CN113143943A - Thonningianin A在制备作为L-型钙离子通道激活剂的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Thonningianin A(TA)在制备作为L‑型钙离子通道激活剂的药物中的应用，这种药物可用于预防或/和治疗人或动物血管钙化。本发明的有益效果：本发明发现赶黄草提取物TA具有防治糖尿病相关血管钙化疾病的作用，并发现了其作用机理，提供了其在制备作为细胞膜L‑型钙离子通道激活剂的药物中的新用途，含有TA的药物具有预防或/和治疗人或动物血管钙化的应用前景。

Description

Thonningianin A在制备作为L-型钙离子通道激活剂的药物 中的应用

技术领域

本发明属于化合物的药物新用途技术领域，涉及一种赶黄草提取物的新用途，具体涉及Thonningianin A(TA)在细胞膜L-型钙离子通道激活剂的药物中的应用。

背景技术

血管钙化的发生是由于各种病理因素刺激，打破了血管壁矿化防御机制，使血管平滑肌细胞由收缩表型向成骨表型转化。近年来对血管钙化的病理过程的诸多研究使研究者趋向于认为血管钙化是一种主动调控的，与骨形成相似的、可预防和逆转的复杂生物学过程(Leopold J A.Vascular calcification:an age-old problem of oldage.Circulation,2013,127(24):2380-82.)。糖尿病患者血糖升高，将导致血管弹性纤维断裂，弹性减弱，同时破坏内膜，导致脂质沉积，造成动脉粥样硬化，长期将导致血管钙化。糖尿病患者血管钙化常为中膜钙化，又称Monckeberg’s硬化，发生在血管中膜层，钙化连续、弥散分布，通常病变为中、小动脉，如：股动脉、胫前动脉、胫后动脉等(PFEILER S,WINKELS H,KELM M，et al.IL-1family cytokines in cardiovascular disease.Cytokine,2017.)。目前糖尿病血管钙化仍是造成心血管疾病死亡的主要原因之一，虽然糖尿病血管钙化的发生、发展机制已经研究的比较深入，但仍没有有效的药物疗法可以预防、延缓甚至逆转血管钙化，从而恢复血管顺应性。

自噬是一种高度保守的细胞调节过程，主要负责去除和回收长寿命的蛋白质和细胞器自。自噬在生物体内多种病理和生理过程中都发挥着重要的作用，包括清除体内异常的细胞器和蛋白质、抗细胞凋亡、抑制肿瘤、呈递抗原等(CHEN N X,MOE SM.Pathophysiology of Vascular Calcification[J]. Current Osteoporosis Reports,2015,13(6):372-80.)。随着对糖尿病血管钙化研究的不断深入，部分科学家将自噬的调控与血管钙化结合起来。

赶黄草(PCP)是一种传统的中国中草药，目前已鉴定出赶黄草的多种活性提取物。专利文献CN108567789B公开了赶黄草提取物Thonningianin A(TA, Pincecembrindihydrochalcone-7-O-[3”-O-galloyl-4”，6”-hexahydroxydiphenoyl] -glucoside)在制备预防或治疗酒精性心肌病药物中的应用，TA能够降低酒精性心肌病模型中血浆CK-MB含量。专利文献CN109125337A报道赶黄草提取物TA在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中具有较强的自噬活性。进一步研究证实，TA可以通过引起细胞内Ca²⁺浓度增加，诱导与AMP/ATP有关的AMPK活化，在HUVECs中诱导自噬，减轻体外ROS水平，并抑制了动脉粥样硬化小鼠模型的主动脉中氧化应激相关的炎性小体表达。既往研究表明，适度的自噬可以保护血管钙化，但TA是否可以通过激活自噬以减轻糖尿病血管钙化仍未可知。

发明内容

有鉴于此，本发明通过实验证实了TA对血管钙化的抑制作用，并发现了 TA通过激活细胞膜L-型钙离子通道来激活自噬从而发挥其作用。因此提出如下技术方案：

本发明提供TA在制备作为细胞膜L-型钙离子通道激活剂的药物中的应用，TA的结构如式(I)：

在另一种实施方案中，上述药物用于预防或/和治疗人或动物血管钙化。

在另一种实施方案中，上述血管钙化是由糖尿病引起或伴随糖尿病发生的。

在另一种实施方案中，上述血管钙化发生于人或动物的动脉。

在另一种实施方案中，上述血管钙化发生于人的股动脉、胫前动脉、胫后动脉。

在另一种实施方案中，上述血管钙化发生于具有平滑肌的血管壁中膜。

在另一种实施方案中，上述药物通过激活平滑肌细胞膜L-型钙离子通道诱导自噬来预防或/和治疗人或动物血管钙化。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明发现赶黄草提取物TA具有防治糖尿病相关血管钙化疾病的作用，并发现了其作用机理，提供了其在制备作为细胞膜L-型钙离子通道激活剂的药物中的新用途，含有TA的药物具有预防或/和治疗人或动物血管钙化的应用前景。

附图说明

图1为小鼠主动脉平滑肌细胞(MASMCs)经钙化诱导后，茜素红染色图片和成骨细胞表型标志物表达情况。其中：(A)HG+β-GP干预14天后， Control(对照组)和HG+β-GP(钙化组)的茜素红染色图片及钙化面积百分比统计学分析(**P<0.01)；(B)RT-qPCR检测Control(对照组)和HG+β-GP (钙化组)钙化相关Runx2、BMP2和OPN的mRNA表达水平(*P<0.05， **P<0.01)。

