CN105793279A - 预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的分子靶标 - Google Patents

预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的分子靶标 Download PDF

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M·努瓦泽
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Abstract

本发明涉及用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的治疗性化合物，包含：–抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或–增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂。

Description

预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的分子靶标
技术领域
本发明涉及至少一种用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的分子靶标。进一步的，本发明涉及用于预防或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的新治疗剂和涉及所述用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的分子靶标的新基因疗法。此外，本发明涉及使用所述治疗剂或所述基因治疗来预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的方法。
背景技术
纤维化是在器官或组织中形成过量纤维组织或疤痕组织。纤维化是组织对慢性损伤或长期炎症的常见病理生理反应。这种纤维化有多种潜在来源。它可以由疾病(遗传或非遗传)、治疗的副作用(例如放射或化疗)、有毒环境(例如吸烟)或受伤引起。它可以影响不同器官，例如皮肤或肺。
纤维化通常引起被影响器官的组织衰竭。纤维组织像疤痕组织，僵硬、厚并且刚性。有时，它还能够肿胀。例如，在肺中，由于纤维化肺的异常扩张，纤维化导致呼吸急促(尤其是在锻炼期间)和干咳。
纤维化的一些实例是肺纤维化(肺)、囊性纤维化(肺和消化系统)、克罗恩病(肠)、硬皮病/系统性硬化症(肺或皮肤)、关节纤维化(膝、肩、其他关节)、具有增生性疤痕或疤痕疙瘩的皮肤纤维化。
当该现象涉及的组织是皮肤时，主要影响的是伤口愈合过程。
自然的伤口愈合分为三个连续阶段；每个阶段的特征是特异性的细胞活性：炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段。
第一个阶段称为炎症阶段，在受伤后几分钟开始。血管破裂诱导形成主要由纤维蛋白和纤维连接蛋白组成的血块。血块部分填充病变，并允许炎症细胞在病变区内迁移。炎症细胞被募集以清创伤口。血小板释放因子(例如细胞因子和/或生长因子)，所述因子诱导募集涉及伤口愈合的细胞(炎症细胞例如中性白细胞和巨噬细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞)。
第二个阶段称为增殖阶段，对应于肉芽组织的发育。成纤维细胞迁移至伤口区、增殖并通过分泌细胞外基质(ECM)蛋白形成新的临时细胞外基质。然后，血管内皮细胞迁移以促进病变的血管新生或血管生成。在肉芽组织内，成纤维细胞被激活并分化成由于表达α-平滑肌肌动蛋白(与平滑肌细胞中的那些相似)而具有收缩特性的肌成纤维细胞。肌成纤维细胞在伤口愈合中具有重要作用，因为它们提供伤口收缩。最后，角化细胞从伤口边缘迁移、增殖并分化以重建表皮。
伤口愈合过程的最后一个阶段在伤口闭合后发生。它对应于肉芽组织的重塑。肉芽组织重组，III型胶原蛋白被I型胶原蛋白替代，因为正常真皮主要由I型胶原蛋白组成。在该阶段期间，过量的肌成纤维细胞通过细胞凋亡清除。伤口愈合的最后一个阶段较长。受伤后一年，疤痕重塑，变得没那么红且更薄。
然而，该过程不仅复杂而且脆弱，容易中断或失败，导致形成慢性或非愈合性伤口或形成异常疤痕。可能导致这个的因素包括疾病(例如糖尿病、静脉或动脉疾病)、年龄、感染或组织定位。
成纤维细胞在伤口愈合中的作用
伤口愈合的过程涉及成纤维细胞，这涉及几个分化步骤：从静态成纤维细胞到动态成纤维细胞，再转化成肌成纤维细胞，最后进入细胞凋亡。
在正常的伤口愈合中，成纤维细胞被激活，然后分化成由于其表达α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)而具有收缩特性的肌成纤维细胞。肌成纤维细胞通过将伤口边缘移动更靠近而引起过量细胞外基质沉积和伤口闭合。在增生性疤痕、疤痕疙瘩或纤维状伤口愈合中，肌成纤维细胞活性持续，并导致组织变性，这在例如烧伤后形成的增生性疤痕中尤其明显。本发明的目的是在整个基因组范围内定位在这个过程中将被激活或失活的不同基因，从而提供导致异常疤痕或纤维化的异常愈合的分子特征。
结缔组织代表一大类物理结构和不同功能：肌腱、软骨、骨、真皮、角膜等。由于器官和组织具有特定功能(例如，皮肤的功能是保护、感觉和热调节)，组成这些组织和器官的结缔组织也具有由特定细胞类型提供的精确功能。例如，在乳头状或网状真皮中发现胶原蛋白I、III和V、XIV、弹性纤维、基底膜聚糖或SPARC。与此相反，发现III型、IX型、X型胶原蛋白与肌腱中的聚集蛋白聚糖和硫酸皮肤素有关。
成纤维细胞是其中细胞被细胞外基质(与其中它们连接在一起的上皮不同)包围的结缔(或间充质)组织的主要细胞。这些成纤维细胞在损伤器官的伤口愈合中具有活性，因为它们增殖、分化成肌成纤维细胞、分泌胶原蛋白和其他特定ECM蛋白和组成器官结缔组织的纤维，导致组织的愈合和重组。
