CN114622011A

CN114622011A - Creg在预防或治疗血管钙化中的医药用途

Info

Publication number: CN114622011A
Application number: CN202210379627.7A
Authority: CN
Inventors: 韩雅玲; 闫承慧; 刘丹; 田孝祥; 王静
Original assignee: General Hospital of Shenyang Military Region
Current assignee: General Hospital of Shenyang Military Region
Priority date: 2022-04-12
Filing date: 2022-04-12
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2042-04-12
Also published as: CN114622011B

Abstract

本发明公开了E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A stimulated gene,CREG）蛋白的用途，属于分子生物医疗技术领域。主要涉及CREG蛋白用于预防或治疗血管钙化的医药用途。发明人通过大量实验发现，在采用注射VitD3的方法建立的小鼠血管钙化模型中，CREG表达明显下调。CREG杂合子小鼠加重VitD3引起的血管钙化；反之，CREG转基因小鼠改善VitD3引起的血管钙化。细胞学水平发现，CREG表达降低后可以加重磷酸盐引起的小鼠血管平滑肌细胞钙化；反之，过表达CREG抑制pi引起的小鼠VSMCs钙化。本研究为深入阐明血管钙化的调控机制提供新的实验依据和理论线索，并且可能为血管钙化等相关心血管疾病的防治提供新的干预靶点。

Description

CREG在预防或治疗血管钙化中的医药用途

技术领域

本发明涉及分子生物医疗技术领域，具体涉及E1A激活基因阻遏子（cellularrepressor of E1A stimulated gene, CREG）蛋白的用途，主要涉及CREG蛋白用于预防或治疗血管钙化的医药用途，具体涉及到CREG蛋白或其活性片段在制备用于预防或治疗血管钙化药物中的应用。

背景技术

血管钙化是指血管系统中以磷酸钙复合物形式存在的矿物质沉积。任何动脉壁钙化的存在都会使死亡率和心血管事件的风险增加3-4倍。据血管的病变部位分为内膜钙化和中膜钙化。作为心血管疾病独立的危险因素，血管钙化是血管疾病的共同病理基础。血管钙化是一个以羟基磷灰石沉积为特征的活跃过程，是细胞内外复杂的信号通路改变的结果。越来越多的证据表明，血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化并生成基质囊泡在血管钙化中起着不可或缺的作用。

E1A 激活基因阻遏子基因（cellular repressor of E1A stimulated genes，CREG）是一种小分子糖蛋白（220个氨基酸），在细胞内主要定位于核周内质网和溶酶体。研究表明，CREG参与调节细胞的生长和分化。本实验室前期系列研究证明，使用外源性CREG重组蛋白以剂量依赖的方式抑制血管紧张素II引起的血管重塑。此外，CREG在维持血管平滑肌细胞的成熟表型、抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖方面起重要作用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种CREG在血管钙化中的作用。通过本发明的研究，明确了CREG表达水平与血管钙化存在明显的负相关性，CREG过表达抑制血管钙化的发生和发展，说明CREG可能作为血管钙化治疗的潜在治疗策略。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供了一种CREG的表达水平的检测试剂在制备辅助诊断血管钙化的产品中的应用。

进一步地，所述的血管钙化诊断筛查的产品以CREG基因作为诊断标记物。

更进一步地，所述的血管钙化诊断筛查的产品是通过western或定量PCR技术来检测样本中CREG基因的表达水平，所述的CREG表达水平与血管钙化存在明显的负相关性。

本发明还提供一种特异性过表达CREG基因的表达载体在制备治疗血管钙化药物中的应用。

进一步地，所述表达载体包括CREG蛋白或其活性片段以及真核细胞表达载体。

优选地，所述真核细胞表达载体包括质粒表达载体或病毒表达载体。

进一步地，所述表达载体用于增强CREG基因表达，所述表达载体通过增强血管平滑肌细胞的CREG基因表达达到抑制血管钙化的发生和发展。

进一步地，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。

进一步地，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂量。

与现有技术相比本发明的有益效果。

发明人通过大量实验发现，在采用注射VitD3的方法建立的小鼠血管钙化模型中，CREG表达明显下调。CREG杂合子小鼠加重VitD3引起的血管钙化；反之，CREG转基因小鼠改善VitD3引起的血管钙化。细胞学水平发现，CREG表达降低后可以加重磷酸盐（pi）引起的小鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）钙化；反之，过表达CREG抑制pi引起的小鼠VSMCs钙化。以上结果表明，CREG在血管钙化过程中起重要调控作用。

