KR20010102130A

KR20010102130A - 지혈 및 면역기능에 사용하기 위한 억제제

Info

Publication number: KR20010102130A
Application number: KR1020017010308A
Authority: KR
Inventors: 쉐파르드폴오.; 래서제랄드더블유.; 비숍폴디.
Original assignee: 리스 데브라 케이.; 지모제넥틱스, 인코포레이티드
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 2000-02-17
Publication date: 2001-11-15
Also published as: CZ20012916A3; WO2000048625A3; ES2202061T3; EP1154785A2; EP1154785B1; AU772103B2; BR0008298A; DE60004015D1; PL349924A1; HUP0105284A3; US6448221B1; AU2883200A; EP1382345A2; ATE245439T1; JP2002537270A; DE60004015T2; CN1341027A; IL144460A0; HK1039892A1; HUP0105284A2

Abstract

본 발명은 지혈 및 면역 기능에서 억제제로서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 분자에 관한 것이다. 이러한 억제제는 콜라겐-유사 도메인 및 공모양 도메인을 함유하는 단백질 부류의 요소이다. 억제제는 혈전 형성 및 보체 활성을 감소시킴으로서 맥관구조내의 혈류를 촉진시키는 데 유용한다. 억제제는 또한 콜라겐 표면을 회복시키고 상처 치료를 조절하는 데 유용한다.

Description

지혈 및 면역기능에 사용하기 위한 억제제{INHIBITORS FOR USE IN HEMOSTASIS AND IMMUNE FUNCTION}

혈관 손상은 손상을 회복하고 혈관으로부터 혈액 방출을 억제하기 위한 일련의 이벤트 활동을 개시한다. 이 과정이 지혈로서 알려진다. 혈소판은 혈전 형성에 의해서 지혈에서 초기 역할을 하거나 혈관 손상의 순간적인 회복을 플러그한다. 혈소판은 일반적으로 혈관벽을 라이닝하는 내피세포와 상호작용하지 않지만, 사고를 통해 또는 외과수술 과정동안 혈관에 대한 손상은 내피 세포를 파괴시킬 수 있다. 손상의 범위에 따라서, 콜라겐, 탄성층 또는 섬유 콜라겐과 관련된 평활근 세포와 같은 다양한 아내피세포 요소가 유동 혈액에 노출될 것이다.

아내피세포가 하기의 혈관 손상에 노출될 때, 국부적 혈류에서 이동하는 혈소판은 콜라겐을 포함하는 노출된 아내피세포 매트릭스와 상호작용하고, 흐름이 늦어진다. 혈소판 표면상의 수용체 및 노출된 콜라겐 층과의 더이상의 상호작용은 혈소판 결합 및 활성화를 유발하여 국부적 혈류 정지를 초래한다. 결합된 혈소판은 활성화되고 피브리노겐-혈소판간 결합 형성을 통하여 혈류를 통과하는 혈소판과 응집체를 형성한다. (Moroi and Jung, Frontiers in Bioscience 3: 719-28,1998; Barnes et al., Atherosclerosis XI, Jacotot et al., eds., Elsevier Science, pp. 299-306, 1998 and Barnes et al., Curr. Opin. Hematol. 5: 314-20, 1998).

지혈 반응은 평가되고 혈관 손상의 정도, 노출된 특이적 혈관 성분 및 손상 범위에서 혈류 상태에 의존한다. (Rand et al., Thrombosis and Haemostasis 78: 445-50,1997). 가벼운 혈관 손상동안과 같은 아내피세포 매트릭스의 노출은(type VI collagen and von Willebrand factor) 저혈류 상태를 가진 면적에서의 낮은 정도의 흡착 및 응집을 촉진한다. 더 큰 정도의 혈관 외상을 야기하는 손상 및 내부 탄성층 및 탄력소-결합 미세섬유와 같은 추가적인 혈관 성분의 노출은 더 강한 혈소판 응집체 형성을 자극할 것이다. 섬유 콜라겐을 노출시키는 심각한 혈관 외상은 혈전 혈소판 반응을 일으키고, 그것은 희생자를 과량의 혈액 손실로부터 보호한다. (Rand et al., 상기참조)

지혈 억제제는 혈관 손상 다음의 혈류 증가 및 콜라겐 표면을 회복시키기에 유용할 것이다.

보체 인자 C1q 는 3 개의 관련 폴리펩티드(A, B 및 C 사슬)의 6 개의 복제로 구성되고, 각 폴리펩티드는 아미노-말단 근처에 콜라겐 도메인 및 카르복시-말단 공모양 영역을 가지는 약 225 아미노산 길이이다. 6 개의 3 중 나선 영역은 중앙 영역 및 6 개의 대를 형성하는 6 개의 A, 6 개의 B 및 6 개의 C 사슬의 콜라겐 도메인에 의해 형성된다. 공모양 헤드 부분은 A, B 및 C 사슬의 공모양 카르복시 말단 도메인의 결합에 의해 형성된다. 그러므로, Clq 는 6 개의 콜라겐-유사 대를 통해 중앙 섬유 영역에 연결된 6 개의 공모양 헤드로 구성된다. Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90,1991. 이 구성은 종종 꽃의 화속으로 말해진다. Acrp30 는 단일 형태의 폴리펩티드 사슬로부터 형성된 유사한 화속 구조를 가진다.

Clq 는 방어 메카니즘을 자극할 뿐만 아니라 조직 손상을 야기할 수 있는 독성 산소종을 유발하는 것으로 밝혀졌다. (Tenner, Behrinq Inst. Mitt. 93: 241-53,1993). Clq 결합 부위는 혈소판상에서 발견된다. 추가적인 보체 및 Clq 는 염증에서 역할을 한다. 보체 활성은 C1q 가 면역글로블린에 결합함으로서 개시된다.

C1q 및 보체 경로의 억제제는 항-염증 이용, 보체 활성 및 혈전 활성의 억제에 유용할 것이다.

본 발명은 본원의 기술로부터 당업자에게 자명한 이러한 사용을 위한 이러한 폴리펩티드를 제공한다.

(발명의 개요)

한 양태에서, 본 발명은 포유동물에 제약학적 허용가능한 부형제로 지방세포 보체 관련 단백질의 제약학적 유효량을 투여하는 것에 의해 상기 지방세포 보체 관련 단백질이 맥관구조내에서 혈전형성 및 보체 활성을 감소시키는 것을 포함하는 상기 포유동물의 맥관구조내의 혈류를 촉진하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 지방세포 보체 관련 단백질은 SEQ ID NO:2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 75 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 상기 서열은 콜라겐 도메인을 형성하는 Gly-Xaa-Xaa 또는 Gly-Xaa-Pro 반복 ( 여기서 Xaa 는 어떤 아미노산도 됨), 및 카르복시-말단 공모양 부분이다. 관련 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 22-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드와 SEQ ID NO:2 사이의 어느 차이는 보존적인 아미노산 치환 때문이다. 다른 구체예에서, 콜라겐 도메인은 13 Gly-Xaa-Xaa 반복 및 1 Gly-Xaa-Pro 반복으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 공모양 도메인은 10 개의 베타 시트로 구성된다. 관련 구체예에서, 베타 시트는 SEQ ID NO:2 의 147-151, 170-172, 178-181, 191-203 , 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, 및 269-274 에 해당하는 아미노산 잔기와 회합된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 잔기 1-281 또는 SEQ ID NO:44 의 잔기 1-281 을 포함한다.

본 발명은 또한 폴리펩티드가 제 2 의 폴리펩티드와 복합체를 형성하고 있는 올리고머를 제공한다. 한 구체예에서, 폴리펩티드는 분자간 이황화 결합에 의해 복합체를 형성한다. 또 다른 구체예에서, 올리고머는 3합체이다. 또 다른 구체에에서, 올리고머는 6합체이다 . 또 다른 구체예에서, 다합체는 18합체 이다.

또 다른 양태에서, 폴리펩티드는 보체 경로의 억제 및 콜라겐-매개 혈소판 부착, 활성 또는 응집의 억제에 의해서 혈전형성 및 보체 활성을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 상기 동물에서 급성 혈관 손상 전, 그 동안 또는 다음에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 손상은 혈관 복원 때문이다. 관련 구체예에서, 혈관 복원은 혈관확장술, 관상동맥바이패스이식, 동맥내막절제술, 미세 혈관 회복 또는 혈관 이식의 문합술을 포함한다. 다른 구체예에서, 손상은 외상, 뇌졸증 또는 동맥류때문이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에 지방세포 보체 관련 단백질의 제약학적 유효량을 투여하는 것에 의해 상기 단백질이 보체 활성, 혈전 활성 또는 면역 활성에 대해 손상된 콜라겐 조직을 비활성화하는 것을 포함하는 포유동물에서 손상된 콜라겐 조직을 회복시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 손상된 콜라겐 조직은 국소빈혈 및 재관류와 관련된 손상때문이다. 또 다른 구체예에서, 손상은 외상 손상 국소빈혈, 장교액, 또는 혈액 흐름의 예비- 및 후-확립과 관련된 손상을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 심폐성 바이패스 국소빈혈 및 리세시테이션, 심근경색증, 또는 외상-후 혈관경련을 겪는 포유동물에 투여된다. 관련 구체예에서, 외상-후 혈관경련은 뇌졸증, 경피적 경혈관 확장술, 동맥내막절제술, 사고에 의한 혈관 외상 또는 외과수술-유발 혈관 외상을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에 지방세포 보체 관련 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 것에 의해 상기 폴리펩티드가 보체 활성, 혈전 활성 또는 면역 활성에 대해 전립선 생물질의 표면을 불활성화하는 것을 포함하는 상기 포유동물과 관련된 사용을 위한 전립선 생물질의 표면을 회복시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 전립선 생물질의 표면을 콜라겐 또는 콜라겐 단편, 젤라틴, 섬유소 또는 피브로넥틴으로 코팅한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 포유동물에 지방세포 보체 관련 단백질의 제약학적 유효량을 투여하는 것에 의해 상기 폴리펩티드가 상처 치료의 진행을 향상시키는 것을 포함하는 상기 포유동물에서 상처 회복을 조절하는 방법을 제공한다.

도 1 은 본 발명의 zsig37 폴리펩티드 및 HUMUPST2~1 (Maeda et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm. 221 (2) : 286-9, 1996); C1QA~HUMAN (Sellar et al., Biochem. J. 274: 481-90, 1991, Reid, Biochem. J. 179: 367-71,1979, 및 Reid et al., Biochem. J. 203: 559-69,1982); HP25~TAMAS (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21,1993 and Kondo & Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8,1992); HP27~TAMAS (Takamatsu et al. 및 상기참조된 Kondo & Kondo); 및 CERL~RAT (Wada & Ohtani, Brain Res. Mol. Brain Res. 9: 717,1991)의 복합 배열을 보여준다.

도 2 는 도 1 의 복합 배열에서 나타난 6 개의 단백질의 비교로 아미노산 동일성을 비율로 보여주는 매트릭스이다.

도 3 a 는 형태 VI 콜라겐에 zsig37-FITC 결합을 보여준다.

도 3b 는 형태 VI 콜라겐에 결합한 FITC 표지된 zsig37 와 비표지된 zsig37 의 경쟁을 보여준다.

도 4 는 zsig37 에 보체 C1q-FITC 의 결합을 보여준다.

도 5 는 zsig37 에 의한 사람의 보체 활성의 억제를 보여준다.

도 6 은 zsig37 의 존재하에서 콜라게에 의해 혈소판의 응집 비율을 보여준다.

도 7 은 zsig37 의 존재하에서 SK5 섬유아세포의 증식을 보여준다.

발명의 상세한 설명을 제시하기 전에, 하기의 용어를 정의하는 것이 그것의 이해를 위해서 도움이 될 수 있다.

본원에서 용어 "친화성 표지"는 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하기 위해 또는 기질에 폴리펩티드의 부착 부위를 제공하기 위해 폴리펩티드에 부착할 수 있는 펩티드 절편을 의미한다. 원칙적으로, 이용가능한 항체 또는 다른 특이적 결합제에 대한 어느 펩티드 또는 단백질도 친화성 표지로서 사용될 수 있다. 친화성 표지는 폴리-히스티딘 트랙, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J. 4 : 1075,1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3,1991), 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (Smith and Johnson, Gene 67: 31,1988), 물질 P, Flag^TM펩티드 (Hopp et al., Biotechnoloqy 6: 1204-10,1988; Eastman Kodak Co., New Haven, CT 로부터 이용가능), 스트렙타비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다. 일반적으로, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107,1991 참조. 친화성 표지를 암호화하는 DNA 는 상업적 공급자로부터 이용가능하다. (예를 들어, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ 참조).

용어 "폴리뉴클레오티드의 보체" 는 기준 서열과 비교했을 때 상보적인 염기 서열 및 역 방향을 가지는 폴리뉴클레오티드 분자이다. 예를 들어, 5' ATGCACGGG 3' 는 5'CCCGTGCAT 3' 이다.

용어 "축중 뉴클레오티드 서열" 은 (폴리펩티드를 암호화하는 기준 폴리뉴클레오티드 분자와 비교했을 때) 하나 이상의 축중 코돈을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 축중 코돈은 뉴클레오티드의 서로 다른 트리플렛을 포함하지만, 같은 아미노산 잔기를 코드화한다(즉, GAU 및 GAC 트리플렛은 각각 Asp 를 암호화한다).

폴리뉴클레오티드에 적용될 때, 용어 "분리"는 폴리뉴클레오티드가 그것의 천연적인 유전적 환경으로부터 제거되었고 따라서, 다른 외인성 또는 원하지 않는 코드 서열이 없고, 유전적으로 설계된 단백질 생산 시스템내에서의 사용에 적합한 형태라는 것을 나타낸다. 이러한 분리 분자는 그들의 천연 환경으로부터 분리되고 cDNA 및 게놈 클론을 포함한다. 본 발명의 분리 DNA 분자는 통상적으로 결합된 다른 유전자가 결여되지만, 프로모터 및 터미네이터와 같은 자연 발생 5' 및 3' 비번역 영역을 포함할 수 있다. 관련 영역의 확인은 당업자에게 자명할 것이다. (예를 들어, Dynan and Tijan , Nature 316:774-78,1985 참조)

"분리" 폴리펩티드 또는 단백질은 혈액 및 동물 조직을 제외한 것과 같은 그것의 천연 환경을 제외한 상태에서 발견되는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바람직한 형태에서, 분리 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드, 구체적으로는 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 결여된다. 매우 정제된 형태, 즉 95 % 이상의, 더욱 바람직하게는 99 % 순도 이상의 폴리펩티드를 제공하는 것이 바람직하다. 본원에 사용될 때, 용어 "분리"는 이합체 또는 교호적인 글리코실화 또는 유도형과 같은 교호적인 물리적 형태로 같은 폴리펩티드의 존재를 배척하지 않는다.

용어 " 오르토로그"는 서로 다른 종에서 얻은 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 상응물인 한 종으로부터 얻어진 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 오르토로그 간의 서열 차이는 종분화 결과이다.

용어 "폴리펩티드"는 5' 에서 3' 말단으로 해독되는 디옥시리보뉴클레오티드또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA 를 포함하고, 천연 원으로부터 분리될 수 있고, 시험관내에서 합성될 수 있거나, 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 염기 쌍(축약 "bp"), 뉴클레오티드("nt"), 또는 킬로베이스 ("kb")로 표현된다. 본원에서 허용하는 경우에, 후자의 2 가지 용어는 단일-가닥 또는 이중-가닥인 폴리뉴클레오티드를 개시할 수 있다. 용어가 이중-가닥 분자에 적용될 때, 총 길이를 나타내는 데 사용되고, 용어 "염기쌍" 과 등가로 이해될 것이다. 당업자에게 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2 가닥은 길이면에서 약간 다를 수 있고 그것의 말단은 효소적 절단의 결과로서 어긋날 수 있다는 것이 이해될 것이다; 그러므로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자내의 어떤 뉴클레오티드는 염기쌍을 형성하지 않을 수 있다. 이러한 비-염기쌍형성 말단은 길이면에서 일반적으로 20 nt 를 초과하지 않을 것이다.

"폴리펩티드"는 자연적으로 또는 합성적으로 생산되든지간에, 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기의 폴리머이다. 약 10 아미노산 잔기 미만의 폴리펩티드는 일반적으로 "펩티드"로 말한다.

본원에 사용될 때, "프로브 및/또는 프라이머"는 RNA 또는 DNA 일 수 있다. DNA 는 cDNA 또는 게놈 DNA 일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브 및 프라이머는 단일 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA, 일반적으로 합성 올리고뉴클레오티드이지만, 클론화 cDNA 또는 게놈 서열 또는 그것의 보체로부터 생산될 수 있다. 분석적 프로브는 다소 짧은 프로브(14-17 뉴클레오티드)가 사용될 수 있지만, 길이면에서 적어도 일반적으로 20 뉴클레오티드일 것이다. PCR 프라이머는 길이면에서 적어도 5 뉴클레오티드, 바람직하게는 15 또는 그 이상의 nt, 더욱 바람직하게는 20-30 nt 이다. 분석을 위해 유전자의 작은 영역이 표적화될 때, 더 짧은 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 유전자의 총 분석을 위해서, 폴리뉴클레오티드 프로브는 전 엑손 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 프로브는 당업계에 알려진 기술을 사용하여, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 및 Amersham Corp., Arlington Heights, IL, 과 같은 많은 원으로부터 상업적으로 이용가능한 효소, 비오틴, 방사성핵종, 발색단, 화학발광제, 파라마그네틱 입자등과 같은 검출가능한 신호를 제공하도록 표지화될 수 있다.

비정확한 분석 방법(예를 들어, 겔 일렉트로포레시스)으로 결정된 폴리머의 분자량 및 길이는 대략적인 값으로 이해될 것이다. 이러한 값이 "약" X 또는 "대략적인" X 로 표현될 때, 지정된 X 의 값은 ±10 % 의 정확도로 이해될 것이다.

