CN1341027A - 止血和免疫功能的抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在止血和免疫功能中用作抑制剂的多核苷酸和多肽分子。这些抑制剂是带有胶原蛋白样结构域和球状结构域的蛋白质家族的成员。该抑制剂通过降低血栓形成活性和补体活性对于促进脉管系统中的血流动是有用的。该抑制剂对于钝化胶原性表面和调节伤口的愈合也是有用的。
Description
发明背景
血管损伤启动一系列事件以修复损伤并控制血液从血管流出。该过程被称作止血。血小板在止血的早期阶段起作用,其通过形成血栓或栓形物以暂时修复血管损伤。血小板正常是不与血管壁的被覆内皮相互作用的,但由于事故或在手术过程中引起的血管损伤会破坏内皮细胞。根据损伤的程度,将会有不同的内皮下成分例如胶原蛋白、弹性膜或具有相关原纤维胶原蛋白的平滑肌细胞暴露于流动的血液。
当这些内皮下成分在血管损伤后被暴露时,在此局部血流中移动的血小板将与暴露的含有胶原蛋白的内皮下基质相互作用,并减慢下来。血小板表面受体与暴露的胶原蛋白层之间的进一步作用导致血小板的结合和激活,引起局部血流的阻滞。这些结合的血小板被激活,并通过在血小板间形成血纤蛋白原桥与流经的血流中的血小板形成聚集物(Moroi和Jung,生物科学前沿(Frontiers in Bioscience)3:719-28,1998;Barnes等,动脉粥样硬化症(Atherosclerosis)XI,Jacotot等编,ElsevierScience,第299-306页,1998;和Barnes等,Curr.Opin.Hematol.5:314-20,1998)。
止血反应是分级的,该反应取决于损伤区域中血管的损伤程度、所暴露的具体血管成分以及血流情况(Rand等,血栓形成和止血(Thrombosisand Haemostasis)78:445-50,1997)。内皮下基质(VI型胶原蛋白和冯·维勒布兰德氏因子)在例如轻微血管损伤期间的暴露促进了低血流状况区域中出现低程度的粘附和聚集。导致更大程度血管创伤和其它血管成分(例如内弹性膜和弹性蛋白相关的微丝)暴露的损伤将刺激形成更为强大的血小板聚集物。暴露原纤维胶原蛋白的严重血管创伤会激起血小板的血栓形成反应,该反应保护受伤害者不过度失血(Rand等,同上)。
止血抑制剂对于增加血管损伤后的血流量和钝化胶原性表面将是有用的。
补体因子Clq由3个相关多肽(A、B和C链)的6个拷贝组成,每个多肽大约长225个氨基酸并在近氨基端有一个胶原蛋白结构域而在羧基端有一个球形区域。由6个A、6个B和6个C链的胶原蛋白结构域形成6个三股螺旋区域,构成一个中心区域和6个柄。球形头部由一个A、一个B和一个C链的球形羧基端结构域相连形成。因此Clq由通过6个胶原样柄与一个中心纤维区域连接的6个球形头组成。Sellar等,生物化学杂志(Biochem.J.)274:481-90,1991。该构象通常称为花束。Acrp30具有类似的花束结构,该结构由单一类型多肽链所形成。
已经发现Clq刺激防御机制并引发能够造成组织损伤的毒性氧种类的产生(Tenner,Behring Inst.Mitt.93:241-53,1993)。在血小板上可以发现Clq的结合位点。此外,补体和Clq还在炎症中起作用。补体的激活是通过Clq与免疫球蛋白的结合起始的。
Clq和该补体途径的抑制剂对于抗炎症应用、补体激活和血栓形成活性的抑制将是有用的。
本发明提供可用于这些用途和本领域技术人员从本文的解说中将明了的其它用途的多肤。
发明概述
一方面,本发明提供促进哺乳动物脉管系统中血流的方法,其包括给所述哺乳动物施用存在于可药用载体中的有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质;由此所述脂肪细胞补体相关蛋白质降低所述脉管系统中的血栓形成活性和补体活性.在一个实施方案中,该脂肪细胞补体相关蛋白质包含如下多肽,该多肽含有与SEq ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少75%一致性的氨基酸残基序列,其中所述序列含有:形成胶原结构域的Gly-Xaa-X砚或Gly-Xaa-Pro重复(其中Xaa是任何氨基酸),以及羧基端的球形部分.在一个相关实施方案中,该多肽含有与SEQID NO:2第22-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸残基序列。在另一个实施方案中,该多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸残基序列。在又一实施方案中,所述多肽与SEQ ID NO:2之间的任何差异均由保守氨基酸替代引起。在另一个实施方案中,该胶原蛋白结构域由13个Gly-Xaa-Xaa重复和1个Gly-Xaa-Pro重复组成。在又一实施方案中,该球形结构域由10个β折叠组成。在一个相关的实施方案中,该β折叠与相应于SEQ ID NO:2的第147-151、170-172、178-181、191-203、207-214、219-225、227-239、244-250和269-274位的氨基酸残基相关。在又一实施方案中,该多肽含有SEQ ID NO:2的第1-281位残基或SEQ ID NO:44的第1-281位残基。
本发明还提供与第二个多肽复合形成寡聚体的多肽。在一个实施方案中,该多肽通过分子间二硫键复合。在另一个实施方案中,该寡聚体是三聚体。在又一实施方案中,该寡聚体是六聚体。在又一实施方案中,该多聚体是十八聚体。
在另一个实施方案中,该多肽通过抑制补体途径和抑制胶原蛋白介导的血小板粘附、激活或聚集,降低血栓形成活性和补体活性。在另一个实施方案中,在所述哺乳动物出现急性血管损伤之前、过程中或之后施用该多肽。在又一实施方案中,所述破损是由于血管重建引起的。在一个相关的实施方案中,该血管重建包括血管成形术、冠状动脉旁路移植、动脉内膜切除术、微血管修复或血管移植物的吻合。在另一个相关实施方案中,所述损伤是由于外伤、中风或血管瘤引起的。
另一方面,本发明提供钝化(pacify)哺乳动物中损坏的胶原性组织的方法,包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质,籍此所述蛋白质使该损坏的胶原性组织对补体激活、血栓形成活性或免疫激活不起反应。在一个实施方案中,该损坏的胶原性组织是由于与缺血和再灌注相关的损伤造成的。在另一个实施方案中,该损伤包括外伤性损伤缺血、肠绞窄(intestinal strangulation)或与血流恢复之前或之后(pre-and post-establishment of blood flow)相关的损伤。在又一实施方案中,给患有心肺动脉旁路缺血和recesitation、心肌梗死或外伤后血管痉挛的哺乳动物施用该多肽。在一个相关实施方案中,该外伤后血管痉挛包括中风、经皮腔内血管成形术、动脉内膜切除术、意外性血管外伤或手术引起的血管外伤。
再一方面,本发明提供钝化用于哺乳动物的假体生物材料(prostaticbiomaterial)表面的方法,包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质;籍此所述多肽使所述假体生物材料(prostheticbiomaterial)表面对补体激活、血栓形成活性或免疫激活不起反应。在一个实施方案中,所述假体生物材料的表面包被有胶原蛋白或胶原蛋白的片段、明胶、纤维蛋白或纤连蛋白。
本发明的另一方面提供在哺乳动物中调节伤口修复的方法,包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质;籍此所述多肽加速伤口的愈合进程。
附图简要说明
图1图解了本发明zsig37多肽与HUMUPST2_1(Maeda等,Biochem.Biophys.Res.Comm.221(2):286-9,1996);C1QA_HUMAN(Sellar等,生物化学杂志274:481-90,1991;Reid,生物化学杂志179:367-71,1979;和Reid等,生物化学杂志203:559-69,1982);HP25_TAMAS(Takamatsu等,分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)13:1516-21,1993和Kondo & Kondo,J.Biol.Chem.267:472-8,1992);HP27_TAMAS(Takamatsu等,和Kondo & Kondo参考文献同上);和CERL_RAT(Wada& Ohtani,Brain Res.Mol.Brain Res.9:71-7,1991)的多序列比对。
图2是一个矩阵,显示了图1多序列比对中所示6个蛋白质相比较的氨基酸一致性百分数。
图3a显示了zsig37-FITC与VI型胶原蛋白的结合。
图3b显示了未标记的zsig37与FITC标记的zsig37对VI型胶原的竞争结合。
图4显示了补体Clq-FITC与zsig37的结合。
图5显示了zsig37对人类补体活性的抑制。
图6显示了在zsig37存在时血小板通过胶原聚集的百分数。
图7显示了在zsig37存在时SK5成纤维细胞的增殖。
发明详述
在详细阐述本发明之前,定义以下术语可能对于本发明的理解是有帮助的。
术语“亲和标记物”在本文中用以指能够与多肽连接以利于该多肽的纯化或检测,或提供该多肽与底物结合的位点的多肽片段。原则上,任何可以获得其抗体或其它特异性结合剂的肽或蛋白质均可以用作亲和标记物。亲和标记物包括聚组氨酸序列片段、A蛋白(Nilsson等,EMBO J.4:1075,1985;Nilsson等,酶学方法(Methods Enzymol.)198:3,1991)、谷胱苷肽S-转移酶(Smith和Johnson,基因(Gene)67:31,1988)、P物质、FlagTM肽(Hopp等,生物技术(Biotechnology)6:1204-10,1988;可以从Eastman Kodak公司,New Haven,CT获得)、链霉亲和素结合肽、或其它抗原表位或结合域。一般参见Ford等,蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107,1991。编码亲和标记物的DNA可以从供应商处获得(例如Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)。
术语“多核苷酸分子的互补体”是与参照序列相比具有互补的碱基序列和相反取向的多核苷酸分子。例如,序列5’ATGCACGGG 3’与5’CCCGTGCAT 3’互补。
术语“简并核苷酸序列”是指包括一个或多个简并密码子的核苷酸序列(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比而言)。简并密码子含有不同的三联体核苷酸,但编码相同的氨基酸残基(例如,GAU和GAC三联体均编码Asp)。
术语“分离的”当应用于多核苷酸时,是指该多核苷酸已从其天然遗传环境中被取出,并因此不含有其它外来或不需要的编码序列,而且其存在形式适合用于遗传工程蛋白质制备系统。这些分离的分子是从其天然环境中分离出来的分子,包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含有通常与之相联的其它基因,但可以包括天然存在的5’和3’非翻译区例如启动子和终止子。相联区域的鉴定对于本领域普通技术人员是明了的(见例如Dynan和Tijan,自然(Nature)316:774-78,1985)。
“分离的”多肽或蛋白质是指在非其天然环境的情况中例如在脱离血液和动物组织的情况中发现的多肽或蛋白质。在一种优选的形式中,该分离多肽基本不含有其它多肽,尤其是动物来源的其它多肽。优选提供高纯度形式的该多肽,例如具有大于95%的纯度、更优选大于99%的纯度。当用于本文时,术语“分离的”并不排除以其它物理形式存在的相同多肽,例如二聚体或其它糖基化形式或衍生形式。
术语“直向同源物(ortholog)”是指从一个物种获得的多肽或蛋白质,其是另一个物种的多肽或蛋白质的功能性对应物。直向同源物之间的序列差异是物种形成的结果。
术语“多核苷酸”是指从5’向3’末端进行阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA,并且可以是从天然来源分离的、体外合成的、或从天然和合成分子的组合制备的。多核苷酸的大小以碱基对(缩写“bp”)、核苷酸(“nt”)或千碱基(“kb”)表示。在上下文允许的地方,后两个术语可以描述单链或双链多核苷酸。当该术语应用于双链分子时,其用以指整个长度并应理解为与术语“碱基对”相同。本领域技术人员将知道,双链多核苷酸的两条链可以在长度上稍有不同,并且它们的末端可以由于酶切而是交错的;因此在双链多核苷酸分子中并非所有核苷酸都是配对的。这些非配对末端一般长度不超过20个nt。
“多肽”是通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物,而不论其是天然产生的还是合成产生的。少于大约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。
本文所用“探针和/或引物”可以是RNA或DNA。DNA可以是cDNA或基因组DNA。多核苷酸探针和引物是单链或双链DNA或RNA,通常是合成的寡核苷酸,但也可以从克隆的cDNA或基因组序列或其互补体产生。分析探针一般长至少20个核苷酸,尽管有时可以使用更短的探针(14-17个核苷酸)。PCR引物至少长5个核苷酸,优选15个nt或更多、更优选20-30个nt。当基因的一个小区域是分析的靶标时,可以使用短多核苷酸。对于基因的整体分析,多核苷酸探针可以含有完整的外显子或更多。可以通过本领域熟知的技术用例如酶、生物素、放射性核素、荧光基团、化学发光物、顺磁颗粒等对探针进行标记以提供可检测信号,这些标记物可以从许多商业途径获得,例如Molecular Probes公司,Eugene,OR和Amersham公司,Arlington Heights,IL。
通过粗略的分析方法(例如,凝胶电泳)确定的分子量和多聚物的长度应理解为是大概值。当该值以“大约”X或“近似”X表示时,X的所述值应理解为准确到±10%。
本发明部分基于如下发现,即一种新的脂肪细胞补体相关蛋白质同系物抑制胶原蛋白介导的血小板激活和包括Clq的补体途径。该蛋白质命名为zsig37,并全面地描述于共同转让的公开PCT专利申请WO99/04000。
