CN110272477B - 与内皮细胞激活相关的靶点comp及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与内皮细胞激活相关的靶点COMP及其应用。本发明研究发现细胞外基质蛋白COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用，抑制其激活进而抑制内皮的激活。本发明根据COMP与integrinα5结合序列在体外合成短肽，该短肽可抑制内皮的激活，从而减缓动脉粥样硬化的发生或发展，具有一定的治疗作用。本研究揭示了COMP在内皮细胞中激活的新机制并为临床上治疗动脉粥样硬化提供了新的靶点。

Description

与内皮细胞激活相关的靶点COMP及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及与内皮细胞激活相关的靶点COMP及其应用。

背景技术

心血管疾病是导致全球致病率和致死率上升的首要因素。而动脉粥样硬化作为一种慢性的渐进性动脉疾病，是多种心血管疾病的主要病因，其发病机制复杂，目前尚未完全阐明，其特点是受累动脉病变从内膜开始，常表现为脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。作为动脉粥样硬化的始动因素，血管内皮功能紊乱的预防对于控制动脉粥样硬化的发病意义重大。在细胞和分子水平上，内皮细胞激活后细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管黏附分子-1(VCAM-1)表达增加，介导内皮炎症反应，进而促进了动脉粥样硬化的发生和发展。

血管壁内皮细胞在维持血管内稳态上具有重要作用。血管壁的慢性炎症是多种心血管疾病如动脉粥样硬化(AS)的危险因素，而炎症发生的主要部位则位于血管内皮，多项研究表明内皮细胞激活(内皮功能障碍)是多种心血管疾病如AS发生发展的早期环节，内皮激活主要表现为多种抗氧化，抗炎和抗血栓因子表达的下调以及内皮渗透性的增加，促炎因子(IL-6、IL-8)和黏附相关分子(ICAM-1，VCAM-1)表达的上调，使白细胞向内皮的聚集和黏附增加，进而启动动脉粥样硬化的发生。对内皮激活的具体机制研究可为临床治疗多种心血管疾病提供新的理论依据。

细胞外基质(ECM)构成了细胞外的微环境，细胞外基质蛋白包括胶原、弹性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等，可与细胞表面黏附相关受体蛋白或者调节生长因子和细胞因子等相互结合参与调节细胞一系列功能。ECM成分的异常改变会引起多种心血管疾病如高血压、动脉粥样硬化、血管钙化等的发生和发展。

软骨寡聚基质蛋白COMP，也可称为血小板反应蛋白TSP5，是一种主要表达在软骨系统和心血管系统的五聚体基质蛋白。近年来，越来越多的研究集中在软骨寡聚基质蛋白COMP在心血管系统中的作用。但目前对于COMP是否参与内皮激活以及其作用机制尚不清楚。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种短肽。

本发明提供的短肽是如下1)或2)或3)或4)所述的短肽：

1)氨基酸序列是软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列的第531-554位(如序列3所示)；

2)在软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列第531-554位所示的短肽的N端和/或C端连接标签得到的融合短肽；

3)将软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列第531-554位经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的短肽；

4)与软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列第531-554位具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的短肽。

所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的短肽、多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述75％或75％以上的同源性可为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。

本发明的第二个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品的活性成分为上述短肽。

本发明提供的产品可为药物或制剂。需要的时候，在上述产品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

本发明提供的产品可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的产品均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明提供的产品可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明的第三个目的是提供上述短肽或上述产品的新用途。

本发明提供了上述短肽或上述产品在如下a1)-a20)中任一种中的应用：

a1)预防和/或治疗动脉粥样硬化；

a2)制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的产品；

a3)减缓动脉粥样硬化的发生和/或发展；

a4)制备减缓动脉粥样硬化的发生和/或发展的产品；

a5)抑制内皮细胞的激活；

a6)制备抑制内皮细胞的激活的产品；

a7)抑制integrinα5信号通路；

a8)制备抑制integrinα5信号通路的产品；

a9)抑制integrinα5的激活；

a10)制备抑制integrinα5的激活的产品；

a11)抑制integrinα5信号通路下游分子FAK和/或Src的磷酸化；

a12)制备抑制integrinα5信号通路下游分子FAK和/或Src的磷酸化的产品；

a13)降低动脉粥样硬化斑块的损伤面积和/或脂质沉积；

a14)制备降低动脉粥样硬化斑块的损伤面积和/或脂质沉积的产品；

a15)抑制动脉粥样硬化斑块内膜层的内皮激活标志物ICAM-1和VCAM-1的表达；

a16)制备抑制动脉粥样硬化斑块内膜层的内皮激活标志物ICAM-1和VCAM-1的表达的产品；

a17)减少动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞浸润；

a18)制备减少动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞浸润的产品；

a19)减少integrinα5和纤维连接蛋白FN的相互结合；

a20)制备减少integrinα5和纤维连接蛋白FN的相互结合的产品。

本发明的第四个目的是提供软骨寡聚基质蛋白COMP的新用途。

本发明提供了软骨寡聚基质蛋白COMP在如下m1)-m14)中任一种中的应用：

m1)抑制内皮细胞的激活；

m2)制备抑制内皮细胞的激活的产品；

m3)抑制湍流引起的内皮细胞炎症反应相关基因的表达；

m4)制备抑制湍流引起的内皮细胞炎症反应相关基因的表达的产品；

m5)下调湍流引起的ICAM-1和/或VCAM-1的表达水平；

m6)制备下调湍流引起的ICAM-1和/或VCAM-1的表达水平的产品；

m7)减少单核细胞THP1向内皮细胞的黏附；

m8)制备减少单核细胞THP1向内皮细胞的黏附的产品；

m9)抑制integrinα5信号通路；

m10)制备抑制integrinα5信号通路的产品；

m11)抑制integrinα5的激活；

m12)制备抑制integrinα5的激活的产品；

m13)抑制integrinα5信号通路下游分子FAK和/或Src的磷酸化；

m14)制备抑制integrinα5信号通路下游分子FAK和/或Src的磷酸化的产品。

上述应用中，所述软骨寡聚基质蛋白COMP通过与integrinα5相互作用抑制integrinα5激活，进而抑制内皮细胞的激活。进一步的，所述软骨寡聚基质蛋白COMP通过其TYP3结构域(软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列的第266-520位)和C端结构域(软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列的第521-755位)与integrinα5相互作用抑制integrinα5激活，进而抑制内皮细胞的激活。

上述应用中，所述内皮细胞炎症反应相关基因包括VCAM-1和/或ICAM-1和/或SELE和/或TNFα和/或IL-1β和/或IL-6和/或CCL2和/或CCL7和/或CCL8和/或CYR61。

本发明的第五个目的是提供提高软骨寡聚基质蛋白COMP活性的物质或增强COMP基因表达的物质的新用途。

本发明提供了提高软骨寡聚基质蛋白COMP活性的物质或增强COMP基因表达的物质在如下n1)-n6)中任一种中的应用：

n1)预防和/或治疗动脉粥样硬化；

n2)制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的产品；

n3)减缓动脉粥样硬化的发生和/或发展；

n4)制备减缓动脉粥样硬化的发生和/或发展的产品；

n5)抑制内皮细胞的激活；

n6)制备抑制内皮细胞的激活的产品。

上述应用中，所述提高软骨寡聚基质蛋白COMP活性的物质为促进软骨寡聚基质蛋白COMP合成或抑制软骨寡聚基质蛋白COMP降解或提高软骨寡聚基质蛋白COMP功能的蛋白质、多肽或小分子化合物；

所述增强COMP基因表达的物质为过表达COMP基因的物质。所述过表达COMP基因的物质可为过表达COMP基因的质粒或含有过表达COMP基因的质粒的细胞系。在本发明的具体实施例中，所述含有过表达COMP基因的质粒的细胞系为含有COMP质粒的HEK293细胞系(该细胞系记载于文献“Cartilage Oligomeric Matrix Protein Maintains theContractile Phenotype of Vascular Smooth Muscle Cells by Interacting Withα7β1Integrin”中)。

软骨寡聚基质蛋白COMP作为靶点在开发预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物或减缓动脉粥样硬化的发生和/或发展的药物或抑制内皮细胞激活的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述引用或产品中，所述软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列的GenBank号为AAI25093.1，COMP基因序列的GenBank号为BC125092.1，编码基因序列如序列表的序列1所示。所述integrinα5氨基酸序列的GenBank号为AAH08786.1，integrinα5基因序列的GenBank号为BC008786.2，编码基因序列如序列表的序列2所示。

本发明研究发现软骨寡聚基质蛋白COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用，抑制其激活进而抑制内皮细胞的激活，并根据COMP与integrinα5结合序列在体外合成短肽。通过实验证明：该短肽可抑制内皮细胞的激活，从而减缓动脉粥样硬化的发生或发展，具有一定的治疗作用。本研究揭示了COMP在内皮细胞中激活的新机制并为临床上治疗动脉粥样硬化提供了新的靶点。