본 발명은 부분적으로 신규한 지방세포 보체 관련 단백질 호모로그가 콜라겐-매개 혈소판 활성 및 C1q 를 포함하는 보체 경로를 억제한다는 발견에 기초한다. 이 단백질은 zsig37 로 명명되고, 일반적으로 등록된 공개 PCT 특허 출원 WO 99/04000 에 총체적으로 개시된다.

zsig37 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:1) 은 아미노-말단 신호 서열, 비-상동성의 인접한 N-말단 영역, Gly-Xaa-Xaa 또는 Gly-Xaa-Pro 반복 및 카르복시-말단 공모양 단백질로 구성되는 절단된 콜라겐 도메인을 가지는 폴리펩티드(SEQ ID NO:2 )를 코드화한다. 신규한 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 긴 3' 비번역 영역을 포함한다. 상기에 제시된 일반적인 폴리펩티드 구조는 그러한 단백질 각각의 콜라겐-유사 도메인이 zsig37 폴리펩티드의 그것보다 더 긴 것을 제외하고는 Acrp30 및 HUMUPST2＿1 과 공통된다. 또한, HUMUPST2＿1 DNA 서열은 긴 3' 비번역 영역을 특징으로 한다. 게다가, Acrp30 및 도 1 에 배열된 모든 서열은 CERL＿RAT 를 제외하고는, 도 1 및 SEQ ID NO:2 에 보여진 zsig37 폴리펩티드의 위치 187 에서 보존된 시스테인 잔기를 공유한다. 또한, 본 발명의 zsig37 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 93 (Asn)에서 추정상의 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다.

Zsig37 에 해당하는 mRNA 의 조직 분배의 분석은 심장과 태반에서 발현이 가장 높았고, 신장, 난소, 부선 및 골격 근육에서 상대적으로 덜 강한 신호를 보였고, 노던 블럿상에 존재하는 광범위한 다른 조직상에서 낮은 신호를 보였다.

지방세포 보체 관련 단백질 Acrp30 (SEQ ID NO:3) 및 지방세포 분비 단백질 apM1 (도 1 및 2 의 HUMUPST2＿1) 와의 상동성 관계가 zsig37 에 대해 확립되었다. 다소 더 먼 상동성은 또한 보체 성분 C1Q A 사슬로 확인되었고, 2 개의 인자가 도 1 및 2 에서 보여진대로 동면하는 시베리아 우드척(Siberian woodchucks) (HP25＿TAMAS 및 HP27＿TAMAS) 및 래트 뇌 단백질(CERL＿RAT)의 활동 상태에서 관찰되었다.

Zisg37 의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1 으로 개시되고, 그것의 추론된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2로 개시된다. 폴리펩티드 SEQ ID NO:2 를 코드화하는 축중 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:23 으로 제공된다. 상기에 일반적으로 개시된 대로, zsig37 폴리펩티드는 아미노산 1 (Met) 내지 아미노산 잔기 21 (Gly)에 분포하는 신호 서열을 포함한다. 대안적인 신호 서열은 아미노산 1(Met) 내지 아미노산 25 (Ser) 에 분포한다. 그러므로, 완성형 폴리펩티드는 아미노산 22 (Leu) 또는 26 (Arg) 내지 아미노산 281 (Pro) 에 분포한다. 아미노산 잔기 22 (Leu) 및 98 (Lys) 사이에 분포하는 완성형 폴리펩티드내에서, N-말단 영역에서는 어떠한 상동성도 발견되지 않는다. 게다가, 절단된 콜라겐 도메인은 아미노산 99 (Gly) 및 140 (Arg) 사이에서 발견된다. 절단된 콜라겐 도메인에서, 1 개의 완전한 Gly-Xaa-Pro 및 13 개의 불완전한 Gly-Xaa-Xaa 반복이 관찰된다. 대조적으로, Acrp30 은 22 개의 완전한 또는 불완전한 반복을 포함한다. Zsig 37 폴리펩티드는 또한 약 아미노산 141 (Cys) 내지 281 (Pro) 에 분포하는 카르복시-말단 공모양 도메인을 포함한다. Zsig37 폴리펩티드, HUMUPST2＿1 및 Acrp30 은 콜라겐 도메인 및 공모양 도메인에서 상동성을 나타내지만, 완성형 폴리펩티드의 N-말단 부분에서는 아니다.

ACRP30 의 공모양 Clq 도메인은 TNF 부류에 상당한 구조적 상동성을 보이는 10 개의 β 가닥 " 젤리 롤" 위치를 가지는 것으로 결정되었고(Shapiro and Scherer, Curr. Biol. 8: 335-8,1998), SEQ ID NO: 2 로 나타난 zsig37 서열은 이 구조의 모든 10 개의 β-가닥을 포함한다. (SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 147-151, 170-172, 178-181, 185-188, 191-203, 207-214, 219-225, 227-238, 244-250, 및 269-274). 이러한 가닥은 각각 "A", A'", ""B", "B'", "C", ""D","E", "F", "G" 및 "H" 로 표시된다.

Zsig37 은 아미노산 잔기 152-180 및 213 -226 에 2 개의 수용체 결합 루프를 가진다. 아미노산 잔기 191 (Gly), 193(Tyr), 238(Leu)및 272 (Gly) 은 CD40,TNFα, TNFβ, ACRP30 및 zsig37 을 포함하는 상과 전체에서 보존성을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태는 지혈 및 면역 기능의 억제제로서 zsig37 폴리펩티드 단편의 사용을 포함한다. 바람직한 단편은 SEQ ID NO:2 의 아미노산 99 (Gly) 내지 아미노산 140 (Arg)에 분포하는 zsig37 폴리펩티드의 콜라겐-유사 도메인, 콜라겐-유사 도메인을 포함하는 zsig37 폴리펩티드 부분 또는 이량체화 또는 올리고머화 할 수 있는 콜라겐-유사 도메인의 부분을 포함한다. 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO:2 의 아미노산 140 (Arg) 또는 141(Cys) 내지 281 (Pro)에 분포하는 zsig37 폴리펩티드의 공모양 도메인, 공모양-유사 도메인을 포함하는 zsig37 폴리펩티드의 부분 또는 공모양-유사 도메인의 활성 부분을 포함한다. 본 발명의 다른 zsig37 폴리펩티드 단편은 콜라겐-유사 도메인 및 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 99 (Gly) 내지 281(Pro)에 분포하는 공모양 도메인 모두를 포함한다. 이러한 단편은 구체적으로 콜라겐-매개 혈소판 활성의 억제 및 보체 및 C1q 의 억제에 유용하다.

본 발명은 또한 zsig37 융합 단백질의 사용을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 (1) (a) SEQ ID NO:2, 아미노산 잔기 1 (Met), 22(Leu) 또는 26( Arg) 내지 아미노산 잔기 281(Pro), 에서 보여진 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩티드 분자;(b) SEQ ID NO: 2 의 아미노산 99 (Gly) 내지 아미노산 140 (Arg) 에 분포하는 폴리펩티드 분자, 콜라겐-유사 도메인을 포함하는 zsig37 폴리펩티드의 부분 또는 이량체화 또는 올리고머화가 가능한 콜라겐-유사 도메인의 부분; (c) SEQ ID NO:2 의 아미노산 140 (Arg) 또는 141 (Cys) 내지 281 (Pro) 에 분포하는 폴리펩티드 분자, 공모양-유사 도메인 또는 공모양-유사 도메인의 활성 부분을 포함하는 zsig37 폴리펩티드의 부분; 또는 (d) 아미노산 99 (Gly) 내지 281 (Pro) 에 분포하는 폴리펩티드 분자, 콜라겐-유사 도메인 및 공모양 도메인을 포함하는 zsig37 폴리펩티드의 부분을 포함하는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드; 및 (2) 다른 폴리펩티드를 포함한다. 다른 폴리펩티드는 대안적 또는 추가적인 공모양 도메인, 대안적 또는 추가적 콜라겐-유사 도메인, 융합 단백질등의 분비를 용이하게 하기 위한 신호 펩티드일 수 있다.

또한 zsig37 아고니스트 및 안타고니스트가 본 발명의 방법에서 유용하다. 안타고니스트를 확인하는 방법은 당업자에게 알려진다. 예를 들어, zsig37 폴리펩티드의 안타고니스트는 zsig37 폴리펩티드에 반응하는 세포를 제공하는 단계, zsig37 폴리펩티드 및 시험 화합물의 존재하에서 세포의 제 2 의 부분을 배양하는 단계, 및 세포의 제 1 의 부분과 비교할 때 세포의 제 2 의 부분의 세포 반응의 감소를 검출하는 단계에 의해서 확인될 수 있다. 본 원에 개시된 분석법에 첨가하여, 샘플은 수용체 결합 또는 zsig37-의존성 세포 반응의 자극/억제를 측정하기 위해 설계된 다양한 분석법내에서 zsig37 활성 억제에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, zsig37-반응성 세포 라인은 zsig37-자극 세포 경로에 반응하는 수용체 유전자 구조체로 트랜스펙션될 수 있다. 이 형태의 수용체 유전자 구조체는 당업계에 공지되고, 일반적으로 루시퍼라제와 같은 분석 가능한 단백질을 코드화하는 유전자에 작동가능하게 연결된 zsig37-DNA 반응 요소를 포함할 것이다. DNA 반응 요소는 시클릭 AMP 반응 요소(CRE), 호르몬 반응 요소 (HRE), 인슐린 반응 요소 (IRE) (Nasrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5273-7,1990) 및 혈청 반응 요소(SRE) (Shaw et al. Cell 56: 563-72,1989)를 제한없이 포함한다. 시클릭 AMP 반응 요소는 Roestler et al., J. Biol. Chem. 263 (19): 9063-6,1988 및 Habener, Molec Endocrinol. 4 (8): 1087-94,1990 에 개관된다. 호르몬 반응 요소는 Beato, Cell 56: 335-44; 1989 에 개관된다. 참여 화합물, 용액, 혼합물 또는 추출물은 리포터 유전자 발현의 zsig37 자극의 감소를 증거로 표적 세포상의 zsig37 의 활성 억제 능력에 의해 시험된다. 이 형태의 분석법은 세포-표면 수용체에 결합하는 zsig37 을 직접 차단하는 화합물 뿐만 아니라 수용체-리간드 결합에 연이은 세포 경로 과정을 차단하는 화합물을 검출할 것이다. 대안적으로, 화합물 또는 다른 샘플은 검출가능한 표지(예를 들어,¹²⁵I, 비오틴, 호스래디쉬 퍼옥시다제, FITC 등)로 표지된 zsig37 을 사용하여 수용체와 zsig37 결합의 직접적 차단이 시험될 수 있다. 이 형태의 분석법에서, 수용체와 표지된 zsig37 의 결합을 억제하는 시험 샘플의 능력은 제 2 의 분석법을 통해 확증될 수 있는 억제 활성을 나타낸다. 결합 분석법에 사용된 수용체는 세포 수용체 또는 분리, 고정화 수용체일 수 있다.

Zsig37 폴리펩티드 에피토프, 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 본 발명의 방법에 또한 사용가능하다. 다클론 및 단일클론 항체를 준비하는 방법이 당업계에 공지된다. (예를 들어, Sambrook et al.,Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, Second Edition,Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Hurrell, J. G. R., Ed.,Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 참조).

당업자에게 자명한 대로, 다클론 항체는 말, 카우, 염소, 양, 개, 닭, 래빗, 마우스, 햄스터, 기니아 피그 및 래트와 같은 다양한 온혈동물 뿐만 아니라 트랜스제닉 양, 카우, 염소 또는 피그와 같은 트랜스제닉 동물을 접종시킴으로서 발생될 수 있다. 항체는 또한 변형된 형태의 효모 및 균류 뿐만 아니라 포유동물 및 곤충 세포에서 발현될 수 있다. zsig37 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 동물을 접종시키기 위한 항원(면역원)으로 기능하거나 또는 면역 반응을 유발한다. 적당한 항원은 SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 22-281, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 26-281, 또는 그것의 인접한 9-281 아미노산 잔기 단편인 SEQ ID NO:2 에 의해 코드화된 zsig37 폴리펩티드를 포함할 것이다. Zsig37 폴리펩티드의 면역원성은 명반(알루미늄 히드록사이드)과 같은 애쥬반트 또는 프로인드 완전 또는 불완전 애주번트의 사용을 통해 향상될 수 있다.면역화에 유용한 폴리펩티드는 또한 zsig37 의 융합과 같은 융합 폴리펩티드 또는 면역글루블린 폴리펩티드 또는 친화성 표지를 가지는 그것의 부분을 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 완전한-길이 분자 또는 그것의 부분일 수 있다. 폴리펩티드 부분이 "헵튼-유사" 라면, 이러한 부분은 면역화를 위한 거대분자 담체에(케이홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 테타누스 톡시드)유리하게 결합 또는 연결될 수 있다.

본원에 사용될 때, 용어 "항체"는 다클론 항체, 친화성-정제 다클론 항체, 단일클론 항체, 및 F(ab')₂및 Fab 단백질 분해성 단편과 같은 항원-결합 단편을 포함한다. 키메라 항체, Fv 단편, 단일 사슬 항체등 뿐만 아니라 합성 항원-결합 펩티드 및 폴리펩티드와 같은 유전적으로 설계된 완전한 항체 또는 단편이 또한 포함된다. 비-인간 항체는 인간 프레임워크 및 항상 영역상에 단지 비-인간 CDR 을 이식함으로서 또는 전체 비-인간 가변성 도메인(선택적으로)을 결합함으로서 인간화될 수 있다(선택적으로 노출된 잔기의 치환으로 사람-유사 표면으로 그들을 "클라킹", 여기에서 결과는 "베니어화" 항체). 어떤 예로서, 인간화된 항체는 적당한 결합 특징을 향상시키기 위해서 사람의 가변성 영역 프레임워크 도메인내에서 비-인간 잔기를 보유할 수 있다. 인간화 항체를 통해서, 생물학적 반감기는 향상될 수 있고, 인간에 대한 투여에 기초한 역 면역 반응에 대한 가능성은 감소된다. 본원에 유용한 항체를 생산하거나 선택하는 대안적 기술은 zsig37 단백질 또는 펩티드에 대해 림프구의 시험관내 노출, 및 파지 또는 유사한 벡터내에 라이브러리를 전개하는 항체 선택(예를 들어, 고정된 또는 표지된 zsig37 단백질 또는 펩티드의 사용을 통해)을 포함한다.

항체는 1) 그들이 한계 수준의 결합 활성을 나타내고/또는 2) 그들이 관련 폴리펩티드 분자와 현저한 교차-반응을 하지 않는다면 특이적으로 반응하는 것으로 정의된다. 첫번째로, 본원의 항체는 그들이 결합 친화력(K_a) 10⁶mol^-1또는 그 이상, 바람직하게는 10⁷mol^-1또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 10⁸mol^-1또는 그 이상, 가장 바람직하게는 10⁹mol^-1또는 그 이상으로 zsig 37 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프에 결합한다면 특이적으로 결합한다. 항체의 결합친화력은 예를 들어,Scatchard 분석에 의해서와 같이 (Scatchard , Ann. NY Acad.Sci.51:660-672,1949) 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

둘째로, 항체는 그들이 관련 폴리펩티드와 현저하게 교차 결합하지 않는다면, 특이적으로 결합한다. 항체는 그들이 표준 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 공지된 관련 폴리펩티드가 아닌 zsig37 폴리펩티드를 검출한다면 항체는 관련 폴리펩티드 분자와 눈에 띄게 교차-반응하지 않는다 (Ausubel et al., 상기참조). 공지된 관련 폴리펩티드의 예는 Acrp30 (SEQ ID NO:3) , 배열 도 1 등에서 보여진 폴리펩티드와 같은 단백질 부류의 다른 원소를 포함한다. 그들은 또한 바람직하다면, 오르토로그 및 돌연변이 사람 zsig37 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이, 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 군을 분리하기 위해 공지된 관련 폴리펩티드에 "대해 스크리닝" 될 수 있다. 예를 들어, 사람 zsig37 폴리펩티드에 대해 유발된 항체는 불용성 매트릭스에 부착된 관련 폴리펩티드에 흡착된다; 사람 zsig37 에 특이적인 항체는 적당한 완충액 상태하에서 매트릭스를 통해 유동할 것이다. 이러한 스크리닝은 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 비-교차반응성 다클론 및 단일클론 항체의 분리를 허용한다. (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunoloqy, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). 특정 항체의 스크리닝 및 분리는 당업계에 잘 알려진다 (Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993;Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98,1988; Monoclonal Antibodies: Principes andPractice, Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al.,Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101,1984 참조). 이러한 분석법의 대표적인 예는 동시발생적인 면역전기영동, 방사면역분석법, 방사면역침전법, 효소-결합 면역흡착분석법(ELISA), 도트 블럿 또는 웨스턴 블럿 분석법, 억제 또는 보체 분석법, 및 샌드위치 분석법을 포함한다.

조혈성, 구체적으로 혈소판 흡착 및 활성에 대한 zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합, 아고니스트 또는 안타고니스트의 영향은 본원에 제공되고 당업자에게 공지된 방법 및 분석법을 사용하여 결정될 수 있는 혈소판 응집을 유발한다. 콜라겐은 혈소판 응집의 잠재적인 유발자이다. 이것은 혈관 손상으로부터 회복하는 환자에게 위험을 제공한다. 콜라겐-유발 혈소판의 억제제는 이러한 목적에 유용할 것이다. Zsig37 은 피브로넥틴 및 형태 I, II, III, V, VI 콜라겐에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, zsig37 은 농도 의존 방식으로 콜라겐 VI 상의 특이적 도메인에 결합한다. Zsig37 은 또한 콜라겐-매개 혈소판 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. Zsig37-유발 억제는 콜라겐 활성에 선택적이었고, zsig37 은 공지된 혈소판 활성제 ADP 또는 혈전에 의해서 활성화된 혈소판에 영향이 없었다. 이러한 결과는 하기의 실시예 단락, 하기의 발명의 상세한 설명에 개시된다. zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합, 아고니스트 또는 안타고니스트는 혈소판이 콜라겐-코팅된 표면에 결합하는 것을 차단하는 데 유용하고, 관련 콜라겐-유발 혈소판 응집을 감소시키는데 유용할 것이다.

C1q 는 보체 경로의 성분이고 방어 메카니즘을 자극할 뿐만 아니라 조직 손상을 야기할 수 있는 독성 산소종의 생산을 촉매하는 것으로 밝혀졌다. (Tenner, Behring Inst. Mitt.93:241-53,1993). C1q 결합 위치는 혈소판상에서 발견된다. 면역 결합 파트너에 독립적인 C1q 는 혈소판 흡착 또는 형태 변형은 아니지만 혈소판 응집을 억제하는 것으로 밝혀졌다. C1q 의 아미노 말단 영역은 콜라겐과 상동성을 공유한다. (Peerschke and Ghebrehiwet, J. Immunol.145:2984-88,1990). Zsig37 은 농도 의존 방식으로 보체 C1q 에 결합한다. Zsig37 은 감작된- 및 미-감작된 염소 적혈구 모두를 가진 C1q 를 포함하는 보체 경로 억제에 효과적임이 밝혀졌다.

