CN105457015A - 重组creg蛋白抑制高血压血管重塑的医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及E1A激活基因阻遏子(CREG)蛋白的用途，具体涉及CREG蛋白在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途。本发明还涉及表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途。本发明还涉及含有CREG蛋白、表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞、或者能够抑制CREG蛋白表达下调的制剂的组合物，以及含有检测CREG蛋白表达水平的试剂的试剂盒。

Description

重组CREG蛋白抑制高血压血管重塑的医药用途

技术领域

本发明涉及E1A激活基因阻遏子(CREG)蛋白的医药用途，具体涉及CREG蛋白用于制备对高血压和/或高血压性血管重塑具有明确抑制作用的药物的用途。本发明还涉及表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途。本发明还涉及含有CREG蛋白、表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞、或者能够抑制CREG蛋白表达下调的制剂的组合物，以及含有检测CREG蛋白表达水平的试剂的试剂盒。

背景技术

高血压病以动脉血压升高为特征，是危害人类健康的主要疾病之一，我国人群目前的患病率高达18.8％，知晓率为30.6％，治疗率为24.7％，但平均控制率仅为6.1％。高血压血管重塑是指长期高血压环境下动脉血管结构和功能的适应性改变，是高血压病的一种显著性病理特征，也是导致高血压许多机体并发症如动脉粥样硬化，脑卒中及心、肾功能衰竭的主要原因之一。近年来的研究发现，细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)合成增加是血管重塑过程中的关键环节，有充足的证据表明，血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)和其他血管壁细胞(如血管外膜成纤维细胞，adventitialfibroblasts，AFs等)均参与其中。但遗憾的是，迄今为止，血管重塑形成机制尚不明确，目前的研究成果还没有形成有效的药物和器械以防止血管重塑的发生。

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAS)是肾脏和心血管功能的主要调节系统，包括血管紧张素(angiotensin,Ang)Ⅰ、AngⅡ、AngⅢ、AngⅣ、Ang1-7、血管紧张素转换酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)以及ACE2等多种成分。AngII作为RAS中重要的因子，可通过内分泌、旁分泌和自分泌等方式发挥其多重性生物功能，如诱导炎症反应、影响细胞增殖及迁移、促进ECM合成等。ACE2是2000年通过克隆技术新发现的与人类ACE相关的羧肽酶，可以降解AngⅡ产生具有血管舒张活性和抗增生作用的Ang1-7，提供一个与AngⅡ抗衡的系统，ACE2高表达于血管内皮细胞，但在产生ECM的关键细胞VSMCs和心脏成纤维细胞也有表达。

E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes，CREG)是一个1998年发现的参与维持组织及细胞成熟分化稳态的重要调控因子(VealE,MolCellBiol,1998；18(9):5032-5041)。但目前尚没有CREG蛋白用于治疗高血压或抑制高血压血管重塑的报道。

发明内容

本发明通过大量实验证明，外源性AngⅡ诱导VSMCs中CREG基因表达下调，CREG基因表达下调加重AngⅡ诱导的血压升高和血管重塑，CREG基因过表达可通过上调ACE2表达对抗AngⅡ诱发的血压升高和血管重塑，外源性CREG蛋白可对抗AngⅡ诱导的血压升高和血管重塑，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及E1A激活基因阻遏子(CREG)蛋白在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途。

本发明第二方面涉及表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途；其中所述重组细胞含有表达CREG蛋白的重组载体，所述重组载体含有编码CREG蛋白的核苷酸序列。

根据本发明第二方面任一项的用途，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。

在本发明的实施方案中，在本发明的实施方案中，其中所述的重组腺病毒载体为人腺病毒5型Ad5-CREG，其于2008年1月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉,武汉大学)，保藏号为CCTCC－V200801。该保藏信息已在中国专利CN101475961A中公开。

本发明还涉及能够抑制CREG蛋白表达下调的制剂在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途。

在本发明中，所述能够抑制CREG蛋白表达下调的制剂例如包括能够和下调CREG蛋白表达水平的制剂结合以抑制该制剂功能的制剂。在本发明的实施方案中，所述能够抑制CREG蛋白表达下调的制剂例如为能够和AngⅡ结合以抑制AngⅡ功能的制剂。