附图说明

图1为COMP可抑制湍流引起的内皮细胞的激活。图1A为VCAM-1表达水平。图1B为ICAM-1表达水平。数据显示为Means±SEM，*p<0.05；未配对双尾t检验，n＝6。图1C为湍流系统示意图。

图2为生理状态下COMP^-/-小鼠血管内皮激活标志物表达上调。图2A和图2B为三种小鼠分离出的血管弓部小弯侧(AA inner)、弓部大弯侧(AA outer)以及直部(TA)进行enface免疫荧光染色拍摄的免疫荧光图像，用红色荧光标记VE-Cadherin，用绿色荧光标记VCAM-1(A)，ICAM-1(B)(内皮细胞激活标志物)，用DAPI(蓝)标记细胞核，n＝6。图2C为Western Blotting检测三种小鼠主动脉血管弓部和直部的VCAM-1蛋白表达水平。图2D为用Image J软件对VCAM-1蛋白表达水平进行定量及统计分析。数据显示为Means±SEM，*p<0.05；未配对双尾t检验，n＝6。

图3为病理状态下COMP^-/-小鼠血管内皮激活标志物表达上调。图3A为相机拍摄图片。图3B为伊红-苏木素染色(HE染色)。图3C和图3D为三组小鼠左颈总动脉结扎血管做enface免疫荧光染色，用红色荧光抗体标记VE-Cadherin，绿色荧光抗体标记VCAM-1、ICAM-1，用DAPI标记细胞核，n＝6。

图4为体外COMP纯化蛋白可抑制湍流引起的内皮细胞炎症反应。图4A为RNA测序结果。图4B为实时定量PCR分析VCAM-1、VCAM-1、SELE、TNFα、IL-1β、IL-6、CCL2、CCL7、CCL8、CYR61mRNA表达水平，数据显示为Means±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双因素方差分析，n＝6。图4C为采用Western Blotting检测VCAM-1、ICAM-1、SELE蛋白水平的表达，以β-actin为内参。图4D为用imageJ软件对VCAM-1、ICAM-1、SELE进行定量及统计分析，数据显示为Means±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双因素方差分析，n＝6。图4E为内皮细胞铺于包被有COMP纯化蛋白的玻璃板上并给予内皮细胞湍流(0.5±4dynes/cm²，1Hz)处理，BCECF探针预孵育单核细胞THP-1 30分钟，之后与湍流处理的内皮细胞以及给予COMP纯化蛋白处理的内皮细胞共同孵育1小时，洗去未粘附细胞，荧光显微镜拍照。图4F为统计荧光标记THP-I细胞数目。实验结果以均值±标准误(Mean±SEM)表示，多组间比较采用双因素方差分析(two way ANOVA)，进一步组间两两比较采用bonferroni’s post hoc test检验，*p＜0.05，n＝5。

图5为COMP可与内皮激活相关的integrinα5相互作用。图5A为内皮细胞接种在包被有COMP纯化蛋白的玻璃板上并给予内皮细胞湍流(0.5±4dynes/cm²，1Hz)处理，2小时后收细胞进行免疫共沉淀实验。兔和鼠的IgG作为阴性对照。图5B和图5C为分离小鼠主动脉血管弓部和直部分别进行免疫共沉淀实验。兔和鼠的IgG作为阴性对照。图5D为分离小鼠主动脉血管弓部和直部分别进行免疫荧光共定位实验，用红色荧光标记COMP，用绿色荧光标记integrinα5，用蓝色标记细胞核(DAPI)，n＝6。

图6为COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用。图6A为免疫共沉淀实验分析COMP不同结构域和integrinα5的相互作用。图6B为免疫双杂交实验分析COMP不同结构域和integrinα5的相互作用。*p＜0.05，n＝6。

图7为COMP不同结构域与敲除COMP结合序列的integrinα5之间不再存在相互作用。图7A为通过对COMP和integrinα5进行结构预测找到二者相互结合的序列，其中蓝色为integrinα5，黄色为COMP。图7B为免疫共沉淀实验分析COMP不同结构域与敲除COMP结合序列的integrinα5的相互作用。图7C为免疫双杂交实验分析COMP不同结构域与敲除COMP结合序列的integrinα5的相互作用，*p＜0.05，n＝6。

图8为COMP可抑制integrinα5的激活及其下游分子FAK和Src的磷酸化。图8A为WT小鼠和COMP^-/-小鼠分离出的血管弓部小弯侧(AA inner)，弓部大弯侧(AA outer)以及直部(TA)的en face免疫荧光染色图像，用红色荧光标记VE-Cadherin(内皮标志物)，用绿色荧光标记激活态integrinα5(Act-α5)，用DAPI(蓝)标记细胞核，n＝6。图8B为WT小鼠和COMP^-/-小鼠行左颈总动脉结扎血管做免疫荧光染色，用红色荧光抗体标记VE-Cadherin，绿色荧光抗体标记激活态integrinα5(Act-α5)，用DAPI标记细胞核，n＝6。图8C为Western Blotting检测WT小鼠和COMP^-/-小鼠主动脉血管直部和弓部的p-FAK和p-Src蛋白表达水平。图8D为用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析，数据显示为Means±SEM，*p<0.05；未配对双尾t检验，n＝5。

图9为COMP可抑制由湍流(OSS)或纤维连接蛋白(FN)引起的integrinα5的激活以及其下游分子FAK和Src的磷酸化。图9A为内皮细胞接种在包被有不同浓度梯度的COMP纯化蛋白的玻璃板上并给予内皮细胞湍流(0.5±4dynes/cm2，1Hz)处理，1小时后收细胞用Western Blotting检测激活态integrinα5的表达水平。图9B为用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析，数据显示为Means±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双因素方差分析，n＝6。图9C为内皮细胞接种在同时包被有不同浓度梯度的COMP纯化蛋白和纤维连接蛋白FN的培养皿上，6小时后收细胞用Western Blotting检测激活态integrinα5的表达水平。图9D为用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析，数据显示为Means±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双因素方差分析，n＝6。图9E为内皮细胞接种在同时包被有COMP纯化蛋白和纤维连接蛋白FN的培养皿上，6小时后收细胞用Western Blotting检测激活态integrinα5及其下游分子p-FAK和p-Src的表达水平。图9F为用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析，数据显示为Means±SEM，*p<0.05；bonferroni校正后的双因素方差分析，n＝6。

图10为24肽可抑制integrinα5的激活以及其下游分子FAK和Src的磷酸化。图10A为给予内皮细胞不同浓度的24肽处理48小时后将其铺于包被有纤维连接蛋白FN的无菌培养皿上培养6小时，收细胞用Western Blotting检测激活态integrinα5及其下游分子p-FAK和p-Src的表达水平。图10B为用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析，数据显示为Means±SEM，*p<0.05，bonferroni校正后的单因素方差分析，n＝6。

图11为24肽可抑制integrinα5与纤维连接蛋白FN的相互作用。给予内皮细胞24肽(50μg/ml)处理，48小时后收细胞进行免疫共沉淀实验，n＝3。

图12为24肽减缓西方饮食诱导的动脉粥样硬化。图12A为血浆胆固醇和甘油三酯表达水平，其中，TG：甘油三酯(triglyceride)；CHO：胆固醇(cholesterol)，数据显示为Means±SEM，未配对双尾t检验，n＝5。图12B为分离两组小鼠主动脉血管做en face油红O染色。图12C为对两组小鼠主动脉血管油红O染色统计。Aorta：主动脉；AA：主动脉弓部；TA，主动脉直部，数据显示为Means±SEM，*p<0.05。未配对双尾t检验分析，n＝5。