该zsig37的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)编码一个多肽(SEQ ID NO:2),该多肽具有一个氨基端信号序列、一个邻近的N-端非同源区域、一个由Gly-Xaa-Xaa或Gly-Xaa-Pro重复组成的截短胶原蛋白结构域和一个羧基端球形部分。该新多核苷酸序列还含有一个长的3’非翻译区。Acrp30和HUMUPST2_1共同具有以上给出的该通用多肽结构,只是这些蛋白的每一个的胶原蛋白样结构域都比zsig37的长。HUMUPST2_1 DNA序列的特征还在于有一个长的3’非翻译区。而且,Acrp30和图1比对的所有序列,除了CERL_RAT外,均在图1和SEQ ID NO:2所示zsig37多肽的第187位具有一个保守半胱氨酸残基。而且,本发明的zsig37多肽包括一个推测的N-连接糖基化位点,该位点位于SEQ ID NO:2的第93位(Asn)氨基酸。
zsig37的相应mRNA的组织分布分析显示,在心脏和胎盘中表达最高,在肾、卵巢、肾上腺和骨骼肌中信号相对较弱,而存在于Northern印迹上的许多其它组织中信号更弱。
zsig37与脂肪细胞补体相关蛋白质Acrp30(SEQ ID NO:3)和脂肪细胞分泌蛋白apM1(图1和2中的HUMUPST2_1)的同系物关系已确立。还鉴定了与补体成分C1QA链、在冬眠的西伯利亚旱獭的活跃状态中所观察到的两个因子(HP25_TAMAS和HP27_TAMAS)和大鼠脑蛋白质(CERL_RAT)更远一些的同源关系,如图1和2所示。
zsig37的核苷酸序列描述于SEQ ID NO:1中,其推导的氨基酸序列描述于SEQ ID NO:2中。在SEQ ID NO:23中提供了编码SEQ ID NO:2之多肽的简并核苷酸序列。正如以上一般描述的,该zsig37多肽包括一个从第1位氨基酸(Met)至第21位氨基酸(Gly)的信号序列。可选择的另一个信号序列从第1位氨基酸(Met)至第25位氨基酸(Ser)。因此该成熟多肽从第22位氨基酸(Leu)或第26位氨基酸(Arg)延伸至第281位氨基酸(Pro)。在该成熟多肽中,N-端区域,即第22位氨基酸残基(Leu)和第98位氨基酸残基(Lys)之间未发现已知的同源性。此外,在第99位氨基酸(Gly)和第140位氨基酸(Arg)之间发现一个截短的胶原蛋白结构域。在该截短的胶原蛋白结构域中,观察到1个完全的Gly-Xaa-Pro和13个不完全的Gly-Xaa-Xaa重复。相反地,Acrp30含有22个完全或不完全重复。该zsig37多肽还包括一个羧基端球形结构域,从大约第141位氨基酸(Cys)延伸至第281位氨基酸(Pro)。Zsig39多肽、HUMUPST2_1和Acrp30表现出在胶原蛋白结构域和球形结构域中是同源的,而在成熟多肽的N端部分则不同源。
ACRP30的球形Clq结构域经测定具有一个10个β链的“涂果子冻的薄卷饼(jellyroll)”拓扑结构(Shapiro和Scherer,Curr.Biol.8:335-8,1998),该结构显示出与TNF家族具有显著的结构同源性,而且SEQ ID NO:2所示zsig37序列含有该结构的所有10个β链(SEQ ID NO:2的第147-151、170-172、178-181、185-188、191-203、207-214、219-225、227-238、244-250和269-274位氨基酸残基)。这些链分别称为“A”、“A’”、“B”、“B’”、“C”、“D”、“E”、“F”、“G”和“H”。
zsig37具有两个受体结合环,位于氨基酸第152-180位和第213-226位。在包括CD40、TNFα、TNFβ、ACRP30和zsig37的超家族中,第191位(Gly)、193位(Tyr)、238位(Leu)和272位(Gly)氨基酸残基表现出是保守的。
本发明的另一方面包括zsig37多肽片段作为止血和免疫功能的抑制剂的应用。优选的片段包括zsig37多肽的胶原蛋白样结构域(SEQ ID NO:2的第99位氨基酸(Gly)至第140位氨基酸(Arg))、zsig37多肽的含有该胶原蛋白样结构域的部分、或该胶原蛋白样结构域的能够形成二聚体或寡聚体的部分。其它优选的片段包括zsig37多肽的球形结构域(SEQID NO:2的第140位氨基酸(Arg)或第141位氨基酸(Cys)至第281位氨基酸(Pro))、zsig37多肽的含有该球形样结构域的部分、或该球形样结构域的活性部分。本发明的另一个zsig37多肽片段包括该胶原蛋白样结构域和从SEQ ID NO:2第99位(Gly)至第281位(Pro)氨基酸残基的球形结构域两者。这些片段在抑制胶原蛋白介导的血小板激活中以及在对补体和Clq的抑制中尤其有用。
本发明还提供zsig37融合蛋白的用途。例如,本发明的融合蛋白包括(1)选自下组的多肽:(a)含有SEQ ID NO:2第1位(Met)、第22位(Leu)或第26位(Arg)氨基酸残基至第281位氨基酸残基(Pro)所示的氨基酸序列的多肽分子;(b)SEQ ID NO:2第99位氨基酸(Gly)至第140位氨基酸(Arg)之间的多肽分子、zsig37多肽的含有胶原蛋白样结构域的部分、或能够形成二聚体或寡聚体的该胶原蛋白样结构域的部分;(c)SEQID NO:2的第140位氨基酸(Arg)或第141位氨基酸(Cys)至第281位氨基酸(Pro)之间的多肽分子、zsig37多肽的含有所述球形样结构域的部分、或该球形样结构域的活性部分;或(d)第99位氨基酸(Gly)至第281位氨基酸(Pro)之间的多肽分子、zsig37多肽的包括所述胶原蛋白样结构域和所述球形结构域的部分;和(2)另一个多肽。该另一个多肽可以是一个可替代的或其它的球形结构域、一个可替代的或其它的胶原蛋白样结构域或利于该融合蛋白分泌的信号肽等等。
zsig37的拮抗剂和激动剂在本发明方法中也是有用的。鉴定拮抗剂的方法是本领域已知的。例如,zig37多肽的拮抗剂可以通过如下步骤进行鉴定:提供响应zsig37多肽的细胞,将此细胞的第一部分在存在zsig37多肽时进行培养,将此细胞的第二部分在存在该zsig37多肽和测试化合物时进行培养,检测该细胞的第二部分相对该细胞的第一部分在细胞响应方面的降低。除了本文所公开的这些分析方法之外,还可以在多种设计成测量受体的结合或zsig37依赖性细胞响应的激活/抑制的分析方法中检测样品对zsig37活性的抑制。例如,可以用响应zsig37所刺激的细胞通路的报道基因结构转染zsig37效应细胞系。该类型的报道基因结构是本领域已知的,一般包含可操作地与编码可测定蛋白质例如荧光素酶的基因相连的zsig37-DNA效应元件。DNA效应元件可包括但不限于环AMP效应元件(CRE)、激素效应元件(HRE)、胰岛素效应元件(IRE)(Nasrin等,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:5237-7,1990)和血清效应元件(SRE)(Shaw等,细胞(Cell)56:563-72,1989)。环AMP效应元件的综述见Roestler等,J.Biol.Chem.263(19):9063-6,1988和Habener,分子内分泌学(Molec.Endocrinol.)4(8):1087-94,1990。激素效应元件的综述见Beato,细胞(Cell)56:335-44,1989。对于候选化合物、溶液、混合物或提取物,测试其抑制zsig37对靶细胞的活性的能力,这通过zsig37刺激的报道基因表达的降低来指示。此类分析将检测直接阻断zsig37与细胞表面受体结合的化合物,以及阻断受体-配体结合之后细胞通路中的过程的化合物。在可选择的另一种方法中,可以采用标记了可检测标记(例如125I、生物素、辣根过氧化物酶、FITC等)的zsig37,检测化合物或其它样品对zsig37与受体结合的直接阻断。在此类分析方法中,测试样品抑制标记的zsig37与受体结合的能力指示了抑制活性,该抑制活性可以通过第二种分析进行验证。用于结合分析方法的受体可以是细胞受体或分离的、固定化的受体。
特异与zsig37多肽表位、肽或多肽结合的抗体在本发明方法中也是有用的。制备多克隆和单克隆抗体的方法是本领域所熟知的(见例如Sambrook等,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual),第2版,Cold Spring Harbor,NY,1989;和Hurrell,J.G.R.编,单克隆杂交瘤抗体:技术和应用(Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications),CRC Press公司,Boca Raton,FL,1982)。
本领域的普通技术人员将明了,多克隆抗体可以通过接种多种恒温动物例如马、奶牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠、仓鼠、豚鼠和大鼠,以及转基因动物例如转基因绵羊、奶牛、山羊或猪来制备。还可以以经过修饰的形式在酵母和真菌中以及哺乳动物和昆虫细胞中表达抗体。zsig37多肽或其片段用作抗原(免疫原)接种动物或引发免疫应答。适合的抗原将包括由SEQ ID NO:2的第22-281位氨基酸残基、SEQ ID NO:2的第26-281位氨基酸残基、或SEQ ID NO:2的连续的第9-281位氨基酸残基片段所编码的zsig37多肽。zsig37多肽的免疫原性可以通过使用佐剂例如明矾(氢氧化铝)或弗氏完全或不完全佐剂来增强。对于免疫有用的多肽还包括融合多肽,例如zsig37或其部分与免疫球蛋白多肽或与亲和标记物的融合物。多肽免疫原可以是全长的分子或其部分。如果该多肽部分是“类半抗原”,则可以有利地将该部分与高分子载体(例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)结合或连接用于免疫。
本文所用术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体、和抗原结合片段,例如F(ab’)2和Fab蛋白水解片段。基因工程化的完整抗体或片段例如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等,以及合成的抗原结合肽和多肽也包括在内。非人类抗体可以通过仅将非人类CDR嫁接到人类的构架和恒定区上,或通过掺入完整的非人类可变区(任选地通过取代暴露的残基用人类抗体样表面“覆盖”它们,其中所获得的结果是“表面经装饰的”抗体)来实现人源化。在一些情况中,人源化抗体可以在人的可变区构架结构域中保留非人类的残基以增强正确的结合特性。通过对抗体的人源化,可以增加生物学半衰期,并降低给人施用时产生不利免疫反应的潜在可能性。用于制备或筛选本文有用的抗体的另一些可选择技术包括将zsig37蛋白质或肽在体外暴露给淋巴细胞,并(例如通过使用固定化的或标记的zsig37蛋白质或肽)筛选噬菌体或类似载体的抗体展示文库(antibody display library)。
如果:1)抗体表现出阈值水平的结合活性,和/或2)抗体与相关多肽分子没有显著的交叉反应,则该抗体被定义为具有特异结合性。首先,在本文中如果抗体与zsig37多肽、肽或表位的结合具有106mol-1或更高,优选107mol-1或更高,更优选108mol-1或更高,最优选109mol-1或更高的结合亲和力(Ka),则该抗体具有特异结合性。抗体的结合亲和力可以容易地由本领域的普通技术人员根据例如Scatchard分析(Scatchard,Ann.NY Acad.Sci.51:660-672,1949)进行测定。
其次,如果抗体与相关多肽没有显著的交叉反应,则该抗体具有特异结合性。例如,如果采用标准Western印迹分析(Ausubel等,同上)抗体仅检测zsig37多肽而不检测已知的相关多肽,则该抗体与相关多肽分子没有显著的交叉反应。已知相关多肽的例子包括蛋白质家族的其它成员例如Acrp30(SEQ ID NO:3)、图1比对中所示的多肽等等。如果需要的话,它们还可以包括直向同源物和突变的人类zsig37多肽。而且,可以“筛选不与”已知相关多肽结合的抗体以分离特异与本发明多肽特异结合的群体。例如,将针对人类zsig37多肽所产生的抗体与附着在不溶性基质上的相关多肽吸附;在适合的缓冲液条件下特异结合人类zsig37多肽的抗体将会流过该基质。这种筛选方法使得可以分离不与密切相关的多肽发生交叉反应的多克隆和单克隆抗体(抗体:实验室手册(Antibody:A Laboratory Manual),Harlow和Lane(编),Cold Spring HarborLaboratory Press,1988;当代免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology),Cooligan等(编),National Institute of Health,JohnWiley and Sons公司,1995)。筛选和分离特异性抗体的方法是本领域所熟知的(见,基础免疫学(Fundamental Immunology),Paul(编),Raven Press,1993;Getzoff等,免疫学进展(Adv.in Immunol.)43:1-98,1998;单克隆抗体:原理和实践(Monoclonal Antibodies:Principles andPractice),Goding J.W.(编),Academic Press公司,1996;Benjamin等,免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)2:67-101,1984)。这些分析方法的代表性例子包括:并行免疫电泳(concurrentimmunoelectrophoresis)、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶连免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹或Western印迹分析、抑制或竞争分析和三明治分析(sandwich assay)。
zsig37多肽、片段、融合物、拮抗剂或激动剂对于止血的影响,尤其是对导致血小板聚集的血小板粘附和激活的影响,可以通过采用本文所提供的以及本领域所已知的方法和分析进行测定。胶原蛋白是血小板聚集的有效诱导剂。这就对从血管损伤康复的患者造成了危险。针对胶原蛋白诱导的血小板聚集的抑制剂对于该目的将是有用的。zsig37被发现可以与纤连蛋白以及I、II、III、V和VI型胶原蛋白结合。尤其是,zsig37可以以浓度依赖性方式与VI型胶原蛋白上的特定结构域结合。而且发现zsig37可以抑制胶原蛋白所介导的血小板激活。zsig37所诱导的抑制作用对于胶原蛋白的激活具有选择性,zsig37对由已知血小板激活剂ADP或凝血酶激活的血小板没有作用。这些结果在以下实施例部分中有更为详细的描述。预期对于阻止血小板与胶原蛋白包被表面的结合以及降低相关的胶原蛋白诱导的血小板聚集,zsig37多肽、片段、融合物、拮抗剂或激动剂将是有用的。