图2为MASMCs钙化模型细胞经TA干预处理后的茜素红染色图片和成骨细胞表型标志物表达情况。其中：(A)干预14天后，Control组、HG+β-GP 组、HG+β-GP+6μM TA组、HG+β-GP+8μM TA、6μM TA组、8μM TA组的茜素红染色图片及钙化面积百分比统计学分析(*P<0.05，**P<0.01)；(B) RT-qPCR测定Control组、HG+β-GP组、HG+β-GP+6μM TA组、HG+β-GP+8μM TA、6μM TA组、8μM TA组钙化相关Runx2、BMP2和OPN的mRNA表达水平(*P<0.05，**P<0.01)。

图3为MASMCs钙化模型细胞在不转染和转染ATG7 siRNA的情况下，成骨细胞表型标志物表达情况以及细胞内钙化相关蛋白表达情况。其中：(A) 将MASMCs分为Control组、HG+β-GP组、HG+β-GP+8μM TA组，在转染或者不转染ATG7 siRNA后，测定钙化相关Runx2、BMP2和OPN mRNA的表达情况(*P<0.05，**P<0.01)；(B-D)细胞免疫荧光染色测定Control组、 HG+β-GP组、HG+β-GP+8μM TA组、Control+siATG7组、HG+β-GP+siATG7 组、HG+β-GP+8μMTA+siATG7组钙化相关蛋白Runx2(B)、BMP2(C)和 OPN(D)的表达情况(红色荧光分别代表Runx2、BMP2和OPN，蓝色荧光代表DAPI)。

图4为TA和不同钙离子通道抑制剂对GFP-LC3 U87细胞自噬标志物 GFP-LC3表达情况和细胞内钙离子浓度的影响。其中：(A)不同钙离子通道抑制剂Nifedipine、2-APB、Dantrolene干预72小时后，通过荧光显微镜观察表达GFP-LC3荧光颗粒的细胞百分比数量，并通过GraphPad Prism 5软件进行统计学分析(**P<0.01，***P<0.001)；(B)在细胞外液没有钙离子存在情况下，TA对细胞内钙离子浓度的影响；(C)和(D)：在细胞外液有钙离子存在情况下，观察不同顺序先后予以Nifedipine和TA干预后对细胞内钙离子浓度的影响。柱状图表示不同时间点予以不同药物干预后细胞内离子浓度变化的差异性(**P<0.01，***P<0.001)。

图5为TA和不同钙离子通道抑制剂对HG+β-GP诱导的MASMCs钙化影响。其中：(A)予以MASMCs不同钙离子通道抑制剂Nifedipine、2-APB 和Dantrolene干预后，培养72小时，通过RT-qPCR检测钙化相关RUNX2、 BPM2、OPN mRNA水平的表达(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)；(B)干预 14天后，通过茜素红染色试剂盒检测各组钙结节染色面积及钙化面积百分比统计学分析(**P<0.01,***P<0.001)。

图6为糖尿病小鼠血管钙化模型的钙化相关指标的检测。其中：(A)通过腹腔注射STZ(150mg/kg)构建糖尿病小鼠模型，分别在注射STZ后3天、1 周、2周、3周、4周测定小鼠空腹血糖(**P<0.01,n＝24)；(B)造模完成后，取Control组和DM+VitD组小鼠主动脉血管，通过钙测定试剂盒检测两组小鼠主动脉血管钙浓度及钙含量(**P<0.01)；(C)取Control组和DM+VitD 组小鼠主动脉血管进行Von Kossa染色(钙化区域染成黑色)，并进行钙化面积百分比统计学分析(***P<0.001)。

图7为糖尿病小鼠血管钙化模型的钙化相关蛋白表达情况。取Control组和DM+VitD组小鼠主动脉弓血管进行冰冻切片及免疫荧光染色检测钙化相关蛋白RUNX2(A)、BMP2(B)及OPN(C)表达情况(红色荧光分别代表 Runx2、BMP2和OPN，蓝色荧光代表DAPI)(**P<0.01,***P<0.001)。

图8为TA的干预对糖尿病小鼠血管钙化模型相关指标的影响。其中：(A) 对糖尿病小鼠予以TA和VitD干预后，取Control组、DM+VitD组、 DM+VitD+0.1mg/kg TA组、DM+VitD+0.2mg/kg TA组小鼠主动脉血管，通过钙测定试剂盒检测四组小鼠主动脉血管钙浓度及钙含量(*P<0.05， **P<0.01)；(B)取Control组、DM+VitD组、DM+VitD+0.1mg/kg TA组、 DM+VitD+0.2mg/kg TA组小鼠主动脉血管进行Von Kossa染色(钙化区域染成黑色)，并进行钙化面积百分比统计学分析(**P<0.01，***P<0.001)。

