CN111875702B - 抗creg单克隆抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫学领域,涉及抗CREG单克隆抗体及应用,具体涉及用于检测人血清CREG蛋白的单克隆抗体及ELISA试剂盒的制备方法。抗CREG单克隆抗体SIM156‑10及SIM156‑35,其具有重链可变区和轻链可变区:(I)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:1‑6所示,和/或(II)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:7‑12所示。所述的抗CREG单克隆抗体SIM156‑10和SIM156‑35在制备用于检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒中的应用。所述试剂盒提及的编码单克隆抗体的氨基酸序列可以通过基因工程技术克隆至表达载体中,并转染至哺乳动物细胞进行大规模表达,从而实现工业化量产以及质量控制,以满足未来的临床需求。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域,涉及抗CREG单克隆抗体及应用,具体涉及用于检测人血清CREG蛋白的单克隆抗体及ELISA试剂盒的制备方法。
背景技术
E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1Astimulated gene,CREG)最早在1998年被首次报道。近30年来以本发明人所在实验室为主的系列研究表明,CREG是维持心血管稳态及代谢稳态的关键基因。在血管疾病中,CREG可以通过调控血管平滑肌细胞的表型转化参与血管损伤后再狭窄的发生,还可以通过抑制巨噬细胞炎症反应参与血管动脉粥样硬化的发生发展。在心脏疾病中,CREG可以通过多种机制参与急性心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心室重构等多个心脏病理生理过程。在代谢性疾病中,白色脂肪组织或肝细胞中CREG的表达减低导致小鼠发生明显的肥胖、胰岛素抵抗及非酒精性脂肪肝。由此可见,CREG在心血管系统及代谢器官的表达变化与心血管疾病及代谢疾病的发生发展密切相关。
人CREG是含有220氨基酸的小分子糖蛋白,其N端含有一小段信号肽,负责引导CREG向细胞膜转运,然后分泌到细胞外。因此,在体外培养的细胞上清及血液中可以检测到CREG蛋白的表达。根据已有的研究证据推测,如果能检测人血清中CREG蛋白的表达水平,将对心血管及代谢性疾病的诊断、进展及预后判断都可能具有重要意义。发明人所在实验室曾筛选市售抗体包被CREG ELISA检测试剂盒,但灵敏性过低(检测下限390ng/ml)。目前也有市售人CREG ELISA检测试剂盒,检测范围在0.45ng/ml-100ng/ml。由于CREG表达降低和表达升高都具有重要意义,发明人在既往的结果发现人血清中的CREG可高达1200ng/ml,因此市售试剂盒存在检测范围过窄的缺陷。而且市售试剂盒提供的抗体大多为免疫动物分离的多抗,无法进行产,也无法对产品的均一性进行有效的控制,因此难以满足未来的临床需求。因此,研究和开发检测人血清CREG蛋白的单克隆抗体及ELISA试剂盒的制备方法是亟待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题,本发明提供了抗CREG单克隆抗体及应用,并提供了用于检测血清CREG蛋白的单克隆抗体及ELISA试剂盒。该方法首选分选CREG特异的单个B细胞方法,得到CREG单克隆抗体;进一步应用BIAcore方法,获得结合CREG蛋白不同表位的两个抗体。最后采用两种抗体配对方法,制备成功CREGELISA检测试剂盒。所述试剂盒提及的编码单克隆抗体的氨基酸序列可以通过基因工程技术克隆至表达载体中,并转染至哺乳动物细胞进行大规模表达,从而实现工业化量产以及质量控制,以满足未来的临床需求。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案。
抗CREG单克隆抗体SIM156-10及SIM156-35,其具有重链可变区和轻链可变区:
(I)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:1-6所示;或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸,与(I)所示的氨基酸序列至少有80%同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列;和/或
(II)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:7-12所示;或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸,与(I)所示的氨基酸序列至少有80%同源性的、且功能相同或相似的氨基酸序列。
