CN101670097A

CN101670097A - 软骨寡聚基质蛋白在制备血管钙化治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN101670097A
Application number: CN200910093499A
Authority: CN
Inventors: 孔炜; 王宪; 杜瑶瑶; 王悦
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2009-09-24
Filing date: 2009-09-24
Publication date: 2010-03-17

Abstract

本发明公开了软骨寡聚基质蛋白(COMP)在制备治疗血管钙化的药物中的应用。表达软骨寡聚基质蛋白的重组腺病毒也可应用于治疗血管钙化。实验证实：表达软骨寡聚基质蛋白的重组腺病毒抑制大鼠腹主动脉钙化。

Description

软骨寡聚基质蛋白在制备血管钙化治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种医学领域，特别涉及软骨寡聚基质蛋白在制备治疗血管钙化的药物中的应用。

背景技术

血管钙化是指在血管壁、心肌和心脏瓣膜处出现钙磷沉积。临床上血管钙化常见于动脉粥样硬化、晚期肾病及糖尿病的病人。其中，动脉粥样硬化的钙化主要见于血管内膜的粥样斑块处；而晚期肾病、糖尿病病人的血管钙化则主要发生在血管的中膜，往往导致受累血管僵硬性增加、舒张功能降低和左心室肥大。流行病学调查证明血管中膜钙化与糖尿病、慢性肾病病人的心血管并发症的高发病率和死亡率密切相关(John RC，Leopold JA，Loscalzo J.Vascular calcification：pathobiologicalmechanisms and clinical implications.Circ Res，2006，99：1044～59)。以往，血管钙化被认为是钙磷代谢异常，从而在血管过度沉积的被动过程，然而临床上单纯控制钙磷的摄入并不能有效地预防和控制钙化。近十年来人们对血管钙化的认识终于有了新的突破：发现它是一个受到高度调控的主动过程，血管中膜平滑肌细胞或血管外膜周细胞、成纤维细胞等发生骨样/软骨样细胞表型转换；出现基质小泡以及各种调控骨分化的关键蛋白，类似于生理状态下的骨发育过程。由于血管钙化是一个多病因，多途径涉及到多种机制的复杂过程，如高无机磷或高钙磷乘积、继发性甲状甲状旁腺激素激素过多、氧自由基、炎症、细胞凋亡等过程均促进了钙化的发生，因此目前临床上采用的降低血钙血磷，比如运用无机焦磷酸，一些磷离子的结合剂，以及维生素K等，但仍不能有效的控制血管钙化的发生发展。人们对于钙化机制的深入认知对于钙化的防治具有重要意义。

软骨寡聚基质蛋白COMP(Cartilage Oligomeric Matrix Protein)是2005年Riessen等新证实的人血管中的正常细胞外基质，由五个长度相近的亚基组成的524KD五聚体大分子糖蛋白，主要由血管平滑肌细胞分泌(Riessen R，Fenchel M，Chen H，Axel DI，Karsch KR，Lawler J.Cartilage oligomeric matrix protein(thrombospondin-5)is expressed by human vascular smooth muscle cells.Arteriosclerosis，thrombosis，and vascular biology，2001；21：47-54.)。之所以被命名为软骨基质蛋白，是因为COMP也是软骨的主要基质成份。