附图说明

图1. CREG在VitD3诱导的小鼠血管钙化模型中表达下调。其中图A、B是对照组与实验组小鼠血管Von Kossa和茜红素染色；图C、D是血管的免疫组化染色；图E、F是Westernblot结果及其统计图；图G是Real-time PCR检测结果（n=3，**p<0.01 vs. Control组）。

图2. CREG表达缺失加重VitD3引起的血管钙化。其中图A、B是CREG^+/-与其同窝对照小鼠血管Von Kossa和茜红素染色（scale bar=100 μm）；图C、D是血管的免疫组化染色；图E、F是Western blot结果及其统计图（n=3，*p<0.05 vs. littermate control组，**p<0.01 vs. Control组；^#p<0.05，^##p<0.01 vs. littermate control+VitD3组；^&p<0.05 vs.CREG^+/-组；littermate control：同窝对照小鼠；CREG^+/-：CREG杂合子小鼠）。

图3. CREG过表达减轻VitD3引起的血管钙化。其中图A、B是CREG^tg与其同窝对照小鼠血管Von Kossa和茜红素染色（scale bar=100 μm）；图C、D是血管的免疫组化染色；图E、F是Western blot结果及其统计图（n=3，**p<0.01 vs. Control组，*p<0.05 vs.littermate control组；^#p<0.05，^##p<0.01 vs. littermate control+VitD3组；^&p<0.05vs. CREG^tg组；littermate control：同窝对照小鼠；CREG^tg：CREG转基因鼠）。

图4. CREG低表达加重pi诱导的VSMCs钙化。其中图A、B是VSMCs茜红素染色（scalebar=20 μm）；图C、D是Western blot结果及其统计图；图E是Real-time PCR检测结果（n=3，**p＜0.05，**p＜0.01 vs. Control组或siControl组；^#p<0.05，^##p＜0.01 vs.siControl +pi，^&p<0.05, vs. siCREG, siControl：control si-RNA；siCREG：CREG si-RNA）。

图5. CREG过表达抑制pi诱导的VSMCs钙化。其中图A、B是VSMCs茜红素染色（scalebar=20 μm）；图C、D是Western blot结果及其统计图；图E是Real-time PCR检测结果（n=3，*p＜0.05，**p＜0.01 vs. AdGFP或Control组；^#p<0.05，^##p＜0.01 vs.AdGFP +pi，^&p＜0.05vs. AdCREG，AdGFP：GFP腺病毒；AdCREG：CREG腺病毒）。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市面购买获得的常规产品。本发明的实验数据均为百分数，两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均采用GraphPad Prism8.0软件包处理，以P<0.05为有统计学差异。

实施例1：CREG在VitD3诱导的血管钙化模型中表达下调。

1. 实验动物及饲养。

实验动物种属、性别、周龄及来源：C57BL/6J小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6J小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司。小鼠于无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级动物房内饲养，室温为（22±2）℃，湿度为45%~70%，每12h光照循环，自由进食及饮水。

2. 小鼠血管钙化模型的建立。

C57BL/6J小鼠随机分为对照组及实验组，实验组小鼠采用连续5d皮下注射维生素D3（VitD3，15万单位/kg/day）的方法建立小鼠血管钙化模型，对照组小鼠皮下注射同等体积的生理盐水5d。VitD3购自北京索莱宝科技有限公司。

3. 血管茜红素染色。

收取实验组和对照组小鼠的主动脉，进行茜红素染色，具体操作步骤如下。

（1）固定：将一段清洗干净的小鼠主动脉放入装有多聚甲醛的15mL的离心管中，固定超过24h。

（2）脱水：将固定好的主动脉放入包埋盒中，再放入不同浓度的酒精中进行梯度脱水（70%酒精1h，80%酒精1h，95%酒精1h，100%酒精1h*3次）。

（3）包埋：将主动脉垂直放入包埋盒中，再加入适量的液体石蜡，将包埋盒放在冷却台上使石蜡逐渐冷却成块。

（4）切片：将包埋盒放入石蜡切片机，4μm厚度连续切取主动脉横截面的石蜡切片，将切好的石蜡切片小心地贴在载玻片上，放入烘烤箱中过夜。

（5）脱蜡：将切片依次放入二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、无水乙醇10 min、95%乙醇10 min、90%乙醇5 min、85%乙醇5 min，逐级脱蜡。