본 발명의 Zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합 단백질, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트는 흡착되고 활성화되는 혈소판의 수 및 혈소판 응집체의 크기를 감소시킴으로서 포유동물의 맥관구조내에서 혈류를 촉진하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 이러한 치료가 필요한 포유동물에 zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트의 제약학적 유효량의 투여에 의하여 zsig37 이 포유동물의 맥관구조내에서 혈전형성 및 보체 활성을 감소시키는 것을 포함할 것이다. 하기에 개시된 대로, zsig37 폴리펩티드는 콜라겐-매개 혈소판 활성을 억제하고 결합을 통해 피브로넥틴 및 형태 I, II, III, V 및 VI 콜라겐을 불활성화시킨다. Zsig37 투여는 혈소판 흡착, 활성 및 응집 방식을 감소시킴으로서 혈관 손상 부위에서 혈전형성 활성을 감소시킨다. Zsig37 은 또한 하기에 개시된 대로 보체 경로 및 C1q 를 억제하여 맥관구조내에서 보체 활성을 감소시킨다. 이러한 방법에 사용되는 zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트는 포유동물에서 급성 혈관 손상의 전, 손상 동안 또는 그 다음에 투여될수 있다.

바람직한 방법에서, 혈관 손상은 혈관확장술, 동맥내막절제술, 관상동맥우회로술이식, 미세 혈관 회복 또는 혈관 이식의 문합술을 제한없이 포함하는 혈관 복원 때문이다. 외상, 뇌졸증 또는 동맥류에 기인한 혈관 손상이 또한 기대된다. 다른 바람직한 방법에서, 혈관 손상은 플라크 파괴, 맥관구조의 분해, 당뇨병 및 죽상경화증과 관련된 합병증에 기인한다. 관상동맥에서 플라크 파괴는 심장병을 유발하고 대뇌동맥에서 플라크 파괴는 뇌졸증을 유발한다. 이러한 방법에서 zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합 단백질, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트의 사용은 또한 파종성 혈관내응고(DIC) 및 SID 와 같은 면역 시스템과 관련된 맥관구조의 전 시스템 질환을 회복시키는 데 유용할 것이다. 추가적으로 보체 억제 활성은 세동맥경화와 같은 비-맥관구조 면역 질환 치료에 유용할 것이다.

상관관계가 국부화된 국소빈혈 심근층에서 C1q 의 존재 및 적혈구의 축적 다음에 관상동맥 폐색 및 재관류 사이에서 발견되었다. 세포성 성분의 해리 다음에 조직 손상은 보체 활성을 유발하여 심근 손상의 제 1 의 원인일 수 있는 독성 산소 생산을 유발하는 보체 활성을 유발한다 (Rossen et al., Circ. Res. 62: 572-84, 1998 and Tenner, ibid.). 보체 경로의 차단은 재관류 상해로부터 허혈성 심근을 보호하는 것으로 밝혀졌다 (Buerke et al., J. Pharm. Exp. Therp. 286: 429-38, 1998). 보체 억제 및 zsig37 의 Clq 결합 활성은 이러한 목적에 유용할 것이다.

Zsig37 의 콜라겐 및 C1q 와의 결합능력은 혈소판 흡착, 활성 또는 응집, 및 독성 산소 산물의 해리를 유발하는 염증성 과정의 활성을 예방하는 손상된 콜라겐성 조직을 회복하는 데 유용할 것이다. 노출된 조직을 보체 활성, 혈전 활성 및 면역 활성, zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트와 같은 과정에 대하여 불활성으로 남겨둠으로서 국소빈혈 및 재관류 상해 효과 감소에 유용할 것이다. 구체적으로, 이러한 상해는 외상 손상 국소빈혈, 장교액, 및 혈류 확립 전- 및 후와 관련된 손상을 포함할 것이다. Zsig37 은 심폐 바이패스 국소빈혈 및 레세시테이션, 뇌졸증 또는 경피적 경활관 확장술 뿐만 아니라 사고에 의한 또는 외과수술-유발 혈관 외상과 같은 심근경색증 및 외상 후 혈관경련의 치료에 유용할 것이다.

Zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트는 또한 전립선 생물질 회복에 유용할 것이고 외과수술 장비는 보체 활성, 혈전 활성 또는 면역 활성에 대하여 물질 표면을 불활성으로 만든다. 이러한 물질은 콜라겐 또는 콜라겐 단편-코팅된 생물질, 젤라틴-코팅된 생물질, 섬유소-코팅된 생물질, 프브로넥틴-코팅된 생물질, 헤파린-코팅된 생물질, 콜라겐 및 겔-코팅된 스텐트, 동맥 이식, 합성 심장 판막, 인공 기관 또는 어느 1 ×10⁸보다 크게 zsig37 과 결합하는 혈관에 노출된 전립선 이용을 제한없이 포함한다. 이러한 물질의 코팅은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들어, US 특허번호 5,272,074 참조.

보체 및 C1q 는 염증에서 중요한 역할을 한다. 보체 활성은 C1q 와 면역글루블린의 결합에 의해 개시될 수 있다(Johnston, Pediatr. Infect. Dis. J. 12: 933-41,1993; Ward and Ghetie, Therap. Immunol. 2: 7794,1995). Clq 및 보체의 억제제는 항-염증제로서 유용할 것이다. 이러한 이용은 감염 예방을 이룰 수 있다. 추가적으로, 이러한 억제제는 보체 활성 및 C1q 에 대한 면역 복합체에 결합에 의해 매개되는 염증을 겪는 개인에게 투여될 수 있다. Zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합 단백질, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트는 상처 회복을 매개하는 방법, 손상된 상처 치료를 극복함으로서 상처 치료의 진행을 향상시키는 방법에 유용할 것이다. 상처 치료의 진행은 예를 들어, 염증의 감소, 섬유아세포의 재순환, 상처 수축 및 감염 감소와 같은 요소를 포함할 것이다.

콜라겐과 결합하는 종양 세포의 능력은 종양의 전이에 기여할 수 있다. 콜라겐 결합의 억제제는 또한 흡착 상호작용 및 종양의 전이성 확산 조절에 유용하다 (Noeske-Jungbult et al., US 특허번호 5,723,312).

Zsig37 은 하기에 더 상세하게 개시되지만, Dainty et al., J. Pharmacol. 100: 767,1990 and Rhee et al., Neurotox. 16: 179,1995 의 과정을 사용하여 노레피네페린-수축 대동맥환에서 혈관확장 유발에서 발견되었다.

혈소판 흡착, 활성 및 응집은 본원에 개시된 방법 또는 혈소판 응집 분석법(Chiang et al., Thrombosis Res. 37: 605-12,1985) 및 혈소판 흡착 분석법(Peerschke and Ghebrehiwet, J. Immunol.144: 221-25,1990)과 같은 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 평가될 수 있다. Clq 및 보체 경로의 억제는 본원에 개시된 방법 또는 Suba and Csako, J. Immunol. 117: 304-9,1976 에 개시된 것과 같은 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 콜라겐에 대한 혈소판흡착 및 콜라겐-유발 혈소판 응집의 억제에 대한 분석법은 Keller et al., J. Biol. Chem. 268: 5450-6,1993; Waxman and Connolly, J. Biol. Chem. 268: 5445-9,1993; Noeske-Jungblut et al., J. Biol. Chem. 269: 5050-3 or 1994 Deckmyn et al.,Blood 85: 712-9,1995 에 개시된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

다양한 시험관 내 및 생체내 모델은 국소빈혈 및 재관류 상해에 대한 zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합 단백질, 항체, 아고니스트 및 안타고니스트의 효과를 평가하는 데 유용하다. 예를 들어, Shandelya et al., Circulation 88: 2812-26,1993; Weisman et al., Science 249: 146-151, 1991; Buerke et al., Circulation 91: 393-402,1995; Horstick et al., Circulation 95 : 701-8,1997 and Burke et al., J. Phar. Exp. Therp. 286: 429-38,1998 참조. 생체외 햄스터 혈소판 응집 분석법은 Deckmyn et al., 상기참조에 개시된다. 햄스터 및 비비에서 출혈 시간은 Deckmyn et al., 상기참조에 개시된 모델을 사용하여 zsig37 폴리펩티드 주입 후에 측정할 수 있다. 본 발명의 단백질 투여에 반응하여 혈전의 형성은 Deckmyn et al., 상기참조에 의해 제공된 햄스터 페모랄 정맥 혈전형성을 사용하여 측정될 수 있다. 혈류 상태하에서 zsig37의 투여 다음에 혈소판 흡착상의 변화는 Harsfalvi et al., Blood 85: 705-11,1995 에 개시된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

보체 억제 및 상처 치료는 zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합 단백질, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트가 단독 또는 예를 들어, 팔디핀, 모우바틴 또는 칼린과 같은 다른 알려진 콜라겐-유발 혈소판 활성 및 응집의 억제제와 조합하여 분석된다.

Zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합 단백질, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트는 본원에 개시되거나 피그의 피층의 치료(Lynch et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 7696-700, 1987) 및 유전적으로 당뇨병성 마우스에서 점진성 피부 상처(Greenhalgh et al., Am. J.Pathol.136:1235-46, 1990)와 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 단독으로 또는 상기에 개시된 다른 알려진 보체 억제제와 조합하여 분석될 수 있다.

게다가, zsig37 폴리펩티드, 단편, 그것의 융합 아고니스트 또는 안타고니스트는 항-미생물 이용분야에서 제약학적으로 유용할 수 있다. 예를 들어, 보체 성분 C1q 는 세균 및 바이러스 같은 감염제에 대하여 숙주 방어 역할을 한다. C1q 는 몇 개의 특이화된 기능을 나타내는 것으로 알려진다. 예를 들어, C1q 는 결합 항체 또는 C-반응성 단백질(CRP)과 상호작용에 의해서 보체 캐스캐이드를 유발한다. 또한, C1q 는 어떤 세균, RNA 바이러스, 마이코플라스마, 요산 결정체, 세균 엔도톡신 및 어떤 세포간 세포소기관 막의 리피드 A 성분과 직접적으로 상호작용한다. C1q 수용체에 결합하는 C1q 는 식작용을 촉진하는 것으로 여겨진다. C1q 는 또한 숙주 방어 시스템의 항체 형성 측면 향상을 나타낸다. 예를 들어, Johnston, Pediatr. Infect. Dis.J.12(11) :933-41,1993 참조 . 그러므로, 가용성 C1q-유사 분자는 감염제의 용균 또는 식작용을 촉진시키는 항-미생물제로서 유용할 수 있다.

C1q 의 양성적으로 하전된, 세포외, 3 차 헤릭스, 콜라겐 도메인 및 대식세포 스캐빈저 수용체는 리간드 결합에서 중요한 역할을 하는 것으로 결정되었고, 다음이온에 대하여 광범위한 결합 특이성을 가지는 것을 보였다(Acton et al., J.Biol. Chem. 268:3530-37, 1993). 리소포스포리피드 성장 인자(리소포스파티드산, LPA) 및 다른 분열유발 음이온은 손상된 조직 부위에 위치하고 상처의 회복을 돕는다. LPA 는 혈소판 활성 및 매트릭스 조립체의 상향-조절을 포함하는 많은 생물학적 효과를 나타낸다. LPA 는 다른 혈액 응고 인자와 상승작용을 하고 상처 치료를 매개하는 것으로 여겨진다.

C1q 및 대식세포 스캐빈저 수용체와 같은 단백질의 콜라겐성 도메인은 LPA 와 같은 산성 인지질에 결합하는 것으로 알려진다. Zsig37 의 콜라겐 도메인의 9 합체 영역, SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 127-135 는 C1q 및 대식세포 스캐빈저 수용체상에서 발견되는 콜라겐 도메인과 서열 상동성을 공유한다. Zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합, 아고니스트 또는 안타고니스트의 LPA 와 같은 분열유발성 음이온과의 상호작용은 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 결정될 수 있고, 예를 들어, Acton et al., 상기 참조 참조. 본 발명의 폴리펩티드 및 항체에 의한 염증 과정 억제는 또한 손상된 부위에서 감염 예방에 유용할 것이다.

제약학적 사용의 경우에, 종래의 방법에 따라서 본 발명의 단백질은 비경구적, 경구적, 코, 직장, 국소적, 경피적 투여등과 함께 조제될 수 있다. 바람직한 투여는 혈관 손상 부위 또는 그 부근에서 만들어진다. 일반적으로, 제약학적 조제물은 식염수, 완충 식염수, 물내의 5 % 덱스트로스등과 같은 제약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 조합하여 zsig37 단백질을 포함할 것이다. 조제물은 하나 이상의 부형제, 보존제, 용해제, 완충제, 작은병 표면상의 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민등을 더 포함할 수 있다. 조제 방법은 당업계에 공지되고 예를 들어,Remington : The Scinece and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed.,Mack Publishing Co., Easton PA, 19^thed.,1995 에 개시된다. 치료적 투여량은 치료될 상태의 성질 및 심각성, 환자 특성등을 고려하여 일반적으로 허용된 기준에 따라 임상의사에 의해서 결정될 것이다. 투여량의 결정은 당업자의 수준내이다.

본원에 사용될 때, zsig37 폴리펩티드, 단편, 융합 단백질, 아고니스트 또는 안타고니스트의 "제약학적 유효량" 은 원하는 생물학적 결과를 유발하기에 충분한 양이다. 결과는 신호, 징후, 또는 질병의 원인의 경감, 또는 생물시스템의 어느 다른 원하는 변형일 수 있다. 예를 들어, zsig37 폴리펩티드의 유효량은 징후의 주관적인 경감이나 임상의사 또는 다른 자격있는 관찰자에 의해 지목된 대로 객관적으로 확인가능한 개선을 제공하는 것이다. 이러한 zsig37 폴리펩티드의 유효량은 예를 들어, 콜라겐-활성 혈소판 활성의 억제를 제공할 것이고, C1q 를 포함하는 보체 경로는 환자의 맥관구조내에서 국부화된 혈류 및/또는 국소빈혈 및 재관류의 손상성 효과의 감소를 향상시킬 것이다. Zsig37 폴리펩티드의 유효량은 치료되는 질환 또는 징후에 의존하여 광범위하게 다양할 것이다. 투여될 폴리펩티드 양, 및 조제물에서 그것의 농도는 선택된 부형제, 투여 경로, 특정 폴리펩티드의 잠재성, 환자의 임상 상태, 조제물에서 화합물의 부작용 및 안정성에 의존한다. 그러므로, 임상의사는 해당 환자 또는 유사한 환자의 임상 경험에 따라 조제물에서 적당한 농도를 포함하는 적당한 제제뿐만 아니라 투여될 조제물의 양을 채용할 것이다. 이러한 양은 부분적으로 치료되는 특정 상황, 나이, 몸무게, 및 환자의 일반적인 건강, 및당업자에게 자명한 다른 인자에 의존할 것이다. 전형적인 투여량은 대상의 0.01-100 mg/kg 의 범위일 것이다. 벌룬 카테테르와 같은 이용분야에서 전형적인 투여량은 대상의 0.05-5 mg/kg 이다. 특정 화합물의 투여량은 실험 동물상의 연구와 조합하여 시험관 내 또는 체외 연구를 통해 결정될 수 있다. 시험관 내 또는 체외에 유효한 것으로 밝혀진 화합물의 농도는 동물 연구에 대한 가이드를 제공하고, 여기에서 투여량은 작용 부위에 유사한 농도를 제공하기 위해 계산된다.

본 발명은 하기의 제한되지 않은 실시예에 의해서 더 예시된다.

(실시예 1)

EST 서열의 신장

본 발명의 신규한 zsig37 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드는 EST 데이타베이스로부터 EST 를 선택하는 단계, 그것에 기초하여 단백질 서열을 예견하는 단계, 및 EST 에 기초하여 예견된 단백질과 가장 상동성있는 분비 단백질에 대한 공지된 서열 데이타베이스를 찾는 단계에 의해 최초로 확인되었다. 공지된 분비 단백질과 생물학적으로 관심있는 상동성을 가지는 단백질을 잠재적으로 코드화하는 EST 가 더 이상의 연구로 확인되었다. 단일 EST 서열을 발견했고, 지방세포 특이적 단백질과의 상동성이 예견되었다. 예를 들어, Scherer et al., J.Biol.Chem. 270 (45):26746-9,1995 참조. 상응하는 cDNA 를 확인하기 위해서, 전체 코딩 서열을 포함하는 것으로 여겨지는 클론을 서열결정에 사용했다. 제조자의 지시에 따라,Invitorget S.N.A.P.^TMMiniprep kit (Invtirogen, Crop.,San Diego, CA) 를 사용하여 LB + 50 μg/ml 암피실린에서 5 ml 하룻밤동안의 배양물을 준비했다. 주형을 제조자의 지시에 따라서, ABI PRISM^TMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer Corp.)를 사용하여 ABIPRISM^TM모델 377 DNA 서열기상(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.)에서 서열결정했다. 클론-함유 벡터상의 SP6 및 T7 프로모터에 대한 올리고뉴클레오티드 ZC695 (SEQ ID NO: 5), ZC694 (SEQ ID NO: 6)를 서열결정 프라이머로 사용했다. 올리고뉴클레오티드 ZC13210 (SEQ ID NO: 7), ZC13588 (SEQ ID NO: 8), ZC13532 (SEQ ID NO: 9), ZC13641 (SEQ ID NO: 10), ZC13586 (SEQ ID NO: 11), ZC13651 (SEQ ID NO: 12), ZC13622 (SEQ ID NO: 13), ZC13625 (SEQ ID NO: 14), ZC13650 (SEQ ID NO: 15), ZC13589 (SEQ ID NO: 16), ZC13624 (SEQ ID NO: 17),ZC13531 (SEQ ID NO: 18), ZC13587 (SEQ ID NO: 19), 및 ZC13623 (SEQ ID NO: 20)을 클론으로부터 서열을 완성하기 위해 사용했다. 서열결정 반응을 Hybaid OmniGene Temperature Cycling System (National Labnet Co., Woodbridge, NY)상에서 수행했다. SEQUENCHER^TM3. 0 서열 분석 소프트웨어 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI)를 데이타 분석을 위해 사용했다. 결과적인 2769 bp 서열이 SEQ ID NO:1 으로 개시된다. SEQ ID NO: 1 으로 나타난 서열과 본래 유도된 EST 서열의 비교는 1 개의 염기쌍 불명료성(미공지 "N" 잔기) 및 어떤 염기쌍도 삽입되지 않았음을 보였고 불명료성의 분석에서 루신의 확인 및 추론된 아미노산 서열사이에 0 프레임 이동을 초래했다.