所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10及SIM156-35还包括恒定区,所述的恒定区为人IgG1和小鼠IgG1。
一种表达载体,包含编码所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10及SIM156-35。
一种宿主细胞,所述的宿主细胞经由所述的表达载体转化或转染而来,为原核细胞或真核细胞。
一种结合物,包括与化学标记物标记供价连接的抗CREG单克隆抗体SIM156-10及SIM156-35。
一种偶联物,其由所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10及SIM156-35和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
一种药物组合物,包括所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10及SIM156-35和/或所述的结合物和/或所述的偶联物。
所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35和/或所述的结合物和/或所述的偶联物和/或所述的药物组合物在制备用于检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒中的应用。
所述检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒的制备方法是基于所述的抗人CREG单克隆抗体体SIM156-10及SIM156-35不同配对方式产生的ELISA检测方法,分别以所述的CREG单克隆抗体SIM156-10(人Fc)为包被抗体,SIM156-35(小鼠Fc)为检测抗体;或者以SIM156-35(小鼠Fc)为包被抗体,以SIM156-10(人Fc)为检测抗体,制备ELISA检测试剂盒,进行血清样本的检测。
所述用于检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒的检测范围:以抗体SIM156-35作为包被抗体、抗体SIM156-10作为检测抗体的方式,可准确定量的范围为16.2~2000ng/ml;以抗体SIM156-10作为包被抗体、抗体SIM156-35作为检测抗体,可准确定量的范围为0.438~54ng/ml。
所述的血清样本为人、小鼠和食蟹猴的血清样本。
与现有技术比,本发明的有益效果如下。
本发明提供了抗CREG单克隆抗体及应用,并提供了用于检测血清CREG蛋白的单克隆抗体及ELISA试剂盒的制备方法。该方法首选分选CREG特异的单个B细胞方法,得到CREG单克隆抗体;进一步应用BIAcore方法,获得结合CREG蛋白不同表位的两个抗体。最后采用两种抗体配对方法,制备成功CREGELISA检测试剂盒。所述用于检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒的检测范围:以抗体SIM156-35作为包被抗体、抗体SIM156-10作为检测抗体的方式,可准确定量的范围为16.2~2000ng/ml;以抗体SIM156-10作为包被抗体、抗体SIM156-35作为检测抗体,可准确定量的范围为0.438~54ng/ml。所述试剂盒提及的编码单克隆抗体的氨基酸序列可以通过基因工程技术克隆至表达载体中,并转染至哺乳动物细胞进行大规模表达,从而实现工业化量产以及质量控制,以满足未来的临床需求。
附图说明
图1是人CREG-mFc/His蛋白免疫SJL小鼠的血清滴度检测结果。
图2是BIAcore检测CREG单克隆抗体结合CREG的epitope binning。
图3是人CREGELISA检测试剂盒制备方式(1)(抗体SIM156-10包被/抗体SIM156-35检测)示意图。
图4是方式(1)11个浓度点标准曲线拟合图。
图5是方式(1)5个浓度点标准曲线拟合图。
图6是人CREGELISA检测试剂盒制备方式(2)(抗体SIM156-35包被/抗体SIM156-10检测)示意图。
图7是方式(2)10个浓度点标准曲线拟合图。
图8是方式(2)6个浓度点标准曲线拟合图。
图9是10%血清背景标准曲线拟合图。
具体实施方式
实施例1人CREG-His、人CREG-mFc重组蛋白的制备。
合成带有HindIII及EcoRI酶切位点的编码人CREG-His、人CREG-mFc(mFc为小鼠IgG1的Fc片段)融合蛋白的基因,通过酶切连接的方法构建至pcDNA3.1-GS载体中,将质粒提取出并转染CHO细胞,通过MSX加压筛选,得到稳定表达重组蛋白的Bulk Pool,制备方法参考专利CN 109053903 A,一种重组人CREG-Fc融合蛋白的制备及其应用。之后进行表达并利用Ni Sepharose HP及ProteinG层析柱对上清进行一步纯化,得到人CREG-His、CREG-mFc重组蛋白。
实施例2 CREG蛋白动物免疫。
