2, AdV-vacíos (virus vacíos), n= 8 para machos y hembras. El grupo 3, AdV-zsig37CEE, n= 8 para machos y hembras.

Se monitorizaron las temperaturas corporales y pesos de los animales y el peso del alimento ingerido durante las tres semanas del estudio. No se encontraron diferencias entre los grupos.

El día 21, los ratones hembra se sacrificaron por dislocación cervical, y el día 22 los machos. Los animales se desangraron y se recogieron tejidos para necropsia.

Se realizó un panel de química sérica estándar en el momento del sacrificio. Hígado, riñón, y parámetros metabólicos estaban todos en los intervalos normales. Había, sin embargo, una diferencia entre el grupo de tratamiento con zsig37 y el grupo tratado con virus vacíos. Los animales con zsig37 tenían un índice lipémico medio mayor que los controles de virus vacíos. La diferencia no era significativa, sin embargo justificó investigaciones adicionales. Se ensayaron los ácidos grasos libres totales en el suero restante de cada animal. Se observó una diferencia significativamente estadística en los niveles de ácidos grasos libres en suero entre los ratones macho (p= 0,0379) que recibieron virus vacíos, y los que recibieron virus que codificaban zsig37; los ratones con zsig37 tenían niveles más altos. Se observó también una diferencia, aunque no estadísticamente significativa, en las hembras (p= 0,3357). Se pesaron hígado, bazo, riñón, timo, corazón y cerebro después de extirparlos. No se encontraron diferencias entre los grupos de tratamiento. El análisis histopatológico de estos tejidos y médula ósea no reveló diferencias entre los grupos de tratamiento.

Para confirmar los resultados anteriores, se realizó un segundo examen como anteriormente con las siguientes modificaciones. Se ensayaron tres grupos: a) no tratados y en ayunas, b) con AdV vacío y en ayunas, c) con Adv-zsig37CEE y en ayunas, que contenían 20 ratones C57B16/J, 10 machos y 10 hembras. Los ratones se hicieron ayunar durante una noche, y se recogieron 100 \mul de suero para establecer un nivel basal para los siguientes parámetros: glucosa de ayuno. TP, fosfatasa alcalina, colesterol, triglicéridos, ácidos grasos libres e insulina. Se tomaron los pesos corporales tres veces por semana. El día 0, se inyectaron a los ratones en la vena lateral de la cola 0,1 ml de la solución de virus apropiada. Se recogió sangre el día 17 después de un ayuno de una noche. Después de 3 semanas, los ratones se sacrificaron y se recogió toda la sangre. Se mezcló una porción de la sangre con EDTA para observar los CBC, y el resto se volvió a ensayar y se examinó como se describe anteriormente. Los órganos se recogieron y se guardó el canal para histopatología.

Ejemplo 11 Vasodilatación de anillos aórticos

Se midió el efecto de zsig37 sobre la vasodilatación de anillos aórticos según los procedimientos de Dainty et al., J. Pharmacol. 100: 767, 1990 y Rhee et al., Neurotox. 16: 179, 1995. Brevemente, se tomaron anillos aórticos de 4 mm de longitud de ratas Sprague Dawley de 4 meses y se dispusieron en solución de Krebs modificada (NaCl 118,5 mM, KCl 4,6 mM, MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O 1,2 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, CaCl_{2}\cdot2 H_{2}O 2,5 mM, NaHCO_{3} 24,8 mM y glucosa 10 mM). Los anillos se unieron después a un transductor de fuerza isométrica (Radnoti Inc., Monrovia, CA) y los datos se registraron con una plataforma fisiológica Ponemah (Gould Instrument Systems, Inc., Valley View, OH) y se dispusieron en un baño de tejidos de 10 ml oxigenado (95% de O_{2}, 5% de CO_{2}) con solución de Krebs modificada. Los tejidos se ajustaron a 1 gramo de tensión en reposo y se permitieron estabilizar durante una hora antes de ensayar. Los anillos se ensayaron mediante adiciones de 5 \mul de norepinefrina 1 x 10^{-7} M (Sigma Co., St. Louis, MO) hasta una concentración final de aproximadamente 1 x 10^{-9} M y Carbachol, un agonista muscarínico de acetilcolina (Sigma Co.) a 2 x 10^{-7} M final, para ensayar la integridad de los anillos. Después de cada ensayo, los anillos se lavaron tres veces con tampón fresco, se dejaron 5 minutos entre lavados y se permitieron reposar durante 1 hora. Para ensayar la vasodilatación, los anillos se contrajeron a dos gramos y se permitieron estabilizar durante 15 minutos. Se añadió después zsig37 a 1, 2 ó 4 de los 4 baños, sin lavar, y se registró la tensión en los anillos y se comparó con los anillos de control. Se ensayó después la contracción de los anillos con norepinefrina como se describe anteriormente. Los anillos se ensayaron con zsig37 323, 162 y 81 ng/ml, pero no pudo determinarse una respuesta a la dosis. Para evaluar la significancia estadística de los datos, se realizó un ensayo de contingencia en todos los anillos zsig37 y de control, utilizando la dilatación como determinante. 10 de los 12 anillos ensayados con zsig37 experimentaron vasodilatación, así como 2 de los 7 controles. El valor de P exacto de Fisher es 0,045. Se concluyó que zsig37 induce la vasodilatación en anillos aórticos contraídos con norepinefrina.