Clq是补体途径的一个成分,而且发现Clq可以刺激防御机制以及引发能够造成组织损害的毒性氧种类的产生(Tenner,Behring Inst.Mitt.93:241-53,1993)。在血小板上发现有Clq的结合位点。已发现不依赖免疫结合配偶体的Clq可以抑制血小板的聚集但不抑制血小板的粘附或形状改变。Clq的氨基端区域与胶原蛋白具有同源性(Peerschke和Ghebrehiwet,免疫学杂志(J.Immunol.)145:2984-88,1990)。zsig37以浓度依赖性方式与补体Clq结合。发现zsig37在有致敏和未致敏绵羊红细胞时可以有效地抑制包括Clq的补体途径。
本发明的zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂可以通过降低粘附和被激活的血小板数目以及血小板聚集物的大小用于促进哺乳动物脉管系统中血液流动的方法中。这些方法将包括给需要该治疗的哺乳动物使用有效治疗量的zsig37多肽、片段、融合物、抗体、拮抗剂或激动剂,籍此zsig37降低该哺乳动物脉管系统中的血栓形成活性和补体活性。正如以下描述的,zsig37多肽抑制胶原蛋白介导的血小板激活,并通过结合失活纤连蛋白和I、II、III、V和VI型胶原蛋白。施用zsig37可以通过减小血小板粘附、激活和聚集的形态(modes),在血管损伤位置降低血栓形成活性。正如以下所描述的,zsig37还抑制补体途径和Clq,从而降低了脉管系统中的补体活性。用于这些方法的zsig37多肽、片段、融合物、抗体、拮抗剂或激动剂可以在哺乳动物的急性血管损伤之前、过程中或之后施用。
在一个优选的方法中,该血管损伤是由于血管重建引起的,该血管重建包括但不限于血管成形术、动脉内膜切除术、冠状动脉旁路移植、微血管修复或血管移植物的吻合。由于外伤、中风或血管瘤引起的血管损伤也在考虑之列。在其它优选方法中,该血管损伤是由于血小板破裂、脉管系统的降解、与糖尿病相关的并发症和动脉粥样硬化引起的。冠状动脉中血小板的破裂会引起心脏病发作,而脑动脉中血小板的破裂会引起中风。zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂在这些方法中的应用对于缓解与免疫系统相关的脉管系统全系统疾病,例如弥散性血管内凝血(DIC)和SID也将是有用的。此外,其补体抑制活性对于治疗非脉管系统免疫疾病例如小动脉硬化将是有用的。
已发现局部缺血心肌中Clq的存在与冠状动脉闭塞和再灌注之后的白细胞累积之间有相关性。组织损伤后细胞性成分的释放引发导致毒性氧产物的补体激活,这些毒性氧产物可能是心肌损伤的主要原因(Rossen等,Circ.Res.62:527-84,1998和Tenner,同上)。发现阻断该补体途径可以保护缺血性心肌不受到再灌注的损害(Bureke等,J.Pharm.Exp.Therp.286:429-38,1998)。zsig37多肽的补体抑制和Clq结合活性对于这些目的将是有用的。
zsig37的胶原蛋白和Clq结合能力可以用于钝化损坏的胶原性组织,防止血小板粘附、激活或聚集,以及导致毒性氧产物释放的炎症过程的激活。通过使暴露组织对补体活性、血栓形成活性和免疫激活等作用不起反应,zsig37多肽、片段、融合物、抗体、拮抗剂或激动剂可以用于降低缺血和再灌注的损伤性影响。具体地,这些损伤包括外伤性损伤缺血、肠绞窄以及与血流恢复前和恢复后相关的损伤。zsig37可以用于治疗心肺动脉旁路缺血和recesitation、心肌梗死和外伤后的血管痉挛,例如中风、经皮腔内血管成形术以及意外性血管外伤或手术引起的血管外伤。
zsig37多肽、片段、融合物、抗体、拮抗剂或激动剂也可以用于钝化假体生物材料和手术器械,使得这些材料的表面对于补体激活、血栓形成活性或免疫激活不起反应。这些材料包括但不限于胶原蛋白或胶原蛋白片段包被的生物材料、明胶包被的生物材料、纤维蛋白包被的生物材料、纤连蛋白包被的生物材料、肝素包被的生物材料、胶原蛋白和凝胶包被的斯滕特固定模、动脉移植物、合成的心脏瓣膜、人造器官或任何暴露于血液的以超过1×108的水平与zsig37结合的假器官应用物。对这些材料的包被可以采用本领域已知的方法进行,见例如Rubens,美国专利5,272,074。
补体和Clq在炎症中起作用。通过Clq与免疫球蛋白结合起始补体的激活(Johnson,Pediatr.Infect.Dis.J.12:933-41,1993;Ward和Ghetie,治疗免疫学(Therap.Immunol.)2:77-94,1995)。Clq和补体的抑制剂作为抗炎症剂将是有用的。这些应用可以用于防止感染。此外,可以给患有补体激活和免疫复合物与Clq结合所介导的炎症的个体,施用这些抑制剂。zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂可以通过克服损伤性伤口的愈合在调节伤口的修复、加快伤口愈合的进程的方法中应用。伤口愈合进程包括,例如炎症的减轻、成纤维细胞的恢复、伤口的收缩和感染的减轻等要素。
肿瘤细胞结合胶原蛋白的能力可能促成肿瘤转移。胶原蛋白结合的抑制剂对于调节肿瘤的粘附相互作用和转移扩散也是有用的(Noeske-Jungbult等,美国专利5,723,312)。
已发现采用Dainty等,药物学杂志(J.Pharmacol.)100:767,1990和Rhee等,Neurotox.16:179,1995的方法,zsig37可以在去甲肾上腺素收缩的主动脉环中诱导血管舒张,下文将作更为详细的描述。
可以采用本文所描述的方法或本领域已知的方法,例如血小板的聚集分析(Chiang等,血栓形成研究(Thrombosis Res.)37:605-12,1985)和血小板粘附分析(Peerschke和Ghebrehiwet,免疫学杂志144:221-25,1990)评价血小板的粘附、激活和聚集。可以采用本文所公开的方法或本领域已知的方法,例如Suba和Csako,免疫学杂志117:304-9,1976中所描述的方法,确定Clq和补体途径的抑制。可以采用描述于Keller等,J.Biol.Chem.268:5450-6,1993;Waxman和Connolly,J.Biol.Chem.268:5445-9,1993;Noeske-Jungblut等,J.Biol.Chem.269:5050-3,1994;或Deckmyn等,血液(Blood)85:712-9,1995中的方法,测定血小板与胶原蛋白的粘附以及胶原蛋白诱导的血小板聚集的抑制。
为了评价zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂和激动剂对缺血和再灌注损伤的影响,有多种体外和体内模型。见例如Shandelya等,血液循环(Circulation)88:2812-26,1993;Weisman等,科学(Science)249:146-151,1991;Buerke等,血液循环91:393-402,1995;Horstick等,血液循环95:701-8,1997;和Burke等,J.Phar.Exp.Therp.286:429-38,1998。Deckmyn等(同上)描述了离体仓鼠血小板聚集分析。在注射zsig37多肽之后可以采用Deckmyn等(同上)所描述的模型测定仓鼠和狒狒的出血次数。可以采用Deckmyn等(同上)所提供的仓鼠股静脉血栓形成模型测量响应本发明蛋白质的施用而产生的血栓形成。施用zsig37之后在流动情况下血小板粘附的改变可以采用Harsfalvi等,血液85:705-11,1995中所述的方法来测定。
可以分析单独zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂,或者是分析它们与胶原蛋白诱导的血小板激活和聚集的其它抑制剂例如palldipin、moubatin或calin等之组合的补体抑制和伤口愈合作用。
zsig37多肽、片段、融合蛋白、抗体、拮抗剂或激动剂的评价可以采用本文所述的方法或本领域已知的方法进行,例如猪的皮层愈合(healing of dermal layer)(Lynch等,美国国家科学院院刊84:7696-700,1987)和遗传性糖尿病小鼠中全厚度皮肤损伤(Greenhalgh等,美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)136:1235-46,1990)等。可以单独分析本发明多肽,或结合上述的其它已知补体抑制剂一起进行分析。
此外,zsig37多肽、片段、融合物、其拮抗剂或激动剂在治疗上对于抗微生物应用可能是有用的。例如,补体成分Clq在宿主对感染物例如细菌和病毒的防御中起作用。已知Clq表现出几种特化功能。例如,Clq通过与结合的抗体或C-反应蛋白(CRP)的相互作用触发补体级联反应。而且,Clq可以直接与某些细菌、RNA病毒、支原体、尿酸结晶、细菌内毒素的A脂质成分和某些胞内细胞器成员相互作用。Clq与Clq受体的结合被认为可以促进吞噬。Clq还表现出增强宿主防御系统的抗体形成方面。见例如Johnston,Pediatr.Infect.Dis.J.12(11):933-41,1993。因此,可溶性Clq样分子可以用作抗微生物剂,促进对感染物的裂解或吞噬。
Clq和巨噬细胞消除受体中的带正电荷细胞外三股螺旋胶原蛋白性结构域被确定在配体结合中起作用,并表现出对于聚阴离子具有广泛的结合特异性(Acton等,J.Biol.Chem.268:3530-37,1993)。溶血磷脂生长因子(溶血磷脂酸,LPA)和其它促有丝分裂阴离子位于损伤组织处,并有助于伤口的修复。LPA发挥着许多生物学作用,包括血小板的激活和基质装配的上调。LPA被认为与其它凝血因子协同起作用,并介导伤口的愈合。
已知蛋白质例如Clq和巨噬细胞消除受体的胶原蛋白样结构域可以和酸性磷脂例如LPA结合。zsig37胶原蛋白结构域的一个9mer区域,即SEQ ID NO:2的第127-135位氨基酸残基,与Clq和巨噬细胞消除受体上的胶原蛋白结构域具有序列同源性。zsig37多肽、片段、融合物、拮抗剂或激动剂与促有丝分裂阴离子例如LPA的相互作用可以采用本领域已知的分析方法确定,见例如Acton等,同上。本发明多肽和抗体对发炎过程的抑制在防止伤口部位感染方面也是有用的。
对于药物应用,可以将本发明蛋白质与可药用载体根据常规方法配制成制剂用于肠胃外、口服、鼻内、直肠、局部、经皮给药等。优选的给药是在血管损伤处或附近进行。一般地,药物制剂包括zsig37蛋白质以及可药用载体例如盐水、缓冲盐水或5%葡萄糖水溶液等等。制剂可以进一步包括一或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止在药瓶表面上蛋白质损失的白蛋白等。配制方法是本领域所熟知的,并公开于例如Remington:制药科学和实践(The Science and Practice of Pharmacy),Gennaro编,Mack Publishing公司,Easton PA,第19版,1995。治疗剂量一般由临床医师根据公认的标准并考虑待治疗的疾病的性质和严重性、患者的特点等来确定。剂量的确定属于本领域普通技术人员的水平范围内。
本文所用zsig37多肽、片段、融合蛋白、拮抗剂或激动剂的“药物学有效量”是指足以引起期望的生物学结果的量。该结果可以是病征、症状或病因的减轻,或任何其它期望的生物学系统改变。例如,zsig37多肽的有效量将能提供症状的主观缓解或由临床医师或其它有资格的观察者所指出的客观上可以确认的改善。zsig37多肽的这种有效量将提供例如对胶原蛋白所激活的血小板激活和包括Clq的补体途径的抑制、增加患者脉管系统中的局部血流量、和/或降低缺血和再灌注的损伤性作用。zsig37多肽的有效量能够随着待治疗的疾病或症状而有相当大的变化。待施用的该多肽的量和其在药物制剂中的浓度取决于所选择的载体、施用途径、特定多肽的效能、患者的临床状况、负效应和药物制剂中化合物的稳定性。因此,临床医师将根据对于所针对的患者或相似患者的临床经验使用在制剂中含有适合浓度的合适制剂和施用的制剂量。这些量将部分取决于待治疗的具体疾病、患者的年龄、体重和一般健康情况、以及本领域技术人员所明了的其它因素。典型地,剂量范围在0.01-100mg/kg施用对象体重。在例如用球囊导管进行的应用中,典型剂量范围将为0.05-5mg/kg施用对象体重。特定化合物的剂量可以根据体外或离体研究并结合实验动物研究来决定。在体外或离体研究中发现有效的化合物浓度为动物研究提供了指导,在动物研究中对剂量进行计算以在作用位置提供相似浓度。
本发明进一步通过如下非限制性实施例进行阐述。
实施例1
EST序列的延伸
本发明的编码此新zsig37多肽的多核苷酸最初是通过如下步骤鉴定的:从EST数据库中选择一个EST,由此预测蛋白序列,并在已知序列数据库中搜索与基于此EST的预测蛋白质最同源的分泌蛋白。鉴定潜在编码与已知分泌蛋白具有生物学上有意义的同源性的蛋白质的EST用于进一步研究。发现一个EST序列,并预测其与脂肪细胞的特定蛋白质同源。见,例如Scherer等,J.Biol.Chem.270(45):26746-9,1995。为了鉴定相应的cDNA,对认为可能含有完整编码序列的克隆进行测序。使用Invitrogen S.N.A.P.TM Miniprep试剂盒(Invitrogen公司,San Diego,CA),根据厂商说明书,制备5ml生长在LB+50μg/ml氨苄青霉素中的过夜培养物。在ABIPRISMTM377型DNA测序仪(Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,Ct.)上,使用ABI PRISMTMDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒,根据厂商说明书对该模板进行测序。使用针对含有该克隆的载体上的SP6和T7启动子的寡核苷酸ZC695(SEQ ID NO:5)和ZC694(SEQ ID NO:6) 作为测序引物。使用寡核苷酸ZC13210(SEQ ID NO:7)、ZC13588(SEQ ID NO:8)、ZC13532(SEQ ID NO:9)、ZC13641(SEQ ID NO:10)、ZC13586(SEQ ID NO:11)、ZC13651(SEQ ID NO:12)、ZC13622(SEQ ID NO:13)、ZC13625(SEQ ID NO:14)、ZC13650(SEQ ID NO:15)、ZC13589(SEQ ID NO:16)、ZC13624(SEQ ID NO:17)、ZC13531(SEQ ID NO:18)、ZC13587(SEQ ID NO:19)、和ZC13623(SEQ ID NO:20)完成该克隆的序列测定。测序反应在Hybaid OnmiGene Temperature Cycling系统(National Labnet公司,Woodbridge,NY)中进行。采用SEQUENCHERTM3.0序列分析软件(GeneCodes公司,Ann Arbor,MI)进行数据分析。所获得的2769bp序列公开于SEQ ID NO:1中。最初来源的EST序列与SEQ ID NO:1所示序列的比较显示,有一个碱基对不确定(一个未知的“N”残基),没有碱基对插入,导致在该不确定碱基分辩时鉴定为亮氨酸,并且在这两个推导的氨基酸序列之间不存在移码。