肌成纤维细胞定义为在纤维化期间发生的过量ECM蛋白沉积的主要来源。固有肌成纤维细胞来自组织特异性的成纤维细胞群，其在响应损伤中增殖并被激活，如在很多器官例如皮肤、肺或肾中情况一样。
纤维化、增生性疤痕和疤痕疙瘩
纤维化是组织对慢性损伤的常见病理生理反应。纤维化影响不同器官，例如皮肤和肺。纤维化的特征是成纤维细胞分化成肌成纤维细胞和过量的结缔组织的积聚。纤维化诱导器官丧失功能和潜在的器官衰竭。
增生性疤痕、疤痕疙瘩或纤维疤痕由异常伤口愈合引起。这些疤痕的特征是过量ECM蛋白，尤其是胶原蛋白的沉积。在这些异常伤口中，由于肌成纤维细胞过量，肉芽组织高度增殖(〈〈CellularandmolecularpathologyofHTS:basisfortreatment.>>ArmourA,ScottPG,TredgetEE.WoundRepairRegen.2007Sep-Oct；15Suppl1:S6-17.Review.Erratumin:WoundRepairRegen.2008Jul-Aug；16(4):582)。
在正常的伤口愈合中，成纤维细胞被激活，然后分化成由于表达α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)而具有收缩特性的肌成纤维细胞。肌成纤维细胞通过将伤口边缘移动更靠近而引起过量细胞外基质沉积和伤口闭合。在增生性疤痕、疤痕疙瘩或纤维状伤口愈合中，肌成纤维细胞活性持续，并导致组织变性，这在例如烧伤后形成的增生性疤痕中尤其明显。
增生性疤痕和疤痕疙瘩的特征是过量胶原蛋白的沉积，造成凸起的疤痕(疤痕疙瘩比增生性疤痕更强烈)。它们最常在青春痘、机体穿孔、割伤和烧伤的位置形成。
有些增生性疤痕是非功能性疤痕，因为它们限制其发展的皮肤的功能。它们使疤痕区和邻近区的移动性丧失，这可以完全限制移动(例如，肘和手臂的移动)。它们大多是特定解剖区烧伤的结果。
因此，如果有风险发展成异常疤痕或不能正确愈合，伤口的治疗尤其适于早期的伤口。因此，通过增强或调控有助于伤口愈合的因子，可能能够矫正该过程，从而降低纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的发生率。如果组织(例如器官的组织)容易发生纤维化，在早期治疗该组织也是令人有兴趣的。
本发明可以通过以下改善患者的生活质量：确保新伤口不会恶化成纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩，和可以以主动促进愈合同时预防形成纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的方式治疗已有伤口。
发明简述
本发明涉及用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的治疗性化合物，包括：
–抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或
–增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂。
本发明还涉及包含如上定义的治疗性化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明还涉及制备如上所述的药物组合物的方法，包括将所述治疗性化合物与药学上或兽医上可接受的载体或介质结合或联合。
在一个方面，本发明涉及用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的方法，其中所述方法包括向所述纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织施用包含以下的治疗性化合物：
–抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或
–增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂。
在另一个方面，本发明涉及用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
(a)至少一种如上定义的治疗性化合物或组合物，和
(b)至少一种用于向所述伤口施用的敷料。
本发明还涉及用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的联合治疗剂，包括：
a)抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂，和
b)至少一种进一步的治疗剂。
还在另一个方面，本发明涉及以下试剂在用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的用途：抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂，其中所述试剂调控成纤维细胞和肌成纤维细胞的分化和/或活性。
发明详述
因此，本发明的一个方面提供用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的治疗性化合物，包含：
(a)抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或
(b)增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂。
在本发明一个优选的实施方案中，所述治疗性化合物还包含用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的：抑制至少一个选自E2F1、EGR2、GLI1、JUN、MYC、SMAD3、SMAD4、SOX9、SRF,优选EGR2、SOX9的基因的活性的试剂，和/或增强至少一个选自ETS1、PPARG的基因的活性的试剂。
实际上，发明人已经发现纤维化过程涉及这些基因，且它们的下调或上调有助于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩。