Ejemplo 12 Unión de zsig37 a proteínas de matriz

Se utilizó un ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzima) para medir la unión de zsig37 a diversas proteínas de matriz y Clq de complemento. Las proteínas de matriz utilizadas fueron colágeno bovino de tipo I (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ), laminina, vitronectina, fibronectina, colágenos humanos de tipo II, III, IV, V, VI (Chemicon International, Temecula, CA). Se utilizó BSA V (Sigma Co.) como control negativo. Justo antes del uso, las proteínas se diluyeron en 2 x PSB (solución salina tamponada con fosfato, Sigma Co.) hasta 100 \mug/ml y se ajustaron a pH 7,2 con NaOH 0,1 N. Cada muestra de proteína se sembró por cuadruplicado (100 \mul/pocillo) en una placa de 96 pocillos. La placa se permitió secar durante una noche en una campana de flujo laminar, se lavó 3 veces con 400 \mul de BSA 5 mg/ml en 1 X PBS y se transfirió en seco. Se marcó zsig37 con FITC según las instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford, IL). Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de zsig-FITC 1,8 \mug/ml en 5% de BSA, PBS. Las placas se incubaron durante 1,5 horas a temperatura ambiente y después se lavaron 3 veces con 5% de BSA, PBS. Se añadieron después a cada pocillo 100 \mul de anti-FITC de ratón/biotina 1:400 (Sigma Co.). La placa se incubó durante 1,5 horas a temperatura ambiente y se lavó 3 veces con 5% de BSA, PBS. La placa se incubó después con 100 \mul de estreptavidina/HRP 1:1000 (Amersham, Piscataway, NJ) durante 1 hora y se lavó 3 veces con 5% de BSA, PBS. La placa se reveló después utilizando Supersignal® Ultra (Pierce, Rockford, IL) según las instrucciones del fabricante. Después de reaccionar durante 1 minuto, se eliminó el líquido en exceso de la placa invirtiendo la placa y secando con golpecitos. La placa se expuso a una película de rayos X (Kodak, Rochester, Nueva York).

Los resultados de este examen indican que sólo la fibronectina y los colágenos I, II, III, V y VI se unen significativamente a zsig37-FITC. Dicha unión no se observó con laminina, vitronectina, colágeno IV o el control de BSA.

Ejemplo 13 Especificidad de la unión de zsig37 a colágeno de tipo VI

Se modificó el ensayo ELISA de unión como se describe en el ejemplo 12 para evaluar cuantitativamente la unión. Se unió zsig37-FITC en un intervalo de 0,4 a 4 \mug/ml a 10 \mug de colágeno de tipo VI (Chemicon International) como se describe anteriormente. Se leyó la luminiscencia del reactivo Supersignal® en un lector de placas Wallac 1420 (Wallac, Gaithersburg, MD), y se utilizó la intensidad como medida cuantitativa de la zsig37-FITC unida a la placa ELISA.

La unión de zsig37 a colágeno de tipo VI se ajusta a una curva de unión hiperbólica típica (Figura 3a). La zsig37-FITC unida sembrada a 0,4 \mug/ml puede separarse por competición del colágeno mediante la adición de zsig37 no marcado en el intervalo de 0,8 a 8 \mug/ml (Figura 3b). Estos datos indicarían que la unión es específica de los dominios en el colágeno del tipo VI y que es dependiente de la concentración.

Ejemplo 14 Unión de zsig37 a Clq de complemento

Se mostró que zsig37-FITC a 0,2 \mug/ml se unía a Clq de complemento (Sigma Co.) de 0,1 a 10 \mug/ml mediante el método descrito anteriormente en el ejemplo 13 (Figura 4). La cantidad de unión depende de la concentración y es saturable.

Ejemplo 15 Inhibición del complemento por zsig37

Se efectuaron ensayos de complemento en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Se utilizó tampón Veronal de gelatina que contenía magnesio y calcio (NaCl 141 mM, barbitol de sodio 1,8 mM, ácido barbitúrico 3,1 mM, gelatina bovina al 0,1%, MgCl_{2} 0,5 mM y CaCl_{2} 0,15 mM) para todas las diluciones de suero e inhibidor, así como suspensiones de eritrocitos. Se añadieron 50 \mul de suero de complemento humano estandarizado (Sigma Co.) diluido 1/37,5 (para una dilución final de 1/150) a cada pocillo. El inhibidor se añadió por triplicado, 50 \mul/pocillo. Se incubaron el suero y el inhibidor durante 30 minutos a temperatura ambiente. El ensayo se inició mediante la adición de 100 \mul de 2 x 10^{8}/ml eritrocitos de oveja no sensibilizados (Colorado Serum Co., Denver, CO), eritrocitos de oveja sensibilizados, sensibilizados utilizando el protocolo del fabricante de hemolisina (BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) y eritrocitos de conejo que contienen EGTA 16 mM y Mg^{++} 4 mM. Se sembró también una serie de diluciones de suero humano de 1/50 a 1/400 como control de actividad. Se utilizaron eritrocitos, lisados con agua destilada y diluidos a 100, 75, 50, 25 y 12,5% de lisis, para cuantificar el porcentaje de lisis del complemento. La placa se selló y se incubó a 37ºC durante 1 hora con mezclado cada 15 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de EDTA 220 mM, 20 \mul/pocillo, y las placas se centrifugaron a 1500 x G durante 10 minutos. Se extrajeron 100 \mul de sobrenadante de cada pocillo y se transfirieron a una placa de fondo redondo plano de 96 pocillos para análisis. La placa se leyó a 415 nm y se calculó el porcentaje de lisis.

La zsig37 fue eficaz para inhibir la ruta clásica tanto con eritrocitos de oveja sensibilizados como no sensibilizados (Figura 5). No hubo inhibición aparente de la ruta alternativa ensayada con eritrocitos de conejo y EGTA. El mecanismo de inhibición es indeterminado, pero debido a que Clq se une a zsig37, la diana más probable es Cl.

Ejemplo 16 Inhibición por zsig37 de la activación por colágeno de plaquetas

Se extrajo sangre de voluntarios sanos en tubos que contenían citrato de sodio, mantenidos a temperatura ambiente, y se utilizó a las cuatro horas de la extracción. Se analizó la sangre completa en busca de activación de plaquetas utilizando un "Whole Blood Lumi-Aggregometer Chrono-Log 560ª" (Chrono-Log Corp., Haverton, PA), según las instrucciones del fabricante. Para cada punto de ensayo, se añadieron 500 \mul de sangre a un tubo de reacción que contenía una barra de agitación y 500 \mul de solución salina isotónica que contenía zsig37 a concentraciones de 0 a 20 \mug/ml. La mezcla se incubó durante 4 minutos, seguido de activación de plaquetas iniciada por la adición de 5 \mul de colágeno entrecruzado 1 mg/ml (Chrono-Log Corp.) a la mezcla de sangre/zsig37. La inhibición de la activación por ADP (concentración final 10 \muM) y trombina (concentración final 1U/ml) se ensayó de modo similar.