图13为24肽降低ApoE^-/-小鼠主动脉流出道斑块损伤面积和脂质沉积、降低ApoE^-/-小鼠主动脉流出道斑块内膜层的ICAM-1、VCAM-1和激活态integrinα5的表达水平。图13A为苏木精-伊红染色(HE)及斑块面积统计。图13B为油红O染色(ORO)及斑块面积统计。图13C为主动脉流出道切片作斑块巨噬细胞免疫荧光染色及斑块面积统计，用红色荧光标记CD68(巨噬细胞标志物)；用蓝色荧光(DAPI)标记细胞核。图13D为天狼星红染色及斑块面积统计。图13E为平滑肌细胞免疫荧光染色及斑块面积统计，用绿色荧光标记α-SMA(平滑肌细胞标志物)；用蓝色荧光(DAPI)标记细胞核，数据显示为Means±SEM，*p<0.05，未配对双尾t检验分析，n＝5。图13F、图13G和图13H为主动脉流出道切片作斑块内膜层免疫荧光染色，用红色荧光抗体标记vWF(内皮细胞标志物)，用绿色荧光抗体标记VCAM-1(F)，ICAM-1(G)和激活态integrinα5(H)，n＝5。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中主要试剂名称及来源如下：三溴乙醇(阿佛丁，粉末)、抗生素G418、Heparin-Agrose是美国Sigma Aldrich公司的产品；氯化钾是天津市风船化学试剂有限公司的产品；氯化钠、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氢氧化钠是天津市光复科技发展有限公司的产品；琼脂糖是美国Gene公司的产品；Ⅰ型核酸染料、多聚甲醛粉末、天狼猩红染色液、苏木素-伊红(H&E)染色液、中性树胶封片剂、牛血清白蛋白(BSA)、氨苄霉素、卡那霉素、琼脂粉、免疫荧光一抗稀释液、Western一抗稀释液是北京Solarbio科技有限公司的产品；胰蛋白胨和酵母浸粉是美国OXID公司的产品；盐酸、异丙醇和丙三醇(甘油)是天津市博迪化工有限公司的产品；DMSO培养基和RPMI 1640培养基是美国Hyclone公司的产品；冰冻组织包埋剂OCT是美国SAKURA公司的产品；Research Diet D12109C是北京市BIOPIKE有限公司的产品；油红O粉末和曲拉通(Triton X-100)是美国Sigma Aldrich公司的产品；DAPI封片剂和山羊血清封闭工作液是北京中杉金桥生物技术有限公司的产品；Opi-MEM培养基是美国Gibco公司的产品；ProteinA/G Agrose、转染试剂和转染试剂RNAimax是美国Invitrogen公司的产品；小鼠饮食是Research Diets的产品；纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)是美国Millipore公司的产品；血小板反应蛋白1(TSP1)、CCN家族成员1(CCN1)和CCN家族成员3(CCN3)是美国Abcam公司的产品；感受态细菌Trans-T1、感受态细菌DH5α是北京TransGen技术有限公司的产品；NP-40是北京市鼎国昌盛生物技术有限责任公司的产品；荧光素酶活性检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒是美国Promega公司的产品。

下述实施例中的抗体及其来源如下：兔抗COMP单抗(#ab42225)、羊抗vWF多抗(#ab11713)、鼠抗vWF单抗(#ab201336)、大鼠抗VE-Cadherin单抗(#ab91064)、兔抗CD31单抗(#ab28364)、兔抗Integrinα5单抗(#ab150361)、鼠抗Integrinα5单抗(#ab6131)、兔抗Active Integrinα5单抗(#ab72663)是美国Abcam公司产品；鼠抗Integrinα5单抗(#sc-166665)、兔抗VCAM-1多抗(#sc-8304)、兔抗ICAM-1多抗(#sc-7891)、鼠抗ICAM-1单抗(#sc-107)是美国Santa Cruz公司的产品；鼠抗Active Integrinα5单抗(#MABT201)是美国Millipore公司的产品；兔抗COMP多抗(#13641)、鼠抗integrinβ1多抗(#26918)、鼠抗integrinα3单抗(#66070)、兔抗integrinα6多抗(#27189)、兔抗integrinαv多抗(#27096)、兔抗integrinβ3多抗(#18309)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)是美国Proteintech公司的产品；兔抗FAK单抗(#3285s)、兔抗磷酸化FAK(397位酪氨酸)单抗(#8556s)、兔抗SRC单抗(#6943s)、兔抗磷酸化SRC(416位酪氨酸)单抗(#2109s)、兔抗VCAM-1单抗(#39036s)、兔抗FLAG单抗(#14793s)是美国CellSignaling Technology公司的产品；兔抗HA单抗(#H6908)是美国Sigma Aldrich公司的产品；Alexa

488标记山羊抗鼠IgG(H+L)和Alexa

594标记山羊抗兔IgG(H+L)是美国Invitrogen公司的产品。

下述实施例中的脂质提取试剂盒：甘油三酯测定试剂盒[GPO-PAP法]、胆固醇测定试剂盒[CHOD-PAP法]、低密度脂蛋白测定试剂盒、高密度脂蛋白测定试剂盒是中生北控生物科技股份有限公司的产品。低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒直接法的具体测定步骤如下：将工作液R1和小鼠血浆按照100:1的比例(工作液150μL，血浆1.5μL)加入96孔板，标准品等比稀释后与样品同批检测，37℃维持5分钟，补加50μL工作液R2，37℃维持5分钟，恢复至室温后用酶标仪检测，设置波长600nm，根据标准曲线计算血浆低密度脂蛋白胆固醇浓度。总胆固醇测定试剂盒CHOD-PAP法的具体测定步骤如下：将工作液和小鼠血浆按照100:1的比例(工作液200μL，血浆2μL)加入96孔板，标准品等比稀释后与样品同批检测，37℃孵育6分钟，恢复至室温后用酶标仪检测，设置波长505nm，根据标准曲线计算血浆总胆固醇浓度。高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒直接法的具体测定步骤如下：将工作液R1和小鼠血浆按照100:1的比例(工作液150μL，血浆1.5μL)加入96孔板，标准品等比稀释后与样品同批检测，37℃维持5分钟，补加50μl工作液R2，37℃维持5分钟，恢复至室温后用酶标仪检测，设置波长600nm，根据标准曲线计算血浆高密度脂蛋白胆固醇浓度。甘油三酯测定试剂盒GPO-PAP法的具体测定步骤如下：将工作液和小鼠血浆按照100:1的比例(工作液200μL，血浆2μL)加入96孔板，标准品等比稀释后与样品同批检测，37℃孵育10分钟，恢复至室温后用酶标仪检测，设置波长505nm，根据标准曲线计算血浆甘油三酯浓度。

下述实施例中的相关溶液配方如下：

1640培养基的配制：1640粉末1袋、NaHCO₃ 2g、HEPES 2.4g、丙酮酸钠0.11g、100×青链霉素溶液10ml。调PH于7.4，Milli-Q级纯净水定容至1L，过滤(0.22μm)后4℃储存。

Tris缓冲盐溶液：Tris 10mM；CaCl₃ 2mM。过滤(0.22μm)后4℃储存。

洗脱液：Tris 10mM；CaCl₃ 2mM；NaCl 0.75mM。调PH于7.5，过滤(0.22μm)后4℃储存。

CO-IP相关试剂(IP缓冲液)：EDTA 1mM、Tris(PH＝7.2)20mM、NaCl 100mM、甘油10％、NP-40 0.1％、PMSF 0.5mM、亮抑酶肽和抑肽酶100ng/ml。

4％多聚甲醛的配置：称取多聚甲醛40g溶于800ml PBS缓冲液，加热搅拌，同时滴加1mol/L氢氧化钠至澄清，加入PBS定容至1L，调PH值到7.4，4℃避光保存。

油红O染液：储存液：称取0.5g油红O粉末，溶于100ml的98％异丙醇，4℃避光过夜保存。工作液：量取储存液30ml，以3:2的比例与20ml Milli-Q级纯净水混匀后静置10分钟，定性滤纸过滤，现用现配。

下述实施例中的实验仪器名称及来源如下：冰冻切片机、倒置显微镜、正置显微镜是德国Leica公司的产品；共聚焦荧光显微镜是日本Olympus公司的产品；四通道注射泵是清华大学电机系制作；四通道蠕动泵是美国MasterFlex公司的产品；恒温培养振荡器是上海智城分析仪器制造有限公司的产品；全自动化学发光成像分析系统是上海天能科技有限公司的产品；旋转混合仪是海门市其林贝尔仪器制造有限公司的产品。

下述实施例中的组织取材方法如下：1、给小鼠称重并记录，按30μL/g腹腔注射1.2％阿佛丁溶液。2、小鼠麻醉后，对胸腹部酒精消毒，充分暴露其胸腹腔，用0.1％肝素钠润洗过的1mL注射器于右心室取血，将血液转移到提前准备好的含20μL 0.1％肝素钠的1.5ml EP管内，室温5,000rpm离心10分钟，取上层浆至新的EP管中，存于-80℃冰箱用于后续血浆脂质的检测。3、剪开右心耳，用1×PBS缓冲液从左心室缓慢灌流。4、取肝脏、肺脏、肾脏及脂肪等组织，锡纸包裹，液氮速冻后，存于-80℃冰箱用于后续实验；OCT包埋心脏，用于流出道冰冻切片，存于-80℃冰箱用于后续染色实验。心脏冰冻切片的制备方法：1、提前30min预冷冰冻切片机，准备好相关实验用品。2、小鼠心脏取材后，以解剖位(以两心耳为水平面，流出道为中心)置于装好OCT包埋剂的EP管内。3、液氮中速冻，保存于-80℃。4、取出冻好的组织，用预冷好的切片机50μm厚度修片，自出现瓣膜开始，以7μm厚度，连续切片，固定在防脱载玻片上。5、冰冻切片于-80℃储存用于后续染色实验。主动脉/颈总动脉冰冻切片的制备方法如下：1、提前预冷冰冻切片机，准备好相关实验用品。2、小鼠血管取材后，以环切(血管垂直放入)或者纵切(血管水平放入)方式置于装好OCT包埋剂的EP管内。3、液氮中速冻，保存于-80℃。4、将血管在EP管内的位置用标记笔大致标出。5、按标记笔标记的位置修片，自出现血管组织开始，以10μm厚度，连续切片，固定在防脱载玻片上。6、冰冻切片于-80℃储存用于后续染色实验。