（6）染色：切片有组织的一面朝上，取1%茜素红染液滴加于组织面上，室温下染色10-15 min。用蒸馏水冲洗。

（7）McGee-Russell分化液迅速分化数秒。

（8）Mayer苏木素染色液浅染细胞核1-2 min。

（9）脱水：无水乙醇Ⅰ、Ⅱ 各10 min、二甲苯透明。

（10）封片：中性树胶滴在切片上，取一张盖玻片，盖在中性树胶上，小心摊开，防止产生气泡。

结果显示：与对照组比，实验组小鼠血管茜红素染色阳性面积明显增加，如图1A、B。

4. 血管Von Kossa染色。

收取实验组和对照组小鼠的主动脉，进行Von koaas染色，具体操作步骤如下。固定、脱水、包埋、切片、脱蜡同前。

（1）染色：切片入Von Kossa银溶液强光照射30-60 min。

（2）蒸馏水洗1 min。

（3）入海波溶液处理2 min。

（4）苏木素染色液浅染细胞核1-2 min。

（5）封片：中性树胶滴在切片上，取一张盖玻片，盖在中性树胶上，小心摊开，防止产生气泡。

结果显示：与对照组比，实验组小鼠血管Von koaas染色阳性面积明显增加，如图1A、B。

5. 血管免疫组织化学染色。

收取实验组和对照组小鼠的主动脉，进行免疫组织化学染色，具体操作步骤如下。固定、脱水、包埋、切片、脱蜡同前。

（1）抗原修复：切片浸泡入的抗原修复液中100℃煮40min后降至室温。

（2）将切片放在湿盒中，有组织一面的朝上，每张切片加入一滴或50μL过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10min后，无菌磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS）洗三次，每次10min。

（3）去除PBS，每张切片加一滴或或50μL山羊血清，室温孵育30min。

（4）除去血清，每张切片加50μL CREG（1:100 PBS稀释）4℃过夜。

（5）常温下复温30min，PBS清洗三次，每次10min。

（6）将50μL试剂C溶液滴加至石蜡切片上（使用PBS进行1:100稀释），室温孵育10min。用PBS冲洗3次，每次5 min。

（7）将50μL试剂D溶液滴加至石蜡切片上，室温孵育10min。用PBS冲洗3次，每次5min。

（8）去除PBS，每张切片加50μL DAB显色液。DAB显色液20倍稀释。

（9）苏木素溶液复染细胞核。

（10）将石蜡切片在1%盐酸中放置30 s，进行分化，流水冲洗。

（11）将石蜡切片在氨水中放置30 s，进行细胞核返蓝，流水冲洗。

（12）脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

（13）在正置显微镜下观察染色结果并拍照保存图片。

结果显示：与对照组比，VitD3组小鼠钙化指标OPN、RUNX2表达明显增多，而CREG表达明显下降，结果见图1C、D。

6. Western blot方法检测血管钙化模型中CREG表达情况。

为了明确CREG在血管钙化中的作用，采用皮下注射VitD3的方法建立小鼠血管钙化模型，利用western blot方法检测血管中CREG的表达情况。分别收取实验组与对照组的血管，加入适量的蛋白裂解液，于冰上裂解30min，每隔5min颠倒混匀一次。4℃，12000g，离心20min，收集上清为细胞总蛋白。采用BCA比色法试剂盒测定裂解液中的蛋白质浓度。充分混匀后，在100℃水浴条件下，煮沸5min，室温下12000g，离心30s。在每个样品孔中加入蛋白样品20μg，接通电源，开始电泳。按照如下电压和时间进行：100V电压，30min，120V电压，60min，待溴酚蓝电泳至玻璃板底部后关闭电源。以90V的电压将样品转印到PVDF膜上，时间为2h。将PVDF膜放入5%牛奶封闭液1h后加入一抗4℃孵育过夜。分别以1:1000抗CREG (美国Abcam公司)抗体、1:1000抗OPN (美国Abcam公司)抗体、1:1000抗RUNX2 (美国Cellsignalling公司)抗体、1:1000抗αSMA (美国Abcam公司)抗体、1：1000抗β-actin（美国Cellsignalling公司）抗体作为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠（或抗兔）抗体（美国Cell signalling公司）作为二抗，行Western blot检测，用ECL试剂盒(美国Amersham公司)发光显影。采用ImageJ 1.51软件进行条带的灰度值测量并进行统计学分析。