实施例2
组织分布
使用Clontech(Palo Alto,CA)的人类多组织印迹(Human MultipleTissue Blots)进行Northern分析。使用T4多核苷酸激酶和正向反应缓冲液(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD),根据厂商说明书,用32P放射性标记针对SEQ ID NO:1中所示成熟蛋白质的核苷酸序列5’末端的30个碱基DNA探针(ZC12447;SEQ ID NO:4)。采用NUCTRAP推进柱(StratageneCloning Systems,La Jolla,CA)纯化该探针。使用EXPTRSSHYB(Clontech,Palo Alto,CA)溶液进行预杂交,并作为Northern印迹的杂交溶液。杂交在50℃过夜进行,然后用2×SSC和0.1%SDS于室温洗涤该印迹,接着用1×SSC和0.1%SDS于68℃(大约低于解链温度5℃)进行洗涤。观察到一个大约2.8kb长度的转录本。信号强度在心脏和胎盘最高,肾、卵巢、肾上腺和骨骼肌中相对较低,而在Nortehn印迹上存在的大多数其他组织中信号更低。
采用Gut Northern组织印迹进行其它Northern印迹分析。该印迹的制备采用了来自人类结肠直肠腺癌细胞系SW480(Clontech,Palo Alto,CA)、人类小肠组织(Clontech)、人类胃组织(Clonteeh)、人类肠平滑肌细胞系(Hism;ATCC号CRL-1692;美国典型培养物保藏中心,12301Parklawn Drive,Rockville,MD)、正常人结肠细胞系(FHC;ATCC号CRL-1831;美国典型培养物保藏中心)和人类正常胎儿小肠细胞系(FHs74Int.;ATCC号CCL241;美国典型培养物保藏中心)的mRNA。
通过酸性胍方法(Cheomczynski等,生物化学分析(Anal. Biochem.)162:156-9,1987),从Hism、FHC和FHs74 Int.分离总RNA。通过在保留polyA+RNA的柱子中洗脱总RNA,选择polyA+RNA(Aviv等,美国国家科学院院刊69:1408-12,1972)。每个样品的2μg polyA+RNA在1.5%琼脂糖凝胶上于2.2M甲醛和磷酸缓冲液中分离。将这些RNA转移至Nytran膜(Schleicher和Schuell,Keene,NH)上,于20×SSC中过夜。在UVStratalinker 2400(Stratagene,La Jolla,CA)中,以0.12焦耳处理该印迹。然后于80℃干烤该印迹一小时。
通过PCR扩增全长cDNA(显示于SEQ ID NO:1中),并采用Rediprimepellet试剂盒(Amersham,Arlington Heights,IL)以及32P dCTP,根据厂家说明书进行放射性标记。该印迹在EXPRESSHYB(Clontech)中于56℃杂交过夜。室温下在2×SSC和0.1%SDS中洗涤该印迹,然后在2×SSC和0.1%SDS中于65℃进行洗涤,最后在0.1×SSC和0.1%SDS中于65℃进行洗涤。结果显示,zsig37与除了人类肠平滑肌细胞系HISM之外的所有组织均发生杂交。
实施例3
zsig37基因的染色体作图
采用NIGMS人/鼠体细胞杂交作图2号系列(NIGMS Human/RodentSomatic Cell Hybrid Mapping Pannel No.2)(National Institute ofGeneral Medical Sciences,Coriell Institute of Medical Research),通过PCR将zsig37作图定位在人第17号染色体17q25.2区。该系列由分离自24个人/鼠体细胞杂种的DNA组成,其中所述的每一个体细胞杂种均保留了一个特定的人类染色体和亲本DNA。对于zsig37基因的作图,在96孔微滴定板(Stratagen,La Jolla,CA)中设定20μl反应,并将其用于“RoboCycler Gradient 96”温度循环仪(Stratagene)中。该27个PCR反应的每一个均由2μl 10×KlenTaq PCR反应缓冲液(Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)、1.6μl dNTP混合物(每种2.5mM,PERKIN-ELMER,Foster City,CA)、lμl有义引物(SEQ ID NO:21)、1μl反义引物(SEQ ID NO:22)、2μl RediLoad(Research Genetics,Inc.)、0.4μl 50×Advantage KlenTaq聚合酶混合物(Clontech Laboratories,Inc.)、25ng来自单个杂种克隆或对照的DNA、以及ddH2O,总体积为20μl。该反应物用等量矿物油覆盖并密封。PCR循环仪的条件如下:起始一个循环95℃变性5分钟,之后35个循环,每个是95℃变性1分钟、60℃退火1分钟以及72℃延伸1.5分钟,接着最后1个循环72℃延伸7分钟。在3%NuSieve GTG琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts,Rockland,ME)上电泳分离该反应产物。
实施例4
哺乳动物表达载体zsig37NEE/pZP9和zsig37CEE/pZP9的构建
为zsig37多肽制备了两个表达载体,zsig37NEE/pZP9和zsig37CEE/pZP9,其中这些结构被设计来表达具有C-或N-端Glu-Glu标记的zsig37多肽。
zsig37NEE/pZP9
采用ZC15040(SEQ ID NO:24)和ZC15033(SEQ ID NO;25)作为PCR引物,以及以上实施例1中所述的模板,PCR产生一个800bp的zsig-37DNA片段。该PCR反应为:94℃孵育3分钟,然后94℃30秒、30℃ 20秒和72℃ 1分钟进行5个循环,之后94℃30秒、64℃ 20秒和72℃ 1分钟进行25个循环。接着72℃延伸5分钟。然后在0.9% TBE琼脂糖凝胶上于1×TBE缓冲液中电泳所获得的PCR产物。切下具有预计大小的条带,并用Qiaex II树脂(Qiagen)根据厂商说明书从该凝胶中纯化此DNA。用限制性酶Bam HI和Xba I消化该DNA,之后进行提取和沉淀。
将所切下的并经限制性消化的zsig37 DNA片段亚克隆至限制性酶BamHI和xba I消化过的质粒NEE/pZP9中。该zsig37NEE/pZP9表达载体整合了TPA前导序列,并在编码zsig37多肽的多核苷酸序列的N-端连有Glu-Glu标记(SEQ ID NO:26)。质粒NEE/pZP9(保藏在美国典型培养物保藏中心,12301 Parklawn Drive,Rockville,MD,ATCC 98668)是一个哺乳动物表达载体,其含有一个带有小鼠金属硫蛋白-1启动子、TPA前导肽、之后为一个编码Glu-Glu标记的序列(SEQ ID NO:26)、多个用以插入编码序列的限制性位点、以及一个人类生长激素终止子的表达盒。该质粒还含有一个大肠杆菌的复制原点、一个具有SV40启动子、增强子和复制原点、DHFR基因和SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单元。
zsig376CEE/pZP9
采用ZC15721(SEQ ID NO:27)和ZC15035(SEQ ID NO;28)作为PCR引物,根据以上提及的程序,PCR产生一个866bp的zsig-37 DNA片段。用限制性酶EcoR I和Bam HI消化纯化的该PCR片段,之后采用QiaexII树脂按以上所述方法进行凝胶纯化。
将所切下的并经限制性消化的zsig37 DNA片段亚克隆至限制性酶EcoR I和Bam HI消化过的质粒CEE/pZP9中。该zsig37CEE/pZP9表达载体采用了zsig37自身的信号肽,并在C-端连接Glu-Glu表位(SEQ IDNO:26)作为纯化的帮助物。质粒CEE/pZP9(保藏在美国典型培养物保藏中心,12301 Parklawn Drive,Rockyille,MD,ATCC 98668)是一个哺乳动物表达载体,其含有一个带有小鼠金属硫蛋白-1启动子、多个用以插入编码序列的限制性位点、一个编码Glu-Glu标记的序列(SEQ IDNO:26)、一个终止密码子以及一个人类生长激素终止子的表达盒。该质粒还含有一个大肠杆菌的复制原点、一个具有SV40启动子、增强予和复制原点、DHFR基因和SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单元。
对于该N-和C-标记的结构,将大约30ng限制性消化的插入片段和50ng相应的载体于室温连接4个小时。每个连接反应物各取1μl,根据厂商说明书电穿孔独立转化DH10B感受态细胞(GIBCO BRL,Gaithersburg,MD),之后铺在含有50mg/ml氨苄青霉素的LB平板上,并孵育过夜。
通过上面描述的PCR筛选菌落。对于zsig37NEE/pZP9和zsig37CEE/pZP9的筛选,引物是ZC13006(SEQ ID NO:29)和ZC13007(SEQ ID NO:20)。该PCR反应在94℃孵育2.5分钟,然后94℃10秒、58℃20秒和72℃1分钟进行25个循环。接着72℃延伸5分钟。通过测序分析验证阳性克隆的插入序列,对于zsig37NEE为1013bp片段,而对于zsig37CEE为一个950bp的片段。大量质粒制备采用QIAGENMaxiPrep试剂盒(Qiagen)根据厂商说明书进行。
实施例5
zsig37NEE和CEE多肽的转染和表达
将BHK 570细胞(ATCC CRL-10316)接种在10cm组织培养皿中,并于37℃,5%CO2条件下在DMEM/FBS培养基(DMEM、Gibco/BRL高葡萄糖(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)、5%胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)、2μML-谷氨酰胺(JRH Biosciences,Lenexa,KS)、1μM丙酮酸钠(GibcoBRL))中使其过夜生长至大约50-70%汇合。然后采用LipofectamineTM(Gibco BRL),在无血清(SF)培养基制剂(DMEM、Gibco/BRL高葡萄糖(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)、2mM L-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠盐、10μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素、10μg/ml胎球蛋白、和2ng/ml硒)中,用质粒zsig37NEE/pZP9(N-端Glu-Glu标记)或zsig37CEE/pZP9(C-端Glu-Glu标记)转染该细胞。在15ml管中将16μg zsig37NEE/pZP9和16μg zsig37CEE/pZP9分别稀释至最终总体积640μl的SF培养基中。在分开的管中,将35μl LipofectamineTM(Gibco BRL)与605μl SF培养基混合。向该DNA混合物加入LipofectamineTM混合物,并使其在室温孵育大约30分钟。向该DNA:LipofectamineTM混合物加入5ml SF培养基。用5ml SF培养基洗涤所述细胞一次,吸出,并加入该DNA:LipofectamineTM混合物。将该细胞在37℃孵育5小时,然后向此平板加入6.4mlDMEM/10%FBS、i%PSN培养基。37℃孵育该平板过夜,次日用新鲜的FBS/DMEM培养基替换掉该DNA:LipofectamineTM混合物。在转染后的第2天,在150mm平板中以1∶50、1∶100和1∶200的比例将细胞分开培养在选择培养基(含有1μM MTX的ESTRP#1)中。在转染后第5天用新鲜的选择培养基重新饲喂这些平板。筛选集落
大约在转染后10-12天,从每个转染中选出一个带有氨甲蝶呤抗性集落的150mm培养皿,吸出培养基,用10ml无血清ESTEP 2培养基(668.7g/50L DMEM(Gibco)、5.5g/50L丙酮酸的96%钠盐(Mallinckrodt)、185.0g/50L NaHCO3(Mallinckrodt)、25ml/50L的5.0mg/ml胰岛素、25ml/50L的10.0mg/ml转铁蛋白)洗涤该平板。吸去洗涤培养基,并更换成5ml无血清ESTEP 2。然后将预先浸泡过无血清ESTEP2的无菌Teflon网(Spectrum Medical Industries,Los Angeles,CA)放置在这些细胞上。然后将预先浸泡过无血清ESTEP 2的无菌硝酸纤维素滤膜放置在该网上。将硝酸纤维素上的定位标记转移到培养皿上。然后将这些平板在37℃,5%CO2孵育器中孵育5-6小时。孵育之后,取出滤膜,吸去培养基,并替换为DMEM/5%FBS、1×PSN(Gibco BRL)培养基。然后将此滤膜放在含有50ml缓冲液(25mM Tris,25mM甘氨酸,5mMβ-巯基乙醇)可密封的袋子中,并于65℃水浴中孵育10分钟。在10%脱脂奶粉/Western A缓冲液(Western A:50mM Tris pH7.4,5mM EDTA,0.05%NP-40,150mM NaCl和0.25%明胶)中于室温在摇床上封闭该滤膜15分钟。然后将该滤膜与1∶1000稀释的抗Glu-Glu抗体-HRP结合物在2.5%脱脂奶粉/Western A缓冲液(Western A:50mM Tris pH7.4,5mM EDTA,0.05%NP-40,150mM NaCl和0.25%明胶)中4℃在摇床上孵育过夜。然后室温下在加有0.1%Tween 20的PBS中洗涤该滤膜3次,每次5-15分钟。用ECL试剂(Amersham公司,Arlington Heights,IL)根据厂商说明书对该滤膜进行显色,并对胶片(Hyperfilm ECL,Amersham)暴光大约5分钟。
将该胶片与含有集落的平板对齐。使用此胶片作为指导,选出适合的集落。将无菌3mm集落盘(PGC Scientific公司,Frederick,MD)浸泡在胰蛋白酶中,然后放在这些集落上。将每种结构各12个集落转移至96孔平板的200μl选择培养基中。对每个集落进行7次两倍的系列稀释。将这些细胞在37℃生长1周,此时选择目前处于最佳密度的接受了最低稀释度细胞的孔,胰蛋白酶消化,并将细胞转移至含有选择培养基的一个12孔平板中。同时用胰蛋白酶消化上述150mm培养皿,合并剩余的细胞,并用于Western分析和支原体检测。冷冻保存此细胞库。