下述实施例中的统计方法如下：研究中所有量化实验结果均以均值±标准误(Mean±SEM)表示，非配对t检验(Unpaired-independent samples T test)进行连续性变量的两组间比较；多组间比较采用双因素方差分析(two way ANOVA)，进一步组间两两比较采用bonferroni’s post hoc test检验。下述实施例中的统计学分析应用软件如下：i.GraphPad Prism 6用于非配对t检验和单因素方差分析；ii.MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)用于多元统计分析。

下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示。

表1、引物序列

下述实施例中所涉及的内皮细胞为原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。具体分离和培养方法如下：1、为维持细胞的活性，产妇脐带于分娩后最好24小时内分离。脐带保存于无菌的1×HEPES缓冲液中，4℃保存(脐带来自天津医科大学总医院产科)。2、在细胞超净工作台内检查脐带有无破损，切掉脐带两端1-2cm以更好的暴露脐静脉，并切除与钳子接触过的区域避免污染。3、轻轻擦去脐带上的血液和缓冲液，将两个金属插头(Hose End)分别插入脐静脉的两端，尼龙扎带扎紧固定。轻揉脐带，挤出残留在动静脉中的血液、凝块。4、将金属插头与装满1×HEPES缓冲液的20mL注射器连接。举起脐带轻揉脐带并冲洗2-3次，直至脐带内的血液和凝块全完被冲出。5、将注射器内换成10mL 2.5％胰酶，另一端用注射器连接封闭，将胰酶缓缓注入脐带直至充盈。6、将脐带放入盛有约200mL 37℃恒温无菌的1×HEPES缓冲液的烧杯内孵育10分钟。7、将脐带小心拿出，并且轻揉地按摩脐带2-3分钟，反复抽吸脐带内胰酶1-2次，加速内皮细胞的消化脱落。8、将脐带悬于装有10mL含10％血清的M199培养基的50mL离心管上，打开金属插头，将含有细胞的胰酶小心灌入离心管内终止消化，用细胞培养基反复冲洗脐带收取尽可能多的内皮细胞。9、1000rpm离心5分钟。10、弃掉细胞培养基，用8mL新鲜M199培养基重悬管底细胞沉淀。11、将细胞悬液贴壁打入包被有一型胶原蛋白的10cm培养皿中，放置于37℃、5％CO₂孵箱内培养称P0，第二天早上换液。12、细胞长满大约需要3-6天，待细胞生长密度达90％以上时按1:3比例进行细胞传代至P1；进一步实验需要混合三根脐带的细胞以排除个体差异性，留部分细胞冻存备用。M199培养基(原代人脐静脉内皮细胞培养基)的配方如下：M199(美国Invitrogen公司)9.6g、HEPES 5.96g、Heparin(肝素钠)94mg、Thymidine(胸苷)12mL、NaHCO₃ 2.2g、ECGF(内皮细胞生长因子)0.3μg、100×青链霉素溶液10mL。调pH于7.4，Milli-Q级纯净水定容为1L，过滤(0.22μm)后4℃储存。

下述实施例中的COMP全身敲除小鼠(下文简称为COMP^-/-小鼠)、平滑肌特异性过表达COMP小鼠(下文简称为SMC-COMP^Tg小鼠)和ApoE全身敲除小鼠(下文简称为ApoE^-/-小鼠，动脉硬化小鼠模型)均记载于文献“Shift of Macrophage Phenotype Due to CartilageOligomeric Matrix Protein Deficiency Drives Atherosclerotic Calcification.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。用于COMP^-/-小鼠基因型鉴定的引物如下：Mus COMP3primer：TTGCTCGTTAGGGACTCCAT；Mus COMP5primer：CAGAAGCAAAGGTCGTGGAA；Neo COMP：CGCCTTCTTGACGAGTTCTT(扩增产物大小为650bp的小鼠为阳性)。用于SMC-COMP^Tg小鼠基因型鉴定的引物如下：SM22-Comp：GACAGGCTTCGCAGTGAAA和TGAGCCAAGCAGACTTCCAT；Comp-MHC：GACAGGCTTCGCAGTGAAA和CATAGA AGCCTAGCCCACACCA(扩增产物大小为500bp的小鼠为阳性)。

实施例1、软骨寡聚基质蛋白COMP可抑制内皮激活

一、软骨寡聚基质蛋白COMP可抑制湍流引起的内皮细胞的激活

将软骨寡聚基质蛋白(COMP)、血小板反应蛋白1(TSP1)、CCN家族成员1(CCN1)、CCN家族成员3(CCN3)和细胞外基质纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)分别包被于无菌玻璃板上4℃过夜，以细胞外基质Ι型胶原CollagenΙ(ColⅡ)为对照，各细胞外基质的浓度均为200ng/mL。然后将内皮细胞接种在上述已包被细胞外基质的无菌玻璃板上，每个玻璃板的内皮细胞的密度为1×10⁶。之后给予内皮细胞湍流(0.5±4dynes/cm²，1Hz)处理，并检测处理后内皮细胞激活的标志物VCAM-1和ICAM-1的mRNA水平。

具体步骤如下：1、实验前，先将内皮细胞铺于包被有胶原等细胞外基质蛋白的无菌玻璃板上培养至细胞全部贴壁，传代密度为1:1。2、按图1C所示搭建湍流流室系统，仅剩上下槽末端接口未连接。3、使用洁净的止血钳夹闭四个下槽末端的接口。4、分别由上下槽注入M199培养基，待上下槽均充满培养基后，手动挤压上下槽连接的管道，使槽内液体流至管道各处。5、将长满细胞的无菌玻璃板和硅胶垫片、流室底座由上至下似“三明治”样组合在一起，并用夹子将外围边缘夹紧。6、将上述“三明治”组合与下槽末端接口紧密连接，三明治之间则使用高压灭菌后的短胶管连接。7、完成整个流室系统的安装后，松开止血钳，手动挤压下槽连接的管道排空流室进出管道中和流室内部的气泡。8、待流室上下槽液体平衡稳定后，用流体测试仪测量流经流室液体的速度，对于8cm×10cm的玻璃板，流体速度为6mL/分钟。而对于4cm×7cm的玻璃板，流体速度为3mL/分钟。9、在此流室基础上，在流室进入管用三通连接器加上一个注射泵，并将注射泵速度调整为400μL/秒。10、松开血管钳，排净流室系统内气泡，然后将流室玻璃板面置于最下层。11、最后，将整个流室系统置于5％CO₂、37℃培养箱内，维持箱内温度和CO₂不变，使系统稳定下工作。

结果表明：这些基质细胞蛋白中仅有软骨寡聚基质蛋白COMP可以抑制湍流引起的内皮激活(图1A和图1B)。

二、生理状态下COMP^-/-小鼠血管内皮激活标志物表达上调

为进一步验证基质蛋白COMP对内皮激活的抑制作用，在生理状态下，采用免疫荧光染色法检测8周龄野生型小鼠(WT)、COMP全身敲除小鼠(COMP^-/-)和平滑肌特异性过表达COMP小鼠(SMC-COMP^Tg)三种小鼠分离出的主动脉弓部小弯侧(AA inner)、弓部大弯侧(AAouter)和直部血管(TA)内皮激活的标志物VCAM-1和ICAM-1。同时分离WT、COMP^-/-和SMC-COMP^Tg三种小鼠主动脉血管弓部和直部，并提取蛋白，采用Western Blotting检测VCAM-1蛋白表达水平，用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析。

血管en face/切片免疫荧光染色方法具体如下：

血管en face免疫荧光染色：1、分离小鼠主动脉血管或颈总动脉后，放入预冷的PBS中。小心剥离血管表面的脂肪结缔组织。2、将分离干净的主动脉血管或颈总动脉放入4％浓度的多聚甲醛中室温固定15分钟后，PBS洗3次，每次5分钟，在显微镜下撕掉主动脉血管的外膜。3、将剥离掉外膜的小鼠血管放入0.05％Triton X-100透膜液中室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。4、将透膜后的血管放入山羊血清工作液或免疫荧光一抗稀释液中室温孵育封闭30分钟。5、提前将一抗按1:100比例用免疫荧光一抗稀释液稀释混合，弃掉封闭液后，将血管放入一抗中于4℃湿盒内孵育摇动过夜。6、取出湿盒，PBS洗3次，每次5分钟。7、荧光二抗按1:200比例用免疫荧光一抗稀释液稀释混合，室温孵育1小时，避光进行。8、PBS洗3次，每次5分钟，避光进行，将血管分段剪成小片，使血管内膜面朝向盖玻片，用含DAPI的封片剂滴染，指甲油封片，4℃避光保存用于后续激光共聚焦显微镜(Olympus)拍照分析。