(실시예 2)

조직 분배

노던을 Clontech (Palo Alto, CA) 로부터 Human Multiple Tissue Blot 을 사용하여 수행했다. SEQ ID NO:1 에서 보여진 완성형 단백질의 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 30 염기 DNA 프로브 (ZC12447; SEQ ID NO:4)를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 제조자의 특정에 따른 전술한 반응 완충액 (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) 을 사용하여³²P 로 방사성 표지했다. 프로브를 NUCTRAP 푸쉬 컬럼(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)을 사용하여 정제했다. EXPRESSHYB (Clontech, Palo Alto, CA) 용액을 예비혼성화 및 노던 블럿용 혼성화 용액으로 사용했다. 혼성화는 50 ℃ 에서 하룻밤동안 발생했고, 그 다음 블럿을 RT 에서 2X SSC 및 0.1% SDS 에서 세척했고, 그 다음 68 ℃ (녹는점보다 5 ℃ 미만) 에서 1X SSC 및 0. 1% SDS 에서 세척했다. 1 개의 전사체 크기는 대략 2.8 kb 로 관찰되었다. 신호 강도는 심장 및 태반에서 가장 높았고, 신자, 난소, 부신 및 골격 근육에서 상대적으로 덜 강한 신호이고, 노던 블럿상에 존재하는 다양한 다른 조직에서 더 낮은 신호였다.

추가적인 노던 블럿 분석을 거트 노던 조직 블럿(Gut Northern Tissue Blot)을 사용하여 행했다. 블럿을 사람의 결직장 선암종 세포 라인 SW480 (Clontech, Palo Alto, CA), 사람의 작은 창자 조직 (Clontech), 사람의 위 조직 (Clontech),사람의 창자 평활근 세포 라인 (Hism; ATCC No. CRL1692; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD), 정상인 결장 세포 라인 (FHC; ATCC No. CRL-1831; American Type Culture Collection) 및 사람의 정상 태아의 작은 창자 세포 라인 (FHs74 Int. ; ATCC No. CCL241; American Type Culture Collection)으로부터 mRNA 를 사용하여 준비했다.

총 RNA 를 Hism, FHC 및 FHs74 Int.로부터 산 구아니듐 방법(Cheomczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156-9,1987)을 사용하여 분리했다. polyA⁺RNA 를 polyA⁺RNA 를 보유하는 컬럼을 통하여 총 RNA 를 용출함으로서 선택했다. (Aviv et al., Proc. Nat. Acad. Sci.69: 1408-12,1972). 각 샘플로부터 2 μg 의 polyA⁺RNA 를 2.2 M 포름알데히드 및 인산 완충액의 1.5 % 아가로스 겔에서 분리했다. RNA 를 하룻밤동안 20X SSC 에서 Nytran 막(Schleicher and Schuell, Keene, NH)으로 옮겼다. 블럿을 0.12 줄에서 UV Stratalinker 2400 (Stratagene, La Jolla, CA) 으로 처리했다. 그 다음 블럿을 1 시간동안 80 ℃ 에서 굽는다.

총 길이 cDNA (SEQ ID NO: 1 으로 보여짐) 를 PCR 로 증폭했고, 제조자의 특정에 따른 Rediprime pellet kit (Amersham, Arlington Heights, IL)를 사용하여³²P dCTP 로 방사성 표지했다. 블럿을 56 ℃ 에서 하룻밤동안 EXPRESSHYB (Clontech) 에서 혼성화했다. 블럿을 2X SSC 및 0.1% SDS 에서 실내온도로 세척했고, 그 다음 65 ℃ 에서 2X SSC 및 0.1% SDS 에서 세척했고, 최종적으로 65 ℃ 에서 0.1X SSC 및 0.1% SDS 에서 세척했다. 결과는 zsig37 이 사람의 창자 평활근 세포 라인 HISM 을 제외하고 모든 조직에 혼성화했다는 것을 보여주었다.

(실시예 3)

Zsig37 유전자의 염색체 지도

zsig37 유전자를 사람의 염색체 17, 영역 17q25.2 에 NIGMS 사람/설치류 체세포 세포 하이브리드 맵핑 패널 넘버 2 (Human/Rodent Somatic Cell Hybrid Mapping Panel Number 2) (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of Medical Research) 를 사용하여 PCR 에 의해 맵핑했다. 패널은 각각 하나의 특이적 사람 염색체 및 모 DNA 를 보유하는 24 개의 사람/설치류 체세포 하이브리드로부터 분리된 DNA 로 구성된다. Zsig37 유전자 맵핑의 경우에, 20 μl 반응을 96-웰 마이크로티터 플레이트에서 셋업했고 (Stratagene, La Jolla, CA), "RoboCycler Gradient 96" 열 사이클러 (Stratagene) 를 사용했다. 각각의 27 PCR 반응은 2 μl 10X KlenTaq PCR 반응 완충액 (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1.6 μl dNTP mix (각 2.5 mM, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 μl 센스 프라이머 (SEQ ID NO: 21), 1 μl 안티센스 프라이머 (SEQ ID NO: 22), 2 μl RediLoad (Research Genetics, Inc.), 0.4 μl 50X Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Inc.), 총 부피 20 μl 를 위해 각 하이브리드 클론 또는 대조 및 ddH₂0 으로부터의 25 ng 의 DNA 로 구성된다. 반응을 동량의 미네랄 오일로 오버레이했고 밀봉했다. PCR 사이클러 조건은 95 ℃ 에서 5 분변성 최초 1 사이클, 95 ℃ 에서 1 분 변성 35 사이클, 60 ℃ 에서 1 분 어닐링 및 72 ℃ 에서 1.5 분 연장, 다음에 72 ℃ 에서 7 분간 최종 1 사이클 연장으로 한다. 반응을 3% NuSieve GTG 아가로스 겔에서 (FMC Bioproducts, Rockland, ME) 전기영동에 의하여 분리했다.

(실시예 4)

포유동물 발현 벡터의 제조

zsig37NEE/pZP9 및 zsig37CEE/pZP9

2 개의 발현 벡터를 zsig37 폴리펩티드, zSIG37NEE/pZP9 및 zSIG37CEE/pZP9를 생산하기 위해 준비했고, 여기에서 구조체는 C- 또는 N-말단 Glu-Glu 표지를 가지는 zsig37 폴리펩티드를 발현하도록 유전적으로 설계되었다.

Zsig37NEE/pZP9

800 bp PCR 생성 zsig-37 DNA 단편을 PCR 프라이머 및 상기 실시예 1 에 개시된 주형으로서 ZC15040 (SEQ ID NO: 24) 및 ZC15033 (SEQ ID NO: 25)을 사용하여 생성하였다. PCR 반응을 94 ℃ 에서 3 분간 인큐베이션했고, 그 다음 94 ℃ 에서 30 초, 30 ℃ 에서 20 초 및 72 ℃ 에서 1 분 5 사이클 그 다음, 94 ℃ 에서 30 초, 65 ℃ 에서 20 초 및 72 ℃ 에서 1 분 25 사이클 동안 계속했다. 72 ℃ 에서 5 분 연장했다. 그 다음 결과적 PCR 생산물을 1X 완충액과 함께 0.9 % TBE 아가로스 겔상에서 수행했다. 예견된 크기의 밴드를 절제했고, DNA 를 제조자의 지시에 따라 Qiaex II수지(Qiagen)로 겔로부터 정제했다. DNA 를 제한 효소 Bam HI 및 Xba I 으로 분해했고, 다음에 추출 및 침전시켰다.

절제되고 제한 분해된 zsig37 DNA 단편을 제한 효소 Bam HI 및 Xba I 으로 컷된 플라스미드 NEE/pZP9 로 아클론했다. zsig37NEE/pZP9 발현 벡터에 TPA 리더를 삽입하고 zsig37 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드 서열의 N-말단에 Glu-Glu 표지 (SEQ ID NO: 26)를 부착한다. 플라스미드 NEE/pZP9 (American Type Culture Collection 에 기탁, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, ATCC No. 98668)는 마우스 메탈로티오나인-1 프로모터, TPA 리더 펩티드 , 그 다음 Glu-Glu 표지 (SEQ ID NO:26)를 코드화하는 서열, 코드 서열의 삽입을 위한 다중 제한 부위, 및 사람 성장 호르몬 터미네이터를 가지는 발현 카세트를 포함하는 포유동물 발현 벡터이다. 플라스미드는 또한 E.coli 복제 기점, SV40 프로모터, 인핸서 및 복제 기점, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가지는 포유동물 선택 마커 발현 단위를 포함한다.

zsig376CEE/pZP9

866 bp PCR 생성 zsig37 DNA 단편을 PCR 프라이머로서 ZC15721 (SEQ ID NO: 27) 및 ZC15035 (SEQ ID NO: 28) 를 사용하여 상기에 제시된 과정에 따라서 제조했다. 정제된 PCR 단편을 Eco RI 및 Bam HI 으로 분해했고, 상기에 개시된 대로 Qiaex II 수지를 사용하여 겔 정제했다.

절제되고 제한 분해된 zsig37 DNA 를 Eco RI 및 Dam HI 으로 컷된 플라스미드 CEE/pZP9 에 아클론했다. zsig37CEE/pZP9 발현 벡터는 고유한 zsig37 신호 펩티드를 사용하고, 정제 목적으로 Glu-Glu 에피토프(SEQ ID NO: 26)가 C-말단에 부착된다. 플라스미드 CEE/pZP9 (American Type Culture Collection 에 기탁, 12301Parklawn Drive,Rockville, MD, ATCC No. 98668) 는 마우스 메탈로티오나인-1 프로모터, 코드 서열의 삽입을 위한 다중 제한 부위, Glu-Glu 표지 (SEQ ID NO:26) 를 코드화하는 서열, 정지 코돈 및 사람 성장 호르몬 터미네이터를 가지는 발현 카세트를 포함하는 포유동물 발현 벡터이다. 플라스미드는 또한 E.coli 복제 기점, SV40 프로모터, 인핸서 및 복제 기점, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가지는 포유동물 선택 마커 발현 단위를 가진다. 포유동물은 또한 E.coli 복제기점, SV40 프로모터, 인핸서 및 복제 기점, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가지는 포유동물 선택가능한 마카 발현 단위를 포함한다.

N-및 C-표지된 구조체의 경우에, 약 30 ng 의 제한 분해 삽입체 및 50 ng 의 해당하는 벡터를 4 시간동안 실내온도에서 연결했다. 각 연결 반응의 1 μl 를 제조자의 지시에 따라 DH10B 수용성 세포(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) 에 독립적으로 일렉트로포레이션했고, 50 mg/ml 암피실린을 함유하는 LB 플레이트상에 플레이트했고, 하룻밤동안 인큐베이션했다.

콜로니를 상기에 개시된 대로 PCR 로 스크리닝했다. zsig37NEE/pZP9 및 zsig37CEE/pZP9 를 스크리닝하기 위한 프라이머는 ZC13006 (SEQ ID NO: 29) 및 ZC13007 (SEQ ID NO: 20) 이었다. PCR 반응을 94 ℃ 에서 2.5 분 인큐베이션했고, 그 다음 94 ℃ 에서 10 초, 58 ℃ 에서 20 초 및 72 ℃ 에서 1 분동안 25 사이클 계속했다. 그 다음, 72 ℃ 에서 5 분 연장을 했다. 양성 클론의 삽입 서열, zsig37NEE 에 대한 1013 bp 및 zsig37CEE 에 대한 950 bp 단편은 서열 분석에 의해 증명되었다. 광범위한 플라스미드 제조는 제조자의 지시에 따라 QIAGENMaxiprep kit (Qiagen) 를 사용하여 행했다.

(실시예 5)

zsiq37NEE 및 CEE 폴리펩티드의 트랜스펙션 및 발현

BHK 570 세포 (ATCC No. CRL-10314)를 10 cm 조직 배양물 디쉬에 플레이트했고 DMEM/FBS 배지 (DMEM, Gibco/BRL 고 글루코스, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% 태아 소 혈청 (Hyclone, Logan, UT), 2 μM L-글루타민 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 μM 피루브산 나트륨(Gibco BRL))의 37 ℃, 5 % CO₂에서 대략 50 내지 70 % 합류하도록 배양을 허용했다. 그 다음 세포를 무혈청(SF) 배지 조성물 (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 2 mM L-글루타민, 2 mM 소듐 피루베이트, 10 ug/ml 트랜스페린, 5 μg/ml 인슐린, 10 μg/ml 페투인 및 2 ng/ml 세레늄)에서 Lipofectamine^TM(Gibco BRL)을 사용하여 플라스미드 zsig37NEE/pZP9 (N-말단 Glu-Glu 표지) 또는 zsig37CEE/pZP9 (C-말단 Glu-Glu 표지)로 트랜스펙션했다. zsig37NEE/pZP9 의 16 μg 및 zsig37CEE/pZP9 의 16 μg 을 각각 15 ml 튜브에서 희석하여 최종 총 부피를 640 μl SF 배지로 했다. 각각의 튜브에서, 35 μl 의 Lipofectamine^TM(Gibco BRL) 을 SF 배지의 605 μl 와 혼합했다. Lipofectamine^TM혼합을 DNA 혼합에 첨가하고 실내온도에서 대략 30 분 인큐베이션을 허용했다. SF 배지의 5 ml 를 DNA: Lipofectamine^TM혼합물에 첨가했다. 세포를 SF 배지의 5 ml 로 한 번 린스했고, 흡출했고, DNA: Lipofectamine^TM혼합물을첨가했다. 세포를 5 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션했고, 그 다음 6.4 ml 의 DMEM /10 % FBS, l% PSN 배지를 플레이트에 첨가했다. 플레이트를 37 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션했고, DNA: Lipofectamine^TM혼합물을 다음 날 새로운 FBS/DMEM 배지로 교환했다. 트랜스펙션 후 2 일 째, 세포를 1: 50, 1: 100 및 1: 200 에서 150 mm 플레이트의 선택 배지(1 μM MTX 를 가지는 ESTEP #1)로 분할한다. 플레이트를 트랜스펙션 후 5 일에 다시 새로운 선택 배지로 교환한다.

콜로니 스크리닝

트랜스펙션 후 대략 10-12 일에, 150 mm 배양물 디쉬의 메토트렉세이트 내성 콜로니를 각 트랜스펙션으로부터 취했고, 배지를 흡출했고, 플레이트를 10 ml 무-혈청 ESTEP 2 배지 (668.7g/50L DMEM (Gibco), 5.5 g/50L 피루브산, 나트륨염 96% (Mallinckrodt), 185.0g/50L NaHC0₃(Mallinkrodt), 5.0 mg/ml, 25 ml/50L 인슐린, 10.0 mg/ml 및 25 ml/50L 트랜스페린)로 세척했다. 세척 배지를 흡출했고 5 ml 무혈청 ESTEP 2 로 교환했다. 그 다음, 무혈청 ESTEP 2 에 예비-담금된 무균 테프론 그물 (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA)을 세포위에 놓았다. 그 다음, 무혈청-ESTEP 2 에서 예비-담금된 무균 니트로셀룰로스를 그물위에 놓았다. 니트로셀룰로스상의 방향 표지를 배양물 디쉬에 옮겼다. 그 다음, 플레이트를 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터에 5-6 시간동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후에, 여과기를 제거했고, 배지를 흡출했고 DMEM/5% FBS, 1X PSN (Gibco BRL) 배지로 교체했다. 그 다음, 여과기를 50 ml 완충액 (25 mM Tris, 25 mM 글리신, 5 mM P-머캅토에탄올)을포함하는 밀봉가능한 백에 놓았고 10 분동안 65 ℃ 물욕에서 인큐베이션했다. 여과기를 회전하는 쉐이커상에서 실내온도로 15 분동안 10 % 무지방 건조 우유/웨스턴 A 완충액(웨스턴 A: 50mM Tris pH 7.4,5 mM EDTA, 0.05% NP-40,150 mM NaCl 및 0.25% 젤라틴)에서 차단했다. 그 다음 여과기를 회전하는 쉐이커상에서 4 ℃ 하룻밤동안 2.5 % 무지방 건조 우유/웨스턴 A 완충액(웨스턴 A: 50mM Tris pH 7.4,5 mM EDTA, 0.05% NP-40,150 mM NaCl 및 0.25% 젤라틴)에서 1:1000 희석으로 항-Glu-Glu 항체-HRP 결합체와 함께 인큐베이션했다. 그 다음, 여과기를 세척당 5-15 분, PBS 와 0.1% 트윈 20 에서 실내온도로 3 번 세척했다. 여과기를 제조자의 지시에 따라, ECL 시약(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)과 함께 현상시켰고 대략 5 분동안 필름(Hyperfilm ECL, Amersham)에 노출시켰다.

필름을 콜로니를 포함하는 플레이트와 정렬했다. 가이드로서 필름을 사용하여, 적당한 콜로니를 선택했다. 무균, 3 mm 콜로니 디스크 (PGC Scientific Corp., Frederick, MD) 를 트립신에 담구었고, 콜로니상에 놓았다. 각 구조체로부터 12 개의 콜로니를 96 웰 플레이트내의 200 μl 의 선택 배지에 옮겼다. 각 콜로니에 대해 일련의 7 번, 2-배 희석을 수행했다. 37 ℃ 에서 1 주동안 세포를 배양했고, 최적 밀도인 세포의 가장 낮은 희석을 수용한 웰을 선택했고, 트립신 처리했고, 선택 배지를 포함하는 12 웰 플레이트에 옮겼다. 또한 150 mm 배양물 디쉬를 트립신 처리했고 세포 잔류물을 풀했고 웨스턴 분석 및 마이코플라스마 시험에 놓았다. 풀을 저장을 위해 냉동시켰다.