直接从该12孔平板将这些克隆扩大培养在2个T-75三角瓶中。保留一个三角瓶以继续细胞的生长,将第二个三角瓶生长在无血清ESTEP 2中,收获该瓶的细胞用于Western印迹分析。基于western印迹分析选择每一种表达载体的克隆,将其合并,并转入大规模培养。
实施例7
zsig37CEE的大规模哺乳动物表达
将从上述表达程序获得的含有表达zsig37CEE的汇合细胞的一个T-162三角瓶,和含有zsig37NEE的一个三角瓶,每个扩大至4个T-162三角瓶。将所获得的4个三角瓶中的一个分装在4个冻存管中冻存,其余3个三角瓶用以产生一个Nunc细胞工厂。
来自zsig37CEE和zsigNEE的三个T-162三角瓶的细胞分别用于接种两个Nunc细胞工厂(10层,可从VWR购买获得)。简单地说,采用胰蛋白酶使来自上述T-162三角瓶的细胞解离,合并后加入预先加热至37℃的1.5升ESTEP1培养基(668.7g/50L DEME(Gibco)、5.5g/50L丙酮酸的96%钠盐(Mallinckrodt)、185.0g/50L NaHCO3(Mallinckrodt)、25ml/50L的5.0mg/ml胰岛素、25ml/50L的10.0mg/ml转铁蛋白(JRHBiosciences)、2.5L/50L(鉴定过的)胎牛血清(Hyclone)、1μMMTX,pH调节至7.05+/-0.05)中。然后将含有这些细胞的培养基通过漏斗倒入该Nunc细胞工厂。将这些细胞工厂置于37℃/5.0%CO2的孵育箱中。
在80-100%汇合时,对这些Nunc细胞工厂的内容物进行可视污染测试(酚红颜色改变)。由于没有观察到污染,将来自这些汇合工厂的上清液倒入一个小的收集容器中,取样后丢弃。然后用400ml PBS洗涤这些附着细胞一次。为了将这些细胞从这些工厂解离下来,每个加入100ml胰蛋白酶,然后除去,并在残余的胰蛋白酶中孵育这些细胞5-10分钟。用200ml ESTEP1培养基洗涤两次后收集这些细胞。向10个含有ESTEP1培养基的瓶子(每个1.5升,37℃)的每一个中加入40ml收集的细胞。然后用一个1.5升的瓶子供应一个Nunc工厂。将每个细胞工厂都置于37℃/5.0%CO2孵育器中。
在80-100%汇合时,对这些Nunc细胞工厂进行可视污染测试(酚红颜色改变)。由于没有观察到污染,将来自这些汇合工厂的上清液倒入一个小的收集容器中,取样后丢弃。然后用400ml PBS洗涤细胞一次。向每个Nunc细胞工厂加入1.5升ESTEP2培养基(668.7g/50L DEME(Gibco)、5.5g/50L丙酮酸的96%钠盐(Mallinckrodt)、185.0g/50LNaHCO3(Mallinckrodt)、25ml/50L的5.0mg/ml胰岛素、25ml/50L的10.0mg/ml转铁蛋白)。将这些细胞工厂孵育在37℃/5.0% CO2中。
大约48小时后,对这些Nunc细胞工厂进行可视污染测试(酚红颜色改变)。将每个工厂的上清液倒入小的收集容器中。向每个Nunc细胞工厂倒入新鲜的无血清培养基(1.5升),并在37℃/5.0% CO2中孵育这些工厂。将每种结构的1ml上清液收集物转移至显微镜载玻片上,并进行污染的显微镜分析。将每种结构的小收集容器中的内容物合并,并立即过滤。然后在48小时后基本上按以上所述进行第二次收集,之后丢弃这些细胞工厂。使用一个无菌组装的过滤系列装置进行收获上清液(条件培养基)的无菌过滤。安装如下:将导管用金属丝连接在一个Opti-Cap过滤器(Millipore公司,Bedford,MA)和一个Gelman Supercap 50过滤器(Gelman Sciences,Ann Arbor,MI)上。该Supercap 50过滤器还连有一个位于无菌工作台中的无菌带盖容器;位于该MilliporeOpti-cap过滤器上游的导管被插入一个蠕动泵中;并将该导管的游离末端放在大的收集容器中。该蠕动泵以200-300rpm的速率运行,直到所有的条件培养基都通过该0.22μm的最后一个过滤器进入无菌收集容器中为止。在纯化前将该过滤物置于4℃冷室中。用一个5kDA截断的Millipore浓缩器(Millipore公司,Bedford,MA),根据厂商说明书将该培养基浓缩10倍,并将其用于Western印迹分析,该分析中采用了抗-FLAG标记的抗体(Kodak)。
zsig37CEE:
5个T-162三角瓶=0.12mg/L,38kDa;
1个工厂,FBS=0.12mg/L,38kDa;
10个工厂,FBS=0.12mg/L,38kDa;
10个工厂(#1),SF=1.2mg/L,38kDa;和
10个工厂(#2),SF=3.56mg/L,38kDa
zsig37NEE:
5个T-162三角瓶=0.137mg/L,35kDa;
1个工厂,FBS=0.137mg/L,35kDa;
10个工厂,FBS=0.137mg/L,35kDa;
10个工厂(#1),SF=1.37mg/L,35kDa;和
10个工厂(#2),SF=4.11mg/L,35kDa。
实施例7
zsig37 NEE和zsig37 CEE的纯化
除非另行指出,所有操作均在4℃进行。采用以下程序纯化含有N-端或C-端Glu-Glu(EE)标记的zsig37。来自幼年仓鼠肾(BHK)细胞的总共25升条件培养基顺序通过一个4英寸0.2mM Millipore(Bedford,MA)OptiCap囊形过滤器以及一个0.2mM Gelman(Ann Arbor,MI)Supercap50进行过滤除菌。然后采用配有3000kDa截断的Amicon(Bedford,MA)S10Y3膜的Millipore ProFlux A30切线式流动浓缩器,将该物质浓缩成大约1.3升。再次用上述的Gleman过滤器过滤除菌该浓缩物。向该浓缩的条件培养基加入蛋白酶抑制剂混合物至终浓度为2.5mM乙二胺四乙酸(EDTA,Sigma Chemical公司,St.Louis,MO)、0.001mM亮抑酶肽(Boehringer-Mannheim,Indianapolis,IN)、0.001mM抑胃酶肽(Boehringer-Mannheim)和0.4mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)。向样品中加入按以下所述制备的25.0ml抗-EE Sepharose样品用于批量吸附,然后在Wheaton(Millville,NJ)转管培养装置上于4℃轻柔地搅拌该混合物18.0小时。
然后将该混合物倒入一个5.0×20.0cm Econo柱(Bio-Rad,Laboratories,Hercules,CA)中,然后用30个柱体积的磷酸缓冲盐(PBS)洗涤该凝胶。丢弃未保留的流过成分。一旦洗脱物在280nM的吸光值小于0.05之后,将过柱流速降低至零,并用2.0柱体积的含有0.4mg/ml EE肽(AnaSpec,San Jose,CA)的PBS分批洗涤该抗EESepharose凝胶。所用肽具有序列:Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp(SEQ IDNO:31)。4℃一小时后,恢复流动,并收集洗脱的蛋白质。该部分称为肽洗脱物。然后用2.0柱体积的0.1M甘氨酸(pH2.5)洗涤该抗-EESepharose胶,并单独地收集该甘氨酸洗涤物。通过加入小量体积的10×PBS将该甘氨酸洗脱组分的pH调节至7.0,并将其贮存在4℃,以便如果需要可以进行进一步分析。
使用具有15,000分子量截断值的膜浓缩器(Millipore,Bedford,MA)根据厂商说明书将该肽洗脱物浓缩至5.0ml。通过在PBS平衡过的1.5×50cm Sephadex G-50(Pharmacia,Piscataway,NJ)柱上采用BioCadSprint HPLC(PerSeptive BioSystems,Framingham,MA)以1.0ml/min的流速进行层析,将该浓缩的肽洗脱物与游离肽分离开。以2ml作为一个组分,进行收集,并监测280nM处的吸光度。收集在280nM处具有吸收并在柱子的外水体积附近洗脱的第一个峰物质。该组分是纯的zsig37NEE或zsig37CEE。按以上所述方法浓缩该纯物质,通过SDS-PAGE和Western印迹,使用抗-EE的抗体进行分析,并取样进行氨基酸分析和N-端测序。剩余的样品等分后,根据我们的标准程序贮存在-80℃。
在没有还原剂时zsig37 NEE在SDS-PAGE凝胶上的电泳显示为一条主要的考马斯亮蓝染色带,表观分子量为39,000kDa,以及几个分子量在60,000-116,000之间的次要成分。所有条带在Western印迹上均表现出与抗-EE抗体的交叉反应性。在存在还原剂时,仅观察到的条带是该39,000kDa蛋白质,而且其考马斯亮蓝染色强度增加。该条带在Western印迹上也显示出与抗-EE抗体的交叉反应性。
对于zsig37 CEE,在没有还原剂时在SDS-PAGE凝胶上的电泳显示为一条表观分子量为39,000的主要考马斯亮蓝染色带,以及几个分子量在60,000-116,000之间的次要成分。在Western印迹上,仅有表观分子量为150,000、116,000和60,000的条带表现出与抗-EE抗体的交叉反应性。在存在还原剂时,仅观察到39,000kDa的考马斯亮兰染色条带,而且该物质在Western印迹上表现出与抗-EE抗体的交叉反应性。在这些条件下,还观察到在150,000kDa处有小量的交叉反应物质。
抗-EE Sepharose的制备
采用500ml Nalgene 0.45微米过滤装置以含有0.02%叠氮化钠的100ml PBS洗涤100ml床体积的G蛋白质-Sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)3次。用6.0倍体积的200mM三乙醇胺pH8.2(TEA,Sigma,St.Louis,MO)洗涤该凝胶,然后加入等体积含有900mg抗体的EE抗体溶液。4℃孵育过夜后,用5倍体积的200mM前述TEA洗涤该树脂以去除未结合的抗体。将该树脂重悬在2倍体积的TEA中,并将其转移至适合的容器中,之后加入溶解在TEA中的dimethylpimilimidate-2HCl(Pierce,Rockford,IL)至终浓度为每ml胶36mg。室温摇动该凝胶45分钟,然后用上述的过滤装置除去液体。然后用5倍体积的溶解于200mMTEA中的20mM乙醇胺室温孵育该凝胶10分钟,以封闭凝胶上的非特异位点。用5倍体积含有0.02%叠氮化钠洗涤该凝胶,然后在该溶液中于4℃保存该凝胶。
实施例8
粘附和增殖分析
按如下所述分析zsig37刺激TF-1细胞粘附和铺展的能力。用PBS或ELISA包被缓冲液(0.1 M NaCO3)从C末端Glu-Glu-标记的zsig37制备从10-0.0625μg/ml的系列稀释,并将各种稀释以100μl/孔加至96孔板(Costar,Pleasanton,CA)中。将该板在37℃、5%CO2孵育2小时。然后用RPMI/10%FBS(RPMI 1640,2mML-谷氨酰胺、110μg/ml丙酮酸钠、PSN和10%热失活的胎牛血清)洗涤该板三次,使其封闭15分钟。
将TF-1细胞(获自急性粒细胞白血病细胞)在RPMI/10% FBS中重悬,并以10,000细胞/孔接种至zsig37CEE包被的96孔板,终体积为每孔120μl。将该板在37℃于5%CO2中孵育2小时。然后用PBS洗涤该板三次,每孔加入200μl生长培养基(RPMI/10%FBS,5ng/ml GM-CSF),在洗涤之前和之后对细胞进行微生物学检查。
还使用染料掺入实验基于比色分析的变化和荧光信号的增加定量测定粘附细胞的数目。向96孔板加入Alamar BlueTM(AccuMed,Chicago,IL),并将该细胞于37℃、5%CO2孵育过夜。然后用荧光计扫描培养板,激发光波长544nm,发射波长590nm。zsig37CEE-PBS包被的平板上比zsig37CEE-0.1M NaCO3包被的平板上有更多的粘附细胞。加入可溶性zsig37并不阻断细胞对结合的zsig37的粘附。
第二个分析采用TF-1、DA-1(来源于带有B-细胞淋巴瘤的小鼠淋巴结并通过在IL-3培养基中的过度生长产生的IL-3依赖性细胞系(由Dr.Kenneth Kaushansky,University of Washington,Seattle,WA提供))、前B细胞(p53+/-小鼠骨髓细胞,IL-7依赖性,B220+,低Thy1,Sca-1+)、和A7BaF-3细胞系,以5,000个细胞/孔的密度按如上所述进行。还以500个细胞/孔的密度接种了BHK细胞。zsig37增强了A7-BaF-3细胞的生长并轻微抑制DA-1细胞的生长。
实施例9
小鼠的直向同源序列
使用本发明的编码此人类新zsig37多肽的多核苷酸筛选小鼠的EST数据库以寻找同源的小鼠序列。针对该人类zsig37序列发现一个单一的EST序列,并对其进行了预测。为了鉴定相应的cDNA,将认为可能含有完整编码序列的克隆用于测序。采用Invitrogen S.N.A.P.TMMiniprep试剂盒(Invitrogen公司)根据厂商说明书,制备5ml生长于LB+50μg/ml氨苄青霉素中的过夜培养物。在ABIPRISMTM377型DNA测序仪(Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT)上,采用ABI PRISMTMBig Dye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(Perkin-Elmer公司),根据厂商说明书,对该模板进行测序。寡核苷酸ZC694(SEQ ID NO:6)、ZC6768(SEQ ID NO:32)、ZC18297(SEQ ID NO:33)、ZC18298(SEQID NO:34)、ZC18402(SEQ ID NO:35)、ZC18403(SEQ ID NO:36)、ZC18456(SEQ ID NO:37)、ZC18457(SEQ ID NO:38)、ZC18560(SEQID NO:39)、ZC18561(SEQ ID NO:40)、ZC18687(SEQ ID NO:41)和ZC18688(SEQ ID NO:42)用以完成该克隆的完整序列测定。测序反应在Hybaid OnmiGene Temperature Cycling系统(National Labnet公司,Woodbridge,NY)中进行。采用SEQUENCHERTM3.1序列分析软件(Gene Codes公司,Ann Arbor,MI)进行数据分析。所获得的2559bp序列公开于SEQ ID NO:43中,而推导的氨基酸序列公开于SEQ ID NO:44中。与人类zsig37核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的比对显示出在核苷酸水平上有77%的一致性。推测的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)与人类的多肽序列(SEQ ID NO:2)有77%的一致性。