血管冰冻切片切片免疫荧光染色：1、从-80℃中提前取出组织冰冻切片，室温放置15分钟至水分完全挥发。2、用组化笔将要染色的组织圈选出来。3、用PBS缓冲液浸洗5分钟，3次，脱去OCT包埋剂。4、将组织冰冻切片放入4％浓度的多聚甲醛中室温固定15分钟后，PBS洗3次，每次5分钟。5、将组织冰冻切片放入0.05％Triton X-100透膜液中室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。6、将透膜后的组织切片放入山羊血清工作液或免疫荧光一抗稀释液中室温孵育封闭30分钟。7、提前将一抗按1:100比例用免疫荧光一抗稀释液稀释混合，弃掉封闭液后，将一抗滴染到每块组织上，放入4℃湿盒内孵育摇动过夜。8、取出湿盒，PBS洗3次，每次5分钟。9、荧光二抗按1:200比例用免疫荧光一抗稀释液稀释混合，滴染到每块组织上，室温孵育1小时，避光进行。10、PBS洗3次，每次5分钟，避光进行，用吸水纸小心吸干组织上残留的水滴，用含DAPI的封片剂滴染，指甲油封片，4℃避光保存用于后续激光共聚焦显微镜(Olympus)拍照分析。

结果表明：在血管弓部尤其是小弯侧VCAM-1和ICAM-1在COMP^-/-小鼠的表达显著高于WT，而其在SMC-COMP^Tg小鼠中的表达较低(图2A和图2B)。同样，相对于WT小鼠，COMP^-/-小鼠主动脉血管弓部VCAM-1的蛋白水平也显著增加，而SMC-COMP^Tg小鼠内皮激活的标志物则显著下调(图2C和图2D)。

三、病理状态下COMP^-/-小鼠血管内皮激活标志物表达上调

在病理状态下，给予WT、COMP^-/-和SMC-COMP ^Tg三种小鼠行左颈总动脉部分结扎术并给两周西方饮食在体模拟湍流状态(图3A)，两周后分离三种小鼠左、右颈总动脉进行免疫组化和免疫荧光染色。

小鼠左颈总动脉部分结扎术(在体模拟湍流模型)的具体步骤如下：1、雄性WT、COMP^-/-和SMC-COMP^Tg小鼠，分别给予普通饮食(天津医科大学动物部，SPF级)喂养1周适应环境。2、使用气体麻醉(异氟烷，浓度2％)持续麻醉，小鼠仰面安置于37℃恒温台上，垫高小鼠颈部，黑布遮盖眼睛防止强光照射。3、在手术区域褪毛、消毒后，于颈部正中进行约1cm的切口，切开皮肤、钝性分离皮下筋膜及肌肉，直至暴露出气管。4、于气管左侧用显微器械在显微镜下进行分离，小心游离出左颈总动脉远心端分岔处；5、用6-0号丝线，在甲状腺上动脉远端结扎颈外动脉，按血管走行将颈内动脉和枕动脉结扎在一起。6、对照组：分离出右颈总动脉及其分支，但不进行结扎。7、缝合小鼠颈部切口，术后将其置于恒温箱中缓慢复苏。8、给予小鼠西方饮食(Research Diets，D12109C)喂养两周。9、1.2％三溴乙醇(阿佛丁)麻醉处死动物，分离左右两侧颈总动脉进行下一步实验。

结果表明：相比WT和SMC-COMP^Tg小鼠，COMP^-/-小鼠左颈总动脉内皮激活情况明显加重(图3B、图3C和图3D)。

四、体外COMP纯化蛋白可抑制湍流引起的内皮细胞炎症反应

将体外制备的COMP纯化蛋白包被于无菌玻璃板上，4℃过夜，次日将内皮细胞接种在包被有COMP纯化蛋白的玻璃板上(每个玻璃板内皮细胞密度为2×10⁶，COMP纯化蛋白的浓度为200ng/mL)并给予湍流处理(0.5±4dynes/cm²，1Hz)，收集处理后的细胞委托华大基因公司进行RNA测序；采用实时定量PCR检测VCAM-1、ICAM-1、SELE、TNFα、IL-1β、IL-6、CCL2、CCL7、CCL8、CYR61mRNA表达水平；采用Western Blotting检测VCAM-1、ICAM-1、SELE蛋白表达水平，并用imageJ软件对VCAM-1、ICAM-1、SELE进行定量及统计分析；通过单核细胞黏附实验检测COMP对单核细胞THP1黏附内皮细胞的影响。

体外纯化COMP蛋白的制备方法具体如下：1、将含有COMP质粒的HEK293细胞株(含有COMP质粒的HEK293细胞株及其构建方法记载于文献“Cartilage Oligomeric MatrixProtein Maintains the Contractile Phenotype of Vascular Smooth Muscle Cellsby Interacting Withα7β1Integrin”中，利用抗生素G418(750mg/ml)筛选即可获得)的培养基换成Opti-MEM，继续培养24小时。2、将步骤1获得的培养基至新的50ml离心管中(如果细胞状态比较好，可继续加条件培养基进行培养，步骤同1-2。3、利用含2mM氯化钙的Tris缓冲盐溶液预平衡连接肝素的蛋白珠子，混悬2次每次10分钟。4、加入一定量的条件培养基至平衡过的连肝素的蛋白珠子，4℃混悬过夜。5、低速离心，让蛋白珠子沉淀，弃去上清。6、利用含2mM氯化钙的Tris缓冲盐溶液洗涤珠子，4℃4次每次10分钟，沉淀珠子，弃去上清。7、将珠子转移至新的1.5ml的EP管中，加入250ul洗脱液4℃混悬30分钟，洗脱连接在珠子上的COMP纯化蛋白，离心取上清，重复4次，完全洗脱，-70℃分装保存。

单核细胞黏附实验的具体步骤如下：1、提前复苏THP-1细胞系，使用含10％FBS的1640培养基进行培养，细胞密度达90％可进行传代，继续培养用于后续实验。2、准备合适代数(P5/P6)的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，传至无菌玻璃板上，待细胞密度达90％，给予细胞湍流处理2h。3、收集THP-1细胞至15ml离心管，1000rpm，5min，离心弃掉培养基，用PBS缓冲液重悬，重复2-3次。4、使用BCECF-AM标记THP-1细胞系，按照1；500的比例将染料加至15ml离心管，37℃避光孵育30min。5、1000rpm，5min，离心弃上清，PBS洗3遍，用M199培养基重悬，之后按每个玻璃板2×10⁶个细胞将其加至HUVECs中，37℃孵育1小时。6、1000rpm，5min，离心弃上清，PBS洗2遍以除去未黏附的THP-1，4％多聚甲醛固定15min，PBS洗两遍，之后使用荧光显微镜拍照，每孔取5个视野，统计绿色荧光细胞数量。

结果表明：RNA测序结果显示COMP可以抑制湍流引起的内皮细胞炎症反应相关信号通路如TNFα，NF-κB pathway等，进一步的qPCR验证VCAM-1、VCAM-1、SELE、TNFα、IL-1β、IL-6、CCL2、CCL7、CCL8、CYR61炎症基因mRNA表达水平，其中COMP可以抑制湍流引起的SELE、ICAM-1和VCAM-1的上调(图4A)。COMP可以抑制湍流引起的内皮细胞炎症反应相关基因的表达，其中最为显著的为VCAM-1，ICAM-1和内皮选择素SELE(图4B)。蛋白水平上验证COMP可下调湍流引起的ICAM-1和VCAM-1的表达水平(图4C和图4D)。单核细胞黏附实验也表明COMP可减少单核细胞THP1向内皮细胞黏附(图4E和图4F)。

实施例2、COMP通过其TYP3和C-端结构域与integrinα5相互结合

一、COMP可以与内皮激活相关的integrinα5相互作用

integrin作为一大类跨膜受体蛋白，由α和β两个亚基通过非共价键连接组成异源二聚体，可与胞外基质或其它细胞表面受体结合，介导细胞-细胞、细胞-细胞外基质之间的信号传导，通过由内到外(inside-out)和由外到内(outside-in)双向传递跨膜信号。为验证作为细胞外基质的COMP是否通过integrin信号通路介导了对内皮激活的抑制作用，通过如下免疫共沉淀实验验证COMP是否与上述内皮激活相关integrin有相互作用：将内皮细胞接种在包被有COMP纯化蛋白的玻璃板上(每个玻璃板内皮细胞密度为2×10⁶，COMP纯化蛋白的浓度为200ng/mL)并给予内皮细胞湍流(0.5±4dynes/cm²，1Hz)处理，2小时后收细胞进行免疫共沉淀实验；分离小鼠主动脉血管、弓部和直部分别进行免疫共沉淀实验；分离小鼠主动脉血管弓部和直部分别进行免疫荧光共定位实验。