클론을 12 웰 플레이트로부터 2 개의 T-75 훌라스크로 직접 확장시켰다. 1개의 훌라스크를 세포 성장을 계속하도록 하였고, 다른 훌라스크를 웨스턴 블럿 분석을 위해서 배양된 무혈청 ESTEP 2 에서 배양했다. 웨스턴 블럿 분석에 기초하여, 각각의 발현 구조체의 클론을 선택했고, 풀했고, 더 큰 배양물로 전이했다.

(실시예 7)

zsiq37CEE 의 광범위한 포유동물 발현

zsig37CEE 를 발현하는 합류 세포를 포함하는 1 개의 T-162 훌라스크 및 zsig37NEE 를 포함하는 1 개를 상기에 개시된 발현 과정으로부터 얻었고, 각각 4 개의 T-162 훌라스크로 확장시켰다. 4 개의 결과적인 훌라스크 중 1 개를 4 개의 저온유리병을 동결시키는 데 사용했고, 나머지 3 개의 훌라스크를 Nunc 세포 팩토리(factory)를 생성하는 데 사용했다.

zsig37CEE 및 zsig37NEE 의 3 개의 T-162 훌라스크로부터 얻은 세포를 2 개의 Nunc 세포 팩토리에 독립적으로 공급하는 데 사용했다 (10 층, VWR 로부터 상업적으로 이용가능). 요약하면, 상기에 개시된 T-162 훌라스크로부터 얻은 세포를 트립신을 사용하여 분리했고, 풀했고, 그리고 37 ℃ 로 예비가열된 1.5 리터 ESTEP1 배지(668.7g/50L DMEM (Gibco), 5.5 g/50L 피루브산, 나트륨염 96% (Mallinckrodt), 185.0 g/50L NaHC03 (Mallinkrodt), 5.0 mg/ml 및 25 ml/50L 인슐린 (JRH Biosciences), 10.0 mg/ml 및 25 ml/50L 트랜스페린 (JRH Biosciences), 2.5L/50L 태아 소 혈청 (특징화) (Hyclone), 1 μM MTX , 7.05 +/-0.05 로 pH 조정됨)에 첨가했다. 그 다음, 세포를 포함하는 배지를 깔대기에 의해서 Nunc 세포 팩토리에 부었다. 세포 팩토리를 37 ℃/5.0 % CO₂인큐베이터에 놓았다.

80-100 % 합류, 가시적인 염색 시험(페놀 레드 칼라 변화)을 Nunc 세포 팩토리 수용물상에서 수행했다. 어떠한 염색도 관찰되지 않았을 때, 합류 팩토리으로부터 상청액을 작은 회수기에 부었고, 샘플화했고, 폐기했다. 그 다음 흡착 세포를 400 ml PBS 로 한 번 세척했다. 팩토리로부터 세포를 분리하게 위해서, 100 ml 의 트립신을 각각에 첨가했고 제거했고, 그 다음 세포를 5 내지 10 분동안 잔여 트립신에서 인큐베이션했다.

세포를 ESTEP1 배지와 함께 2 번, 200 ml 세척한 다음 수거했다. 10 개의 ESTEP1 배지-함유 병(각각 1.5 리터, 37 ℃)의 각각에 40 ml 의 수거된 세포를 첨가했다. 그 다음, 1.5 리터 병을 Nunc 팩토리를 채우기 위해 사용했다. 각 세포 펙토리를 37 ℃/5.0 % CO₂인큐베이터에 놓았다.

80-90% 합류, 가시적 염색 시험(페놀 레드 색상 변화)을 Nunc 세포 팩토리상에서 수행했다. 염색이 전혀 관찰되지 않았을 때, 융합성 팩토리로부터 상청액을 작은 회수기에 부었고, 샘플화했고 폐기했다. 그 다음 세포를 400 ml PBS 로 세척했다. 1.5 리터의 ESTEP2 배지 (668.7g/50L DMEM (Gibco), 5.5 g/50L 피루브산, 나트륨염 96% (Mallinckrodt), 185. 0 g/50L NaHCO₃(Mallinkrodt), 5.0 mg/ml, 25 ml/50L 인슐린, 10.0 mg/ml 및 25 ml/50L 트랜스페린)를 각 Nunc 세포 팩토리에 넣었다. 세포 팩토리를 37 ℃/5.0% C0₂에서 인큐베이션했다.

대략 48 시간에서 가시적 염색 시험(페놀 레드 색상 변화)을 Nunc 세포 팩토리상에서 수행했다. 각 팩토리로부터 상청액을 작은 회수기에 부었다. 새로운 무-혈청 배지(1.5 리터)를 각 Nunc 세포 팩토리에 부었고, 팩토리를 37 ℃/5.0 % CO₂에서 인큐베이션했다. 각 구조체로부터 1 ml 의 상청액 배양을 현미경 슬라이드로 옮겼고, 염색에 관하여 현미경 분석을 했다. 각 구조체에 대해 작은 회수기의 내용물을 풀했고 즉시 여과했다. 그 다음, 48 시간에서 실질적으로 상기에 개시된 대로 제 2 의 배양을 수행했고, 그 후 세포 팩토리를 폐기했다. 무균으로 조립된 여과기 트레인 장치를 배양 상청액(조정 배지)의 무균 여과에 사용했다. 조립체는 하기와 같다: 튜빙은 Opti-Cap 여과기(Millipore Corp., Bedford, MA) 및 Gelman Supercap 50 여과기 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)에 와이어-결합되었다. 또한 Supercap 50 여과기는 후드에 위치한 무균 캡핑 용기에 부착되었다; Millipore Opti-cap 여과기의 업스트림에 위치한 튜빙을 연동 펌프에 삽입했다; 그리고 튜빙의 자유 말단을 큰 배양 용기에 놓았다. 연동 펌프를 모든 조정 배지가 0.22 μm 최종 여과기를 통해 무균 수거 용기로 통과할 때가지 200 내지 300 rpm 으로 계속했다. 여과액을 정제할 때까지 4 ℃ 의 찬 방에 놓았다. 배지를 제조자의 지시에 따라서, Millipore 5 kDA 컷오프 농축기 (Millipore Corp., Bedford, MA)로 10X 농축했고 항-FLAG 표지 항체(Kodak)를 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 했다.

Zsiq37CEE:

5 T-162 훌라스크 = 0.12 mg/L, 38 kDa;

1 팩토리, FBS = 0.12 mg/L, 38 kDa;

10 팩토리, FBS = 0.12 mg/L, 38 kDa;

10 팩토리 (#1), SF = 1.2 mg/L, 38 kDa; 및

10 팩토리 (#2), SF = 3.56 mg/L, 38 kDa Zsiq37NEE:

5 T-162 훌라스크 = 0.137 mg/L, 35 kDa;

1 팩토리, FBS = 0.137 mg/L, 35 kDa;

10 팩토리, FBS = 0.137 mg/L, 35 kDa;

10 팩토리(#1), SF = 1.37 mg/L, 35 kDa; 및

10 팩토리 (#2), SF = 4.11 mg/L, 35 kDa.

(실시예 7)

zsiq37 NEE 및 zsiq37 CEE 의 정제

다르게 표시되지 않는다면, 모든 작동은 4℃ 에서 수행했다. 하기의 과정을 N-말단 또는 C-말단 Glu-Glu (EE) 표지를 포함하는 zsig37 정제에 사용했다. 베이비 햄스터 키드니 (BHK) 세포로부터 얻어진 조정 배지의 총 25 리터를 연이어서 4 인치, 0.2 mM Millipore (Bedford, MA) OptiCap 캡슐 여과기 및 0.2 mM Gelman (Ann Arbor, MI) Supercap 50 을 통하여 무균 여과했다. 다음에, 재료를 300 kDa 컷오프 Amicon(Bedford, MA) S10Y3 막으로 고정된 Millipore ProFlux A30 접선면 유동 농축기를 사용하여 약 1.3 리터로 농축했다. 농축된 재료를 다시 상기에 개시된 대로, Gelman 여과기로 무균-여과했다. 프로테아제 억제제의 혼합물을 농축된 조정 배지에 첨가하여 최종 농도를 2.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0.001 mM 류펩틴 (Boehringer-Mannheim,Indianapolis, IN), 0.001 mM 페파스타틴 (Boehringer Mannheim) 및 0.4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim) 로 하였다. 하기에 개시된 대로 준비된 25.0 ml 샘플의 항-EE Sepharose 를 배치 흡착을 위해 샘플에 첨가했고, 혼합물을 4 ℃ 에서 18.0 h 동안 Wheaton (Millville, NJ) 롤러 배양 장치에서 부드럽게 교반했다.

그 다음 혼합물을 5.0 x 20.0 cm Econo-Column (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA) 에 부었고, 겔을 30 컬럼 부피의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척했다. 보유되지 않고 유동 산출된(flow-through) 분획을 폐기했다. 일단 280 nM 에서 유출물의 흡광도가 0.05 미만이라면, 유동 산출 컬럼을 0 으로 감소시켰고 항-EE Sepharose 겔을 0.4 mg/ml 의 EE 펩티드(AnaSpec, San Jose, CA)를 포함하는 PBS 의 2.0 컬럼 부피로 배치식 세척했다. 사용된 펩티드는 서열 Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp(SEQ ID NO: 31)을 가졌다. 4 ℃ 에서 1.0 시간 후에, 유동을 다시 시작했고, 용출된 단백질을 수거했다. 이 분획을 펩티드 용출이라 한다. 그 다음, 항-EE Sepharose 겔을 pH 2.5 에서 2.0 컬럼 부피의 0.1 M 글리신으로 세척했고, 글리신 세척을 분리하여 수거했다. 글리신-용출 분획의 pH 를 소량의 10 X PBS 를 첨가함으로서 7.0 으로 조정했고 필요한 경우 나중의 분석을 위해서 4 ℃ 에서 저장했다.

펩티드 용출을 제조자의 지시에 따라, 15,000 분자량 컷오프 막 농축기 (Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 5.0 ml 로 농축했다. 농축된 펩티드 용출을 유속 1.0 ml/분 에서 PBS 에서 평형된 1.5 x 50 cm Sephadex G-50 (Pharmacia, Piscataway,NJ) 컬럼상에서 BioCad Sprint HPLC (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 를 사용하여 크로마토그래피에 의해 자유 펩티드로부터 분리했다.2-ml 의 분획을 수거했고 280nM 에서 흡광도를 모니터했다. 280nM 에서 흡광되고, 컬럼의 무부피 근처의 용출하는 물질의 제 1 의 피크를 수거했다. 이 분획은 순수한 zsig37 NEE 또는 zsig37 CEE 였다. 순수한 물질을 상기에 개시된 대로 농축했고, SDS-PAGE 및 항-EE 항체로 웨스턴 블럿으로 분석했고, 샘플을 아미노산 분석 및 N-말단 서열결정을 위해 취했다. 샘플의 잔류물을 앨러쿼트했고, 표준 과정에 따라서, 80 ℃ 에서 저장했다.

환원제의 부재하에서 SDS-PAGE 겔상의 zsig37 NEE 의 전기영동은 분자량 39,000 에 해당하는 하나의 주요한 코마지(Coomassie) 블루-염색 밴드 및 60,000 및 116,000 사이의 분자량의 몇 개의 마이너 성분을 보였다. 모든 밴드는 웨스턴 블럿에서 항-EE 항체와 교차 반응성을 보였다. 환원제의 존재하에서, 관찰된 유일한 밴드는 39,000 kDa 단백질이었고, 그것의 코마지 블루 염색 강도는 증가했다. 이 밴드는 또한 웨스턴 블럿 상의 항-EE 항체와 교차 반응성을 보였다.

Zsig37 CEE 의 경우에, 환원제의 부재하에서 SDS-PAGE 겔상에서 전기영동은 분자량 39,000 에 해당하는 하나의 주요한 코마지 블루-염색 밴드 및 60,000 및 116,000 사이의 분자량의 몇 개의 마이너 성분을 보였다. 웨스턴 블럿에서, 분자량 150,000, 116,000, 및 60,000 에 해당하는 밴드만이 항-EE 항체와 교차 반응성을 보였다. 환원제의 존재하에서, 39,000 kDa 에서 코마지 블루-염색 밴드만이 관찰되었고, 이 물질은 웨스턴 블럿 상의 항-EE 항체와 교차 반응성을 보였다. 이러한 조건하에서, 소량의 교차-반응성 물질이 또한 150,000 kDa 에서 보여졌다.

항-EE Sepharose 의 제조

100 ml 베드 부피의 단백질 G-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) 를 500 ml Nalgene 0.45 마이크론 여과 단위를 사용하여 0.02 % 소듐 아자이드를 포함하는 100ml 의 PBS 로 3 번 세척했다. 겔을 pH 8.2 에서, 6.0 부피의 200 mM 트리에탄올아민으로 세척했고(TEA, Sigma, St. Louis, MO), 900 mg 의 항체를 포함하는 같은 부피의 EE 항체 용액을 첨가했다. 4 ℃ 에서 하룻밤동안의 인큐베이션 후에, 비결합 항체를 상기에 개시된 대로 5 부피의 200 mM TEA 를 가진 수지로 세척함으로서 제거했다. 수지를 2 부피의 TEA 에서 재현탁했고, 적당한 용기에 옮겼고, TEA 에서 용해된 디메틸피밀리미데이트-2HCl(Pierce, Rockford, IL)을 첨가하여 최종 농도 36 mg/ml 의 겔로 하였다. 겔을 45 분 동안 실내온도에서 진탕시켰고, 액체를상기에 개시된 대로 여과 단위를 사용하여 제거했다. 그 다음, 겔상의 비특이적 부위를 200 mM TEA 에서 5 부피의 20 mM 에탄올아민으로 실내온도에서 10 분동안 인큐베이션하여 차단했다. 겔을 0.02 % 소듐 아자이드를 함유하는 5 부피의 PBS 로 세척했고, 4 ℃ 에서 용액에 저장했다.

(실시예 8)

부착 및 증식 분석

zsig37 의 TF-1 세포 부착 및 확산을 촉진하는 능력을 하기와 같이 분석했다. 일련의 희석을 PBS 또는 ELISA 코팅 완충액 (0.1 M NaC03) 에서 C-말단 Glu-Glu-표지 zsig37, 10 내지 0.0625 μg/ml 으로부터 준비했고, 각각을 100 μl/웰로 96 웰 플레이트에 놓았다(Costar, Pleasanton, CA). 플레이트를 2 시간동안 37 ℃에서, 5 % CO₂로 인큐베이션했다. 그 다음 플레이트를 RPMI/10% FBS (RPMI 1640,2 mM L-글루타민, 110 μg/ml 피루브산 나트륨, PSN 및 10% 열 불활성화 태아 소 혈청)로 3 X 세척했고, 15 분동안 차단되도록 했다.

TF-1 cells (급성 골수종 세포로부터 유도)를 RPMI/10%FBS 에서 재현탁했고, 최종 부피 120 μl/웰로 zsig37CEE-코팅된 96 웰 플레이트에 10,000 세포/웰로 플레이트했다. 플레이트를 2 시간동안 5 % CO₂하에서 인큐베이션했다. 그 다음 플레이트를 PBS 로 3 번 세척했고, 200 μl/웰 성장 배지(RPMI/10%FBS, 5ng/ml GM-CSF) 를 첨가했다. 세포를 세척 전과 후에 현미경으로 조사했다.

염료 삽입 분석을 비색 변화 및 형광 신호의 증가에 기초한 흡착 세포의 숫자를 정량적 측정에 또한 사용했다. Alamar Blue^TM(AccuMed, Chicago, IL) 를 96 웰 플레이트에 첨가했고, 세포를 5 % CO₂에서 하룻밤동안 37 ℃ 에서 인큐베이션했다. 그 다음, 플레이트를 여기 파장 544 nm 및 방출 파장 590 nm 를 가진 형광계를 사용하여 스캔했다. zsig37CEE-0.1 M NaC0₃코팅된 플레이트보다 zsig37CEE-PBS 코팅된 플레이트상에 더욱 흡착된 세포가 있었다. 가용성 zsig37 의 첨가는 결합 zsig37 에 세포의 흡착을 차단하지 않는다.

제 2 의 분석을 5,000 세포/웰에서 상기에 개시된 대로 TF-1, DA-1 (IL-3 배지에서 과배양에 의해 B-세포 림프종을 가진 마우스의 림프절로부터 유래된 IL3 의존 세포 라인(Dr. Kenneth Kaushansky, University of Washington, Seattle, WA 에의해 제공)), pre-B (p53-/-마우스 골수 세포, IL-7 의존, B220+, Thyl low, Sca-1+), 및 A7BaF-3 세포 라인을 사용하여 수행했다. 또한 BHK 세포를 500 세포/웰에 플레이트했다. Zsig37 은 A7-BaF-3 세포의 성장을 향상시켰고 DA-1 세포의 성장을 약간 억제했다.

(실시예 9 )

마우스 오르토로그 서열

본 발명의 신규한 사람 zsig37 폴리펩티드-코드화 폴리뉴클레오티드를 상동성 있는 마우스 서열에 대한 마우스 EST 데이타베이스를 스크리닝하기 위해 사용했다. 단일 EST 서열을 발견했고 사람 zseg37 서열을 예견했다. 상응하는 cDNA 를 확인하기 위해서, 전 코드 서열을 포함할 것 같은 클론을 서열결정에 사용했다. 제조자의 지시에 따른 Invitrogen S. N. A. P Miniprep kit (Invitrogen Corp.)의 사용하여, LB + 50 μg/ml 암피실린에서 5 ml 하룻밤동안의 배양물을 준비했다. 주형을 ABIPRISM^TM모델 377 DNA 서열기상에서 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) 제조자의 지시에 따라 ABI PRISM^TM큰 염색 터미네이터 사이클 서열결정 레디 반응 키트(Perkin-Elmer Corp.)를 사용하여 서열결정했다. 올리고뉴클레오티드 ZC694 (SEQ ID NO: 6), ZC6768 (SEQ ID NO: 32), ZC18297 (SEQ ID NO: 33), ZC18298 (SEQ ID NO: 34), ZC18402 (SEQ ID NO: 35), ZC18403 (SEQ ID NO: 36), ZC18456 (SEQ ID NO: 37), ZC18457 (SEQ ID NO: 38), ZC18560 (SEQ ID NO: 39), ZC18561 (SEQ ID NO: 40), ZC18687 (SEQ ID NO: 41) 및 ZC18688 (SEQ ID NO: 42)을 클론으로부터 서열을 완성하기 위하여 사용했다. 서열 결정 반응을 하이브리드 OmniGene 온도 사이클링 시스템(National Labnet Co.,Woodbridge, NY)에서 행했다. SEQUENCHER^TM3. 1 서열 분석 소프트웨어 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) 를 데이타 분석을 위해서 사용했다. 결과적인 2559 bp 서열은 SEQ ID NO: 43 으로 개시되고 추론된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 44 로 개시된다. 사람 zsig37 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1)과의 배열은 뉴클레오티드 수준에서 77 % 동일성을 보였다. 추정적인 아미노산 서열(SEQ ID NO: 44)은 사람 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO: 2)과 77 % 동일성을 가진다.