采用6-8周龄的雌性SJL小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)或者Balb/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)进行免疫。第一次免疫注射时,用弗氏完全佐剂(complete freund's adjuvant,CFA,购自SIGMA,货号:F5881)混合人CREG-His重组蛋白,后三次免疫注射的佐剂则采用弗氏不完全佐剂(incomplete freund's adjuvant,IFA,购自SIGMA,货号:F5506)和CpGODN1826(合成自上海生工生物),分别与CREG-mFc、CREG-His混合,交替免疫。特别地,第一次和第二次免疫注射后足垫和背部,第三次和第四次免疫注射尾部皮下及背部,以获得高滴度的抗血清。在末次免疫(第四次免疫)后的第7天,安乐死小鼠并无菌取出脾脏,无菌分离提取小鼠脾脏淋巴细胞,分装冻存于液氮中。如图1所示,经CREG-mFc/His蛋白免疫后获得了高滴度高特异性的抗CREG血清。将免疫后小鼠的脾脏或淋巴结中的CREG特异的单个B细胞用BD AriaIII流式分选仪分选至96孔板中,将单细胞的mRNA反转录成cDNA。然后以cDNA为模板进行巢式PCR,分别进行抗体重链和轻链扩增。扩增得到抗体重链可变区和轻链可变区,分别通过同源重组方法克隆到重链表达载体和轻链表达载体。重链表达载体的恒定区来源于人IgG1和小鼠IgG1。
实施例3 BIAcore检测CREG抗体与人CREG-His蛋白结合的特异性。
利用BIAcore检测实施例2所获得的10株CREG抗体与人CREG-His蛋白结合的特异性。该实验采用Protein A芯片,通过手工操作(manual run)测定出芯片捕获稀释后的抗体所需要的时间,以使得能饱和结合抗原Rmax为50RU。将人CREG-His梯度稀释至32、16、8、4、2nM。采用多循环动力学测得抗体与抗原的亲和力。在每一个循环中,注射抗体后再注入梯度浓度的CREG蛋白,使抗原与抗体发生结合与解离过程。每个循环后用Glycine-HCl pH1.5进行ProteinA芯片的再生。应用BIAcore T200分析软件拟合抗体抗原的亲和力KD。BIAcore检测结果见表1,实施例2获得的10个抗CREG抗体与人CREG-His蛋白之间存在特异性结合,且亲和力水平较高。
表1.CREG抗体与人CREG-His特异性结合的BIAcore结果。
实施例4 BIAcore检测抗CREG抗体在人CREG-His蛋白上的Epitope binning。
利用BIAcore检测CREG抗体在人CREG-His蛋白上的epitope binning。采用氨基偶联固定人CREG-His,先注射结合base Ab,再进一步分别注射结合其他Abs。此外交替baseAb和其他抗体的注射顺序。通过对比分析base Ab和其他抗体在两种情况下与人CREG-His的结合信号是否存在差别,判断抗体之间在人CREG蛋白上的binding epitope的关系。具体在每个循环中,所有抗体均采用300nM的浓度,注射180s,使用650mM HCl溶液进行再生。
由epitope binning结果可知,抗体SIM156-35结合CREG的表位与抗体SIM156-10及SIM156-64结合CREG的表位不同,如图2和表2所示。
表2.BIAcore检测CREG抗体在人CREG-His蛋白上的Epitope binning。
注:Y:有表位竞争;N:无表位竞争。
结合表1亲和力测定结果,选取亲和力最高的SIM156-10(人Fc)和SIM156-35(小鼠Fc)作为抗体对进行ELISA检测试剂盒的开发。其序列的CDRs用IMGT软件分析,对应的序列信息见表3及4。其中表3为候选抗体分子的VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)序列,表4为侯选抗体分子的IMGT分析结果。
表3.CREG抗体分子的VH和VL序列。
注:VH:重链可变区,VL:轻链可变区。
表4.抗体分子的IMGT分析结果。
VH:重链可变区,VL:轻链可变区。
实施例5 CREG ELISA检测试剂盒制备。
在实施例4中筛选到SIM156-10(人Fc)和SIM156-35(小鼠Fc)1对抗体,该抗体对有如下2种配对方式。(1)抗体SIM156-10作为包被抗体,抗体SIM156-35作为检测抗体;(2):抗体SIM156-35作为包被抗体,抗体SIM156-10作为检测抗体。
1.两种抗体配对方式(非血清基质背景)ELSA检测试剂盒的制备。
(1)抗体SIM156-10作为包被抗体,抗体SIM156-35作为检测抗体。
实验原理示意图如图3所示。实验步骤如下:酶标板中预先包被100μl/孔的1μg/ml抗体SIM156-10,封闭液37℃封闭1h。人CREG-His用稀释液(0.5%BSA-PBS-0.05%Tween20)稀释至2μg/ml,后续3.33倍梯度,共11个浓度点;封闭后的酶标板洗板后,按50μl/孔加入稀释后的人CREG-His,50μl/孔2μg/ml的抗体SIM156-35,400rpm室温共孵育2h。洗板后加入羊抗鼠(goat anti mouse)IgG Fc-HRP工作液(1:10000稀释),100μl/孔,400rpm室温孵育1h;再次洗板,加入HRP的底物TMB进行显色,加入终止液终止反应后用酶标仪读取吸光值。图4为11个浓度点的标准曲线拟合图,图5为可准确定量的标准曲线拟合图。表5数据表明,抗体SIM156-10作为包被抗体、抗体SIM156-35作为检测抗体,可准确定量的范围为0.438~54ng/ml。