本发明还涉及检测CREG蛋白表达水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断高血压和/或高血压性血管重塑。

本发明还涉及组合物，其含有CREG蛋白、表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞、或者能够抑制CREG蛋白表达下调的制剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑；其中所述重组细胞含有表达ACE2蛋白的重组载体，所述重组载体(例如重组腺病毒载体)含有编码ACE2蛋白的核苷酸序列。

本发明还涉及试剂盒，其含有检测CREG蛋白表达水平的试剂，所述试剂盒用于诊断高血压和/或高血压性血管重塑。

本发明还涉及血管紧张素Ⅱ用于下调组织/细胞(离体的或在体的)中CREG蛋白表达水平的用途。

本发明还涉及CREG蛋白用于上调组织/细胞(离体的或在体的)中血管紧张素转化酶2表达水平的用途。

在本发明中，所述CREG蛋白(即人E1A激活基因阻遏子蛋白，cellularrepressorofE1A-stimulatedgene)既包括具有完整序列的CREG蛋白，也包括具有CREG蛋白功能的只含有部分序列的CREG蛋白。

在本发明的实施方案中，所述CREG蛋白的GenBank号为NP_003842.1。在本发明的实施方案中，所述CREG基因的GenBank号为NM_003581.2。

在本发明的实施方案中，其中所述的重组腺病毒载体为人腺病毒5型Ad5－CREG，其于2008年1月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉,武汉大学)，保藏号为CCTCC－V200801。该保藏信息已在中国专利CN101475961A中公开。

在本发明中，所述高血压是指收缩压≥140mmHg，和/或舒张压≥90mmHg。

在本发明中，所述高血压性血管重塑是指长期高血压环境下动脉血管结构和功能的适应性改变，主要表现为血管平滑肌细胞增生、肥大，中膜增厚、胶原沉积、顺应性下降，是高血压病的一种显著性病理特征。

在本发明中，所述预防和/或治疗高血压性血管重塑是指抑制或减缓高血压性血管重塑的发生、抑制或减缓高血压性血管重塑的进展、和/或逆转高血压性血管重塑的病理改变。

在本发明的实施方案中，其中所述高血压和/或高血压性血管重塑是指血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的或者和AngⅡ相关的高血压和/或高血压性血管重塑。

在本发明中，所述载体例如为原核表达载体、真核表达载体、噬菌体载体或病毒载体。其中所述原核表达载体例如为PET载体、PGEX载体，所述真核表达载体例如为pcDNA3.1、pEGFP-C1、pPIC9K，所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体λgt、λgt-λB，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。

在本发明的实施方案中，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。

在本发明的实施方案中，所述重组腺病毒载体为Ad-CREG-GFP。

在本发明中，所述细胞可以为原核细胞或真核细胞。所述真核细胞例如为哺乳动物细胞。所述细胞可以通过向原核细胞或真核细胞中引入重组载体而得到。

在本发明中，所述原核细胞例如可以为大肠杆菌DH5α、JM109、Top10等，所述真核细胞例如可以为CHO细胞、293T细胞、血管平滑肌细胞等，所述哺乳动物例如可以为大鼠、小鼠、犬、小型猪、猴、人等。

在本发明中，可以利用本领域所知的任何种类的转染方法获得转染有特定核酸或载体的宿主细胞，例如，可通过电穿孔或显微注射将核酸引入细胞中；或者，可使用脂转染试剂如FuGENE6、X-tremeGENE和LipofectAmine；或者，可通过基于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒的适当病毒病毒载体将核酸引入细胞中。

在本发明中，可以通过本领域公知的方法检测CREG蛋白的表达水平，例如通过扩增CREG蛋白的mRNA并进行定量或者Westernblot来检测CREG蛋白的表达水平。

在本发明中，所述蛋白的表达水平是指mRNA的水平或者蛋白的水平。

在本发明中，所述上调/下调组织/细胞中蛋白的表达是指提高或降低组织/细胞中蛋白质水平或mRNA水平的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或者提高大于100％。其中所述的上调或下调是与未干预的组织/细胞例如转染对照载体组的组织/细胞进行比较。

附图说明

图1.AngⅡ诱导小鼠血压升高和血管重塑，同时下调血管壁中CREG表达.

