CN106148520A - Macf1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用 - Google Patents

Macf1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106148520A
CN106148520A CN201610530383.2A CN201610530383A CN106148520A CN 106148520 A CN106148520 A CN 106148520A CN 201610530383 A CN201610530383 A CN 201610530383A CN 106148520 A CN106148520 A CN 106148520A
Authority
CN
China
Prior art keywords
macf1
osteoporosis
gene
diagnosis
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610530383.2A
Other languages
English (en)
Inventor
骞爱荣
胡丽芳
印崇
赵帆
陈志浩
张琰
马剑华
苏佩红
李迪杰
仇伍霞
马小莉
王牌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwestern Polytechnical University
Original Assignee
Northwestern Polytechnical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwestern Polytechnical University filed Critical Northwestern Polytechnical University
Priority to CN201610530383.2A priority Critical patent/CN106148520A/zh
Publication of CN106148520A publication Critical patent/CN106148520A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用，用于解决现有MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中无应用的技术问题。技术方案是包括MACF1基因的序列和MACF1蛋白的氨基酸序列。所述诊断骨质疏松症的产品包括：用real time PCR、免疫检测、芯片诊断骨质疏松症的产品。所述治疗骨质疏松症的药物包括：编码功能性MACF1蛋白的核酸试剂。本发明通过给老龄骨质疏松小鼠注射MACF1重组质粒，表明增加MACF1的表达对骨质疏松有治疗效果，为骨质疏松症诊断和治疗提供标记分子与新靶点，提高了骨质疏松症诊断和治疗的准确性。

Description

MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物 中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用。
背景技术
骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的疾病，目前已成为全球发病率、致残率及病死率较大的疾病之一，是世界范围的一个健康问题。骨质疏松症具有发病率高、涉及人群广等特点。特别对于老年人、绝经后妇女、长期卧床病人以及空间失重环境工作人员(如，航天员)，骨质疏松或骨质流失引起骨密度下降、骨组织微结构改变、脆性增加，导致容易发生骨折或诱发其他疾病，严重影响人们的健康与生活。骨质疏松症的发生是多种因素综合作用的结果。目前研究表明，成骨细胞分化能力下降导致骨形成减少是骨质疏松症发生的重要原因之一。
随着分子生物学技术的快速发展，基因诊断与治疗逐渐应用于临床疾病治疗中。
文献1“Wu GP,He XC,Hu CB,Li DP,Yang ZH,Guo L,Effect ofelectroporation-mediated transfecting recombinant plasmid pIRES-hBMP2-hVEGF165 on mandibular distraction osteogenesis,Ann Plast Surg.69(2012)316-325.”报道了采用电穿孔技术将pIRES-hBMP2-hVEGF165重组质粒转染入兔子下颌牵张区域，研究骨形态生成蛋白BMP2与血管内皮生长因子VEGF对骨生成的影响，结果表明，pIRES-hBMP2-hVEGF165重组质粒诱导了骨形成。
文献2“Osawa K,Okubo Y,Nakao K,Koyama N,Bessho K,Osteoinduction byrepeat plasmid injection of human bone morphogenetic protein-2,J Gene Med.12(2010)937-944”报道了向小鼠骨骼肌注射编码人BMP-2的质粒，结果发现，通过注射编码人BMP-2的质粒引起了骨形成。
上述方法均采用重组质粒注射表明骨形态生成蛋白BMP2可以诱导骨形成，但均未用于对骨质疏松的治疗与检测，而且文献2是从骨骼肌进行注射，很可能会引起异位成骨，不利于对骨骼疾病的治疗。