免疫共沉淀实验的具体步骤如下：1、预冷的PBS洗涤细胞(HEK293)两次，最后一次吸干PBS。2、加入预冷的RIPA buffer(1ml/10⁷个细胞，10cm培养基)。3、预冷的细胞刮将细胞从培养皿上刮下，把悬液吸至1.5ml的EP管中，4℃缓慢摇动30min(充分裂解)。4、4℃，14000g离心15min，将上清转移至新的EP管中(此步可选择蛋白质定量)。5、取含500ug全蛋白的上述液体至三个新的EP管，分别为阳性对照(input)，阴性对照(IgG)和实验组(目的)，在目的EP管中加入免疫沉淀一抗，阴性对照管中加入相应种属的IgG抗体，4℃缓慢摇动过夜。6、加入20-50μL充分重悬的ProteinA/G Agrose，室温缓慢摇动1-2小时。7、4℃，12000rpm，1min离心，小心吸除上清。8、使用提前配好的预冷IP buffer分别各洗涤2-3次。9、最后一次洗涤后，充分弃掉上清，加入50ul 2XSDS，震荡重悬离心，沸水浴煮3-5min。10、取样品用于SDS-PAGE电泳或-20℃储存。

结果表明：体内外的免疫共沉淀实验结果皆表明COMP可以与integrinα5相互结合(图5A、图5B、图5C和图5D)。

二、COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用

通过免疫共沉淀实验和免疫双杂交实验进一步研究integrinα5和COMP的具体结合的结构域。

1、免疫共沉淀实验

根据COMP蛋白的结构在体外构建包含COMP不同结构域：N端结构域(COMP蛋白氨基酸序列第20-83位)，EGF结构域(COMP蛋白氨基酸序列第84-261位)，TYP3结构域(COMP蛋白氨基酸序列第266-520位)和C端结构域(COMP蛋白氨基酸序列第521-755位)以及COMP全长的质粒(带Flag标签)。然后将包含COMP不同结构域的质粒分别与integrinα5质粒(带HA标签)(购买自Addgene)共转染到HEK293细胞中，24小时后收细胞进行免疫共沉淀实验。

结果表明：COMP的TYP3结构域和C端结构域与integrinα5有相互结合(图6A)。

2、免疫双杂交实验

将integrinα5编码基因序列克隆到pBIND载体(Promega)上，得到pBIND-integrinα5。将COMP的不同结构域以及全长的编码基因序列分别克隆到pACT载体(Promega)上，分别得到含有COMP不同结构域的pACT。然后将pBIND-integrinα5分别与含有COMP不同结构域的pACT共转染到HEK293细胞中，48小时后收取细胞检测荧光素酶的活性。

免疫双杂交实验的具体步骤如下：1、将编码COMP的四个功能域片段(N端aa20-83、EGF结构域aa84-261、TYP3结构域aa266-520、C端aa521-755)及全长的COMP片段经PCR扩增后分别克隆到pACT载体中；2、将编码全长的integrinα5片段经PCR扩增后克隆到pBIND载体中；3、将上述含pACT载体的质粒分别与含pBING载体的质粒以及含荧光素酶报告基因的质粒pG5luc(Promega)按1：1：1的比例转染到HEK293细胞系中。4、上述质粒共转染48小时后，收取细胞裂解液，使用双荧光素酶报告实验系统(Promega)检测荧光素酶的活性。

结果表明：COMP的TYP3结构域和C端结构域与integrinα5有相互结合(图6B)。

三、敲除COMP在integrinα5上的结合区域后，二者之间不再存在相互作用

为了进一步反向验证COMP可通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用。首先对COMP和integrinα5进行结构预测(图7A)，找到了二者相互结合的序列，其中COMP与integrinα5结合的序列刚好是其TYP3和C端结构域，这与上述免疫共沉淀实验和双杂交实验的结果一致。然后将integrinα5上面COMP的结合片段(integrinα5氨基酸序列的第42-490位)敲除之后，再分别与COMP全长以及含TYP3和C端结构域的质粒共转染到HK293细胞中进行免疫共沉淀实验和免疫双杂交实验。

免疫共沉淀实验结果表明：敲除COMP在integrinα5上面的结合序列之后，无论是全长的COMP还是其TYP3结构域和C端结构域与integrinα5不再发生相互作用(图7B)，这一结果从反向证实了COMP通过其TYP3和C端结构域与integrinα5相互作用。免疫双杂交实验也证实了这一结果(图7C)。

实施例3、COMP可抑制integrinα5信号通路

一、COMP可抑制integrinα5的激活以及其下游分子FAK和Src的磷酸化

1、分离8周龄WT小鼠和COMP^-/-小鼠主动脉血管直部、弓部小弯侧和弓部大弯侧进行en face免疫荧光染色。

结果表明：与WT小鼠相比，COMP^-/-小鼠血管弓部尤其是小弯侧integrinα5的激活显著增加(图8A)。

2、给予8周龄WT小鼠和COMP^-/-小鼠行左颈总动脉部分结扎术在体模拟湍流的血流状态，给予西方饮食两周后分离两组小鼠左颈总动脉进行免疫荧光染色。

结果表明：与WT小鼠相比，COMP^-/-左颈总动脉结扎部位integrinα5的激活显著增加(图8B)。

3、分离8周龄WT小鼠和COMP^-/-小鼠主动脉血管直部和弓部，并提取蛋白，采用Western Blotting检测integrinα5信号通路的下游分子FAK和Src的磷酸化水平。

结果表明：与WT小鼠相比，COMP^-/-小鼠血管尤其弓部FAK和Src的磷酸化水平显著增强(图8C和图8D)。

二、COMP可抑制由湍流(OSS)或纤维连接蛋白(FN)引起的integrinα5的激活以及其下游FAK和Src的磷酸化水平

1、将内皮细胞接种在包被有不同浓度梯度(10nM、25nM、50nM、100nM、200nM)的COMP纯化蛋白的玻璃板上(每个玻璃板内皮细胞密度为5×10⁵)并给予内皮细胞湍流(0.5±4dynes/cm2，1Hz)处理，1小时后收细胞用Western Blotting检测激活态integrinα5的表达水平，同时用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析。

结果表明：湍流引起的integrinα5激活可被COMP抑制，且这种抑制作用具有COMP剂量依赖性(图9A和图9B)。

2、将内皮细胞接种在同时包被有不同浓度梯度(10nM、25nM、50nM、100nM、200nM)的COMP纯化蛋白和纤维连接蛋白FN(10μg/ml)的培养皿上(培养皿上内皮细胞密度为5×10⁵)，6小时后收细胞用Western Blotting检测激活态integrinα5的表达水平，同时用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析。

结果表明：纤维连接蛋白FN引起的integrinα5激活可被COMP抑制，且这种抑制作用具有COMP剂量依赖性(图9C和图9D)。

3、将内皮细胞接种在同时包被有COMP纯化蛋白(200nM)和纤维连接蛋白FN(10μg/ml)的培养皿上(培养皿上内皮细胞密度为5×10⁵)，6小时后收细胞用Western Blotting检测激活态integrinα5及其下游p-FAK和p-Src的表达水平，同时用Image J软件对蛋白表达水平进行定量及统计分析。

结果表明：COMP也可逆转FN引起的integrinα5的激活，进而抑制其下游分子FAK和Src的磷酸化(图9E和图9F)。

实施例4、体外合成的源于COMP的短肽可抑制内皮激活

一、体外合成源于COMP的短肽

根据COMP与integrinα5的结合序列委托上海强耀生物科技有限公司(ChinaPeptides)合成了含24个氨基酸的短肽FRAFQTVVLDPEGDAQIDPNWVVL(序列3)，其为COMP蛋白的第531-554位，并将其命名为24肽。合成的短肽溶于玉米油中进行保存。

二、24肽可抑制integrinα5的激活以及其下游分子FAK和Src的磷酸化

将步骤一合成的24肽加入内皮细胞培养体系(内皮细胞培养体系是将原代人脐静脉内皮细胞HUVECs接种于M199培养基中得到的，内皮细胞密度为2.5×10⁵)中，使24肽浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml和50μg/ml，然后置于5％CO₂、37℃培养箱内短肽处理48小时后将其铺于包被有纤维连接蛋白FN(10μg/ml)的无菌培养皿上培养6小时，收取培养后的细胞并提取蛋白，采用Western Blotting检测integrinα5的激活以及其下游分子FAK和Src的磷酸化水平。

结果表明：24肽可发挥与COMP相同的作用，即可逆转纤维连接蛋白FN引起的integrinα5的激活以及其下游分子FAK和Src的磷酸化(图10A和图10B)，即抑制integrinα5的激活以及其下游分子FAK和Src的磷酸化。