(A)应用微渗透泵给予小鼠AngⅡ(1.5mg/(kg·d))刺激14d，导致小鼠血压明显升高，血管壁增厚明显。左图为给予小鼠AngⅡ刺激0d、3d、7d、10d、12d和14d后血压变化情况。右图为未给予AngⅡ处理和给予AngⅡ处理14d后小鼠主动脉血管HE染色。

(B)小动物超声检测小鼠升主动脉(距离主动脉根部1mm)和头臂干分叉(距离主动脉分叉0.5mm)处血管壁厚度，发现AngII诱导血管壁增厚明显，**p<0.01实验重复五遍。

(C)Masson染色发现AngⅡ导致主动脉中胶原含量增加，同时免疫荧光染色发现血管壁中CREG和ACE2表达较正常对照组明显减少。

数据采用均数±标准误(±SE)表示。

图2.AngⅡ呈时间/计量依赖效应下调小鼠原代VSMCs中CREG表达

(A)细胞免疫荧光染色观察小鼠原代VSMCs表达CD31、α-SMA、desmin、ACE2、Ang1-7和Mas1表达情况。

(B)不同浓度AngⅡ(0、10nM、100nM、1μM和10μM)刺激VSMCs24h后，Western-blot结果显示随着AngII浓度增大，I/III型胶原表达逐渐增多，而CREG和ACE2蛋白表达水平却逐渐减少。0浓度组与不同浓度AngⅡ处理组比较。

(C)1μMAngⅡ刺激VSMCs不同时间后(0、12h、24h、48h、72h)，Western-blot结果显示随着AngⅡ作用时间的延长，I/III型胶原表达逐渐增多，而CREG和ACE2蛋白表达水平却逐渐减少。0小时组与不同时间AngⅡ处理组比较。

图3.CREG基因表达下调加重AngⅡ诱导的血压升高和血管重塑

(A)免疫荧光染色和RT-PCR检测野生型(CREG^+/+)小鼠和CREG杂合子(CREG^+/-)小鼠主动脉中CREG表达情况

(B)CREG^+/+小鼠和CREG^+/-小鼠给予AngⅡ刺激0d、3d、7d和14d后血压变化情况。

(C)HE染色观察CREG^+/+小鼠和CREG^+/-小鼠给予AngⅡ刺激0d、3d、7d和14d后主动脉血管壁厚度变化情况。

(D)Masson染色观察CREG^+/+小鼠和CREG^+/-小鼠给予AngⅡ刺激0d、3d、7d和14d后主动脉血管壁中胶原含量变化情况。

图4.CREG基因过表达抑制VSMCs合成ECM蛋白

Westernblot检测CREG基因过表达对AngⅡ诱导的I/III型胶原表达的影响，**p<0.01实验重复五遍。

图5.CREG基因过表达上调VSMCs中ACE2mRNA和蛋白表达

(A)用腺病毒载体介导CREG基因在VSMCs中过表达，然后应用AngⅡ刺激VSMCs24h，RT-PCR检测VSMCs中CREG、ACE2和Mas1mRNA表达变化，**p<0.01实验重复五遍。

(B)用腺病毒载体介导CREG基因在VSMCs中过表达，然后应用AngⅡ刺激VSMCs24h，Western-blot检测VSMCs中CREG、ACE2和Mas1蛋白表达变化，**p<0.01实验重复五遍。

图6.CREG基因过表达通过上调ACE2/Ang1-7抑制细胞外基质蛋白合成

Westernblot检测在Ang1-7拮抗剂A779存在的情况下，CREG基因过表达对AngⅡ诱导的I/III型胶原表达的影响，**p<0.01实验重复五遍。

图7.重组CREG蛋白干预对抗AngⅡ诱导的小鼠血压升高和血管重塑

(A)给予小鼠不同浓度重组CREG蛋白(15μg/(kg·d)、30μg/(kg·d)、60μg/(kg·d)、300μg/(kg·d))或血管紧张素受体拮抗剂氯沙坦(6g溶于500ml水中，小鼠通过饮水摄取氯沙坦)处理，同时给予小鼠AngII(1.5mg/(kg·d))刺激0d、1d、2d、3d、7d、10d、12d和14d后血压变化情况。