因此，本发明涉及新型基因治疗方法和/或新型蛋白治疗方法。
如在本文所用，表述“抑制基因活性的试剂”或“抑制剂”是指能够下调所述基因的试剂。它包括在基因表达水平起作用的试剂以及在蛋白水平起作用的试剂，无论是通过降低给定细胞中存在的蛋白的量还是通过抑制蛋白活性。
如在本文所用，表述“增强基因活性的试剂”或“增强剂”是指能够上调所述基因的试剂。它包括在基因表达水平起作用的试剂以及在蛋白水平起作用的试剂，无论是通过增加给定细胞中存在的蛋白的量还是通过增加蛋白活性。它还包括在信号通路中，在所述基因或蛋白上游或下游起作用的试剂。
在一个实施方案中，新治疗剂包括基因表达的抑制剂或增强剂，所述抑制剂或增强剂可以是裸露的或是质粒和病毒载体或药物形式的反义DNA或RNA、siRNA、shRNA、cDNA、TALENS或核酶。
在一个优选的实施方案中，所述治疗性化合物是siRNA，其选自具有如SEQIDNO：11至SEQIDNO：74所示的序列的siRNA及其混合物。
这些siRNA抑制靶基因的表达。
在一个实施方案中，增强基因活性的试剂是cDNA。
通常，CREB5基因的表达可以通过施用CREB5cDNA增强。
这对列出的所有其他基因同样比照适用。
可以用本领域技术人员已知的任何合适形式向待治疗的纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩施用或递送cDNA。它可以作为裸露DNA递送、使用质粒载体、病毒载体或任何其他合适的手段。
在另一个实施方案中，新治疗剂包含由基因功能编码的蛋白质的抑制剂或增强剂，所述抑制剂或增强剂可以是可逆或不可逆结合以抑制或增强蛋白功能的结合剂，例如抗体或已知的或合成的蛋白激动剂或拮抗剂；或在蛋白信号机制上游或下游起作用以抑制或增强蛋白信号，从而在伤口组织中消除或增强蛋白表达的效果的试剂。
所述试剂(抑制剂或增强剂)可以是本领域已知的作用于给定分子靶标的任何试剂。
通常，PPARG增强剂可选自噻唑烷二酮，例如罗格列酮和吡格列酮(CurrDrug TargetsCardiovascHaematolDisord.2005Oct；5(5):377-86.RoleofPPAR-gammaagonistthiazolidinedionesintreatmentofpre-diabeticanddiabeticindividuals:acardiovascularperspective.DumasiaR,EagleKA,Kline-RogersE,MayN,ChoL,MukherjeeD)。
通常，PPARG的抑制剂可以是G3335(CAS36099-95-3)(Chembiochem.2006Jan；7(1):74-82.ThedipeptideH-Trp-Glu-OHshowshighlyantagonisticactivityagainstPPARgamma:bioassaywithmolecularmodelingsimulation.YeF,ZhangZS,LuoHB,ShenJH,ChenKX,ShenX,JiangHL.)。
本发明的治疗剂用于治疗或预防纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩。这些纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩优选哺乳动物纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩，更优选人纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩。
用于本发明的抗体最理想是单克隆抗体或人源化抗体。
在本发明的以上方面和实施方案中，配制治疗剂用于局部应用，但也可以配制用于口服、皮肤、经皮、透皮、静脉或任何已知的应用。
或者，在本发明的以上方面，配制治疗剂应用于敷料或浸渍敷料。
本发明的治疗剂可与另一种活性剂一起施用。这种活性剂可以是抗生素或抗菌剂、防腐剂、抗病毒剂、抗真菌剂、止痛剂、抗炎剂、伤口愈合剂、角质分离剂、麻醉剂。这种活性物质是熟练的医生众所周知的。
在本发明的另一个方面，提供用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的药物组合物，包含本发明的治疗剂和药学上可接受的载体。
只要对于被处理的纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织考虑是合适或推荐的，在药物组合物中也可存在其他活性物质。
载体，如果存在超过一种，则每一种载体必须在与制剂中的其他成分相容方面是可接受的，且对接受者无害。
制剂包括适于局部、口服、直肠、经鼻或任何已知施用的那些，且可通过药学领域公知的任何方法制备。
可以通过将本发明的治疗剂与载体结合来制备组合物。通常，通过以下来制备制剂：将活性剂与液体载体均匀紧密结合，或将活性剂与液体载体或细分固体载体或两者精确结合，然后如有需要，将产品成型。本发明扩展至用于制备药物组合物的方法，包括将本发明的治疗剂与药学上可接受的载体或介质联合或结合。
对于皮肤的局部应用，可以将常规用途的化合物制成霜剂、软膏、凝胶、啫喱、溶液或悬浮液等。可以用于组合物的霜剂或软膏制剂是本领域公知的常规制剂。
本发明中用于口服施用的制剂可以呈现为：胶囊、各自包含预定量活性剂的小袋或片剂；粉末或颗粒；水性液体或非水性液体中的活性剂溶液或悬浮液、或水包油液体乳液或油包水液体乳液；或药丸等。
对于口服施用的组合物(例如片剂或胶囊)，术语“可接受的载体”包括介质如常见赋形剂，例如粘合剂，如糖浆、阿拉伯树胶、凝胶、山梨醇、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填充剂和载体，例如玉米淀粉、凝胶、半乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠和褐藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他硬脂酸盐、硬脂酸甘油硬脂酸、硅油、滑石蜡、油和硅胶。也可以使用调味剂例如薄荷、冬青油、樱桃香料等。期望添加着色剂以使剂量形式容易分辨。也可以用本领域公知的方法包衣片剂。