表5.标准曲线拟合数据(抗体SIM156-10包被/抗体SIM156-35检测)。
(2)抗体SIM156-35作为包被抗体,抗体SIM156-10作为检测抗体。
实验原理示意图如图6所示。实验步骤如下:酶标板中预先包被100μl/孔的1μg/ml抗体SIM156-35,封闭液37℃封闭1h。人CREG-His用稀释液(0.5%BSA-PBS-0.05%Tween20)稀释至2μg/ml,后续3.33倍梯度,共10个浓度点;封闭后的酶标板洗板后,按50μl/孔加入稀释后的人CREG-His,50μl/孔2μg/ml的抗体SIM156-10,400rpm室温共孵育2h。洗板后加入鼠抗人(mouse anti human)IgG Fc-HRP工作液(1:10000稀释),100μl/孔,400rpm室温孵育1h;再次洗板,加入HRP的底物TMB进行显色,加入终止液终止反应后用酶标仪读取吸光值。图7为10个浓度点的标准曲线拟合图,图8为可准确定量的标准曲线拟合图。表6数据表明,抗体SIM156-35作为包被抗体、抗体SIM156-10作为检测抗体的方式,可准确定量的范围为16.2~2000ng/ml。
由表5和表6可知,抗体SIM156-10作为包被抗体、抗体SIM156-35作为检测抗体的配对方式,检测的灵敏度较高,检测的下限可达到0.438ng/ml。抗体SIM156-35作为包被抗体、抗体SIM156-10作为检测抗体的配对方式,检测的范围更宽,检测的上限可达到2000ng/ml。
表6.标准曲线拟合数据(抗体SIM156-35包被/抗体SIM156-10检测)。
2.健康个体血清CREG本底值。
由于健康个体血清中天然存在一定量的CREG,因此需对血清基质本身的CREG本底值进行测定,之后选取本底值较低的个体血清用于配制血清背景的标准曲线。用非血清基质背景的标准曲线,测定10个健康个体的血清CREG本底值,测定结果见表7,10个个体血清稀释10倍后,除M17本底值低于定量下限0.438ng/ml外,其余均落在标曲可定量范围内。后续选用M17作为血清基质,用于配制标准曲线,血清含量为10%。
表7. 10健康个体血清CREG本底值。
3.血清基质背景条件下,标准曲线定量范围的确定。
根据欧洲药品评价局(EMEA)指导原则要求,标准曲线的基质背景与待测样品需一致。此ELISA试剂盒后续将用于检测血清样本中人CREG-His的浓度,因此需建立血清基质背景的标准曲线,并确定其可准确定量的线性范围。基质:含10%M17血清的稀释液。采用实施例5中的方式(1)。具体实验步骤同实施例5方式(1)。标准曲线拟合如图8所示,其可准确定量的线性范围为0.438~54ng/ml,见表8和表9。
表8.10%血清背景标准曲线拟合数据。
表9. 10%血清基质背景标准曲线重复数据。
实验ID | 包被抗体 | 检测抗体 | 线性范围 | R<sup>2</sup> | AR%范围 |
1 | SIM156-10 | SIM156-35 | 0.219~54.02ng/ml | 1 | ≤±10% |
2 | SIM156-10 | SIM156-35 | 0.438~54.02ng/ml | 1 | ≤±15% |
4.试剂盒的种属特异性。
用非血清背景的标准曲线,分别检测健康大鼠、小鼠和食蟹猴血清中的CREG本底值。如表10所示,10倍稀释后的大鼠血清CREG值低于标曲定量下限,而小鼠及食蟹猴血清CREG本底值均较高,且高于健康人的本底值。提示该试剂盒抗体可能与小鼠及食蟹猴种属的CREG有交叉反应,其应用范围可能扩展至小鼠及食蟹猴的动物实验中。
表10.大鼠、小鼠及食蟹猴血清CREG本底值。
实验ID | 大鼠血清 | 小鼠血清 | 食蟹猴血清 |
浓度(ng/ml) | 1.3 | 7.6 | 18.6 |
序列表
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<400> 11
KVS
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
FQGSH VPFT
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
EVQLQ ESGPG LVAPS QSLSI TCTVS GFSLF TYGVH WVRQP PGKGL EWLGV
IWIGG ITNYN SALMS RLSIS KDNSK SQVFL KMNSL QTDDT AIYYC ARDMG
RRYFD VWGAG TTVTV SS
<210> 14
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
EVQLQ ESGPE LKKPG ETVKI SCKAS GYTFT TYGMS WVKQA PGKGL KWMGW
