CN111304200B - 一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络及其应用。本发明阐明了高脂血症大鼠种植体周围骨整合的机制，提供了一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络，即lnc MSTRG.97162.4－miR‑193a‑3p－ENTR1调控网络。研究表明miR‑139a‑3p基因的表达抑制高脂血症大鼠种植体周围骨整合，lnc MSTRG.97162.4基因、ENTR1基因的表达促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合，从而通过对转录前及转录后相关基因的调控，促进高脂血症大鼠种植体周围的骨整合，初步为临床高脂血症患者种植术提供一定的理论基础。

Description

一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络 及其应用

技术领域

本发明涉及一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

高脂血症是以血液中脂质水平升高为特点的代谢性疾病，发病率逐年升高，其与骨质疏松的相关性已在流行病学和实验研究中得到证实。研究发现，高脂血症可导致种植体周围新骨生成减少，种植体-骨结合界面的结合强度降低，但调控机制未见报道，因此探索高脂血症影响种植体-骨整合的具体机制，对于提高高脂血症患者种植牙的成功率来说至关重要。

非编码RNA(non-coding ribose nucleic acid,ncRNA)是一类不能翻译成蛋白质的RNA。ncRNA刚开始被认识是转录过程中产生的“垃圾”、“暗物质”，但是越来越多的证据表明它们在多种生理和病理过程中发挥重要的和多种多样的作用。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸单位的非编码RNA，以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控、转录后调控等方面调控基因的表达水平。有研究发现，lncH19和lncANCR在骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells，BMSCs)的成骨分化和骨形成中是必不可少的。miRNA是含有22个核苷酸的具有调控功能的非编码RNA，通过靶向结合mRNA3′非翻译区(3‘-untranslated region，3’-UTR)发挥多种生物学功能；多种研究亦表明，miRNA参与骨代谢的调节。例如，miR-138能够抑制人基质干细胞的成骨细胞分化；在小鼠体外，miR-103a靶向作用于Runt相关的转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)来抑制成骨分化和基质矿化；miR-29c-3p通过靶向下调蓬乱蛋白2的表达，抑制高脂环境下BMSCs的成骨分化。2011年，哈佛大学Pier教授提出竞争性内源RNA(ceRNA)的理念，即具有相同miRNA应答元件的转录物(mRNA、假基因转录物、lncRNA、cirRNA等)通过竞争性结合同种miRNA来调控各自的表达水平，从而影响细胞的功能。lncRNA作为竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA)或者“miRNA海绵”能够调节mRNA的翻译和稳定性。例如，通过上调lncTCONS_00041960可抑制下游miR-125a-3p、miR-204-5p的表达，进而促进Runx2的表达，从而促进BMSCs成骨分化；lncRNAMALAT1作为ceRNA，可以通过抑制miR-204的表达来增强Smad4的表达，来促进成骨分化；在人的BMSCs中，lncH19作为ceRNA，抑制miR-141和miR-22的表达，进而促进β-catenin的表达来促进成骨分化。

内体相关运输调节因子1(Endosome-associated-trafficking regulator 1，ENTR1)是重量为45kDa的蛋白。Hagemann研究证明，内源性ENTR1定位于细胞的早期或再循环内体，也有部分定位于胞浆，其在细胞分裂时表达增加，并最终成为中心体的组成部分。也有研究证明，ENTR1定位于原始纤毛的纤毛基底体。ENTR1复杂的定位使其功能及作用不明确。目前研究发现，ENTR1的功能主要包括以下几个方面：(1)囊泡运输和信号转导：ENTR1在细胞中的定位提示其潜在的运输功能；ENTR1通过WASH复合物的介导，与膜转运核心蛋白(Retromer)复合物结合，运输蛋白质；ENTR1也是靶向标记Retromer复合物内体的必需蛋白。(2)细胞凋亡：过表达的ENTR1可导致肿瘤坏死因子受体1的表达降低，对肿瘤坏死因子诱导的凋亡的抗性增加。(3)细胞分裂：ENTR1作为一种内体蛋白，通过与蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用，参与调节细胞的分裂。(4)其他：ENTR1可作为癌相关蛋白，是恶性间皮瘤的候选标记物；ENTR1还能够与影响克罗恩病的关键因子--含核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2相互作用等。

随着新一代高通量测序技术的诞生、发展及完善，RNA测序(RNA sequence)技术逐渐成为研究和分析基因表达的有效方法。与传统的聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)、基因芯片等技术相比，RNA测序技术不但能提供实验样本基因组的海量信息(包括已知和未知的转录本)，而且假阳性率低、可信度高，对于发现生理病理过程中的重要分子有一定的指导意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络，即lnc MSTRG.97162.4－miR-193a-3p－ENTR1调控网络，及其在制备促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络，其特征在于，所述调控网络为lnc MSTRG.97162.4－miR-193a-3p－ENTR1调控网络；

其中，lnc MSTRG.97162.4的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

miR-193a-3p的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

ENTR1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明通过研究发现，在高脂血症大鼠中，lnc MSTRG.97162.4基因、miR-193a-3p基因和ENTR1基因的表达会影响大鼠种植体周围的骨整合，其中miR-139a-3p基因的表达抑制高脂血症大鼠种植体周围骨整合，lnc MSTRG.97162.4基因、ENTR1基因的表达促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合。

上述ceRNA调控网络在制备促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合药物中的应用，其特征在于，所述应用为上述ceRNA调控网络的调节因子在制备促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合药物中的应用。

根据本发明优选的，所述ceRNA调控网络的调节因子包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、多肽、蛋白或慢病毒。

根据本发明优选的，所述药物在高脂血症大鼠中促进lnc MSTRG.97162.4基因的表达和/或促进ENTR1基因的表达和/或抑制miR-193a-3p基因的表达。

根据本发明优选的，所述药物含有有效剂量的上述ceRNA调控网络的调节因子。

根据本发明优选的，所述药物含有药学上可接受的载体。

本发明的技术特点和有益效果：

本发明从转录前和转录后的层面上，阐明了高脂血症大鼠种植体周围骨整合的机制，提供了一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络，即lncMSTRG.97162.4－miR-193a-3p－ENTR1调控网络，研究表明miR-139a-3p基因的表达会抑制高脂血症大鼠种植体周围骨整合，lnc MSTRG.97162.4基因、ENTR1基因的表达会促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合，即miR-139a-3p基因对高脂血症大鼠种植体周围骨整合的调控与lnc MSTRG.97162.4基因、ENTR1基因呈负相关，从而通过对转录前及转录后相关基因的调控，促进高脂血症大鼠种植体周围的骨整合，初步为临床高脂血症患者种植术提供一定的理论基础。