(B)HE和Masson染色观察正常对照组、重组CREG蛋白处理组(300μg/(kg·d))和氯沙坦处理组小鼠给予AngⅡ刺激14d后主动脉血管壁厚度和胶原含量变化情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用SPSS17.0软件包处理。P<0.05为有统计学差异。

实施例1.AngⅡ诱导小鼠血压升高和血管重塑，同时下调血管壁中CREG表达

①小鼠高血压血管重塑模型的建立

在无菌条件下称取AngⅡ(以1.5mg/(kg·day)的剂量计算)，并溶于0.9％的生理盐水，注入ALZET微渗透泵中。将注有试剂的微渗透泵于37℃生理盐水孵育过夜。腹腔注射水合氯醛麻醉C57BL/6小鼠，无菌条件下，分别将含AngⅡ的ALZET微渗透泵埋入皮下，对照组皮下埋植仅灌注有生理盐水的ALZET微渗透泵，并用缝合线缝合切口。待小鼠清醒后，洁净条件下喂养3、7和14d。由此获得了小鼠高血压血管重构模型。

②小鼠血压监测

采用SoftronBP2100进行鼠尾无创血压测定，首先对加热箱进行加热，默认温度为38℃。将小鼠放入鼠笼内固定，固定好后将其整体放入加热箱内。将小鼠鼠尾穿过传感器，并尽可能将传感器置于鼠尾根部。保持环境安静，待小鼠稳定后开始测量。测量重复3次，每次间隔约1min，以均值作为收缩压(结果见图1)。

结果显示，AngII刺激3d后小鼠血压开始升高，7d时血压显著升高。

③HE染色观察血管壁形态

a.取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，5μm切片；

b.切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min；

c.苏木素染色5min，自来水冲洗；

d.盐酸乙醇分化30s；

e.自来水浸泡15min；

f.置伊红液2min；

g.常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)1min→95％乙醇(II)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(II)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(II)1min→中性树脂封固。

结果显示，AngII刺激14d后，血管中膜明显增厚(结果见图1)。

④小动物超声检测血管壁厚度

采用加拿大VisualSonics公司的Vevo2100超声生物显微镜成像系统，探头中心频率30MHz。2％异氟烷对小鼠进行麻醉后，剔除胸腹部毛发。将小鼠仰卧位固定于恒温检查台，温度保持37℃，同步记录小鼠心电、呼吸等生理参数，心率维持在450次/min左右，心率稳定1min后前胸涂抹耦合剂行超声生物显微镜检查。检查台向左侧倾斜约30°，探头与小鼠身体长轴平行并侧倾，置于小鼠胸骨右缘，探头与小鼠右胸壁呈45°角扫描，调整X、Y方向旋钮，获得升主动脉长轴、主动脉弓及其分支以及降主动脉长轴切面。以主动脉根部和头臂干作为解剖标志，收缩期测量小鼠主动脉根部上1mm，以及头臂干分叉上0.5mm处的管壁厚度。