微管微丝交联因子1(microtubule actin crosslinking factor 1，MACF1)，又名ACF7(Actin crosslinking factor 7)，是一种新的细胞骨架交联分子，定位于人1p31-32上，在调节细胞迁移、细胞极化、细胞粘附、细胞信号转导、蛋白质运输等多种生物学功能中起重要作用。本课题组研究发现MACF1具有促进成骨细胞分化的重要作用。
尚未见到有关MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中应用的报道。
发明内容
为了克服现有MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中无应用的不足，本发明提供一种MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用。该应用包括MACF1基因的序列和MACF1蛋白的氨基酸序列。所述诊断骨质疏松症的产品包括：用real time PCR、免疫检测、芯片诊断骨质疏松症的产品。所述治疗骨质疏松症的药物包括：编码功能性MACF1蛋白的核酸试剂。该MACF1基因及其表达产物可作为骨质疏松症诊断的标记分子和治疗的新靶点，提高了骨质疏松症诊断和治疗的准确性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：一种诊断和治疗骨质疏松症药物，其特点是：至少包括一对特异性扩增MACF1基因的引物。正向引物：5'-AACCAAGGCAACCCATTCTT-3'；反向引物：5'-ACTCTGCTCGCTCCAGTTTC-3'。
一种采用免疫检测诊断骨质疏松症的药物包括：与MACF1蛋白特异性结合的抗体。
一种采用芯片诊断骨质疏松症的药物包括：基因芯片和蛋白芯片。其中基因芯片包括与MACF1基因的核酸序列杂交的探针，蛋白芯片包括与MACF1蛋白特异性结合的抗体。
一种采用编码功能性MACF1蛋白的核酸试剂治疗骨质疏松症的药物包括：含有MACF1基因序列的重组质粒。
一种MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用，其特点是包括以下步骤：
(1)设计MACF1基因特异性引物序列5'-AACCAAGGCAACCCATTCTT-3'，5'-ACTCTGCTCGCTCCAGTTTC-3'，并合成制备以获得MACF1基因特异性引物；
(2)MACF1基因特异性引物用于骨质疏松检测：收集骨质疏松症患者骨组织样本，构建老龄骨质疏松小鼠模型并收集骨组织样本，检测MACF1在上述骨组织样本中的表达量，证实MACF1在人骨质疏松患者骨组织样本与小鼠骨质疏松骨组织样本中均显著低表达。
MACF1基因特异性引物是一种用于诊断人骨质疏松症等骨骼系统相关疾病的标志基因，能应用于制备检测骨组织中MACF1基因表达水平的人骨骼系统相关疾病的检测试剂盒、试纸、芯片以及real time PCR。
(3)MACF1重组质粒在骨质疏松治疗中的应用：采用体外转染方法将MACF1重组质粒转染到小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中，通过real time PCR实验、MTT实验与ALP染色实验检测MACF1高表达对前成骨细胞增殖与成骨分化能力的影响，证实MACF1高表达可促进前成骨细胞增殖与成骨分化。进一步采用体内转染方法将MACF1重组质粒注射入18月龄C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，采用microCT检测MACF1高表达对股骨骨密度与骨组织微结构的影响，证实MACF1高表达增加了老龄鼠骨密度，并改善骨组织微结构。
MACF1基因及其表达产物能够用于制备诊断和治疗骨质疏松症等骨骼疾病的药物及药物组合物。上述药物及药物组合物包括药学上的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂、崩解剂；并包括制备药物组合物的不同添加剂，如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
本发明的有益效果是：该应用包括MACF1基因的序列和MACF1蛋白的氨基酸序列。所述诊断骨质疏松症的产品包括：用real time PCR、免疫检测、芯片诊断骨质疏松症的产品。所述治疗骨质疏松症的药物包括：编码功能性MACF1蛋白的核酸试剂。本发明通过给老龄骨质疏松小鼠注射MACF1重组质粒，表明增加MACF1的表达对骨质疏松有治疗效果，为骨质疏松症诊断和治疗提供标记分子与新靶点，提高了骨质疏松症诊断和治疗的准确性。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
附图说明
图1是本发明采用real time PCR检测老龄性骨质疏松症患者骨组织中MACF1基因表达的结果图。v.s.65岁组，***P<0.001。
图2是本发明采用real time PCR检测老龄性骨质疏松症患者骨组织中骨形成标志基因表达的结果图。A:Runx2表达结果图；B:Bglap表达结果图。v.s.65岁组，*P<0.05，***P<0.001。
图3是本发明采用real time PCR检测MACF1在老龄性骨质疏松小鼠骨组织中表达的结果图。***P<0.001。