发明内容

本发明的目的在于提供软骨寡聚基质蛋白(COMP)在制备预防或治疗血管钙化药物中的应用。

上述的软骨寡聚基质蛋白的氨基酸序列如GenBank号为EDL28815的自5’端第1位-755位所示。

上述的血管钙化是血管中膜的钙化，具体是指胸主动脉平滑肌细胞钙化或腹主动脉钙化。

本发明的另一目的在于提供表达软骨寡聚基质蛋白的重组腺病毒在制备预防或治疗血管钙化的药物中的应用。

上述重组腺病毒的构建步骤如下：

1)将软骨寡聚基质蛋白的编码基因转入穿梭载体pShuttle-CMV(-)，构成重组穿梭载体；

2)将步骤1)得到的重组穿梭载体与pAdxis腺病毒骨架载体连接，制成含有所述软骨寡聚基质蛋白的编码基因的重组腺病毒载体；

3)将步骤2)得到的重组腺病毒载体感染受体细胞，得到重组腺病毒。

上述软骨寡聚基质蛋白的编码基因的编码序列如GenBank号为NM_016685的自5’端第15位-2279位所示。

上述受体细胞是真核生物的传代细胞；所述真核生物的传代细胞可以为HEK293细胞。

本发明的又一目的在于提供一种预防或治疗血管钙化的药物。

本发明提供的药物的活性成分是如下1)或2)：

1)软骨寡聚基质蛋白；

2)表达软骨寡聚基质蛋白的重组腺病毒。

上述重组腺病毒的构建步骤如下：

上述软骨寡聚基质蛋白的编码基因的编码序列如GenBank号为NM_016685的自5’端第15位-2279位所示；上述软骨寡聚基质蛋白的氨基酸序列如GenBank号为EDL28815的自5’端第1位-755位所示。

上述血管钙化是血管中膜的钙化，具体是指胸主动脉平滑肌细胞钙化或腹主动脉钙化。

实验发现，由高磷(10mM β-甘油磷酸)体外诱发的血管中膜钙化模型中，随着钙化的进展，牛胸主动脉平滑肌细胞表达的全长COMP呈时间依赖性减少，相伴随的是降解产物的增加，提示血管中膜钙化过程中伴随有正常的基质蛋白COMP的降解；在CaCl₂(0.2M)诱导的腹主动脉钙化模型中，COMP全长蛋白表达也明显减少，相应的其降解片段增加。

进一步发现：如果在培养基中给与重组的全长COMP腺病毒，则可以有效地抑制平滑肌细胞钙化的发生，钙化结节特异性茜素红染色和⁴⁵Ca²⁺摄取均有一定程度的减弱；相反，如果用siRNA特异性敲低平滑肌细胞COMP水平，CaCl₂诱发的平滑肌细胞的钙化则明显加重。

在CaCl₂诱导的腹主动脉钙化模型，先用0.2M CaCl₂涂抹腹主动脉10分钟，之后将6×10⁸pfu量的COMP腺病毒与30％Pluronic gel(Sigma)4℃下混匀后，均匀涂抹在腹主动脉外膜上，对照组加入等量的GFP腺病毒与Pluronic gel同样处理，随即缝合伤口。7天后，取处理过的腹主动脉段，进行钙沉积测定和von Kossa染色，发现和对照组相比，过表达COMP病毒组的钙沉积显著性降低到约50％，vonKossa染色也显示钙结节明显减少。

附图说明

图1为β-甘油磷酸诱导的原代培养的牛胸主动脉平滑肌细胞钙化模型的图，其中A是茜素红染色图，红色显示钙沉积，B是⁴⁵Ca²⁺摄入结果。

图2为由高磷(10mM β-甘油磷酸)体外诱发的血管中膜钙化模型中COMP的表达，其中A是钙化过程中COMP蛋白表达的变化；B是三次实验的统计结果。

图3为小分子干扰RNA特异性敲低COMP后，CaCl₂诱导的大鼠平滑肌细胞钙化情况，其中A是COMP mRNA相对表达量；B是钙沉积结果；C是茜素红染色图。

图4为Ad-COMP感染过的原代牛平滑肌细胞的COMP蛋白表达量。

图5为Ad-COMP感染过的原代牛平滑肌细胞钙化被抑制，其中A是⁴⁵Ca²⁺摄入结果；B是茜素红染色图。

图6是大鼠腹主动脉钙化模型的建立，其中A是腹主动脉茜素红染色图，B是主动脉中钙沉积结果。

图7是Ad-COMP感染大鼠腹主动脉增加COMP表达量。

图8是Ad-COMP抑制大鼠腹主动脉钙化，其中A是主动脉von Kossa染色图；B是主动脉中钙沉积结果。

图1-图8中，Control是未钙化的对照组，β-GP组为β-甘油磷酸诱导的钙化实验组，CaCl₂组为CaCl₂诱导的钙化实验组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、软骨寡聚基质蛋白(COMP)与血管钙化相关性的发现