图9为TA的干预对糖尿病小鼠血管钙化模型钙化相关蛋白表达情况的影响。对糖尿病小鼠予以TA和VitD干预后，取Control组、DM+VitD组、 DM+VitD+0.1mg/kg TA组、DM+VitD+0.2mg/kg TA组小鼠主动脉弓血管进行冰冻切片及免疫荧光染色检测钙化相关蛋白RUNX2(A)、BMP2(B)及 OPN(C)表达情况(红色荧光分别代表Runx2、BMP2和OPN，蓝色荧光代表DAPI)(**P<0.01，***P<0.001)。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

人和哺乳动物血管钙化具有类似的疾病机理，小鼠是最常用的实验动物，使用其作为模型来研究TA对血管钙化的作用，能够得到初步可信的研究结论，为后期临床研究提供初步的依据。因此，本研究通过细胞钙化模型实验、小鼠动物模型实验研究TA对血管钙化的影响及作用机理。

一、实验方法

(一)实验材料及设备

(1)实验动物

实验动物均为八周龄雄性C57BL/6J小鼠，购买于成都达硕生物技术有限公司(SCXK(川)2015—030)，实验动物在西南医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK(川)2013-17)进行饲养。所有小鼠均为自由饮食，进水，光照保持昼夜节律，室内温度控制在25℃。实验过程中任何环节均按照《西南医科大学实验动物质量管理方法》中的各项管理方法严格执行。

(2)主要实验试剂

兔抗鼠RUNX2单克隆抗体、兔抗鼠OPN单克隆抗体、兔抗鼠BMP2单克隆抗体均购自abcam公司；2-APB购自APExBIO；胰酶细胞消化液(0.25％胰酶)和青链霉素溶液(100×)购自Beyotime公司；无钙台式液购自Bomei公司；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自 Foregene；DMEM/F12细胞培养基和胎牛血清购自GIBCO公司；兽用维生素 D3注射针液购自Nongke公司；β-actin、RUNX2、BMP2、OPN基因引物购自Sangon公司；链脲佐菌素、柠檬酸缓冲液、Von Kossa染色试剂盒、茜素红染色试剂盒、CCK-8检测试剂盒、β-磷酸甘油、含钙台式液、多聚甲醛、组织钙离子含量检测试剂盒、Dantrolene、4-PBA和Nifedipine购自Solarbio 公司；Fura-2购自Thermo Scientific公司；盛牌高脂饲料，包含质量份的基础饲料59.8％、猪油16％、蔗糖20％、蛋黄3％、胆固醇1％以及胆盐0.2％。

(3)主要实验仪器

主要使用的实验仪器及生产厂家为：多功能酶标仪，Bio-Tek(美国)； CorningCoolCell程序降温盒，Corning(美国)；电子天秤，CP323S(德国)；微量移液器，Eppendorf(德国)；体式显微镜、冰冻切片机、倒置相差显微镜、分光光度计，Leica(德国)；倒置荧光显微镜，Olympus(日本)；Thermo C02 细胞培养箱、-80℃超低温冰箱、普通高速离心机、低温离心机、台式超高速离心机、实时荧光定量PCR仪，Thermo Scientific(美国)；显微荧光离子影像系统，Till Polychrome V(德国)；电热恒温水浴锅，上海医用恒温设备厂；精细显微剪、精细显微镊，苏州市协和医疗器械厂。

(二)小鼠原代主动脉平滑肌细胞的提取与培养

实验步骤：(1)1％戊巴比妥钠(5mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，将小鼠仰卧位固定于载物台上，用脱毛器刮净小鼠胸部及腹部毛发，75％乙醇消毒后，用剪刀配合组织镊依次打开胸、腹腔，剪去肋骨，暴露心脏。

(2)用10ml注射器吸取10ml PBS后，穿刺小鼠左心室，冲洗2-3次，待停止冲洗小鼠主动脉仍保持透明后，沿小鼠脊柱分离主动脉，剪取胸腹主动脉后，立即放入提前预冷的盛有无菌PBS的培养皿中，接下来的操作均在超净台中进行。

(3)在超净台中提前消好毒的体式显微镜下，用显微镊轻轻剥去血管周围的脂肪组织，注意不能挤、捏血管，将剥好的血管放入另一个干净的提前预冷的盛有无菌PBS的培养皿中，用显微剪纵向剪开血管，用显微镊轻轻刮除小鼠主动脉内膜后，小心分离中膜和外膜；

(4)将分离好的中膜用无菌PBS漂洗3次后放入另一个无菌的培养皿中，吸管滴加2ml含20％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基完全淹没血管，用显微剪将中膜剪成约1-3mm大小的组织块，用吸管将剪好的组织块连同培养基一起均匀平铺于无菌培养瓶中，吸取多余的培养基后，将培养瓶直立，加入 4ml含20％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基，放入37℃5％CO2培养箱中，4小时后，平放培养瓶，将已经贴壁的中膜组织碎片完全浸泡在培养基中，静置培养5-6天，期间不能频繁移动培养瓶，待显微镜观察中膜组织块周围有细胞爬出后即可3天换液一次，直至传代。

(5)细胞转代：待爬出平滑肌细胞达80％后，即可开始传代。吸管洗净培养瓶中旧的培养基后，加入无菌PBS清洗2遍。加入0.25％胰蛋白酶1ml，置于37℃培养箱中消化3分钟后，于倒置显微镜下观察到细胞收缩变圆时，立即加入含20％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基2ml停止消化，轻轻拍打培养瓶壁，使之脱壁形成细胞悬液，收集细胞悬液放入离心管中，离心机1000 r/min，离心5分钟，弃上清液，用含20％胎牛血清的DMEM/F12细胞培养基8mL重悬细胞，将细胞混匀后接种于2个新的无菌培养瓶中，3天换液一次。