本发明以lnc MSTRG.97162.4－miR-193a-3p－ENTR1调控网络为基础，制备得到lnc MSTRG.97162.4过表达慢病毒载体、miR-193a-3p抑制表达慢病毒载体、ENTR1过表达慢病毒载体，用于促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合，在治疗高脂血症大鼠种植体周围骨整合中具有重要的意义。

附图说明

图1为大鼠种植体-骨结合界面在不同倍数显微镜下的硬组织切片染色图；图中，normal为对照组，HF group为实验组；

图2为大鼠种植体-骨结合界面在第二周和第四周的micro-CT三维重建模型图；图中，normal group为对照组，HF group为实验组；

图3为lnc MSTRG.97162.4基因与ENTR1蛋白的RNA-pull down实验western blot验证图；图中，GAPDH为内参蛋白，Input为阳性对照组，lnc 2.4为实验组，Antisense为阴性对照组；

图4为miR-139a-3p抑制表达慢病毒载体作用于高脂血症大鼠后lncMSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1、Runx2、ALP基因相对表达量的柱状图；图中，A为miR-193a-3p基因柱状图，B为lnc MSTRG.97162.4基因柱状图，C为ENTR1基因柱状图，D为ALP基因柱状图，E为Runx2基因柱状图；

图5为miR-139a-3p过表达慢病毒载体作用于高脂血症大鼠后lncMSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1、Runx2、ALP基因相对表达量的柱状图；图中，A为miR-193a-3p基因柱状图，B为lnc MSTRG.97162.4基因柱状图，C为ENTR1基因柱状图，D为ALP基因柱状图，E为Runx2基因柱状图；

图6为lnc MSTRG.97162.4过表达慢病毒载体作用于高脂血症大鼠后lncMSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1、Runx2、ALP基因相对表达量的柱状图；图中，A为lncMSTRG.97162.4基因柱状图，B为ALP基因柱状图，C为Runx2基因柱状图，D为ENTR1基因柱状图，E为miR-193a-3p基因柱状图；

图7为ENTR1抑制表达慢病毒载体作用与高脂血症大鼠后lnc MSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1、Runx2、ALP基因相对表达量的柱状图；图中，A为ENTR1基因柱状图，B为ALP基因柱状图，C为Runx2基因柱状图，D为lnc MSTRG.97162.4基因柱状图，E为miR-193a-3p基因柱状图；

图8为ENTR1过表达慢病毒载体作用于高脂血症大鼠后lnc MSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1、Runx2、ALP基因相对表达量的柱状图；图中，A为ENTR1基因柱状图，B为ALP基因柱状图，C为Runx2基因柱状图，D为lnc MSTRG.97162.4基因柱状图，E为miR-193a-3p基因柱状图；

图9为注射miR-139a-3p抑制表达慢病毒载体的大鼠硬组织切片不同倍数显微镜下的染色图；图中，A、B、C为注射miR-139a-3p抑制表达慢病毒载体的染色图，D、E、F为注射阴性对照液的染色图；

图10为注射miR-139a-3p过表达慢病毒载体的大鼠硬组织切片不同倍数显微镜下的染色图；图中，A、B、C为注射miR-139a-3p过表达慢病毒载体的染色图，D、E、F为注射阴性对照液的染色图；

图11为注射lnc MSTRG.97162.4过表达慢病毒载体的大鼠硬组织切片不同倍数显微镜下的染色图；图中，A、B、C为注射lnc MSTRG.97162.4过表达慢病毒载体的染色图，D、E、F为注射阴性对照液的染色图；

图12为注射ENTR1抑制表达慢病毒载体的大鼠硬组织切片不同倍数显微镜下的染色图；图中，A、B、C为注射ENTR1抑制表达慢病毒载体的染色图，D、E、F为注射阴性对照液的染色图；

图13为注射ENTR1过表达慢病毒载体的大鼠硬组织切片不同倍数显微镜下的染色图；图中，A、B、C为注射ENTR1过表达慢病毒载体的染色图，D、E、F为注射阴性对照液的染色图；

图14为注射miR-139a-3p慢病毒载体的大鼠种植体micro-CT三维重建模型图；图中，A为miR-139a-3p抑制表达慢病毒载体组，B为miR-139a-3p过表达慢病毒载体组，C为阴性对照液组；

图15为注射lnc MSTRG.97162.4过表达慢病毒载体的大鼠种植体micro-CT三维重建模型图；图中，A为lnc MSTRG.97162.4过表达慢病毒载体组，B为阴性对照液组；

图16为注射ENTR1慢病毒载体的大鼠种植体micro-CT三维重建模型图；图中，A为ENTR1抑制表达慢病毒载体组，B为阴性对照液组，C为ENTR1过表达慢病毒载体组，D为阴性对照液组；

图17为骨髓间充质干细胞成骨诱导后的ALP染色、茜素红染色和油红O染色图；

图18为lnc MSTRG.97162.4沉默慢病毒载体作用于BMSCs后lnc MSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1、Runx2、ALP基因相对表达量的柱状图；图中，A为lnc MSTRG.97162.4基因柱状图，B为ENTR1基因柱状图，C为miR-193a-3p基因柱状图，D为ALP基因柱状图，E为Runx2基因柱状图；

图19为转染lnc MSTRG.97162.4沉默慢病毒载体的BMSCs的ALP染色图；图中，A为转染lnc MSTRG.97162.4沉默慢病毒载体的染色图，B为转染无关序列慢病毒载体的染色图；

图20为miR-193a-3p慢病毒载体作用于对BMSCs后lnc MSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1、Runx2、ALP基因相对表达量的柱状图；图中，A为miR-193a-3p基因柱状图，B为lncMSTRG.97162.4基因柱状图，C为ENTR1基因柱状图，D为ALP基因柱状图，E为Runx2基因柱状图；

图21为转染miR-193a-3p慢病毒载体的BMSCs的ALP染色图；图中，A为转染miR-193a-3p过表达慢病毒载体的染色图，B为转染无关序列慢病毒载体的染色图，C为转染miR-193a-3p抑制表达慢病毒载体的染色图，D为转染无关序列慢病毒载体的染色图；