La inhibición de la activación de plaquetas mediada por colágeno mediante zsig37 muestra una relación dependiente de la dosis a entre 5 y 20 \mug/ml (Figura 6a). La inhibición es selectiva de la activación de colágeno y no tiene efecto sobre la activación estimulada por ADP o trombina (Figura 6B). La activación del colágeno no se inhibió por otra proteína relacionada con Clq de complemento zsig39 (solicitud de patente de EE.UU. en tramitación junto con la presente 09/140.804).

Ejemplo 17 Estimulación del crecimiento de fibroblastos SK5 por zsig37

Se sembró fibronectina humana (25 \mug/ml, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) en placas de 96 pocillos (Costar, Pleasanton, CA) a 100 \mul/pocillo, y se permitió secar en una campana laminar durante una noche. Se sembraron fibroblastos SK5 humanos en DMEM (Gibco) que contenía 10% de suero bovino fetal bajo en endotoxinas (Hyclone, Logan UT) a 5000 células/pocillo en placas recubiertas con fibronectina, y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 2 a 3 días. El número de células por placa se ajustó para conseguir la no confluencia. Las células se lavaron después dos veces con DMEM Hi glucose exento de suero (Gibco) y se privaron de suero haciéndolas crecer en DMEM Hi glucose exento de suero durante 24 horas. Se añadió zsig37 a los pocillos por triplicado, a concentraciones de 312,2 ng/ml a 10.000 ng/ml en 100 \mul de DMEM. Las células se incubaron después durante 48 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%. La proliferación celular se ensayó añadiendo 15 \mul de solución de tinción MTT (kit CellTiter96^{TM}, Promega) a cada pocillo. La placa se incubó durante 4 horas a 37ºC, CO_{2} al 5%, y la reacción se detuvo con una solución de solubilización/paro (kit CellTiter96^{TM}, Promega) según las instrucciones del fabricante. La placa se incubó durante 1 hora para solubilizar los cristales de formazán y se midió la absorbancia a 570 nm con referencia a 650 nm utilizando un lector de placas ELISA.

Los resultados (Figura 7) muestran un aumento dependiente de la dosis del número de fibroblastos SK5 en el intervalo de concentraciones ensayado. Estas concentraciones estaban dentro del intervalo de valores observado para los efectos mitogénicos de la cadena b de fibrinógeno (Gray, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12, 684, 1995 y Gray, et al., J. Biol. Chem. 270, 26602, 1995) y para la adhesión celular de fibroblastos a Clq sembrado (Bordin y Ghebrehiwet, J. Immun. 145: 2520, 1990), creyéndose que ambos interaccionan con la calrreticulina de la superficie celular.

Ejemplo 18 Producción de antisueros zsig37

Se prepararon antisueros policlonales de conejo inmunizando dos conejos hembra blancos de Nueva Zelanda con zsig37-CEE purificado a partir de células BHK. La proteína se conjugó a la proteína vehículo hemocianina de lapa bocallave (KLH) con glutaraldehído. Se administró a cada conejo una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 200 \mug de péptido en coadyuvante completo de Freund seguido de inyección ip de recuerdo de 100 \mug de péptido en coadyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. De siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de recuerdo, se extrajo sangre a los animales y se recogió el suero. Los animales se sometieron después a recuerdo y toma de sangre cada tres semanas.

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Ejemplo 19 Detección de la unión de proteína zsig37 marcada con FITC a tejidos

Se detectó la unión de proteína zsig37 marcada con FITC a tejidos de la siguiente manera:

Se obtuvieron tejidos humanos o embriones de ratón embebidos en parafina y seccionados sobre portaobjetos de fuentes comerciales (concretamente DAKO Corporation, Carpintería, CA; Biogenex, San Ramón, CA; Novagen, Madison, WI; y Biomeda, Foster City, CA) o de elaboración propia. Las secciones de tejido humano incluían glándula suprarrenal, cerebro, corazón, intestino delgado, intestino grueso, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata, bazo, estómago, testículos, tiroides y útero. Las secciones de embrión de ratón fueron de la etapa de 16 días.

Las secciones de tejido se desparafinaron utilizando condiciones estándar de 3 x 5 minutos en xileno, 4 minutos en etanol al 100% (EtOH), 3 minutos en EtOH al 100%, y 2 minutos en EtOH al 95%. Las secciones de tejido se sometieron después a un proceso de recuperación de anticuerpos de 20 minutos a 94ºC según las instrucciones del fabricante (DAKO Corporation), seguido de una digestión de 20 minutos con 0,01% de pepsina/HCl 0,2 N. Las secciones de tejido se aclararon dos veces con H_{2}O d y una vez con tampón PBS/0,05% de Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO), y después se bloquearon durante 45 minutos con 1 x PBS/5% de BSA/5% de leche en polvo desgrasada (Carnation, Los Ángeles, CA). Esto fue seguido por una etapa de bloqueo con avidina/biotina realizada según las instrucciones de los fabricantes (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Las secciones de tejido se lavaron 3 veces con 1 x tampón PBS/0,05% de Tween 20 y después se incubaron con la concentración apropiada de proteína zsig37 marcada con FITC en PBS/5% de BSA durante 45-60 minutos. Después de lavar las secciones de tejido 3 veces en 1 x PBS/0,05% de Tween 20, se incubaron con una dilución 1:400 de conjugado de Mab anti-FITC (mo) y biotina durante 30-60 minutos, se lavaron 3 veces en PBS/0,05% de Tween 20 y después se incubaron durante 30-60 minutos con una dilución 1:500 de estreptavidina-FITC (NEN Life Science Products, Boston, MA) seguido de 2 lavados con 1 x tampón PBS/0,05% de Tween 20 y 1 lavado con 1 x PBS sin Tween 20. Las secciones de tejido se colocaron después en un medio antiapagamiento que contenía yoduro de propidio 0,5 \mug/ml como colorante de contraste.