一、β-甘油磷酸诱导的原代培养的牛胸主动脉平滑肌细胞钙化模型的建立以及钙化模型中COMP的表达

1、β-甘油磷酸诱导的原代牛胸主动脉平滑肌细胞钙化模型的建立

取牛胸主动脉(取自北京清真屠宰厂)，采用组织贴块培养法，即去除内皮后将中层平滑肌层剪成1平方毫米组织小块贴在培养瓶内，然后给予20％FBS培养，大约六七天之后可见组织块周围有细胞爬出，待瓶内细胞长满后用胰蛋白酶消化传代保种，经SM-alpha actin免疫荧光鉴定，为平滑肌细胞。实验中，将得到的原代平滑肌细胞铺在六孔板中，每孔约15万个细胞，每孔加10mmol/L β-甘油磷酸刺激(购自Sigma公司)诱导牛主动脉平滑肌细胞钙化，每2天换一次液，细胞钙化的鉴定使用茜素红染色和⁴⁵Ca²⁺摄入实验。

其中，茜素红染色的方法是即细胞培养7天后，去除培养液，加入1％的茜素红染色半小时，之后洗去浮色，照相；⁴⁵Ca²⁺摄入的方法是即细胞培养5天后每孔加入1微居⁴⁵Ca²⁺，48小时后用液体闪烁计数仪测定细胞的⁴⁵Ca²⁺摄入情况。

以没有经过β-甘油磷酸刺激的细胞孔作为对照，实验设三次重复，每次重复设置平行对照孔。结果如图1所示，与对照组相比，用β-甘油磷酸刺激的细胞染色有明显的红色结节即为钙结节(图1A)；钙摄入(图1B)也明显高于对照组(Controlvs.β-GP，N＝3，P＜0.01，结果为平均值±标准误)。

以上结果说明，β-甘油磷酸诱导的原代培养的牛胸主动脉平滑肌细胞钙化模型已经成功建立。

2、钙化模型中COMP的表达

将步骤1得到的原代平滑肌细胞传代培养，得到第五代牛主动脉平滑肌细胞，给予其β-甘油磷酸刺激，按照步骤1提供的方法进行钙化诱导，每隔两天换液一次，分别在刺激后3天，5天，7天收取蛋白，进行western blot，用抗兔的COMP的抗体(多克隆抗体，购自AbCAM，Cambridge公司，UK，Cat.No.ab14515，以1∶1000稀释。)去检测细胞中COMP蛋白(分子量110KD)的表达。结果如图2A所示，以β-actin为内参，和Control组相比，β-GP组平滑肌细胞COMP全长110KD是显著减少的，其降解片段(大约55KD)则是显著增加的。图2B显示的COMP110KD条带统计图。

二、小干扰RNA特异性敲低COMP后，CaCl₂诱导的大鼠平滑肌细胞钙化情况

1、小干扰RNA特异性敲低COMP

设计合成了COMP特异的小分子干扰RNA。具体方法是：根据大鼠COMP序列(Pubmed Accession Number NM_012834，由Invitrogen公司Blcok-iTTM RNAi Designer软件设计COMP siRNA序列：COMP siRNA的正义链为：5′-AGAAACUUGAGCUGUGUUGAUAGCC-3′，COMP siRNA的反义链为：5′-GGCUAUCAAGACAGCUCAAGUUUCU-3′。合成上述序列的COMP siRNA。

将50nmol/L COMP siRNA(体积是2.5μl)用Oligofectamine(购自Invitrogen公司，CA)转染至铺在六孔板中的A7r5(大鼠平滑肌细胞系，购自ATCC公司(CRL-1444))，每孔6万个，48小时后提取细胞的总RNA，逆转录成cDNA，并以其为模板，以5′-GTGACTTCGATGCTGACAAGGT-3′和5′-GTCTTGATAGCCGAAGATGAAGC-3′为引物，实时定量PCR扩增COMP基因。以大鼠的β-actin基因作为内参，扩增β-actin基因的正义链为：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，反义链为：5′-TCGGGGCATCGGAAC CGCTCA-3′。同时以转染scramble siRNA(购自Invitrogen公司，Stealth^TM RNAi duplex Cat.No.12935)的A7r5作为对照。设定转染了scramble siRNA的A7r5的mRNA水平为1，转染COMP siRNA的A7r5与之相比。实验设三次重复，每种处理设平行孔。结果如图3A(Scramble siRNA vs.COMP siRNA，N＝3，P＜0.05)所示。其中，siRNA scramble为转染scramble siRNA的A7r5，siRNA COMP为转染了COMP siRNA的A7r5。结果表明，转染COMP siRNA的A7r5中COMP的mRNA水平显著被抑制(60％)。