另外或可替代的，本发明的进一步方面还包括或可替代的包括用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的新方法，所述方法包括向所述纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩施用：
抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或
增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂。
本发明还涉及用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的新方法，所述方法进一步包括向所述纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩施用：
-抑制至少一个选自E2F1、EGR2、GLI1、JUN、MYC、SMAD3、SMAD4、SOX9、SRF,优选EGR2、SOX9的基因的活性的试剂，和/或
-增强至少一个选自ETS1、PPARG的基因的活性的试剂。
还根据本发明的进一步方面，提供用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
(a)至少一种如上所述的治疗剂；和
(b)至少一种用于向所述纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩施用的医疗设备。
术语“医疗设备”包括器械、装置、移植体、体外试剂或用于诊断、预防或治疗疾病或其他病症的且在机体内或机体上不通过化学反应实现其目的(使其成为药物)的相似或相关的物品。当医药产品(也称为药品)通过病理、代谢或免疫手段实现其主要目的，医疗设备通过其他手段，例如物理、机械或热能手段起作用。
还根据本发明的进一步方面，提供用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的联合治疗剂，包含基因表达的抑制剂或增强剂和蛋白活性的抑制剂或增强剂。
根据本发明的进一步方面，提供用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的治疗剂，包含蛋白或其同源物的抑制剂或增强剂。
根据本发明的进一步方面，提供蛋白或其同源物的抑制剂或增强剂在制备用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的药物中的用途。根据本发明的进一步方面，提供蛋白或其同源物的抑制剂或增强剂用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的用途。如本文所用，术语“同源物”是指与FOXS1、CREB5、E2F1、EGR2、ETS1、GLI1、HIC1、IRF7、JUN、MAF、MEOX2、MYC、POU2F2、PPARG、SIX2、SMAD3、SMAD4、SOX9、SRF、STAT4、TCF4的氨基酸序列具有至少50％同源性且保留FOXS1、CREB5、E2F1、EGR2、ETS1、GLI1、HIC1、IRF7、JUN、MAF、MEOX2、MYC、POU2F2、PPARG、SIX2、SMAD3、SMAD4、SOX9、SRF、STAT4、TCF4序列的生物活性的氨基酸序列。优选同源物与FOXS1、CREB5、E2F1、EGR2、ETS1、GLI1、HIC1、IRF7、JUN、MAF、MEOX2、MYC、POU2F2、PPARG、SIX2、SMAD3、SMAD4、SOX9、SRF、STAT4、TCF4肽序列具有至少75％同源性，以优选的增加顺序，与FOXS1、CREB5、E2F1、EGR2、ETS1、GLI1、HIC1、IRF7、JUN、MAF、MEOX2、MYC、POU2F2、PPARG、SIX2、SMAD3、SMAD4、SOX9、SRF、STAT4、TCF4肽序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同源性。
本文所述的治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩包括参考人或兽医用途。
在本发明随后的权利要求书和之前的说明书中，除非文中由于表达语言或必要含义需要，单词“包含(comprise)”或变体例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”以包括的含义使用，即指定所述特征的存在但不排除本发明各种实施方案中进一步特征的存在或添加。
本发明各方面的优选特征可以与其他方面的任何特征一起描述。
本发明的其他特征将从以下实施例变得明显。一般而言，本发明扩展至该说明书(包括所附的权利要求书和附图)中公开的特征的任何新特征或新组合。因此，与本发明的具体方面、实施方案或实施例一起描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分可以理解为可应用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。
并且，除非另有说明，本文所述的任何特征可以用为相同或相似目的的其他特征代替。
根据本发明的基因的全部信息可从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得或是本领域技术人员公知的。
本发明现在将通过以下参考附图和表格的实施例的方式描述，其中：
附图说明
图1：在成纤维细胞分化成肌成纤维细胞中的关键转录因子
a)解释计算机模拟的网络分析的图表
b)表示通过生物信息学和网络分析鉴定的不同转录因子的表格。