图4是本发明采用real time PCR检测老龄性骨质疏松小鼠骨组织中骨形成标志基因表达的结果图。A:ALP表达结果图；B:Bglap表达结果图。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图5是本发明采用real time PCR检测MACF1低表达对前成骨细胞中成骨分化基因表达影响的结果图。A:ALP表达结果图；B:Runx2表达结果图。**P<0.01，***P<0.001。
图6是本发明MACF1重组质粒转染前成骨细胞MC3T3-E1增加细胞中MACF1表达的结果图。v.s.对照组，*P<0.05。
图7是本发明采用MTT检测MACF1高表达对前成骨细胞增殖影响的结果图。
图8是本发明MACF1高表达对前成骨细胞碱性磷酸酶活性影响的结果照片。
图9是本发明MACF1高表达对前成骨细胞中成骨分化标志基因Runx2表达影响的结果图。v.s.对照组，*P<0.05。
图10是本发明采用microCT检测MACF1高表达对老龄性骨质疏松小鼠骨组织微结构影响的结果照片。
图11是采用专用骨骼分析软件分析MACF1高表达对老龄性骨质疏松小鼠骨骼影响的结果图。A:骨矿物密度分析结果图；B:骨矿物含量分析结果图。v.s.对照组，*P<0.05。
具体实施方式
以下实施例参照图1-11。
实施例1。MACF1在老龄性骨质疏松症患者骨组织中的表达情况。
采用real time PCR检测老龄性骨质疏松症患者骨组织中MACF1基因的表达。
(1)设计并制备人源MACF1基因的特异性引物，序列如下：
正向引物：5'-AACCAAGGCAACCCATTCTT-3'(SEQ ID No.3)；
反向引物：5'-ACTCTGCTCGCTCCAGTTTC-3'(SEQ ID No.4)。
引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
(2)老年性骨质疏松患者骨组织样本收集。
分别选择60-70岁(65岁组)和80-95岁(90岁组)不伴有影响骨代谢疾病及其他严重疾病的骨质疏松症骨折患者进行骨组织样本收集，所收集样本为骨折患者手术切除标本，所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。所收集样本立即于RNA保护剂中保存，并于-80℃冰箱内保存。
(3)骨组织样本RNA的提取。
取所收集的骨组织样本，剥离干净肌肉，用液氮研磨骨组织，待研磨充分后，转移到1.5ml EP管，加入1ml TRIzol试剂(Invitrogen公司)，震荡仪混匀。4℃，12000g离心20min，取上清，转移到新的1.5ml EP管。每1ml TRIzol加入200μl的氯仿，用手上下震荡15s，室温放置2-3min。4℃，12000g离心15min，取上层水相转移到新的1.5ml EP管中，加入4℃预冷的异丙醇(500μl/1ml TRIzol)，轻轻吹打混匀，-20℃冰箱静置30min，沉淀RNA。4℃，12000g离心10min，移去上清，缓慢沿管壁加入1ml 75％乙醇，小心地吹打混匀。4℃，7500g离心10min，移去上清，室温干燥沉淀10-20min，但不可完全干燥。加入20-50μl无RNase水溶解RNA(根据沉淀多少确定加水量)。
(4)骨组织样本RNA纯度与完整性检测。
取上述提取所得RNA样品2μl，用紫外分光光度计检测RNA样品在260nm和280nm处的吸光值，根据A260/A280比值确定所得RNA的纯度，同时检测得到RNA的浓度。另取5μl RNA样品，与上样缓冲液混合，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，采用凝胶成像系统观察，出现28S、18S与5S条带，且28S条带亮度约为18S条带的2倍，5S条带较弱，表明RNA完整性良好。经上述RNA纯度与完整性检测后，采用所获得RNA进行后续实验或放置在-80℃冰箱保存。
(5)Real time PCR检测骨组织中MACF1基因表达。
首先采用RT reagent kit(TAKARA)将以上获得总RNA反转录成cDNA，操作按说明书进行，反转录条件为：37℃，15min；85℃，15s。之后采用PremixEx TaqTM II试剂(TAKARA)进行real time PCR检测MACF1在不同年龄的老龄性骨质疏松症患者骨组织中的表达情况，以GAPDH为内参，操作按试剂说明书进行，real time PCR反应条件为：95℃，30s，95℃，10s，60℃，30s，共44个循环。所用MACF1基因引物序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，GAPDH引物序列如下：
GAPDH Forward Primer：5'-CCTCTGACTTCAACAGCGAC-3'；
GAPDH Reverse Primer：5'-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3'。
参照图1，结果表明，随着老龄性骨质疏松症患者年龄的增加，MACF1基因表达明显下降，与65岁组相比，90岁组骨组织中MACF1的表达量下降了72％。
实施例2。老龄性骨质疏松症患者骨组织中骨形成标志基因的表达。
采用real time PCR检测老龄性骨质疏松症患者骨组织中骨形成标志基因runt-related transcription factor 2(Runx2)和骨钙素基因(Bglap)的表达。