(6)细胞冻存：选对数增生期2-5代MASMCs进行冻存，冻存前一天换液。消毒超净工作台，吸掉培养瓶内旧的培养基，PBS缓冲液冲洗3遍后，向瓶内加入1mL 0.25％胰酶消化液，在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，加入2-3mL完全培养基终止消化。使用吸管，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液并移入无菌离心管中。离心机1000rpm离心5min后，移除上清液，加入冻存液，吹打均匀后，分装移入无菌冻存管中，封口胶仔细密封，分别以4℃、30min；-20℃、2h； -80℃过夜，然后置于液氮罐冻存。

(三)茜素红染色

(1)样本固定：取长势良好的2-5代MASMCs细胞接种于24孔板细胞培养板上，分组给予干预。干预后，小心吸取24孔板细胞培养板里的培养液，每孔加约茜素红染色试剂盒Reagent A清理液100uL，清理细胞表面。清理后，吸取清理液，每孔加入100uL Reagent B固定液，室温固定15分钟后，抽去固定液，Reagent A清理液清理2遍。

(2)样品染色：小心加入Reagent C染色液，轻轻晃动24孔板，使染色液均匀覆盖在细胞表面，室温温孵育5分钟，或直至肉眼可见桔红色后，抽去Reagent C染色液，室温空气中晾干10-15分钟。

(3)样本澄清：晾干后加入Reagent D脱水液，轻轻晃动24孔板后，抽去Reagent D脱水液并重复2-3次。小心加入Reagent E澄清液，轻轻晃动24 孔板后，抽去Reagent E澄清液并重复2-3次。

(4)样本观察：染色结束后即刻在光学显微镜下观察：钙沉积阳性细胞呈桔红色。

(四)实时荧光定量PCR

(1)引物设计：根据GeneBank中β-actin、RUNX2、BMP2、OPN基因序列，运用DNAman软件设计引物(见表1)。

表1荧光定量PCR实验所用引物序列表

(2)细胞总RNA提取

①移除6孔板各组细胞培养液，用灭菌PBS清洗细胞并吸净残余液体，加入250uLBuffer cRL1进行消化、裂解；②将裂解好的细胞混合液转移至含 DNA-Cleaning Column的收集管，12000rpm室温离心2min，保留收集管内上清液；③向上清液加入1.6倍体积约400uL的Buffer cRL2，轻柔混匀；④将混合液全部转移至RNA-only Column中(纯化柱放入收集管中)，12000 rpm离心1min；⑤弃掉收集管中废液；向纯化柱中加入500uL Buffer RW1,12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液；⑥向纯化柱中加入700uL Buffer RW2，12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，重复该步骤一次；⑦将纯化柱放入收集管中，12000rpm空管离心2min，去掉离心柱中残余的 Buffer RW2；⑧将纯化柱转移至新的RNA收集管，向纯化柱的膜中央加入适量的已于65℃预热的RNase-Free ddH2O，室温放置2min后，以12000rpm 离心1min并收集RNA溶液；⑨将离心得到的RNA溶液重新加至纯化柱中，重复步骤⑧；⑩使用分光光度计对RNA浓度及纯度进行检测。

(3)RNA逆转录

①将检测合格的RNA溶液放入预先加热至65℃的水浴锅加热变性5min, 变性后立即置于冰上冷却；②冰面上配制逆转录反应体系(见表2)，并轻轻震荡均匀，按下温度进行反应：37℃15min、50℃5min(逆转录反应)；98℃5min(酶失活反应)；4℃，∞，反应结束后行cDNA扩增或放入-20℃保存；冻存时间不超过一周。

表2逆转录反应体系

(4)RNA逆转录

①配制RT-qPCR反应体系，见表3。

表3 RT-qPCR反应体系

②于无菌无酶环境中，取PCR专用96孔板置于冰上，按表5精确加入反应试剂(加样过程中尽量避免气泡产生，避免其粘附于管壁)，加样完成后，避光于离心机中1000rpm离心3min后，置入荧光定量PCR仪中进行 RT-qPCR反应，反应条件如下：95℃预变性2min；95℃5s、60℃10s，45 个循环，最后通过解链曲线分析底物扩增的特异性，每个样本设置3个复孔，实验重复3次，Ct值为每个反应管内荧光信号到达设定域值所经历的循环数。用2^-△△ct法计算相关RNA的相对表达水平。

(五)血管平滑肌细胞钙化模型的建立

取对数期生长的2-5代MASMCs，当细胞融合至70％左右时，PBS冲洗 3次后，换用钙化培养基(含5％胎牛血清DMEM/F12细胞培养基+35mM葡萄糖+10mMβ-磷酸甘油)培养14天，每2天换液一次。通过RT-qPCR检测 BMP2、RUNX2、OPN mRNA的表达及茜素红染色鉴定钙化模型造模成功。