图2a：表示用RT-qPCR评估的αSMAmRNA水平的图表。用模拟siRNA或针对不同mRNA(FOXS1、EGR2、SRF、SOX9、HIC1、STAT4、TCF4、MYC、JUN、IRF7、E2F1、GLI1、CREB5、STAT1)的siRNA处理NHDF，伴随或不伴随TGFβ1处理。用TUBB标准化RT-qPCR，将模拟siRNA处理(TGF-b)的条件设为1。用针对SRF、HIC1或STAT4的siRNA处理NHDF导致大量细胞死亡。(*):无法分析。用针对STAT1和USF2的siRNA处理NHDF代表对照实验，因为这些因子对成纤维细胞分化成肌成纤维细胞没有任何作用。
图2b：表示如a)所述处理NHDF后，用αSMA阳性细胞百分比评估的分化细胞百分比的图表。用针对SRF、HIC1或STAT4的siRNA处理NHDF导致大量细胞死亡。(*):无法分析。用针对STAT1和USF2的siRNA处理NHDF代表对照实验，因为这些因子对成纤维细胞分化成肌成纤维细胞没有任何作用。
图2c：表示用RT-qPCR评估的αSMAmRNA水平的图表。用模拟siRNA或针对不同mRNA(PPARG、MAF、MEOX2、SIX2、STAT1或USF2)的siRNA处理原发性人真皮成纤维细胞。用TUBB标准化RT-qPCR，将模拟siRNA处理(TGF-b)的条件设为1。用针对STAT1和USF2的siRNA处理NHDF代表对照实验，因为这些因子对成纤维细胞分化成肌成纤维细胞没有任何作用。
图3：对FOXS1、EGR2、SRF、SOX9、HIC1、STAT4、TCF4、MYC、JUN、IRF7、E2F1、GLI1、CREB5，TGFβ1处理后的短期和长期。对于各因子，图表表示RT-qPCR评估的用TGFβ处理的NHDF随时间增加的mRNA水平。
图4：对PPARG、SIX2、MEOX2、MAF，TGFβ1处理后的短期和长期。对于各因子，图表表示RT-qPCR评估的用TGFβ处理的NHDF随时间增加的mRNA水平。
图5：表示用模拟siRNA或针对不同TFmRNA(SOX9、EGR2、TCF4或FOXS1)的siRNA处理并伴随TGF-β处理NHDF(供体A)48h(浅灰色)或72h(深灰色)后，TCF4(a)、EGR2(b)、SOX9(c)、STAT4(d)、FOXS1(e)、PPARG(f)、MAF(g)、MEOX2(h)和SIX2(i)mRNA水平的图表。对于所有图表，对于各处理时间(48h和72h)，将用模拟siRNA和TGF-β处理(T+E)的条件设为100％。
表1：为治疗和/或预防纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩上升或下降的基因。
表2：针对靶基因的siRNA序列。
具体实施方式
响应病变，成纤维细胞迁移入伤口，在其中它们分化成最后将在重塑阶段期间进入细胞凋亡的收缩性肌成纤维细胞。可以在环境控制的组织培养条件下离体研究该分化过程，因此可以解决时间控制的一系列不同基因的表达模式。
材料和方法
建立纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的离体模型
肌成纤维细胞在受伤后皮肤的生理重建和在产生表征纤维化例如增生性疤痕的病理性组织变形中具有重要作用(DesmouliereA,ChaponnierC,GabbianiG(2005)Tissuerepair,contraction,andthemyofibroblast.WoundRepairRegen13:7-12)。
为研究产生纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩中涉及的肌成纤维细胞，在胶原蛋白涂布的培养板上，在补充有10％FCS(Invitrogen,5μg/mL胰岛素和1ng/mLb-FGF(PromoKine)和1ng/mLb-FGF(PromoKine)的DMEM-F12(Invitrogen)中培养NHDF，因为已知TGF-O1在成纤维细胞中诱导αSMA的表达(DesmouliereA,GeinozA,GabbianiF,GabbianiG13(1993)Transforminggrowthfactor-beta1inducesalpha-smoothmuscleactinexpressioningranulationtissuemyofibroblastsandinquiescentandgrowingculturedfibroblasts.JCellBiol,1993jul,122(1):103-111)。
通过分析肌成纤维细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达来评估成纤维细胞分化的效率。
通过RT-qPCR(mRNA水平)和Western印迹(蛋白)来评估所述αSMA的表达。
通过分析肌成纤维细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的表达来评估成纤维细胞分化的效率。
Western印迹分析
通过用裂解液(TRIS、NaCl、NP40、EDTA、IMDTT)刮细胞并在冰上孵育30分钟提取总蛋白。为除去细胞碎片，将样品于4℃在13000xg下离心10分钟，并储存于-20℃直到使用。根据BCA方法(Sigma)测定蛋白浓度。在NuPAGE10％BIS-Tris凝胶(Invitrogen)上样等量的总蛋白(20μg)，在150V通过迁移分离，并在30V转移至硝酸纤维素膜(Whatman)1小时。然后，染色膜中的αSMA(Abcam)和微管蛋白(Abcam)。随后分别用与辣根过氧化物酶(HRP)(Promega)偶联的第二抗体山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG孵育。用UptiLightHSWB底物(Uptima,Interchim)通过ECL化学发光检测信号。用扫描器将条带数字化，并用软件(ImageJ1.43u,64-bit)计算相同印迹强度的所有条带之间的比例。将相对αSMA表达标准化至各自的微管蛋白值。