Se observó una unión significativa a paredes de vasos y a tejidos de tipo conectivo fibroso fino tales como la matriz colagenosa en la mayoría de las secciones de tejidos humanos y de embrión estudiadas.

Ejemplo 20 Zsig37 en el modelo de lesión en la arteria carótida de conejo

Se administró zsig37 en un modelo modificado de lesión de arteria carótida de conejo (Folts et al., Circulation 79: 116-124, 1989 y Golino et al., Thrombosis and Haemostasis 67: 302-305, 1992) para determinar el grado de protección ofrecido en la prevención de oclusión vascular después de una lesión por aplastamiento.

34 conejos blancos de Nueva Zelanda macho de aproximadamente 3-6 meses (R&R Rabbitry, Stanwood, WA) se dividieron en dos grupos. 15 conejos recibieron dosis de zsig37 en el intervalo de 2-13,5 \mug/kg y 19 conejos de control se inyectaron con PBS o cantidades equivalentes de PBS o zsig39, otra proteína relacionada con el complemento de adipocitos (documento WO99/10492). Los conejos se anestesiaron con ketamina (50 mg/kg, IM) y se mantuvieron con anestesia de inhalación de halotano durante el estudio. Se afeitó el pelo de orejas y cuello y se dispuso un angiocatéter en la vena marginal de la oreja para soporte IV. Se realizó una incisión de línea media en el cuello y se accedió a la arteria carótida. Se expusieron aproximadamente 5 cm de la arteria carótida común próximales a la bifurcación interna/externa mediante disección roma del tejido circundante, y se cauterizó cualquier rama secundaria visible. Se dispuso una sonda de flujo (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY) distal al sitio de lesión previsto, y se estableció un flujo sanguíneo de línea base. Se aisló después de la circulación una sección de 2,5-3,0 cm del vaso utilizando grapas vasculares atraumáticas. Después de la eliminación de la sangre del segmento de vaso, se inyectaron 0,4 ml de zsig37 en cloruro de sodio al 0,9% o 0,04 ml de cloruro de sodio al 0,9% como control en el segmento de vaso vacío utilizando una aguja 30G. El vaso se dejó reposar durante un tratamiento prelesión de 5 minutos. Se inflingió después una lesión por aplastamiento de 1,0 cm en el centro del segmento del vaso utilizando un hemostato protegido y se dejó reposar durante 10 minutos. Se retiraron después las grapas del vaso y se restableció el flujo sanguíneo. Se monitorizó continuamente el flujo sanguíneo durante 60 minutos, después de cuyo momento se sacrificaron los conejos y se extrajo el vaso para análisis histológico.

No se observó dependencia de la dosis a estas concentraciones. Un metaanálisis de todas las dosis de zsig37 dio como resultado un aumento significativo en la patencia temporal en comparación con controles en un ensayo de t no apareada (P= 0,019).

El tiempo de patencia media porcentual para los grupos combinados de animales de control negativos, determinado a partir del seguimiento del flujo sanguíneo, fue de un 13,5% con un error estándar de \pm 1,7%. El tiempo de patencia media porcentual para los grupos combinados de animales tratados con zsig37, determinado a partir del seguimiento del flujo sanguíneo, fue de un 37,2% con un error estándar de \pm 10,3%.

En una segunda serie de experimentos, se utilizó zsig37 marcada50 \mul/pocillo con fluorosceína en el modelo de arteria carótida lesionada. Se anestesiaron ratones blancos de Nueva Zelanda macho como anteriormente. Mediante una incisión en el cuello, se expuso la arteria carótida y se aislaron aproximadamente 5 cm del vaso del tejido consecutivo circundante. Se evacuó la sangre del segmento aislado y se aplicaron grapas vasculares atraumáticas. Se inyectaron aproximadamente 0,05 ml de zsig37 marcada con fluoresceína (concentración 100 \mug/ml) en el segmento aislado hasta rellenar completamente el vaso utilizando una aguja 30G. Después de un periodo de exposición de 5 minutos, el vaso se lesionó y se continuó la exposición durante otros 110 minutos antes de retirar las grapas y restablecer el flujo sanguíneo. Los animales se sacrificaron como se describe anteriormente a 1, 10 y 60 minutos después del reestablecimiento del flujo sanguíneo, y los vasos se recogieron y se fijaron con formalina para evaluación histológica.

La zsig37 marcada se unió preferiblemente a receptores en el centro de los vasos lesionados. La zsig37 marcada no se unió a áreas del vaso que no estuvieran lesionadas. El periodo de flujo sanguíneo antes de la recogida del vaso no parece afectar a la cantidad de zsig37 que permanece unida al tejido, concretamente, no hubo diferencias en la cantidad de zsig37 marcada unido a los tejidos en el punto temporal de recogida 1 minuto frente a 60 minutos. Esto puede indicar que la zsig37 se une estrechamente al vaso lesionado y no se separa por lavado por el flujo sanguíneo restablecido.