(六)siRNA转染实验

(1)转染前一天，取处于对数期生长的2-5代MASMCs，用无菌无酶 PBS清洗细胞，加入0.25％胰酶消化液1ml消化细胞后，1000r/min室温离心 4分钟，弃去上清液，加入不含双抗的DMEM/F12细胞培养基重悬细胞，计数后，以1×10⁵细胞/孔的密度接种到6孔板上，37℃、5％C0₂细胞培养箱中培养过夜。转染前3小时，取出细胞置于倒置显微镜下观察。若融合率达 50％-70％，即可进行转染实验。

(2)用120μl1X riboFECT^TMCP Buffer稀释5μl 20μM siRNA储存液，轻轻混匀，再加入12μl riboFECT^TMCP Reagent，轻轻吹打混匀。室孵育5-15min，制备成转染复合物。将riboFECT^TMCP转染复合物加入到1863μl无双抗 DMEM/F12细胞培养基、不含双抗的钙化培养基、含8μM TA的无双抗钙化培养基中，轻轻混匀。

(3)吸去6孔板中原有的培养基，无菌无酶PBS清洗细胞3遍后，将含有riboFECT^TMCP转染复合物的培养基按分组分别加入到6孔板中，37℃、 5％C0₂细胞培养箱中培养48h。

(七)细胞免疫荧光染色

(1)将提前种植于6孔板并按照分组干预后的MASMCs用PBS清洗3 次，每次4min；加入4％多聚甲醛固定20min；预冷PBS洗涤3次，每次5 min；常温下滴加200μl 5％BSA室温孵育封闭1h后，滴加100μl一抗(兔抗鼠 RUNX2单克隆抗体/兔抗鼠OPN单克隆抗体/兔抗鼠BMP2单克隆抗体)，室温避光孵育过夜。

(2)孵育过夜后的细胞用PBS清洗3次，每次4min，然后滴加100μL 二抗(羊抗体兔荧光二抗)，室温避光孵育1h；最后滴加100μL DAPI染核，室温避光孵育10min；将6孔板置于荧光显微镜下，观察目的蛋白荧光表达情况。

(八)TA和不同钙离子通道抑制剂对GFP-LC3 U87细胞自噬荧光蛋白表达的影响

将GFP-LC3 U87细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，1X105个/孔接种于 6孔板中，分别予以TA和不同钙离子通道抑制剂干预后，4％甲醛溶液进行细胞固定，室温固定20min，用PBS清洗细胞3次，每次10min；于荧光显微镜下进行荧光观察并拍照记录。统计GFP-LC3荧光颗粒的细胞百分比数量，并通过GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。

(九)细胞内钙离子浓度测定

(1)储存液配制：用49.9μl二甲基亚砜(DMSO)溶解50μg的Fura-2-AM 粉末配制成1mmol/L的Fura-2-AM储存液。在-20℃避光密封保存。

(2)用HBSS溶液稀释1mmol/l的Fura-2-AM储存液，配制成5μmol/l 的Fura-2-AM工作液。

(3)取出预培养的MASMCs，去除培养基，根据实验需要，用含CA²⁺/ 不含CA²⁺HBSS冲洗细胞3次。

(4)加入Fura-2-AM工作液，在37℃、5％C0₂细胞培养箱中培养30min。

(5)根据实验需要，用含CA²⁺/不含CA²⁺HBSS冲洗细胞3次，去除 Fura-2-AM工作液，然后再加入HBSS溶液覆盖细胞，37℃、5％C0₂细胞培养箱中再培养20min，以确保AM体在细胞内的完全去酯化作用。

(6)显微荧光离子影像系统在Fura-2-AM激发波长340nm和380nm处采集数据。F340/F380比值用来表示细胞内钙离子浓度变化的指标。

(十)糖尿病血管钙化小鼠模型的建立

(1)取4周龄C57BL/6J雄性小鼠32只，普通饮食喂养1周，随机选取 8只为对照组，24只构建糖尿病模型。实验前一天所有小鼠禁食不禁水12小时，对照组腹腔注射50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH4.5，100mg/kg)，实验组腹腔注射150mg/kg链脲佐霉素(STZ，50mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冰上避光配制，现配现用)。72h后，空腹血糖(隔夜禁食12h不禁水)>11.1 mmol·L^-1者视为造模成功(重复测量3次)。

(2)造模3周后，待血糖趋于稳定，糖尿病小鼠腹腔注射维生素D3(Vit D，5×10⁵IU/kg/d)，连续7天，建立糖尿病血管钙化小鼠模型，组织钙含量/ 钙浓度检测、VonKossa染色、组织免疫荧光染色鉴定模型建立成功。

(十一)组织钙含量及钙浓度测定

麻醉小鼠后打开胸腔，从心尖注入生理盐水灌流，待停止冲洗小鼠主动脉仍保持透明后，沿小鼠脊柱分离主动脉，剪取主动脉弓到腹主动脉的一段血管并小心剔除血管周围结缔组织。80℃烤箱烤干，组织称重，将干燥的主动脉浸没在含65％HNO3的培养皿中，180℃烘烤24h，冷却后加1ml双蒸水溶解后继续烘干,重复溶解烘干3次后,加入500μL双蒸水将烘干物充分溶解后，转移到EP管中，高速离心机中10000r/min离心10min,随后用钙测定试剂盒(邻甲酚酞络合铜法)测定其钙含量。