结果显示：在VitD3建立的小鼠血管钙化模型中，钙化指标OPN、RUNX2表达明显增多；分化指标αSMA表达减少，CREG蛋白表达减少，结果见图1E、F。

7. 荧光实时定量PCR（Real-time PCR）方法检测血管钙化模型中CREG表达情况。

（1）血管组织RNA的提取。

A.小鼠血管组织放入无RNase的EP管中，加入1mL Trizol，放入三个无RNase的研磨珠，在组织研磨匀浆器中进行研磨180s，50Hz。

B.放置于室温5min，加入1/5的三氯甲烷，之后将其上下颠倒混匀，静置15min。

C.12000rpm，4℃，离心15min。

D.吸取其上清，加入等体积的异丙醇后将其倒置混匀，室温下静置10 min。

E.12000rpm，4℃，离心15min，弃掉上清。

F.加1mL 75%乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。

G.12000rpm，4℃，离心15min，弃掉上清。

H.室温晾干，透明即可。

I.加入25μL无酶水溶解RNA。

（2）RNA逆转录为cDNA。

使用Takara逆转录试剂盒。

A.去除基因组DNA

。

B.逆转录反应

。

反应条件：37℃，15 min；85℃，5 s 。

（3）引物序列

。

（4）荧光定量 PCR

。

按照上表的体积，配制 20μL qPCR反应体系，每组样本分别设置3个复孔。反应条件：95℃ 5min，（95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 30s）×40个循环，72℃ 5s，95℃ 15s。采用 2^－△△Ct法，分析每组样本的表达。

结果显示，在皮下注射VitD3的方法建立小鼠血管钙化模型中，钙化指标OPN、RUNX2转录水平明显增高，CREG转录水平降低，结果见图1G。

以上结果均显示，CREG在小鼠血管钙化模型中表达下降，提示CREG可能参与血管钙化发生发展的过程。

实施例2 CREG表达缺失加重VitD3引起的小鼠血管钙化。

1. CREG^+/-小鼠及其相应的同窝对照组小鼠由江苏集萃药康生物科技有限公提供，饲养条件均同实施例1。

2. CREG^+/-小鼠及其相应的同窝对照组小鼠钙化模型的建立。

CREG^+/-小鼠及其相应的同窝对照组小鼠随机分为对照组及实验组，使用连续5d皮下注射VitD3的方法建立小鼠血管钙化模型，具体方法同实施例1。

3. 血管茜红素染色检测血管钙化严重程度。

使用连续5d皮下注射VitD3的方法建立小鼠血管钙化模型，具体方法同实施例1。分别收取注射后14d的小鼠血管，进行茜红素染色，具体步骤同实施例1。

结果显示：CREG表达缺失加重血管钙化，结果见图2A、B。

4. 血管Von Kossa染色检测血管钙化严重程度。

使用连续5d皮下注射VitD3的方法建立小鼠血管钙化模型，具体方法同实施例1。分别收取注射后14d的小鼠血管，进行Von Kossa染色，具体步骤同实施例1。

结果显示：CREG表达缺失加重血管钙化，结果见图2A、B。

5. 血管免疫组织化学染色。

使用连续5d皮下注射VitD3的方法建立小鼠血管钙化模型，具体方法同实施例1。分别收取注射后14d的小鼠血管，进行血管免疫组织化学染色，具体步骤同实施例1。

结果显示：与littermate control +VitD3组相比，CREG^+/-+VitD3组小鼠血管钙化指标RUNX2和OPN表达显著增加, 结果显示：CREG表达缺失加重血管钙化，结果见图2C、D。