结果显示，AngII刺激14d后，小鼠主动脉根部和头臂干管壁厚度明显增加(结果见图1)。

⑤Masson染色观察血管壁中胶原含量

a.石蜡切片脱蜡至水；

b.依次自来水和蒸馏水洗；

c.用Weigert铁苏木素液染核5-10min；

d.充分水洗，如过染可盐酸乙醇分化；

e.蒸馏水洗；

f.用Masson丽春红酸性复红液5-10min；

g.以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；

h.1％磷钼酸水溶液分化3-5min；

i.不经水洗，直接用苯胺蓝液染5min；

j.以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；

k.95％乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固。

结果显示，AngII刺激14d后，小鼠主动脉中胶原含量明显增加(结果见图1)。

⑥免疫荧光染色观察血管壁中CREG和ACE2表达变化

a.冰冻切片室温晾干15min；

b.用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10min，以去除OCT；

c.用含10％正常血清的PBS室温封闭切片1h，此步不洗涤，把封闭液吸干即可；

d.加入兔抗小鼠CREG或ACE2单抗(1:100)(分别购自英国Abcam公司、美国NovusBiological公司)，4℃孵育过夜；

e.PBS洗3次，每次10min；

f.加入荧光标记二抗(1:100)(驴抗兔Alex488标记，美国Invitrogen公司)，室温孵育2h；

g.PBS洗3次，每次15min；

h.封片后，荧光显微镜观察结果并拍照。

结果显示，AngⅡ刺激14d后，血管中膜CREG和ACE2表达明显减少(结果见图1)。

实施例2.AngⅡ呈时间/计量依赖效应下调小鼠原代VSMCs中CREG表达

①为了初步验证AngⅡ与CREG蛋白表达间的关系，我们首先培养小鼠原代VSMCs。12～14周龄C57BL/6小鼠断颈处死，75％乙醇浸泡5min，无菌条件下取胸主动脉，放入无菌预冷的PBS中，清洗后纵向剖开血管腔，刮去血管内膜和外膜，剩下薄层的血管中膜，转移入含有20％胎牛血清的DMEM培养基中，剪成1mm³小块，吸弃多余的培养基，将组织块均匀铺于培养皿上，置于37℃，5％CO₂培养箱干涸1h，待组织块贴壁后向培养皿中滴加少量含有20％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃，5％CO₂培养箱中，1次/2d更换培养液，待细胞生长达到70％～80％融合状态时，传代培养。取4～10代的细胞用于细胞学实验。我们已成功培养原代小鼠VSMCs。

②采用细胞免疫荧光染色的方法，进行小鼠原代VSMCs细胞类型的鉴定，

a.将细胞培养在盖玻片上；

b.用预温的1×PBS洗3次，每次10min；

c.4％的多聚甲醛室温固定20-30min；

d.1×PBS洗3次，每次10min；

e.1％TritonX-100透化10-15min；

f.1×PBS洗3次，每次10min；

g.5％山羊血清室温封闭30min；

h.分别加入1：100Anti-CD31抗体(内皮细胞标志物，购自英国Abcam公司)、1：100Anti-α-SMA和1：100Anti-desmin抗体(VSMCs标志物，购自美国Sigma公司)、1：100Anti-ACE2抗体(购自美国NovusBiological公司)、1：100Anti-Ang1-7抗体(购自美国PhoenixPharmaceuticals公司)和1：100Anti-Mas1抗体(购自美国NovusBiological公司)，放在湿盒里，4℃过夜；

i.1×PBS洗3次，每次10min；

j.加二抗，室温避光孵育2h；

k.1×PBS洗3次，每次10min；

l.95％甘油封片。

结果发现，内皮细胞标志物CD31为阴性，平滑肌细胞标志物desmin和α-SMA为阳性，说明分离培养的细胞为VSMCs，排除血管内皮细胞的污染。同时，VSMCs表达ACE2、Ang1-7和Ang1-7的受体Mas1(结果见图2)。

③分别采用不同浓度(10nM、100nM、1μM、10μM)和不同作用时间(12h、24h、48h、72h)的AngⅡ刺激VSMCs，提取各组VSMC中的蛋白进行CREG和细胞外基质蛋白(I/III型胶原)表达检测。提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，分别以1：1000Anti-CREG(购自英国Abcam公司)、1：1000Anti-I型胶原(购自美国NovusBiological公司)及1：1000Anti-III型胶原单克隆抗体(购自美国Abcam公司)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体(购自康为世纪公司)作为二抗行Western-blot检测，用ECL试剂盒(购自Amersham公司)发光显影。人VSMC裂解产物，用CREG抗体、I型胶原抗体及III型胶原抗体可分别检测到大小约为28kD、150kD及138kD的融合蛋白表达条带(结果见图2)。

结果显示不同浓度AngⅡ刺激VSMCs24h后，随着AngⅡ浓度增大，I/III型胶原蛋白表达逐渐增多，而CREG和ACE2蛋白表达水平却逐渐减少。1μmol/LAngII刺激VSMCs不同时间后，随着AngⅡ作用时间的延长，I/III型胶原蛋白表达逐渐增多，而CREG和ACE2蛋白表达水平却逐渐减少。上述研究结果显示：CREG基因表达与细胞外基质蛋白表达间呈负相关关系，而与ACE2蛋白表达间呈正相关关系，提示CREG基因表达可能具有抑制细胞外基质蛋白表达，并上调ACE2表达的作用。