图22为ENTR1沉默慢病毒载体作用于BMSCs后lnc MSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1、Runx2、ALP基因相对表达量的柱状图；图中，A为ENTR1基因柱状图，B为lncMSTRG.97162.4基因柱状图，C为miR-193a-3p基因柱状图，D为ALP基因柱状图，E为Runx2基因柱状图；

图23为转染ENTR1沉默慢病毒载体的BMSCs的ALP染色图；图中，A为转染ENTR1沉默慢病毒载体的染色图，B为转染无关序列慢病毒载体的染色图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均按照常规操作进行；所涉及药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。若无特殊说明，实施例中的百分比均为质量百分比。

实施例1：动物模型建立

20只成年雄性Wistar大鼠按照随机数字表法，随机均分为对照组和实验组，分别给予普通饮食和高脂饮食。所有动物饲养于山东大学口腔医学院动物中心，确保室温在20-25℃，相对湿度在50％-65％，能自由饮水，环境相对安静。喂养8周后，禁食12小时，所有大鼠用玻璃毛细管在内眦静脉处取血0.5mL转移至EP管中。所有血样于冰盒中静置半小时后，放于4℃低温离心机中4000rpm离心10min。转移上清液至新的EP管中，检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)的水平。实验组大鼠的TC是对照组的2倍以上，且LDL显著高于对照组即认为高脂血症大鼠建模成功，进行后续实验并继续高脂饲料喂养。两组大鼠的血脂参数如表1：

表1：两组大鼠的血清脂质水平(mean±SD，单位：mmol/L).

注：*实验组和对照组有明显统计学差异(P<0.05)。

实施例2：种植体植入

实施例1中实验组高脂血症大鼠建模成功后，所有大鼠于双侧股骨干骺端行种植体植入术。术前、术中所用的所有器械高压蒸汽消毒灭菌后，放入烤箱中烤干。大鼠称重后，腹部用碘伏棉球消毒，按每100g注入0.3mL的10％水合氯醛进行腹腔注射麻醉。麻醉后，将大鼠的牙齿和四肢用棉线绑在手术板上，仰卧并固定于手术台上，在股骨干骺端处备皮、碘伏消毒、酒精脱碘、铺巾，在双侧股骨前内侧用11号手术刀片切开皮肤，做约2cm的全厚切口，钝性分离肌层和骨膜，充分暴露股骨干骺端。在生理盐水持续冲洗下，用简式种植机和FG 557钻针分别于距双侧股骨干骺端远心端5mm处，制备直径1.2mm、深度2.5mm的种植窝。将种植体手动旋入种植窝，分别采用4-0、5-0的缝线对位分层缝合肌肉和皮肤，并用酒精对创口进行消毒。术后3天内每只大鼠每天肌注头孢唑林钠20万μ。

术后，对照组和实验组大鼠继续分别给予普通饮食和高脂饮食。种植体植入后10天，所有大鼠注射10％水合氯醛麻醉。麻醉后，迅速分离肌肉和黏膜，暴露股骨干骺端，获得包含种植体的骨组织样本。两组各取4个样本置于4％多聚甲醛溶液中固定、50％至100％乙醇梯度脱水、浸塑液浸泡、聚甲基丙烯酸树脂包埋备用。其余样本，去除多余的肌肉组织和骨组织，并用焦炭酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)冲洗去除血水，获得包含种植体及其周围1mm的骨组织。将这些样本放于冻存管中，迅速置于液氮罐中保存。

实施例3：硬组织切片及染色

将实施例2经4％多聚甲醛溶液固定、50％至100％乙醇梯度脱水、浸塑液浸泡、聚甲基丙烯酸树脂包埋的样本进行硬组织切片及染色，步骤如下：

(1)将样本用硬组织切片机沿着种植体长轴切开，获得厚30μm的组织切片；

(2)将苏木素染液滴到切片上，染色10min后，用流水冲洗1min，去除多余染液；然后滴加伊红染液于切片上，染色3min后，用流水冲洗1min，去除多余染液；干燥后，用中性树胶封片。

将上述封片后的切片置于倒置显微镜下，观察种植体-骨结合界面情况，在40、100、200倍显微镜下显示：实验组种植体周围新骨形成明显少于对照组，骨质疏松(见图1)，说明高脂血症不利于种植体周围新骨的生成。

实施例4：种植体的micro-CT三维重建

将实施例2经4％多聚甲醛溶液固定、50％至100％乙醇梯度脱水、浸塑液浸泡、聚甲基丙烯酸树脂包埋的样本，通过Inveon micro-CT对骨种植体进行micro-CT分析，选取种植体周围0.5mm为选定分析区域，并通过COBRA-Exxim软件进行三维重建，以表征新形成的骨骼。结果如图2所示，种植体植入2周后，实验组较对照组种植体周围新形成骨骼增多，种植体植入4周后，实验组较对照组种植体周围新形成骨骼增多，说明高脂血症不利于种植体周围新骨形成。

实施例5：骨组织的RNA测序

将实施例2获得的骨组织提取总RNA后，进行RNA测序。

通过RNA测序技术筛选确定了389个差异表达的mRNA，770个差异表达lncRNA和7种差异表达circRNA，并通过GO分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes，KEGG)信号通路分析预测它们的功能。根据分析选择了9种与骨骼信息和高脂血症相关的mRNA及其相关的ncRNA，其中，随机选择了lncRNA lncRNA-MSTRG.97162.4、miR-193a-3p和ENTR1基因进行验证。

其中，lnc MSTRG.97162.4的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；miR-193a-3p的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；ENTR1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，ENTR1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

采用RNA-pull down实验验证miR-193a-3p基因与ENTR1蛋白的作用关系，westernblot验证结果如图3所示，说明miR-193a-3p基因可直接与ENTR1蛋白相结合。

实施例6：miR-193a-3p、lnc MSTRG.97162.4、ENTR1慢病毒载体在大鼠体内对种植体周围骨整合的作用

按照实施例1的方法构建高脂血症大鼠模型，随机均分3组，于种植体手术前3天在种植体植入部位分别肌肉注射miR-139a-3p抑制表达慢病毒载体、miR-139a-3p过表达慢病毒载体及LV16病毒阴性对照液，分别记为miR-139a-3p inhibitor组、miR-139a-3penhancer和对照组；注射lnc MSTRG.97162.4过表达慢病毒载体及LV17病毒阴性对照液，分别记为lnc MSTRG.97162.4enhancer和对照组；注射ENTR1抑制表达慢病毒载体、ENTR1过表达慢病毒载体及LV16和LV17病毒阴性对照液，分别记为ENTR1 inhibitor组、ENTR1enhancer组和对照组，种植体手术后10天，所有大鼠注射10％水合氯醛麻醉、处死，获得包含种植体及其周围1mm骨组织的样本。上述慢病毒载体均通过苏州吉玛基因股份有限公司购买获得。