骨组织RNA提取方法同实施例1中RNA样品的制备方法。将所提取总RNA反转录成cDNA，操作按说明书进行，反转录条件为：37℃，15min；85℃，15s。取各组的cDNA作为模板，以GAPDH作为内参，采用Premix Ex TaqTM II试剂(TAKARA)进行real time PCR检测Runx2、Bglap的表达，real time PCR反应条件为：95℃，30s，95℃，10s，60℃，30s，共44个循环。所用Runx2、Bglap与GAPDH引物序列如下：
Runx2Forward Primer：5'-GCCTTCAAGGTGGTAGCCC-3'；
Runx2Reverse Primer：5'-CGTTACCCGCCATGACAGTA-3'；
Bglap Forward Primer：5'-GAAGCCCAGCGGTGCA-3'；
Bglap Reverse Primer：5'-CACTACCTCGCTGCCCTCC-3'；
GAPDH Forward Primer：5'-CCTCTGACTTCAACAGCGAC-3'；
GAPDH Reverse Primer：5'-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3'。
参照图2，从图中可以看出，随着老龄性骨质疏松症患者年龄的增加，骨形成标志基因Runx2和Bglap的表达均明显下降，相对于65岁组，90岁组骨组织中Runx2和Bglap的表达分别下降了26％和93％。
实施例3。MACF1基因在老龄性骨质疏松小鼠骨组织中的表达。
(1)建立老龄骨质疏松小鼠模型。
选用C57BL/6小鼠，饲养至15月龄、17月龄、21月龄，分别取相应时间点的小鼠，脱颈处死小鼠，收集胫骨样本，-80℃冰箱保存。
(2)提取小鼠胫骨样本RNA，采用real time PCR对不同年龄小鼠骨组织中MACF1基因表达进行检测。
骨组织RNA提取方法同实施例1中RNA样品的制备方法。将所提取总RNA反转录成cDNA，操作按说明书进行，反转录条件为：37℃，15min；85℃，15s。取各组的cDNA作为模板，以GAPDH作为内参，采用Premix Ex TaqTM II试剂(TAKARA)进行real time PCR检测MACF1基因表达，real time PCR反应条件为：95℃，30s，95℃，10s，60℃，30s，共44个循环。所用MACF1与GAPDH引物序列如下：
MACF1Forward Primer：5'-GAAAACATTCACCAAGTGGGTCAAC-3'；
MACF1Reverse Primer：5'-TGTCCATCCCGAAGGTCTTCATAG-3'；
GAPDH Forward Primer：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'；
GAPDH Reverse Primer：5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'。
参照图3，从图中可以看出，随着小鼠年龄的增加，MACF1基因表达明显下降且呈现年龄依赖下降趋势。与15月龄组相比，17月龄组骨组织中MACF1表达下降63％，而21月龄组骨组织中MACF1表达则下降87％。
实施例4。老龄性骨质疏松小鼠骨组织中骨形成标志基因的表达。
采用real time PCR对15月龄，17月龄，以及21月龄C57BL/6小鼠骨组织中骨形成标志分子碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和骨钙素基因(Bglap)表达进行检测。
骨组织RNA提取方法同实施例1中RNA样品的制备方法。将所提取总RNA逆转录为cDNA，操作按说明书进行，反转录条件为：37℃，15min；85℃，15s。
取各组的cDNA作为模板，以GAPDH作为内参，采用real time PCR检测ALP与Bglap基因表达，real time PCR反应条件为：95℃30s，变性；95℃10s；60℃30s，44个循环。所用ALP、Bglap与GAPDH引物序列如下：
ALP Forward Primer：5'-GTTGCCAAGCTGGGAAGAACAC-3'；
ALP Reverse Primer：5'-CCCACCCCGCTATTCCAAAC-3'；
Bglap Forward Primer：5'-GAACAGACTCCGGCGCTA-3'
Bglap Reverse Primer：5'-AGGGAGGATCAAGTCCCG-3'
GAPDH Forward Primer：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'；
GAPDH Reverse Primer：5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'。
参照图4，结果表明，随着小鼠年龄的增加，ALP与Bglap基因表达明显下降且呈现年龄依赖下降趋势。
实施例5。MACF1低表达对前成骨细胞分化能力的影响。
以MACF1低表达前成骨细胞为研究对象，采用real time PCR检测MACF1低表达对前成骨细胞中成骨标志基因ALP和Runx2表达的影响。