实施例3.CREG基因表达下调加重AngⅡ诱导的血压升高和血管重塑

分别以C57BL/6来源的野生型(CREG^+/+)小鼠和CREG杂合子(CREG^+/-)小鼠(CREG^+/-小鼠购自南方基因组模式动物中心(上海))为研究对象，观察CREG基因表达下调对AngII诱导的血压升高和血管重塑的影响。

①分别采用免疫荧光染色和RT-PCR的方法检测CREG^+/-小鼠主动脉中CREG表达情况。免疫荧光染色结果发现，CREG^+/-小鼠血管壁中CREG表达量较CREG^+/+小鼠降低。取CREG^+/-和CREG^+/+小鼠胸主动脉组织，加Trizol裂解液1ml，提取血管组织总RNA。根据GenBank中小鼠CREGmRNA序列(NM_011804.2)，设计并合成的小鼠CREG基因RT-PCR引物如下：

小鼠CREG上游引物：5’-GAGGAAGAGAGGTGCAGGTG-3’(SEQIDNO：1)，下游引物：5’-CATTGCTGTCCTCGACTGAA-3’(SEQIDNO：2)；内参GAPDH上游引物：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’(SEQIDNO：3)，下游引物：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(SEQIDNO：4)。

将提取的RNA合成cDNA后(TakaRa公司的cDNA第一链合成试剂盒。扩增条件是：37℃，15min；85℃，5s)，通过下列反应体系和反应条件扩增出小鼠CREG编码序列共250个碱基。

具体条件：

95℃，3min

94℃，30s；59℃，30s；72℃，1min，30个循环

72℃，10min

扩增产物经2％的琼脂糖凝胶分离检测，用EB染色显影。CREG^+/-和CREG^+/+小鼠胸主动脉组织裂解产物，可检测到大小约为250bp的cDNA表达条带，CREG^+/-小鼠主动脉中CREG表达量较CREG^+/+小鼠明显减少(结果见图3)。

②分别将含AngII的ALZET微渗透泵埋入CREG^+/+和CREG^+/-小鼠皮下，制作小鼠高血压血管重构模型，方法同实施例1。观察给予AngⅡ刺激后0d、3d、7d、10d、12d和14d血压变化，方法同实施例1。结果发现，CREG^+/-小鼠基础血压较CREG^+/+小鼠略有升高，给予AngⅡ刺激后，CREG^+/-小鼠较CREG^+/+小鼠血压升高更为明显(结果见图3)，提示CREG^+/-小鼠对AngⅡ的升压刺激更为敏感，可能由于CREG^+/-小鼠发生更为严重的血管重塑所导致。

③HE染色观察CREG^+/+小鼠和CREG^+/-小鼠给予AngⅡ刺激0d、3d、7d和14d后血管壁厚度变化情况，方法同实施例1。结果发现，AngⅡ刺激3d、7d和14d后，CREG^+/-小鼠主动脉中膜厚度增加程度较CREG^+/+小鼠显著(结果见图3)，提示CREG基因表达下调加重AngⅡ诱导的血管重塑。

④Masson染色观察CREG^+/+小鼠和CREG^+/-小鼠给予AngII刺激0d、3d、7d和14d后血管壁中胶原含量变化情况，方法同实施例1。结果发现，AngⅡ刺激3d、7d和14d后，CREG^+/-小鼠血管壁中胶原含量增加程度较CREG^+/+小鼠显著(结果见图3)，提示CREG基因表达下调加重AngⅡ诱导的血管重塑。

实施例4.CREG基因过表达抑制VSMCs合成ECM蛋白

①CREG基因过表达VSMCs的建立

为了研究CREG基因过表达对VSMCs中ACE2mRNA和蛋白表达的影响，我们首先建立CREG基因过表达的细胞模型。携带人CREG基因的重组腺病毒(Ad5-CREG)的制备参见中国专利200810000053.8(公开号CN101475961A)，其于2008年1月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉,武汉大学)，保藏号为CCTCC－V200801。该保藏信息已在中国专利CN101475961A中公开。只表达GFP蛋白的腺病毒(Ad-GFP)作为对照。将VSMCs接种于培养瓶中，次日，以感染倍数(MOI)为300的浓度分别感染Ad-CREG-GFP和Ad-GFP，培养48h后收集细胞，进行CREG基因表达的检测。