INTYS GVPMY ADDFK GRFAF SLETA ASTAY LQINN LKNED TATYF CARWD
YYGTA GGFYA MDFWG QGTTV TVSS
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
DILMT QSPAS LSASV GETVT ITCRA SGNIY NYLAW YQQKQ GKSPQ FLVYN
GKTLA DGVPS RFSGS GSGTQ YSLKI NSLQP EDFGN YYCQH FWNTP PTFGG
GTKLE IK
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
DILMT QTPLS LPVSL GDQAS ISCRS SQSIV HSNGI TYLEW YLQKP GQSPK
LLIYK VSKRF SGVPD RFSGS GSGTD FTLKI SRVEA EDLGL YYCFQ GSHVP
FTFGS GTKLE IK
Claims (10)
1.抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35的组合物,其特征在于,其中包括重链可变区和轻链可变区:
(I)所述SIM156-10的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示;
(II)所述SIM156-35的重链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,重链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,重链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示,轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示,轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.如权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35的组合物,其特征在于,所述的单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35还包括恒定区,所述的恒定区为人IgG1和小鼠IgG1。
3.一种表达载体,其特征在于,包含编码权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35的组合物。
4.一种宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞经由权利要求3所述的表达载体转化或转染而来,为原核细胞或真核细胞。
5.一种结合物,其特征在于,包括与化学标记物标记供价连接的权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35的组合物。
6.一种偶联物,其特征在于,其由权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35的组合物和/或权利要求5所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
7.一种药物组合物,其特征在于包括权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35的组合物和/或权利要求5所述的结合物和/或权利要求6所述的偶联物。
8.如权利要求1所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35的组合物和/或权利要求5所述的结合物和/或权利要求6所述的偶联物和/或权利要求7所述的药物组合物在制备用于检测血清样本CREG蛋白 ELISA检测试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒的制备方法是基于所述的抗CREG单克隆抗体SIM156-10和SIM156-35的不同配对方式产生的ELISA检测方法,分别以所述的CREG单克隆抗体SIM156-10为包被抗体,SIM156-35为检测抗体;或者以SIM156-35为包被抗体,以SIM156-10为检测抗体,制备ELISA检测试剂盒,进行血清样本的检测。
10.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述用于检测血清样本CREG蛋白ELISA检测试剂盒的检测范围:以抗体SIM156-35作为包被抗体、抗体SIM156-10作为检测抗体的方式,可准确定量的范围为16.2~2000ng/ml;以抗体SIM156-10作为包被抗体、抗体SIM156-35作为检测抗体,可准确定量的范围为0.438~54ng/ml;所述的血清样本为人、小鼠和食蟹猴的血清样本。
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