分别取对照组细胞，MACF1低表达前成骨细胞，以1×104个/cm2的细胞数接种于6孔板中，每组设3个复孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48小时。之后，将细胞培养基更换为诱导成骨分化培养基(α-MEM添加10％FBS、50μg/ml维生素C与10mMβ甘油磷酸钠)诱导细胞成骨分化，每2天更换培养基，分别在诱导分化1天、7天、14天、21天时取出细胞，采用TRIzol裂解细胞，并采用氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总RNA，将所提取mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件为：42℃，30min；85℃，10min。取各组细胞的cDNA作为模板，以GAPDH作为内参，采用real time PCR检测ALP、Runx2基因表达。所用ALP、Runx2与GAPDH引物序列如下：
ALP Forward Primer：5'-GTTGCCAAGCTGGGAAGAACAC-3'；
ALP Reverse Primer：5'-CCCACCCCGCTATTCCAAAC-3'；
Runx2 Forward Primer：5'-TGCACCTACCAGCCTCACCATAC-3'
Runx2 Reverse Primer：5'-GACAGCGACTTCATTCGACTTCC-3'
GAPDH Forward Primer：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'；
GAPDH Reverse Primer：5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'；
Real time PCR反应条件：95℃，30s，95℃，10s，58℃或60℃，30s，72℃，5s，40个循环。
参照图5，从图中可以看出，与对照组相比，MACF1低表达明显抑制成骨分化标志基因ALP与Runx2的表达，表明，MACF1低表达抑制了成骨分化。
实施例6。采用MACF1重组质粒转染前成骨细胞。
以MC3T3-E1前成骨细胞为研究对象，采用电穿孔技术将MACF1重组质粒转染至MC3T3-E1前成骨细胞，从而使MC3T3-E1前成骨细胞高表达MACF1。
(1)实验分组：实验分为对照组与MACF1重组质粒组，其中对照组采用电穿孔转染空质粒PEGFP-C1A；MACF1重组质粒组采用电穿孔转染MACF1全长cDNA质粒PEGFP-C1A-ACF7，所有组的细胞数量及培养条件均相同。
(2)细胞RNA提取及real time PCR检测。
细胞转染48小时后，采用TRIzol裂解细胞，并采用氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总RNA，将所提取mRNA逆转录为cDNA，使用TAKARA试剂盒(DRR037A)。逆转录条件为：37℃，15min；85℃，15s。取各组细胞的cDNA作为模板，以GAPDH作为内参，采用real time PCR检测MACF1的基因表达。所用MACF1与GAPDH引物序列如下：
MACF1 Forward Primer：5'-GAAAACATTCACCAAGTGGGTCAAC-3'；
MACF1 Reverse Primer：5'-TGTCCATCCCGAAGGTCTTCATAG-3'；
GAPDH Forward Primer：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'；
GAPDH Reverse Primer：5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'；
Real time PCR反应条件为：95℃30s，95℃，10s，60℃，30s，44个循环。
参照图6，结果表明，与对照组相比，MACF1重组质粒组前成骨细胞中MACF1表达水平显著增加，较对照组增加了74％。
实施例7。MACF1高表达对前成骨细胞增殖的影响。
(1)实验分组：实验分为对照组与MACF1重组质粒组，其中对照组采用电穿孔转染空质粒PEGFP-C1A；MACF1重组质粒组采用电穿孔转染MACF1全长cDNA质粒PEGFP-C1A-ACF7，所有组的细胞数量及培养条件均相同。
(2)MTT法检测MACF1高表达对前成骨细胞增殖的影响。
选取对照组与MACF1重组质粒组细胞，每组细胞设2个复孔，以2×104个/孔的细胞数接种于24孔板中。分别在转染6小时、30小时、54小时、78小时后取出细胞，向每孔细胞中加MTT溶液(5mg/ml，PBS配制，pH 7.4)200μl，置于细胞培养箱中继续培养，4小时后，小心吸弃孔内培养基，每孔加入1ml DMSO，震荡10min，使紫色甲臜充分溶解后，每孔取200μl溶液转移至96孔板中。采用多功能酶标仪，490nm波长处测定每孔细胞光吸收值。
参照图7，与对照组相比，转染30小时、54小时、78小时后，MACF1重组质粒组前成骨细胞数量均明显增加，表明，MACF1高表达显著促进前成骨细胞MC3T3-E1的增殖。
实施例8。MACF1高表达对前成骨细胞分化的影响。
分别采用BCIP/NBT碱性磷酸酶染色法与real time PCR检测MACF1高表达对前成骨细胞分化的影响。
(1)BCIP/NBT碱性磷酸酶染色法检测前成骨细胞碱性磷酸酶活性。
将MC3T3-E1前成骨细胞随机分为2组，1组细胞转染空质粒PEGFP-C1A(对照组)，另1组细胞转染MACF1全长cDNA质粒PEGFP-C1A-ACF7(MACF1重组质粒组)，每组细胞设3次重复实验。转染48小时后，以0.8×104个/孔的细胞数接种于96孔板中，接种24小时后，采用BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天)对细胞进行染色，检测细胞碱性磷酸酶活性。