取上述骨组织样本，采用RT-PCR检测lnc MSTRG.97162.4、miR-193a-3p、ENTR1及成骨相关因子Runx2、ALP的基因差异表达。miR-139a-3p inhibitor组与对照组的结果如图4所示，结果显示，miR-139a-3p inhibitor组miR-193a-3p基因表达下调，lncMSTRG.97162.4基因表达上调，ENTR1基因表达上调，Runx2、ALP基因表达上调，促进了高脂血症大鼠种植体周围骨整合。miR-139a-3p enhancer组与对照组的结果如图5所示，结果显示，miR-139a-3p enhancer组miR-193a-3p基因表达上调，lnc MSTRG.97162.4基因表达下调，ENTR1基因表达下调，Runx2、ALP基因表达下调，抑制了高脂血症大鼠种植体周围骨整合。lnc MSTRG.97162.4enhancer组与对照组的结果如图6所示，结果显示，lncMSTRG.97162.4enhancer组lnc MSTRG.97162.4基因表达上调，miR-193a-3p基因表达下调，ENTR1基因表达上调，Runx2、ALP基因表达上调，促进了高脂血症大鼠种植体周围骨整合。ENTR1 inhibitor组与对照组的结果如图7所示，结果显示，ENTR1 inhibitor组ENTR1基因表达下调，lnc MSTRG.97162.4基因表达下调，miR-139a-3p基因表达上调，Runx2、ALP基因表达下调，抑制了高脂血症大鼠种植体周围骨整合。ENTR1 enhancer组与对照组的结果如图8所示，结果显示，ENTR1 enhancer组ENTR1基因表达上调，lnc MSTRG.97162.4基因表达上调，miR-139a-3p基因表达下调，Runx2、ALP基因表达上调，促进了高脂血症大鼠种植体周围骨整合。

取上述各自对照组和miR-139a-3p inhibitor组、miR-139a-3p enhancer组、lncMSTRG.97162.4enhancer组、ENTR1 inhibitor组和ENTR1 enhancer组骨组织按照实施例3进行苏木素-伊红染色，进行形态学的观察。miR-139a-3p inhibitor组和对照组的染色结果如图9所示，结果显示，miR-139a-3p inhibitors组成骨细胞数量增多，新骨形成明显多于对照组；miR-139a-3p enhancer组和对照组的染色结果如图10所示，结果显示，miR-139a-3p enhancer组成骨细胞数量减少，新骨形成明显少于对照组，进一步证实miR-139a-3p基因抑制高脂血症大鼠种植体周围骨整合。lnc MSTRG.97162.4enhancer组和对照组的染色结果如图11所示，结果显示，lnc MSTRG.97162.4enhancer组成骨细胞数量增多，新骨形成明显多于对照组，进一步证实lnc MSTRG.97162.4基因促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合。ENTR1 inhibitor组和对照组的染色结果如图12所示，结果显示，ENTR1 inhibitor组成骨细胞数量减少，新骨形成明显少于对照组；ENTR1 enhancer组和对照组得染色结果如图13所示，结果显示，ENTR1enhancer组成骨细胞数量增多，新骨形成明显多于对照组，进一步证实ENTR1基因促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合。

取上述各自对照组和miR-139a-3p inhibitor组、miR-139a-3p enhancer组、lncMSTRG.97162.4enhancer组、ENTR1 inhibitor组和ENTR1 enhancer组骨组织按照实施例4进行micro-CT三维重建。miR-139a-3p inhibitor组、miR-139a-3p enhancer组和对照组的三维模型如图14所示，结果显示，miR-139a-3p inhibitor组种植体周围新骨增多，新骨形成明显多于对照组，miR-139a-3p enhancer组种植体周围新骨减少，新骨形成明显少于对照组，进一步证实miR-139a-3p基因抑制高脂血症大鼠种植体周围新骨形成。lncMSTRG.97162.4enhancer组和对照组的三维模型如图15所示，结果显示，lncMSTRG.97162.4enhancer组种植体周围新骨增多，新骨形成明显多于对照组，进一步证实lnc MSTRG.97162.4基因促进高脂血症大鼠种植体周围新骨形成。ENTR1 inhibitor组、ENTR1 enhancer组和对照组的三维模型如图16所示，结果显示，ENTR1 inhibitor组种植体周围新骨减少，新骨形成明显少于对照组，ENTR1 enhancer组种植体周围新骨增多，新骨形成明显多于对照组，进一步证实ENTR1基因促进高脂血症大鼠种植体周围新骨形成。

实施例7：骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养与能力鉴定

(1)BMSCs的获取、培养

采用全骨髓细胞贴壁培养法：取20天60g左右的Wistar大鼠，脱颈处死，浸泡消毒10min(放置于装有75％乙醇的烧杯中)，擦干，并移入超净工作台。剪开大鼠后腿区域皮肤，剥离组织，暴露骨面，取出双侧股骨，PBS缓冲液(含双抗)冲洗备用；提前准备体积分数为15％胎牛血清(FBS)的α-MEM完全培养基(含链霉素100mg/L，100U/mL)，用以冲洗股骨和胫骨骨髓腔，多次缓慢冲洗后，可观察到髓腔内发白，得原代BMSCs，置于5％CO₂、37℃恒温培养箱中传代培养。

(2)高脂成骨诱导液、普通成骨诱导液的配制

①在避光的条件下称取地塞米松0.00393g置于10mL离心管中、β-甘油磷酸钠0.206g和维生素C0.005 g同时置于另一个10mL离心管中；②将离心管移动至超净工作台内(避光操作)，加入2mL无水乙醇溶解地塞米松，再加入3mL 10％(体积分数)FBS的α-MEM培养液，并使用0.22μm过滤器过滤除菌，得到5mL的2×10^-3mol/L的地塞米松溶液；再取5μL置于15mL离心管中，并添加5mL 10％(体积分数)FBS的α-MEM培养液制得2×10^-6mol/L的地塞米松溶液；所配制的地塞米松溶液置于4℃冰箱避光保存，2周内用完；③用1mL移液器取②中所得避光保存的地塞米松溶液250μL加入到47.25mL 10％(体积分数)FBS的α-MEM培养液中；④取5mL10％(体积分数)FBS的完全培养液加入装有β-甘油磷酸钠及维生素C的离心管中，轻轻摇晃直至完全溶解，并用0.22μm过滤器过滤除菌，然后使用5mL移液器取2.5mL加入到③中所得的47.50mL溶液中，最后得到50mL普通成骨诱导液；⑤配制的普通成骨诱导液放置于4℃冰箱储藏，不超过1周。