总RNA样品制备
实验4天后，用TRIzol试剂(Invitrogen)裂解经处理的成纤维细胞，并储存于-80℃。然后用氯仿纯化并用异丙醇沉淀RNA。在NanoDrop2000c分光光度计(ThermoScientific)上定量总RNA。使用SuperScriptIIIRT(Invitrogen)和RNAseOUT(Invitrogen)用oligotdT(Invitrogen)将500ng总RNA逆转录成cDNA。将cDNA储存于-20℃。
定量实时RT-PCR
在LightCycler480系统(Roche)上，用MaximaSYBRGreenqPCR混合母液(Fermentas)，用5μL1:20稀释的cDNA进行定量实时RT-PCR(RT-qPCR)。用Eurofins设计αSMA的正向和反向引物(MWG,αSMA正向:CTGTTTTCCCATCCATTGTG(SEQIDNO:9),αSMA反向:CCATGTTCTATCGGGTACTT(SEQIDNO:10))，并将100μM储液储存于-20℃。在每个RT-qPCR反应中使用正向和反向引物对。循环条件如下：初始95℃10分钟,接着是45个循环(95℃15秒，58℃30秒,72℃20秒)。用LightCycler480SW1.5评估TM曲线，测定Cp，并将各扩增反应的相对浓度近似化。
siRNA处理
通过用特异性的小干扰RNA短暂转染NHDF敲除不同TF的表达。对各个靶标使用至少两个不同的siRNA(Qiagen)或高度特异性的ONTARGETPLUSsmartpoolsiRNA(ThermoScientific)。根据生产商的说明，用10nMsiRNA和4μLINTERFERin试剂(PolyPlus,Ozyme)处理NHDF，并伴随用TGF-β1和渗出物处理6天。为维持充分的敲除，在第一次转染48h后进行第二次转染。在第一次转染48h后评估敲除的效率。
α平滑肌肌动蛋白免疫荧光
将如前所述处理的在胶原涂层的培养皿中生长的细胞用PBS中的4％多聚甲醛(PFA)固定15分钟，并用PBS中的2.5％TritonX-100(Euromedex,2000-B)渗透3分钟。用PBS中的5％BSA饱和后，染色细胞中的α-SMA(Abcam,ab5694)和DNA(DAPI)。使用CyTM3偶联的抗兔(GEHealthcare,PA43004)作为第二抗体。在NikonECLIPSETi(Nikon)上用油浸物镜(PlanFluor40X/1.30Oil,Nikon)观察样品。用数码相机(CoolSNAPHQ2,Photometrics)和软件(MetaMorf7.5.4.0)拍摄数字图像。为评估由不同处理引起的成纤维细胞分化百分比，用DAPI测定每个视野中细胞的总数，并用α-SMA染色计数肌成纤维细胞(分化的成纤维细胞)。然后，实现STUDENT(t-)和χ2检测以评估未处理成纤维细胞(不含TGFβ)和经处理的成纤维细胞之间αSMA的差异表达。
网络分析
为发现各不同处理后成纤维细胞命运的主要调节因子，我们进行了基因网络分析，用未经TGFβ处理的成纤维细胞的基因谱处理了mRNA序列深度测序分析经TGFβ处理的成纤维细胞的基因谱后确定的基因表达列表。在这些分析中，并基于互相关联的基因的下降或上升比显著的LogFC具有更重要的意义这一假设，我们使用仅基于其P值而不是基于其LogFC值而选择的基因列表。我们进行了两种分析：独创的“上游调节因子分析”和DIRE(http://dire.dcode.org/)分析。给定两种条件之间的具体基因表达谱，独创的“上游调节因子分析”在于选择潜在的上游调节因子。DIRE分析基于基因之间潜在的共同调节元件的选择，所述基因基于这些元件在进化期间的保守性。从这些鉴定的元件，DIRE能够为一系列共调节基因提供主要调节因子的列表。对于所分析的各个列表，我们从这两个分析选择在关注的列表中考虑的两种条件的至少一种中表达(即在两种条件的至少一种中测序数超过20)的转录因子(TF)。然后，我们将两组分析深入比较，决定在“关键调节因子列表”中保留属于两个分析的转录因子。由于这两个分析的可能偏差，我们还决定拯救只属于一个分析而不属于另一个，但在一个列表或另一个中呈现非常有趣的靶基因模式的转录因子。总之，这些基因网络分析允许我们提出在一个或另一个成纤维细胞命运中是关键条件因子的TF列表(图1)。
成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的基因表达途径
在正常和病理条件下，人原发性成纤维细胞的成纤维细胞分化中涉及的主要分子靶标的鉴定
我们进行了计算机模拟的基因网络分析来发现之前定义的不同基因表达途径的假定的上游调节因子。该方法是原创的，因为我们使用全球基因网络分析来鉴定潜在关键调节因子，且发明人没有考虑这些因子表达的变化来选择它们。例如，我们使用DIRE程序(http://dire.dcode.org/)来鉴定不同基因列表中进化保守的潜在调节元件，这允许我们发现能够潜在地结合这些元件并因此调节这些基因组的转录因子。从该分析中选择出23个转录因子。
为优先考虑不同转录因子(TF)的深入研究，我们在不同成纤维细胞处理后进行了TF的时间响应研究。我们在不同处理后对它们的表达变化进行了短期(30分钟到8小时)和长期(8小时到96小时)分析(图3和图4)。
我们进行了详尽的基于siRNA的方法，一方面研究这些不同因子在正常的成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的通路中的作用(图2)。
如通过分析TGFβ-和siRNA处理的NHDF的αSMA表达所评估，14个在此鉴定的潜在关键转录因子的siRNA敲除抑制了成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的通路：GLI1、HIC1、TCF4、SOX9、STAT4、MYC、CREB5、IRF7、JUN、E2F1、EGR2、SRF、FOXS1，因为它们的敲除或多或少有效抑制了肌成纤维细胞分化(图2a-b-c)。非常有趣的是，除了在TGFβ处理时表达强烈并快速上调的SOX9、FOXS1和EGR2，其他因子的mRNA水平在第一天期间或在TGFβ处理后是恒定的，并在4天的分化中大致不变。这表明维持它们的表达而不是它们的过表达对于成纤维细胞分化成肌成纤维细胞是必要的。