(실시예 10)

세포 기초 분석법

Zsig37 폴리펩티드를 고 산출량, 죽지않는 골아세포 세포 라인에서 세포 반응을 선택적으로 활성화시키는 물질을 확인하기 위하여 시험관내 분석으로 분석했다. p53-/-(결핍)마우스로부터 유래된 성숙한 골아세포 세포 라인, 루시퍼라제의 발현을 유도하는 유발가능한 혈청 반응 요소(SRE) 을 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션된 CCC4 를 분석에 사용했다. 이러한 세포는 또한 내인성 PTH, PDGF 및 bFGF 수용체를 발현한다. SRE 의 자극 및 그에 따른 CCC4 세포에서 루시퍼라제의 발현은 화학 존재가 골아세포에서 유사분열 촉진 자극의 가능성을 나타낸다.

CCC4 라인은 트립신처리되었고 플레이트 배지에서 (alpha-MEM, 1% 열 불활성화 태아 소 혈청, 1 mM 피루브산 나트륨 및 2 mM L-글루타메이트) 5 x 10⁴세포/ml로 조정했고, Dynatech Microlite 불투명 화이트 μl 플레이트(Dynatech, Chantilly, VA)에 플레이트했고 (200 μl/웰) 37 ℃ , 5 % CO₂에서 하룻밤동안 인큐베이션했다. 그 다음 성장 배지를 흡출했고, 50 μl/웰 분석법 배지 (F-12 HAM, 0.5% 소 혈청 알부민, 20 mM HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 2 mM L-글루타메이트)로 교체했다. Zsig37 의 일련의 희석은 분석 배지에서(0.29-1000 ng/ml 최종 분석 농도) 행했고 웰에 첨가했다. Zsig37 샘플을 3 번 분석했다. 또한 혈청(음성) 및 bFGF (양성) 대조군을 사용했다. bFGF 의 최종 농도는 3 ng/ml 였다. 대조군을 4 번 분석했다. 플레이트를 37 ℃, 5% CO₂에서 4 시간동안 인큐베이션했다. 그 다음, 분석 배지를 흡출했고, 플레이트를 PBS 로 한 번 린스했다. 그 다음 각 웰에 25 μl 의 용해 완충액이 첨가되었다. (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, WI). 플레이트를 실내온도에서 15 분동안 인큐베이션했다. 50 μl/웰의 루시퍼라제 기질(Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp.)을 첨가했고, 루시퍼라제 활성을 2 초/웰 그 다음 1 초 연장에서 랩시스템 LUMINOSKAN으로 측정했다. 평균 기초(비유발) 신호를 3 ng/ml bFGF 마다 생산된 최대 유발의 비율로서 표 5 에 나타난 모든 해독으로부터 제외한다.

Zsig37 은 그들이 골아세포를 자극하는 것을 나타내면서 이 분석법에서 루시퍼라제의 분석을 자극한다. Zsig37 는 1000 ng/ml 에서 최대 73 내지 75 % 로 자극한다.

Zsig37 이 유사 성장 인자, 구체적으로는 티로신 키나제 수용체 리간드PDGF, bFGF 및 EGF (인슐린-R 음성) 으로서 작용하는 지를 결정하기 위하여 유사대응하는 유사 성장 인자 분석을 수행했다. 루시퍼라제 발현을 유도하는 유발가능한 혈청 반응 요소(SRE) 를 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션된 Swiss 3T3 마우스, Swiss 3T3 로부터 유래된 클론 세포 라인을 분석법에 사용했다. 이러한 세포는 또한 내인성 PMA, EGF 및 bFGF 수용체를 발현한다. SRE 자극 및 그에 따른 Swiss 3T3 세포에서 루시퍼라제의 발현은 화학 존재는 PDGF, bFGF 및 EGF 성장 인자 활성의 모방 가능성을 나타낸다.

Swiss 3T3 세포는 트립신처리되었고 상기에 개시된 대로 플레이트 배지에서 5 x 10⁴세포/ml 로 조정했고, 플레이트했고 인큐베이션했다. 그 다음 성장 배지를 흡출했고, 50 μl/웰 분석법 배지 (F-12 HAM, 0.5% 소 혈청 알부민, 20 mM HEPES)로 교체했다. Zsig37 의 일련의 희석은 분석 배지에서(0.29-1000 ng/ml 최종 분석 농도) 행했고 웰에 첨가했다. Zsig37 샘플을 3 번 분석했다. 또한 세포 증식을 촉진하기 위하여 혈청(음성) 및 bFGF (양성) 대조군을 사용했다. bFGF 의 최종 농도는 3 ng/ml 였다. 대조군을 4 번 분석했다. 플레이트를 37 ℃, 5% CO₂에서 4 시간동안 인큐베이션했다. 그 다음, 분석 배지를 흡출했고, 플레이트를 PBS 로 한 번 린스했다. 그 다음 각 웰에 25 μl 의 용해 완충액이 첨가되었다. (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, WI). 플레이트를 실내온도에서 15 분동안 인큐베이션했다. 40 μl/웰의 루시퍼라제 기질(Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp.)을 첨가했고, 루시퍼라제 활성을 2 초/웰 그 다음 1 초 연장에서 랩시스템 LUMINOSKAN으로 측정했다. 평균 기초(비유발) 신호를 3 ng/ml bFGF 마다 생산된 최대 유발의 비율로서 나타난 모든 해독으로부터 제외한다. bFGF, DDGF, EGF 또는 PMA 으로 이 세포 라인의 5 시간 처리는 SRE-루시퍼라제 발현의 25-50 배 유발을 초래한다.

Zsig37 은 이 분석법에서 루시퍼라제의 발현을 자극하는 것 같지 않다. Zsig37 은 1000 ng/ml 에서 최대 0.2 내지 0.1% 로 자극한다.

실시예 10

아데노바이러스 송달에 의한 zsig37 의 체내 투여

대략 12 주 된, 24 마리의 수컷 및 24 마리의 암컷 C57B16/J 마우스를 (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) 무게를 재고, 체온을 측정했고, 주입 전 4 일 동안 매일 음식 섭취를 모니터했다. (-4 일 내지-1 일). 0 일에, 마우스는 3 그룹으로 나뉘었고, 정맥 테일 정맥 주사에 의해서 또는 전혀 주사없이 0.1 ml 바이러스 (AdV-결여 1.8x1011 바이러스 입자/0.1 ml 또는 AdV-zsig37-CEE 5x1011 바이러스 입자/0.1 ml) 를 수용했다. 주입은 숙주 간의 감염을 초래했고 바이러스에 의한 송달 유전자의 발현은 24 시간내에 시작되고 1 내지 4 주동안 계속된다. 마우스의 3 그룹을 시험했다. 그룹 1 , 비처리, n=8 각 수컷 및 암컷. 그룹 2, AdV-결여(무바이러스), n=8 각 수컷 및 암컷. 그룹 3, AdV-zsig37 CEE, n=8 각 수컷 및 암컷.

동물의 체온, 중량 및 섭취된 음식 중량을 3 주의 연구기간 동안 모니터했다. 그룹간에 어떠한 차이도 발견할 수 없었다.

21 일에 암컷 마우스를 경부탈구에 의해서 안락사시켜서 희생시켰고 22 일에수컷도 마찬가지로 처치했다. 동물을 방혈시켰고 조직을 검시를 위해 수거했다.

표준 혈청 화학 패널을 희생시에 행했다. 간, 신장 및 대사 매개변수는 모두 정상 범위내였다. 그러나, Zsig37 처리 그룹과 바이러스-결여 처리 그룹간의 차이가 있었다. Zsig37 동물은 바이러스-결여 대조군보다 더 높은 평균 지방 인덱스를 가졌다. 차이가 중요하지는 않았지만, 더 이상의 연구가 보장되었다. 총 무-지방산을 각 동물에서 얻은 잔여 혈청상에서 분석했다. 혈청 무-지방산 수준에서 통계적으로 중요한 차이는 바이러스-결여를 수용하는 수컷 마우스(p=0.0379)와 바이러스를 코드화하는 zsig37 을 수용하는 수컷 마우스 사이에서 나타났다; zsig37 마우스가 더 높은 수준을 가졌다. 통계적으로 중요하지는 않지만, 차이는 또한 암컷(p=0.3357)에서 나타났다. 제거후에 간, 비장, 신장, 흉선, 심장 및 뇌의 중량을 쟀다. 처리 그룹간에 어떤 차이도 발견되지 않았다. 이러한 조직 및 골수의 조직병리학은 처리 그룹간의 어떤 차이도 보이지 않았다.

상기 결과를 확인하기 위해서, 제 2 의 스크린을 하기의 변형과 함께 상기에 개시된 대로 행했다. 3 그룹; a) 비처리 및 금식, b) AdV-결여 및 금식, c) AdV-zsig37-CEE 및 금식, 20 C57B16/J 함유, 각 수컷 및 암컷 10 마리를 시험했다. 마우스를 하룻밤동안 금식시켰고 100 μl 혈청을 수거하여 하기의 매개변수에 대한 기초 수준을 확립했다: 글루코스 단식,TP, 알카라인 포스파타제, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 무지방산 및 인슐린. 0 일에, 마우스에 0.1 ml 의 적당한 바이러스 용액으로 측면 테일 정맥에 주입했다. 하룻밤 금식 다음 17 일에 혈액을 수거했다. 3 주 후에, 마우스를 죽였고 혈액을 수거했다. 혈액 부분을 EDTA 와 혼합하여 CBS를 찾았고 잔류물을 상기에 개시된 대로 재-분석했고 스크린했다. 기관을 수거했고 조직병리학용으로 시체를 보관했다.

(실시예 11)

대동맥환의 혈관확장

대동맥환의 혈관확장에 대한 zsig37 의 효과를 (Dainty et al., J. Pharmacol. 100: 767,1990 and Rhee et al., Neurotox. 16: 179,1995) 과정에 따라 측정했다. 요약하면, 길이 4 mm 의 대동맥환을 4 개월 된 Sprague Dawley 래트로부터 취했고 변형된 Krebs 용액에 (118.5 mM NaCl, 4.6 mM KCl, 1.2 mM MgS0₄.7 H₂0,1.2 mM KH₂PO₄,2.5 mM CaCl₂. 2H₂0, 24.8 mM NaHC0₃및 10 mM 글루코스) 놓았다. 그 다음, 환을 등척의 힘 트랜스듀서(Radnoti Inc.,Monrovia, CA) 에 부착시켰고 데이타를 Ponemah 생리학 플랫폼(Gould Instrument systems, Inc.,Valley View, OH) 으로 기록했고, 10 ml 조직욕 산소화(95% O₂, 5% CO₂) 변형 Krebs 용액에 놓았다. 조직을 1 g 휴지 신장으로 조정했고 시험전 1 시간동안 안정화를 허용했다. 환을 1x10^-7M 노레피네페린 (Sigma Co., St. Louis, MO) 의 5μl 첨가에 의해서 최종 농도를 약 1x10^-9M 로 하여 시험했고, 최종 농도 2 X 1^-7M 로 무스카린 아세틸콜린 아고니스트 (Sigma Co.), 카르바콜로 환 보전에 대해 시험했다. 각 시험 후에, 환을 새로운 완충액으로 5 분 간격을 두고 3 번 세척했고 1 시간 방치했다. 혈관 확장을 시험하기 위해서, 환을 2 g 으로 수축시켰고 15 분동안 안정화시켰다. 그 다음, zsig37 을 수체교환없이 4 개의 욕 중 1, 2 또는 3 에 첨가했고 환의 신장을 기록했고 대조 환과 비교했다. 그 다음 환을 상기에 개시된 대로 노레피네페린으로 수축성을 시험했다. 환을 323, 162, 및 81 ng/ml zsog37 에서 시험했지만 투여량 반응은 결정될 수 없었다. 데이타의 통계적인 중요성을 평가하기 위해서, 결정자로서 팽창을 사용하여 모든 zsig37 및 대조 환에 대해 분할 시험을 행했다. Zsig37 로 시험된 12 환중의 10 은 7 대조의 2 와 마찬가지로 혈관확장했다. Fisher 는 P 값이 0.045 로 되게 했다. 결국, zsig37 이 노레피네페린 수축 대동맥환에서 혈관확장을 유발한다.

(실시예12)

매트릭스 단백질에 Zsig37 의 결합

ELISA (효소-결합 면역흡착 분석법)를 다양한 매트릭스 단백질 및 보체 C1q 에 zsig37 의 결합 측정에 사용했다. 사용된 매트릭스 단백질은 소 콜라겐 형태 I (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) 라미닌, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 사람 콜라겐 형태 II, III, IV, V, VI (Chemicon International, Temecula, CA)이었다. BSA V (Sigma Co.) 를 음성 대조군으로 사용했다. 사용 바로 직전에, 단백질을 2 X PBS (인산염 완충 식염수, Sigma Co.)로 희석하여 100 μg/ml 로 하였고 0.1 N NaOH 를 가지고 pH 7.2 로 조정했다. 각 단백질 샘플을 96 웰 플레이트로 4 번 플레이트(100 μl/웰)했다. 플레이트를 층류 후드에서 하룻밤동안 건조시켰고 1 X PBS 및 염색된 건조에서 400 μl 의 5 mg/ml BSA 를 가지고 3 번 세척했다. Zsig37 은 제조자의 지시에 따라 (Pierce, Rockford, IL) 표지된 FITC 였다. 각 웰에 5 %BSA, PBS 로 100 μl 의 1.8 μg/ml zsig37-FITC 를 첨가했다. 플레이트를 실내온도에서 1.5 시간동안 인큐베이션했고 그 다음 5 % BSA, PBS 로 3 번 세척했다. 그 다음, 각 웰에 100 μl 의 1:400 마우스 항-FITC/비오틴(Sigma Co.)을 첨가했다. 플레이트를 실내온도에서 1.5 시간 인큐베이션했고 그 다음 5% BSA, PBS 로 3 번 세척했다. 그 다음 플레이트를 1 시간동안 100 μl 의 1:1000 스트렙타비딘/HRP (Amersham, Piscataway, NJ) 로 인큐베이션했고 5 % BSA, PBS 로 3 번 세척했다. 그 다음 플레이트를 제조자의 지시에 따라 SupersignalUltra (Pierce, Rockford, IL) 를 사용하여 현상했다. 1 분간 반응 후에, 플레이트를 역으로 하고 건조를 패팅하여 플레이트로부터 잉여 액체를 제거했다. 플레이트를 X-레이 필름(Kodak, Rochester, New York)에 노출시켰다.

스크린의 결과는 피브로넥틴 및 콜라겐 I, II, III, V 및 VI 만이 zsig37-FITC 에 현저하게 결합한다는 것을 나타낸다. 이러한 결합은 라미닌, 비트로넥틴, 콜라겐 IV 또는 BSA 대조에서는 보이지 않았다.

(실시예 13)

콜라겐 형태 VI 에 zsig37 결합의 특이성

실시예 12 에 개시된 대로 결합에 관한 ELISA 분석을 결합을 정량적으로 평가하기 위해서 변형했다. 0.4 내지 4 μg/ml 범위내의 zsig37-FITC 는 상기에 개시된 대로 10 μg 의 콜라겐 형태 VI (Chemicon International)에 결합했다. Supersignal시약으로부터 발광을 Wallac 1420 플레이트 해독기 (Wallac, Gaithersburg MD) 및 ELISA 플레이트에 결합한 zsig37-FITC 의 정량측정으로 사용된 농도로 해독했다.

콜라겐 형태 VI 에 zsig37 의 결합은 전형적인 쌍곡선 결합 곡선(도 3 a)에 일치한다. 0.4 μg/ml 에서 플레이트된 결합 zsig37-FITC 는 0.8 내지 8 μg/ml 의 범위로 비표지 zsig37 을 첨가함으로서 콜라겐과 경쟁할 수 있다(도 3b). 이러한 데이타는 결합이 콜라겐 형태 VI 상의 도메인에 특이적이고 농도 의존적이라는 것을 나타낼 것이다.

(실시예 14)

보체 C1q 와 zsig37 결합

0.2 μg/ml 에서 zsig37-FITC 는 상기 실시예 13(도 4)에 개시된 방법에 의하여 0.1 내지 10 μg/ml 에서 보체 C1q (Sigma Co.)와 결합을 나타냈다. 결합양은 농도 의존적이고 포화가능하다.

(실시예 15)

Zsig37 에 의한 보체 억제

보체 분석을 96 웰 원형 하단 플레이트에서 행했다. 마그네슘 및 칼슘을 포함하는 젤라틴 베로날 완충액(141 mM NaCl, 1.8 mM 소듐 바르비톨, 3.1 mM 바르비투르산, 0.1% 소 젤라틴, 0.5 mM MgCl₂및 0.15 mM CaCl₂)을 모든 혈청 및 억제제 희석 뿐만 아니라 적혈구 현탁에 사용했다. 1/37.5 희석된(최종 희석 1/150) 50 μl 의 표준화 사람 보체 혈청(Sigma Co.)을 각 웰에 첨가했다. 억제제를 3 번, 50 μl/웰에 첨가했다. 혈청 및 억제제를 실내 온도에서 30 분동안 인큐베이션했다. 분석은 미감작된 양 적혈구(Colorado Serum Co.,Denver, CO), 감작된 양 적혈구, Hemolysin 제조자의 프로토콜 (BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) 을 사용하여 감작되고 16 mM EGTA, 및 4 mM Mg⁺⁺를 포함하는 래빗 적혈구에 100 μl 의 2 X 10⁸ml 를 첨가함으로서 개시된다. 또한, 1/50 내지 1/400 에 이르는 일련의 사람 혈청 희석을 활성 억제로서 플레이트했다. 증류수로 용균되고, 100, 75, 50, 25, 및 12.5 용균 비율로 희석된 적혈구를 보체 비율 용균을 정량화하기 위해 사용했다. 플레이트를 밀봉했고 매 15 분마다 혼합시키면서 1 시간동안 37 ℃ 에서 인큐베이션했다. 반응을 200 mM EDTA, 20 μl/웰 의 첨가에 의해 중지시켰고 10 분동안 1500 x G 로 플레이트를 원심분리했다. 100 μl 의 상청액을 각 웰로부터 제거했고 분석을 위해서 96 웰의 평평한 하단 플레이트에 옮겼다. 플레이트를 415 nM 에서 해독했고 용균 비율을 계산했다.