使用高脂培养基替代α-MEM培养液重复上述步骤即可得到高脂成骨诱导液。高脂培养基为PYTHONBI品牌，货号AAPR156。

(3)BMSCs成骨诱导

取步骤(1)中传代培养的第三代细胞，将细胞随机分为实验组(高脂组)、对照组(正常组)，分别用步骤(2)配制的高脂成骨诱导液和普通成骨诱导液进行成骨诱导。

(4)BMSCs成骨成脂能力鉴定

成骨诱导第7、14、28天，分别进行ALP染色、茜素红染色和油红O染色，观察两组细胞成骨分化情况，染色结果如图17所示。ALP染色结果显示，实验组(图17B)ALP深染明显低于对照组(图17A)；茜素红染色结果显示，实验组(图17D)钙化结界明显少于对照组(图17C)；油红O染色结果显示，实验组(图17F)红色油滴明显多于对照组(图17E)；即高脂环境抑制BMSCs成骨分化。

实施例8：lnc MSTRG.97162.4慢病毒载体在BMSCs成骨分化过程中的作用

研究lnc MSTRG.97162.4慢病毒载体在BMSCs成骨分化过程中的作用，步骤如下：

将lnc MSTRG.97162.4沉默慢病毒载体和无关序列对照慢病毒载体转染BMSCs，转染后分组，分别记为si-lnc MSTRG.97162.4组和si-nc组，转染1天后进行高脂成骨诱导。

高脂成骨诱导结束后，采用RT-PCR检测miR-193a-3p，lnc MSTRG.97162.4，ENTR1，Runx2、ALP的基因差异表达，检测结果如图18所示，结果显示：si-lnc MSTRG.97162.4组lncMSTRG.97162.4基因表达下调，相应的ENTR1，Runx2、ALP基因表达下调，而miR-193a-3p基因表达上调，即lnc MSTRG.97162.4沉默慢病毒载体抑制高脂环境下BMSCs成骨分化。

ALP染色检测BMSCs成骨能力，检测结果如图19所示，结果显示：si-lncMSTRG.97162.4组ALP深染低于si-nc组，也说明lnc MSTRG.97162.4沉默慢病毒载体抑制高脂环境下BMSCs成骨分化。

实施例9：miR-193a-3p慢病毒载体在BMSCs成骨分化过程中的作用

研究miR-193a-3p慢病毒载体在BMSCs成骨分化过程中的作用，步骤如下：

将miR-193a-3p过表达慢病毒载体及其无关序列对照病毒载体转染BMSCs，转染后分组，分别记为miR-193a-3p-enhancer组和enhancer-nc组；将miR-193a-3p抑制表达慢病毒载体及其无关序列对照病毒载体转染BMSCs，转染后分组，分别记为miR-193a-3p-inhibitor组和inhibitor-nc组；转染1天后进行高脂成骨诱导。

高脂成骨诱导结束后，采用RT-PCR检测miR-193a-3p，lnc MSTRG.97162.4，ENTR1，Runx2、ALP的基因差异表达，检测结果如图20所示，结果显示：miR-193a-3p-enhancer组miR-193a-3p基因表达上调，相应的ENTR1，Runx2、ALP基因表达下调，而且lncMSTRG.97162.4基因表达下调；miR-193a-3p-inhibitor组的表达趋势则相反，即miR-193a-3p抑制表达慢病毒载体促进高脂环境下BMSCs成骨分化。

ALP染色检测BMSCs成骨能力，检测结果如图21所示，结果显示：miR-193a-3p-enhancer组ALP深染低于enhancer-nc组；相反，miR-193a-3p-inhibitor组ALP深染高于inhibitor-nc组，说明miR-193a-3p抑制表达慢病毒载体促进高脂环境下BMSCs成骨分化。

实施例10：ENTR1慢病毒载体在BMSCs成骨分化过程中的作用

研究ENTR1慢病毒载体在BMSCs成骨分化过程中的作用，步骤如下：

将ENTR1沉默慢病毒载体及其无关序列对照病毒载体转染BMSCs，转染后分组，分别记为si-ENTR1组和si-nc组；转染1天后进行高脂成骨诱导。

高脂成骨诱导结束后，采用RT-PCR检测miR-193a-3p，lnc MSTRG.97162.4，ENTR1，Runx2、ALP的基因差异表达，检测结果如图22所示，结果显示：si-ENTR1组ENTR1基因表达下调，相应的lnc MSTRG.97162.4，Runx2、ALP基因表达下调，而miR-193a-3p表达上调，即ENTR1沉默慢病毒载体抑制高脂环境下BMSCs成骨分化。

ALP染色检测BMSCs成骨能力，检测结果如图23所示，结果显示：si-ENTR1组ALP深染低于si-nc组，说明ENTR1沉默慢病毒载体抑制高脂环境下BMSCs成骨分化。

综上，本发明通过研究慢病毒表达载体对于大鼠以及骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨影响，发现骨整合lnc MSTRG.97162.4－miR-193a-3p－ENTR1调控网络中，miR-139a-3p基因的表达抑制高脂血症大鼠种植体周围骨整合，lnc MSTRG.97162.4基因、ENTR1基因的表达促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合，而且采用miR-139a-3p抑制表达慢病毒载体、lnc MSTRG.97162.4过表达慢病毒载体、ENTR1过表达慢病毒载体均可以促进高脂血症大鼠种植体周围的骨整合。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1988