(十二)组织免疫荧光染色

(1)冰冻切片的准备

①麻醉小鼠后打开胸腔，从心尖注入生理盐水灌流，待停止冲洗小鼠主动脉仍保持透明后，沿小鼠脊柱分离主动脉。

②1.5mL离心管剪去锥形底部，盖好盖子倒置，注满组织包埋剂OCT，注意不要产生气泡。

③将血管段垂直放入离心管中，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。

④切片：取出包埋组织块，固定至冰冻切片机样品托，修平包埋块表面后切片，切片厚度为10μm。用载玻片小心铺展组织切片，置于-80℃冰箱保存。

(2)染色

①将切片从-80℃取出，置于60℃烘烤10-15min，晾至室温后用组化笔圈出切片位置。

②固定：用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗5次，每次5min。

③破膜和封闭：0.2％Triton X-100和5％BSA室温共孵育2h。

④PBS稍加洗涤后，使用一抗(兔抗鼠RUNX2单克隆抗体/兔抗鼠OPN 单克隆抗体/兔抗鼠BMP2单克隆抗体)4℃孵育过夜。

⑤次日PBS洗5次，每次5min。随后使用二抗(羊抗体兔荧光二抗)室温孵育2h，注意避光。

⑥PBS洗5次，每次5min，用含DAPI的水性封片剂封片，荧光镜检。

(十三)小鼠主动脉Von Kossa染色

①麻醉小鼠后打开胸腔，从心尖注入生理盐水灌流，待停止冲洗小鼠主动脉仍保持透明后，沿小鼠脊柱分离主动脉。

②将主动脉放入培养皿中，小心加入1ml PBS，清洗血管样本，清洗3 次。

③小心加入1ml 4％甲醛溶液，浸没整个组织，室温下孵育1小时。

④抽去固定液后，再次用PBS清洗血管样本，清洗3次后，加入Von Kossa 染色液，浸没整个组织

⑤室温下置于太阳光直射或60瓦灯直射孵育60分钟；或直至可见黑色。

(十四)统计学方法

各实验独立重复至少三次以上，应用GraphPad Prism 5软件分析，结果以平均数±标准差表示(Mean±SD)，多组间比较采用重复测量单因素方差分析。 P<0.05为差异有统计学意义。

二、细胞实验

实施例1

TA对平滑肌细胞钙化的影响

以小鼠主动脉平滑肌细胞(MASMCs)为研究对象，研究TA对其钙化的影响。前期采用CCK-8试剂盒测定TA对MASMCs的半数抑制浓度(IC₅₀)。按照试剂盒的常规操作方法，将细胞分为对照组和不同浓度TA干预组(200、 100、50、25、12.5、6.25、3.125μM)与MASMCs共孵育，根据吸光度计算细胞存活率。再通过GraphPad Prism 5软件计算出TA在MASMCs的IC₅₀。结果表明：TA对MASMCs的IC₅₀为13.47μM，所以选择使用6μM、8μM的 TA作为干预浓度，研究TA对MASMCs钙化的影响。

(1)小鼠主动脉平滑肌细胞钙化模型的建立

采用组织培养法从8周龄C57小鼠的胸主动脉中分离原代MASMCs，取对数期生长的2-5代MASMCs，将细胞分为Control组(对照组)和HG+β-GP 组(钙化组)。Control组细胞常规培养，HG+β-GP组在细胞融合至70％左右时，PBS冲洗3次后，换用钙化培养基(含5％胎牛血清DMEM/F12细胞培养基+35mM葡萄糖+10mMβ-磷酸甘油)培养14天，每2天换液一次。通过RT-qPCR检测BMP2、RUNX2、OPN mRNA的表达及茜素红染色鉴定钙化模型是否造模成功。

茜素红染色显示：与Control组相比，HG+β-GP组可观察到弥漫性分布的桔红色钙化结节，且细胞钙化面积是对照组的5.8倍(图1A，**P<0.01)。

与骨矿化相比，血管钙化是一个有组织且高度调控的过程，主要表现为血管平滑肌细胞成骨分化，由收缩表型向成骨表型转化。大量研究表明，Runx2、BMP2和OPN是成骨细胞重要的表型标志物，成骨细胞分化过程中，其表达通常上调。RT-qPCR检测结果表明：与Control组相比，HG+β-GP组中Runx2、BMP2和OPN的mRNA表达均明显升高(图1B，*P<0.05,**P<0.01)。

茜素红染色结果和成骨细胞表型标志物Runx2、BMP2和OPN表达的上调，表明小鼠主动脉平滑肌细胞钙化模型成功建立。

(2)TA减轻HG+β-GP诱导的MASMCs钙化

将细胞分为Control组、HG+β-GP组、HG+β-GP+6μM TA组、 HG+β-GP+8μM TA组、6μMTA组、8μM TA组，培养14天后，通过茜素红染色可以发现：与Control组相比，HG+β-GP组钙结节染色面积明显增加，在予以6μM、8μM的TA干预后，钙结节染色面积明显减少，且在HG+β-GP+8μM TA组中效果最明显，而单独予以6μM、8μM的TA对细胞钙结节沉积没有影响(图2A，*P<0.05,**P<0.01)。同时，通过RT-qPCR检测到HG+β-GP +6μM TA组和HG+β-GP+8μM TA组中Runx2、BMP2和OPN mRNA的表达较HG+β-GP组明显降低，同样也是在8μM的TA干预后效果最明显，而单独予以6μM、8μM的TA干预对钙化相关Runx2、BMP2和OPN mRNA的表达没有明显影响(图2B，*P<0.05,**P<0.01)，以上结果表明：TA可以减轻 HG+β-GP诱导的MASMCs钙化。