实施例10
基于细胞的分析
在高处理量体外试验中分析zsig37多肽,以鉴定选择性激活永生化成骨细胞系中细胞应答的物质。来源于p53-/-(缺陷)小鼠的成熟成骨细胞系CCC4是经含有由诱导型血清反应元件(SRE)驱动表达的荧光素酶的质粒转染的,用于该测试试验。这些细胞还表达内源性PTH、PDGF和bFGF受体。CCC4细胞中SRE的激活以及由此导致的荧光素酶的表达指出,该化学物质很可能刺激了成骨细胞中的有丝分裂。
用胰蛋白酶消化CCC4细胞系,并在接种培养基(α-MEM、1%热失活胎牛血清、1mM丙酮酸钠和2mM L-谷氨酰胺)中将浓度调节至5×104个细胞/ml,并将其接种(200μl/孔)在Dynatech Microlite不透明白色微滴定板(Dynatech,Chantilly,VA)中,之后于37℃、5%CO2下孵育过夜。然后吸去该生长培养基,并更换成50μl/孔的测试培养基(F-12HAM、0.5%牛血清白蛋白、20mMHEPES、1mM丙酮酸钠和2mML-谷氨酰胺)。在测试培养基中对zsig37进行系列稀释(0.29-1000ng/ml的最终测试浓度),并加入孔中。对zsig37样品的测试重复三次。还使用血清(阴性)和bFGF(阳性)对照。bFGF的终浓度是3ng/ml。重复测试对照四次。将这些微滴定板于37℃、5%CO2下孵育4个小时。然后吸去该测试培养基,并用PBS洗涤这些微滴定板一次。然后向每个孔加入25μl裂解缓冲液(荧光素酶检测试剂,E1501,Promega公司,Madison,WI)。室温孵育这些微滴定板15分钟。加入50μl/孔的荧光素酶底物(荧光素酶检测试剂,E1501,Promega公司),然后采用LUMINOSKAN实验室系统以2秒/孔并紧接1秒延迟的速度检测荧光素酶的活性。从表5所示的所有读数终减去平均基础(未诱导)信号作为3ng/ml bFGF产生的最大诱导的百分数。
在该分析中zsig37刺激了荧光素酶的表达,这说明它们刺激了成骨细胞。zsig37在1000ng/ml的浓度时刺激达到最大值的73-75%。
为了确定zsig37是否是作为生长因子的模拟物,尤其是酪氨酸激酶受体的配体PDGF、bFGF和EGF(胰岛素-R阴性)的模拟物起作用的,进行一个生长因子对应模拟物分析。来源于Swiss 3T3小鼠的克隆细胞系Swiss 3T3是经含有由诱导型血清反应元件(SRE)驱动表达的荧光素酶的质粒转染的,用于该分析。这些细胞还表达内源性PMA、EGF和bFGF受体。Swiss 3T3细胞中SRE的激活和由此产生的荧光素酶的表达显示,该化学物质很可能模拟了PDGF、bFGF和EGF生长因子的活性。
按以上所述用胰蛋白酶消化Swiss 3T3细胞,在接种培养基中将浓度调节至5×104个细胞/ml,并进行接种和孵育。然后吸去该生长培养基,并更换成50μl/孔的测试培养基(F-12 HAM、0.5%牛血清白蛋白、20mMHEPES)。在测试培养基中对zsig37进行系列稀释(0.29-1000ng/ml的最终测试浓度),并加入孔中。对zsig37样品的测试重复三次。还使用了促进细胞增殖的血清(阴性)和bFGF(阳性)对照。bFGF的终浓度是3ng/ml。重复测试对照四次。将这些微滴定板于37C、5%CO2下孵育5个小时。然后吸去该测试培养基,并用PBS洗涤这些微滴定板一次。然后向每个孔加入25μl裂解缓冲液(荧光素酶检测试剂,E1501,Promega公司,Madison,WI)。室温孵育这些微滴定板15分钟。加入40μl/孔的荧光素酶底物(荧光素酶检测试剂,E1501,Promega公司),然后采用LUMINOSKAN实验室系统以2秒/孔并紧接1秒延迟的速度检测该荧光素酶的活性。从以3ng/ml bFGF产生的最大诱导的百分数表示的所有读数中已减去平均基础(未诱导)信号。用bFGF、DDGF、EGF或PMA对该细胞系进行的5小时处理导致了25-50倍的SRE-荧光素酶诱导表达。
zsig37在该分析中没有表现出对荧光素酶表达的刺激。zsig37在1000ng/ml的浓度时刺激达到最大值的0.2-0.1%。
实施例10
通过腺病毒递送进行zsig37的体内给药
对大约12周龄的24只雄性和24只雌性C57B16/J小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,ME)称重,测量体温并在注射前4天(第-4至-1天)每天监测其食物的摄取。在第0天,将这些小鼠分成3组,通过尾部静脉注射接受0.1ml病毒(AdV-空1.8×1011个病毒颗粒/0.1ml或AdV-zsig37-CEE 5×1011个病毒颗粒/0.1ml),或者是根本不接受注射。注射应导致宿主肝部感染,并且病毒所递送的基因的表达应在24个小时内开始并持续1-4周。对这三组小鼠进行测试。组1,未处理,n=雌雄各8只。组2,AdV-空(空病毒),n=雌雄各8只。组3,AdV-zsig37 CEE,n=雌雄各8只。
在三周的研究期间中对这些动物的体温、体重和摄取的食物量进行监测。在各组间未发现有差异。
在第21天,通过断颈以无痛方式处死雌性小鼠,在第22天,同样处死雄性小鼠。抽取动物的血液并收获组织用于尸检。
在处死时进行了标准的血清化学检测。肝、肾和代谢参数均处于正常范围。然而zsig37处理组和空病毒处理组之间有差异。zsig37动物相对空病毒对照有较高的平均高脂血指数。然而该差异并不显著,需要进一步的研究来证实。对来自每个动物的剩余血清进行总游离脂肪酸的分析。在接受空病毒的雄性小鼠(p=0.0379)和接受编码zsig37的病毒的雄性小鼠之间观察到血清游离脂肪酸水平上具有统计学显著意义的差异;zsig37小鼠具有较高的水平。在雌性小鼠中也观察到差异(p=0.3357),尽管该差异不具有统计学显著意义。肝、脾、肾、胸腺、心脏和脑在取出后进行了称重。在处理组之间未发现差异。这些组织和骨髓的组织病理学分析显示在这些处理组之间没有差异。
为了验证以上结果,按以上方法采用以下改动进行了第二次检查。检测了三个组:a)未进行处理并禁食,b)Adv-空并禁食,c)AdV-zsig37-CEE并禁食,这三个组包含20只C57B16/J,雌雄各10只。将这些小鼠禁食过夜,然后收集100μl血清以确立如下参数的基础水平:禁食时的葡萄糖、TP、碱性磷酸酶、胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸和胰岛素。每周三次称取体重。在第0天,从尾外侧静脉中向小鼠注射0.1ml适合的病毒溶液。在过夜禁食后第17天收集血液。3周后,处死小鼠并收集所有血液。一部分血液与EDTA混合以观察CBC’s,剩余的按以上所述进行再次测试和检查。收集器官并保存尸体用于组织病理学分析。
实施例11
主动脉环的血管舒张
根据Dainty等(药理学杂志(J.Pharmacol.)100:767,1990)和Rhee等(Neurotox.16:179,1995)的程序测定zsig37对主动脉环血管舒张的影响。简单地说,从4月龄Sprague Dawley大鼠中取出长度4mm的主动脉环,将其放置在修饰的Krebs溶液(118.5mM NaCl,4.6mM KCl,1.2mM MgSO4·7H2O,1.2mM KH2PO4,2.5mM CaCl2·2H2O,24.8mM NaHCO3和10mM葡萄糖)中。然后将这些环附着在等长力量传感器(Radnoti公司,Monrovia,CA)上,并用Ponemah生理学平台(Gould Instrument systems公司,Valley View,OH)记录数据,然后将其置于10ml组织浴槽充氧(95%O2,5%CO2)的修饰Krebs溶液中。将这些组织调节至1克静息张力并使其在测试之前稳定一小时。通过加入5μl 1×10-7M的去甲肾上腺素(Sigma公司,St.Louis,MO)至终浓度大约1×10-9M测试该环,并通过加入终浓度为2×10-7M的氨甲酰胆碱(一种毒蕈碱性乙酰胆碱拮抗剂)(Sigma公司)测试该环的完整性。在每次测试之后,用新鲜的缓冲液洗涤该环三次,两次洗涤之间间隔5分钟,并且使其搁置一个小时。为了测试血管舒张,使这些环收缩至2克,并稳定15分钟。然后向4个浴槽的1、2或3个加入zsig37,但不要冲入,记录每个环上的张力并与对照环进行比较。然后按以上所述用去甲肾上腺素检测这些环的收缩。在323、162和81ng/ml zsig37时检测环,但不能确定剂量反应。为了评价这些数据的统计学显著性,在所有的zsig37和对照环上采用膨胀度作为行列式(determinant)进行列联检验。用zsig37测试的12个环中的10个与7个对照中的2个发生了血管舒张。Fisher确切P值为0.045。结论是在去甲肾上腺引起收缩的主动脉环中zsig37诱导了血管舒张。
实施例12
zsig37与基质蛋白质的结合
采用ELISA(酶联免疫吸附分析)测定zsig37与各种基质蛋白质和补体Clq的结合。所用的基质蛋白质是牛I型胶原蛋白(Becton Dickinson,Lincoln Park,NJ)、层粘连蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白、人II、III、IV、V、VI型胶原蛋白(Chemicon International,Temecula,CA)。BSAV(Sigma公司)用作阴性对照。临用之前,将这些蛋白质在2×PBS(磷酸缓冲盐,Sigma公司)中稀释至100μg/ml,并用0.1N NaOH调节pH至7.2。每种蛋白样品一式四份接种在96孔板中(100μl/孔)。使该板在层流超净台中干燥过夜,然后用400μl 1×PBS中的5mg/ml BSA洗涤3次,用吸水纸吸干。根据厂家说明书(Pierce,Rockford,IL)对zsig37进行FITC标记。向每孔加入100μl溶于5%BSA、PBS的1.8μg/mlzsig37-FITC。将这些板在室温孵育1.5小时,然后用5%BSA、PBS洗涤3次。向每孔加入100μl 1∶400小鼠抗FITC/生物素(Sigma公司)。室温孵育这些板1.5小时,之后用5%BSA、PBS洗涤3次。然后将该板与100μl 1∶1000链霉亲和素/HRP(Amersham,Piscataway,NJ)一起孵育1小时,并用5%BSA、PBS洗涤3次。然后采用SupersignalUltra(Pierce,Rockford,IL)根据厂商说明书对这些板进行显色。反应1分钟后,倒转该板以从该板除去剩余的液体并轻拍使其干燥。将该板对X-射线胶片(Kodak,Rochester,纽约)爆光。
该检查的结果显示,仅有纤连蛋白和I、II、III、V和VI型胶原蛋白与zsig37-FITC显著结合。在层粘连蛋白、玻连蛋白、IV型胶原蛋白或BSA对照中均未观察到这种结合。
实施例13
zsig37与VI型胶原蛋白结合的特异性
对实施例12中所述的用于检测结合的ELISA分析进行修改以定量地对结合进行评价。按以上所述的方法使范围在0.4-4μg/ml的zsig37-FITC与10μg VI型胶原蛋白(Chemicon International)结合。在Wallac1420平板读数器(Wallac,Gaithersburg MD)上读出Supersignal试剂发出的荧光,其强度用作与ELISA板结合的zsig37-FITC的定量测量。
zsig37与VI型胶原蛋白的结合符合典型的结合双曲线(图3a)。通过加入0.8-8μg/ml的未标记zsig37能够竞争掉以0.4μg/ml铺板的zsig37-FITC与胶原蛋白的结合(图3b)。这些数据显示,该结合对于VI型胶原蛋白上的域是特异的并且是浓度依赖性的。
实施例14
zsig37与补体Clq的结合
通过以上描述的实施例13中的方法,显示出0.2μg/ml的zsig37-FITC可以与0.1-10μg/ml的补体Clq(Sigma公司)结合(图4)。结合的量是浓度依赖的并且是可饱和的。
实施例15
zsig37对补体的抑制
在96孔圆形底板中进行补体分析。将含有镁和钙的明胶佛罗那缓冲液(Veronal buffer)(141mM NaCl,1.8mM巴比妥钠,3.1mM巴比妥酸,0.1%牛明胶,0.5mM MgCl2和0.15mM CaCl2)用于所有血清和抑制剂稀释液以及红细胞悬浮液。50μl标准化的人补体血清(Sigma公司)按1/37.5进行稀释(最终稀释度为1/150),之后将其加入每个孔。抑制剂一式三份按50μl/孔加入。将该血清和抑制剂室温孵育30分钟。通过加入100μl2×108/ml未致敏的绵羊红细胞(Colorado Serum公司,Denver,CO)、致敏的绵羊红细胞(致敏采用溶血素厂商的操作指南(BioWhittaker公司,Walkersville,MD)进行)、以及含有16mM EGTA和4mM Mg++的兔红细胞,起始该分析。还接种了1/50-1/400的人血清系列稀释物作为活性对照。红细胞用蒸馏水裂解并稀释至100%、75%、50%、25%和12.5%溶解,然后将此红细胞用于量化补体的溶解百分数。密封该板并将其于37℃孵育1小时,并每隔15分钟混合一次。加入20μl/孔的22mM EDTA,终止该反应,并以1500×G离心该板10分钟。从每孔取出100μl的上清液并将其转移至96孔平底板中用于分析。在415nm对该板进行读数,并计算溶解百分数。
对于致敏和未致敏绵羊红细胞,zsig37均有效地抑制了经典途径(图5)。用兔红细胞和EGTA测试的另一个途径没有明显的抑制。抑制的机制还未确定,但由于Clq结合zsig37,C1是最可能的靶标。
实施例16
zsig37对血小板的胶原蛋白激活的抑制
从健康志愿者抽取血液,放入含有柠檬酸钠的管中置于室温,并在抽取的4小时内使用。采用Chrono-Log 560A全血Lumi-Aggregometer(Chrono-Log公司,Haverton,PA)根据厂家说明书分析全血的血小板激活。对于每个测试点,向含有搅拌棒和500μl含0-20μg/ml浓度zsig37的等渗盐水的反应管中加入500μl血液。孵育此混合物4分钟,之后向此血液/zsig37混合物中加入5μl 1mg/ml交联的胶原蛋白(Chrono-Log公司),起始血小板的激活。以相似方式检测ADP(终浓度10μm)和凝血酶(终浓度1U/ml)对激活的抑制。