参照图8，从图中可以看出，与对照组相比，MACF1重组质粒组前成骨细胞中ALP活性明显增加，表明，MACF1高表达可促进成骨细胞分化。
(2)Real time PCR检测前成骨细胞中成骨分化标志基因Runx2的表达。
细胞培养与转染如实施例6所述，转染48小时后，采用TRIzol裂解细胞，并采用氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总RNA，将所提取mRNA逆转录为cDNA，使用TAKARA试剂盒(DRR037A)。逆转录条件为：37℃，15min；85℃，15s。
取各组细胞的cDNA作为模板，以GAPDH作为内参，采用real time PCR检测Runx2基因表达。所用Runx2与GAPDH引物序列如下：
Runx2 Forward Primer：5'-TGCACCTACCAGCCTCACCATAC-3'
Runx2 Reverse Primer：5'-GACAGCGACTTCATTCGACTTCC-3'
GAPDH Forward Primer：5'-TGCACCACCAACTGCTTAG-3'；
GAPDH Reverse Primer：5'-GGATGCAGGGATGATGTTC-3'；
Real time PCR反应条件为：95℃，30s；95℃，10s，60℃，30s，44个循环。
参照图9，结果表明，MACF1重组质粒组前成骨细胞中Runx2表达水平显著增加，表明MACF1高表达可促进成骨细胞分化。
实施例9。骨髓腔注射MACF1重组质粒对老龄性骨质疏松小鼠骨密度的影响。
(1)实验分组：以18月龄老龄性骨质疏松C57BL/6小鼠为研究对象，分为对照组与MACF1重组质粒组，其中对照组为通过小鼠股骨骨髓腔注射英格恩转染试剂和生理盐水组；MACF1重组质粒组为通过股骨骨髓腔注射PEGFP-C1-ACF7质粒组，所有组的饲养条件均相同。
(2)骨髓腔注射MACF1重组质粒。
小鼠经麻醉机麻醉后，剪开左侧膝关节外侧皮肤，进行股骨骨髓腔注射，每15天注射1次，共注射3次。
(3)microCT检测MACF1重组质粒对小鼠骨骼的影响。
第3次注射结束25天后，脱颈处死小鼠。剥离取出左侧股骨，去除骨表面的软组织，用70％乙醇固定后，截取股骨远端，采用microCT扫描，获取数据后，用SIEMENS InveonResearch Workplace软件进行三维重建处理，并用专用骨骼分析软件分析松质骨骨矿物密度(BMD)和骨矿物含量(BMC)。
参照图10，结果表明，与对照组相比，MACF1重组质粒组老龄小鼠的股骨骨组织骨小梁数量与皮质骨厚度均明显增加。进一步通过专用骨骼分析软件对松质骨骨矿物密度(BMD)和骨矿物含量(BMC)进行分析，参照图11，与对照组相比，MACF1重组质粒组老龄小鼠的股骨BMD增加了62％，而BMC增加了56％，这些结果表明增加MACF1表达量显著增加了老龄鼠骨密度，并改善骨组织微结构，说明，增加MACF1的表达在治疗骨质疏松中起作用。

Claims (5)

1.一种诊断和治疗骨质疏松症药物，其特征在于：至少包括一对特异性扩增MACF1基因的引物；正向引物：5'-AACCAAGGCAACCCATTCTT-3'；反向引物：5'-ACTCTGCTCGCTCCAGTTTC-3'。
2.一种采用免疫检测诊断骨质疏松症的药物，其特征在于：包括与MACF1蛋白特异性结合的抗体。
3.一种采用芯片诊断骨质疏松症的药物，其特征在于：包括基因芯片和蛋白芯片；其中基因芯片包括与MACF1基因的核酸序列杂交的探针，蛋白芯片包括与MACF1蛋白特异性结合的抗体。
4.一种采用编码功能性MACF1蛋白的核酸试剂治疗骨质疏松症的药物，其特征在于：包括含有MACF1基因序列的重组质粒。
5.一种MACF1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用，其特点是包括以下步骤：
(1)设计MACF1基因特异性引物序列5'-AACCAAGGCAACCCATTCTT-3'，5'-ACTCTGCTCGCTCCAGTTTC-3'，并合成制备以获得MACF1基因特异性引物；
(2)MACF1基因特异性引物用于骨质疏松检测：收集骨质疏松症患者骨组织样本，构建老龄骨质疏松小鼠模型并收集骨组织样本，检测MACF1在上述骨组织样本中的表达量，证实MACF1在人骨质疏松患者骨组织样本与小鼠骨质疏松骨组织样本中均显著低表达；
MACF1基因特异性引物是一种用于诊断人骨质疏松症等骨骼系统相关疾病的标志基因，能应用于制备检测骨组织中MACF1基因表达水平的人骨骼系统相关疾病的检测试剂盒、试纸、芯片以及real time PCR；
(3)MACF1重组质粒在骨质疏松治疗中的应用：采用体外转染方法将MACF1重组质粒转染到小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中，通过real time PCR实验、MTT实验与ALP染色实验检测MACF1高表达对前成骨细胞增殖与成骨分化能力的影响，证实MACF1高表达可促进前成骨细胞增殖与成骨分化；进一步采用体内转染方法将MACF1重组质粒注射入18月龄C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，采用microCT检测MACF1高表达对股骨骨密度与骨组织微结构的影响，证实MACF1高表达增加了老龄鼠骨密度，并改善骨组织微结构；