(3)TA通过激活自噬减轻HG+β-GP诱导的MASMCs钙化

自噬相关蛋白7(ATG7)是自噬形成过程中的关键蛋白，自噬从形成到降解整个过程都离不开ATG7的直接参与与调控。为了进一步探究TA是否通过激活自噬减轻HG+β-GP诱导的MASMCs钙化，通过向MASMCs转染沉默 ATG7表达的Smart Silencer转染体来抑制自噬，从而进一步观察TA对 MASMCs钙化的影响。

不转染和转染ATG7 siRNA的各组中，使用无双抗DMEM/F12细胞培养基进行培养的分别记作Control组和Control+siATG7组，使用无双抗的钙化培养基进行培养的分别记作HG+β-GP组和HG+β-GP+siATG7组，使用含8μM TA的无双抗钙化培养基组进行培养的分别记作HG+β-GP+8μM TA组和 HG+β-GP+8μM TA+siATG7组。测定钙化相关Runx2、BMP2和OPN mRNA的表达情况。

RT-qPCR结果表明:与HG+β-GP+8μM TA组相比，HG+β-GP+8μM TA+siATG7组中钙化相关Runx2、BMP2和OPN mRNA的表达明显增加(图 3A，P＜0.05)，表明抑制自噬能够降低TA对HG+β-GP诱导的MASMCs钙化的保护作用。

为了进一步验证这一结论，通过细胞免疫荧光实验再次观察抑制自噬后， TA对HG+β-GP诱导的MASMCs钙化相关蛋白Runx2、BMP2和OPN的表达情况影响。激发红色荧光的二抗与细胞内Runx2、BMP2和OPN特异性结合后荧光显微镜拍摄结果显示为红色，细胞核显示为蓝色。结果表明：与 HG+β-GP组相比，HG+β-GP+8μM TA组中钙化相关蛋白Runx2、BMP2和 OPN的表达明显降低，在此基础上敲除ATG7后，Runx2、BMP2和OPN的表达升高(图3B、3C、3D)。

上述实验证明，TA通过激活自噬减轻HG+β-GP诱导的MASMCs钙化。

实施例2

TA激活自噬机理及对细胞膜上L-型钙离子通道的激活作用

(1)TA通过细胞膜上L-型钙离子通道增加细胞内钙离子浓度促进自噬

既往研究表明，TA可以通过引起细胞内Ca²⁺浓度增加，诱导与AMP/ATP 有关的AMPK活化，从而激活自噬。为了进一步验证TA是否及通过何种途径增加细胞内钙离子浓度从而促进自噬，使用稳定表达自噬免疫荧光的GFP-LC3 U87细胞作为实验对象，在不同钙离子通道抑制剂Nifedipine(细胞膜L-型钙离子通道抑制剂)、2-APB(内质网膜IP3R钙离子通道抑制剂)、 Dantrolene(内质网膜RyR钙离子通道抑制剂)干预下，观察TA对自噬的影响。

免疫荧光结果显示：与Control组相比，8μM TA组能明显增加细胞 GFP-LC3荧光的表达，表明TA有较强的激活自噬的能力，然而在不同钙离子通道抑制剂共同干预下，只有8μM TA+1μM Nifedipine组能够抑制细胞 GFP-LC3荧光的表达，且在8μM TA+2μM Nifedipine组中效果更明显，而单独予以不同钙离子通道抑制剂Nifedipine、2-APB、Dantrolene干预，对细胞 GFP-LC3荧光的表达没有影响(图4A，**P<0.01，***P<0.001)，这表明 TA可能是通过细胞膜上L-型钙离子通道增加细胞内钙离子浓度促进自噬的。

为了进一步验证上述结论，通过细胞内钙离子检测试剂盒，动态观察在 TA和Nifedipine干预下MASMCs内钙离子浓度的变化情况。结果表明：在细胞外液没有钙离子存在的情况下，予以8μM TA干预不会导致MASMCs内钙离子浓度变化(图4B，**P<0.01，***P<0.001)。在细胞外液有钙离子存在的情况下，予以8μM TA干预导致MASMCs内钙离子浓度明显增加，在增加过程中再予以2μM Nifedipine干预后，能够明显抑制TA对MASMCs内钙离子浓度的促进作用(图4C，***P<0.001)，而提前予以2μM Nifedipine干预后，再予以8μM TA干预不会导致MASMCs内钙离子浓度的增加(图4D)。以上结果表明：TA具有激活细胞膜上L-型钙离子通道的作用，其通过细胞膜上L-型钙离子通道增加细胞内钙离子浓度促进自噬。