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus

<400> 1

ctcacctaag ctgaaaaaac actgtgcact ttaatttccc gcctgtaacc ttgggccagc 60

tggagacagg gttttgaaat ctcagctata aagataccca gccaaagtct catcttgcct 120

taacaatgtt tcagagactg aataaaatgt ttgtaggtga agtcactact tcttccagcc 180

acgagccaga atttagtgag aaagaagatg atgagtggat tcttgttgac ttcataggta 240

aggcatatgc aacaattaat tgtcacaaga agtggcatcc agcaaactat gtatctgaca 300

ataatcttaa atactgttga ttctcctgcc ttcacttccc aagactgatt ataggcatac 360

cacagcacac ctggctcaga agtgggaact cctggggctg gaggaaggct gtcagttaag 420

tgcttctgca cacatatacc tacttcttag taccctcaaa catgaatgtg tacacacata 480

gacagaaaat gtgaactctt agtcagcact ttggtaggaa accctcatat gagcaacagg 540

aacccacagg gcttataata tgcttatttg ctagactaga aagtccaaag ccattcttca 600

atgtctgtgt aatggagaga ttggaaattg caactgttac aagcaaatgt aaatgcctgt 660

gtgagcacct gttaatatag tattgtcctt ttttctgtgt tgcgaccttg atgggtgact 720

ccacatatgc attgtgggtc acaatctaga tacctgcact ggtttctcag cagaagaaga 780

ggaggaagat gaagacattg gtgaagagtc ctcagcagag cacacttctg tcttctcctg 840

tttacctaca tctttggagt gcttggctga caccagcgat tcctgcttcc ttcagtttga 900

gtcctgtcca atggaggaga gctggttcat cactcctccc ccatgtttta cagcaggggg 960

attaaccact atcaaagtgg aaacaagtcc tatggaaaac cttctcattg aacatcccag 1020

catgtctgtc tatgctgtgc acaactcctg tcctggtctc agtgaagcta gctgtgggaa 1080

cgatgactat aactcaagtg gtcccagaat ggaagcccag agtgaactgg ggacgcacat 1140

tcactgctgt gttgcagcgc ttgctgctca ggcaaccttt ttggaacaac ccaagagttt 1200

tcgcccttcc cagtggataa aaggacacag tgaaagacag tctctgaaca gaaatggcct 1260

ccgtcgccag aaccttacca gggattacca cactcgacaa atgaagcaca gtggctgggt 1320

ggttcaccag ccctgcccac gccagtacaa ttactgagaa ggctgagtta tgttggttgg 1380

cttccttagg ttttgtgcat atgtattgga tgtatgtgca tacaatcaaa gtgctgcctc 1440

tttccagcca actgaagacc aatcgcttag tgtatcggtg tgtttagaca ctatcacaac 1500

cagatttttg tgctgtgtat cacaaaatgc cttgctcctg acaattactt ttaaaaaacc 1560

ttttcagaat atttttggaa acatatcaat acagtgacag tgtttggggt tgtctttaag 1620

tacaataagg tatatatata tatgagttag catcttaagg acatttctca ccccaagtat 1680

aagaataggc atcttctcaa tttcctttat tttgtattat ttaatctttt gtgtaagcaa 1740

aaatttattc tcagggtcag ccatatactt tattgaccag tacttgttag tcttttctgt 1800

atataatgag tacattttta cactaacacg agcattaaca ggtgattttt ttttttttgc 1860

catggatata atggaattaa tggctgaact tacctttgaa agaaaacttg acatatttct 1920

gtatgtatgg ttcctccccc cccccccaga ttaagtcatt gcagttcatt gtggaattca 1980

ggtacatt 1988

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus

<400> 2

aactggccta caaagtccca gt 22

<210> 3

<211> 6721

<212> DNA

<213> Rattus norvegicus

<400> 3

ggcgttcggc gcaggcttcc ggccggccgc gccggatgag gcaggggctg gcgacggcgt 60

tgtgggccat ggggccgcgg ccgggttagg gcgcggcgat gtcgggctac gcgcggcggc 120

agggcgcgcc cccactatcg cggacgcgga gcctcgtagt tcccgacggt gagcggcgcg 180

cggccggggc agggccgggg ggcgcgggcg gcggcggccc gcggtgaagc cgctctcgtt 240

gtcacttaca gctcctgcgt tctatgagcg ccggtcttgt ctcccccagc tagactgtga 300

acgcccccat ggcggggacc tgcaccccca gttcttcggc tttcggccga cgtttatgtg 360

ctatgtgccc agcccggtgc tggcttcggt aggagacaca ggtgagagtc ggggcgtcgg 420

ccagagtgcg gagctgggca gcgcggggag ccctccccac agcccgcccg ccggccccta 480

ggcaggaagg tcagtgcccg gtggagctcg gagaccactt cagcccaccg tattgggaga 540

ggccaggggc tggacctagg ggtctgcatt ccaccggcag ctgctcctag agcgcgcagg 600

agtgtgtagt ttactttgtc cagcctcagg agacagcctt ctagtcccag accagagcct 660

gtcagtggga gtcaggcgtc tatggtcttc acctccctgg acaaacgctg cagtcataaa 720

gcttgctgtg atcacggtga gctgacaatg tctttttgca gattttggct atggaaaggg 780

gaaatgtact aaacaaggcc cgtcgggagc ccatgagacg cgctttggag gtagagtagc 840

tcagtgcttc ttcttttctt cttcagacac ggtgccaggc agtggtctgg ccatgggctt 900

tcaggatgac agagtttaag ggggtatacc tggagcccaa aagaatactg gagatggacg 960

cccaaggatt gaagactgag tgtgagggca aaataattta taatgtcaga ggtgcctggg 1020

aggtggagag gcagcaggat acaagtcaca cagaagccca ctttactcag gctggcaccc 1080

acataagatg tggatgttat gagacccaca taagcaactg agtgtggtag gtgtggaggt 1140

agaggctggt caactagggt acttggagga aaggtcggag gaagggatgg catagagcag 1200

atctggcatc tcaggagctt tgcttttttt tttttttttt cttttctttt cttttctttt 1260

tttcggagct ggggactgaa cccagggcct tgcgcttgct aggcaaacgc tctaaccact 1320

gagctaaatc cccaaccccc tcaggagctt tgaatcccct acaggagtag ccttcagtcc 1380

acactgagtg tatggagtga agtcagcctg ggcacgtgac tcagaggtag ataagttacc 1440

tcattgtgga cggacccctg gacttgattt tcggctcagc atcttttgtt ctaaggaggc 1500

aagggttgtc tcagggcaac cacatggtga aaacctgcca gagtgggcct attctccaat 1560