2、CaCl₂诱导的大鼠平滑肌细胞钙化情况

将A7r5细胞铺在六孔板里，每孔6万个细胞，按照步骤二的步骤1提供方法将50nmol/L COMP siRNA转染A7r5，48小时后，往六孔板中加5mmol/L CaCl₂-给予细胞钙化刺激，12天后细胞进行茜素红染色和钙沉积测定，其中，茜素红染色和钙沉积测定与步骤一提供的方法相同。实验设三次重复，每次重复设置平行对照孔。结果如图3所示(Control vs.CaCl₂，N＝3，P＜0.05，图中的数据为平均值±标准差)，转染了COMP siRNA的A7r5和转染了scramble siRNA的A7r5相比，钙化结节明显增多(图3C)，钙沉积也明显加重(约30％)(图3B)。

实施例2、表达COMP的腺病毒的制备及其功能检测

一、重组COMP腺病毒(Ad-COMP)的获得及其鉴定

1、重组COMP腺病毒的获得

利用RT-PCR技术，从小鼠主动脉中扩增COMP的全长cDNA(GenBank号为NM_016685。提取小鼠主动脉中总RNA，逆转录成cDNA，以其为模板，用下述引物进行PCR扩增。

Sense：5’-ACGGAATTC CGCCACCATGGGCCCCACTGCCTGCGTTCTAGT-3’(序列表中序列1)；

Antisense：5’-GCATCT AGACACACTGGTCCCTAAACTCTCTGCAG-3’(序列表中序列2)。

扩增得到2.4kbp的片段，命名为comp，经测序验证，得到的片段具有GenBank号为NM_016685的自5’端第15位-2279位所示的核苷酸。该片段可以编码序列如GenBank号为EDL28815的第1位-755位所示的氨基酸。

腺病毒构建参照BD公司说明(BD，Biosciences Clontech，CA)将上述得到的comp重组连接到pShuttle-CMV(-)重组穿梭载体，再将其转移到pAdxis重组腺病毒骨架载体上，然后让其感染HEK293细胞系，得到细胞系内大量复制扩增的腺病毒，命名为Ad-COMP，之后收集感染的HEK293细胞进一步纯化，即氯化铯不连续超速离心分离，之后再进行连续密度梯度超速离心分离，最后脱盐处理，得到的病毒用2％甘油混匀保存。纯化获得的病毒需要进行滴度鉴定，即将HEK293以每孔1万的数量铺在96孔板内，然后将病毒原液稀释成不同倍数进行感染，十天以后观察记录CPE(细胞病变效应)孔数，计算得出Ad-COMP的滴度。

按照获得Ad-COMP腺病毒的方法，将comp换成绿色荧光蛋白(GFP)基因(GFP是GenBank号为GQ221701的自5’端第1位-661位所示的基因)，制备得到Ad-GFP腺病毒，作为对照。

2、重组COMP腺病毒(Ad-COMP)的鉴定

用5M和10M的Ad-COMP分别感染实施例1中步骤一的步骤1得到的原代牛平滑肌细胞，对照组用等量Ad-GFP腺病毒，48小时后，提取细胞总蛋白，用抗COMP特异性抗体做免疫印迹实验，以β-actin为内参，结果如图4所示，Ad-COMP感染过的原代牛平滑肌细胞的COMP蛋白(11OKD)水平明显增加。

二、重组COMP腺病毒抑制血管钙化

1、重组COMP腺病毒抑制β-甘油磷酸诱导的原代牛胸主动脉平滑肌细胞钙化

5M的Ad-COMP感染实施例1中步骤一的步骤1得到的原代牛平滑肌细胞，对照组是等量Ad-GFP，48小时后按照实施例1中步骤一的步骤1提供的方法给予细胞10mmol/L β-甘油磷酸刺激，7天后按照实施例1中步骤一的步骤1提供的方法进行细胞染色和⁴⁵Ca²⁺摄入实验。实验设三次重复，结果如图5显示，过表达Ad-COMP组与Ad-GFP组相比，钙结节明显更少(图5B)，钙45摄入也显著减少(图5A)。N＝3，P＜0.05。图中的数据为平均值±标准差。