zsig37对胶原蛋白介导的血小板激活的抑制表现出在5-20μg/ml之间的剂量依赖关系(图6a)。该抑制对于胶原蛋白激活具有选择性,而且对于ADP或凝血酶刺激的激活没有作用(图6b)。胶原蛋白激活并不被另一种补体Clq相关蛋白质zsig39所抑制(同时待审的美国专利申请09/140,804)。
实施例17
zsig37对SK5成纤维细胞生长的刺激
按100μl/孔将人纤连蛋白(25μg/ml,GIBCO BRL,Gaithersburg,MD)铺在96孔板(Costar,Pleasanton,CA)中,并使其在层流超净台中干燥过夜。将存在于含有10%胎牛血清-低内毒素(Hyclone,Logan,UT)的DMEM(Gibco)中的人SK5成纤维细胞以5000细胞/孔接种在纤连蛋白包被的平板中,于37℃、5%CO2下孵育2-3天。将每个平板的细胞数目调节到不产生汇合。然后用无血清DMEM高蔗糖(Gibco)洗涤细胞两次,并通过在无血清DMEM高蔗糖生长24小时造成细胞的血清饥饿。将100μlDMEM中的zsig37一式三份加入孔中,浓度为312.2ng/ml至10,000ng/ml。然后将这些细胞于37℃、5%CO2下孵育48小时。向每孔加入15μl MTT染料溶液(CellTiter96TM试剂盒,Promega),测试细胞增殖。将培养板于37℃、5%CO2孵育4小时,并根据生产商的说明书用Solublization/Stop溶液(CellTiter96TM试剂盒,Promega)终止反应。将培养板孵育1小时以溶解甲结晶,使用ELISA培养板读数仪在570nm处测定吸光度,以650nm处作为参照。
结果(图7)显示,在被测的zsig37浓度范围内,SK5成纤维细胞数呈剂量依赖性增加。这些浓度处于观察到纤维蛋白原b链的促有丝分裂效果(Gray等,Am J.Respir.Cell Mol.Biol.12,684,1995和Gray等,J.Biol.Chem.270,26602,1995)和成纤维细胞与接种的Clq粘附(Bordin和Ghebrehiwet,免疫学杂志(J.Immun.)145:2520,1990)的数值范围之内,这两者均被认为与细胞表面的钙网蛋白相互作用。
实施例18
zsig37抗血清的制备
用从BHK细胞纯化的zsig37-CEE免疫两只雌性新西兰白兔,以制备兔多克隆抗血清。用戊二醛将该蛋白质与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联。给每只兔子最初腹膜内注射200μg包含在完全弗氏佐剂中的肽,之后每三周腹膜内加强注射100μg包含在不完全弗氏佐剂中的肽。第二次加强注射给药之后7-10天,抽取动物的血液,并收集血清。然后每三周对动物加强免疫并取血。
实施例19
在组织中检测FITC标记的zsig37蛋白质的结合
按如下所述在组织中检测FITC标记的zsig37蛋白质的结合:
从商业途径(即,DAKO公司,Carpinteria,CA;BioGenex,San Ramon,CA;Novagen,Madison,WI;和Biomeda,Foster City,CA)或自制获得经石蜡包埋和切片于载玻片上的人类组织或小鼠胚胎。该人类组织切片包括肾上腺、脑、心脏、小肠、大肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、前列腺、脾、胃、睾丸、甲状腺和子宫。小鼠胚胎切片来自第16天阶段的小鼠胚胎。
采用标准条件:二甲苯中3×5分钟、100%的乙醇(EtOH)中4分钟、100%EtOH中3分钟和95%EtOH中2分钟,对这些组织切片进行脱蜡。然后根据厂家说明书(DAKO公司)在94℃对这些组织切片进行20分钟的抗原重现,之后进行20分钟的0.01%胃蛋白酶/0.2N HCl消化。在dH2O中洗涤组织切片两次,在PBS/0.05%Tween20(Sigma,St.Louis,MO)缓冲液中洗涤一次,然后用1×PBS/5%BSA/5%脱脂奶粉(Carnation,LosAngeles,CA)进行45分钟封闭。接着根据厂家说明书(VectorLaboratories,Inc.,Burlingame,CA)完成抗生物素蛋白/生物素封闭步骤。在1×PBS/0.05%Tween20缓冲液中洗涤这些组织切片3次,然后与PBS/5%BSA中的适合浓度的FITC标记zsig37蛋白质一起孵育45-60分钟。在1×PBS/0.05%Tween20中3次洗涤这些组织切片后,将其与抗FITC(mo)MAb生物素偶联物(Sigma)的1∶400稀释物一起孵育30-60分钟,在PBS/0.05%Tween20中洗涤3次,之后与链霉亲和素-FITC(NENLife Science Products,Boston,MA)的1∶500稀释物一起孵育30-60分钟,接着在1×PBS/0.05%Tween20中洗涤2次,在无Tween20的1×PBS中洗涤1次。然后将这些组织切片用含有0.5μg/ml复染剂碘化丙锭的抗退色介质封固。
在所研究的大多数人类组织和胚胎切片中观察到血管壁和细纤维结缔组织例如胶原性基质有显著的结合。
实施例20
兔颈动脉损伤模型中的zsig37
在修饰的兔颈动脉损伤模型(Folts等,血液循环(Circulation)79:116-24,1989;和Golino等,血栓形成和止血(Thrombosis andHaemostasis)67:302-5,1992)中施用zsig37,以确定在防止压伤后血管闭塞方面所提供的保护程度。
将34只大约3-6月龄的雄性新西兰白兔(R&R Rabbitry,Stanwood,WA)分成两组。15只兔子接受剂量范围在2-13.5μg/kg的zsig37,19只对照兔注射PBS或等量的PBS或zsig39(另一种脂肪细胞补体相关蛋白质(WO99/10492))。用氯胺酮(50mg/kg,IM)麻醉兔子,并在研究的持续时间内维持氟烷吸入麻醉。刮去耳和颈的毛发,并将血管用导管放入耳缘静脉中用于IV支持。在颈部沿中线切开,并接近颈动脉。通过钝器解剖与周围组织分开以暴露接近内/外杈的大约5cm颈总动脉,烧灼任何可见的侧分支。将血流量探测器(Transonic Systems,Inc.,Ithaca,NY)置于预期的损伤位置的远端,并确立基线血流量。然后采用无损伤血管钳将2.5-3.0cm的血管段与血循环分开。在除去该血管段的血液之后,采用30G针头向该空血管段中注射0.4ml 0.9%氯化钠中的zsig37或0.4ml 0.9%氯化钠(对照)。静置该血管5分钟,作为损伤前处理。然后采用保护性止血钳在该血管段的中部造成一个1.0cm的压伤,并保持10分钟。然后除去血管钳,重新建立血液流动。持续监测血流量60分钟,之后无痛处死兔子并切出血管进行组织学分析。
在这些浓度时未观察到剂量依赖性。在非配对t-检验中,所有zsig37剂量的梅塔分析导致开放时间(time patent)比对照显著增加(P=0.019)。
对于阴性对照动物构成的组合组,由血流记录图确定的开放时间的平均百分数为13.5%,标准误为±1.7%。对于组合的zsig37处理动物组,由血流记录图确定的开放时间的平均百分数为37.2%,标准误为±10.3%。
在第二个系列实验中,将荧光素化zsig37用于该损伤颈动脉模型。按上述方法麻醉雄性新西兰白兔。通过在颈部切开,暴露出颈动脉,并将大约5cm的血管与周围连接组织分开。将该分离段的血液排出,之后加上无损伤血管钳。采用30g针头向该分离段中注射大约0.05ml荧光素化zsig37(浓度100μg/ml),以完全充满该血管。暴露5分钟之后,损伤该血管并继续再暴露110分钟,之后除去钳子,重新建立血流。按以上所述在血流重建后1、10和60分钟无痛处死动物,收集血管并用甲醛固定用于组织学评价。
标记的zsig37偏好与损伤血管中膜内的受体结合。标记的zsig37不与未损伤的血管区域结合。血管收集前的血流时间似乎不影响与组织结合的zsig37的量,即在1分钟和60分钟收集时间点之间与组织结合的标记zsig37的量没有差异。这可能暗示了zsig37与损伤血管的紧密结合,而且不会被重建的血流冲开。
我们还在兔髂动脉压伤/狭窄模型中评价了血管损伤后zsig37对血流动力学的影响。按上述方法麻醉年轻成年雄性新西兰白兔。通过在腹部切开,暴露出主动脉髂动脉杈,使每根髂动脉与周围组织分开,并连接主要分支。给每根髂动脉配备一个超声血流量探测器以监测通过该血管的血流。基于血流数据,选择一根髂动脉用于损伤,另一根插入导管用于递送测试样品。按剂量将兔子分组,每组6只动物。含有zsig37的测试样品剂量在所选的输注期间内以半对数增加方式从3μg/kg增加至1000μg/kg。起始该测试样品的输注后,构建一个临界狭窄以降低大约50%的通过该血管的血流量。在该狭窄形成和血流量稳定期之后,通过在平滑持针钳的夹子中挤压血管使其损伤。损伤后持续输注一段时间(10-20分钟)。损伤后对通过该损伤血管的血流进行60分钟监测。在该研究期结束之后,无痛处死动物。收集腹主动脉的较低部分和每根髂动脉,甲醛固定后用于组织学评价。
由血流记录图确定的血流参数包括狭窄后的平均流量、损伤后的平均流量、和血管保持开放的时间。该数据提示,60分钟期间内,随着剂量增加至300μg/kg,zsig37具有促进开放时间增加的倾向。
实施例21
对5-羟色胺诱导的大鼠主动脉环收缩的舒张
用CO2轻微麻醉大约3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠,然后断头处死。快速取出胸主动脉,并置于修饰的Kreb’s-Henseleit缓冲液(118.2mMNaCl,4.6mM KCl,2.5mM CaCl2,1.2mM MgSO4,24.8mM NaHCO3,1.2mMKH2PO4和10.0mM葡萄糖)中。丢弃主动脉的粗糙末端后,从每只大鼠切出4个2-3mm的主动脉环段。一些实验中,在切下环段之前沿着一个21G针头摩擦主动脉的内腔使内皮裸露出来。在确定zsig27的浓度依赖反应之前,通过加入乙酰胆碱类似物氨甲酰胆碱验证内皮的裸露。在没有内皮的情况下,氨甲酰胆碱不能使收缩的血管环段发生血管舒张。
固定这些环并将其与压力位移传感器(force displacementtransducers)连接,该装置放置在充氧的(95%O2,5%CO2)具套箱的玻璃器官浴槽中,该浴槽中是修饰的Kreb’s-Henseleit缓冲液(pH7.4),并保持在30℃。将静息张力设为1gm,并在1小时的孵育期中不断重新调节至1gm。在余下的孵育期中每15分钟向该浴槽中加入新鲜的充氧的修饰Kreb’s-Henseleit缓冲液。1小时孵育结束之后,加入10uM 5-羟色胺以使该环段收缩。达到最大收缩后,即在加入5-羟色胺后大约15-20分钟,绘制zsig37的累积浓度反应曲线。向5ml浴槽中加入5至150μl的zsig37,终浓度从1ng/ml至高达40μg/ml。在浓度反应结束后加入毛喉素(2.5μM或25μM)或硝化甘油(22μM),验证这些环部分的生活力。
在有和没有完整内皮的情况下,zsig37的加入均诱导了5-羟色胺收缩的大鼠主动脉段的浓度依赖性血管舒张。相应zsig37的舒张首先在高于100ng/ml的浓度下观察到。在向浴槽加入每种浓度的zsig37之后大约30-60秒观察到血管舒张,在加入zsig37后3-5分钟内舒张反应达到平台。针对zsig37的该舒张反应的特征显示,该血管舒张是一个受体-第二信使介导的事件。此外,zsig37使内皮裸露的主动脉段发生血管舒张的能力提示,zsig37直接对平滑肌细胞作用以引发该血管舒张反应。
实施例22
采用原位杂交鉴定表达zsig37受体的细胞
分离特定的人类组织,然后通过原位杂交鉴定zsig37的表达。制备、切片并用于原位杂交的各种人类组织包括主动脉、耳、淋巴结、胎盘、前列腺、唾液腺、皮肤和睾丸。将这些组织在10%的缓冲甲醛溶液(Surgipath,Richmond,IL)中固定,并包埋在parapalst X-tra(OxfordScientific,St.Louis,MO)中,用Reichart-Jung 2050显微切片机(Leica Instruments GmbH,Nussloch,德国)以5μM切片。将组织切成4-8微米。组织采用标准操作(“非同位素原位杂交的开发”,Laboratory of Experimental Pathology,National Institute ofEnviromental Health Sciences,Research Park Triangle,NC)制备。简单地说,用HistoClear(National Diagnostics,Atlanta,GA)对组织切片进行脱蜡,然后用乙醇脱水。接着用蛋白酶K(50μg/ml)(Boehringer Mannheim,Indinanapolis,IN)于37℃消化切片2-20分钟。该步骤之后对组织进行乙酰化和再水化。
PCR产生的三种原位探针是针对人的zsig37序列设计的。设计了两套寡核苷酸引物以产生用于zsig37 cDNA不同区域的探针:(1)寡核苷酸ZC23,689(SEQ ID NO:45)和ZC23,694(SEQ ID NO:46)用于产生一个zsig37的414bp探针;(2)ZC23,703(SEQ ID NO:47)和ZC23,697(SEQ IDNO:48)用于产生一个zsig37的896bp探针;(3)ZC24,441(SEQ ID NO:49)和ZC24,442(SEQ ID NO:50)用于产生一个zsig37的290bp探针。每一套的反义寡聚物还包含T7 RNA聚合酶启动子的工作序列以允许从这些产物简单地转录出反义RNA探针。通过Qiagen离心柱(Qiagen公司,Chatsworth,CA)纯化这些PCR产物,之后进行酚/氯仿提取和乙醇沉淀。随后用地高辛配基(Boehringer)或生物素(Boehringer)以及体外转录系统(Promega公司,Madison,WI)根据厂家说明书标记探针。
原位杂交采用上述地高辛配基-或生物素标记的zsig37探针进行。向载玻片加上探针,浓度为1-5pmol/ml,并在50-60℃孵育12-16小时。随后在2×SSC和0.1×SSC中于50-55℃洗涤载玻片。随后再在2×SSC和0.1×SSC中于50-55℃洗涤载玻片。采用tyramide信号扩增法(TSA原位间接试剂盒,NEN,Boston,MA)放大信号,并用Vector Red底物试剂盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA)根据厂家说明书显色。然后用苏木精(Vector Laboratories)对这些载玻片进行复染。
在人主动脉、心脏、前列腺、唾液腺和睾丸中观察到阳性信号。阳性染色细胞表现为主动脉周围外膜内小直径血管的内皮细胞、覆盖在心外膜外的间皮细胞、唾液腺的腺泡细胞和分散的单核细胞、胎盘的滋养层、前列腺的上皮细胞和睾丸生精小管的复层上皮。
实施例23
zsig37的SEC-MALLS分析