ctggctgggc agctcacctc cctgttctgc agtgttcttt gagtcacagt tgaagtgtga 1620

tggtagcaca cgatgctggg ccctctcaca gtctctgtgg cctctgtcat ttcaggtgac 1680

aaacttgaag accttgaaga agccaatcca ttctccttca aagagttttt gaaaaccaag 1740

aacctcagcc tgtcaaaaga agacacagcc accagtcgaa tttacccgaa ggtacatctg 1800

ggaagctgtc agtggttgcc ttaaagaaag tctcttgtac cttacagctt tggaaactga 1860

ctcgagtgtg gggagcaaag caggacagac atggctgctg gtggagagac tgtgggtgga 1920

gcggccgctt ggcccctttg gtagaagaaa tgggccctct ttgtgggagc atagagaagg 1980

ccaagcattg gcttccagtc cgcagtgttt ctctccactg tttttaggag gcctcgaggc 2040

acccactggg actagaccac aactcccctg tctcccagcc catgggatat ggcctggaat 2100

atcagcagcc attttttgaa gacccaacaa gagccagcaa cctagaggag gatgaagagg 2160

acgggtggag cagagcctac ctgccgtctg ccgtggagca gactcactcc acgagagcca 2220

cgcagaactc atcgccctgt ggcacctacc tttccttctt ttccaacgcg tcagagctgg 2280

caggtcctga gtctttgccc ccatggacac tgagtgacac tgactccagg ctctccccag 2340

cgtctccagc tgggaatcct aatgtagact ttgcagctca tgaagaatcc ttaggggaca 2400

gacacctgcg gacgctgcag ttaagttacg aagcagtaag taagggcagt gtggcaccca 2460

acacagctga gcaatgtaga gaagagctgc agtcatctac ttcctgggtg gcctgggttc 2520

aatgccttgg acaagacagt tggtcgtatg atagcttgct gtagaattgc cctgaggagg 2580

ggctcgagat atagagagct cagtggtagt ttttcctagc acttggggag tcctaggtta 2640

gattctgaat gctccaaagt aagagaaaaa ggaatttctc catggagagc tctcccctag 2700

gttggttttg attgtgcaat tagtatagca ggcagacatg agctagaatg gatgaacggt 2760

ctattggaag tgctggctaa gagtcatcct gctgaatgcc ccacatgaag gaagactttg 2820

aaaccatagt cacctagaaa cattgaagtg tgtggccaca agtcatctct gttaagggct 2880

tgggggtgtt tccatttgac ctggggtgtt tatgttccag agctgggcat agacgtgcac 2940

aactgtcatc ccagcacttg gaaggtgaag gcagggggaa caagagttca aggccattct 3000

tagctacata ggagtaagtt agagggcaaa caaggctgca ggagatgctg cctcaaaaag 3060

atacttcatg gacaaacggg atgtgtcttc atggggccag ccctgccctg ccccgaatgc 3120

taaggttcca cctccagacc aacaaaagaa aatattccag gacagaagta tgttccgctt 3180

atgagggaga catactgtgt gtctaatgag gaattttttt tctctacagc tgaaagatga 3240

aaactctaag ctcagaagaa agctaagtga ggttcagagc ttctctgaaa ctcaaacaga 3300

aatgtatgta aacttgtagt taggtgtcac cttaaaaacc acctctacca ttcagggaac 3360

tcggttccaa gggctgaggg gcatagctgc ttgtcatcct taaatctaaa gcagcaaaca 3420

catcttcttg ttctgtttta gtctttttaa gacacaaatc agctgagttt tgtcttggtt 3480

ggcagacttg agaaaatggt atctgggcct tccacaggga gcatgaagct gggcggtcat 3540

tgctaccctg cggctgcctg aggcagcttc tccatccatg gctctagtgg gtctcaccgt 3600

tagtcaggct acagtgctgt tggaagcact cttggcaggg cctggagaac tcaactccat 3660

ttttccttac tgagggtgag gacgctcgaa cggaagttgg aggcgaagat gatcaaggaa 3720

gagagtgact tccatgacct ggagtcagta gtccagcaag tcgaacagaa cctcgaactg 3780

atgaccgtac ggagggctct gctctggggt ggtgggcagg ggacaggaag ctgcttcgaa 3840

ggagcatttg ttactgctgc cagagtccac aactggaccc tgcagtcagc aggcggccct 3900

caccgtgctg aatgtgcact gtggtaggcc agcataccct gatactgtaa gggttctctc 3960

tgagggtggg tggtccctga tgctggtgag cagagggagc ccaggtccaa ggggtggaca 4020

tcaatgggca gagtaatcag gaaggtagtt atagctcacg ctgtctgttg aggtaagtct 4080

cctgtatcaa cacagccttg gtgatgtgca ttgtgtttat gttttggggg ccacagaaac 4140

gggctgtaaa agcagaaaat catgtcatga agctgaaaca ggaagtaaat ttgctccagg 4200

taagtaaaga gaaagatttc gctgttactg tactttgtaa aagtctcata gatgtgagct 4260

cagggaggaa gaggtaatgt gagccaagcg tggcgatgtc tgcttctaat tgaagtattc 4320

aggcgtcaag gcaaaagggt agtcatccat ccgagggcag ccggggctac agggcaagaa 4380

gcacttgttt tgagtaggcc aggctcatcc catgcccatg cagtctgtgc cgttgtgata 4440

ctgtagcact gactactcac ccttccttct aggcacagct ctccaacttc aagcgagaaa 4500

acgaagccct tcggtcaggc cagggtgcca gccttaccgt ggtgaagcag aacaccgatg 4560

tggccttgca gaacctccat gttgtcatga acagtgcaca cgcatctata aagtgagtcc 4620

ctggggggct ggggatttag ctcagtggta gagcgcttac ctaggaagcg caaggccctg 4680

ggttcggtcc ccagctccga aaaaaagaac caaaaaaaaa aaaaagtgag tccctggatg 4740

gcctggctct cgggtgttcc agctctacag tctgactaga ccaagaaggg aaatgtgcta 4800

accggccagg tcagctagga agtcaagcac gtggtctcac ttcatagcac tgactggcct 4860

agaaccatat atgtagatta ggttgacctt gaactcacac gggtccttct gcctctacac 4920

tggagtgcta gaatttaaag gcatgcgtca cctcacctgg cttgtttttt ttgtttttgt 4980

ttgagacaaa gtctcctggt gtagccctgg tggctctggc actgtgtgta gagcaggcta 5040

gcctcagact catagatttc ctcttctatt tcccatgtcc tggaactgaa ggtatgcact 5100

atcataccat tttagggttt ttatttttaa tctgttccag agaaccttcc cactaataga 5160

tggcgaatga tgccaggact ctgaatccag ctcctttacc tgtagatgct gcagctctaa 5220

ctaaagggca tgatgtgact tccacagtga gcatactgtg tgctagttgt aacttccaca 5280