Se evaluó también el efecto de zsig37 sobre la dinámica del flujo sanguíneo después de lesión vascular en un modelo de lesión por aplastamiento/estenosis de arteria ilíaca de conejo. Se anestesiaron conejos blancos de Nueva Zelanda macho adultos jóvenes como se describe anteriormente. Mediante una incisión abdominal, se expuso la bifurcación aortoilíaca, se liberó cada ilíaca de los tejidos circundantes y se ligaron las ramas principales. Cada ilíaca se instrumentó con una sonda de flujo por ultrasonidos para monitorizar el flujo sanguíneo a través del vaso. Basándose en los datos del flujo sanguíneo, se seleccionó una ilíaca para utilizar para la lesión y la otra se cateterizó para suministro de la muestra de ensayo. Los conejos se dividieron en grupos de dosis de 6 animales/grupo. Las dosis de muestra de ensayo que contenían zsig37 se aumentaron en incrementos semilogarítmicos de 3-1000 \mug/kg durante el periodo de infusión seleccionado. Se inició la infusión de las muestras de ensayo después de la creación de una estenosis crítica que redujo el flujo sanguíneo a través del vaso aproximadamente a un 50%. Después de la creación de la estenosis y de un periodo de estabilización del flujo sanguíneo, el vaso se lesionó mediante aplastamiento del vaso entre las mandíbulas de un portaagujas blando. La infusión se continuó después de la lesión durante un periodo fijado de tiempo, 10-20 minutos. Se monitorizó el flujo sanguíneo a través del vaso lesionado durante 60 minutos después de la lesión. Los animales se sacrificaron a la conclusión del periodo de estudio. La sección menor de la aorta abdominal y cada ilíaca se recogieron y se fijaron con formalina para evaluación histológica.

Los parámetros de flujo determinados a partir del seguimiento del flujo incluían el flujo medio post-estenosis, el flujo medio post-lesión y el tiempo que el vaso permanecía patente. Este dato sugiere que existe una tendencia de la zsig37 a promover un tiempo de patencia aumentado con dosis aumentadas de hasta 300 \mug/kg durante un periodo de 60 minutos.

Ejemplo 21 Relajación de contracciones de anillo aórtico inducidas por serotonina

Se anestesiaron ligeramente ratas Sprague-Dawley macho de aproximadamente 3 meses con CO_{2}, y después se decapitaron. Se extirpó entonces rápidamente la aorta torácica y se dispuso en tampón de Kreb-Henseleit modificado (NaCl 118,2 mM; KCl 4,6 mM; CaCl_{2} 2,5 mM; MgSO_{4} 1,2 mM; NaHCO_{3} 24,8 mM; KH_{2}PO_{4} 1,2 mM; y glucosa 10,0 mM). Se cortaron de cada rata 4 secciones de anillo aórtico de 2-3 mm después de desechar el extremo desigual de la aorta. En algunos experimentos, se denudó el endotelio, antes de cortar las secciones de anillo, frotando el lumen de la aorta a lo largo de una aguja de calibre 21. La denudación del endotelio se verificó mediante la adición del análogo de acetilcolina carbacol, antes de determinar las respuestas dependientes de la concentración de zsig37. En ausencia del endotelio, el carbacol no relaja las secciones de anillo vascular contraídas.

Los anillos se fijaron y se conectaron a tranductores de desplazamiento de fuerza en baños de órganos de vidrio revestidos oxigenados (95% de O_{2}, 5% de CO_{2}) mantenidos a 30ºC en tampón de Kreb-Henseleit modificado, pH 7,4. La tensión en reposo se fijó a 1 gm, y se reajustó continuamente a 1 gm durante un periodo de incubación de 1 hora. Se añadió tampón de Kreb-Henseleit modificado oxigenado fresco a los baños cada 15 minutos durante el periodo de incubación en reposo. Al final de la incubación de 1 hora, las secciones de anillo se contrajeron mediante la adición de serotonina 10 \muM. Después de alcanzar la contracción máxima, aproximadamente 15-20 minutos después de las adiciones de serotonina, se construyeron las curvas de respuesta a la concentración acumulativa para zsig37. Se añadió zsig37 a baños de 5 ml en volúmenes de 5 hasta 150 \mul, para concentraciones finales en el intervalo de 1 ng/ml hasta 40 \mug/ml. Se verificó la viabilidad de las secciones de anillo al final de la respuesta de concentración mediante la adición de forscolina (2,5 \muM o 25 \muM) o nitroglicerina (22 \muM).

La adición de zsig37 indujo una vasorrelajación dependiente de la concentración de secciones aórticas de rata contraídas con serotonina con y sin endotelio intacto. La relajación en respuesta de la zsig37 se observó en primer lugar a concentraciones superiores a 100 ng/ml. La relajación se observó aproximadamente 30-60 segundos después de las adiciones de cada concentración de zsig37 al baño, y las respuestas de relajación tuvieron una meseta a los 3-5 minutos después de la adición de zsig37. El carácter de la respuesta de relajación ante zsig37 indica que la vasorrelajación es un evento mediado por receptor-segundo mensajero. Adicionalmente, la capacidad de zsig37 de vasorrelajar secciones aórticas denudadas de endotelio indica que zsig37 actúa directamente sobre las células de músculo liso para desencadenar la respuesta vasorrelajante.

Ejemplo 22 Identificación de células que expresan el receptor de zsig37 utilizando hibridación in situ

Se aislaron y examinaron tejidos humanos específicos en busca de la expresión de zsig37 mediante hibridación in situ. Los diversos tejidos humanos preparados, seccionados y sometidos a hibridación in situ, incluían aorta, oído, nódulo linfático, placenta, próstata, glándula salivar, piel y testículo. Los tejidos se fijaron en formalina tamponada al 10% (Surgipath, Richmond, IL), se embebieron en Parapalst X-tra (Oxford Scientific, St. Louis, MO), y se seccionaron a 5 \mum con un microtomo Reichart-Jung 2050 (Leica Instruments GmbH, Nussloch, Alemania). Los tejidos se seccionaron a 4 y 8 micrones. Se prepararon los tejidos utilizando un protocolo estándar ("Development of non-isotopic in situ hybridization", Laboratory of Experimental Pathology, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Park Triangle, NC). Brevemente, se desparafinaron secciones de tejido con HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) y después se deshidrataron con etanol. A continuación, las secciones se digirieron con proteinasa K (50 \mug/ml) (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) a 37ºC durante 2 a 20 minutos. Esta etapa fue seguida por acetilación y rehidratación de los tejidos.