通过计算机模拟分析鉴定的其他四个潜在关键转录因子(MAF、SIX2、MEOX2和PPARG)的siRNA敲除似乎在缺少TGFβ时，以与用TGFβ处理的模拟转染细胞所得的相同程度诱导成纤维细胞分化成肌成纤维细胞。总之，这些结果表明用敲除方法，我们能够降低或诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞(表1)。
计算机模拟的基因网络分析允许我们鉴定在分化成肌成纤维细胞期间成纤维细胞命运的潜在关键调节因子。通过敲除方法，我们发现19个因子对分化有强烈作用。
我们还鉴定了似乎起作用但不如以上段落所述的那些强烈的因子，因为它们的敲除导致αSMA表达持续但微弱的降低。这些因子是MYC、JUN、E2F1、IRF7和CREB5。
非常有趣的是，我们表明，某些转录因子的失活导致成纤维细胞分化本身的增加。PPARGmRNA的敲除导致增加的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。
FOXS1属于通常涉及发育过程例如形态发生和分化的叉头转录因子家族。已经表明，FOXS1在睾丸血管发育中具有重要作用。此外，FOXS1被描述为早期的感觉神经标志物。在此，我们表明，FOXS1的失活在缺少TGFβ的情况下增加肌成纤维细胞分化。
已经描述MEOX2涉及TGFβ通路，因为它在TGFβ3敲除小鼠中被鉴定为腭裂发育的重要因子。C2C12成肌细胞实验表明，MEOX2对于骨骼肌发育和分化同样重要。在此，我们表明，针对MEOX2的siRNA导致成纤维细胞能够绕开渗出物的作用以能够分化成肌成纤维细胞。
在T细胞中，已经表明MAF通过中和TGFβ负责抑制IL22表达。TGFβ和MAF在CD4(+)T细胞中对IL21表达具有拮抗/相反的作用。在同一意义上，在本研究中，我们表明MAF是在不存在或存在渗出物的情况下，成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的抑制剂，因为通过siRNA使其失活导致肌成纤维细胞分化增加。相反，在软骨细胞分化中，长的MAF形式与SOX9相互作用并合作以激活下游靶标。这是肌成纤维细胞和软骨细胞分化之间的差异的另一个实例。
SIX2已经涉及在肾中维持多能性：在胚胎性肾间质细胞中它能够抑制分化，并且在肾发育期间，它维持祖细胞池。在此，在真皮成纤维细胞中，SIX2的失活导致绕开渗出物对TGFβ信号的主要作用。
成纤维细胞分化成肌成纤维细胞期间关键转录因子之间的调控的相互作用
在SOX9、EGR2或FOXS1敲除后TCF4mRNA的表达没有变化(图5)，将TCF4置于这些因子之间的调控相互作用网络的顶端。相反，EGR2的表达在针对TCF4和SOX9的siRNA处理时被明显抑制，但在针对FOXS1的处理时保持不变(图5)，将其置于网络中TCF4和SOX9之后但在FOXS1之前。SOX9mRNA在TCF4和FOXS1敲除时基本上保持不变。发明人将FOXS1作为SOX9的下游靶标。相反，EGR2敲除时SOX9上调(图5)。STAT4mRNA在TCF4、SOX9和EGR2敲除时被下调(图5)，使其成为这些TF的下游靶标，但在FOXS1siRNA处理时保持不变，使其在FOXS1之前。与此一致，FOXS1mRNA在TCF4、SOX9和EGR2siRNA处理时被下调(图5)，使其成为这一连串的末端。总体上，PPARG、MAF和MEOX2mRNA在针对TCF4、SOX9、EGR2和FOXS1的siRNA处理时被下调(图5)，这与其在成纤维细胞分化中作为拮抗剂的作用一致。SIX2mRNA水平在EGR2和FOXS1敲除时不变(图5)，但在TCF4和SOX9敲除时被上调，这与这两个TF之间的紧密相互作用一致，表明分化激动剂SOX9和TCF4与拮抗剂SIX2之间存在信号平衡。
能够绕开分化的转录因子的鉴定在纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩中非常重要。在本研究中，通过聚焦成纤维细胞，并不意味着我们试图掩饰其他细胞例如中性细胞和巨噬细胞在皮肤愈合过程中的重要性，而是我们将生物情况简化以更清楚地描述这个情况。
与癌症的关系
肌成纤维细胞不仅在纤维化中是重要细胞，也已经在癌症中证明它们的重要性，其中作为“癌症相关的成纤维细胞”的基质中的肌成纤维细胞的存在促进肿瘤发展，而且经常与炎症、细胞侵袭、高度恶化和预后差有关。与良性前列腺增生相比，肌成纤维细胞在来自前列腺癌的基质中富集，并与癌症前沿相关。它们产生MMP、细胞因子(IL8、VEGF)和趋化因子(CXCL12)来促进癌症增殖、肿瘤侵袭和新血管生成。作为代替的治疗途径，靶向癌症中的基质细胞(和它们中的肌成纤维细胞)以消除其迁移、侵入和增殖的能力似乎非常重要。但癌症的情况并没有如此简单，已经表明，由于炎症通常与癌症相关，发现绕开或抑制炎症的新方法也可有助于对抗癌症。这种对TGFβ依赖性成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的深入研究为发现治疗性靶标提供了很多新途径。然而，由于TGFβ的促纤维化和抗炎症的双重活性，应当很好地平衡抑制或再加强TGFβ作用的治疗剂，因为通过抑制TGFβ通路来抑制纤维化也可能增加癌症易感性。
更好的理解正常成纤维细胞分化为肌成纤维细胞在本领域中非常重要，因为它打开进入可以用于其他重要病理的新治疗剂标志物或靶标的新途径。