MACF1基因及其表达产物能够用于制备诊断和治疗骨质疏松症等骨骼疾病的药物及药物组合物；上述药物及药物组合物包括药学上的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂、崩解剂；并包括制备药物组合物的不同添加剂，如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
CN201610530383.2A 2016-07-06 2016-07-06 Macf1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用 Pending CN106148520A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610530383.2A CN106148520A (zh) 2016-07-06 2016-07-06 Macf1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610530383.2A CN106148520A (zh) 2016-07-06 2016-07-06 Macf1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106148520A true CN106148520A (zh) 2016-11-23

Family

ID=58061474

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610530383.2A Pending CN106148520A (zh) 2016-07-06 2016-07-06 Macf1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106148520A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107114311A (zh) * 2017-04-26 2017-09-01 西北工业大学 Macf1基因在成骨细胞中条件性敲除的小鼠模型的构建及应用
CN109055542A (zh) * 2018-09-27 2018-12-21 中国航天员科研训练中心 预测失重骨丢失腰椎骨密度下降风险的方法与dna甲基化标志物

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997040183A2 (en) * 1996-04-10 1997-10-30 The Biological Research Center Of The Hungarian Academy Of Sciences Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
WO2005047546A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Diagnostic and prognostic methods and compositions for seizure- and plasticity-related disorders
CN104531700A (zh) * 2014-11-11 2015-04-22 西北工业大学 抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列及其应用
CN105112550A (zh) * 2015-09-28 2015-12-02 北京泱深生物信息技术有限公司 作为骨质疏松症诊治靶标的mtus1基因
CN105169411A (zh) * 2015-07-14 2015-12-23 西北工业大学 力学敏感的miR-138-5p作为药物靶点在骨骼肌肉系统疾病中应用
CN105518153A (zh) * 2013-06-20 2016-04-20 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 生物标志物鉴定

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997040183A2 (en) * 1996-04-10 1997-10-30 The Biological Research Center Of The Hungarian Academy Of Sciences Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
WO2005047546A2 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Diagnostic and prognostic methods and compositions for seizure- and plasticity-related disorders
CN105518153A (zh) * 2013-06-20 2016-04-20 因姆内克斯普雷斯私人有限公司 生物标志物鉴定
CN104531700A (zh) * 2014-11-11 2015-04-22 西北工业大学 抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列及其应用