Se diseñaron tres sondas in situ generadas por PCR frente a la secuencia de zsig37 humano. Se diseñaron dos conjuntos de cebadores oligonucleotídicos para generar sondas para regiones separadas del ADNc de zsig37: (1) oligonucleótido ZC23.689 (SEC ID Nº 45) y ZC23.694 (SEC ID Nº 46) se utilizaron para generar una sonda de 414 pb para zsig37; (2) ZC23.703 (SEC ID Nº 47) y ZC23.697 (SEC ID Nº 48) se utilizaron para generar una sonda de 896 pb para zsig37; (3) ZC24.441 (SEC ID Nº 49) y ZC24.442 (SEC ID Nº 50) se utilizaron para generar una sonda de 290 pb para zsig37. El oligo sin sentido de cada conjunto contenía también la secuencia funcional para el promotor de ARN polimerasa T7 para permitir una transcripción fácil de las sondas de ARN sin sentido a partir de estos productos. Los productos de PCR se purificaron mediante columnas de espín Qiagen (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) seguido de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. Las sondas se marcaron subsiguientemente con digoxigenina (Boehringer) o biotina (Boehringer) utilizando un sistema de transcripción in vitro (Promega Corp., Madison, WI) según las instrucciones del fabricante.

La hibridación in situ se efectuó con una sonda de zsig37 marcada con digoxigenina o biotina como se describe anteriormente. La sonda se añadió a los portaobjetos a una concentración de 1 a 5 pmol/ml durante 12 a 16 horas a 50-60ºC. Los portaobjetos se lavaron subsiguientemente con 2 x SSC y 0,1 x SSC a 50-55ºC. Los portaobjetos se lavaron subsiguientemente con 2 x SSC y 0,1 x SSC a 50-55ºC. Las señales se amplificaron utilizando la amplificación de señal de la tiramida (kit indirecto in situ TSA, NEN, Boston, MA) y se visualizaron con un kit de sustrato Vector Red (Vector Laboratories, Burlingame, CA) según las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se tiñeron después por contraste con hematoxilina (Vector Laboratories).

Se observaron señales positivas en aorta, corazón, próstata, glándula salivar y testículos humanos. Las células teñidas positivamente parecieron ser células endoteliales de vasos de pequeño diámetro en la túnica adventicia que rodea la aorta, células mesoteliales que recubren el epicardio, células acinares de la glándula salivar y células mononucleares dispersas, trofoblastos de la placenta, células epiteliales de la próstata y epitelio estratificado de los túbulos seminíferos de los testículos.

Ejemplo 23 Análisis SEC-MALLS de zsig37

La zsig37 contiene un dominio de tipo colágeno N-terminal así como una región globular C-terminal que tiene homología con la familia del factor de necrosis tumoral, y como otras de dichas proteínas, se espera que zsig37 multimerice. La zsig37 purificada analizada utilizando un espectrómetro de masas de trampa de iones-ISE (Finnigan Matt, San José, CA), indicó la presencia de especies cercanas a trímeros y nonámeros, lo que era un resultado inesperado cuando se comparaba con otras proteínas homólogas. La cartografía peptídica de zsig37 utilizando CL-EM/EM en un espectrómetro de masas de trampa de iones-ISE (Finnigan Matt) reveló que diversos residuos de cisteína estaban modificados con un grupo S-cisteinilo. Puede ser que la modificación de los residuos de cisteína claves en la proteína zsig37 durante la fermentación con cisteína libre en el medio esté evitando una asociación oligomérica apropiada de esta molécula.

Para aprender más, se realizó una comparación de zsig37 reducida y no reducida utilizando una columna de exclusión por tamaño Biosep S-300 a 1,0 ml/minuto (7,8 x 3000 mm; Phenomenex, Torrance, CA) en HPLC HP 1050 (Hewlett Packard, Heidelberg, Alemania). El HP 1050 se acopló a detectores de dispersión de luz e índice de refracción miniDAWN y Optilab DSP, (Waytt Technology, Santa Bárbara, CA) para SEC-MALLS en línea.

Se añadió 1 \mug de zsig37 recombinante (1,0 mg/ml) a TCEP a una relación 10:1 mol/mol de TCEP a zsig37 y se mantuvo a temperatura ambiente durante 70 minutos. Se inyectaron 60 \mul de la zsig37 reducida para análisis SEC-MALLS, y el resto de la zsig37 reducida se dializó en módulos Slide-A-Layer de 0,5-3,0 ml, 10 K de MWCO (Pierce, Rockford, IL) con agitación frente a PBS, pH 7,4, con los tres cambios de tampón siguientes: 1 litro de PBS a temperatura ambiente durante 4 horas, 1 litro de PBS a 4ºC durante una noche y 1 litro de PBS a temperatura ambiente durante 4 horas.

Después de la diálisis, se permitió continuar la oxidación a 4ºC. La oxidación se monitorizó por análisis SEC-MALLS de alícuotas tomadas en tres puntos temporales, T= 0 horas, T= 24 horas y T= 96 horas. Los valores de peso molecular se determinaron utilizando el método de dos detectores LS-RI.

El análisis de la zsig37 recombinante dializada reducida parece indicar inicialmente la formación de hexámeros y 18-meros detectados por SEC-MALLS, que es más coherente con los estados oligoméricos observados en homólogos. Estas formas fueron también activas en ensayos in vitro.

Ejemplo 24 Unión de zsig37 a monocitos

Se aislaron monocitos CD14 positivos a partir del producto de aféresis de sangre periférica congelada utilizando un método de selección positiva con perlas Miltenyi (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las células purificadas eran más de un 80% CD14 positivas por tinción con FACS. Las células se resuspendieron a 1 x 10^{6} células/ml en RPMI + 10% de suero fetal bovino (FBS) y se sembraron en discos de cultivo de tejido de 100 mm, 5 ml/placa. Se añadió interferón \gamma humano recombinante a 100 ng/ml y las células se incubaron a CO_{2} al 5%, 37ºC durante 48 horas.