6. Western blot方法检测CREG^+/-组小鼠及其同窝对照组血管钙化模型中钙化指标的表达，具体步骤同实施例1。

结果显示：与littermate control +VitD3组相比，CREG^+/-+VitD3组相比钙化指标OPN和RUNX2蛋白水平明显升高，分化指标αSMA下降得更加明显，结果见图2E、F。

实施例3 CREG过表达减轻VitD3诱导的血管钙化。

1. CREG转基因(CREG^tg)小鼠及其相应的同窝对照组小鼠由江苏集萃药康生物科技有限公司提供。饲养条件均同实施例1。

2. CREG^tg小鼠及其相应的同窝对照组小鼠钙化模型的建立。

CREG^tg小鼠及其相应的同窝对照组小鼠随机分为对照组及实验组，使用连续5d皮下注射VitD3的方法建立小鼠血管钙化模型，具体方法同实施例1。

3. 血管茜红素染色检测血管钙化严重程度。

结果显示：CREG^tg小鼠减轻VitD3诱导的血管钙化，结果见图3A、B。

4. 血管Von Kossa染色检测血管钙化严重程度。

使用连续5d皮下注射VitD3的方法建立小鼠血管钙化模型，具体方法同实施例1。分别收取注射后14d的小鼠血管进行Von Kossa染色，具体步骤同实施例1。

5. 血管免疫组织化学染色。

结果显示：与littermate control +VitD3组相比，CREG^tg+VitD3组小鼠血管中钙化指标RUNX2和OPN表达显著下降，结果见图3C、D。

6. Western blot方法检测CREG^tg组小鼠及其同窝对照组血管钙化模型中钙化指标的表达，具体步骤同实施例1。

结果显示：与littermate control + VitD3组相比，CREG^tg+ VitD3组钙化指标OPN和RUNX2蛋白水平表达有所下降，分化指标αSMA有所回调，结果见图3E、F。

实施例4 CREG低表达加重pi引起的VSMCs钙化。

1. 小鼠原代平滑肌细胞的分离与培养。

取5-6只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠（购自于中国江苏集萃药康生物科技有限公司），小心地将主动脉剪下来，保存在含有1×抗生素的冰的PBS中，小心地去除主动脉外膜。用眼科剪将中膜将组织条剪成约2mm长的小块。将主动脉中膜组织块重悬于3mL 0.15% II型胶原酶消化液中，并将其转移到六孔板。将六孔板置于37℃，5%CO₂培养箱中消化2-3h后终止消化。将细胞悬液接种于1个6孔板中，每孔2mL。在第3d时首次换液，去除未贴壁细胞或组织块。以后根据细胞生长情况每3～5 d换液1次。在100mm培养皿中用含20%胎牛血清的DMEM培养基（生长培养基）培养，待细胞生长密度达80%~90%融合时，进行细胞传代。

2. 小鼠原代平滑肌细胞钙化的诱导。

小鼠原代平滑肌细胞在120mm培养皿中用含20%胎牛血清的生长培养基养，待细胞密度达到80%~90%时，给予高磷刺激（Phosphate，pi，2.6mmol/L）24h，对照组给予同等体积的PBS。

3. CREG低表达小鼠原代平滑肌细胞模型的建立

为了制备低表达CREG原代平滑肌细胞，将细胞铺至六孔板中，等细胞长到70%-80%时进行siRNA转染。将每孔加入0.5mL Opti-MEM培养基，应用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂将siControl和siCREG转染至小鼠原代平滑肌细胞中（siCREG的靶序列为5’-CTACTTTGGTGGACCTAAA-3’）。37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养4-6h，然后将6孔板中换成含20%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基，继续培养24h可用于实验。