②检测VSMCs中CREGmRNA表达情况

收集Ad-CREG-GFP和Ad-GFP转染的细胞，提取mRNA进行逆转录后，RT-PCR检测CREG基因的表达情况，方法同实施例3。结果显示，Ad-CREG-GFP组细胞中hCREGmRNA表达水平显著升高，提示CREG基因过表达的VSMCs细胞模型建立成功。

④检测VSMCs中CREG蛋白表达情况

收集Ad-CREG-GFP和Ad-GFP转染的细胞，提取总蛋白，Western-blot检测CREG基因的表达情况，方法同实施例2。结果显示，Ad-CREG-GFP组细胞中hCRE蛋白表达水平显著升高，提示CREG基因过表达的VSMCs细胞模型建立成功。

⑤检测CREG基因过表达对VSMCs合成ECM蛋白的影响

分别提取各组VSMC中的蛋白进行CREG、I型胶原及III型胶原的表达检测。提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，分别以1：1000Anti-CREG(购自英国Abcam公司)、1：1000Anti-I型胶原(购自美国NovusBiological公司)及1：1000Anti-I型胶原单克隆抗体(购自美国Abcam公司)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体(购自康为世纪公司)作为二抗行Western-blot检测，用ECL试剂盒(购自Amersham公司)发光显影。人VSMC裂解产物，用CREG抗体、I型胶原抗体及I型胶原抗体可分别检测到大小约为28kD、150kD及138kD的融合蛋白表达条带。

结果显示，CREG基因过表达可以抑制AngⅡ诱导的VSMCs合成I/III型胶原(结果见图4)。

实施例5.CREG基因过表达上调VSMCs中ACE2mRNA和蛋白表达

检测CREG基因过表达对VSMCs中ACE2表达的影响

CREG基因过表达VSMCs的建立同实施例4。分别提取各组VSMC中的蛋白及总RNA进行CREG、ACE2及Mas1的表达检测。提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，分别以1：1000Anti-CREG(购自英国Abcam公司)、1：1000Anti-ACE2(购自美国NovusBiological公司)及1：1000Anti-Mas1单克隆抗体(购自美国NovusBiological公司)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体(购自康为世纪公司)作为二抗行Western-blot检测，用ECL试剂盒(购自Amersham公司)发光显影。人VSMC裂解产物，用CREG抗体、ACE2抗体及Mas1抗体可分别检测到大小约为28kD、88kD及43kD的融合蛋白表达条带。提取细胞总RNA，CREGRT-PCR引物及扩增反应条件如实施例3。扩增产物经2％的琼脂糖凝胶分离检测，用EB染色显影。人VSMC的裂解产物，可检测到大小约为350bp的hCREGcDNA表达条带。

小鼠ACE2上游引物：5’-TGGGCAAACTCTATGCTGA-3’(SEQIDNO：5)，下游引物：5’-TTCATTGGCTCCGTTTCTTA-3’(SEQIDNO：6)；小鼠Mas1上游引物：5’-AGGGTGACTGACTGAGTTTGG-3’(SEQIDNO：7)，下游引物：5’-GAAGGTAAGAGGACAGGAGC-3’(SEQIDNO：8)。

将提取的RNA合成cDNA后(TakaRa公司的cDNA第一链合成试剂盒。扩增条件是：37℃，15min；85℃，5s)，通过下列反应体系和反应条件扩增出小鼠ACE2和Mas1编码序列分别为213和174个碱基。

具体条件(ACE2)：

94℃，4min

94℃，30s；57℃，30s；72℃，30s，30个循环

72℃，7min

具体条件(Mas1)：

94℃，4min

94℃，30s；65℃，30s；72℃，30s，30个循环

72℃，7min

结果显示，CREG基因过表达可以上调ACE2mRNA和蛋白表达水平，但不影响Mas1mRNA和蛋白表达水平(结果见图5)，提示CREG基因过表达可能通过上调ACE2对抗AngⅡ诱导的血压升高和血管重塑。