zsig37含有一个N端胶原蛋白样结构域和一个C端球形区,与肿瘤坏死因子家族具有同源性,而且与其它此类蛋白质一样,zsig37被认为可以多聚化。采用ESI离子阱质谱仪(Finnigan Matt,San Jose,CA)对纯化的zsig37的分析显示,存在近似三聚体和九聚体的种类,与其它同源性蛋白质相比较这是一个未预料到的结果。采用LC-MS/MS在ESI-离子阱质谱仪(Finnigan Matt)上对zsig37进行的肽作图揭示,有几个半胱氨酸残基被S-半胱氨酰基所修饰。可能是,发酵过程中培养基内游离半胱氨酸对zsig37蛋白中关键性半胱氨酸残基的修饰,防止了该分子以正确的寡聚体形式联结。
为了获得更多的了解,采用Biosep S-300的大小排阻层析柱以1.0ml/分钟的速度(7.8×3000mm;Phenomenex,Torrance,CA)在HP 1050 HPLC(Hewlett Packard,Heidleberg,德国)上比较还原和非还原zsig37。该HP 1050与光散射和折射率探测器miniDAWN和Optilab DSP(WayttTechnology,Santa Barbara,CA)偶联用于即时SEC-MALLS。
将1毫克重组zsig37(1.0mg/ml)加入TCEP中,TCEP与zsig37的比为10∶1mol/mol,室温保持70分钟。注入60μl还原的zsig37用于SEC-MALLS分析,剩余的还原zsig37在0.5-3.0ml Slide-A-Lyzer盒,10K MWCO(Pierce,Rockford,IL)中对PBS(pH7.4)透析,透析过程伴随搅拌并按如下所述更换三次缓冲液:1升PBS室温4小时,1升PBS 4℃过夜,然后1升PBS室温4小时。
透析后,允许在4℃继续氧化。通过对三个时间点所采取的等分试样的SEC-MALLS分析监测氧化,所述三个时间点是T=0小时、T=24小时和T=96小时。采用LS-RI二探测器法确定分子量的值。
对还原的透析重组zsig37的分析一开始似乎就暗示了六聚体和十八聚体的形成,正如SEC-MALLS所检测到的情况,这也更符合在同系物中观察到的寡聚体状态。这些形式在体外分析中也是有活性的。
实施例24
zsig37与单核细胞的结合
从冰冻的外周血采集产品,采用正选择方法用Miltenyi珠(MiltenyiBiotec Auburn,CA)分离CD14阳性单核细胞。纯化的细胞通过FACS染色有80%的为CD14阳性。将细胞重悬在RPMI+10%胎牛血清(FBS)中,浓度为1×106细胞/ml,然后接种在100mm的组织培养皿中,5ml/板。加入重组人γ干扰素至100ng/ml,并将这些细胞在5%CO2、37℃下孵育48小时。
通过非酶学方法用EDTA从这些培养板刮下细胞,离心浓缩后重悬在FACS染色缓冲液中,以500,000个细胞/管等分用于染色。用在γ干扰素中放置了48小时的相同采集产品,进行再一次CD14筛选,获得未活化的细胞。将这些细胞孵育在不同浓度的生物素化zsig37中,之后孵育在链霉亲和素PE中。所有封闭采用“冰冷的”zsig37在冰上30分钟进行。通过在FACS缓冲液中洗涤一次除去未结合的蛋白质。采用FACS测定装置(Becton Dickinson,Lincoln Park,NJ)测定结合的数量,并用仅作为对照的二抗以上的信号表示。γ干扰素处理的细胞中ICAM-1表示的大约1个log增加,验证了单核细胞的激活。
在激活和未激活的单核细胞中均观察到zsig37的结合,在γ干扰素处理的细胞中观察到zsig37结合的增加。可以检测到低至1.5μg/ml的结合,这是所测试的最低浓度。在15μg/ml,激活细胞中结合大约增加4倍。仅当用70倍过量的“冷”zsig37进行预处理时,在激活的细胞中观察到结合的轻微(大约10%)降低。激活的单核细胞中zsig37结合的增加暗示了炎症细胞因子引起了单核细胞上zsig37结合蛋白/受体的上调。这可能潜在地导致了在单核细胞的噬菌作用、微生物杀伤和细胞的细胞毒性中涉及到zsig37。在培养两天后,培养物中存在有巨噬细胞,而且zsig37可以偏好与该亚类细胞结合。没有可以获得的良好巨噬细胞标志以确定这种情况是否正在发生。zsig37还与小鼠单核细胞/巨噬细胞系RAW264.7(ATCC CRL 2278)结合,说明其具有巨噬细胞特异性。
从前文,应当理解,尽管本文为了阐述的目的对本发明的具体实施方案进行了描述,但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此,本发明除了受到所附权利要求的限制外不受其它限制。
Claims (66)
1.促进哺乳动物脉管系统中血流的方法,包括给所述哺乳动物施用存在于可药用载体中的有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质;由此所述脂肪细胞补体相关蛋白质降低所述脉管系统中的血栓形成活性和补体活性。
2.根据权利要求1的方法,其中所述脂肪细胞补体相关蛋白质包含如下多肽,该多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少75%一致性的氨基酸残基序列,其中所述序列含有:
形成胶原蛋白结构域的Gly-Xaa-Xaa或Gly-Xaa-Pro重复,其中Xaa是任何氨基酸,以及
一个羧基端球形部分。
3.根据权利要求2的方法,其中所述多肽含有与SEQ ID NO:2第22-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸残基序列。
4.根据权利要求2的方法,其中所述多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸序列。
5.根据权利要求3的方法,其中所述多肽与SEQ ID NO:2之间的任何差异均是由于保守氨基酸替代引起的。
6.根据权利要求3的方法,其中所述胶原蛋白结构域由13个Gly-Xaa-Xaa重复和1个Gly-Xaa-Pro重复组成。
7.根据权利要求3的方法,其中所述球形结构域由10个β折叠组成。
8.根据权利要求7的方法,其中所述β折叠与相应于SEQ ID NO:2的第147-151、170-172、178-181、191-203、207-214、219-225、227-239、244-250和269-274位的氨基酸残基相关。
9.根据权利要求2的方法,其中所述多肽含有SEQ ID NO:2的第1-281位残基或SEQ ID NO:44的第1-281位残基。
10.根据权利要求2的方法,其中所述多肽与第二个多肽复合形成寡聚体。
11.根据权利要求10的方法,其中所述多肽通过分子间二硫键复合。
12.根据权利要求11的方法,其中所述寡聚体是三聚体。
13.根据权利要求11的方法,其中所述寡聚体是六聚体。
14.根据权利要求11的方法,其中所述多聚体是十八聚体。
15.根据权利要求1的方法,其中所述多肽通过抑制补体途径和抑制胶原蛋白介导的血小板粘附、激活或聚集来降低血栓形成活性和补体活性。
16.根据权利要求1的方法,其中所述多肽在所述哺乳动物发生急性血管损伤之前、过程中或之后施用。
17.根据权利要求16的方法,其中所述损伤是由血管重建引起的。
18.根据权利要求17的方法,其中所述血管重建包括血管成形术、冠状动脉旁路移植、动脉内膜切除术、微血管修复或血管移植物的吻合。
19.根据权利要求18的方法,其中所述损伤是由于外伤、中风或血管瘤引起的。
20.在哺乳动物中钝化损坏的胶原性组织的方法,包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质;籍此所述蛋白质使该损坏胶原性组织对补体激活、血栓形成活性或免疫激活不起反应。
21.根据权利要求20的方法,其中所述脂肪细胞补体相关蛋白质包含如下多肽,该多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少75%一致性的氨基酸残基序列,其中所述序列含有:
形成胶原蛋白结构域的Gly-Xaa-Xaa或Gly-Xaa-Pro重复,其中Xaa是任何氨基酸,以及
一个羧基端球形部分。
22.根据权利要求21的方法,其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2第22-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸残基序列。
23.根据权利要求21的方法,其中所述多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸序列。
24.根据权利要求22的方法,其中所述多肽与SEQ ID NO:2之间的任何差异均是由于保守氨基酸替代引起的。
25.根据权利要求22的方法,其中所述胶原蛋白结构域由13个Gly-Xaa-Xaa重复和1个Gly-Xaa-Pro重复组成。
26.根据权利要求22的方法,其中所述球形结构域由10个β折叠组成。
27.根据权利要求26的方法,其中所述β折叠与相应于SEQ ID NO:2的第147-151、170-172、178-181、191-203、207-214、219-225、227-239、244-250和269-274位的氨基酸残基相关。
28.根据权利要求22的方法,其中所述多肽含有SEQ ID NO:2的第1-281位残基或SEQ ID NO:44的第1-281位残基。
29.根据权利要求22的方法,其中所述多肽与第二个多肽复合形成寡聚体。
30.根据权利要求29的方法,其中所述多肽通过分子间二硫键复合。
31.根据权利要求29的方法,其中所述寡聚体是三聚体。
32.根据权利要求29的方法,其中所述寡聚体是六聚体。
33.根据权利要求29的方法,其中所述寡聚体是十八聚体。
34.根据权利要求20的方法,其中所述损坏胶原性组织是由与缺血和再灌注相关的损伤引起的。
35.根据权利要求34的方法,其中所述损伤包括外伤性损伤缺血、肠绞窄或与血流恢复之前和之后相关的损伤。
36.根据权利要求20的方法,其中给患有心肺动脉旁路缺血和recesitation、心肌梗死或外伤后血管痉挛的哺乳动物施用所述多肽。
37.根据权利要求36的方法,其中所述外伤后血管痉挛包含中风、经皮腔内血管成形术、动脉内膜切除术、意外性血管外伤或手术引起的血管外伤。
38.钝化用于哺乳动物的假体生物材料表面的方法,包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质;
籍此所述多肽使所述假体生物材料表面对补体激活、血栓形成活性或免疫激活不起反应。
39.根据权利要求38的方法,其中所述脂肪细胞补体相关蛋白质包含如下多肽,该多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少75%一致性的氨基酸残基序列,其中所述序列含有:
形成胶原蛋白结构域的Gly-Xaa-Xaa或Gly-Xaa-Pro重复,其中Xaa是任何氨基酸,以及
一个羧基端球形部分。
40.根据权利要求39的方法,其中所述多肽含有与SEQ ID NO:2第22-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸残基序列。
41.根据权利要求39的方法,其中所述多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸序列。
42.根据权利要求40的方法,其中所述多肽与SEQ ID NO:2之间的任何差异均是由于保守氨基酸替代引起的。
43.根据权利要求40的方法,其中所述胶原蛋白结构域由13个G1y-Xaa-Xaa重复和1个Gly-Xaa-Pro重复组成。
44.根据权利要求40的方法,其中所述球形结构域由10个β折叠组成。
45.根据权利要求44的方法,其中所述β折叠与相应于SEQ ID NO:2的第147-151、170-172、178-181、191-203、207-214、219-225、227-239、244-250和269-274位的氨基酸残基相关。
46.根据权利要求40的方法,其中所述多肽含有SEQ ID NO:2的第1-281位残基或SEQ ID NO:44的第1-281位残基。
47.根据权利要求39的方法,其中所述多肽与第二个多肽复合形成寡聚体。
48.根据权利要求47的方法,其中所述多肽通过分子间二硫键复合。
49.根据权利要求47的方法,其中所述寡聚体是三聚体。
50.根据权利要求47的方法,其中所述寡聚体是六聚体。
51.根据权利要求47的方法,其中所述寡聚体是十八聚体。
52.根据权利要求38的钝化假体生物材料表面的方法,其中所述假体生物材料的表面包被有胶原蛋白或胶原蛋白的片段、明胶、纤维蛋白或纤连蛋白。
53.在哺乳动物中调节伤口修复的方法,包括给所述哺乳动物施用有效治疗量的脂肪细胞补体相关蛋白质;籍此所述多肽加速伤口愈合进程。
54.根据权利要求53的方法,其中所述脂肪细胞补体相关蛋白质包含如下多肽,该多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少75%一致性的氨基酸残基序列,其中所述序列含有:
形成胶原蛋白结构域的Gly-Xaa-Xaa或Gly-Xaa-Pro重复,其中Xaa是任何氨基酸,以及
一个羧基端球形部分。
55.根据权利要求54的方法,其中所述多肽含有与SEQ ID NO:2第22-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸残基序列。
56.根据权利要求54的方法,其中所述多肽含有与SEQ ID NO:2第26-281位残基在氨基酸序列上有至少90%一致性的氨基酸序列。
57.根据权利要求55的方法,其中所述多肽与SEQ ID NO:2之间的任何差异均是由于保守氨基酸替代引起的。
58.根据权利要求55的方法,其中所述胶原蛋白结构域由13个Gly-Xaa-Xaa重复和1个Gly-Xaa-Pro重复组成。
59.根据权利要求55的方法,其中所述球形结构域由10个β折叠组成。
60.根据权利要求59的方法,其中所述β折叠与相应于SEQ ID NO:2的第147-151、170-172、178-181、191-203、207-214、219-225、227-239、244-250和269-274位的氨基酸残基相关。
61.根据权利要求55的方法,其中所述多肽含有SEQ ID NO:2的第1-281位残基或SEQ ID NO:44的第1-281位残基。
62.根据权利要求55的方法,其中所述多肽与第二个多肽复合形成寡聚体。
63.根据权利要求62的方法,其中所述多肽通过分子间二硫键复合。
64.根据权利要求62的方法,其中所述寡聚体是三聚体。
65.根据权利要求62的方法,其中所述寡聚体是六聚体。
66.根据权利要求62的方法,其中所述寡聚体是十八聚体。
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