(2)TA通过诱导自噬从而减轻HG+β-GP诱导的MASMCs钙化

为研究TA是否是通过激活细胞膜L-型钙通道诱导自噬从而减轻 HG+β-GP诱导的MASMCs钙化，将MASMCs分为Control组、HG+β-GP组、 HG+β-GP+8μM TA组、HG+β-GP+8μM TA+2μM Nifedipine组、HG+β-GP+8μM TA+100μM 2-APB组、HG+β-GP+8μM TA+20μM Dantrolene组、2μM Nifedipine 组、100μM 2-APB组、20μM Dantrolene，培养72小时后，通过RT-qPCR检测钙化相关RUNX2、BPM2、OPN mRNA水平的表达。结果显示：与HG+β-GP 组相比，HG+β-GP+8μMTA组能明显减轻钙化相关RUNX2、BPM2、OPN mRNA水平的表达，而只有HG+β-GP+8μM TA+2μMNifedipine组较 HG+β-GP+8μM TA钙化相关RUNX2、BPM2、OPN mRNA水平的表达上升，而予以其他钙通道抑制剂2-APB和Dantrolene共同干预或者单独予以 Nifedipine、2-APB和Dantrolene干预均不能导致钙化相关RUNX2、BPM2、 OPN mRNA水平的表达升高(图5A,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)，说明只有L-型钙离子通道抑制剂Nifedipine能减轻TA对MASMCs钙化的保护作用。

为了进一步验证上述结论，将这些细胞分组干预14天后，进行茜素红染色分析，结果表明：与HG+β-GP组相比，HG+β-GP+8μM TA组钙结节染色面积明显减少，而予以2μMNifedipine干预后，钙结节染色面积较 HG+β-GP+8μM TA组增加，而予以其他钙通道抑制剂2-APB和Dantrolene共同干预或者单独予以Nifedipine、2-APB和Dantrolene干预均不能导致钙结节染色面积增加(图5B,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

以上结果表明：TA可以通过激活平滑肌细胞膜L-型钙通道诱导自噬从而减轻HG+β-GP诱导的MASMCs钙化。

三、动物实验

实施例3

动物实验验证TA对血管钙化的作用

(1)糖尿病小鼠血管钙化模型的建立

取造模后小鼠的主动脉血管进行组织钙含量/钙浓度检测，结果表明：与 Control组相比，糖尿病小鼠并注射Vit D(DM+VitD)组小鼠主动脉钙离子含量及浓度明显升高(图6B，**P<0.01)。通过组织Von Kossa染色，结果发现:与Control组相比，DM+VitD组小鼠钙化面积(黑色区域)明显增加(图 6C)。取两组小鼠主动脉弓血管进行组织免疫荧光染色，结果表明：DM+VitD 组主动脉RUNX2、BMP2、OPN蛋白表达较Control组明显升高(图7A、7B、7C)。这些结果表明糖尿病小鼠血管钙化模型诱导成功。

(2)TA减轻糖尿病小鼠主动脉中膜钙化

在对糖尿病小鼠进行诱导钙化的同时，将不同给药浓度的TA(低浓度 0.1mg/kg，高浓度0.2mg/kg)分别注射到小鼠体内，干预7天后，分别取Control 组、DM+VitD组、DM+VitD+0.1mg/kg TA组、DM+VitD+0.2mg/kg TA组小鼠主动脉血管进行组织钙离子检测，结果发现：与DM+VitD组相比， DM+VitD+0.1mg/kg TA组和DM+VitD+0.2mg/kg TA组主动脉钙离子含量及浓度明显降低，且在DM+VitD+0.2mg/kg TA组中效果最明显(图8A，*P<0.05， **P<0.01)。同时，取四组小鼠主动脉血管进行Von kossa染色和组织免疫荧光实验，结果表明：与DM+VitD组相比，DM+VitD+0.1mg/kg TA组和 DM+VitD+0.2mg/kg TA组主动脉钙化面积(黑色区域)明显减少(图8B， *P<0.05，**P<0.01)，钙化相关蛋白RUNX2、BMP2及OPN的表达明显降低(图9A、9B、9C，*P<0.05,**P<0.01)，同样在DM+VitD+0.2mg/kg TA 组中效果最明显。这说明TA能明显减轻糖尿病小鼠主动脉中膜钙化。

上述体外和体内实验结果表明：(1)TA具有激活细胞膜上L-型钙离子通道的作用，通过该途径促进细胞外液钙离子内流，增加细胞内钙离子浓度，从而激活自噬；

(2)TA通过激活平滑肌细胞膜L-型钙离子通道诱导自噬抑制糖尿病小鼠主动脉中膜钙化；

(3)TA可以减轻糖尿病小鼠主动脉中膜钙化。

最后需要说明的是，上述描述仅仅为本发明的优选实施例，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.Thonningianin A(TA)在制备作为L-型钙离子通道激活剂的药物中的应用，TA的结构如式(I)：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物用于预防或/和治疗人或动物血管钙化。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述血管钙化是由糖尿病引起或伴随糖尿病发生的。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述血管钙化发生于人或动物的动脉。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述血管钙化发生于人的股动脉、腘动脉、胫前动脉、胫后动脉。

6.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述血管钙化发生于具有平滑肌的血管壁中膜层。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述药物通过激活平滑肌细胞膜L-型钙离子通道诱导自噬来预防或/和治疗人或动物血管钙化。

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