Zsig37 은 감작된- 및 미감작된 양 적혈구 모두의 전통적인 경로를 억제하는 데 효과적이었다(도 5). 래빗 적혈구 및 EGTA 로 처리된 대체 경로의 분명한 억제는 없었다. 억제 메카니즘은 결정되지 않았지만, C1q 는 zsig37 에 결합하기 때문에, C1 이 가장 표적이 된다.

(실시예 16)

혈소판 콜라겐 활성의 zsig37 의 억제

혈액을 건강한 지원자로부터 추출하여 시트레산 나트륨을 포함하는 튜브에 담고, 실내온도에서 유지했고, 추출후 4 시간내에 사용했다. 전 혈액을 제조자의지시에 따른, Chrono Log 560A 전 혈액 Lumi-Aggregometer (Chrono-Log Corp.,Haverton, PA) 를 사용하여 분석했다. 각 시험 포인트에 대해서, 500 μl 의 혈액을 교반 바, 및 0 내지 20 μg/ml 의 농도에서 zsig37 을 포함하는 500 μl 의 등장 식염수를 포함하는 반응 튜브에 첨가했다. 혼합물을 4 분동안 인큐베이션한 후에, 혈액/zsig37 혼합물에 5 μ1 의 1 mg/ml 가교-결합 콜라겐(Chrono-Log Corp.)을 첨가함으로서 혈소판 활성을 개시했다. ADP (최종 농도 10 μM), 및 혈전 (최종 농도 lU/ml)에 의한 활성 억제를 유사한 방식으로 시험했다.

Zsig37 에 의한 콜라겐-매개 혈소판 활성 억제는 5 내지 20μg/ml (도 6a) 에서 투여량 의존적 관계를 니타낸다. 억제는 콜라겐 활성에 대해 선택적이고 ADP 또는 혈전(도 6b) 에 의해 자극되는 활성에 대하여 어떤 효과도 보이지 않는다. 콜라겐 활성은 다른 보체 C1q 관련 단백질 zsig39 (공유 출원계류중인 US 특허 출원번호 09/140,804) 에 의해서는 억제되지 않았다.

(실시예 17)

Zsig37 에 의한 SK5 섬유아세포 성장의 자극

사람의 피브로넥틴 (25 ug/ml, GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) 을 100 μl/웰로 96 웰 플레이트에 (Costar,Pleasanton, CA) 플레이트했고 하룻밤동안 후드층에서 건조시켰다. 10 % 태아 소 혈청-저 엔도톡신 (Hyclone, Logan, UT)을 포함하는 DMEM(Gibco)의 사람 SK5 피브로넥틴을 5000 세포/웰로 피브로넥틴-코팅된 플레이트에 플레이트했고 2 내지 3 일동안 37 ℃, 5% CO₂에서 인큐베이션했다. 플레이트당세포 수를 비-합류를 얻도록 조정했다. 그 다음 세포를 무-혈청 DMEM 하이 글루코스(Gibco) 로 2 번 세척했고 24 시간동안 무혈청 DMEM 하이 글루코스에서 배양시킴으로서 혈청을 제거했다. Zsig37 를 100 μl DMEM 에서 농도 312.2 ng/ml 내지 10,000 ng/ml 의 농도로 3 번 웰에 첨가했다. 그 다음 세포를 37 ℃, 5 % CO₂에서 인큐베이션했다. 세포 증식을 각 웰에 15 μl MTT 염료 용액(CellTiter96^TMkit, Promega)을 첨가하여 시험했다. 플레이트를 37 ℃ 에서 4 시간동안 5 % CO₂에서 인큐베이션했고 반응을 제조자의 지시에 따라 용해/정지 용액 (CellTiter96^TMkit, Promega) 을 사용하여 정지시켰다. 플레이트를 1 시간동안 인큐베이션하여 포르마잔 결정체를 용해시켰고 ELISA 플레이트 해독기를 사용하여 650 nm 를 기준으로 570 nm 에서 흡광도를 측정했다.

결과(도 7)는 시험된 zsig37 농도의 범위에 걸쳐 SK5 섬유아세포 숫자 증가에 의존적 투여량을 나타낸다. 이러한 농도는 모두 세포 표면 칼렉티큐린과 상호작용하는 것으로 여겨지는 피브리노겐 b 사슬의 분열촉진 효과(Gray, et al, Am J. Respir. Cell Mol. Biol. 12,684,1995 and Gray, et al, J. Biol. Chem. 270, 26602,1995) 및 플레이트된 C1q 에 대한 섬유아세포 흡착 (Bordin, and Ghebrehiwet, J. Immun. 145: 2520,1990) 에 보여진 값의 범위였다.

(실시예 18)

Zsiq37 항-혈청 생산

래빗 다클론 항-혈청을 BHK 세포로부터 정제된 zsig37-CEE 로 2 마리의 뉴질랜드 화이트 래빗 암컷을 면역화함으로서 준비했다. 단백질은 글루테르알데히드를 가진 담체 단백질 케이홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 결합시켰다. 래빗에 각각 완전 프로인드 애주반트로 200 μl 의 펩티드를 초기 복강내(ip) 주입했고, 그 다음 3 주마다 불완전 프로인드 애주반트로 100 μg 펩티드를 추가면역 ip 주입했다. 제 2 의 추가면역 주입의 투여 후 7 일 내지 10 일에 동물을 출혈시켰고 혈청을 수거했다. 그 다음, 동물을 추가면역했고 3 주마다 출혈시켰다.

(실시예 19)

조직에서 FITC 표지된 zsig37 단백질 결합 검출

조직에서 FITC 표지 zsig37 단백질 결합을 하기와 같이 검출했다.

파라핀 포매되고 슬라이드상의 절개된 사람 조직 또는 마우스 배아를 상업적인 원(즉, DAKO Corporation, Carpinteria, CA; BioGenex, San Ramon, CA; Novagen, Madison, WI; and Biomeda, Foster City, CA)또는 가정으로부터 얻었다. 사람의 조직 절개는 부선, 뇌, 심장, 작은 창자, 큰 창자, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 비장, 위, 고환, 갑상선, 및 자궁을 포함했다. 마우스 배아 절개는 16 일 단계에서부터 였다.

조직 절편을 크실린내에서 3 x 5 분, 100 % 에탄올(EtOH) 에서 4 분, 100 % EtOH 에서 3 분, 및 95 % EtOH 에서 2 분의 표준조건을 사용하여 탈왁스했다. 그 다음 제조자의 지시(DAKO Corporation)에 따라, 조직 절편을 94 ℃ 에서 20 분간 항원 회수 과정을 거친 다음에, 20 분 0.01% 펩신/0.2 N HC1 분해를 했다. 조직 절편을 dH₂0 에서 2 번 린스했고, PBS/0.05% 트윈 20 (Sigma, St. Louis, MO) 완충액에서 1 번 린스했고, 그 다음 1 X PBS/5% BSA/5% 비지방 건조 우유 (Carnation, Los Angeles, CA)와 함께 45 분 차단했다. 그 다음 제조자의 지시(Vector Laboratories, Inc.,Burlingame, CA)에 따라, 아비딘/비오틴 차단 단계를 수행했다. 조직 절편을 1 x PBS/0.05% 트윈 20 완충액에서 3 번 세척했고, 그 다음 45-60 분동안 PBS/5% BSA 에서 FITC 표지된 zsig37 단백질의 적당한 농도로 인큐베이션했다. 세척 후에, 조직 절편을 1 X PBS/0.05% 트윈 20 에서 3 번 세척후에, 30-60 분동안 1:400 희석의 항-FITC(mo) MAB 비오틴 결합 (Sigma) 과 함께 인큐베이션했고, PBS/0.05% 트윈 20 에서 3 번 세척했고, 그 다음 30-60 분동안 1:500 희석의 스트렙타비딘-FITC (NEN Life Science Products, Boston, MA)로 인큐베이션했고, 1 X PBS/0.05 % 트윈 20 완충액에서 2 번 세척했고, 트윈 20 부재하의 1 X PBS 에서 1 번 세척했다. 그 다음, 조직 절편에 대조 염색으로서 0.5 μg/ml 프로피듐 요오드를 포함하는 항페이드(antifade) 배지를 탑재했다.

중요한 결합은 혈관벽 및 사람의 조직 대다수의 콜라겐 매트릭스와 같은 미세한 섬유성 연결 형태 조직 및 연구된 배아 절편에서 보여졌다.

(실시예 20)

래빗 목동맥 손상 모델에서 Zsiq37

혈관 폐색 다음에 압좌 손상 예방에 제공된 보호의 정도를 결정하기 위해서 zsig37 을 변형된 래빗 목동맥 손상 모델에 투여했다 (Folts et al., Circulation79: 116-24,1989 and Golino et al., Thrombosis and Haemostasis 67: 302-5,1992).

대략 3-6 개월 된 34 마리의 수컷 뉴질랜드 화이트 래빗(R & R Rabbitry, Stanwood, WA)을 2 그룹으로 나누었다. 15 마리의 래빗은 2-13.5 μg/kg 범위에 걸친 zsig37 투여량을 수용했고, 19 마리의 대조군 래빗은 PBS 또는 동등한 양의 PBS 또는 zsig39, 또 다른 지방세포 보체 관련 단백질을 주입받았다 (W099/10492). 래빗을 케타민으로 (50 mg/kg, IM) 마취했고, 연구 중 할로탄 흡입 마취상에서 유지시켰다. 털을 귀 및 목으로부터 면도했고, 혈관카테테르를 IV 지지를 위해 귀 가 정맥에 놓았다. 목에 중간선 절개를 했고, 경동맥을 액세스했다. 내부/외부 분기에 인접하는 대략 5 cm 의 일반적인 경동맥을 주변 조직으로부터 무딘 절개에 의해 노출시켰고, 어느 가시적인 측쇄를 마취시켰다. 유동 프로브(Transonic Systems, Inc., Ithaca NY)를 기대되는 상해의 원위부에 놓았고, 기저 혈류를 확립했다. 그 다음, 혈관의 2.5-3.0 cm 절편을 비외상성 혈관 클램프를 사용하여 순환에서 분리했다. 그 다음, 혈관 절편으로부터 제거된 혈액, 0.9 % 염화나트륨내의 0.4 ml 의 zsig37 또는 대조군으로서 0.9 % 염화나트륨내의 0.04 ml 를 30G 니들을 사용하여 공 혈관에 주입했다. 혈관을 5 분 예비-손상 치료동안 방치했다. 그 다음, 1.0 cm 압좌 손상을 보호된 지혈겸자를 사용하여 혈관 절편의 중심에 가했고, 10 분동안 방해받지 않고 방치했다. 그 다음, 혈관 크램프를 제거했고 혈류를 재확립했다. 혈류를 래빗이 마취된 후 60 분동안 연속적으로 모니터했고, 조직 분석동안 혈관을 절단했다.

이러한 농도에서 어떠한 투여량 의존도 보이지 않았다. 모든 zsig37 투여량의 메타 분석은 쌍을 이루지 않은 t-시험(P=0.019) 에서 대조군에 비교될 때, 시간상에서 중요한 증가를 초래했다.

혈류 추적으로부터 결정될 때, 조합된 음성 대조 동물의 그룹에 대해 명백한 평균 시간 비율은 표준 에러 ± 1.7 % 로 13.5 % 였다. 혈류 추적으로부터 결정될 때, 조합된 zsig37 처리 그룹의 동물에 대해 명백한 평균 시간 비율은 표준 에러 ± 10.3 % 로 37.2 % 였다.

제 2 의 연속적인 실험에서, 형광표지된 zsig37 을 손상된 경동맥 모델에서 사용했다. 수컷, 뉴질랜드 화이트 래빗을 상기와 같이 마취했다. 목 절개에 의해서, 경동맥을 노출시켰고, 대략 5 cm 의 혈관을 주변의 연속적인 조직으로부터 분리했다. 혈액을 분리된 단편으로부터 진공처리했고 비외상성 혈관 클립을 적용했다. 대략 0.05 ml 의 형광표지된 zsig37 (농도100 μg/ml) 을 30 g 니들을 사용하여 혈관을 완전하게 채우기 위해 분리 절편에 주입했다. 5 분동안 노출후에, 혈관을 손상시켰고 클립을 제거하고 혈류를 재확립하기 전에 110 분 더 노출을 계속했다. 동물을 상기에 개시된 대로 1, 10, 및 60 분 혈류 재확립 후에 마취했고 혈관을 수거했고 조직 평가를 위해 포르말린 고정했다.

표지된 zsig37 는 손상된 혈관의 배지 수용체에 우선적으로 결합한다. 표지된 zsig37 는 손상되지 않은 혈관 영역에 결합하지 않는다. 혈관 집합 전에 혈류시간은 조직에 결합하여 남아있는 zsig37 의 양에 영향을 미치는 것 같지 않다. 즉, 1 분과 비교하여 60 분 집합 시간 포인트에서 조직에 결합된 표지된 zsig37 의 양에 차이가 없었다. 이것은 zsig37 이 손상된 혈관에 밀접하게 결합하고 재확립된 혈류에 의해 세척되지 않는다는 것을 나타낼 수 있다.

래빗 회장동맥 압좌 손상/협착 모델에서 혈관 손상 다음에 혈류 동력에 대한 zsig37 의 효과를 또한 평가했다. 미숙한 수컷 뉴질랜드 화이트 래빗을 상기에 개시된 대로 마취시켰다. 복부 절개에 의해서 회장동맥 분기를 노출시켰고 조직 주변이 결여된 각 장골과 주 분지를 연결시켰다. 각 장골에 초음파 유동 프로브를 장치하여 혈관을 통한 혈류를 모니터했다. 혈류 데이타에 기초하여, 손상에 사용될 하나의 장골을 선택하였고 다른 장골에는 시험 샘플 송달용 카테테르를 꽂았다. 래빗을 6 동물/그룹의 투여량 그룹으로 나누었다. 선택 주입 기간동안 3-1000 μg/kg 로부터 반-로그 증가로 zsig37 을 포함하는 시험 샘플 투여량이 증가했다. 시험 샘플 주입은 대략 50 % 로 혈관을 통한 혈류를 감소시킨 치명적인 협착 생성후에 개시되었다. 협착 생성 및 혈류 안정화 후에, 혈관을 부드러운 니들 홀더를 집는 부분사이로 혈관을 밀어넣음으로서 손상시켰다. 주입은 10-20 분의 셋트 기간동안 손상-후에 계속되었다. 손상된 혈관을 통한 혈류를 손상-후에 60 분동안 모니터했다. 복부 대동맥 및 각 장골의 더 작은 절편을 수거했고 조직 평가를 위해 포르말린 고정했다.

혈류 매개변수를 혈류 추적으로 결정했고, 협착-후 평균 혈류, 손상-후 평균 혈류, 및 혈관이 개방적으로 남아있는 시간을 포함했다. 이 데이타는 zsig37 이 60 분 기간에 걸쳐 300 μg/kg 이하의 증가된 투여량으로 증가된 개통성 시간을 촉진할 가능성이 있다는 것을 제시한다.

(실시예 21)

세로토닌-유발 래트 대동맥환 수축의 이완

대략 생후 3 개월 된 수컷, Sprague-Dawley 래트를 CO₂로 가볍게 마취했고, 그 다음 단두했다. 그 다음, 흉부 대동맥을 빠르게 제거했고, 변형된 Kreb's-Henseleit 완충액에 (NaCl, 118.2 mM; KC1,4.6 mM; CaCl₂,2.5 mM; MgSO₄,1.2 mM; NaHC0₃, 24.8 mM; KH₂PO₄,1.2 mM; 및 글루코스, 10.0 mM) 놓았다. 각 래트로부터, 4 개의 2-3 mm 대동맥환 절편을 대동맥의 조(粗) 말단을 폐기한 후에 컷했다. 어떤 실험에서, 내피는 환 절편 컷 전에 21 게이지 니들을 따라 대동맥의 루멘을 마찰시켜서 나화시켰다. Zig37 농도 의존 반응을 결정하기 전에, 아세틸콜린 유사체, 카르바콜을 첨가하여 내피 나화를 확인했다. 내피 부재시에, 카르바콜은 잘룩한 혈관 환 절편을 혈관이완하지 않는다.

환을 고정했고, 연결하여 pH 7.4 , 변형된 Kreb's-Henseleit 완충액, 30 ℃ 에서 유지된 산소화 (95%, O_2,5 % CO₂), 재켓, 글래스 기관욕에서 트랜스듀서를 전위시켰다. 휴지 신장은 1 gm 에서 시작하였고, 1 시간 인큐베이션 기간에 걸쳐 계속하여 1 gm 에 재-조정되었다. 새로운 산소화 변형 Kreb's Henseleit 완충액을 휴지 인큐베이션 기간동안 매 15 분마다 욕에 첨가했다. 1 시간 인큐베이션 말미에서, 환 절편을 10 μM 세로토닌의 첨가에 의해 수축시켰다. 최대 수축에 도달한 다음에, 세로토닌의 첨가 후 대략 15-20 분 후에, zsig37 에 대한 누적 농도 반응곡선을 구했다. Zsig37 을 5 내지 150 μl 이하의 부피로 5 ml 욕에 첨가하여, 최종 농도를 1 ng/ml 내지 40 μg/ml 이하의 분포로 하였다. 환 절편의 생존 가능성을 폭스콜린(2.5 μM 또는 25 μM) 또는 니트로글리세린(22 μM)의 첨가에 의해 농도 반응 말미에서 확인했다.