Las células se extrajeron de las placas mediante métodos no enzimáticos utilizando tanto EDTA como rascado, se concentraron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de tinción FACS y se tomaron alícuotas a 500.000 células/tubo para tinción. Se obtuvieron células no activadas efectuando otra selección CD14 con el mismo producto de aféresis después de 48 horas en interferón \gamma. Las células se incubaron a concentraciones variables de zsig37 biotinilada seguida de estreptavidina PE. Todos los bloqueos con zsig37 "fría" se realizaron en hielo durante 30 minutos. La proteína no unida se eliminó por lavado una vez en tampón FACS. La unión se cuantificó utilizando un instrumento de calibrado FACS (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) y se expresó en forma de una señal por encima del anticuerpo secundario sólo control. La activación de monocitos se verificó por un aumento de aproximadamente 1 unidad logarítmica en la expresión de ICAM-1 en células tratadas con interferón \gamma.

La unión de zsig37 se detectó tanto en monocitos activados como no activados, con un aumento en la unión de zsig37 observada en células tratadas con interferón \gamma. La unión se detectó hasta a 1,5 \mug/ml, la concentración más baja ensayada. A 15 \mug/ml, la unión aumentó aproximadamente 4 veces en células activadas. Se observa una ligera reducción (aproximadamente un 10%) de la unión en células activadas sólo cuando se pretratan con un exceso de 70 veces de zsig37 "fría". El aumento de la unión de zsig37 en monocitos activados sugiere la estimulación de la unión de monocitos a proteínas/receptores por zsig37 mediante citocinas inflamatorias. Esto podría dar como resultado potencialmente la implicación de zsig37 en la fagocitosis de monocitos, la eliminación de microbios, y la citotoxicidad celular. Después de dos días en cultivo, hay macrófagos presentes en el cultivo, y la zsig37 puede unirse preferencialmente a este subconjunto de células. No hay buenos marcadores de macrófagos disponibles para determinar si está ocurriendo eso. La zsig37 se une también a una estirpe de monocito/macrófago de ratón, RAW 264.7 (ATCC nº CRL-2278), indicando especificidad de macrófagos.

A partir de lo anterior, se apreciará que, aunque se han descrito realizaciones específicas de la invención en la presente memoria con fines de ilustración, pueden realizarse diversas modificaciones sin desviarse del alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada, excepto por las reivindicaciones adjuntas.

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<110> ZymoGenetics, Inc.

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<120> INHIBIDORES PARA USO EN HEMOSTASIS Y FUNCIÓN INMUNE

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<130> 99-12

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<160> 50

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<170> FastSEQ para Windows, versión 3.0

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<210> 1

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<211> 2769

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (171)...(1013)

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<400> 1

9

10

11

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<210> 2

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<211> 281

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

12

13

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<210> 3

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<211> 247

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

14

15

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<210> 4

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<230> Oligonucleótido ZC12447

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<400> 4

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\dddseqskip

atggggcacg cgactcagga ccaggccaga

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30

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<210> 5

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC695

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<400> 5

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\dddseqskip

gatttaggtg acactatag

\hfill

19

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<210> 6

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC694

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<400> 6

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\dddseqskip

taatacgact cactataggg

\hfill

20

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<210> 7

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13210

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<400> 7

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\dddseqskip

aagcaccggg aagcagggag

\hfill

20

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<210> 8

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13588

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<400> 8

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\dddseqskip

cgggcacgta gcagtagaac

\hfill

20

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<210> 9

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13532

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<400> 9

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\dddseqskip

gagagggctg aagaacaaca

\hfill

20

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<210> 10

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13641

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 10

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\dddseqskip

aaggtggcga gaggaaagga

\hfill

20

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<210> 11

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13586

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<400> 11

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\dddseqskip

tgttcaccgg caagttctac

\hfill

20

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<210> 12

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13651

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<400> 12

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\dddseqskip

ctttgtcctc cacggtttac

\hfill

20

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<210> 13

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13622

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<400> 13

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\dddseqskip

tttcctctcg ccaccttcca

\hfill

20

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<210> 14

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido ZC13625

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<400> 14

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\dddseqskip

cttcggctgc ttctaaccaa c

\hfill

21

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<210> 15

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13650

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 15

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gtaaaccgtg gaggacaaag

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13859

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 16

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gctgccaacc aacacaacca c

\hfill

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13624

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 17

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gcaggattag tcaaaacc

\hfill

18

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13531

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 18

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

aacatggggt gaggtggaga

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13587

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 19

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tcctcgtggg ctaagcatca

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13623

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 20

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

atctccagga accccatagc

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC14444

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 21

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tctccaggaa ccccatag

\hfill

18

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC14445

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 22

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gcaggattag tcaaaacc

\hfill

18

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 843

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Secuencia nucleotídica degenerada que codifica el polipéptido zsig37

\vskip0.333000\baselineskip

<221> Variación

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)...(843)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Cada N es independientemente cualquier nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 23

16

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC15040

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 24

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

actcattcta gactagggct cggt

\hfill

24

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC15033

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 25

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

atgaatggat ccctggtcct gagt

\hfill

24

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Péptido marcaje de afinidad Glu-Glu

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 26

\sa{Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu}

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC15721

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 27

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ctgtaggaat tcatgggctc ccgt

\hfill

24

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC15035

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 28

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

attcatggat ccgggctcgg tggc

\hfill

24

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13006

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 29

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ggctgtcctc taagcgtcac

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC13007

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 30

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

aggggtcaca gggatgcca

\hfill

19

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Péptido Glu-Glu

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 31

\sa{Gly Tyr Met Pro Val Asp}

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC6768

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 32

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gcaattaacc ctcactaaag ggaac

\hfill

25

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18297

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 33

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tcctgaaagg cgagaaaggt g

\hfill

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18298

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 34

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ttccctgagt ctgagctagg

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18402

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 35

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tccagagtga ctggggaagt g

\hfill

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18403

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 36

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

agtgacgagt tcgacaccta c

\hfill

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18456

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 37

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tgtgttccca ttcctggaca c

\hfill

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18457

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 38

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tccttccagc tggctggaaa g

\hfill

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18560

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 39

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

agaatgcagg gataggtcag

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18561

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 40

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tcagaggatc ctgacagcag

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18687

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 41

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tggacacgtg agagggactt c

\hfill

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC18688

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 42

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

agcagtagaa cttcccagtg

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 2559

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (70)...(912)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Ortólogo de ratón