2、重组COMP腺病毒抑制CaCl₂诱导的大鼠腹主动脉钙化

1)CaCl₂诱导的大鼠腹主动脉钙化模型的建立

取240-260克雄性Sprague-Dawley大鼠(湖南克莱斯景达实验动物有限公司)，腹腔注射水合氯醛(300mg/kg)麻醉。分离从肾动脉到髂动脉之间的腹主动脉，棉签涂抹0.2M CaCl₂溶液10分钟，然后关腹缝合伤口，对照组涂抹生理盐水处理相同时间。7天后处死大鼠取处理过的腹主动脉，按照实施例1步骤二的步骤2提供的方法进行茜素红染色和钙沉积测定。结果如图6所示，和对照组相比，涂抹0.2MCaCl₂的腹主动脉茜素红染色有明显的着色(图6A)，钙沉积也显著增加(图6B)。N＝6，P＜0.05。图中的数据为平均值±标准差。

以上结果表明，CaCl₂诱导的大鼠腹主动脉钙化模型已经建立。

2)重组COMP腺病毒抑制CaCl₂诱导的大鼠腹主动脉钙化

重复步骤1)建立钙化模型，涂抹0.2M CaCl₂溶液10分钟后，立即涂抹由6×10⁸pfu量的Ad-COMP与30％Pluronic胶(购自Sigma公司)4℃下混匀的病毒，7天后取处理段腹主动脉，进行钙沉积检测，并组织切片进行von Kossa染色。结果如图8显示，和Ad-GFP相比，Ad-COMP可以显著减少钙结节(图8A)，并可以显著抑制腹主动脉的钙含量，抑制率达50％(图8B)，N＝5，P＜0.05。图中的数据为平均值±标准差。其中，抑制率＝((Ad-GFP组的钙含量)-(过表达Ad-COMP的钙含量))/(Ad-GFP组的钙含量)。

3)机理分析

将6×10⁸pfu量的Ad-COMP与30％Pluronic gel(购自Sigma公司)4℃下混匀，分离完大鼠腹主动脉之后，室温下迅速均匀地涂抹于其上；对照组采用Ad-GFP。随即缝合伤口。7天后，取处理段腹主动脉，提取组织蛋白，按照实施例1步骤一的步骤2中的方法进行western blot法测定COMP蛋白水平。结果如图7显示，相比与涂抹Ad-GFP，涂抹Ad-COMP的血管COMP表达显著增加。将表达出的COMP蛋白测序，其氨基酸序列如GenBank号为EDL28815的第1位m-755位v所示。

序列表

<110>北京大学

<120>软骨寡聚基质蛋白在制备血管钙化治疗药物中的应用

<130>CGGNARL92551

<160>2

<210>1

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

acggaattcc gccaccatgg gccccactgc ctgcgttcta gt 42

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

gcatctagac acactggtcc ctaaactctc tgcag 35

Claims

1、软骨寡聚基质蛋白在制备预防或治疗血管钙化的药物中的应用。

2、表达软骨寡聚基质蛋白的重组腺病毒在制备预防或治疗血管钙化的药物中的应用。

3、如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述软骨寡聚基质蛋白的氨基酸序列如GenBank号为EDL28815的第1位-755位所示。

4、如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：所述血管钙化是血管中膜的钙化。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述血管中膜的钙化是胸主动脉平滑肌细胞钙化或腹主动脉钙化。

6、如权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于：所述重组腺病毒的构建步骤如下：

7、如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述软骨寡聚基质蛋白的编码基因的编码序列如GenBank号为NM_016685的自5’端第15位-2279位所示；所述受体细胞是真核生物的传代细胞；所述真核生物的传代细胞为HEK293细胞。

8、一种预防或治疗血管钙化的药物，其活性成分是如下1)或2)：

1)软骨寡聚基质蛋白；

2)表达软骨寡聚基质蛋白的重组腺病毒。

9、如权利要求8所述的药物，其特征在于：所述重组腺病毒的构建步骤如下：

3)将步骤2)得到的重组腺病毒载体感染受体细胞，得到重组腺病毒；

所述软骨寡聚基质蛋白的编码基因的编码序列如GenBank号为NM_016685的自5’端第15位-2279位所示；所述软骨寡聚基质蛋白的氨基酸序列如GenBank号为EDL28815的第1位-755位所示；所述受体细胞是真核生物的传代细胞；所述真核生物的传代细胞为HEK293细胞。

10、如权利要求8或9所述的药物，其特征在于：所述血管钙化是血管中膜的钙化；所述血管中膜的钙化是胸主动脉平滑肌细胞钙化或腹主动脉钙化。