Zsig37 의 첨가는 완전한 내피가 존재 또는 부재하는 수축 의존성 혈관 이완 세로토닌-수축 래트 대동맥 절편을 유발했다. Zsig37 의 반응에서 이완은 1 차적으로 100 ng/ml 이상의 농도에서 관찰되었다. 이완은 욕에 각 zsig37 을 첨가한 다음 대략 30-60 초에서 관찰되었고, 이완 반응은 zsig37의 첨가 후 3-5 분내에 플래토에 이르렀다. Zsig37 에 대한 이완의 특징은 혈관이완은 수용체-제 2 차 메신저 매개 이벤트라는 것을 나타낸다. 추가적으로, 혈관이완 내피-나환 대동맥 절편에 대한 zsig37 의 능력은 zsig37 가 혈관이완 반응을 유발하기 위해 평활근에 직접 작용한다는 것을 나타낸다.

(실시예 22)

제 자리 혼성화를 사용한 zsig37 수용체를 발현하는 세포의 확인

특이적 사람 조직을 분리했고, 제 자리 혼성화에 의해서 zsig37 발현을 스크리닝했다. 준비되고, 절단되고, 제자리 혼성화에 놓인 다양한 사람의 조직은 대동맥, 심장, 림프절, 태반, 전립선, 침샘, 피부, 및 고환을 포함했다. 조직을 10 % 완충된 포르말린에 고정했고(Surgipath, Richmond, IL), 파라팔스트 X-tra 에 포매했고(Oxford Scientific, St. Louis, MO), Reichart-Jung 2050 마이크로톰 (Leica Instruments GmbH, Nussloch, Germany)으로 5 μm 에서 절단했다. 조직을 4 내지 8 마이콘으로 절단했다. 조직을 표준 프로토콜을 사용하여 준비했다.("Development of nono-isopotic in situ hybridization'', Laboratory of Experimental Pathology, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Park Triangle, NC). 요약하면, 조직 절편을 HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) 로 탈파라핀화했고, 그 다음 에탄올로 탈수화했다. 다음에, 절편을 2 내지 20 분동안 37 ℃ 에서 eith Proteinase K (50 μg/ml) (Boehringer Mannheim, Indinanapolis, IN)로 분해했다. 이 단계 다음에, 조직을 아세틸화 및 재-수화한다.

PCR 에 의해 생성된 3 개의 제자리 프로브를 사람 zsig37 서열에 대하여 유전적으로 설계했다. 2 셋트의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 zsig37 cDNA 의 별개 영역에 대한 프로브를 생성하도록 유전적으로 설계했다:(1) 올리고뉴클레오티드 ZC23,689 (SEQ ID NO: 45) 및 ZC23,694 (SEQ ID NO: 46) 를 사용하여 zsig37 에 대한 414 bp 프로브를 생성했다 ; (2) Zc23,703 (SEQ ID NO: 47) 및 ZC23,697 (SEQ ID NO: 48) 를 사용하여 zsig37 에 대한 896 bp 를 생성했다 ; (3) ZC24,441 (SEQ ID NO: 49) 및 ZC24,442 (SEQ ID NO: 50) 를 사용하여 zsig37 에 대한 290 bp 프로브를 생성했다. 각 셋트로부터 안티센스 올리고 또한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터에 대한 작동 서열을 포함하여 이러한 산물로부터 안티센스 RNA 프로브의 전사를 쉽게 했다. PCR 산물을 Qiagen spin columns (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) 으로 정제했고, 다음에 페놀/클로로폼 추출물 및 에탄올 침전을 했다. 연이어서, 프로브를 제조자의 지시에 따라, 시험관내 전사 시스템 (Promega Corp., Madison, WI)을 사용하여 디곡시게닌 (Boehringer) 또는 비오틴 (Boehringer) 으로 표지했다.

제 자리 혼성화를 상기에 개시된 대로 디곡시게닌- 또는 비오틴-표지 zsig37 프로브로 수행했다. 프로브를 50-60 ℃ 에서 12 내지 16 시간동안 1 내지 5 pmol/ml 의 농도로 슬라이드에 첨가했다. 슬라이드를 50-55 ℃ 에서 2X SSC 및 0.1X SSC 로 연이어 세척했다. 티라마이드 신호 증폭 (TSA in situ indirect kit, NEN, Boston, MA) 을 사용하여 신호를 증폭했고, 제조자의 지시에 따라, Vector Red 기질 키트 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 로 가시화했다. 그 다음, 슬라이드를 헤마토크실린으로 계수-염색했다. (Vector Laboratories).

양성 신호는 사람의 대동맥, 심장, 전립선, 침샘, 고환에서 보였다. 양성 염색 세포는 대동맥 주변의 외막내 작은 직경 혈관의 내피세포, 심장외막을 오버레이하는 중피 세포, 침샘 및 산재된 단핵 세포의 포상 세포, 태반의 영양아층, 전립선 및 고환의 세정관의 다층상피의 내피세포로 나타났다.

(실시예 23)

Zsig37 의 SEC-MALLS 분석

Zsig37 는 N-말단 콜라겐-유사 도메인 뿐만 아니라 종양 괴사 인자 부류 및 유사한 다른 이러한 단백질에 상동성을 가지는 C-말단 공모양 영역을 포함하며, zsig37 는 다합화할 것으로 기대된다. ESI-이온 트랩 질량 분광계(Finnigan Matt, San Jose, CA)을 사용하여 분석한 정제된 zsig37 는 3합체 및 9 합체를 접합하는 종의 존재를 나타냈고, 이것은 다른 상동성 단백질과 비교했을 때, 기대되지 않은 결과였다. ESI-이온 트랩 질량 분광계(Finnigan Matt)상에서 LC-MS/MS 를 사용한 zsig37 펩티드 맵핑은 몇 개의 시스테인 잔기는 S-시스테인일기로 변형되었다는 것을 나타냈다. 배지에서 자유 시스테인과 함께 발효동안 zsig37 단백질의 주요 시스테인 잔기의 변형은 이 분자의 적당한 올리고머 결합을 방해하는 것일 수 있다.

더 이상의 연구를 위해서, 감소 및 비감소 zsig37 의 비교를 HP 1050 HPLC (Hewlett Packard, Heidleberg, Germany) 상에서, 1.0 ml/분으로 Biosep S-300 크기 배척 컬럼(7.8 x 3000 mm; Phenomenex, Torrance, CA)에서 행했다. HP 1050 를 온라인 SEC-MALLS 용 빛 산란 및 굴절 인덱스 검출기, 소형DAWN 및 Optilab DSP, (Waytt Technology, Santa Barbara, CA) 와 결합시켰다.

재조합 zsig37(1.0 mg/ml) 의 1 mg 을 10:1 비율의 TCEP 로 zsig37 에 첨가했고, 실내온도에서 70 분동안 유지했다. 감소된 zsig37 의 60 μl 를 SEC-MALLS 분석에 주입했고, 감소된 zsig37 의 잔류물을 4 시간동안 실내온도에서 1 리터 PBS, 하룻밤동안 4℃ 에서 1 리터 PBS, 및 4 시간동안 실내온도에서 1 리터 PBS 와 같이 3 개의 완충액 변화로 PBS, pH 7.4 에 대하여 교반하면서, 0.5-3.0 ml Slide-A-Lyzer 카세트, 10K MWCO (Pierce, Rockford, IL) 에서 투석했다.

투석에 이어서, 산화를 4 ℃ 에서 연이어 했다. 산화를 3 개의 시간 포인트, T=0 시간, T=24 시간, 및 T=96 시간에서 취한 앨리쿼트의 SEC-MALLS 분석에 의해 모니터했다. 분자량값을 LS-RI, 2 개의 검출기 방법을 사용하여 결정했다.

감소된, 투석 재조합 zsig37 의 분석은 초기에 호모로그에서 관찰된 올리고머 상태와 더욱 일치하는 SEC-MALLS 에 의해 검출된 6합체 및 18합체의 형성을 나타낸다. 이러한 형태는 또한 시험관 내 분석에서 활성이 있었다.

(실시예 24)

단핵세포에 zsig37 결합

CD14 양성 단핵세포를 냉동된 주변 혈액 탈락 산물로부터 Miltenyi 비드 (Miltenyi Biotec Auburn, CA)로 양성 선택 방법을 사용하여 분리했다. 정제된 세포는 FACS 염색에 의해서 80 % CD14 양성보다 더 컸다. 세포를 RPMI + 10 % 태아 소 혈청(FBS) 내에서 1 x 10⁶세포/ml 로 재현탁했고, 100 mm 조직 배양물 디쉬, 5 ml/플레이트에 플레이트했다. 재조합 사람 γ 인터페론을 100 ng/ml 로 첨가했고, 세포를 48 시간동안 37 ℃ 에서 5 % CO₂에서 인큐베이션했다.

세포를 EDTA 및 스크랩핑 모두를 사용하여 비효소적 방법으로 플레이트로부터 제거했고, 원심분리에 의해 농축했고, FACS 염색 완충액에서 재현탁했고 염색용으로 500,000 세포/튜브로 엘리쿼트했다. 비활성 세포를 γ 인터페론에서 48 시간 후에 같은 탈락 산물과 함께 한번 더 CD14 선택을 수행함으로서 얻었다. 세포를 비오틴화 zsig37 그 다음 스트렙타비딘 PE 의 농도를 다양화하여 인큐베이션했다. "냉각" zsig37 과 함께 모든 차단을 30 분동안 아이스상에서 했다. 비결합 단백질을 FACS 완충액에서 단 한번 세척함으로서 제거했다. 결합을 FACS 칼리버 기구(Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)를 사용하여 정량화했고 제 2 의 항체가 조절하는 것 이상의 신호로서 표현되었다. 단핵세포 활성을 γ 인터페론 처리 세포내의 ICAM-1 발현의 1 로그 증가에 의해서 대략적으로 증명했다.

Zsig37 결합은 γ 인터페론-처리 세포에서 관찰된 zsig37 결합의 증가와 함께 활성화 및 비활성화 단핵세포 모두에서 검출되었다. 결합이 1.5 μg/ml 이하로검출되었고, 가장 낮은 농도로 시험했다. 15 μg/ml 에서, 결합은 활성화 세포에서 대략 4 배 증가했다. 70 배 과량 "냉각" zsig37 로 예비처리될 때, 미세한 (대략 10 %) 결합 감소가 활성화된 세포에서 보여진다. 활성화된 단핵세포에서 zsig37 결합의 증가는 염증성 시토킨에 의해 zsig37 에 대한 단핵세포 결합 단백질/수용체의 상향-조절을 제시한다. 이것은 잠재적으로 단핵세포 식작용, 미생물 죽이기, 및 세포의 세포독성에 zsig37 관여를 유발한다. 2 일간의 배양 다음에, 배양물내에 존재하는 대핵세포 및 zsig37 은 세포의 서브셋에 친화적으로 결합할 수 있다. 이것이 발생하는 지를 결정하는데 이용가능한 양호한 대핵세포 마커가 없다. Zsig37 은 또한 대핵세포 특이성을 나타내면서, 마우스 단핵세포/대핵세포 라인, RAW 264.7 (ATCC No. CRL-2278) 에 결합했다.

전술한 대로, 본 발명의 구체적인 구체예는 본원에 예시를 목적으로 개시되었지만 본 발명의 취지에 벗어지지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있을 것이라는

것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항에 의한 것을 제외하고는 제한되지 않는다.

Claims

포유동물에 제약학적으로 허용가능한 부형제로 지방세포 보체 관련 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 것에 의해 상기 지방세포 보체 관련 단백질이 맥관구조내에서 혈전형성 및 보체 활성을 감소시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 포유동물의 상기 맥관구조내에서 혈류를 촉진시키는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 지방세포 보체 관련 단백질은 SEQ ID NO:2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 75 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은

콜라겐 도메인을 형성하는 Gly-Xaa-Xaa 또는 Gly-Xaa-Pro 반복 (여기서, Xaa 는 어떤 아미노산도 됨), 및 카르복시-말단 공모양 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 22-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 폴리펩티드와 SEQ ID NO:2 사이의 어떤 차이는 보존적인 아미노산 치환에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 콜라겐 도메인은 13 개의 Gly-Xaa-Xaa 반복 및 1 개의 Gly-Xaa-Pro 반복으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 공모양 도메인은 10 개의 β 시트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 β 시트는 SEQ ID NO:2 의 147-151, 170-172, 178-181, 191-203 , 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, 및 269-274 에 해당하는 아미노산 잔기와 회합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 잔기 1-281 또는 SEQ ID NO:44 의 잔기 1-281 을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제 2 의 폴리펩티드와 복합체를 형성하여 올리고머를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분자간 이황화 결합에 의해 복합체를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 올리고머는 3합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 올리고머는 6합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 다합체는 18 합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 보체 경로의 억제 및 콜라겐-매개 혈소판 부착, 활성 또는 응집의 억제에 의해서 혈전형성 및 보체 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 동물에 급성 혈관 손상 전, 그 동안 또는 다음에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 손상은 혈관 복원에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 혈관 복원은 혈관확장술, 관상동맥 바이패스 이식, 동맥내막절제술, 미세 혈관 회복 또는 혈관 이식의 문합술을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 손상은 외상, 뇌졸증 또는 동맥류에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
포유동물에 지방세포 보체 관련 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 것에 의해 상기 단백질이 손상된 콜라겐 조직을 보체 활성, 혈전 활성 또는 면역 활성에 대해 불활성화되게 하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 포유동물에서 손상된 콜라겐 조직을 회복시키는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 지방세포 보체 관련 단백질은 SEQ ID NO:2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열에 적어도 75 % 동일성인 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 여기에서 서열은

콜라겐 도메인을 형성하는 Gly-Xaa-Xaa 또는 Gly-Xaa-Pro 반복 (여기서, Xaa 는 어떤 아미노산도 됨), 및 카르복시-말단 공모양 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 22-281 의 아미노산 서열에 적어도 90 % 동일한 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 폴리펩티드와 SEQ ID NO:2 사이의 어떤 차이는 보존적인 아미노산 치환에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 콜라겐 도메인은 13 개의 Gly-Xaa-Xaa 반복 및 1 개의 Gly-Xaa-Pro 반복으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 공모양 도메인은 10 개의 β 시트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 β 시트는 SEQ ID NO:2 의 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, 및 269-274 에 해당하는 아미노산 잔기와 회합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 1-281 또는 SEQ ID NO:44 의 잔기 1-281 을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제 2 의 폴리펩티드와 복합체를 형성하여 올리고머를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분자간 이황화결합에 의해 복합체를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 올리고머는 3합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 올리고머는 6합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 상기 다합체는 18 합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 손상된 콜라겐 조직은 국소빈혈 및 재관류와 관련된 손상에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, 상기 손상은 외상 손상 국소빈혈, 장교액, 또는 혈류 확립 전- 및 후- 와 관련된 손상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 심폐성 바이패스 국소빈혈 및 리세시테이션, 심근경색증, 또는 외상-후 혈관경련을 겪는 포유동물에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36 항에 있어서, 상기 외상-후 혈관경련은 뇌졸증, 경피적 경혈관 확장술, 동맥내막절제술, 사고에 의한 혈관 외상 또는 외과수술-유발 혈관 외상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
포유동물에 지방세포 보체 관련 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 것에 의해 상기 폴리펩티드가 전립선 생물질 표면을 보체 활성, 혈전형성 활성 또는 면역 활성에 대해 불활성화되게 하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 포유동물과 관련된 사용을 위한 전립선 생물질 표면을 회복시키는 방법.
제 38 항에 있어서, 상기 지방세포 보체 관련 단백질은 SEQ ID NO:2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 75 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은

콜라겐 도메인을 형성하는 Gly-Xaa-Xaa 또는 Gly-Xaa-Pro 반복(여기서, Xaa 는 어떤 아미노산도 됨), 및 카르복시-말단 공모양 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 잔기 22-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40 항에 있어서, 상기 폴리펩티드와 SEQ ID NO:2 사이의 어떤 차이는 보존적인 아미노산 치환에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40 항에 있어서, 상기 콜라겐 도메인은 13 개의 Gly-Xaa-Xaa 반복 및 1 개의 Gly-Xaa-Pro 반복으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40 항에 있어서, 상기 공모양 도메인은 10 개의 β 시트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44 항에 있어서, 상기 β 시트는 SEQ ID NO: 2 의 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, 및 269-274 에 해당하는아미노산 잔기와 회합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 잔기 1-281 또는 SEQ ID NO:44 의 잔기 1-281 을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제 2 의 폴리펩티드와 복합체를 형성하여 올리고머를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 47 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분자간 이황화 결합에 의해 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 47 항에 있어서, 상기 올리고머는 3합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 47 항에 있어서, 상기 올리고머는 6합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 47 항에 있어서, 상기 다합체는 18 합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 38 항에 있어서, 상기 전립선 생물질의 표면을 콜라겐 또는 콜라겐 단편, 젤라틴, 섬유소 또는 피브로넥틴으로 코팅하는 것을 특징으로 하는 전립선 생물질 표면을 회복시키는 방법.
포유동물에 지방세포 보체 관련 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 것에 의해 상기 폴리펩티드가 상처 치료 진행을 향상시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물에서 상처 회복을 조절하는 방법.
제 53 항에 있어서, 상기 지방세포 보체 관련 단백질은 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 75 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 서열은

콜라겐 도메인을 형성하는 Gly-Xaa-Xaa 또는 Gly-Xaa-Pro 반복(여기서, Xaa 는 어떤 아미노산도 됨), 및 카르복시-말단 공모양 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 54 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 22-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 잔기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 54 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 의 잔기 26-281 의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55 항에 있어서, 상기 폴리펩티드와 SEQ ID NO:2 의 어떤 차이는 보존적인 아미노산 치환에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55 항에 있어서, 상기 콜라겐 도메인은 13 개의 Gly-Xaa-Xaa 반복 및 1 개의 Gly-Xaa-Pro 반복으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55 항에 있어서, 상기 공모양 도메인은 10 개의 β 시트로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59 항에 있어서, 상기 β 시트는 SEQ ID NO: 2 의 147-151, 170-172, 178-181, 191-203, 207-214, 219-225, 227-239, 244-250, 및 269-274 에 해당하는 아미노산 잔기와 회합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 의 잔기 1-281 또는 SEQ ID NO:44 의 잔기 1-281 을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 55 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제 2 의 폴리펩티드와 복합체를 형성하여 올리고머를 형성하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분자간 이황화결합에 의해 복합체를형성하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 상기 올리고머는 3합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 상기 올리고머는 6합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 62 항에 있어서, 상기 다합체는 18합체인 것을 특징으로 하는 방법.