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 43

17

18

19

21

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 281

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 44

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC23.698

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 45

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gaattcgaat tcctttgttt cca

\hfill

23

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC23.694

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 46

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

taatacgact cactataggg aggaggtacc agggtcacag cag

\hfill

43

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC23.703

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 47

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tctacgacca cttcaacatg

\hfill

20

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC23.697

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 48

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gtaattgttt attgtccaga tg

\hfill

22

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC24.441

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 49

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

atgcattaac cctcactaaa ggggagaggg ctgaagaaca aca

\hfill

43

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Oligonucleótido ZC24.442

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 50

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

taatacgact cactataggg aggggcggcg tagtggctct t

\hfill

41

Claims (27)

1. Uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, que reduce la actividad trombogénica y de complemento en la vasculatura, en la fabricación de una composición farmacéutica para promover el flujo sanguíneo en la vasculatura de un mamífero.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que el polipéptido reduce la actividad trombogénica y de complemento mediante la inhibición de la ruta de complemento y la inhibición de la adhesión, activación o agregación de plaquetas mediadas por colágeno.

3. Uso según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la composición es para administración antes, durante o después de una lesión vascular aguda en dicho mamífero.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicha lesión es debida a reconstrucción vascular.

5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicha reconstrucción vascular comprende angioplastia, injerto de derivación arterial coronario, endarterectomía, reparación microvascular o anastomosis de un injerto vascular.

6. Uso según la reivindicación 3, en el que dicha lesión es debida a traumatismo, apoplejía o aneurisma.

7. Uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos; por el cual dicha proteína convierte el tejido colagenoso lesionado en inerte frente a la activación del complemento, la actividad trombótica o la activación inmune, en la fabricación de un medicamento para inertizar tejidos colagenosos dañados en un mamífero.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que dichos tejidos colagenosos dañados son debidos a lesión asociada a isquemia y reperfusión.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que dicha lesión comprende isquemia por lesión traumática, estrangulación intestinal o lesión asociada al pre- y post-establecimiento del flujo sanguíneo.

10. Uso según las reivindicaciones 8-9, en el que el polipéptido se ha de administrar a un mamífero que padece isquemia por derivación cardiopulmonar y resucitación, infarto de miocardio o vasoespasmo postraumático.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicho vasoespasmo postraumático comprende apoplejía, angioplastia percutánea transluminal, endarterectomía, traumatismo vascular accidental o traumatismo vascular inducido por la cirugía.

12. Uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, por el cual dicha proteína convierte la superficie de un biomaterial protésico en inerte frente a la activación del complemento, la actividad trombótica o la activación inmune, en la fabricación de un medicamento para inertizar la superficie de un biomaterial protésico para uso asociado a un mamífero.

13. Uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos, por el cual dicha proteína potencia la progresión de la curación de heridas, en la fabricación de un medicamento para mediar en la reparación de heridas en un mamífero.

14. Uso según las reivindicaciones 1-13, en el que dicha proteína relacionada con el complemento de adipocitos comprende un polipéptido que comprende una secuencia de residuos aminoacídicos que es al menos 75% idéntica a la secuencia aminoacídica de los residuos 26-281 de la SEC ID Nº 2, en el que dicha secuencia comprende:

repeticiones Gly-Xaa-Xaa o Gly-Xaa-Pro que forman un dominio de colágeno, en el que Xaa es cualquier aminoácido, y

una porción globular carboxi terminal.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia de residuos aminoacídicos que es al menos 90% idéntica a la secuencia aminoacídica de los residuos 22-281 de la SEC ID Nº 2.

16. Uso según la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido comprende una secuencia aminoacídica que es al menos 90% idéntica a la secuencia aminoacídica de los residuos 26-281 de la SEC ID Nº 2.

17. Uso según las reivindicaciones 14-16, en el que cualquier diferencia entre dicho polipéptido y la SEC ID Nº 2 es debida a sustituciones conservadoras de aminoácidos.

18. Uso según las reivindicaciones 14-17, en el que dicho dominio de colágeno consiste en 13 repeticiones Gly-Xaa-Xaa y 1 repetición Gly-Xaa-Pro.

19. Uso según las reivindicaciones 14-18, en el que dicho dominio globular consiste en diez láminas beta.

20. Uso según las reivindicaciones 14-19, en el que dichas láminas beta se asocian a los residuos aminoacídicos correspondientes a 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 107-214, 219-225, 227- 239, 244-250 y 269-274 de la SEC ID Nº 2.

21. Uso según la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido comprende los residuos 1-281 de la SEC ID Nº 2 o los residuos 1-281 de la SEC ID Nº 44.

22. Uso según la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido se acompleja con un segundo polipéptido para formar un oligómero.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que dichos polipéptidos se acomplejan mediante enlaces disulfuro intermoleculares.

24. Uso según las reivindicaciones 22 y 23, en el que dicho oligómero es un trímero.

25. Uso según las reivindicaciones 22 y 23, en el que dicho oligómero es un hexámero.

26. Uso según las reivindicaciones 22 y 23, en el que dicho oligómero es un 18-mero.

27. Uso de una proteína relacionada con el complemento de adipocitos en la fabricación de un medicamento según la reivindicación 12 para inertizar la superficie de un biomaterial protésico, en el que la superficie de dicho biomaterial protésico está recubierta con colágeno o fragmentos de colágeno, gelatina, fibrina o fibronectina.