4. VSMCs茜红素染色检测细胞钙化的严重程度。

使用高磷刺激（Phosphate，pi，2.6mmol/L）24h的方法建立VSMCs钙化，24h后进行茜红素染色，具体步骤同实施例1。

结果显示：CREG敲低加重pi诱导的VSMCs钙化，结果见图4A、B。

5. Western blot检测CREG低表达对小鼠原代平滑肌细胞钙化标志物OPN和RUNX2及分化指标αSMA表达的影响，具体方法同实施例1。

结果显示，与siControl+pi组相比，siCREG+pi组OPN和RUNX2表达明显升高，分化指标αSMA明显降低，结果见图4C、D。

6. Real-time PCR检测CREG低表达对小鼠原代平滑肌细胞钙化标志物OPN和RUNX2表达的影响，具体方法同实施例1。

结果显示，与siControl+pi组比，siCREG+pi组的OPN和RUNX2表达明显升高，结果见图4E。

实施例5 CREG过表达减轻pi引起的VSMCs钙化。

1. CREG过表达小鼠原代平滑肌细胞模型的建立。

为了制备过表达CREG小鼠原代平滑肌细胞，将细胞铺至六孔板中，等细胞长到70%-80%时，使用CREG腺病毒（上海和元生物科技有限公司）感染VSMCs（AdCREG），同时，使用绿色荧光蛋白（AdGFP）腺病毒（上海和元生物科技有限公司）感染VSMCs作为对照组。

2. VSMCs茜红素染色检测细胞钙化的严重程度。

结果显示：CREG过表达减轻VSMCs钙化，结果见图5A、B。

3. Western blot检测CREG过表达对小鼠原代平滑肌细胞钙化标志物OPN和RUNX2及分化标志物αSMA表达的影响, 具体方法同实施例1。

结果显示，与AdControl+pi组比，AdCREG+pi组OPN和RUNX2表达明显降低，分化指标αSMA明显升高，结果见图5C、D。

4. Real-time PCR检测CREG过表达对VSMCs钙化标志物OPN和RUNX2及分化标志物αSMA表达的影响, 具体方法同实施例1。

结果显示，与AdControl+pi组组比，AdCREG+pi组OPN和RUNX2表达明显降低，结果见图5E。

综上所述，本发明从动物学和细胞学两方面入手，应用CREG转基因小鼠及CREG杂合子小鼠制备血管钙化模型，动物学水平验证CREG在血管钙化中的作用；其次，应用小鼠原代血管平滑肌细胞，给予高浓度磷酸盐pi（2.6mmol/L）刺激，细胞学水平明确CREG在血管钙化中的作用并初步探索其作用机制。本研究为深入阐明血管钙化的调控机制提供新的实验依据和理论线索，并且可能为血管钙化等相关心血管疾病的防治提供新的干预靶点。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军北部战区总医院

<120> CREG在预防或治疗血管钙化中的医药用途

<130> 2022-04-09

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttcgcggac atcatctcaa t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcagcgtag cctctggatt t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggtcgttg atggcaaca 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tttgcactgg gtcatgtgtt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggctgcatt gaaaagactg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acccgctgtc ttctagcgt 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttcaggccg aacatgctga g 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctactttggt ggacctaaa 19

Claims

1.CREG的表达水平的检测试剂在制备辅助诊断血管钙化的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述CREG的表达水平的检测试剂在制备辅助诊断血管钙化的产品中的应用，其特征在于，所述的血管钙化诊断筛查的产品以CREG基因作为诊断标记物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的血管钙化诊断筛查的产品是通过western或定量PCR技术来检测样本中CREG基因的表达水平，所述的CREG表达水平与血管钙化存在明显的负相关性。

4.特异性过表达CREG基因的表达载体在制备治疗血管钙化药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的特异性过表达CREG基因的表达载体在制备治疗血管钙化药物中的应用，其特征在于，所述表达载体包括CREG蛋白或其活性片段以及真核细胞表达载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述真核细胞表达载体包括质粒表达载体或病毒表达载体。

7.根据权利要求4所述的特异性过表达CREG基因的表达载体在制备治疗血管钙化药物中的应用，其特征在于，所述表达载体用于增强CREG基因表达，所述表达载体通过增强血管平滑肌细胞的CREG基因表达达到抑制血管钙化的发生和发展。

8.根据权利要求4所述的特异性过表达CREG基因的表达载体在制备治疗血管钙化药物中的应用，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。

9.根据权利要求4所述的特异性过表达CREG基因的表达载体在制备治疗血管钙化药物中的应用，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂量。