组织纤维化(例如肺纤维化、肝纤维化、肾间质纤维化、心血管纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩等)主要通过TGFβ1引起产生ECM的肌成纤维细胞的过度活化。更好的理解成纤维细胞到肌成纤维细胞的基因表达途径对于理解和治愈纤维化非常重要。我们表明，来自慢性伤口的渗出物能够预防和逆转肌成纤维细胞分化，为分化可逆性提供新迹象，如已经在肝、肾或HepatoStellar细胞(HSC)来源的肌成纤维细胞中表明的一样。我们还鉴定了其失活抑制TGFβ依赖性肌成纤维细胞分化的转录因子。肌成纤维细胞不仅在纤维化中是重要细胞，也已经在癌症中证明它们的重要性，其中作为“癌症相关的成纤维细胞”的基质中的肌成纤维细胞的存在促进肿瘤发展，而且经常与炎症、细胞侵袭、高度恶化和预后差有关。与良性前列腺增生相比，肌成纤维细胞在来自前列腺癌的基质中富集，并与癌症前沿相关。它们产生MMP、细胞因子(IL8、VEGF)和趋化因子(CXCL12)来促进癌症增殖、肿瘤侵袭和新血管生成。作为代替的治疗途径，靶向癌症中的基质细胞(和它们中的肌成纤维细胞)以消除其迁移、侵入和增殖的能力似乎非常重要。但癌症的情况并没有如此简单，已经表明，由于炎症通常与癌症相关，发现绕开或抑制炎症的新方法也可有助于对抗癌症。这种对TGFβ依赖性的成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的深入研究为发现治疗性靶标提供了很多新途径。然而，由于TGFβ的促纤维化和抗炎症的双重活性，应当很好地平衡抑制或再加强TGFβ作用的治疗剂，因为通过抑制TGFβ通路来抑制纤维化也可能增加癌症易感性。

Claims (15)

1.用于预防和/或治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的治疗性化合物，包含：
–抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或
–增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂。
2.根据权利要求1的治疗性化合物，进一步包含：
–抑制至少一个选自E2F1、EGR2、GLI1、JUN、MYC、SMAD3、SMAD4和SOX9、SRF,优选EGR2、SOX9的基因的活性的试剂，和/或
–增强至少一个选自ETS1和PPARG的基因的活性的试剂。
3.根据权利要求1或2所述的治疗性化合物，其中所述试剂选自裸露的或是质粒和病毒载体形式的反义DNA或RNA、siRNA、shRNA、cDNA、TALENS或核酶。
4.根据权利要求1或2所述的治疗性化合物，其中所述试剂是蛋白功能的抑制剂或增强剂。
5.根据权利要求4所述的治疗性化合物，其中所述试剂选自：可逆或不可逆结合以抑制蛋白功能的结合剂，例如抗体或合成的拮抗剂，或在蛋白信号机制上游或下游起作用以抑制蛋白功能的试剂。
6.根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中所述治疗性化合物用于治疗哺乳动物纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织。
7.根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中所述治疗性化合物用于治疗人纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织。
8.根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中所述治疗性化合物用于局部应用。
9.根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物，其中所述治疗性化合物应用于敷料或浸渍敷料。
10.药物组合物，包含根据前述权利要求任一项所述的治疗性化合物和药学上可接受的载体。
11.用于制备根据权利要求10所述的药物组合物的方法，包括将所述治疗性化合物与药学上或兽医上可接受的载体或介质联合或结合。
12.用于治疗哺乳动物纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的方法，其中所述方法包括向所述纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织施用包含以下的治疗性化合物：
–抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或
–增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂。
13.用于治疗哺乳动物纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的试剂盒，其中所述试剂盒包含：
(a)至少一种根据权利要求1-9任一项所述的治疗性化合物或根据权利要求10所述的药物组合物，和
(b)至少一种用于向所述纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织施用的敷料。
14.用于治疗哺乳动物纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的联合治疗剂，包含：
(a)–抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或
–增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂，和
(b)至少一种进一步的治疗剂。
15.以下试剂用于治疗纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩或容易发展纤维化、增生性疤痕或疤痕疙瘩的组织的用途：
–抑制至少一个选自HIC1、FOXS1、CREB5、IRF7、POU2F2、STAT4、TCF4,优选TCF4、FOXS1、STAT4的基因的活性的试剂，和/或
–增强至少一个选自MAF、MEOX2、SIX2的基因的活性的试剂；其中所述试剂调控成纤维细胞和肌成纤维细胞分化和/或活性。
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