CN105169411A (zh) * 2015-07-14 2015-12-23 西北工业大学 力学敏感的miR-138-5p作为药物靶点在骨骼肌肉系统疾病中应用
CN105112550A (zh) * 2015-09-28 2015-12-02 北京泱深生物信息技术有限公司 作为骨质疏松症诊治靶标的mtus1基因

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
未知: "Homo sapiens microtubuleactin", 《GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107114311A (zh) * 2017-04-26 2017-09-01 西北工业大学 Macf1基因在成骨细胞中条件性敲除的小鼠模型的构建及应用
CN109055542A (zh) * 2018-09-27 2018-12-21 中国航天员科研训练中心 预测失重骨丢失腰椎骨密度下降风险的方法与dna甲基化标志物

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Carr II et al. The role of biologic agents in the management of common shoulder pathologies: current state and future directions
CN107028980A (zh) 用于治疗心脏疾病的药物组合物
CN108348555A (zh) 细胞扩增方法和治疗组合物
Fu et al. Matrigel scaffolding enhances BMP9-induced bone formation in dental follicle stem/precursor cells
Tawonsawatruk et al. Evaluation of native mesenchymal stem cells from bone marrow and local tissue in an atrophic nonunion model
CN109224130A (zh) 长链非编码RNA lnc-HCAR在制备骨修复体系中的应用及骨修复体系和制备方法
Leng et al. Treatment of ischemia-reperfusion injury of the skin flap using human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) transfected with “F-5” gene
CN106148520A (zh) Macf1基因及其表达产物在制备诊断和治疗骨质疏松症药物中的应用
Shao et al. Wogonin inhibits inflammation and apoptosis through STAT3 signal pathway to promote the recovery of spinal cord injury
CN110840882A (zh) 一种治疗骨质疏松的组合物
CN109069661A (zh) 利用聚合蛋白共轭物的治疗
CN107050454A (zh) 一种miRNA‑483‑5p抑制剂药物及其在治疗骨关节炎药物中的用途
CN113846064A (zh) 一种fgf18基因修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用
Peng et al. Effects of transplantation of FGF-2-transfected MSCs and XACB on TNF-α expression with avascular necrosis of the femoral head in rabbits
WO2016018761A1 (en) Mesenchymal stem cells expressing biomarkers that predict the effectiveness of the mesenchymal stem cells for treating diseases and disorders
CN105457028B (zh) 在骨形成中发挥调控作用的应力敏感性microRNA
CN105112550B (zh) 作为骨质疏松症诊治靶标的mtus1基因
CN104480064A (zh) 眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法
CN104740613A (zh) 脂联素在制备治疗骨折的药物中的应用
CN113648306A (zh) 佛手柑素在预防或治疗骨质疏松和/或骨丢失中的应用
CN103031268B (zh) OGP-rhLeptin融合蛋白转基因工程菌株
CN105396136A (zh) CCN1（Cyr61）在治疗皮肤损伤及皮肤萎缩相关疾病中的应用
CN111701021B (zh) Nipa2作为药物靶点在制备治疗2型糖尿病性骨质疏松的药物中的应用
CN109097431A (zh) 一种筛选促骨细胞生成的间充质干细胞的方法
CN109223801A (zh) 一种新的胃癌肿瘤干细胞杀伤剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161123