三、24肽可抑制integrinα5与纤维连接蛋白FN的相互作用

将步骤一合成的24肽加入内皮细胞培养体系(内皮细胞培养体系是将原代人脐静脉内皮细胞HUVECs接种于M199培养基中得到的，内皮细胞密度为2.5×10⁵)中，使24肽浓度为50μg/ml，在短肽处理48小时后将其铺于包被有纤维连接蛋白FN的无菌培养皿上培养6小时，收取培养后的细胞通过免疫共沉淀的方法检测integrinα5和FN的结合情况。

结果表明：24肽在一定程度上减少了integrinα5与纤维连接蛋白FN的结合(图11)。这也解释了24肽发挥抑制integrinα5激活的机制。

四、24肽减缓西方饮食诱导的动脉粥样硬化形成

为探究24短肽介导的integrinα5激活的抑制作用对动脉粥样硬化形成的影响，进行如下实验：

按照给予或不给予8周龄ApoE^-/-小鼠24肽处理分为如下两组：

实验组：腹腔注射24肽溶液(溶剂为玉米油)，每隔两天注射一次，每次注射剂量为24肽100mg/体重为1kg小鼠；持续给药5周。

对照组：腹腔注射玉米油，每隔两天注射一次，每次注射剂量为玉米油100mg/体重为1kg小鼠；持续注射5周。

注射1周后给两组小鼠喂养4周的西方饮食，给药前监测体重和饮食，共计5周后小鼠麻醉处死取材。采用甘油三酯测定试剂盒[GPO-PAP法]、胆固醇测定试剂盒[CHOD-PAP法]分别检测两组小鼠血浆胆固醇和甘油三酯表达水平；分离两组小鼠主动脉血管、弓部、直部，通过对血管做en face油红O染色观察动脉粥样硬化斑块面积。心脏OCT包埋做流出道切片染色。

结果表明：两组小鼠间血脂水平无明显差异(图12A)。通过对血管做en face油红O染色观察动脉粥样硬化斑块面积发现，与对照组小鼠血管相比，实验组(24肽处理)小鼠斑块面积显著减小(图12B)。斑块的统计分析表明24肽减少了血管整体斑块大小包括血管弓部直部部位的斑块大小(图12C)。说明24肽可减缓西方饮食诱导的动脉粥样硬化形成。

五、24肽减缓ApoE^-/-小鼠主动脉流出道斑块损伤面积和脂质沉积

主动脉流出道为动脉粥样硬化的好发部分，通过对流出道斑块的脂质沉积和平滑肌含量的分析，可以反映动脉粥样硬化斑块的具体成分。

对步骤三两组小鼠主动脉流出道做切片进行免疫组化染色分析。

苏木精—伊红染色法(HE)的具体步骤如下：1、从-80℃中提前取出组织冰冻切片，室温放置15分钟至水分完全挥发。2、用PBS缓冲液浸洗5分钟，3次，脱去OCT包埋剂。3、将组织冰冻切片放入4％浓度的多聚甲醛中室温固定15分钟后，PBS洗3次，每次5分钟。4、Harris苏木素染液滴染1分钟，流水冲洗返蓝，蒸馏水过洗；伊红滴染30秒，浸自来水洗去多余的染色液。5、通风橱内脱水，95％乙醇5秒，更换新鲜95％乙醇脱水2分钟，100％乙醇脱色，100％乙醇分色，二甲苯透明10分钟，更换新鲜的二甲苯再次透明10分钟。6、用中性树脂封片，37℃烤干。7、在显微镜4倍镜下拍摄血管切片染色，Image Pro Plus 6.0统计斑块面积。

油红O染色的具体步骤如下：1、从-80℃中提前取出组织冰冻切片，室温放置15分钟至水分完全挥发。2、用PBS缓冲液浸洗5分钟，3次，脱去OCT包埋剂。3、将组织冰冻切片放入4％浓度的多聚甲醛中室温固定15分钟后，PBS洗3次，每次5分钟。4、稀释油红O储液，配制新鲜工作液，在通风橱内使用60％油红O工作液染色30分钟(避光条件下进行)。5、使用60％的异丙醇在摇床上避光浸洗5分钟，洗掉浮色至底色变白为止。6、使用90％甘油(1×PBS缓冲液配制)封片，阴凉处变干。7、在显微镜4倍镜下拍摄，Image Pro Plus 6.0统计斑块内红色阳性面积。

天狼星红染色的具体步骤如下：1、从-80℃中提前取出组织冰冻切片，室温放置15分钟至水分完全挥发。2、用PBS缓冲液浸洗5分钟，3次，脱去OCT包埋剂。3、将组织冰冻切片放入4％浓度的多聚甲醛中室温固定15分钟后，PBS洗3次，每次5分钟。4、天狼星红工作液浸染40分钟。5、蒸馏水洗2次。6、75％乙醇浸泡3分钟，85％乙醇浸泡3分钟，95％乙醇浸泡3分钟，100％乙醇Ⅰ液浸泡5分钟，100％乙醇Ⅱ液浸泡5分钟，100％二甲苯Ⅰ液浸泡10分钟，100％二甲苯Ⅱ液浸泡10分钟。7、使用中性树胶封固，37℃烤干。8、在显微镜4倍镜下拍摄，Image Pro Plus 6.0统计斑块面积。

结果表明：24肽可减缓动脉粥样硬化形成是通过减少斑块的损伤面积和脂质沉积(图13A和图13B)。动脉粥样硬化与斑块内巨噬细胞的含量也密切相关，对主动脉流出道巨噬细胞染色(以CD68为标志物)发现，24肽可减少斑块的巨噬细胞浸润(图13C)。进一步对斑块成分作天狼星红和平滑肌细胞染色(以α-SMA为标志物)分析斑块稳定性，发现24肽对斑块中胶原和平滑肌的含量均无明显影响(图13D和图13E)。

通过免疫荧光染色分析对两组小鼠斑块内膜层的内皮激活标志物VCAM-1和ICAM-1以及激活态integrinα5的表达水平进行检测。

结果表明：与对照组相比，24肽处理组小鼠内膜层的VCAM-1和ICAM-1以及激活态integrinα5的表达水平较对照组显著降低(图13F、图13G和图13H)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 天津医科大学

<120> 与内皮细胞激活相关的靶点COMP及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtccccg acaccgcctg cgttcttctg ctcaccctgg ctgccctcgg cgcgtccgga 60