实施例6.CREG基因过表达通过上调ACE2/Ang1-7抑制细胞外基质蛋白合成

预先应用Ang1-7拮抗剂A779(10μmol/L，购自美国Biochem公司)孵育CREG基因过表达的VSMC细胞(构建方法同实施例4)2h，然后应用1μmol/LAngⅡ刺激24h，收集细胞，提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，分别以1：1000Anti-CREG(购自英国Abcam公司)、1：1000Anti-ACE2(购自美国NovusBiological公司)、1：1000Anti-I型胶原单克隆抗体(购自美国NovusBiological公司)及1：1000Anti-III型胶原单克隆抗体(购自美国Abcam公司)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体(购自康为世纪公司)作为二抗行Western-blot检测，用ECL试剂盒(购自Amersham公司)发光显影。人VSMC裂解产物，用CREG抗体、ACE2抗体、I型胶原及III型胶原抗体可分别检测到大小约为28kD、88kD、150kD及138kD的融合蛋白表达条带。

结果显示，Ang1-7拮抗剂A779存在的情况下，CREG基因过表达抑制AngⅡ诱导VSMCs合成I/III型胶原的作用消失(结果见图6)，提示CREG基因过表达通过上调ACE2/Ang1-7抑制细胞外基质蛋白合成。

实施例7.重组CREG蛋白干预对抗AngⅡ诱导的小鼠血压升高和血管重塑

监测AngⅡ刺激组(1.5mg/(kg·d))、重组CREG蛋白(15μg/(kg·d))+AngⅡ(1.5mg/(kg·d))刺激组、重组CREG蛋白(30μg/(kg·d))+AngⅡ(1.5mg/(kg·d))刺激组、重组CREG蛋白(60μg/(kg·d))+AngⅡ(1.5mg/(kg·d))刺激组、重组CREG蛋白(300μg/(kg·d))+AngⅡ(1.5mg/(kg·d))刺激组和氯沙坦(0.6g/L)+AngⅡ(1.5mg/(kg·d))刺激组的小鼠血压。AngII和重组CREG蛋白分别采用不同的微渗透泵皮下埋植给药，氯沙坦通过小鼠饮水的方式给药，具体方式参见实施例1。HE染色观察不同处理组小鼠主动脉血管壁厚度，Masson染色观察不同处理组小鼠主动脉血管壁中胶原含量，具体方法如实施例1所示。给药方式为通过皮下埋植微渗透泵给药。重组人CREG蛋白的获得参见中国专利200810007540.7(公开号CN101519663A)。

结果发现，不同浓度(30μg/(kg·d)、60μg/(kg·d)、300μg/(kg·d))重组CREG蛋白具有对抗AngⅡ诱导血压升高的作用，并且呈剂量依赖性，氯沙坦能够完全阻断AngⅡ的升压效应。HE染色发现重组CREG蛋白和氯沙坦均能抑制AngⅡ诱导的血管壁增厚。Masson染色发现重组CREG蛋白和氯沙坦均能抑制AngⅡ诱导的血管壁中胶原沉积(结果见图7)。

上述研究结果提示，重组CREG蛋白有望成为治疗高血压和/或高血压性血管重塑的有效药物。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.CREG蛋白在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途。

2.表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途；其中所述重组细胞含有表达CREG蛋白的重组载体，所述重组载体含有编码CREG蛋白的核苷酸序列。

3.权利要求2的用途，其中所述的重组载体为重组腺病毒载体。

4.能够抑制CREG蛋白表达下调的制剂在制备用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑的药物中的用途。

5.检测CREG蛋白表达水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断高血压和/或高血压性血管重塑。

6.组合物，其含有CREG蛋白、表达CREG蛋白的重组载体或重组细胞、或者能够抑制CREG蛋白表达下调的制剂，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗高血压和/或高血压性血管重塑；其中所述重组细胞含有表达ACE2蛋白的重组载体，所述重组载体(例如重组腺病毒载体)含有编码ACE2蛋白的核苷酸序列。

7.试剂盒，其含有检测CREG蛋白表达水平的试剂，所述试剂盒用于诊断高血压和/或高血压性血管重塑。

8.权利要求1-5任一项的用途、权利要求6的组合物或者权利要求7的试剂盒，其中所述高血压和/或高血压性血管重塑是指血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的或者和AngⅡ相关的高血压和/或高血压性血管重塑。

9.血管紧张素Ⅱ用于调控组织/细胞(离体的或在体的)中CREG蛋白表达水平的用途。

10.CREG蛋白用于调控组织/细胞(离体的或在体的)中血管紧张素转化酶2表达水平的用途。