gtgagcaaac tgtgttctag ttgttgataa tggcagttaa acactcactg gagctgcagc 5340

tggtaaaggt gttgagatgt acctgattca tccaacccct ctgaggagaa agcacagtag 5400

tcctcctgcc agctctcctc atgactcgag gtgtggcctg cagtgactgc cgcccacatc 5460

actgagtact gcaccatcag cttggcctaa gcaaagagca aactcagaat cagttgctga 5520

tgaacttgtc tggcttccag cccaccttct ttggttgcct tccctgagct ttgctagagg 5580

gtggctggcc agtacacagc acatgggcct gaggacagtc acacatagtc cagtgtggca 5640

aaccatggtt gatctgagga gttttccctc tagcttctct cctttaggtc tgtctctggc 5700

tgcttttgca cagctggaat aatggccctg gtgtctctct gttttaggca gctggtgtct 5760

ggagcagaga cactgaacct tgttgctgaa atcctcaagt ctatcgacag aattactgaa 5820

gttaaggatg aggcagactc ttgagaacac gacctgccgc cgggtcccgg cacctctgca 5880

ccgatggcac cacacagctt ccaactgtgc tcctaactaa gcagtcctca ccaaaccatc 5940

tcacagccta agcacgtgac cgggcacctg cagtacaggg ctcctttcca ccggttgcac 6000

ctaacagttt acatgaagtc ctttggggaa gtcccactgt ttgatagact cactgattta 6060

ctggaagaca tttttataaa acccagcaat ttttagaaag cactaaagct gaaacaacag 6120

tttggtaaaa agctgcttcc actgtccctc agatttacta taggatgagc tcgggctcag 6180

ggccagtttt actaagcaga acactaagtg agccagtgtg gaagcgagca gcctgtacag 6240

gactcttgct gtcactctgc ctcacgaaca gacgttgaca ttgtggcctt cacggacggc 6300

tcctgctgtc agcagcctca ccgaggcagc accactcggt agatgctgct gtcctaccag 6360

gaccctagta ccaaagtcac agactgcatt gcagagcgtc acacacgcac tactctgggc 6420

taccagcttc gggaagccat ttgaggctgt tggttttgat gagtgttaat gtgtcagtgc 6480

atcttttgca tagtgcggtt cagactggaa ttagagcaca cacctacctg cctcaggtca 6540

gcaccagttc tttgggctgg ctggctggtt ttgaaggaca agcagacaaa agcagcaccc 6600

tgtgctgtgc tgaggggtca gggtttgggg accactttcc tatagatttt ttaaatttcc 6660

ctcttcccct cctgttgaga tcaacagctt tcttatctaa ataaatcttg aagatcattt 6720

a 6721

<210> 4

<211> 359

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 4

Met Ser Gly Tyr Ala Arg Arg Gln Gly Ala Pro Pro Leu Ser Arg Thr

1 5 10 15

Arg Ser Leu Val Val Pro Asp Gly Asp Lys Leu Glu Asp Leu Glu Glu

20 25 30

Ala Asn Pro Phe Ser Phe Lys Glu Phe Leu Lys Thr Lys Asn Leu Ser

35 40 45

Leu Ser Lys Glu Asp Thr Thr Thr Ser Arg Ile Tyr Pro Lys Glu Ala

50 55 60

Ser Arg His Pro Leu Gly Leu Glu His Ser Ser Pro Ala Ser Gln Leu

65 70 75 80

Met Gly Tyr Gly Leu Glu Ser Gln Gln Pro Phe Phe Glu Asp Pro Thr

85 90 95

Arg Ala Ser Asn Leu Glu Glu Asp Glu Asp Asp Gly Trp Asn Ile Thr

100 105 110

Tyr Leu Pro Ser Ala Val Asp Gln Thr His Ser Ser Arg Asp Thr Gln

115 120 125

Asp Ser Pro Pro Cys Asp Thr Tyr Leu Ser Phe Phe Ser Asn Ser Ser

130 135 140

Glu Leu Ala Cys Pro Glu Ser Leu Pro Pro Trp Thr Leu Ser Asp Thr

145 150 155 160

Asp Ser Arg Ile Ser Pro Ala Ser Pro Ala Gly Ser Pro Asn Ala Asp

165 170 175

Phe Ala Ala His Glu Glu Ser Leu Gly Asp Arg His Leu Arg Thr Leu

180 185 190

Gln Ile Ser Tyr Glu Ala Leu Lys Asp Glu Asn Ser Lys Leu Arg Arg

195 200 205

Lys Leu Asn Glu Val Gln Ser Phe Ser Glu Thr Gln Thr Glu Met Val

210 215 220

Arg Thr Leu Glu Arg Lys Leu Glu Ala Lys Met Ile Lys Glu Glu Ser

225 230 235 240

Asp Phe His Asp Leu Glu Ser Val Val Gln Gln Val Glu Gln Asn Leu

245 250 255

Glu Leu Met Thr Lys Arg Ala Val Lys Ala Glu Asn His Val Leu Lys

260 265 270

Leu Lys Gln Glu Ile Asn Leu Leu Gln Ala Gln Leu Ser Asn Leu Arg

275 280 285

Arg Glu Asn Glu Ala Leu Arg Ser Gly Gln Gly Ala Ser Leu Ser Val

290 295 300

Val Lys Gln Asn Thr Asp Val Ala Leu Gln Asn Leu His Leu Val Met

305 310 315 320

Asn Ser Ala His Ala Ser Ile Lys Gln Leu Val Ser Gly Ala Asp Thr

325 330 335

Leu Asn Leu Val Ala Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Arg Ile Ser Glu

340 345 350

Val Lys Asp Glu Val Asp Ser

355

Claims (5)

1.一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络，其特征在于，所述调控网络为lnc MSTRG.97162.4－miR-193a-3p－ENTR1调控网络；

其中，lnc MSTRG.97162.4的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

miR-193a-3p的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

ENTR1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的ceRNA调控网络在制备促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合药物中的应用，其特征在于，所述应用为权利要求1所述的ceRNA调控网络的调节因子在制备促进高脂血症大鼠种植体周围骨整合药物中的应用，所述药物在高脂血症大鼠中促进lncMSTRG.97162.4基因的表达和/或促进ENTR1基因的表达和/或抑制miR-193a-3p基因的表达。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ceRNA调控网络的调节因子包括：核酸分子、碳水化合物、脂类、多肽、蛋白或慢病毒。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物含有有效剂量的权利要求3所述的ceRNA调控网络的调节因子。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物含有药学上可接受的载体。

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