cagggccaga gcccgttggg ctcagacctg ggcccgcaga tgcttcggga actgcaggaa 120

accaacgcgg cgctgcagga cgtgcgggag ctgctgcggc agcaggtcag ggagatcacg 180

ttcctgaaaa acacggtgat ggagtgtgac gcgtgcggga tgcagcagtc agtacgcacc 240

ggcctaccca gcgtgcggcc cctgctccac tgcgcgcccg gcttctgctt ccccggcgtg 300

gcctgcatcc agacggagag cggcgcgcgc tgcggcccct gccccgcggg cttcacgggc 360

aacggctcgc actgcaccga cgtcaacgag tgcaacgccc acccctgctt cccccgagtc 420

cgctgtatca acaccagccc ggggttccgc tgcgaggctt gcccgccggg gtacagcggc 480

cccacccacc agggcgtggg gctggctttc gccaaggcca acaagcaggt ttgcacggac 540

atcaacgagt gtgagaccgg gcaacataac tgcgtcccca actccgtgtg catcaacacc 600

cggggctcct tccagtgcgg cccgtgccag cccggcttcg tgggcgacca ggcgtccggc 660

tgccagcggc gcgcacagcg cttctgcccc gacggctcgc ccagcgagtg ccacgagcat 720

gcagactgcg tcctagagcg cgatggctcg cggtcgtgcg tgtgtgccgt tggctgggcc 780

ggcaacggga tcctctgtgg tcgcgacact gacctagacg gcttcccgga cgagaagctg 840

cgctgcccgg agcgccagtg ccgtaaggac aactgcgtga ctgtgcccaa ctcagggcag 900

gaggatgtgg accgcgatgg catcggagac gcctgcgatc cggatgccga cggggacggg 960

gtccccaatg aaaaggacaa ctgcccgctg gtgcggaacc cagaccagcg caacacggac 1020

gaggacaagt ggggcgatgc gtgcgacaac tgccggtccc agaagaacga cgaccaaaag 1080

gacacagacc aggacggccg gggcgatgcg tgcgacgacg acatcgacgg cgaccggatc 1140

cgcaaccagg ccgacaactg ccctagggta cccaactcag accagaagga cagtgatggc 1200

gatggtatag gggatgcctg tgacaactgt ccccagaaga gcaacccgga tcaggcggat 1260

gtggaccacg actttgtggg agatgcttgt gacagcgatc aagaccagga tggagacgga 1320

catcaggact ctcgggacaa ctgtcccacg gtgcctaaca gtgcccagga ggactcagac 1380

cacgatggcc agggtgatgc ctgcgacgac gacgacgaca atgacggagt ccctgacagt 1440

cgggacaact gccgcctggt gcctaacccc ggccaggagg acgcggacag ggacggcgtg 1500

ggcgacgtgt gccaggacga ctttgatgca gacaaggtgg tagacaagat cgacgtgtgt 1560

ccggagaacg ctgaagtcac gctcaccgac ttcagggcct tccagacagt cgtgctggac 1620

ccggagggtg acgcgcagat tgaccccaac tgggtggtgc tcaaccaggg aagggagatc 1680

gtgcagacaa tgaacagcga cccaggcctg gctgtgggtt acactgcctt caatggcgtg 1740

gacttcgagg gcacgttcca tgtgaacacg gtcacggatg acgactatgc gggcttcatc 1800

tttggctacc aggacagctc cagcttctac gtggtcatgt ggaagcagat ggagcaaacg 1860

tattggcagg cgaacccctt ccgtgctgtg gccgagcctg gcatccaact caaggctgtg 1920

aagtcttcca caggccccgg ggaacagctg cggaacgctc tgtggcatac aggagacaca 1980

gagtcccagg tgcggctgct gtggaaggac ccgcgaaacg tgggttggaa ggacaagaag 2040

tcctatcgtt ggttcctgca gcaccggccc caagtgggct acatcagggt gcgattctat 2100

gagggccctg agctggtggc cgacagcaac gtggtcttgg acacaaccat gcggggtggc 2160

cgcctggggg tcttctgctt ctcccaggag aacatcatct gggccaacct gcgttaccgc 2220

tgcaatgaca ccatcccaga ggactatgag acccatcagc tgcggcaagc ctag 2274

<210> 2

<211> 3150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggggagcc ggacgccaga gtcccctctc cacgccgtgc agctgcgctg gggcccccgg 60

cgccgacccc cgctgctgcc gctgctgttg ctgctgctgc cgccgccacc cagggtcggg 120

ggcttcaact tagacgcgga ggccccagca gtactctcgg ggcccccggg ctccttcttc 180

ggattctcag tggagtttta ccggccggga acagacgggg tcagtgtgct ggtgggagca 240

cccaaggcta ataccagcca gccaggagtg ctgcagggtg gtgctgtcta cctctgtcct 300

tggggtgcca gccccacaca gtgcaccccc attgaatttg acagcaaagg ctctcggctc 360

ctggagtcct cactgtccag ctcagaggga gaggagcctg tggagtacaa gtccttgcag 420

tggttcgggg caacagttcg agcccatggc tcctccatct tggcatgcgc tccactgtac 480

agctggcgca cagagaagga gccactgagc gaccccgtgg gcacctgcta cctctccaca 540

gataacttca cccgaattct ggagtatgca ccctgccgct cagatttcag ctgggcagca 600

ggacagggtt actgccaagg aggcttcagt gccgagttca ccaagactgg ccgtgtggtt 660

ttaggtggac caggaagcta tttctggcaa ggccagatcc tgtctgccac tcaggagcag 720

attgcagaat cttattaccc cgagtacctg atcaacctgg ttcaggggca gctgcagact 780

cgccaggcca gttccatcta tgatgacagc tacctaggat actctgtggc tgttggtgaa 840

ttcagtggtg atgacacaga agactttgtt gctggtgtgc ccaaagggaa cctcacttac 900

ggctatgtca ccatccttaa tggctcagac attcgatccc tctacaactt ctcaggggaa 960

cagatggcct cctactttgg ctatgcagtg gccgccacag acgtcaatgg ggacgggctg 1020

gatgacttgc tggtgggggc acccctgctc atggatcgga cccctgacgg gcggcctcag 1080

gaggtgggca gggtctacgt ctacctgcag cacccagccg gcatagagcc cacgcccacc 1140

cttaccctca ctggccatga tgagtttggc cgatttggca gctccttgac ccccctgggg 1200

gacctggacc aggatggcta caatgatgtg gccatcgggg ctccctttgg tggggagacc 1260

cagcagggag tagtgtttgt atttcctggg ggcccaggag ggctgggctc taagccttcc 1320

caggttctgc agcccctgtg ggcagccagc cacaccccag acttctttgg ctctgccctt 1380

cgaggaggcc gagacctgga tggcaatgga tatcctgatc tgattgtggg gtcctttggt 1440

gtggacaagg ctgtggtata caggggccgc cccatcgtgt ccgctagtgc ctccctcacc 1500

atcttccccg ccatgttcaa cccagaggag cggagctgca gcttagaggg gaaccctgtg 1560

gcctgcatca accttagctt ctgcctcaat gcttctggaa aacacgttgc tgactccatt 1620

ggtttcacag tggaacttca gctggactgg cagaagcaga agggaggggt acggcgggca 1680

ctgttcctgg cctccaggca ggcaaccctg acccagaccc tgctcatcca gaatggggct 1740

cgagaggatt gcagagagat gaagatctac ctcaggaacg agtcagaatt tcgagacaaa 1800

ctctcgccga ttcacatcgc tctcaacttc tccttggacc cccaagcccc agtggacagc 1860

cacggcctca ggccagccct acattatcag agcaagagcc ggatagagga caaggctcag 1920

atcttgctgg actgtggaga agacaacatc tgtgtgcctg acctgcagct ggaagtgttt 1980

ggggagcaga accatgtgta cctgggtgac aagaatgccc tgaacctcac tttccatgcc 2040

cagaatgtgg gtgagggtgg cgcctatgag gctgagcttc gggtcaccgc ccctccagag 2100

gctgagtact caggactcgt cagacaccca gggaacttct ccagcctgag ctgtgactac 2160

tttgccgtga accagagccg cctgctggtg tgtgacctgg gcaaccccat gaaggcagga 2220

gccagtctgt ggggtggcct tcggtttaca gtccctcatc tccgggacac taagaaaacc 2280

atccagtttg acttccagat cctcagcaag aatctcaaca actcgcaaag cgacgtggtt 2340

tcctttcggc tctccgtgga ggctcaggcc caggtcaccc tgaacggtgt ctccaagcct 2400

gaggcagtgc tattcccagt aagcgactgg catccccgag accagcctca gaaggaggag 2460

gacctgggac ctgctgtcca ccatgtctat gagctcatca accaaggccc cagctccatt 2520

agccagggtg tgctggaact cagctgtccc caggctctgg aaggtcagca gctcctatat 2580

gtgaccagag ttacgggact caactgcacc accaatcacc ccattaaccc aaagggcctg 2640

gagttggatc ccgagggttc cctgcaccac cagcaaaaac gggaagctcc aagccgcagc 2700

tctgcttcct cgggacctca gatcctgaaa tgcccggagg ctgagtgttt caggctgcgc 2760

tgtgagctcg ggcccctgca ccaacaagag agccaaagtc tgcagttgca tttccgagtc 2820

tgggccaaga ctttcttgca gcgggagcac cagccattta gcctgcagtg tgaggctgtg 2880

tacaaagccc tgaagatgcc ctaccgaatc ctgcctcggc agctgcccca aaaagagcgt 2940

caggtggcca cagctgtgca atggaccaag gcagaaggca gctatggcgt cccactgtgg 3000

atcatcatcc tagccatcct gtttggcctc ctgctcctag gtctactcat ctacatcctc 3060

tacaagcttg gattcttcaa acgctccctc ccatatggca ccgccatgga aaaagctcag 3120

ctcaagcctc cagccacctc tgatgcctga 3150

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Phe Arg Ala Phe Gln Thr Val Val Leu Asp Pro Glu Gly Asp Ala Gln

1 5 10 15

Ile Asp Pro Asn Trp Val Val Leu

20

Claims (4)

1.一种短肽，是如下1）或2）所述的短肽：

1）氨基酸序列是软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列的第531-554位；

2）在软骨寡聚基质蛋白COMP氨基酸序列的第531-554位所示的短肽的N端和/或C端连接标签得到的融合短肽。

2.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的短肽。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于：所述产品为药物或制剂。

4.权利要求1所述的短肽或权利要求2或3所述的产品在如下a1）-a10）中任一种中的应用：

a1）制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的产品；

a2）制备减缓动脉粥样硬化的发生和/或发展的产品；

a3）制备抑制内皮细胞的激活的产品；

a4）制备抑制integrin α5信号通路的产品；

a5）制备抑制integrin α5的激活的产品；

a6）制备抑制integrin α5信号通路下游分子FAK和/或Src的磷酸化的产品；

a7）制备降低动脉粥样硬化斑块的损伤面积和/或脂质沉积的产品；

a8）制备抑制动脉粥样硬化斑块内膜层的内皮激活标志物ICAM-1和VCAM-1的表达的产品；

a9）制备减少动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞浸润的产品；

a10）制备减少integrin α5和纤维连接蛋白FN的相互结合的产品。

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